DE60126802T2

DE60126802T2 - Cyclopeptide, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung zur hemmung oder stimulierung von angiogenese

Info

Publication number: DE60126802T2
Application number: DE60126802T
Authority: DE
Inventors: Natacha Betz; Andreas Bikfalvi; Gerard Deleris
Original assignee: Universite Victor Segalen Bordeaux 2; Commissariat a lEnergie Atomique CEA; Universite des Sciences et Tech (Bordeaux 1)
Current assignee: Universite Victor Segalen Bordeaux 2; Universite des Sciences et Tech (Bordeaux 1); Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date: 2000-10-04
Filing date: 2001-10-02
Publication date: 2007-11-08
Anticipated expiration: 2021-10-03
Also published as: WO2002028895A3; ES2282293T3; NZ525069A; JP4303958B2; CA2424506A1; US7199100B2; DK1328546T3; FR2814744B1; RU2249599C2; EP1328546A2; DE60126802D1; ATE354589T1; NO20031377L; JP2004510784A; EP1328546B1; USRE44022E1; US20040092434A1; AU9394801A; WO2002028895A2; NO20031377D0

Description

Technisches Gebiet
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind neue Cyclopeptide und sie enthaltende Systeme, welche die Beherrschung (Behandlung) der Angiogenese erlauben.
Die Angiogenese ist ein Neo-Vaskularisations-Mechanismus, der ausgeht von einem bereits vorhandenen Kapillarnetz (Kapillarbett). Sie ist besonders wichtig und unerlässlich im Verlauf zahlreicher physiologischer Prozesse, wie z.B. der Embryonenentwicklung, der Plazenta-Implantation, aber auch bei verschiedenen Pathologien, insbesondere beim Wachstum von Tumoren, bei der Entwicklung von Metastasen, bei der Ischämie, bei Gefäßerkrankungen des Auges und bei chronischen Entzündungserkrankungen (vgl. Ferrara et al., "Nature Medicine", Band 5, Nr. 12, Dezember 1999, Seiten 1361–1364 [1], und Hagedorn und Bikfalvi [2]). Die Angiogenese ist auch wichtig bei der Gewebeerneuerung (Gewebe-Regeneration) und bei der dauerhaften Kolonisation von implantierten biologischen Materialien, wie z.B. Knochenersatz-Materialien.
Die Angiogenese ist ein Mehrphasen-Prozess, der in einer ersten Stufe beruht auf der Migration (Wanderung), der Haftung und Adhäsion von Endothel-Zellen, dann auf ihrer Proliferation und ihrer Organisation zu Röhren, um schließlich das Gefäßnetz zu bilden, das für die Entwicklung von Geweben erforderlich ist.
Unter den Faktoren, welche die Angiogenese steuern, hat sich der Wachstumsfaktor des Gefäßendothels (VEGF) als einer der wichtigsten erwiesen.
Der VEGF existiert in vier Isoformen A, B, C und D und unter ihnen ist die Isoform A, die 165 Aminosäuren umfasst, ein starker Regulator für die Tumor-Angioge nese und er scheint auch beteiligt zu sein an anderen Pathologien, wie z.B. der Diabetes-Retinopathie oder der chronischen Entzündungserkrankungen.
Der VEGF-A wird von normalen oder transformierten Zellen gebildet. Seine Expression kann durch eine Hypoxie, eine onkogene Aktivierung oder durch eine Aktivierung durch Wachstumsfaktoren, wie z.B. den Wachstumsfaktor der Fibroblasten FGF-2, induziert werden.
Der VEGF-A dockt an unterschiedlichen Rezeptoren, insbesondere dem Rezeptor für das Kinase-Gebiet KDR (VEGFR 2), der ein sehr wichtiger Effektor bei der pathologischen Angiogenese zu sein scheint, an Auch die Inhibierung der Angiogenese mittels des Rezeptors KDR könnte ein interessanter therapeutischer Ansatz sein.
Die Struktur des VEGF-A, der 165 Aminosäuren umfasst, wurde bereits am Ende des Jahres 1997 beschrieben und ist zugänglich ab Ende Juni 1998, wie aus dem Dokument [3] hervorgeht (vgl. Y. A. Muller in "Structure", 1997, 5, Seiten 1325–1338) [3]).
Bisheriger Stand der Technik
Es wurde bereits eine bestimmte Anzahl von Strategien entwickelt mit dem Ziel, in die Funktion des Rezeptors KDR von VEGF einzugreifen. Diese umfassen die Inhibierung (Hemmung) des VEGF:

– durch Human-Antikörper, wie von Presta et al. in "Cancer Research", 57 1997, Seiten 4593–4599 [4], beschrieben,
– durch antiidiotype Antikörper, wie von Ortéga et al. in "Am. J. Pathol." Nov. 1997, 151 (5), Seiten 1215–1224 [5], beschrieben,
– durch Inhibitoren des Tyrosinkinase-Gebiets des Rezeptors KDR, wie von Piossek et al. in "The Journal of Biological Chemistry", Band 274, Nr. 9, 1999, Seiten 5612–5619 [6], beschrieben, und
– durch Inhibitor-Peptide, die durch ein Phagen-Display isoliert wurden, wie von Fairbrother et al. in "Biochemistry" 37, 1998, Seiten 17754–17764 [7], beschrieben.

Es wurden auch bereits andere Moleküle, die gegenüber der Angiogenese aktiv sind, charakterisiert und bestimmte von ihnen sind in der Onkologie in die klinische Phase gelangt, wie es von Hagedorn und Bikfalvi in "Critical Reviews in Oncology/Hematology, 34, 2000, Seiten 89–110 [2], beschrieben ist.
In dem Dokument US-A-5 939 383 [8] wird die Verwendung verschiedener Cyclopeptide vorgeschlagen, die auf einen festen Träger oder auf einen anderen Träger aufgepfropft oder daran gekuppelt werden für biotechnologische Anwendungen. Unter verschiedenen Möglichkeiten wird darin das folgende Cyclopeptid vorgeschlagen:
cyclo(Glu-Gln-Ile-Met-Arg-Ile-Lys-Pro-His-Gln)
(SEQ ID NO: 24)
für den KDR-Rezeptor des VEGF.
Darin ist jedoch kein Ergebnis in Bezug auf die mögliche Inhibierung des KDR-Rezeptors durch dieses Cyclopeptid angegeben, und wie weiter unten ausgeführt, führt dies auch nicht zur Inhibierung der Bindung des VEGF an seinen Rezeptor.
Zusammenfassung der Erfindung
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind insbesondere neue Cyclopeptide, die eine Bindungsaffinität gegenüber dem KDR-Rezeptor aufweisen, die höher ist als diejenige, welche die oben genannten Produkte aufweisen, die ihre Verwendung in Systemen zur Aktivierung oder Inhibierung der Angiogenese erlaubt.
Die Anwesenheit der drei Aminosäuren Arg, Lys und His ist wesentlich für die Erzielung der gewünschten Wechselwirkung mit dem KDR-Rezeptor des VEGF.
Erfindungsgemäß werden die Arg- und Gly-Reste des Cyclopeptids durch eine Kette miteinander verbunden, die ein oder mehrere organische Moleküle aufweisen kann, ausgewählt aus den natürlichen und synthetischen Aminosäuren, d.h. Verbindungen, die eine COOH-Gruppe und eine gegebenenfalls substituiert NH₂-Gruppe aufweisen. Die Aminosäuren können in der L-Form oder in der D-Form vorliegen.
Die synthetischen Aminosäuren können beispielsweise aromatische Verbindungen und/oder heterocyclische Verbindungen sein, die eine COOH-Gruppe und eine NH₂-Gruppe aufweisen an einer Struktur, die es ihnen erlaubt, eine räumliche Konformation zu verleihen, die ähnlich derjenigen des VEGF mit der interessanten Peptid-Sequenz (SEQ ID NO: 1) ist.
Die aromatischen Teile können von Benzol, Naphthalin oder Dibenzofuran abgeleitet sein.
Die Heteroatome können Sauerstoff-, Stickstoff-, Silicium-, Germanium-, Zinn- oder Phosphoratome sein.
Als Beispiel für eine solche Aminosäure kann die 4-(2'-Aminoethyl)-6-dibenzofuranpropansäure der Formel genannt werden:
Die Synthese dieser Säure wird von Bekele et al. in "J. Org. Chem." 62, 1997, Seiten 2259–2262 [9], beschrieben.
Als Beispiele für organische Verbindungen, die verwendet werden können, können genannt werden die Silaxanthene, die 4-(2'-Aminoethyl)-6-(dibenzofuranpropansäure und die 5-(2'-Aminoethyl)-9,9-dimethylsila-xanthen-4-propansäure.
Wenn die Verbindung eine substituierte NH₂-Gruppe aufweist, kann diese eine solche vom NHR-Typ sein, wobei R steht für eine Kohlenwasserstoff-Gruppe, die gegebenenfalls funktionelle Gruppen vom Carboxy-, Ester-, Ether-, Hydroxy- oder Siloxy-Typ trägt.
Vorzugsweise umfasst die Kette, welche die Enden der Peptid-Sequenz miteinander verbindet, eine Aminosäure in der D-Form, vorzugsweise D-Phe oder D-Tyr.
Als Beispiele für erfindungsgemäße Cyclopeptide können die folgenden Cyclopeptide genannt werden:
P11: Cyclo(DPhe-pro-Gln-Ile-Met-Arg-Ile-Lys-Pro-His-Gln-Gly-Gln-His-Ile-Gly-Glu) SEQ ID NO: 5
P16: Cyclo(Arg-Ile-Lys-Pro-His-Gln-Gly)
SEQ ID NO: 8
P17: Cyclo(Pro-Arg-Ile-Lys-Pro-His-Gln-Gly)
SEQ ID NO: 9
Cyclo(Gln-Ile-Met-Arg-Ile-Lys-Pro-His-Gln-Gly-Gln-His-Ile-Gly-Glu)
SEQ ID NO: 10
Cyclo(DPhe-Pro-Gln-Ile-Met-Arg-Ile-Lys-Pro-His-Gln-Gly-Gln-His-Ile-Gly)
SEQ ID NO: 11
Cyclo(DPhe-Pro-Arg-Ile-Lys-Pro-His-Gln)
SEQ ID NO: 13
Cyclo(Gly-Arg-Ile-Lys-Pro-His)
SEQ ID NO: 25
Die erfindungsgemäßen Cyclopeptide können verwendet werden, um die Angiogenese zu beherrschen (zu behandeln) und um die mit der Angiogenese im Zusammenhang stehenden verschiedenen Pathologien zu behandeln. Für diese Anwendungen kann man sie in Form einer Lösung oder in Systemen oder Biomaterialien verwenden.
Wenn die Cyclopeptide in Form einer Lösung verwendet werden, handelt es sich dabei im Allgemeinen um auf oralem Wege oder durch Injizieren verabreichbare wässrige Lösungen. Das Cyclopeptid kann verwendet werden entweder um eine Inhibierung (Hemmung) der Angiogenese durch Fixierung des Cyclopeptids an einem VEGF-Rezeptor zu gewährleisten, oder um eine Aktivierung der Angiogenese durch Kuppeln von zwei Cyclopeptiden an eine geeignete organische Verbindung, um ihr eine räumlich wirksame Konfiguration zu verleihen, welche die Dimerisierung der Rezeptoren für VEGF erlaubt, zu gewährleisten.
In beiden Fällen können die Cyclopeptide erforderlichenfalls an bioaktive Agentien gekuppelt sein.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist außerdem eine Zusammenset zung, die ein Cyclopeptid umfasst, das ausgewählt wird unter den folgenden Cyclopeptiden:
P11: Cyclo(DPhe-Pro-Gln-Ile-Met-Arg-Ile-Lys-Pro-His-Gln-Gly-Gln-His-Ile-Gly-Glu)
SEQ ID NO: 5
P16: Cyclo(Arg-Ile-Lys-Pro-His-Gln-Gly) SEQ ID NO: 8
P17: Cyclo(Pro-Arg-Ile-Lys-Pro-His-Gln-Gly)
SEQ ID NO: 9
P19: Cyclo(Gln-Ile-Met-Arg-Ile-Lys-Pro-His-Gln-Gly-Gln-His-Ile-Gly-Glu)
SEQ ID NO: 10
P20: Cyclo(DPhe-Pro-Gln-Ile-Met-Arg-Ile-Lys-Pro-His-Gln-Gly-Gln-His-Ile-Gly)
SEQ ID NO: 11
P23: Cyclo(DPhe-Pro-Arg-Ile-Lys-Pro-His-Gln)
SEQ ID NO: 13
Cyclo(Gly-Arg-Ile-Lys-Pro-His)
SEQ ID NO: 25
Gegenstand der Erfindung ist ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Aktivierung der Angiogenese, die zwei identische oder unterschiedliche Cyclopeptide umfasst, die an eine pharmazeutisch akzeptable organische Verbindung gekuppelt sind, wobei die Cyclopeptide ausgewählt werden unter den folgenden Cyclopeptiden:
P11: Cyclo(DPhe-Pro-Gln-Ile-Met-Arg-Ile-Lys-Pro-His-Gln-Gly-Gln-His-Ile-Gly-Glu)
SEQ ID NO: 5
P16: Cyclo(Arg-Ile-Lys-Pro-His-Gln-Gly)
SEQ ID NO: 8
P17: Cyclo(Pro-Arg-Ile-Lys-Pro-His-Gln-Gly)
SEQ ID NO: 9
P19: Cyclo(Gln-Ile-Met-Arg-Ile-Lys-Pro-His-Gln-Gly-Gln-His-Ile-Gly-Glu)
SEQ ID NO: 10
P20: Cyclo(DPhe-Pro-Gln-Ile-Met-Arg-Ile-Lys-Pro-His-Gly-Gln-His-Ile-Gly)
SEQ ID NO: 11
P23: Cyclo(DPhe-Pro-Arg-Ile-Lys-Pro-His-Gln)
SEQ ID NO: 13
P24: Cyclo(Gly-Arg-Ile-Lys-Pro-His)
SEQ ID NO: 25
Die pharmazeutisch akzeptable organische Verbindung kann alternierende hydrophile-hydrophobe Sequenzen und mit den Funktionen der Seitenketten der A minosäuren des Cyclopeptids reaktive Funktionen aufweisen.
Wenn die Cyclopeptide in Form von Systemen oder biologischen Materialien verwendet werden, können sie auch so hergestellt werden, dass entweder die Inhibierung oder die Aktivierung der Angiogenese gewährleistet wird.
Bei einer ersten Ausführungsform dieser Systeme können diese ein oder mehr Cyclopeptide umfassen, die auf kovalente Weise an einen organischen Abstandhalterarm gebunden ist (sind), der selbst auf kovalente Weise an einen Träger gebunden ist.
Bei der ersten Ausführungsform dockt dann, wenn das System mit den Rezeptoren des VEGF in Kontakt steht, ein einzelnes Cyclopeptid an einen Rezeptor des VEGF an und verhindert die Dimerisierung des Rezeptors und die Aktivierung der Angiogenese.
Bei einer zweiten Ausführungsform dieser Systeme, die insbesondere bestimmt sind, um die Aktivierung der Angiogenese zu gewährleisten, umfassen diese zwei Cyclopeptide, die auf kovalente Weise an eine organische Verbindung gebunden sind, um die beiden Cyclopeptide in einer räumlichen Konfiguration anzuordnen, die wirksam ist, um die Angiogenese zu aktivieren.
Die organischen Verbindungen stellen pharmazeutisch akzeptable Verbindungen dar. Sie können gebildet sein aus alternierenden hydrophilen-hydrophoben Sequenzen, beispielsweise vom Polyethylenglycol/Alkan- oder Fluoralkan-Typ, und sie können Funktionen aufweisen, die gegenüber den Amin-, Hydroxy-, Carbonsäure-Funktionen oder anderen Funktionen der Seitenketten des Cyclopeptids reaktiv sind, um ihre Fixierung an der Verbindung zu gewährleisten, sie können aber auch Funktionen vom Acryl-Typ aufweisen.
Als ein Beispiel für eine Verbindung dieses Typs kann die Verbindung mit der folgenden Formel genannt werden: HOOCH₂CH₂O(CH₂CH₂O)₅(CH₂)₃-NH-(CH₂CH₂O)5CH₂-CH₂-COOH die zwei Carboxyl-Funktionen aufweist, die mit Hydroxy- oder Amin-Funktionen der Seitenketten der Aminosäuren des Cyclopeptids reagieren können.
Die organischen Verbindungen, die verwendet werden können, können auch aromatische Teile und/oder Heteroatome umfassen, um einerseits die beiden Cyclopeptide in einer wirksamen Konfiguration zu halten, und um andererseits die Fixierung dieser beiden Cyclopeptide in dieser Konfiguration an verschiedenen Trägern zu ermöglichen.
Die aromatischen Teile können von Benzol, Naphthalin oder Dibenzofuran abgeleitet sein.
Die Heteroatome können Sauerstoff-, Stickstoff-, Silicium-, Germanium-, Zinn- oder Phosphoratome sein.
Um die Aktivierung der Angiogenese zu gewährleisten, ist der Abstand zwischen den beiden an der organischen Verbindung fixierten Cyclopeptiden der Art, dass dann, wenn das System mit Zellen in Kontakt gebracht wird, welche die Rezeptoren des Wachstumsfaktors des Gefäßendothels VEGF exprimieren, die Dimerisation dieser Rezeptoren möglich ist.
Bei dieser zweiten Ausführungsform ist die organische Verbindung, welche die beiden Cyclopeptide trägt, im Allgemeinen mittels eines organischen Abstandhalter-Arms mit einem Träger verbunden.
Bei diesen beiden Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Systeme umfasst der Abstandhalter-Arm beispielsweise eine Kohlenwasserstoff-, Fluorkohlenstoff-, Polyether-, Polyethylenglycol-, Polyamin-, Polyamid-, Polyester-, Polysiloxan-Kette oder eine Kombination derselben, die an jedem Ende funktionalisiert ist (eine Funktion trägt), um eine kovalente Bindung einerseits gegenüber dem Cyclopeptid und andererseits gegenüber dem Träger zu bilden.
Vorzugsweise umfasst der organische Abstandhalter-Arm darüber hinaus eine Einheit oder eine Peptid-Sequenz, die durch ein enzymatisches System geschnitten werden kann.
Das Schneiden des Abstandhalter-Arms erlaubt auf diese Weise die Freisetzung der aktiven Cyclopeptide an den gewünschten Stellen (Orten). Das enzymatische System kann aus Metallproteasen der extrazellulären Matrix oder anderen Enzymen bestehen.
In diesem Fall handelt es sich bei der Einheit um eine Peptid-Sequenz, die ein Substrat für diese Metallproteasen der extrazellulären Matrix darstellt, beispielsweise um die folgende Peptid-Sequenz:
HOOC-Ala-Gly-Leu-Leu-Gly-Gln-Pro-Gly-NH₂
Bei einer vorteilhaften Anordnung der Erfindung kann der Abstandhalter-Arm außerdem bioaktive Verbindungen umfassen, die beim Schneiden dieses Abstandhalter-Arms ebenfalls an dem gewünschten Ort (der gewünschten Stelle) freigesetzt werden.
Diese bioaktiven Verbindungen können beispielsweise zytotoxische Agentien, Antikrebs-Mittel oder irgendein anderer Wirkstoff sein, der (die) in den Bereich der KDR-Rezeptoren eingeführt werden soll (sollen).
Erfindungsgemäß kann der Träger, an dem das oder die Cyclopeptide fixiert ist (sind), ein organischer oder anorganischer Feststoff sein. Man kann insbesondere als Träger ein organisches Polymer in fester Form oder in Form eines Gels verwenden.
Das verwendete Polymer ist zweckmäßig ein biologisch kompatibles, biologisch abbaubares oder nicht biologisch abbaubares Polymer.
Als Beispiele für Polymere, die verwendet werden können, können genannt werden das Ethylenpolyterephthalat, die Copolymeren von Vinylidenfluorid und Hexafluorpropylen, die Polyvinylalkohole, die Polyhydroxyethylmethacrylate, die Polysaccharide und die Copolymeren, die aus Monomeren hergestellt sind, die in die Konstitution der oben genannten Polymeren eintreten.
Die erfindungsgemäßen Cyclopeptide können hergestellt werden unter Anwendung von Verfahren, bei denen eine Stufe der automatischen Synthese eines linearen Peptids an einer festen Phase durch einen klassischen Prozess angewendet wird, gefolgt von einer Kupplung der Enden des linearen Peptids entweder nach der Freisetzung des Peptids von der festen Phase oder während der sich daran anschließenden Freisetzung von der festen Phase.
Gemäß einer ersten Ausführungsform umfasst das Verfahren somit

(a) die Herstellung eines linearen Peptids durch chemische Synthese an (auf) einer festen Phase,
(b) die Freisetzung des linearen Peptids aus der festen Phase und
(c) das Kuppeln der Enden des linearen Peptids miteinander zur Bildung des Cyclopeptids.

Gemäß einer zweiten Ausführungsform besteht das Verfahren darin, dass man:

(a) ein lineares Peptid herstellt durch chemische Synthese an (auf) einer festen Phase,
(b) das Kuppeln des freien Endes des linearen Peptids mit einer terminalen Funktion eines Aminosäure-Restes des linearen Peptids und
(c) das Freisetzen des Cyclopeptids aus der festen Phase.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist außerdem ein Verfahren zur Herstellung eines Systems, das umfasst einen Träger, an dem das (die) Cyclopeptid(e) fixiert ist (sind), das darin besteht, dass man einen Träger aus einem organischen Polymer einer Bestrahlung mit ionisierender Strahlung, Plasmastrahlung oder Photonenstrahlung an definierten Zonen des Trägers aussetzt und anschließend auf diese Zonen des Trägers einen organischen Abstandhalter-Arm aufpfropft, an dem das Cyclopeptid fixiert ist oder wird.
Im Allgemeinen führt man eine Bestrahlung durch eine Maske hindurch durch, um die Zonen des Trägers, die modifiziert werden sollen, zu definieren. Bei den verwendeten ionisierenden Strahlen kann es sich handeln um Bündel von Elektronenstrahlen oder ein Strahlenbündel von schnellen schweren Ionen.
In diesem Verfahren können die Cyclopeptide vor der Aufpfropfung an den Abstandhalter-Armen fixiert werden. Man kann auch ihre Fixierung nach der Aufpfropfung durchführen, und in diesem Fall umfasst das Verfahren darüber hinaus eine Stufe der Fixierung der Cyclopeptide an den organischen Abstandhalter-Armen nach dem Aufpfropfen derselben.
Weitere Charakteristika und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der Lektüre der nachfolgenden Beschreibung, der nachstehend angegebenen Aufführungsbeispiele, welche die Erfindung lediglich erläutern, ohne sie jedoch darauf zu beschränken, und aus der Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die erste Ausführungsform der Synthese eines erfindungsgemäßen Cyclopeptids;
2 zeigt die zweite Ausführungsform der Synthese eines erfindungsgemäßen Cyclopeptids;
3 erläutert die Bindung (Ligation) eines erfindungsgemäßen Cyclopeptids an einen Träger mittels eines organischen Abstandhalter-Arms; und
4 erläutert die Fixierung einer organischen Verbindung, die zwei Cyclopeptide trägt, an einem Träger mittels eines Abstandhalter-Arms.
Detaillierte Beschreibung von Ausführungsformen der Erfindung
Nachstehend wird die chemische Synthese der in der weiter unten folgenden Tabelle 1 angegebenen Peptide P1 bis P22 beschrieben, die Sequenzen aufweisen, die den β5-β6-Segmenten des Wachstumsfaktors des Gefäßendothels (VEGF-A) entsprechen.
Die Peptide P1 bis P6, P10, P14 und P15 sind lineare Peptide und die Peptide P7 bis P9, P11, P12, P13 und P16 bis P24 sind Cyclopeptide.
Die Cyclopeptide P7 bis P9, P11, P12, P13, P16 bis P18 und P23 wurden hergestellt unter Verwendung des Synthese-Verfahrens A, d.h. unter Anwendung der ersten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Synthese von Cyclopeptiden.
Die Cyclopeptide P12, P13 und P19 bis P23 wurden hergestellt unter Anwendung des Synthese-Verfahrens B, d.h. unter Anwendung der zweiten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Synthese von Cyclopeptiden.
In der nachfolgenden Beschreibung dieser Synthesen werden die folgenden Abkürzungen verwendet:

FmOC:: 9-Fluorenylmethoxycarbonyl,
tBu:: t-Butoxycarbonyl,
Trt:: Trityl,
2-Cl Trt:: 2-Chlortrityl,
HMPB:: 4-Hydroxymethyl-3-methoxyphenoxy-buttersäure
BHA:: Benzhydrylamin,
HOBt:: N-Hydroxybenzotriazol,
DCC:: N,N'-Dicyclhexylcarbodiimid,
DCM:: Dichlormethan,
TFA:: Trifluoressigsäure,
DIEA:: N,N-Diisopropyl-ethylamin,
NMM:: N-Methylmorpholin,
PyBoP:: Triazol-1-yl-oxy-tris-pyrrolidin-phosphoniumhexafluorphosphat,
NMP:: N-Methylpyrrolidon,
DIPCDI:: N,N'-Diisopropylcarbodiimid,
DMAP:: 4-Dimethylaminopyridin,
FCS:: Kalbsfetus-Serum,
PBS:: Phosphat-Kochsalz-Puffer,
DMEM:: nach Delbecco modifiziertes essentielles Minimalmedium
HEPES:: N-2-(Hydroxyethyl)piperazin-N'-(2-ethansulfonsäure).

Das Synthese-Verfahren A wird dargestellt durch die 1, welche die Synthese des Cycopleptids P7 erläutert.
Bei diesem Verfahren synthetisiert man zunächst das lineare Peptid auf einer festen Phase P durch Batch-Synthese unter Anwendung der Fmoc/tBu-Schutzgruppenmethode und unter Verwendung eines automatischen Synthetisators 430A der Firma Applied Biosystems. Zur Herstellung von geschützten Peptid-Fragmenten verwendet man mit 2-Chlortrityl vorgeladene Harze, die gegenüber Säuren labil sind, beispielsweise die H-His (Trt)-2-ClTrt- und H-Ile-2-ClTrt-Harze oder HMPB-BHA-Harze auf Basis von BHA-Polystyrol, die mit einem Linker funktionalisiert sind, bei dem es sich handelt um die 4-Hydroxymethyl-3-methoxyphenoxy-butansäure von Rinker, beispielsweise das Harz Fmoc-Gly-HMPB-BHA.
Die durch die 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc)-Gruppe geschützten Aminosäuren werden aneinandergekuppelt unter Verwendung eines vierfachen Überschusses der Menge der aktivierten Aminosäure als N-Hydroxybenzotriazol (HOBt)-Ester mittels N,N'-Dicyclohexylcardodiimid (DCC).
In der 1 zeigt die erste Zeile das lineare Peptid, dessen Seitenketten entweder durch Trityl (Trt)-Gruppen im Falle der Aminogruppen von His und Gln, durch die Boc(t-Butyloxycarbonyl)-Gruppe im Falle der Aminogruppe von Lys und durch die 2,2,5,7,8-Pentamethyl-chroman-6-sulfonyl(Pmc)-Gruppe im Falle von Arg geschützt sind.
Dann wird das lineare Peptid von der festen Phase P abgetrennt durch Behandlung mit einer Lösung von 1% Trifluoressigsäure (TFA) in Dichlormethan (DCM).
Man erhält auf diese Weise ein geschütztes Peptid-Fragment in hoher Ausbeute und mit einem hohen Reinheitsgrad sowie mit einem vernachlässigbaren Ver lust der Gruppen, welche die Seitenketten der Aminosäuren schützen.
Durch eine wiederholte Behandlung des Peptidyl-Harzes mit einer frischen TFA-Losung und neuen minimalen Reaktionszeiten (10 mal während 2 min) erhält man die besten Ergebnisse. Danach wäscht man das Harz mehrmals mit DCM und Methanol. Auf dass Abschneiden (Entfernen) folgt die Dünnschichtchromatographie. Die miteinander vereinigten Filtrate werden unter vermindertem Druck eingedampft und dem Rückstand wird Eiswasser zugesetzt, um das Peptid-Material auszufällen. Das rohe Material wird durch Filtration isoliert, mit frischem Wasser gewaschen und in einem Exsikkator unter Hochvakuum über NaOH getrocknet. Die geschützten linearen Peptide werden durch Hochleistungs-Flüssigchromatographie HPLC an einer inversen Phase (Kolonne Lichrosob RP-18 der Firma Merck, 7 μm, 0,4 cm × 25 cm) analysiert unter Verwendung eines linearen Gradienten von 70 bis 100% B in A, wobei das Lösungsmittel A eine 0,1%ige Lösung von TFA und das Lösungsmittel B eine wässrige Lösung von 0,1% TFA und 70% Acetonitril ist.
Das geschützte lineare Peptid entspricht dem in der 1 erläuterten Peptid P7.
Anschließend führt man die Zyklisierung des geschützten linearen Peptids durch. Zu diesem Zweck löst man es in DCM auf zur Erzielung einer Endkonzentration von 1 mg/ml. Zu der Lösung gibt man 6 Äquivalente N,N-Diisopropylethylamin (DIEA) oder N-Methylmorpholin (NMM) zu und man führt die Cyclisierung durch mittels Benzotriazol-1-yl-oxy-tris-pyrrolidin-phosphonium-hexafluorphosphat (PyBOP)/N-Hydroxybenzotriazol (HOBt) unter Verwendung von 3 Äquivalenten jedes Kupplungsreagenz. Man hält das Reaktionsmedium bei 25°C unter einer Stickstoffatmosphäre und unter schwachem Rühren 24 bis 48 h lang, bis die Cyclisierung beendet ist, was durch HPLC überprüft wird.
Man eliminiert das Lösungsmittel durch Verdampfen unter vermindertem Druck und gibt zu dem Rückstand Eiswasser zu. Man trennt das rohre Präzipitat durch Filtration ab, wäscht es mit frischem Wasser, trocknet es in einem Hochvakuum-Exsikkator über NaOH und man verwendet es für die vollständige Schutzgruppen-Entfernung aus den Seitenketten ohne ergänzende Reinigung.
Das geschützte Cyclopeptid entspricht dem in der 1 erläuterten Cyclopeptid P7.
Die Schutzgruppen-Entfernung aus den Seitenketten des Cyclopeptids wird mittels einer 95%igen Lösung von TFA in Gegenwart von Reagenzien (Phenol, Thioanisol, Triisopropylsilan, Wasser) 2 bis 3 h lang durchgeführt. Anschließend führt man eine Verdampfung des Hauptteils des TFA durch, um eine gute Präzipitation des geschützten rohen Cyclopeptids zu erhalten, und man gibt das 10-fache Volumen Ether zu, der mit Eis gekühlt worden ist. Nach dem Abfiltrieren und Waschen mit dem frischen Ether trocknet man den Niederschlag über NaOH und lyophilisiert ihn. Auf diese Weise werden semipräparative Reinigungen an einer HPLC-Kolonne der Firma Applied Biosystems durchgeführt unter Verwendung der Umkehrphasen-Kolonne Lichrosorb C18 (250 × 10).
Man verwendet die weiter oben beschriebenen Puffer A und B. Es werden lineare Gradienten von 10 bis 50% B in A über eine Zeitdauer von 30 min bei einer Durchflussmenge von 4 ml/min angewendet. Man vereinigt die durch HPLC erhaltenen homogenen Fraktionen und lyophilisiert sie, wobei man die gewünschten Cyclopeptide mit einem zufriedenstellenden Grad der Reinheit von mehr als 95% pro analytischer HPLC erhält.
Die 1 erläutert das geschützte Cyclopeptid, dann die Stufe der Schutzgruppen-Entfernung, die zu dem Cyclopeptid P7 der Tabelle 1 führt.
Zur Herstellung der Peptide P8, P9, P11, P12, P13, P16 bis P18 und P23 wendet man die gleiche Arbeitsweise an, wobei man für die Synthese die L- oder D-Aminosäuren, die geschützt sind durch die Gruppe Fmoc, das Harz Fmoc-L-Gly-HMPB/BHA (0,53 mmol/g), das Harz H-His(Trt)-2-ClTrt (0,42 mmol/g), das Harz H-Ile-2-ClTrt (0,53 mmol/g), und das Harz NovaSyn TGA ((90 μm) und PyBOP, das von der Firma Novabiochem stammt, verwendet.
Außerdem verwendet man die Reagenzien HOBt, DCC, TFA, DIEA, NMM und Piperidin, bezogen von der Firma Aldrich.
Es sei darauf hingewiesen, dass die HPLC mit einer Lichrosorb RP-18-Kolonne (7 μm, 0,4 cm × 25 cm) von Merck und mit einer Lichrosorb C-18-Kolonne (5 μm, 0,4 cm × 25 cm) von Interchim durchgeführt werden, wobei man die Elution mit einem linearen Gradienten des Lösungsmittels B in dem Lösungsmittel A durchführt. Das Lösungsmittel A umfasst 0,1% TFA in H₂O. Das Lösungsmittel B umfasst 0,1% TFA, 70% Acetonitril und 30% Wasser. Man wendet eine Durchflussmenge von 1 ml/min für eine Zeitdauer von 30 min an. Der UV-Nachweis erfolgt bei 214 nm und 280 nm. Die gereinigten Peptide werden durch Analyse der Aminosäuren charakterisiert, wobei man die Hydrolyse in 6 M HCl und 2% Phenol 20 bis 24 h lang bei 110°C durch Massenspektrometrie FAB-MS durchführt.
Nachstehend wird das Synthese-Verfahren B entsprechend der zweiten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Synthese von Cyclopeptiden beschrieben.
Der Synthesemodus B wird erläutert in der 2 für den Fall des Peptids P19.
Für diese Synthese verwendet man die gleichen Reagenzien wie für die Synthese A, wobei man das Harz Fmoc-L-Glu (PEG-PS)-OAllyl (0,18 mmol/g) von Perkin-Elmer zugibt.
Zunächst synthetisiert man das lineare Peptid P10 durch Synthese in fester Phase unter Verwendung des automatischen Synthetisators 430 A der Firma Applied Biosystems, wie in dem Synthese-Verfahren A beschrieben.
Wie in der 2 dargestellt, wird die erste Aminsäure mit C-terminalem Fmoc-Glu-OAllyl an dem Harz NovaSyn TGA mit einer Teilchengröße von 90 μm (Feststoffphase P) durch seine Seitenkette fixiert unter Anwendung eines symmetrischen Anhydrid-Verfahrens. Man lässt das Harz 30 min lang in N-Methylpyrrolidon (NMP) aufquellen. Man gibt eine Lösung von 5 Äquivalenten N,N-Diisopropylcarbodiimid (DIPCDI) zu einer Lösung von 10 Äquivalenten der Aminosäure in trockenem DCM bei 0°C zu. Nach 30-minütigem Rühren entfernt man das Lösungsmittel unter vermindertem Druck und löst den Rückstand in NMP und überführt ihn auf das vorimprägnierte Harz. Die Fixierung der Carbonsäure wird erzielt durch katalysierte Veresterung mit 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) in einer Menge von 0,1 Äquivalent innerhalb von 2 h, wobei man eine End-Substitution von 0,25 mmol/g erhält. Die Be ladung (Charge) des Harzes wird bestimmt durch quantitative UV-Analyse des Piperidin-Fmoc-Additionsprodukts bei 290 nm. Das handelsübliche Harz Fmoc-L-Glu-(PEG-PS)-OAllyl (0,18 mmol/g), das von der Firma Perkin-Elmer stammt, wurde ebenfalls verwendet.
Man kuppelt die nachfolgenden Aminosäuren, die durch die Fmoc-Gruppe geschützt sind, aneinander unter Verwendung eines Überschusses, der dem Vierfachen der Menge der aktiven Aminosäure entspricht, als HOBt-Ester mittels DCC.
Auf diese Weise erhält man das lineare Peptid mit geschützten Seitenketten, wie es in der ersten Zeile der 2 dargestellt ist.
Anschließend führt man eine Entfernung der Allyl-Schutzgruppen aus der Aminosäure durch, die an der festen Phase mit dem endständigem Glu fixiert ist, indem man das Harz mit dem geschützten Peptid mit 3 Äquivalenten [Pd(PPh₃)₄] behandelt in einer DCM/AcOH/NMM (37/2/1)-Mischung unter einem Stickstoffstrom für 2,5 h bei 25°C unter gelegentlichem leichtem Rühren. Man eliminiert den Katalysator durch Waschen des Harzes mit 0,5% DIEA in NMP innerhalb von 2 min 3 mal in NMP, dann in Natriumdiethyldithiocarbamat mit 0,5% P/P in NMP, 3 mal innerhalb von 15 min und schließlich dreimal innerhalb von 2 min in NMP und DCM.
Anschließend für man die Cyclisierung des Peptids an der Feststoffphase auf die folgende Weise durch. Man behandelt das Harz mit 20% Piperidin in NMP zur Freisetzung der N-terminalen Aminogruppe des Peptids und man wäscht es mit 1 N HOBt in NMP, dann mit NMP und DCM. Man führt die Cyclisierung in fester Phase durch unter Verwendung von 6 Äquivalenten PyBOP, 6 Äquivalenten HOBt und 12 Äquivalenten DIEA in NMP innerhalb von 4 bis 6 h. Man überprüft die Erzielung der Cyclisierung durch den Ninhydrin-Test. Man wäscht das Harz mehrmals mit MMP und DCM und lässt es unter Hochvakuum eine Nacht lang trocknen. Das geschützte Cyclopeptid ist in der 2 dargestellt.
Anschließend wird eine Abtrennung des Cyclopeptids von der festen Phase durchgeführt und es wird eine Schutzgruppen-Entfernung aus den Seitenketten der Aminosäuren durchgeführt. Diese erfolgt mittels 95%igem TFA und das Produkt der Acidolyse wird durch semi-präparative HPLC, wie weiter oben beschrieben, gereinigt.
Man vereinigt die durch HPLC erhaltenen homogenen Fraktionen und lyophili siert sie, wobei man die gewünschten Cyclopeptide mit einem zufriedenstellenden Grad der Reinheit (mehr als 95% durch HPLC-Analyse) erhält.
Auf diese Weise erhält man das in der 2 dargestellte Cyclopeptid P19.
Anschließend führt man den gleichen Arbeitsgang durch zur Herstellung der Cyclopeptide P20 bis P22 der Tabelle 1.
Die linearen Peptide P1 bis P6, P10, P14 und P15 der Tabelle 1 werden durch klassische Peptid-Synthese hergestellt.
In der Tabelle 2 werden die Struktur und die Molekularmassen der Peptide P1 bis P22 erläutert, wobei man sich auf die Peptid-Sequenz von VEGF-A bezieht, die 165 Aminosäuren umfasst.
Man testet die Peptide P1 bis P24, was ihre Eigenschaft der Inhibierung der Ligierung (Bindung) des VEGF an seinen Rezeptor KDR angeht.
Für diese Versuche verwendet man chinesische Hamster-Ovarienzellen, die einen Mangel an Heparansulfat aufweisen, die transfektiert worden sind mit einem Expressions-Vektor, der VEGFR2cDNAs (CHOm VEGFR2-Zellen) enthält. Es wurde gezeigt, dass der rekombinante KDR der CHO-Zellen die gleichen Charakteristika aufweist wie der KDR der Endothel-Zellen (vgl. Binétruy-Tournaire et al. im "EMBO Journal", 19, (7), 2000, Seiten 1525–1533 [10]).
Die CHOm VEGFR2-Zellen werden erhalten durch Transfektion (Überimpfung) von chinesischen Hamster-Ovarien-Zellen mit einem Defizit an Heparan-Sulfat mit VEGFR2cDNA in einen Vektor psV-7d, wie von Jonca et al. in "J. Biol. Chem.", 1997, 272, Seiten 24203 [11] beschrieben. Die Zellen CHOm VEGFR2 werden routinemäßig kultiviert in einem Eagle-Medium, das durch ein Dulbecco-Medium, ergänzt durch 10% (V/V) fetales Kalsserum (FCS), 50 U/ml Penicillin, 50 μg/ml Streptomycin, 1 mg/ml Glucose und 2 mM L-Glutamin, modifiziert worden ist, in einer Atmosphäre mit 5% CO₂ bei 37°C.
Bei diesen Versuchen verwendet man einen VEGF, der mit ¹²⁵I-Na radioaktiv markiert worden ist unter Verwendung von Iodperlen (Iodogen).
Die spezifische Aktivität von ¹²⁵I-VEGF beträgt 150000 bis 200000 cpm/ng. Die Zellen werden in Behälter mit einem Durchmesser von 3,5 cm, die vorher mit 0,15% Gelatine bedeckt worden ist, in einer Dichte von 200000 Zellen pro Behälter überimpft und in einem Komplett-Medium 2 Tage lang kultiviert. Die Subkonfluenten-Behalter werden bei 4°C transferiert. Die Zellen werden zweimal mit einem Phosphatkochsalzpuffer, der mit Eis gekühlt worden ist (PBS), gewaschen und mit unterschiedlichen Konzentrationen von Peptiden und 5 ng/mL ¹²⁵I-VEGF in Gegenwart oder Abwesenheit von 50 ng/mL Heparin in einem Ligations-Puffer (DMEM, der 20 mmol/L HEPES enthält, pH 7,4, 0,15% Gelatine) 2 h lang bei 4°C inkubiert. Am Ende der Inkubationsperiode werden die Zellen 3 mal mit dem mit Eis gekühlten PBS gewaschen und in 1 ml des Puffers mit 2% Triton X 100, 10% Glycerin, 1 mg/mL Rinderserum-Albumin BSA solubilisiert. Das Ausmaß der an die Zellen gebundenen Radioaktivität wird in einem γ-Strahlen-Counter Kontron MR-250 ausgezählt. Die nicht-spezifische Ligation (Bindung) wird durch Inkubation der Zellen mit ¹²⁵I-VEGF und einem 200-fachen Überschuss von nicht-markiertem VEGF bestimmt. Die spezifische Ligation (Bindung) wird errechnet durch Subtrahieren der nichtspezifischen Ligation (Bindung) von der Gesamt-Ligation (Gesamtbindung).
Man führt diesen Versuch in Gegenwart von festgelegten Konzentrationen der Peptide P1 bis P22 von 20 μM, 200 μM und 400 μM durch. Alle linearen Peptide und einige cyclische Peptide zeigen keinen Inhibitor-Effekt auf die Ligation von VEGF an KDR bei diesen Konzentrationen. Man setzt den Versuch mit den interessanten Cyclopeptiden und zwei linearen Peptiden als Vergleichssubstanzen für eine Analyse der Inhibierung als Funktion der Dosis fort.
Die durch IC₅₀ dargestellten erhaltenen Ergebnisse, d.h. die erforderlichen Konzentration in μM zur Inhibierung von 50% der Ligation (Bindung) des VEGF an den Rezeptor KDR sind ebenfalls in der Tabelle 2 angegeben.
Alle Versuche werden dreimal wiederholt und liefern ähnliche Ergebnisse.
Es wurde auf diese Weise festgestellt, dass die Cyclopeptide P11, P16, P17, P19, P20, P23 und P24 sehr wirksam sind in Bezug auf die Inhibierung der Ligation (Bindung) von VEGF an den Rezeptor KDR.
Dagegen ist das Cyclopeptid P22, das dem in US-A-5 939 383 [8] beschriebenen Cyclopeptid entspricht, nicht besser wirksam als die linearen Peptide P1 bis P6, P10, P14 und P15 in Bezug auf die Inhibierung dieser Ligation (Bindung).
Die Peptide, welche die Ligation (Bindung) von ¹²⁵I-VEGF an den Rezeptor VEGFR2 inhibieren, werden anschließend in Angiogenese-Versuchen in vitro, ex vivo und in vivo und in Bezug auf ihren Effekt auf die Zellensignalgebung getestet. Man erhält hier Ergebnisse, die den Effekt der aktiven Peptide auf die Zellen-Proliferation (Zellenvermehrung), die Zellenmigration (Zellenwanderung) und auf die Aktivierung der p42- und p44-Kinasen (MAP-Kinasen: Kinasen, die durch die Mitogene aktiviert worden sind) betreffen.
Die Zellen-Proliferation wird durch Auszählen der Zellen bestimmt. 7000 Endothel-Zellen werden in die Vertiefungen von Mikrotitrations-Platten mit 24 Vertiefungen (Costar) in einem DMEM-Medium eingeführt, das Rinderserium eines neugeborenen Rindes enthält. Nachdem die Zellen daran haften, werden die Zellen in DMEM ohne Serum gewaschen und mit dem DMEM-Medium, das 1% Rinderserum eines neugeborenen Rindes enthält, 10 ng/mL VEGF in Gegenwart oder in Abwesenheit von unterschiedlichen Konzentrationen von Peptiden inkubiert. Zwei Tage danach werden die Zellen noch einmal durch VEGF in Gegenwart oder Abwesenheit von verschiedenen Peptid-Konzentrationen stimuliert. Am 5. Tag werden die Zellen mit Trypsin behandelt und mit einem Coulter-Counter ausgezählt. Beispielsweise zeigt das Peptid P11 (cyclisch) eine starke Inhibierung der Zellen-Proliferation. Dagegen ist das lineare Peptid inaktiv (Tabelle 3).
Die Zellenmigration wird nach der von Sato und Rifkin in "J. Cell Biol.", September 1988, 107 (3): Seiten 1199–205) [17], beschriebenen Verfahren mit Modifikationen bestimmt. 100000 Endothelzellen werden in Kultivierungsbehälter von 35 mm in einem DMEM-Medium, das 10% fetales Rinderserum enthält, eingeführt. Bei der Zellenkonfluenz wird das Medium durch das DMEM-Medium ohne Serum ersetzt und man lässt die Zellen über Nacht inkubieren. Am folgenden Morgen wird eine Denudation künstlich durchgeführt in der Monoschicht mit einer sterilen Pipettenspitze. Es wird eine Serie von digitalen Fotografien aufgenommen und der Rand der Denudation wird durch eine Linie angezeigt unter Anwendung des Programms BiocomVisionL@b2000. Die Behälter werden anschließend gespült und mit 10 ng/mL VEGF in Gegenwart oder Abwesenheit eines Peptids inkubiert. Nach 18-stündiger Inkubation wird eine neue Serie von fotografischen Aufnahmen gemacht und die Bilder vor und nach Stimulation werden übereinandergelegt. Die Zellen, die sich jenseits des Denudations-Randes befinden, werden ausgezählt. Beispielsweise inhibiert das Peptid P11 (cyclisch) bei diesem Versuchs-Typ stark die Zellenmigration. Dagegen hat das lineare Peptid keine Wirkung (Tabelle 3).
Die Phosphorylierung von ERK1 (p44) und ERK2 (p42) wird bestimmt unter Anwendung des Western Blot unter Verwendung von anti p42/p44-Antikörpern (New England Biolabs). Die Kapillaren-Endothelzellen werden in DMEM, das 10% Rinderserum eines neugeborenen Rindes enthält, kultiviert. Subconfluente Kulturen werden anschließend 24 h lang von Serum befreit. Die Peptide werden in spezifischen Konzentrationen 5 min lang den Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit von 10 ng/mL VEGF wieder hinzugefügt. Die Zellen werden anschließend aus den Kultivierungsbehältern entnommen und 20 mm lang auf Eis in einem Lysis-Puffer, der 50 mM Hepes, pH 7,4, 75 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Nonidet P-40 und 0,01% SDS enthält, lysiert. Das unlösliche Material wird durch Zentrifugieren entfernt und 50 μg/mL Protein-Extrakt werden durch Elektrophorese an einem Polyacrylamid-Gel, das Natriumdodecylsulfat (SDS) enthält, unter denaturierenden Bedingungen abgetrennt. Die Proteine werden anschließend von dem Gel auf eine Nitrocellulosemembran (Amersham Pharmacia Biotech, Orsay) mittels einer Übertragungsapparatur (halbtrockene Übertragung, Bio-Rad, Ivry-sur-Seine, Frankreich) überführt. Die Membran wird anschließend mit den primären Anti-p42/p44 Antikörpern inkubiert, dann an die Peroxidase gekoppelt. Die Visualisierung wird durchgeführt unter Verwendung des Systems ECLplus (Amersham Pharmacia Biotech, Orsay). Die Ergebnisse werden quantitativ bestimmt unter Anwendung des Programms Image Quant (Molecular Dynamics).
Beispielsweise inhibiert das Peptid P11 (cyclisch) stark die Phosphorylieurng von p42/p44. Das lineare Peptid hat keinen Effekt (Tabelle 3).
Tabelle 3
Die Tabelle 3 zeigt den Effekt des Peptids P11 auf die Zellen-Proliferation und die Zellenmigration und auf die Phosphorylierung der MAP-Kinasen (p42 und p44). Die Versuche wurden wie angegeben durchgeführt. Die Inhibierung der Proliferation und der Migration ist angegeben in Werten, die 50% des biologischen Effekts inhibieren (IC 50). 50 μM Peptide wurden für die Phosphorylierungsversuche verwendet. Der Grad der Phosphorylierung wird nach der quantitativen Bestimmung der mit Autoradiographie-Filmen erhaltenen Signale abgeschätzt und die Ergebnisse sind ausgedrückt in % Inhibierung, bezogen auf das mit 10 ng/mL VEGF allein erhaltene Signal.
Die erfindungsgemäßen Cyclopeptide können für die Herstellung von Systemen zur Inhibierung oder Aktivierung der Angiogenese entweder in der löslichen Form oder in einer Form, bei der sie an geeignete Träger gekoppelt bzw. gekuppelt sind, verwendet werden.
In der 3 ist die erste Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Inhibitor-Systems dargestellt.
In dieser Figur erkennt man, dass das Cyclopeptid an einen geeigneten Träger 1 gekuppelt ist mittels eines organischen Abstandhalter-Arms 3, der eine Einheit 4 aufweisen kann, die durch ein enzymatisches System geschnitten werden kann.
Der organische Abstandhalter-Arm kann bestehen aus einer Kohlenwasser stoff-, Fluorkohlenstoff-, Polyether-, Polyethylenglycol-, Polyamin-, Polyamid-, Polyester-, Polysiloxan-Kette oder einer Kombination derselben, die an jedem Ende funktionalisiert ist, um eine kovalente Bindung einerseits mit dem Cyclopeptid und andererseits mit dem Träger 1 zu bilden.
Die Einheit 4, die durch ein in dem Abstandhalter-Arm 3 enthaltenes enzymatisches System geschnitten werden kann, kann insbesondere eine Peptid-Sequenz sein, bei der es sich um ein Substrat für die Enzyme handelt, wie z.B. die Metallproteasen der extrazellulären Matrix.
Die Anwendung dieser Einheit erlaubt somit die Freisetzung des Cyclopeptids an der gewünschten Stelle (dem gewünschten Ort), wenn es mit den geeigneten Enzymen in Kontakt kommt, wodurch es dem Cyclopeptid erlaubt wird, seine Funktion zur Inhibierung der Ligation (Bindung) des VEGF an dem Rezeptor zu erfüllen und die Angiogenese zu beherrschen (zu behandeln).
In der 3 ist ein einzelnes Cyclopeptid dargestellt, das an den Träger gebunden ist. Selbstverständlich können Träger verwendet werden, die eine große Anzahl von Cyclopeptiden aufweisen, die jeweils an den Träger gebunden sind durch einen organischen Abstandhalter-Arm, der eine solche Einheit, wie z.B. 4 enthält, oder nicht enthält.
In der 4 ist eine andere Ausführungsform der erfindungsgemäßen Systeme dargestellt, bei der man zwei Cyclopeptide verwendet zur Erzielung eines aktivierenden Effekts auf die KDR-Rezeptoren.
In diesem Falle werden zwei Cyclopeptide an einer Verbindung 6 fixiert, die ihrerseits durch einen organischen Abstandhalter-Arm 3 mit dem Träger 1 verbunden ist; dieser Arm kann ebenfalls eine Einheit 4 aufweisen, die durch ein enzymatisches System geschnitten werden kann.
Die Auswahl der organischen Verbindung, an der die beiden Cyclopeptide fixiert sind, erlaubt es, diese in einer Konfiguration anzuordnen, die geeignet ist, um die Dimerisation der Rezeptoren des Wachstumsfaktors des vasculären Endothels zu erlauben.
Der Abstand zwischen den beiden fixierten Cyclopeptiden ist somit so groß, dass dann, wenn das System mit Zellen in Kontakt gebracht wird, die Rezeptoren von VEGF exprimieren, er die Dimerisation dieser Rezeptoren erlaubt.
Der organische Abstandhalter-Arm 3 kann vom gleichen Typ sein wie derjenige der der 3 und er kann eine Einheit 4 des gleichen Typs umfassen wie derjenige der 3.
Die organische Verbindung 6 kann bestehen aus alternierenden hydrophilen-hydrophoben Sequenzen vom Polyethylenglycol/Alkan- oder -Fluoralkan-Typ, um eine geeignete Anordnung der beiden Cyclopeptide zu ermöglichen. Die Fixierung jedes Cyclopeptids an dieser Verbindung führt zu einer Einführung von Amin- oder Carbonsäure-Funktionen in die Seitenketten des Cyclopeptids oder von Funktion vom Acryl-Typ.
Der bei den verschiedenen Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Systeme verwendete Träger 1 kann in Form eines Feststoffes oder in Form eines Gels vorliegen. Es kann sich dabei handeln um einen organischen oder anorganischen Feststoff.
Vorzugsweise ist der Träger ein biokompatibles, biologisch abbaubares oder nicht biologisch abbaubares organisches Polymer. In diesem Fall kann die Fixierung des organischen Abstandhalter-Arms an diesem Polymer auf chemischem Wege oder auf radiochemischem Wege erfolgen. In diesem Fall unterwirft man den Träger aus einem organischen Polymer einer Bestrahlung unter Verwendung von ionisierender Strahlung, Plasmastrahlung oder Photonenstrahlung in den definierten Zonen des Trägers, die den Abstandhalter-Arm aufnehmen müssen, und man pfropft anschließend auf diese Zonen den organischen Abstandhalter-Arm auf entweder direkt oder unter Vermittlung eines Monomers, das auf radikalischem Wege (Radioaufpfropfung) polymerisierbar ist, das beispielsweise Amin- oder Carbonsäure-Funktionen aufweist.
Die Kopplung (Kupplung) mit dem radiologisch aufgepfropften Polymer oder nicht, erfolgt beispielsweise durch Erzeugung von Amid-Bindungen entweder zwischen den Carbonsäure-Funktionen und den in das Ende der Abstandhalter-Arme eingeführten Amin-Funktionen oder zwischen den Amin-Funktionen des Trägers und den in das Ende der Abstandhalter-Arme eingeführten Carbonsäure-Funktionen.
Die folgenden Beispiele erläutern die Herstellung solcher Systeme.
Beispiel 1: Herstellung eines Systems, das zwei Cyclopeptide umfasst, die auf kovalente Weise durch eine organische Verbindung miteinander verbunden sind
Man geht aus von einer organischen Verbindung, die drei funktionelle Gruppen aufweist, von denen eine geschützt ist.
Die organische Verbindung hat die Formel: HOOCCH₂CH₂O(CH₂CH₂O)₅(CH₂)₃NH(CH₂CH₂O)₅CH₂CH₂COOH (Verbindung 1)
Der Abstandhalter-Arm ist an der NH-Gruppe dieser Verbindung fixiert und er entspricht der Formel: CH₂=CH-CO-NH-(CH₂)₅-CO-P-CO (Verbindung 2)in der P steht für das Peptid, bei dem es sich um ein Substrat für Metallprotease der extrazellularen Matrix handelt.
Man stellt die organische Verbindung 1 her, indem man die folgenden Stufen durchführt.
Stufe Nr. 1: Kondensation von Hexaethylenqlycol an tert-Butylacrylat
Zur Durchführung dieser Stufe folgt man der Arbeitsweise, wie sie von O. Seitz, H. Kunz in "J. Org. Chem.", 62, 813 (1997) [12], beschrieben worden ist:
In einen Dreihalskolben führt man wasserfreies THF mit Hexaethylenglycol ein, alles unter Stickstoff und unter Rühren. Dann gibt man Na zu, das man sich auflösen lässt. Dann gibt man das tert-Butylacrylat zu. Man rührt 20 h lang bei Umgebungstemperatur. Dann gibt man 1 N HCl zu, um die Lösung zu neutralisieren. Man verdampft das THF unter vermindertem Druck, dann gießt man die Lösung in eine gesättigte Kochsalzlösung. Die Lösung wird dann dreimal mit Ethylacetat extrahiert. Die Gesamtheit der organischen Phasen wird erneut in die gesättigte Kochsalzlösung eingeführt. Man trennt die organische Phase ab und verdampft das Ethylacetat. Man gewinnt das rohe Produkt (Verbindung 3) in einer Ausbeute von 96%.
Stufe Nr. 2: Funktionalisierung des anderen Endes der Verbindung 3 durch Azidbildung – a) Tosylierung nach der Arbeitsweise, wie sie von D. S. Wlibur et al. in "Bioconjugate Chem.", 9, 813 (1998) [13], beschrieben wird:
In einen Zweilhalskolben führt man Pyridin und die Ausgangsverbindung 3 ein. Das Ganze wird bei 0°C unter N₂ gesetzt. Dann gibt man TsCl zu. Nach 15-stündiger Reaktion wird die Lösung in Eis gegossen und 3 mal mit CH₂Cl₂ extrahiert. Die organische Phase wird mit einer 2%igen Essigsäure-Lösung, dann mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wird anschließend abgetrennt, über MgSO₄ getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Das Produkt wird durch Aufgeben auf eine Siliciumdioxid-Kolonne (70/230) unter Verwendung von 100%igem E thylacetat als Eluierungsmittel gereinigt. Das Produkt (die Verbindung 4) wird in einer Ausbeute von 65% gewonnen.
– b) Azid-Bildung unter Anwendung der Verfahrensweise, wie sie von K. D. Reynolds in "Bioconjugate Chem.", 10, 1021–1031 (1999) [14] beschrieben wird:
In einen Zweihalskolben gibt man die Verbindung 4 mit DMF unter N₂ ein und dann gibt man NaN₃ zu. Das Ganze wird 20 h lang gerührt, dabei wird die Lösung opak (undurchsichtig). Die Lösung wird über eine Fritte passiert, dann wird das DMF zusammen mit Toluol gleichzeitig verdampft. Man erhält einen weißen Niederschlag, den man mit Ether verdünnt. Die Lösung wird erneut über eine Fritte passiert und der Ether verdampft.
Man erhält dann die Verbindung 5 in einer Ausbeute von 95%.
Stufe Nr. 3: Funktionalisierung des anderen Endes der Verbindung 3 durch Allylierung
Die Allylierung wird durchgeführt durch nucleophile Substitution von handelsüblichem Allylbromid durch das Natriumsalz von Hexaethylenglycol. Das dabei erhaltene Derivat
wird anschließend durch Chromatographie an einer Siliciumdioxid-Kolonne mit einer Ausbeute von 50% isoliert.
Die Synthese wird in THF durchgeführt.
Stufe Nr. 4: Hydroborierung
Sie wird nach dem von Carboni et al. in "J. Org. Chem.", 1993, 58, 3736–3741 [15], beschriebenen Verfahren durchgeführt, wobei man die Verbindung 5 mit der Verbindung 6, der Dichlorboran zugesetzt worden ist, reagieren lässt. Man erhält so die Verbindung 7. tBuOOCCH₂CH₂O(CH₂CH₂O)₅CH₂CH₂CH₂HN(CH₂CH₂O)₅CH₂CH₂-COOtBu (Verbindung 7)
Stufe Nr. 5: Schutz des Stickstoffs
Die Verbindung 7 wird mit FmocOSu behandelt nach dem Verfahren, wie es beispielsweise von Chetyrkina et al. in "Tetrahedron Letters 2000", 41, 1923–1926 [16], angewendet wurde.
Man erhält die Verbindung 8
Stufe Nr. 6: Entfernung der Schutzgruppe aus den tert-Butyloxycarbonyl-Gruppen
In einen Zweihalskolben führt man die Verbindung 8 ein, der Anisol und dann TFA zugesetzt wird. Man rührt 1 1/2 h lang bei 25°C, dann verdampft man das TFA unter vermindertem Druck. Das Rohprodukt wird dann über eine Siliciumdioxid-Kolonne (70/230) laufen gelassen unter Verwendung von CH₂Cl₂/MeOH (95/5) und dann von CH₂Cl₂/MeOH (90/10) als Eluierungsmittel. Man erhält die reine Verbindung 9 in einer Ausbeute von 65%.
Man fixiert die Cyclopeptide P23 an den beiden funktionellen Gruppen (COOH) der Verbindung 9, wobei man auf die nachstehend beschriebene Weise vorgeht.
Man bringt die Verbindung 9 in THF in Lösung und aktiviert sie unter Verwendung von N, N-Dimethylpropyl-ethylcarbodiimid.
Dann gibt man eine Menge zu, die 1 Mol-Äquivalent jedes Cyclopeptids entspricht, und lässt das Medium 12 h lang bei Umgebungstemperatur stehen, dann lyophilisiert man. Man nimmt das Lyophilisat in Chloroform wieder auf, eliminiert den Harnstoff, der sich gebildet hat, durch Filtration und dampft das Filtrat unter vermindertem Druck ein.
Man charakterisiert das erhaltene Produkt durch Infrarotspektrometrie mit einer Fourier-Transformation, durch Protonen-NMR und Massenspektrometrie. Es entspricht dem gesuchten Produkt.
Um die Fixierung dieses Produkts an einem Träger sicherzustellen, fixiert man zunächst an der NH-Gruppe der organischen Verbindung einen Abstandhalter-Arm, der eine polymerisierbare Funktion trägt. Man arbeitet auf die folgende Weise.
Entfernung der Schutzgruppe aus der NH-Gruppe
Zunächst führt man die Entfernung der Schutzgruppe aus der NH-Gruppe der Verbindung 9 durch durch Behandlung mit Piperidin.
Darüber hinaus stellt man den Abstandhalter-Arm her, indem man die folgende Reaktion durchführt:
In einem Dreihals-Kolben führt man das Salz und Wasser und danach die Aminosäure H₂N (CH₂)₅-COOH ein; Das Ganze wird auf 0°C abgekühlt. Unter starkem Rühren gibt man das Acrylsäurechlorid in einer Menge von etwa 3 ml pro min zu.
Man rührt 10 min lang bei Umgebungstemperatur, dann passiert man die Lösung über eine Fritte. Der Kolben wird wieder auf 0°C gebracht und stark gerührt. Man gibt dann konzentrierte HCl zu, um einen pH-Wert von 2 zu erreichen. Dies führt zu einer Ausfällung des Produkts. Die Mischung wird dann filtriert und das getrocknete Produkt (Verbindung 10) ist rein. Die Ausbeute beträgt 75%.
Kondensation der Verbindung 10
Man kodensiert die Verbindung 10 an das Peptid P, das ein Substrat für die Metallprotease der extrazellulären Matrix ist, in der letzten Stufe ihrer Synthese in fester Phase, dann wird das Ganze von dem Harz abgetrennt, ohne dass eine Entfernung der Schutzgruppen an den Seitenketten durchgeführt wird.
Das erhaltene Molekül wird dann dank des Dicyclohexylcarbodiimids an die von Schutzgruppen befreite Verbindung 9 ankondensiert. Dann werden die Schutzgruppen aus den Seitenketten des Peptids des Abstandhalter-Arms entfernt, dann wird der Arm an einem Träger aus einem Polymer mittels der Acryl-Funktionen des Armes fixiert.
Als Träger verwendet man einen industriellen Film aus Ethylenpolyterephthalat (PTE) mit einer Dicke von 25 μm und man extrahiert ihn mit Toluol unter Rückfluss bei einer Temperatur bei 110°C 12 h lang in einer Soxhlet-Apparatur, um alle Spuren von organischem Monomer zu entfernen.
Anschließend legt man auf den Polymerfilm ein Metallgitter aus Nickel oder aus Kupfer mit einer Dicke von 50 μm, das von kreisförmigen Löchern mit einem Durchmesser von 5 bis 10 μm durchbohrt ist, die über die gesamte Oberfläche regelmäßig verteilt sind in einem Abstand von etwa 100 μm voneinander. Das Gitter wurde hergestellt durch Elektroformen, um eine vollkommene Reproduzierbarkeit und eine sehr hohe Präzision in der Größenordnung von μm zu gewährleisten.
Anschließend wird der Polymerfilm bestrahlt unter Verwendung von Elektronenstrahlung, um nur die den Löchern des Gitters entsprechenden Zonen zu bestrahlen. Das Elektronenstrahlenbündel weist die folgenden Charakteristika auf:

– Energie Ep = 2,5 MeV,
– maximale Intensität I_max = 1 μA,
– maximale Dosis = 500 kGy.

Die Bestrahlung wird in einer Sauerstoff enthaltenden Atmosphäre durchgeführt.
Nach der Bestrahlung entfernt man das Gitter von dem Polymerfilm und bringt den bestrahlten Polymerfilm mit der organischen Verbindung in Kontakt, an der die beiden Cyclopeptide fixiert sind, um diese Verbindung mittels des Abstandhalter-Arms auf den Polymerfilm aufzupfropfen. Diese Fixierung wird durchgeführt, indem man den Film mit einer 10^–2 M Lösung der vorher erhaltenen organischen Verbindung in Acetonitril in Kontakt bringt, wobei man bei 40°C arbeitet.
Auf diese Weise wird die organische Verbindung mittels der Acryl-Funktionen des Abstandhalter-Arms auf die bestrahlen Zonen des Polymerfilms aufgepfropft.
Das Endprodukt wird durch FT-IR-Spektrometrie und durch XPS-Spektrometrie charakterisiert.
Beispiel 2: Herstellung eines Systems, das zwei Cyclopeptide umfasst
In diesem Beispiel wird die Arbeitsweise des vorhergehenden Beispiels angewendet, um zwei Cyclopeptide P23 auf zwei Funktionen der beschriebenen organischen Verbindung, die oben verwendet worden ist, miteinander zu kuppeln.
Zur Durchführung der Kupplung überführt man die organische Verbindung in eine Lösung in Chloroform und aktiviert sie mit Dicyclohexylcarbodiimid DCCl, dann gibt man eine Menge jedes Cyclopeptids zu, die 1 Äquivalent entspricht, und hält das Reaktionsmedium 12 h lang bei 4°C. Man eliminiert den Dicyclohexyl-Harnstoff-Niederschlag durch Abfiltrieren, dann dampft man das Filtrat unter vermindertem Druck ein.
Man charakterisiert das erhaltene Produkt durch Infrarotspektrometrie mit einer Fourier-Transformation, durch Protonen-NMR und durch Massenspektrometrie, wie weiter oben angegeben.
Anschließend fixiert man an der NH-Gruppe der organischen Verbindung einen Abstandhalter-Arm wie in Beispiel 1.
Dann fixiert man das Ganze auf einem Träger, der besteht aus einem industriellen Film aus Poly(vinylidenfluorid/hexafluoropropylen) PVDF-HFP mit einer Dicke von 25 μm. Zur Eliminierung jeder Spur von organischem Monomer unterwirft man den Film vorher einer Extraktion in Dichlormethan unter Rückfluss bei einer Temperatur von 40°C 12 h lang in einer Soxhlet-Apparatur.
Anschließend wird der Film an der Luft mit schnellen schweren Ionen bestrahlt. Die verwendeten Ionen sind Sauerstoffionen, die eine Primärenergie E_p von etwa 10 MeV/uma aufweisen bei Fluenzen zwischen 10⁷ und 10⁹ Ionen/cm² und bei Intensitäten in der Größenordnung von 10² bis 5·10² nA. Man wählt ein Regime mit geringer Fluenz aus, sodass keine Bedeckung der latenten Spuren bzw. Streifen erfolgt.
Dieses Regime wird direkt bestimmt durch die Parameter der Bestrahlung (Atomzahl des Ions, Primärenergie, Fluenz). In diesem Falle erlaubt die statistische Verteilung der aktiven Zentren in der durch die Bestrahlung (Emergenz der latenten Spuren bzw. Streifen) erzeugten gestörten Zone die radiologische Aufpfropfung von mindestens zwei organischen Abstandhalter-Armen, die jeweils ein Cyclopeptid tragen, wobei der Abstand zwischen den Verankerungspunkten so festgelegt wird, dass der Abstand d zwischen zwei Cyclopeptiden die Dimerisation der Rezeptoren des VEGF begünstigt.
Die bestrahlen Zonen werden zum Aufpfropfen verwendet aufgrund der freien Radikale, die entlang der latenten Spur (Streifen) des Ions erzeugt werden, und aufgrund der Emergenz derselben an der Oberfläche des Polymerfilms der organischen Abstandhalter-Arme, welche die erhaltenen Cyclopeptide tragen, wie dies weiter oben beschrieben worden ist, durch Reaktion ihrer Funktionen vom Acryl-Typ mit dem bestrahlten Träger.
Diese Kupplung wird durchgeführt durch Erwärmen des bestrahlten Films auf 40°C, der mit einer 10^–3 M Lösung der organischen Abstandhalter-Arme der Cyclopeptide in Tetrahydrofuran in Kontakt gebracht worden ist.
Die Schlussverbindung wird durch FT-IR-Spektrometrie und XPS-Spektrometrie charakterisiert.
Genannte Literaturhinweise

[1]: Ferrara et al. "Nature Medicine", Band 5, Nr. 12, Dezember 1999, Seiten 1361–1364.
[2]: Hagedorn und Bikfalvi, "Critical Reviews in Oncology/Hematology", 34, 2000, Seiten 89–110.
[3]: Y. A. Muller, "Structure", 1997, 5, Nr. 10, Seiten 1325–1338.
[4]: Presta et al. "Cancer Research", 57, 1997, Seiten 4593–4599.
[5]: Ortega et al., "Am. J. Pathol.", November 1997, 151 (5), Seiten 1215–1224.
[6]: Piossek et al. "The Journal of Biological Chemistry", Band 274, Nr. 9, 1999, Seiten 5612–5619.
[7]: Fairbrother et al. "Biochemistry" 37, 1998, Seiten 17754–17764.
[8]: US-A-5 939 383
[9]: Bekele et al. "J. Org. Chem.", 62, 1997, Seiten 2259–2262.
[10]: Binétruy-Tournaire et al. "EMBO Journal", 19, (7), 2000, Seiten 1525–1533.
[11]: Jonca et al., "J. Biol. Chem.", 1997, 272, Seite 24203.
[12]: O. Seitz, H. Kunz "J. Org. Chem.", 62, 813 (1997).
[13]: Wilbur et al., "Bioconjugate Chem.", 9, 813 (1998).
[14]: J. K. D. Reynolds, "Bioconjugate Chem.", 10, 1021–31 (1999).
[15]: Carboni et al. "J. Org. Chem.", 1993, 58, Seiten 3736–3741.
[16]: Chetyrkina et al. "Tetrahedron Letters", 2000, 41, Seiten 1923–1926.
[17]: Sato et Rifkin "J. Cell Biol.", Sept. 1988, 107 (3): 1199–205).

Tabelle 1
Tabelle 2
Sequenzliste

Claims

Cyclopeptid, ausgewählt aus den folgenden Verbindungen: P11: Cyclo(DPhe-Pro-Gln-Ile-Met-Arg-Ile-Lys-Pro-His-Gln-Gly-Gln-His-Ile-Gly-Glu) SEQ ID Nr. 5 P16: Cyclo(Arg-Ile-Lys-Pro-His-Gln-Gly) SEQ ID Nr. 8 Cyclo(Pro-Arg-Ile-Lys-Pro-His-Gln-Gly) SEQ ID Nr. 9 Cyclo(Gln-Ile-Met-Arg-Ile-Lys-Pro-His-Gln-Gly-Gln-His-Ile-Gly-Glu) SEQ ID Nr. 10 Cyclo(DPhe-Pro-Gln-Ile-Met-Arg-Ile-Lys-Pro-His-Gln-Gly-Gln-His-Ile-Gly) SEQ ID Nr. 11 Cyclo(DTyr-Pro-Arg-Ile-Lys-Pro-His-Gln) SEQ ID Nr. 13 Cyclo(Gly-Arg-Ile-Lys-Pro-His) SEQ ID Nr. 25.
Pharmazeutische Zusammensetzung zum Hemmen (Verhindern) der Angiogenese, die ein Cyclopeptid umfasst, das ausgewählt ist aus den folgenden Cyclopeptiden: P11: Cyclo(DPhe-Pro-Gln-Ile-Met-Arg-Ile-Lys-Pro-His-Gln-Gly-Gln-His-Ile-Gly-Glu) SEQ ID Nr: 5 Cyclo(Arg-Ile-Lys-Pro-His-Gln-Gly) SEQ ID Nr: 8 Cyclo(Pro-Arg-Ile-Lys-Pro-His-Gln-Gly) SEQ ID Nr: 9 Cyclo(Gln-Ile-Met-Arg-Ile-Lys-Pro-His-Gln-Gly-Gln-His-Ile-Gly-Glu) SEQ ID Nr: 10 Cyclo(DPhe-Pro-Gln-Ile-Met-Arg-Ile-Lys-Pro-His-Gln-Gly-Gln-His-Ile-Gly) SEQ ID Nr. 11 Cyclo(DTyr-Pro-Arg-Ile-Lys-Pro-His-Gln) SEQ ID Nr. 13 Cyclo(Gly-Arg-Ile-Lys-Pro-His) SEQ ID Nr. 25.
Pharmazeutische Zusammensetzung zum Aktivieren der Angiogenese, die zwei identische oder unterschiedliche Cyclopeptide umfasst, die mit einer pharmazeutisch akzeptablen organischen Verbindung gekoppelt sind, wobei die Cyclopeptide ausgewählt sind aus den folgenden Cyclopeptiden: P11: Cyclo(DPhe-Pro-Gln-Ile-Met-Arg-Ile-Lys-Pro-His-Gln-Gly-Gln-His-Ile-Gly-Glu) SEQ ID Nr. 5 Cyclo(Arg-Ile-Lys-Pro-His-Gln-Gly) SEQ ID Nr. 8 Cyclo(Pro-Arg-Ile-Lys-Pro-His-Gln-Gly) SEQ ID Nr. 9 Cyclo(Gln-Ile-Met-Arg-Ile-Lys-Pro-His-Gln-Gly-Gln-His-Ile-Gly-Glu) SEQ ID Nr. 10 Cyclo(DPhe-Pro-Gln-Ile-Met-Arg-Ile-Lys-Pro-His-Gln-Gly-Gln-His-Ile-Gly) SEQ ID Nr. 11 Cyclo(DTyr-Pro-Arg-Ile-Lys-Pro-His-Gln) SEQ ID Nr. 13 Cyclo(Gly-Arg-Ile-Lys-Pro-His) SEQ ID Nr. 25.
System, das ein Cyclopeptid nach Anspruch 1 umfasst, das an einen organischen Abstandhalter-Arm kovalent gebunden ist.
System nach Anspruch 4, in dem der organische Abstandhalter-Arm kovalent an einen Träger gebunden ist.
System, das zwei Cyclopeptide nach Anspruch 1 umfasst, die an eine organische Verbindung kovalent gebunden sind.
System nach Anspruch 6, in dem der Abstand zwischen den beiden Cyclopeptiden derart ist, dass dann, wenn das System mit Zellen in Kontakt gebracht wird, welche die Rezeptoren des Wachstumsfaktors des Gefäßendothels (VEGF) exprimieren, der Abstand die Dimerisation dieser Rezeptoren ermöglicht.
System nach einem der Ansprüche 6 und 7, in dem die organische Verbindung mittels eines organischen Abstandhalter-Arms kovalent an einen Träger gebunden ist.
System, das einen festen Träger umfasst, an dem Cyclopeptide nach Anspruch 1 durch eine kovalente Bindung fixiert sind, wobei jedes der Cyclopeptide mittels eines organischen Abstandhalter-Arms an den Träger gebunden ist.
System nach einem der Ansprüche 4, 5, 8 und 9, in dem der Abstandhalter-Arm eine Kohlenwasserstoff-, Fluorkohlenstoff-, Polyether-, Polyethylenglycol-, Polyamin-, Polyamid-, Polyester-, Polysiloxan-Kette oder eine Kombination derselben umfasst, die an jedem Ende funktionalisiert ist (eine funktionelle Gruppe aufweist), um eine kovalente Bindung auszubilden einerseits gegenüber dem Cyclopeptid und andererseits gegenüber dem Träger.
System nach einem der Ansprüche 4 bis 10, in dem der organische Abstandhalter-Arm außerdem eine wiederkehrende Einheit umfasst, die durch ein enzymatisches System geschnitten werden kann.
System nach Anspruch 11, in dem der organische Abstandhalter-Arm außerdem eine bioaktive Verbindung umfasst.
System nach einem der Ansprüche 5, 8 und 9, in dem der Träger ein organischer oder anorganischer Feststoff ist.
System nach einem der Ansprüche 5, 8 und 9, in dem der Träger ein organisches Polymer in Form eines Feststoffes oder in Form eines Gels ist.
System nach Anspruch 14, in dem das organische Polymer ein biokompatibles, biologisch abbaubares oder nicht abbaubares Polymer ist.
System nach Anspruch 15, in dem das organische Polymer ausgewählt ist aus der Gruppe Ethylenpolyterephthalat, der Copolymeren von Vinylidenfluorid und Hexafluorpropylen, der Polyvinylalkohole, der Polyhydroxyethylmethacrylate, der Polysacharide und ihren Copolymeren.
System nach einem der Ansprüche 4 und 5 zum Hemmen (Verhindern) der Angiogenese.
System nach einem der Ansprüche 6 bis 8 zum Aktivieren der Angiogenese.
Verfahren zur Herstellung eines Systems nach einem der Ansprüche 14 bis 16, das darin besteht, dass man einen Träger aus einem organischen Polymer auf definierten Zonen des Trägers mit ionisierenden Strahlen, Plasmastrahlen oder Photonenstrahlen bestrahlt und anschließend auf diese Zonen des Trägers den organischen Abstandhalter-Arm aufpfropft.
Verfahren nach Anspruch 19, bei dem man die Bestrahlung durch eine Maske hindurch durchführt.
Verfahren nach Anspruch 19, bei dem die ionisierenden Strahlen ein Bündel von Elektronen oder schnellen schweren Ionen darstellen.
Verfahren nach Anspruch 19, bei dem die Cyclopeptide vor dem Aufpfropfen an den organischen Abstandhalter-Armen fixiert werden.
Verfahren nach Anspruch 19, das außerdem eine Stufe umfasst, in der die Polypeptide an den organischen Abstandhalter-Armen fixiert werden, nachdem diese aufgepfropft worden sind.