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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf natürlich vorkommende und rekombinante
Nucleinsäuren, die
von Bacillus thuringiensis Cry8-artigen Genen erhalten werden, die
für δ-Endotoxine
codieren, die durch pestizide Aktivität gegen Schädlinge der Art Coleopteran
gekennzeichnet sind. Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung
verwenden die offenbarte Nucleinsäuren und ihre codierten pestiziden
Polypeptide, um Pflanzenschädlinge
zu bekämpfen.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Insektenschädlinge sind
ein Hauptfaktor beim Verlust der landwirtschaftlichen Nutzpflanzen
in der Welt. Ein mit Insektenschädlingen
in Verbindung stehender Nutzpflanzenverlust hat allein durch Corn
Rootworm (Maiswurzelbohrer) eine Milliarde Dollar pro Jahr erreicht.
Beispielsweise kann Corn Rootworm-Fraß für landwirtschaftliche Erzeuger
wirtschaftlich vernichtend sein. Der Western Corn Rootworm (Diabrotica
virgifera) ist ein Hauptinsektenschädling von Korn oder Mais in
vielen Regionen der Welt. Während
der Southern Corn Rootworm ein weniger wichtiger Schädling als
der Western Corn Rootworm ist, kann er gelegentlich beachtliche
wirtschaftliche Schäden
an Mais verursachen. Eine Schädigung
durch Western und Southern Corn Rootworm kann in einem verstärkten Niederlegen,
einer verringerten Trockentoleranz und schließlich in Verringerungen des
Nutzpflanzenertrags resultieren.
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Traditionell
sind die primären
Verfahren zur Bekämpfung
von Corn Rootworm-Populationen
Fruchtfolge und die Anwendung von chemischen Breitbandinsektidizen.
Einige Species von Schädlingen
haben unglücklicherweise
Resistenz gegen die chemischen Insektizide entwickelt. Darüber hinaus
befassen sich Verbraucher wie auch Regulierungsbehörden zunehmend
mit den Umweltgefahren, die mit der Produktion und Verwendung von
synthetischen chemischen Pestiziden verbunden sind. Wegen solcher
Probleme haben Regulierungsbehörden
die Verwendung von einigen der gefährlicheren Pestizide verboten
oder begrenzt. Somit besteht ein wesentliches Interesse an der Entwicklung
alternativer Pestizide.
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Die
biologische Bekämpfung
bzw. Kontrolle von Insektenschädlingen
mit landwirtschaftlicher Bedeutung unter Verwendung eines mikrobiellen
Agenses, z.B. Fungi, Bakterien oder andere Insektenspecies, bietet eine
umweltfreundliche und wirtschaftlich attraktive Alternative. Allgemein
gesprochen, die Verwendung von Biopestiziden weist ein niedrigeres
Belastungsrisiko und geringere Umweltgefahren auf, und sie stellen
größere Targetspezifität bereit
als es für
traditionelle chemische Breitbandinsektizide charakteristisch ist.
Außerdem sind
Biopestizide oft mit geringeren Kosten zu produzieren und verbessern
demnach den wirtschaftlichen Ertrag für eine weite Vielzahl von Nutzpflanzen.
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Von
bestimmten Mikroorganismusspecies der Gattung Bacillus ist bekannt,
dass sie pestizide Aktivität gegen
einen weiten Bereich von Insektenschädlingen, einschließlich Lepidoptera,
Diptera, Coleoptera, Hemiptera und andere, aufweisen. Bacillus thuringiensis
und Bacillus papilliae gehören
zu den erfolgreichsten Biokontrollagenzien, die bis heute entdeckt
wurden. Insektenpathogenität
wurde auch Stämmen
von: B. larvae, B. lentimorbus, B. papilliae, B. sphaericus, B.
thuringiensis zugeschrieben (Harwook, Hrsg. ((1989) Bacillus Plenum
Press), 306) und B. cereus (WO 96/10083). Pestizide Aktivität scheint
in parasporalen kristallinen Proteineinschlüssen konzentriert zu sein,
und es wurden mehrere Gene, die für diese pestiziden Proteine
codieren, isoliert und charakterisiert (siehe z.B. US-Patent Nr.
5,366,892).
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Mikrobielle
Insektizide, insbesondere solche, die von Bacillus-Stämmen erhalten
wurden, spielten in der Landwirtschaft als Alternative zur chemischen
Schädlingsbekämpfung eine
wichtige Rolle. Vor kurzem haben landwirtschaftliche Wissenschaftlicher
Nutzpflanzen mit erhöhter
Insektenresistenz entwickelt, indem sie Nutzpflanzen gentechnisch
veränderten,
so dass sie pestizide Proteine aus Bacillus produzieren (siehe US-Patent
Nr. 5,554,534 und WO 93/15206, die sich auf die Bekämpfung von
Scarab-Schädlingen
auf diese Weise beziehen). Mais- und Baumwollpflanzen, die genetisch
verändert
wurden, um pestizide Proteine zu produzieren, die aus Stämmen von
B. thuringiensis isoliert wurden, bekannt als δ-Endotoxine oder Cry-Toxine, werden
jetzt in der amerikanischen Landwirtschaft in großem Umfang
verwendet und haben die Landwirte mit einer umweltfreundlichen Alternative
zu traditionellen Insektenbekämpfungsverfahren
ausgestattet. Außerdem wurden
Kartoffeln, die genetisch verändert
wurden, so dass sie pestizide Cry-Toxine enthalten, an den amerikanischen
Landwirt verkauft. Obgleich sich diese genetisch veränderten,
Insekten-resistenten Nutzpflanzen als wirtschaftlich sehr erfolgreich
erwiesen haben, stellen sie nur gegen einen engen Bereich der wirtschaftlich wichtigen
Insektenschädlinge
Resistenz bereit. Einige Insekten, z.B. Western Corn Rootworm (Diaprotica
virgifera, Westlicher Maiswurzelbohrer), haben sich als gegen über einer
Behandlung resistent erwiesen und der Level der Bt-Toxinresistenz
ist bei früher
empfindlichen Populationen einiger wichtiger Insektenschädlinge im Ansteigen
begriffen.
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Obgleich
zahlreiche Forscher versucht haben, mutante Endotoxinproteine mit
verbesserter insektizider Aktivität herzustellen, waren nur wenige
erfolgreich. In der Tat wird von den meisten der genetisch veränderten
B. thuringiensis-Toxine, die in der Literatur beschrieben wurden,
eine Endotoxinaktivität
beschrieben, die nicht besser ist als die des Wildtyp-Proteins, und in
vielen Fällen
ist die Aktivität
vermindert oder sogar zerstört.
Demnach werden neue mikrobielle Insektizide, die eine veränderte Spezifität und/oder
verbesserte pestizide Aktivität
haben, zur Verwendung in Schädlingsregulierungstrategien
gewünscht.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Es
werden Zusammensetzungen und Verfahren zur Bekämpfung von Pflanzenschädlingen,
insbesondere von Coleopteran-Insektenschädlingen, bereitgestellt. Spezifischer
bezieht sich die Erfindung auf Verfahren der Bekämpfung von Insekten, wobei
Nucleinsäuren
verwendet werden, die von δ-Endotoxingenen
stammen, um transformierte Mikroorganismen und Pflanzen zu produzieren,
die ein pestizides Polypeptid der Erfindung exprimieren. Die Zusammensetzungen
und Verfahren der Erfindung finden in der Landwirtschaft zur Bekämpfung von
Schädlingen
von Nutzpflanzen Verwendung.
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Die
Erfindung stellt Nucleinsäuren
und Fragmente und Varianten davon bereit, die für Polypeptide codieren, die
pestizide Aktivität
gegen Schädlinge
der Art Coleoptera besitzen. Die Wildtyp- (z.B. natürlich vorkommende)
Nucleotidsequenzen der Erfindung, die aus Stämmen von Bacillus thuringiensis
erhalten werden, codieren für
Cry-8-artige δ-Endotoxine.
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Die
Erfindung stellt ferner Fragmente und Varianten von Cry-8-artigen
Nucleotidsequenzen bereit, die für
biologisch aktive (z.B. pestizide) Polypeptide codieren. In besonderen
Ausführungsformen
codieren die offenbarten Nucleotidsequenzen für Polypeptide, die für wenigstens
ein Insektizid, das zu der Art Coleopteran gehört (z.B. Kartoffelkäfer, Southern
Corn Rootworm und Western Corn Rootworm), pestizid sind.
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Andere
Ausführungsformen
der Erfindung stellen eine Nucleinsäure bereit, die für verkürzte Versionen eines
Cry8-Endotoxins codiert, die durch pestizide Aktivität gekennzeichnet
sind, die entweder der Aktivität
des entsprechenden Volllängenendotoxins äquivalent
oder gegenüber
dieser verbessert ist. Einige der verkürzten Nucleinsäuren der
Erfindung können
als Fragmente oder Varianten bezeichnet werden. In bestimmten Ausführungsformen
sind einige der Nucleinsäure-Fragmente/Varianten
der Erfindung am 3'-Ende
einer codierenden Wildtypsequenz verkürzt; in alternativen Ausführungsformen
umfassen andere Nucleinsäuren
der Erfindung eine fortlaufende Sequenz von Nucleinsäureresten,
die von einer anderen codierenden Sequenz der Erfindung stammen,
die sowohl am 5'-Ende
als auch am 3'-Ende
verkürzt
wurden.
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Die
Erfindung stellt auch rekombinante Cry8-artige Nucleinsäuren bereit,
die mutagenisierte Nucleinsäuresequenz-Varianten
umfassen, die für
B. thuringiensis-Endotoxine codieren, die gentechnisch so modifiziert
wurden, dass sie verbesserte und/oder veränderte pestizide Aktivitäten haben.
Spezifischer ausgedrückt, die
Erfindung stellt mutagenisierte Nucleinsäuren bereit, die für pestizide
Polypeptide codieren, die eine zusätzliche oder eine alternative
Protease-empfindliche Stelle umfassen, die in Domäne 1 der
Polypeptidvariante in einer Region lokalisiert ist, die zwischen α-Helices
3 und 4 des codierten Polypeptids lokalisiert ist.
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Wie
hierin demonstriert wurde, kann das Vorliegen einer zusätzlichen
und/oder alternativen Protease-empfindlichen Stelle in der Aminosäuresequenz
des codierten Polypeptids die pestizide Aktivität und/oder Spezifität des varianten
Polypeptids verbessern, das durch die Nucleinsäure-Varianten der Erfindung
codiert wird. Dementsprechend können
die Cry8-Nucleotidsequenzen
der Erfindung rekombinant verändert
oder manipuliert werden, um Endotoxine zu produzieren, die eine
verbesserte oder veränderte
Aktivität
und/oder Spezifität
im Vergleich zu der eines unmodifizierten Wildtyp-δ-Endotoxins
haben.
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Beispielsweise
stellt ein Typ einer varianten Nucleinsäure (z.B. mutagenisierte Cry8-artige Nucleotidsequenz),
die hierin offenbart ist, zusätzliche
Mutanten bereit, die zusätzliche
Codons umfassen, welche eine zweite Trypsin-empfindliche Aminosäuresequenz
(zusätzlich
zu der natürlich
vorkommenden Trypsinstelle) in ihr codiertes Polypeptid einführen. Eine
alternative Additionsvariante der Erfindung umfasst zusätzliche
Codons, die so konzipiert sind, dass sie eine Chymotrypsin-empfindliche
Stelle einführen,
die unmittelbar 5' der natürlich vorkommenden
Trypsinstelle lokalisiert ist.
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Ein
zweiter alternativer Typ an varianter Nucleinsäure der Erfindung stellt Substitutionsmutanten
bereit, in denen wenigstens ein Codon der Nucleinsäure, die
für die
natürlich
auftretende Protease-empfindliche Stelle codiert, zerstört wird,
und alternative Codons werden in die Varianten-Nucleinsäuresequenz
eingeführt, um
eine andere (z.B. Ersatz-)Protease-empfindliche Stelle an ihre Stelle einzuführen. In
einer bestimmten Ausführungsform
dieses varianten Polypeptids wird eine Ersatzmutante offenbart,
in der die natürlich
auftretende Trypsinspaltstelle, die in dem codierten Polypeptid
vorliegt, zerstört
ist und eine Chymotrypsinspaltstelle an ihrer Stelle eingeführt ist.
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Es
ist zu erkennen, dass eine der offenbarten Mutationen in einer beliebigen
Polynucleotidsequenz der Erfindung durchgeführt werden kann, die die Aminosäurereste
umfasst, die die Trypsinspaltstelle bereitstellen, die Ziel für die Modifikation
ist. Dementsprechend können
Varianten entweder von Volllängenendotoxinen
oder Fragmenten davon so modifiziert werden, dass sie zusätzliche
oder alternative Spaltstellen enthalten.
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Die
Nucleinsäuren
der Erfindung können
eingesetzt werden, um Expressionskassetten zu produzieren, die eingesetzt
werden können,
um transformierte Mikroorganismen zu produzieren, die eine Nucleinsäure der
Erfindung umfassen. Die resultierenden Transformanten können in
der Herstellung von pestiziden Zusammensetzungen eingesetzt werden,
die einen transformierten Mikroorganismus umfassen, oder für die Produktion
oder Isolierung von pestiziden Proteinen eingesetzt werden. Somit
stellt die Erfindung außerdem
pestizide Zusammensetzungen bereit, die entweder pestizide Polypeptide
oder transformierte Mikroorganismen umfassen; sie stellt außerdem Verfahren
zur Herstellung solcher Zusammensetzungen bereit. Die pestiziden
Zusammensetzungen der Erfindung finden in landwirtschaftlichen Methoden
zur Bekämpfung
von Schädlingen
Verwendung. Beispielsweise können
die Zusammensetzungen in einem Verfahren eingesetzt werden, das
Platzieren einer wirksamen Menge der pestiziden Zusammensetzung
in der Umgebung des Schädlings
involviert, und zwar durch eine Vorgehensweise, die aus der Gruppe,
bestehend aus Besprühen,
Bestäuben,
Breitwurf und Samenbeschichtung ausgewählt ist.
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Die
Erfindung stellt außerdem
isolierte pestizide (z.B. insektizide) Polypeptide bereit, die entweder durch
eine natürlich
vorkommende oder eine modifizierte (z.B. mutagenisierte oder manipulierte)
Nucleinsäure der
Erfindung codiert werden. In bestimmten Beispielen umfassen pestizide
Proteine der Erfindung Volllängen-δ-Endotoxinproteine,
Fragmente von Volllängen-δ-Endotoxinen
und variante Polypeptide, die aus mutagenisierten Nucleinsäuren produziert
werden, welche so entwickelt sind, dass sie bestimmte Aminosäuresequenzen
in die Polypeptide der Erfindung einführen. In bestimmten Ausführungsformen
haben die Polypeptidfragmente und Polypeptidvarianten der Erfindung
im Vergleich zu der Aktivität
des natürlich
auftretenden δ-Endotoxins,
von dem sie abgeleitet sind, erhöhte
pestizide Aktivität.
Polypeptide der Erfindung können
entweder aus einer hierin offenbarten Nucleinsäure oder durch die Verwendung
von Standardmolekularbiologie-Techniken produziert werden. Bei spielsweise
kann ein verkürztes
Protein der Erfindung durch Expression einer rekombinanten Nucleinsäure der
Erfindung in einer geeigneten Wirtszelle oder alternativ durch eine
Kombination von ex vivo-Verfahren, z.B. Proteaseverdau und Reinigung,
produziert werden.
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Die
Nucleinsäuren
der Erfindung können
auch eingesetzt werden, um transgene (z.B. transformierte) Pflanzen
zu produzieren, die durch Genome gekennzeichnet sind, die wenigstens
ein stabil eingebautes Nucleotidkonstrukt umfassen, welches eine
codierende Sequenz der Erfindung funktionell mit einem Promotor verknüpft, umfasst,
der die Expression des codierten pestiziden Polypeptids steuert.
Dementsprechend werden auch transformierte Pflanzenzellen, Pflanzengewebe,
Pflanzen und Samen davon bereitgestellt.
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In
einer bestimmten Ausführungsform
kann eine transformierte Pflanze der Erfindung produziert werden,
indem eine Nucleinsäure,
die für
eine verstärkte
Expression in einer Wirtspflanze optimiert wurde, verwendet wird.
Beispielsweise kann eines der pestiziden Polypeptide der Erfindung
zurücktranslatiert
werden, um eine Nucleinsäure
zu produzieren, welche Codons umfasst, die für eine Expression in einem
bestimmten Wirt, z.B. einer Pflanze, spezifischer zur Expression
in einer Zea mays-Pflanze, optimiert sind. Die Expression einer
codierenden Sequenz durch eine solche transformierte Pflanze (z.B.
Dikotyle oder Monokotyle) wird in der Produktion eines pestiziden
Polypeptids resultieren und der Pflanze eine erhöhte Insektenresistenz verleihen.
In einer bestimmten Ausführungsform
stellt die Erfindung transgene Pflanzen bereit, die pestizide Polypeptide
exprimieren, welche in Verfahren zur Bekämpfung des Colorado-Kartoffelkäfers, Western
Corn Rootworm (Westlicher Maiswurzelbohrer) und des Southern Corn
Rootwoorm (Südlicher
Maiswurzelwurm) Verwendung finden.
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Dementsprechend
stellt die Erfindung eine isolierte Nucleinsäure bereit, die eine Nucleotidsequenz umfasst,
die für
ein Polypeptid mit pestizider Aktivität gegen Western Corn Rootworm
(Diabrotica virgifera) codiert, wobei die Nucleotidsequenz ausgewählt ist
aus:
- (a) einer Nucleotidsequenz, die in SEQ
ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 15 oder 17 angegeben ist;
- (b) einer Nucleotidsequenz, die für die in SEQ ID NO: 2, 4, 6,
8, 16 oder 18 angegebene Aminosäuresequenz
codiert;
- (c) einer Nucleotidsequenz, die wenigstens 88% Sequenzidentität zu der
in (a) angegebenen Nucleotidsequenz hat; und
- (d) einer Nucleotidsequenz, die für ein Protein codiert, das
eine Aminosäuresequenz
umfasst, die wenigstens 85% Sequenzidentität zu der in (b) angegebenen
Aminosäuresequenz
hat.
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Die
Erfindung stellt auch ein isoliertes pestizides Polypeptid bereit,
das pestizide Aktivität
gegen Western Corn Rootworm (Diabrotica virgifera) hat, wobei das
Polypeptid ausgewählt
ist aus:
- (a) einem Polypeptid, das eine in
SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 16 oder 18 angegebene Aminosäuresequenz
hat; und
- (b) einem Polypeptid, das wenigstens 85% Sequenzidentität zu der
Aminosäuresequenz
von (a) hat.
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Die
Erfindung stellt auch eine transformierte Pflanze bereit, die in
ihrem Genom wenigstens ein stabil eingebautes Nucleotidkonstrukt
umfasst, das eine codierende Sequenz funktionell mit einem Promotor
verknüpft
umfasst, der eine Expression eines Polypeptids steuert, das für Western
Corn Rootworm bzw. Diabrotica virgifera pestizid ist, wobei die
codierende Sequenz ausgewählt
ist aus:
- (a) einer Nucleotidsequenz, die in
SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 15 oder 17 angegeben ist;
- (b) einer Nucleotidsequenz, die für die in SEQ ID NO: 2, 4, 6,
8, 16 oder 18 angegebene Aminosäuresequenz
codiert;
- (c) einer Nucleotidsequenz, die wenigstens 88% Sequenzidentität zu der
in (a) angegebenen Nucleotidsequenz hat;
- (d) einer Nucleotidsequenz, die für ein Protein codiert, das
eine Aminosäuresequenz
umfasst, die wenigstens 85% Sequenzidentität zu der in (b) angegebenen
Aminosäuresequenz
hat; und
- (e) einer Nucleotidsequenz nach einem von (a) bis (d), die Codons
umfasst, die für
eine Expression in einer Pflanze optimiert sind.
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Die
Erfindung stellt auch einen transformierten Mikroorganismus bereit,
der in seinem Genom wenigstens eine stabil eingebaute Expressionskassette
umfasst, die eine Nucleotidsequenz umfasst, die für ein Polypeptid
codiert, das pestizide Aktivität
gegen Diabrotica virgifera bzw. Western Corn Rootworm hat, wobei
die Nucleotidsequenz ausgewählt
ist aus:
- (a) einer Nucleotidsequenz, die in
SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 15, 17, 27 oder 28 angegeben ist;
- (b) einer Nucleotidsequenz, die für die in SEQ ID NO: 2, 4, 6,
8, 16 oder 18 angegebene Aminosäuresequenz
codiert;
- (c) einer Nucleotidsequenz, die wenigstens 88% Sequenzidentität zu der
in (a) angegebenen Nucleotidsequenz hat; und
- (d) einer Nucleotidsequenz, die für ein Protein codiert, das
eine Aminosäuresequenz
umfasst, die wenigstens 85% Sequenzidentität zu der in (b) angegebenen
Aminosäuresequenz
hat.
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Die
Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Bekämpfung eines Pflanzenschädlings,
umfassend Einführung
in die Pflanze oder Zelle derselben wenigstens ein Nucleotidkonstrukt,
das eine codierende Sequenz funktionell verknüpft mit einem Promotor umfasst,
der eine Expression eines pestiziden Polypeptids in Pflanzenzellen
steuert, wobei das Polypeptid pestizide Aktivität gegenüber Western Corn Rootworm hat
und wobei die Nucleotidsequenz ausgewählt ist aus:
- (a)
einer Nucleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 15 oder
17 angegeben ist;
- (b) einer Nucleotidsequenz, die für die in SEQ ID NO: 2, 4, 6,
8, 16 oder 18 angegebene Aminosäuresequenz
codiert;
- (c) einer Nucleotidsequenz, die wenigstens 88% Sequenzidentität zu der
in (a) angegebenen Nucleotidsequenz hat; und
- (d) einer Nucleotidsequenz, die für ein Protein codiert, das
eine Aminosäuresequenz
umfasst, die wenigstens 85% Sequenzidentität zu der in (b) angegebenen
Aminosäuresequenz
hat.
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Die
Erfindung stellt auch eine Variante der Nucleinsäure, die in SEQ ID NO: 19 angegeben
ist, bereit, wobei die Variante eine Nucleotidsequenz umfasst, die
wenigstens ein zusätzliches
Codon hat, das in der in SEQ ID NO: 19 angegebenen Nucleotidsequenz
nicht vorhanden ist, wobei das wenigstens eine zusätzliche Codon
eine zusätzliche
Protease-empfindliche
Stelle in die Schleifenregion zwischen α-Helices 3 und 4 der Domäne 1 des
codierten Polypeptids einführt,
und wobei außerdem
das durch die Variante codierte Polypeptid durch verbesserte pestizide
Aktivität
gegen einen Schädling,
der zu der Art Coleoptera gehört,
im Vergleich zu der Aktivität
des in SEQ ID NO: 2 angegebenen Polypeptids gekennzeichnet ist.
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Die
Erfindung stellt auch eine isolierte Nucleinsäure bereit, die eine Nucleotidsequenz
umfasst, welche ausgewählt
ist aus:
- (a) einer Nucleotidsequenz, die in
einer von SEQ ID NO: 5, 11, 15, 21, 23, 39 und 43 angegeben ist;
- (b) einer Nucleotidsequenz, die für eine der Aminosäuresequenzen
codiert, die in SEQ ID NO: 6, 12, 16, 22, 24, 40 und 44 angegeben
sind;
- (c) einer Nucleotidsequenz, die für eine Polypeptidvariante von
SEQ ID NO: 16 codiert, wobei das Polypeptid eine zusätzliche
Protease-empfindliche Spaltstelle, insertiert zwischen den Aminosäureresten
164 und 165 von SEQ ID NO: 16, umfasst;
- (d) einer Nucleotidsequenz, die für eine Polypeptidvariante von
SEQ ID NO: 16 codiert, wobei die Polypeptidvariante eine zusätzliche
Aminosäuresequenz,
die zur Einführung
einer Trypsin-Spaltstelle zwischen Aminosäureresten 164 und 165 von SEQ
ID NO: 16 konzipiert ist, umfasst;
- (e) einer Nucleotidsequenz, die für eine Polypeptidvariante von
SEQ ID NO: 16 codiert, wobei das Polypeptid eine zusätzliche
Aminosäuresequenz
umfasst, die so konzipiert ist, dass sie eine Chymotrypsin-Spaltstelle
zwischen Aminosäureresten
160 und 161 von SEQ ID NO: 16 einführt; und
- (f) einer Nucleotidsequenz, die für eine Polypeptidvariante von
SEQ ID NO: 16 codiert, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz
umfasst, in welcher Reste, die den Positionen 161 bis 163 von SEQ
ID NO: 16 entsprechen, entfernt sind und zusätzliche Aminosäuren, die
einer Chymotrypsin-Spaltstelle umfassen, an ihrer Stelle eingeführt sind.
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Die
Erfindung stellt auch eine Variante der Nucleinsäure, die in SEQ ID NO: 15 angegeben
ist, bereit, wobei die Variante eine Nucleotidsequenz umfasst, die
wenigstens ein zusätzliches
Codon enthält,
das eine zusätzliche
Protease-empfindliche Stelle in der Schleifenregion zwischen α-Helices
3 und 4 von Domäne
1 des Polypeptids, das durch die Varianten-Nucleinsäure codiert wird, einführt, und
wobei außerdem
das codierte Polypeptid durch verbesserte Pestizideaktivität gegen
einen Schädling,
der zu der Art Coleoptera gehört,
im Vergleich zu der Aktivität
des in SEQ ID NO: 2 angegebenen Polypeptids gekennzeichnet ist.
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Die
Erfindung stellt auch eine Expressionskassette bereit, die eine
Nucleinsäure
der Erfindung umfasst, wobei die Nucleotidsequenz funktionell mit
einem Promotor verknüpft
ist, der eine Expression in einem Mikroorganismus oder in einer
Pflanzenzelle steuert.
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Die
Erfindung stellt auch eine isolierte Nucleinsäure bereit, die eine Nucleinsäuresequenz
umfasst, die ausgewählt
ist aus:
- (a) einer Nucleotidsequenz, die in
SEQ ID NO: 19, 29, 31, 33, 41 oder 45 angegeben ist;
- (b) einer Nucleotidsequenz, die für die Aminosäuresequenz
codiert, die in SEQ ID NO: 20, 30, 32, 34, 42 oder 46 angegeben
ist;
- (c) einer Nucleotidsequenz, die eine Variante von SEQ ID NO:
19 umfasst, wobei die Variante für
ein Polypeptid codiert, das durch eine zusätzliche Protease-empfindliche
Spaltstelle gekennzeichnet ist, die unmittelbar 5' zur Aminosäure 114
von SEQ ID NO: 20 insertiert ist;
- (d) einer Nucleotidsequenz, die eine Variante von SEQ ID NO:
19 umfasst, wobei die Variante für
ein Polypeptid codiert, das durch eine zusätzliche Aminosäuresequenz
gekennzeichnet ist, die so konzipiert ist, dass sie eine Trypsin-Spaltstelle
zwischen den Aminosäureresten
113 und 114 von SEQ ID NO: 20 einführt;
- (e) einer Nucleotidsequenz, die eine Variante von SEQ ID NO:
19 umfasst, wobei die Variante für
ein Polypeptid codiert, das durch eine zusätzliche Aminosäuresequenz
gekennzeichnet ist, die so konzipiert ist, dass sie eine Chymotrypsin-Spaltstelle zwischen
den Aminosäureresten
113 und 114 von SEQ ID NO: 20 einführt; und
- (f) einer Nucleotidsequenz, die eine Variante von SEQ ID NO:
19 umfasst, wobei die Variante für
ein Polypeptid codiert, das durch eine Aminosäuresequenz gekennzeichnet ist,
in der die Aminosäuren,
die in Positionen 114 bis 116 von SEQ ID NO: 20 lokalisiert sind,
entfernt sind und zusätzliche
Aminosäuren,
die eine Chymotrypsin-Stelle umfassen, an ihrer Stelle insertiert
sind.
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Die
Erfindung stellt auch eine Variante des in SEQ ID NO: 16 angegebenen
Polypeptids bereit, wobei die Variante eine Aminosäuresequenz
umfasst, die wenigstens einen zusätzlichen Aminosäurerest
enthält,
der eine zusätzliche
Protease-empfindliche Stelle in der Schleifenregion zwischen α-Helices
3 und 4 von Domäne 1
des Polypeptids einführt,
und wobei außerdem
das codierte Polypeptid durch eine verbesserte pestizide Aktivität gegen
einen Schädling,
der zur Art Coleoptera gehört,
im Vergleich zu der Aktivität
des in SEQ ID NO: 2 angegebenen Polypeptids gekennzeichnet ist.
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Die
Erfindung stellt auch ein isoliertes pestizides Polypeptid bereit,
das eine in SEQ ID NO: 6, 12, 16, 20, 22, 24, 30, 32, 34, 40, 42,
44 oder 46 angegebene Aminosäuresequenz
umfasst.
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Die
Erfindung stellt auch eine transformierte Pflanze bereit, die in
ihrem Genom wenigstens ein stabil eingebautes Nucleotidkonstrukt
umfasst, das eine codierende Sequenz funktionell mit einem Promotor
verknüpft
umfasst, welcher eine Expression eines pestiziden Polypeptids in
Zellen der transformierten Pflanze steuert, wobei das Polypeptid
pestizide Aktivität
gegen Diabrotica virgifera bzw. Western Corn Rootworm hat und wobei
die codierende Sequenz ausgewählt
ist aus:
- (a) einer Nucleotidsequenz, die in
SEQ ID NO: 11, 19, 21, 23, 29, 31, 33, 39, 41, 43 oder 45 angegeben
ist;
- (b) einer Nucleotidsequenz, die für die in SEQ ID NO: 12, 20,
22, 24, 30, 32, 34, 40, 42, 44 oder 46 angegebene Aminosäuresequenz
codiert;
- (c) einer Nucleotidsequenz, die für eine Polypeptid-Variante
von SEQ ID NO: 16 codiert, wobei die Variante eine zusätzliche
Protease-empfindliche Spaltstelle, insertiert zwischen den Aminosäureresten
164 und 165 von SEQ ID NO: 16, umfasst;
- (d) einer Nucleotidsequenz, die für eine Polypeptid-Variante
von SEQ ID NO: 16 codiert, wobei die Variante eine zusätzliche
Aminosäuresequenz
umfasst, die so konzipiert ist, dass sie eine Trypsin-Spaltstelle
zwischen den Aminosäureresten
164 und 165 von SEQ ID NO: 16 einführt;
- (e) einer Nucleotidsequenz, die für eine Polypeptid-Variante
von SEQ ID NO: 16 codiert, wobei die Variante eine zusätzliche
Aminosäuresequenz
umfasst, die so konzipiert ist, dass sie eine Chymotrypsin-Spaltstelle zwischen
den Aminosäureresten
160 und 161 von SEQ ID NO: 16 einführt;
- (f) einer Nucleotidsequenz, die für eine Polypeptid-Variante
von SEQ ID NO: 16 codiert, wobei die Aminosäurereste, die den Aminosäuren 161
bis 163 von SEQ ID NO: 16 entsprechen, entfernt sind und Aminosäuren, die
eine Chymotrypsin-Spaltstelle
umfassen, an ihrer Stelle eingeführt
sind;
- (g) einer Nucleotidsequenz, die eine Variante von SEQ ID NO:
19 umfasst, wobei die Variante für
ein Polypeptid codiert, das durch eine zusätzliche Protease-empfind liche
Spaltstelle unmittelbar 5' zu
der Aminosäure
114 von SEQ ID NO: 20 gekennzeichnet ist;
- (h) einer Nucleotidsequenz, die eine Variante von SEQ ID NO:
19 umfasst, wobei die Variante für
ein Polypeptid codiert, das durch eine zusätzliche Aminosäure gekennzeichnet
ist, die so gewählt
ist, dass eine Trypsin-Spaltstelle unmittelbar 5' der Aminosäure 114 von SEQ ID NO: 20 eingeführt wird;
- (i) einer Nucleotidsequenz, die eine Variante von SEQ ID NO:
19 umfasst, wobei die Variante zusätzliche Nucleinsäurereste
umfasst, die so konzipiert sind, dass sie eine Chymotrypsin-Spaltstelle
zwischen den Aminosäureresten
113 und 114 von SEQ ID NO: 20 einführen;
- (j) einer Nucleotidsequenz, die für eine Polypeptid-Variante
von SEQ ID NO: 20 codiert, wobei die Aminosäurereste, die in den Positionen
114 bis 116 von SEQ ID NO: 20 lokalisiert sind, entfernt sind und
zusätzliche
Aminosäuren,
die eine Chymotrypsin-Stelle umfassen, an ihrer Stelle sind; und
- (k) einer Nucleotidsequenz nach einem von (a) bis (j), die Codons
umfasst, die für
eine Expression in einer Pflanze optimiert sind.
-
Die
Erfindung stellt auch transformierten Samen der Pflanze der Erfindung
bereit.
-
Die
Erfindung stellt auch einen transformierten Mikroorganismus bereit,
umfassend eine Nucleinsäure, die
ausgewählt
ist aus:
- (a) einer Nucleotidsequenz, die in
SEQ ID NO: 11, 19, 21, 23, 29, 31, 33, 39, 41, 43 oder 45 angegeben
ist;
- (b) einer Nucleotidsequenz, die für die Aminosäuresequenz
codiert, die in SEQ ID NO: 12, 20, 22, 24, 30, 32, 34, 40, 42, 44
oder 46 angegeben ist;
- (c) einer Nucleotidsequenz, die für eine Variante von SEQ ID
NO: 19 codiert, wobei die Variante ein Nucleinsäureinsert umfasst, das so konzipiert
ist, dass es eine zusätzliche
Protease-empfindliche Stelle zwischen den Aminosäureresten 117 und 118 von SEQ
ID NO: 20 einführt;
- (d) einer Nucleotidsequenz, die für eine Polypeptid-Variante
von SEQ ID NO: 16 codiert, wobei die Variante eine zusätzliche
Protease-empfindliche Stelle, insertiert zwischen den Aminosäureresten
164 und 165 von SEQ ID NO: 16, umfasst; und
- (e) einer Nucleotidsequenz, die für eine Polypeptid-Variante
von SEQ ID NO: 20 codiert, wobei die Variante eine zusätzliche
Protease-empfindliche Stelle, insertiert zwischen den Aminosäureresten
117 und 118 von SEQ ID NO: 20, umfasst.
-
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
-
Die
Erfindung bezieht sich auf Zusammensetzungen und Verfahren zur Bekämpfung von
Schädlingen, insbesondere
Pflanzenschädlingen,
spezifischer Insektenschädlinge
der Art Coleopteran. Spezifischer umfassen die isolierten Nucleinsäuren der
Erfindung und Fragmente und Varianten davon Nucleotidsequenzen,
die für
pestizide Polypeptide (z.B. Proteine) codieren. Die offenbarten
pestiziden Proteine sind biologisch aktiv (z.B. pestizid) gegen
Insektenschädlinge,
insbesondere gegen den Colorado-Kartoffelkäfer (Leptinotarsa decemlineata),
den Western Corn Rootworm (Diabrotica virgifera virgifera) und den
Southern Corn Rootworm (Diabrotica undecimpunctata howardi).
-
Die
Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfassen isolierte
Nucleinsäuren
und Fragmente und Varianten davon, die für pestizide Polypeptide codieren,
Expressionskassetten, die Nucleotidsequenzen der Erfindung umfassen,
isolierte pestizide Proteine und pestizide Zusammensetzungen. In
einigen Ausführungsformen
stellt die Erfindung modifizierte Cry8-artige δ-Endotoxinproteine bereit, die
durch eine verbesserte insektizide Aktivität gegen Coleopterane, verglichen
mit der pestiziden Aktivität
des entsprechenden parentalen Wildtyp-Proteins gekennzeichnet sind.
Die Erfindung stellt ferner Pflanzen und Mikroorganismen bereit,
die mit diesen neuen Nucleinsäuren
transformiert sind, und stellt Verfahren bereit, die die Verwendung von
solchen Nucleinsäuren,
pestiziden Zusammensetzungen und transformierten Organismen bei
der Bekämpfung
von Insektenschädlingen
involvieren.
-
In
der Beschreibung, die folgt, wird eine Reihe von Ausdrücken ausgiebig
eingesetzt. Die folgenden Definitionen werden zur Erleichterung
des Verständnisses
der Erfindung bereitgestellt.
-
Wie
hierin verwendet, beinhaltet "Nucleinsäure" die Bezugnahme auf
ein Desoxyribonucleotid- oder Ribonucleotidpolymer, entweder in
einzelsträngiger
oder doppelsträngiger
Form, und wenn der Ausdruck nicht in anderer Weise begrenzt ist,
umfasst er bekannte Analoga (z.B. Peptidnucleinsäuren), die die essentielle
Natur von natürlichen
Nucleotiden dahingehend haben, dass sie an einzelsträngige Nucleinsäuren in
einer ähnlichen
Form wie natürlich
auftretende Nucleotide hybridisieren.
-
Die
Ausdrücke "codierend für" bzw. "codierend" oder "codiert", wie sie hierin
verwendet werden, bedeuten, wenn sie im Kontext mit einer spezifizierten
Nucleinsäure
verwendet werden, dass die Nucleinsäure die erforderliche Information
umfasst, um eine direkte Translation der Nucleotidsequenz in ein
spezifiziertes Protein zu steuern. Die Information, durch welche
ein Protein codiert wird, ist durch die Verwendung von Codons spezifiziert.
Eine Nucleinsäure,
die für
ein Protein codiert, kann nicht-translatierte Sequenzen (z.B. Introns)
innerhalb translatierter Regionen der Nucleinsäure umfassen, oder es können ihr
solche intervenierenden nicht-translatierte Sequenzen fehlen (z.B.
wie in cDNA).
-
Der
Ausdruck "Volllängensequenz", wie er hier für ein spezifiziertes
Polynucleotid oder sein codiertes Protein verwendet wird, bedeutet
die gesamte Nucleinsäuresequenz
oder die gesamte Aminosäuresequenz einer
nativen (nicht-synthetischen) endogenen Sequenz aufweisend. Ein
Volllängen-Polynucleotid
codiert für die
katalytisch aktive Volllängenform
des spezifizierten Proteins.
-
Der
Ausdruck "Antisense", der im Kontext
einer Orientierung einer Nucleotidsequenz verwendet wird, bezieht
sich, so wie er hierin verwendet wird, auf eine Doppelstrang-Polynucleotidsequenz,
die funktionell mit einem Promotor in einer Orientierung verknüpft ist,
in der der Antisense-Strang transkribiert wird. Der Antisense-Strang
ist zu einem endogenen Transkriptionsprodukt ausreichend komplementär, so dass
eine Translation des endogenen Transkriptionsprodukts oft inhibiert
wird.
-
Die
Ausdrücke "Polypeptid", "Peptid" und "Protein" werden hierin austauschbar
verwendet, um ein Polymer aus Aminosäureresten zu bezeichnen. Die
Ausdrücke
finden auf Aminosäurepolymere
Anwendung, in denen ein Aminosäurerest
oder mehrere Aminosäurereste
ein künstliches
chemisches Analogon einer entsprechenden natürlich auftretenden Aminosäure ist/sind,
wie auch auf natürlich
vorkommende Aminosäurepolymere.
-
Die
Ausdrücke "Rest" oder "Aminosäurerest" oder "Aminosäure" werden hierin austauschbar
verwendet, um eine Aminosäure
zu bezeichnen, die in ein Protein, Polypeptid oder Peptid (zusammengefasst "Protein") eingebaut wird.
Die Aminosäure
kann eine natürlich
vorkommende Aminosäure
sein und, wenn keine anderen Beschränkungen bestehen, können bekannte
Analoga von natürlichen
Aminosäuren,
die in ähnlicher Weise
fungieren, wie natürlich
vorkommende Aminosäuren,
mit umfasst werden.
-
Die
Ausdrücke "isoliert" und "gereinigt", wie sie hier verwendet
werden, werden austauschbar verwendet, um Nucleinsäuren oder
Polypeptide oder einen biologisch aktiven Teil davon zu bezeichnen,
die substantiell oder im Wesentlichen frei von Komponenten sind,
die normalerweise mit der Nucleinsäure oder dem Polypeptid, wie
es in seiner natürlich
vorkommenden Umgebung gefunden wird, in Verbindung stehen oder wechselwirken.
Somit ist eine isolierte oder gereinigte Nucleinsäure oder
ein isoliertes oder gereinigtes Polypeptid im Wesentlichen frei
von anderem zellulären
Material oder von Kulturmedium, wenn sie/es durch Rekombinationstechniken
produziert wird, oder im Wesentlichen frei von chemischen Vorläufern oder
anderen Chemikalien, wenn sie/es chemisch synthetisiert wird.
-
Der
Ausdruck "Bekämpfung von
Insektenschädlingen" bzw. "Bekämpfen von
Insektenschädlingen", wie er hierin verwendet
wird, bezieht sich auf die Bewirkung von Veränderungen beim Insektenfraß, -wachstum und/oder
-verhalten in einer beliebigen Entwicklungsstufe, einschließlich, aber
nicht beschränkt,
auf ein Abtöten
des Insekts, Verzögern
des Wachstums, Verhindern seiner Vermehrungsfähigkeit und dergleichen.
-
Die
Ausdrücke "pestizide Aktivität" und "insektizide Aktivität", wie sie hierin
verwendet werden, werden synonym eingesetzt, um die Aktivität eines
Organismus oder einer Substanz, z.B. eines Proteins, zu bezeichnen,
die durch Schädlingsmortalität, Schädlingsgewichtsverlust,
Schädlingsanziehung,
Schädlingsabstoßung und
andere Verhaltensänderungen
und physikalischen Änderungen
eines Schädlings
nach Fraß und
Behandlung für
einen angemessenen Zeitraum, gemessen werden können, allerdings besteht keine
Beschränkung darauf.
Beispielsweise sind "pestizide
Proteine" Proteine,
die pestizide Aktivität
an sich oder in Kombination mit anderen Proteinen zeigen.
-
Der
Ausdruck "pestizid
wirksame Menge" suggeriert
eine Menge einer Substanz oder eines Organismus, die/der pestizide
Aktivität
hat, wenn sie/er in der Umgebung eines Schädlings ist. Für jede Substanz
oder jeden Organismus wird die pestizid wirksame Menge empirisch
für jeden
Schädling,
der in einer spezifischen Umgebung geschädigt wird, bestimmt. Ähnlich kann
der Ausdruck "insektizid
wirksame Menge" verwendet werden,
um eine "pestizid
wirksame Menge" zu
bezeichnen, wenn der Schädling
ein Insektenschädling
ist.
-
Der
Ausdruck "rekombinant
genetisch verändert", wie er hierin verwendet
wird, legt die Verwendung der DNA-Rekombinationstechnologie nahe,
um eine Änderung
in der Proteinstruktur einzuführen
(z.B. gentechnisch einzuführen),
die auf dem Verständnis
des Wirkmechanismus und der Betrachtung der Aminosäuren, die
eingeführt,
deletiert oder substituiert werden, basiert.
-
Der
Ausdruck "mutagenisierte
Nucleotidsequenz",
wie er hier verwendet wird, bezeichnet eine Nucleotidsequenz, die
so mutagenisiert oder verändert
wurde, dass sie einen Nucleotidrest oder mehrere Nucleotidreste
(z.B. Basenpaar) enthält,
der/die in der entsprechenden Wildtyp-Sequenz nicht vorliegen, und
der/die für
ein mutantes δ-Endotoxin
codiert, das verbesserte insektizide Aktivität zeigt.
-
Der
Ausdruck "verbesserte
insektizide Aktivität", wie er hierin verwendet
wird, charakterisiert ein δ-Endotoxin
der Erfindung, das im Vergleich zu der Aktivität seines entsprechenden Wildtyp-Proteins
verstärkte pestizide
Aktivität
gegen Coleopteran hat, und/oder ein Endotoxin, das entweder gegen
einen breiteren Bereich von Insekten wirksam ist oder eine Spezifität für ein Insekt
erwirbt, das gegenüber
der Toxizität
des Wildtyp-Proteins nicht empfindlich ist. Die Feststellung einer
erhöhten
pestiziden Aktivität
erfordert einen Beweis einer Erhöhung
der Toxizität
von wenigstens 30% gegen das Zielinsekt und bevorzugter von 35%,
40%, 45% oder 50% im Vergleich zur insektiziden Aktivität des Wildtyp-Endotoxins,
die gegen dasselbe Insekt bestimmt wird.
-
Einheiten,
Präfixe
und Symbole können
in ihrer SI-akzeptierten Form angegeben werden.
-
Wenn
nichts Anderes angegeben wird, werden Nucleinsäuren von links nach rechts
in 5'- zu 3'-Orientierung angegeben;
Aminosäuresequenzen
werden von links nach rechts in Amino-zu-Carboxy-Orientierung geschrieben.
Numerische Bereiche sind einschließlich der Zahlen, die den Bereich
definieren. Aminosäuren können hierin
entweder durch ihre allgemein bekannten Drei-Buchstaben-Symbole
oder durch die Ein-Buchstaben-Symbole, die von der IUPAC-IUB Biochemical
Nomenclature Commission empfohlen sind, bezeichnet werden. Nucleotide
können
entsprechend durch ihre allgemein anerkannten Ein-Buchstaben-Codes
angegeben werden. Die oben definierten Ausdrücke werden anhand der Beschreibung
als Ganzes vollständiger
definiert.
-
Die
Nucleotidsequenzen der Erfindung können verwendet werden, um einen
Organismus zu transformieren, damit er die codierten pestiziden
Proteine produziert. Es werden Verfahren bereitgestellt, die die
Verwendung von solchen transformierten Organismen involvieren, um
Pflanzenschädlinge
zu bekämpfen
oder zu kontrollieren. Die Erfindung bezieht sich außerdem auf
die Identifizierung von Fragmenten und Varianten der natürlich auftretenden
codierenden Sequenz, die für
biologisch aktive pestizide Proteine codieren. Alle Nucleotidsequenzen
der Erfindung finden direkte Verwendung in Verfahren zur Bekämpfung von
Schäd lingen,
insbesondere Insektenschädlingen,
in noch besonderer Weise von Schädlingen
der Art Coleopteran, einschließlich
z.B. des Colorado-Kartoffelkäfers,
des Western Corn Rootworms und des Southern Corn Rootworms. Dementsprechend
stellt die Erfindung neue Ansätze
zur Bekämpfung
von Insektenschädlingen
bereit, die nicht von der Verwendung traditioneller, synthetischer,
chemischer Insektizide abhängen.
Die Erfindung involviert die Entdeckung natürlich vorkommender, biologisch
abbaubarer Pestizide und der Gene, die sie codieren.
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Die
Erfindung stellt ferner Fragmente und Varianten der natürlich vorkommenden
codierenden Sequenzen bereit, die auch biologisch aktive (z.B. pestizide)
Polypeptide codieren. Die Nucleinsäuren der Erfindung umfassen
Nucleinsäuresequenzen,
die zur Expression durch die Zellen eines bestimmten Organismus optimiert
wurden, z.B. Nucleinsäuresequenzen,
die unter Verwendung Pflanzen-bevorzugter Codons auf der Basis der
Aminosäuresequenz
eines Polypeptids, das verstärkte
pestizide Aktivität
hat, zurück
translatiert wurden.
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Die
Nucleotidsequenzen der Erfindung wurden aus Stämmen des Bakteriums Bacillus
thuringiensis isoliert. Es wurde entdeckt, dass rohe Lysate, die
aus Kulturen der Stämme
hergestellt worden waren, pestizide Aktivität gegen Colorado-Kartoffelkäfer, Western
Corn Rootworm und Southern Corn Rootworm haben. Kristallproteine
wurden aus Kulturen der Stämme
isoliert. Die isolierten Kristallproteine wurden in Insektenfütterungsassays
auf pestizide Aktivität
getestet. Die Resultate dieser Assays zeigten, dass die isolierten
Kristallproteine pestizide Aktivität gegen Coleopteran besaßen. Es
wurden Anstrengungen unternommen, um Nucleotidsequenzen, die Kristallproteine
codieren, aus den Stämmen
zu identifizieren, und es wurden die natürlich auftretenden codierenden
Sequenzen und genomischen Nucleinsäuren der Erfindung entdeckt.
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Es
wurde bewiesen, dass die Nucleotidsequenzen der isolierten Nucleinsäuren für pestizide
Proteine codieren, indem Escherichia coli mit solchen Nucleotidsequenzen
transformiert wurde. Lysate, die aus dem transformierten E. coli
hergestellt worden waren, hatten in Fütterungsassays pestizide Aktivität gegen
Corn Rootworms (Maiswurzelbohrer) und Colorado-Kartoffelkäfer, was
beweist, dass die isolierten Nucleotidsequenzen der Erfindung für pestizide
Proteine codieren. In Abhängigkeit
von den Charakteristika einer gegebenen Lysatpräparation wurde erkannt, dass
der Beweis einer pestiziden Aktivität manchmal eine Trypsinvorbehandlung
erforderte, um die pestiziden Proteine zu aktivieren.
-
Anschließend wurden
Nucleinsäure-Varianten
und -Fragmente, die für
biologisch aktive pestizide Polypeptide codieren, identifiziert.
Einige der codierten pestiziden Proteine erfordern eine Protease-Aktivierung (z.B.
Trypsin), und es wurde beobachtet, dass andere Proteine bei Fehlen
einer Aktivierung biologisch aktiv sind (z.B. pestizid). In einigen
Ausführungsformen
codiert die Nucleinsäure
für eine
trunkierte Version des natürlich
auftretenden Polypeptids und als solche kann sie entweder als Variante
oder Fragment klassifiziert werden. Außerdem wurde eine zweite Generation
an Nucleinsäuresequenzen
gentechnisch verändert,
damit sie Nucleotidsequenzen umfassen, die für Cry8-artige Polypeptide codieren,
die durch verbesserte oder veränderte
pestizide Aktivität
im Vergleich zu der pestiziden Aktivität der natürlich vorkommenden Polypeptide
gekennzeichnet sind.
-
Die
Nucleinsäuren
der Erfindung umfassen isolierte Polynucleotide und Varianten und
Fragmente davon, die biologisch aktive (z.B. pestizide) Polypeptide
codieren, einschließlich,
aber nicht beschränkt
auf, die Cry8-artige Nucleotidsequenzen, die in SEQ ID NO: 1, 3,
5, 7, 9, 11, 15, 17, 19, 21, 23, 27, 28, 29, 31, 33, 39, 41, 43
und 45 angegeben sind. Die hierin offenbarten Nucleotidsequenzen
stellen zwei Hintergrundsequenzen bereit, die hierin als 1218-1
und 49PVD bezeichnet sind, in die Mutationen eingeführt sind.
In einigen Fällen stellen
die Sequenzen auch Varianten von zwei unterschiedlichen Klonen bereit,
die als 1218-1 und 1218-2 bezeichnet werden. Spezifischer stellt
SEQ ID NO: 15 (1218-1A) eine Variante von SEQ ID NO: 5 dar, wobei jede
von diesen alternative Ausführungsformen
des 1218-1-Klons darstellen. Außerdem
stellt SEQ ID NO: 17 (1218-2A) eine Variante von SEQ ID NO: 7 dar,
von denen jede alternative Ausführungsformen
des 1218-2-Klons darstellt.
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Die
Polynucleotide der Erfindung umfassen auch eine synthetische oder
rekombinante Nucleotidsequenz, die für ein pestizides Polypeptid
codiert, das die in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 18, 20, 22,
24, 30, 32, 34, 40, 42, 44 und 46 angegebene Aminosäuresequenzen
umfasst.
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Eine "isolierte" Nucleinsäure ist
frei von Sequenzen (vorzugsweise Proteincodierenden Sequenzen), die
natürlicher
Weise die Nucleinsäure
in der genomischen DNA des Organismus, aus dem die Nucleinsäure stammt,
flankieren (d.h. Sequenzen, die an den 5'- und 3'-Enden
der Nucleinsäure
lokalisiert sind). In verschiedenen Ausführungsformen können die
isolierten Nucleinsäuren
z.B. weniger als etwa 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb oder
0,1 kb Nucleotidsequenzen enthalten, die natürlicher Weise die Nucleinsäuren in
der genomischen DNA der Zelle flankieren, aus welcher die Nucleinsäure stammt.
-
Die
vorliegende Erfindung stellt isolierte Nucleinsäuren bereit, die Nucleotidsequenzen
umfassen, die für
die Aminosäuresequenzen
codieren, welche in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 18, 20, 22,
24, 30, 32, 34, 40, 42, 44 und 46 codieren. In bestimmten Ausführungsformen
stellt die Erfindung Nucleinsäuren
bereit, wie die Nucleotidsequenzen umfassen, die in SEQ ID NO: 1
(Cry1218-1 CDS) und 3 (Cry1218-2 CDS) angegeben sind, die Mais-optimierte Nucleinsäure, die
in SEQ ID NO: 9 (mo1218-1) angegeben ist und die nativen genomischen
Sequenzen, die in SEQ ID NO: 27 (genomisches Cry1218-1) und SEQ
ID NO: 28 (genomisches Cry1218-2) angegeben sind. Die codierende
Sequenz (CDS) für
SEQ ID NO: 27 läuft
ab Basenpaar 731–4348. Die
CDS für
SEQ ID NO: 28 läuft
ab Basenpaar 1254–4883.
Plasmide, die jede dieser fünf
Nucleinsäuren
umfassen, wurden am 05. Mai 2000 und am 20. Oktober 2000 bei der
Patent Depository of the American Type Culture Collection (ATCC),
Manassas, Virginia hinterlegt und den Patent-Hinterlegungsnummern
PTA-1821 (entspricht SEQ ID NO: 1); PTA-1817 (entspricht SEQ ID
NO: 3); PTA-2635 (entspricht SEQ ID NO: 9); PTA-2634 (umfasst SEQ
ID NO: 27) und PTA-2636 (umfasst SEQ ID NO: 28) zugeordnet.
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Die
Patent-Hinterlegungen PTA-1821 und PTA-1817 umfassen ein Gemisch
aus zwei Klonen, von denen jeder ein Teil der gesamten codierenden
Sequenz enthält.
Spezifischer ausgedrückt,
die hinterlegten Plasmide codieren für Nucleinsäuremoleküle, die in einen TA-Vektor
kloniert waren (Invitrogen, Carlsbad, CA), die für zwei überlappende Fragmente der codierenden
Sequenz codieren. Die codierende Volllängensequenz kann unter Verwendung
einer überlappenden
PCR-Strategie produziert werden. Eine erste PCR-Reaktion sollte
Vorwärts-
und Rückwärtsprimer
umfassen, die so konzipiert sind, dass sie den 5'- und den 3'-Enden
der codierenden Volllängensequenz
entsprechen. Geeignete Primer zur Verwendung in PCR-Reaktionen sind
in SEQ ID NO: 35 bis 38 angegeben. Spezifischer ausgedrückt, SEQ
ID NO: 35 und 36 stellen einen ersten Primersatz "(a)" bereit, der einen
Vorwärtsprimer
SEQ ID NO: 35 (5'-ATGAGTCCAAATAATCAAAATG)
und einen Rückwärtsprimer
SEQ ID NO: 36 (5'-CCGCTTCTAAATCTTGTTCC)
für das
5'-Ende der codierenden
Sequenz umfasst. SEQ ID NO: 37 und 38 stellen einen zweiten Primersatz "(b)" bereit, der einen
Vorwärtsprimer
SEQ ID NO: 37 (5'-GGAACAAGATTTAGAGG)
und einen Rückwärtsprimer
SEQ ID NO: 38 (5'-CTCATCGTCTACAATCAATTCATC)
für das
3'-Ende der codierenden
Sequenz umfasst. Die zwei DNA-Banden, die durch die erste PCR-Reaktion
erzeugt werden, welche mit den oben identifizierten Primersätzen durchgeführt wird,
sollten gereinigt werden, und es sollte eine zweite PCR-Runde, ein
Satz für
sieben Zyklen, durchgeführt
werden, wobei die gereinigte DNA, die aus der ersten PCR-Reaktion
isoliert wurde, in Abwesenheit von Primern verwendet wird. Das 3'-Ende der Nucleinsäure, die
durch Primersatz (a) erzeugt wurde, und das 5'-Ende der Nucleinsäure, die durch Primersatz (b)
erzeugt wurde, werden überlappen
und die Erzeugung einer codierenden Volllängensequenz auslösen. Eine
dritte und abschließende
PCR-Reaktion wird durchgeführt,
um die codierende Volllängensequenz
zu erzeugen. Diese Reaktion wird unter Verwendung von 1 μl des zweiten
PCR-Reaktionsproduktes,
und eines Primersatz, der SEQ ID NO: 35 (Vorwärtsprimer von Satz (a)) und
SEQ ID NO: 39 (Rückwärtsprimer
von Satz (b)) umfasst, durchgeführt.
-
Die
oben genannten Hinterlegungen (z.B. PTA-1821; PTA-1817; PTA-2635;
PTA-2634 und PTA-2636) werden unter den Bestimmungen des Budapester
Vertrags über
die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen
zu Zwecken des Patentverfahrens gehalten. Diese Hinterlegungen wurden
lediglich aus praktischen Erwägungen
für Fachleute
auf diesem Gebiet durchgeführt
und sind kein Zugeständnis, dass
eine Hinterlegung gemäß 35 U.S.C. § 112 erforderlich
ist.
-
Von
besonderem Interesse sind optimierte Nucleotidsequenzen, die für die pestiziden
Proteine der Erfindung codieren. Der Ausdruck "optimierte Nucleotidsequenzen", wie er hier verwendet
wird, bezieht sich auf Nucleinsäuren,
die zur Expression in einem bestimmten Organismus, z.B. einer Pflanze,
optimiert sind. Optimierte Nucleotidsequenzen können für einen beliebigen Organismus
von Interesse unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Fachgebiet
bekannt sind, hergestellt werden. Beispielsweise offenbart SEQ ID
NO: 9 eine optimierte Nucleinsäuresequenz,
die für
das pestizide Protein, das in SEQ ID NO: 16 angegeben wird (trunkiertes
1218-1A), codiert. Spezifischer wurde die Nucleotidsequenz von SEQ
ID NO: 9, die die meist bevorzugten Codons SEQ ID NO: 9 umfasst,
durch Umkehrtranslatieren der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 16
angegeben ist, hergestellt, so dass sie meist bevorzugte Codons
umfasst, wie es von Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:
477–498
beschrieben ist. Eine optimierte Nucleotidsequenz findet bei der
Verstärkung der
Expression eines pestiziden Proteins in einer Pflanze, insbesondere
in einer monokotylen Pflanze, bevorzugter einer Pflanze der Familie
der Gramineae (Poaceae), am bevorzugtesten einer Mais- oder Kornpflanze, Verwendung.
-
Die
Erfindung stellt ferner isolierte pestizide (z.B. insektizide) Polypeptide
bereit, die entweder durch eine natürlich vorkommende oder modifizierte
(z.B. mutagenisierte oder trunkierte) Nucleinsäure der Erfindung codiert werden.
Spezifischer stellt die Erfindung Polypeptide, die eine Aminosäuresequenz
umfassen, die in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 18, 20, 22,
24, 30, 32, 34, 40, 42, 44 und 46 angegeben ist, und die Polypeptide,
die durch Nucleinsäuren
codiert werden, die hierin beschrieben werden, z.B. solche, die
in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 15, 17, 19, 21, 23, 27, 28, 29,
31, 33, 39, 41, 43 und 45 angegeben sind, und Fragmente und Varianten
davon bereit.
-
In
bestimmten Ausführungsformen
stellen pestizide Proteine der Erfindung Volllängen-δ-Endotoxinproteine, Fragmente
von Volllängen-δ-Endotoxinen
und Varianten-Polypeptide bereit, die aus mutagenisierten Nucleinsäuren produziert
werden, die so konzipiert sind, dass sie bestimmte Aminosäuresequenzen
in Polypeptide der Erfindung einführen. In bestimmten Ausführungsformen
umfassen die Aminosäuresequenzen,
die in die Polypeptide eingeführt
werden, eine Sequenz, die eine Spaltungsstelle für ein Enzym oder eine Protease bereitstellt.
-
Einige
der Polypeptide der Erfindung, z.B. SEQ ID NO: 2 und 4, umfassen
Volllängen-δ-Endotoxine; andere
Polypeptide, z.B. SEQ ID NO: 6, 8, 10, 16, 18 und 20 stellen Fragmente
eines Volllängen-δ-Endotoxins dar;
und SEQ ID NO: 12, 22, 24, 30, 32, 34, 40, 42, 44 und 46 stellen
Polypeptidvarianten bereit. Einige der Polypeptidfragmente und -Varianten
der Erfindung haben im Vergleich zu der Aktivität des natürlich vorkommenden δ-Endotoxins,
von dem sie abgeleitet sind, eine verstärkte pestizide Aktivität, insbesondere
in Abwesenheit einer in vitro-Aktivierung des Endotoxins mit einer
Protease vor einem Screening auf Aktivität. Insbesondere zeigen die
hierin in Tabelle 1 von Beispiel 6 angegebenen Daten, dass die NGRS-Additionsmutante (SEQ
ID NO: 12) von SEQ ID NO: 16 (trunkiertes 1218-1A-Endotoxin) durch
erhöhte
pestizide Aktivität
gegen den Colorado-Kartoffelkäfer
gekennzeichnet ist.
-
SEQ
ID NO: 6, 10, 16 und 20 stellen Polypeptide bereit, die trunkierte
Versionen des 1218-1-Polypeptids, das in SEQ ID NO: 2 angegeben
ist, darstellen. SEQ ID NO: 16 stellt eine Variante, die hierin
als 1218-1A bezeichnet wird, des Polypeptids bereit, das in SEQ
ID NO: 6 angegeben ist und hierin als 1218-1 bezeichnet wird. Drei
der oben erwähnten
Sequenzen, SEQ ID NO: 6, 10 und 16, stellen ein Polypeptid dar,
das am 3'-Ende der
Aminosäuresequenz,
die in SEQ ID NO: 2 angegeben ist, verkürzt (trunkiert) ist. Im Gegensatz
dazu stellt die vierte Polypeptidvariante, die in SEQ ID NO: 20
angegeben ist, eine Variante bereit, die sowohl am 5'- als auch am 3'-Ende des Volllängenproteins,
das in SEQ ID NO: 2 angegeben ist, trunkiert ist. SEQ ID NO: 8 und
18 (1218-2 bzw. 1218-2A) stellen Polypeptide bereit, die trunkierte
Versionen der in SEQ ID NO: 4 angegebenen Polypeptide darstellen.
Jedes dieser zwei Polypeptide stellt ein Protein bereit, das am
3'-Ende des 1218-2-Volllängenpolypeptids,
das in SEQ ID NO: 4 angegeben ist, trunkiert ist.
-
SEQ
ID NO: 12, 22, 24, 40 und 44 stellen eine Familie von Polypeptiden
bereit, die Varianten der trunkierten 1218-1A-Polypeptide, die in
SEQ ID NO: 16 angegeben sind, verkörpern, somit stellen SEQ ID
NO: 12, 22, 24, 40 und 44 Varianten (oder Mutanten) des biologisch
aktiven Fragments des Cry8-artigen Polypeptids, das in SEQ ID NO:
2 angegeben ist, bereit. Spezifischer ausgedrückt, SEQ ID NO: 12 stellt eine
Mutante bereit, die hierin als NGSR.N1218-1 bezeichnet wird, die
eine zusätzliche
Trypsin-empfindliche Spaltungsstelle umfasst; SEQ ID NO: 22 stellt
eine zweite Mutante bereit, die hierin als LKMS.N1218-1 bezeichnet
wird, die eine Chymotrypsin-empfindliche Spaltungsstelle umfasst,
die im 1218-1- oder
1218-1A-Wildtyp-Polypeptid nicht vorliegt; und SEQ ID NO: 24 stellt
eine Ersatzmutante bereit, die hierin als LKMS.R1218-1 bezeichnet
wird, in der eine existierende Trypsinspaltstelle zerstört ist und
eine Chymotrypsinstelle an ihrer Stelle eingeführt ist. SEQ ID NO: 40 stellt
eine zweite Chymotrypsin-Additionsmutante bereit, die hierin als
LRMS.N1218-1 bezeichnet wird, die die alternative Chymotrypsinspaltungsstelle
LRMS umfasst (SEQ ID NO: 48). SEQ ID NO: 44 stellt eine zweite Ersatz-
oder Substitutionsmutante bereit, die hierin als LRMS.R1218-1 bezeichnet
wird, in der die native Trypsinstelle durch die Chymotrypsinspaltstelle
LRMS ersetzt ist.
-
SEQ
ID NO: 30, 32, 34, 42 und 46 stellen eine zweite Familie von Polypeptiden
bereit, die Varianten oder Mutanten des trunkierten Polypeptids,
das in SEQ ID NO: 20 angegeben ist, verkörpern. Somit stellen SEQ ID
NO: 30, 32, 34, 42 und 46 Varianten des pestiziden Fragments von
SEQ ID NO: 2, das in SEQ ID NO: 20 angegeben ist, bereit. Spezifischer,
SEQ ID NO: 30 stellt eine Mutante bereit, die hierin als NGSR.N49PVD bezeichnet
wird, die eine zusätzliche
Trypsin-empfindliche Spaltstelle umfasst; SEQ ID NO: 32 stellt eine
zweite Mutante bereit, die hierin als LKMS.N49PVD bezeichnet wird,
die eine Chymotrypsin-empfindliche
Spaltungsstelle umfasst, die im Wildtyp-1218-1- oder -1218-1A-Polypeptid
nicht vorhanden ist; und SEQ ID NO: 34 stellt eine Ersatzmutante
bereit, die hierin als LKMS.R49PVD bezeichnet wird, in der eine
existierende Trypsin-Spaltstelle zerstört ist und eine Chymotrypsinstelle
an ihrer Stelle eingeführt
ist. SEQ ID NO: 42 stellt eine zweite Chymotrypsin-Additionsmutante
bereit, die hierin als LRMS.N49PVD bezeichnet wird, welche eine
alternative Chymotrypsin-Spaltstelle LRMS (SEQ ID NO: 48) umfasst.
SEQ ID NO: 46 (LRMS.R49PVD) stellt eine zweite Ersatz- oder Substitutionsmutante
bereit, in der die native Trypsinstelle durch die Chymotrypsin-Spaltstelle
LRMS ersetzt ist.
-
Es
ist einzusehen, dass die Polypeptide der Erfindung entweder durch
Expression einer hierin offenbarten Nucleinsäure oder durch die Verwendung
von Standardmolekularbiologie-Techniken
produziert werden können.
Beispielsweise kann ein trunkiertes Protein der Erfindung durch
Expression einer rekombinanten Nucleinsäure der Erfindung in einer
geeigneten Wirtszelle oder alternativ durch eine Kombination von
ex vivo-Verfahren, z.B. Proteaseverdau und Reinigung eines gereinigten
Wildtyp-Proteins produziert werden.
-
Der
Ausdruck "isoliert" oder "gereinigt", wie er hier unter
Bezugnahme auf ein Polypeptid der Erfindung verwendet wird, bedeutet,
dass das isolierte Protein im Wesentlichen frei von zellulärem Material
ist und beinhaltet Proteinpräparationen,
die weniger als etwa 30%, 20%, 10% oder 5% (als Trockengewicht)
an kontaminierendem Protein haben. Wenn das Protein der Erfindung
oder ein biologischer Teil davon rekombinant produziert wird, stellt
das Kulturmedium weniger als etwa 30%, 20%, 10% oder 5% (als Trockengewicht)
an chemischen Vorläufern
und Chemikalien, die nicht das Protein von Interesse sind, dar.
-
Es
wird erkannt, dass die pestiziden Proteine oligomer sein können und
bezüglich
Molekulargewicht, Anzahl der Reste, Peptidkomponenten, Aktivität gegen
bestimmte Schädlinge
und in anderen Charakteristika variieren werden. Allerdings können durch
die hierin ausgeführten
Verfahren Proteine, die gegen eine Vielzahl von Schädlingen
aktiv sind, isoliert und charakterisiert werden. Die pestiziden
Proteine der Erfindung können in
Kombination mit Bt-Endotoxinen
oder anderen insektiziden Proteinen eingesetzt werden, um den Insektenzielbereich
zu erhöhen.
Darüber
hinaus hat die Verwendung der pestiziden Proteine der Erfindung
in Kombination mit Bt-δ-Endotoxinen
oder anderen insektiziden Wirkstoffen einer unterschiedlichen Natur
besondere Nützlichkeit
für die
Prävention
und/oder Behandlung von Insektenresistenz. Andere insektizide Wirkstoffe
umfassen Proteaseinhibitoren (sowohl Serin- als auch Cystein-Typ), Lectine, α-Amylase
und Peroxidase.
-
Fragmente
und Varianten der Nucleotid- und Aminosäuresequenzen und der Polypeptide,
die dadurch codiert werden, werden von der vorliegenden Erfindung
mit umfasst. Der Ausdruck "Fragment", wie er hierin verwendet
wird, bezieht sich auf einen Teil einer Nucleotidsequenz eines Polynucleotids
oder einen Teil einer Aminosäuresequenz
eines Polypeptids der Erfindung. Fragmente einer Nucleotidsequenz
können
für Proteinfragmente
codieren, die die biologische Aktivität des nativen Proteins beibehalten
und daher pestizide Aktivität besit zen.
Demnach ist es anerkannt, dass einige der Polynucleotid- und Aminosäuresequenzen
der Erfindung korrekt als Fragmente und Varianten bezeichnet werden.
Dies gilt insbesondere für
trunkierte Sequenzen, die biologisch aktiv sind.
-
Es
ist einzusehen, dass der Ausdruck "Fragment", wie er hier verwendet wird, um Nucleinsäuresequenzen
der Erfindung zu bezeichnen, auch Sequenzen umfasst, die als Hybridisierungssonden
nützlich
sind. Diese Klasse von Nucleotidsequenzen codiert im Allgemeinen
keine Fragmentproteine, die biologische Aktivität beibehalten. Somit können Fragmente
einer Nucleotidsequenz von wenigstens etwa 20 Nucleotiden, etwa 50
Nucleotiden, etwa 100 Nucleotiden bis zur Volllängennucleotidsequenz, die die
Proteine der Erfindung codiert, reichen.
-
Ein
Fragment einer Cry8-artigen Nucleotidsequenz, die für einen
biologisch aktiven Teil eines pestiziden Proteins der Erfindung
codiert, wird für
wenigstens 15, 20, 30, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900,
1.000, 1.100 oder 1.200 fortlaufender Aminosäuren oder bis zur Gesamtzahl
der Aminosäuren,
die in einem pestiziden Polypeptid der Erfindung vorliegen, codieren
(z.B. 1.206, 1.210, 667, 667 und 669 Aminosäuren für SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 bzw.
10). Fragmente einer Cry8-artigen Nucleotidsequenz, die als Hybridisierungssonden
oder PCR-Primer einsetzbar sind, brauchen im Allgemeinen nicht für einen
biologisch aktiven Teil eines Pestizidproteins zu codieren.
-
Somit
kann ein Fragment einer Cry8-artigen Nucleinsäure für einen biologisch aktiven
Teil eines pestiziden Proteins codieren oder kann ein Fragment sein,
das als Hybridisierungssonde oder PCR-Primer unter Verwendung der
unten offenbarten Verfahren eingesetzt werden kann. Ein biologisch
aktiver Teil eines pestiziden Proteins kann hergestellt werden,
indem ein Teil einer der Cry8-artigen Nucleotidsequenzen der Erfindung
isoliert wird, der codierte Teil des pestiziden Proteins (z.B. durch
rekombinante Expression in vitro) exprimiert wird und die Aktivität des codierten
Teils des pestiziden Proteins beurteilt wird.
-
Nucleinsäuren, die
Fragmente einer Cry8-artigen Nucleotidsequenz sind, umfassen wenigstens
16, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600,
700, 800, 1.000, 1.204, 1.400, 1.600, 1.800, 2.000, 2.200, 2.400,
2.600, 2.800, 3.000, 3.200, 3.400. oder 3.600 Nucleotide oder bis
zu der Anzahl der Nucleotide, die in einer Cry8-artigen Nucleotidsequenz,
die hierin offenbart ist, vorliegen (z.B. 3.621, 3.633, 2.003, 2.003,
2.010 und 2.010 und 2.022 Nucleotide für SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9,
15 bzw. 17).
-
Beispielsweise
stellen SEQ ID NO: 5, 9, 15 und 19 Fragmente von SEQ ID NO: 1 dar,
und SEQ ID NO: 7 und 17 stellen Fragmente von SEQ ID NO: 3 dar.
Spezifischer ausgedrückt,
bestimmte Ausführungsformen der
Nucleinsäuren
der Erfindung offenbaren Fragmente, die von einer ersten Nucleinsäure der
Erfindung abgeleitet sind (z.B. daraus produziert sind), worin das
Fragment für
ein trunkiertes Cry8-artiges Endotoxin codiert, das durch pestizide
Aktivität
gekennzeichnet ist. Das trunkierte Polypeptid, das durch die Polynucleotidfragmente
der Erfindung codiert wird, ist durch pestizide Aktivität gekennzeichnet,
die im Vergleich zu der Aktivität
des entsprechenden Volllängenpolypeptids,
das durch die erste Nucleinsäure,
aus der das Fragment stammt, codiert wird, entweder gleich oder
verbessert.
-
In
spezifischen Ausführungsformen
sind einige der Nucleinsäurefragmente
der Erfindung am 3'-Ende der
Wildtyp-codierenden Sequenz trunkiert. Beispielsweise stellen SEQ
ID NO: 5 und 15 Fragmente von SEQ ID NO: 1 dar, die am 3'-Ende trunkiert sind.
In einer alternativen Ausführungsform
umfasst eines der Polynucleotide der Erfindung, SEQ ID NO: 19, eine
Nucleinsäuresequenz,
die sowohl am 5'-
als auch am 3'-Ende
der trunkierten 1218-1- und 1218-1A-Toxindomäne, die durch SEQ ID NO: 5
bzw. 15 codiert wird, trunkiert ist.
-
Als "Varianten" sind im Wesentlichen ähnliche
Sequenzen gemeint. Für
Nucleotidsequenzen umfassen konservative Varianten solche Sequenzen,
die wegen der Degeneriertheit des genetischen Codes die Aminosäuresequenz
eines der pestiziden Polypeptide der Erfindung codieren. Natürlich auftretende
Allelvarianten wie diese können
durch die Verwendung gut bekannter Techniken der Molekularbiologie,
wie z.B. durch Polymerasekettenreaktion (PCR) und Hybridisierungstechniken,
wie es unten ausgeführt
wird, identifiziert werden.
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Varianten-Nucleotidsequenzen
umfassen auch synthetisch abgeleitete Nucleotidsequenzen, z.B. solche,
die beispielsweise unter Verwendung einer ortsspezifischen Mutagenese
erzeugt werden, die aber noch für
ein pestizides Protein der Erfindung codieren. Im Allgemeinen werden
Varianten einer bestimmten Nucleotidsequenz der Erfindung wenigstens
etwa 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, im Allgemeinen wenigstens 75%, 80%,
85%, vorzugsweise wenigstens etwa 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%,
93%, 94%, 95%, 96%, 97% und bevorzugter wenigstens etwa 98%, 99%
oder mehr Sequenzidentität
zu der bestimmten Nucleotidsequenz haben, wie es durch Sequenzanordnungsprogramme
bestimmt wird, die an anderer Stelle hierin beschrieben werden,
wobei Defaut-Parameter eingesetzt werden.
-
Der
hierin verwendete Ausdruck "variantes
Protein" bzw. "Varianten-Protein" umfasst Polypeptide,
die von einem nativen Protein durch Deletion (sogenannte Trunkation)
oder Addition einer oder mehrerer Aminosäuren am N-terminalen und/oder
C-terminalen Ende des nativen Proteins; durch Deletion oder Addition
einer oder mehrerer Aminosäuren
an einer oder mehreren Stellen im nativen Protein; oder durch Substitution
einer oder mehrerer Aminosäuren
an einer oder mehreren Stellen im nativen Protein abgeleitet sind.
Dementsprechend umfasst der Ausdruck Varianten-Protein bzw. variantes
Protein biologisch aktive Fragmente eines nativen Proteins, das
eine ausreichende Anzahl von fortlautenden Aminosäureresten
umfasst, um die biologische Aktivität des nativen Proteins beizubehalten.
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Varianten-Proteine,
die von der vorliegenden Erfindung umfasst werden, sind dadurch
biologisch aktiv, dass sie die gewünschte biologische Aktivität des nativen
Proteins weiterhin besitzen, d.h. die pestizide Aktivität, wie sie
hierin beschrieben ist. Solche Varianten können z.B. aus genetischem Polymorphismus
oder aus menschlicher Manipulation resultieren. Biologisch aktive
Varianten eines nativen pestiziden Proteins der Erfindung werden
wenigstens etwa 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, im Allgemeinen wenigstens
etwa 75%, 80%, 85%, vorzugsweise wenigstens etwa 86%, 87%, 88%,
89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% und bevorzugter wenigstens
etwa 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz
für das
native Protein haben, wie es durch Sequenzanordnungsprogramme unter
Verwendung von Defaut-Parametern bestimmt wird, was hier noch an
anderer Stelle beschrieben wird. Eine biologisch aktive Variante
eines Proteins der Erfindung kann sich von diesem Protein um so
wenige wie 1 bis 15 Aminosäurereste,
so wenige wie 1 bis 10, z.B. 6 bis 10, so wenige wie 5, so wenige
wie 4, 3, 2 Aminosäurereste
oder sogar nur um einen Aminosäurerest
unterscheiden.
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Es
ist anerkannt, dass die Nucleinsäuresequenz
irgendeines der Polynucleotide der Erfindung verändert oder mutagenisiert werden
kann, um die biologische Aktivität
und/oder Spezifität
seines codierten pestiziden Polypeptids zu verändern (z.B. zu verbessern).
Zum Beispiel stellt SEQ ID NO: 11 eine Cry8-artige Nucleotidsequenz
bereit, die mutagenisiert wurde, um 12 zusätzliche Nucleotide zu umfassen
(SEQ ID NO: 13), die in der Wildtyp-Nucleinsäuresequenz (SEQ ID NO: 15),
die verändert
wurde, nicht vorliegen. Die Nucleotidsequenz, die in die codierende
Region von SEQ ID NO: 15 insertiert wurde, war so konzipiert, dass
sie für
eine NGRS-Additionsmutante codiert, die eine zusätzliche Trypsin-Spalt stelle
(NGSR) (SEQ ID NO: 14) in der Aminosäuresequenz des codierten Polypeptids
umfasst.
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Spezifischer
ausgedrückt,
die in SEQ ID NO: 14 angegebene Aminosäuresequenz wurde zwischen Aminosäure 164
und 165 des Cry8-δ-Endotoxins,
das in SEQ ID NO: 16 angegeben ist, eingeführt. Diese bestimmte Aminosäuresequenz
wurde ausgewählt,
da sie die endogene Sequenz, die im natürlich vorkommenden Volllängenprotein
(SEQ ID NO: 2) vorliegt, verdoppelt und eine zweite Protease-empfindliche
Stelle schafft. Spezifischer ausgedrückt, die Modifikation führt eine
zweite Trypsin-artige Stelle ein. Es ist dem Fachmann gut bekannt,
dass Trypsin-Bindungen unmittelbar C-terminal zu Aginin und Lysin
spaltet. Wie hierin bewiesen wird, wird das rekombinant gentechnisch
veränderte
Protein (SEQ ID NO: 12), das durch SEQ ID NO: 11 codiert wird, durch
eine verbesserte Aktivität
gegen Coleopterans, insbesondere gegen Colorado-Kartoffelkäfer (siehe
Beispiel 6, Tabelle 1), Southern Corn Rootworm (siehe Beispiel 7,
Tabellen 2 bis 4 und 6) und Western Corn Rootworm (siehe Beispiel
7, Tabelle 5), gekennzeichnet.
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SEQ
ID NO: 21 stellt eine Cry8-artige Nucleotidsequenz dar, die mutagenisiert
wurde, so dass sie 12 zusätzliche
Nucleotide umfasste (SEQ ID NO: 25), die im Wildtyp-Endotoxin nicht
vorhanden sind. Die insertierte Nucleotidsequenz war so konzipiert,
dass sie eine LKMS-Additionsmutante codierte, die eine Chymotrypsin-Spaltstelle
(LKMS) (SEQ ID NO: 26) in der Aminosäuresequenz des codierten Polypeptids
umfasst. Spezifischer ausgedrückt,
die LKMS-Additionsmutante (LKMS.N1218-1) umfasst ein Nucleotidsequenz-Insert,
das die Aminosäuresequenz
LKMS zwischen die Aminosäure
160 und 161 von SEQ ID NO: 6 einführt. Die LKMS-Ersatzmutante
LKMS.R1218-1 umfasst ein Polypeptid, in dem die Aminosäuresequenz
LKMS zwischen Aminosäure
160 und 161 von SEQ ID NO: 16 eingeführt ist und die Aminosäuren NGS
aus den Aminosäurepositionen
161–163
von SEQ ID NO: 16 entfernt sind. Diese Modifikation entfernt eine
Trypsinstelle und führt eine
Chymotrypsinstelle ein. Chymotrypsin spaltet Bindungen unmittelbar
dem C-Terminus zu Methionin.
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Die
LRMS-Additionsmutante (LRMS.N1218-1) und die Ersatzmutante (LRMS.R1218-1)
stellen alternative Ausführungsformen
von Peptiden bereit, die eine zusätzliche oder alternative Chymotrypsin-Spaltstelle umfassen,
allerdings unterscheiden sich die LRMS-Mutanten in der spezifischen
Aminosäuresequenz
(SEQ ID NO: 48) und der Nucleotidsequenz (SEQ ID NO: 47), die verwendet
wird, um die Chymotrypsin-Spaltstelle in die Nucleinsäuresequenz
einzuführen,
die für
die mutanten Polypeptide codiert.
-
SEQ
ID NO: 30 (NGSR.N49PVD), SEQ ID NO: 32 (LKMS.N49PVD), SEQ ID NO:
34 (LKMS.R49PVD), SEQ ID NO: 42 (LRMS.N49PVD) und SEQ ID NO: 46
(LRMS.R49PVD) stellen Mutanten des trunkierten pestiziden Polypeptids
49PVD bereit. Die Aminosäuresequenz
von 49PVD wird in SEQ ID NO: 20 bereitgestellt. Das Grundkonzept
dieser Polypeptide und ihre Nomenklatur folgen demselben Muster,
das oben für
das trunkierte 1218-1-Polypeptid diskutiert wird, und sie werden
an anderer Stelle hierin vollständiger
erläutert.
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Es
ist anerkannt, dass eine beliebige Nucleotidsequenz, die für die Aminosäuresequenzen
NGSR, LKMS oder LRMS codiert, verwendet werden kann und dass die
genaue Identität
der Codons, die verwendet werden, um eine beliebige dieser Spaltstellen
in einen Varianten-Polypeptid einzuführen, in Abhängigkeit
von der Verwendung variieren kann, d.h. von der Expression in einer
bestimmten Pflanzenspecies. Es wird auch erkannt, dass eine beliebige
der offenbarten Mutationen in eine beliebige Polynucleotidsequenz
der Erfindung eingeführt
werden kann, die die Codons für
Aminosäurereste
umfasst, die die native Trypsin-Spaltstelle
bereitstellen, die zur Modifikation targetiert wird. Dementsprechend
können
Varianten entweder der Volllängenendotoxine
oder von Fragmenten davon modifiziert werden, um zusätzliche
oder alternative Spaltstellen zu enthalten; diese Ausführungsformen
sollen vom Rahmen der Erfindung, die hierin offenbart und beansprucht
wird, umfasst werden.
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Die
Erfindung umfasst außerdem
einen Mikroorganismus, der mit wenigstens einer Nucleinsäure der Erfindung,
mit einer Expressionskassette, die die Nucleinsäure umfasst, oder mit einem
Vektor, der die Expressionskassette umfasst, transformiert ist.
Vorzugsweise ist der Mikroorganismus einer, der sich auf Pflanzen vermehrt.
Bevorzugter ist der Mikroorganismus ein Wurzeln besiedelndes Bakterium.
Eine Ausführungsform der
Erfindung bezieht sich auf ein verkapseltes pestizides Protein,
das einen transformierten Mikroorganismus umfasst, der wenigstens
ein pestizides Protein der Erfindung umfasst.
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Die
Erfindung stellt pestizide Zusammensetzungen bereit, die einen transformierten
Organismus der Erfindung umfassen. Vorzugsweise ist der transformierte
Mikroorganismus in der pestiziden Zusammensetzung in einer pestizid
wirksamen Menge zusammen mit einem geeigneten Träger vorhanden. Die Erfindung umfasst
auch pestizide Zusammensetzungen, die ein isoliertes Protein der
Erfindung allein oder in Kombination mit einem transformierten Organismus
der Erfindung und/oder ein eingekapseltes pestizides Protein der Erfindung
in einer insektizid wirksamen Menge zusammen mit einem geeigneten
Träger
umfassen.
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Die
Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Erhöhung des Insektenzielbereichs
bereit, in dem ein pestizides Protein der Erfindung in Kombination
mit wenigstens einem zweiten pestiziden Protein, das sich vom pestiziden
Protein der Erfindung unterscheidet, verwendet wird. Es kann ein
beliebiges pestizides Protein, das auf dem Fachgebiet bekannt ist,
in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Solche
pestiziden Proteine umfassen, sind aber nicht beschränkt auf,
Bt-δ-Endotoxine,
Proteaseinhibitoren, Lectine, α-Amylasen und Peroxidasen.
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Die
Erfindung umfasst transformierte oder transgene Pflanzen, die wenigstens
eine Nucleotidsequenz der Erfindung umfassen. Vorzugsweise ist die
Pflanze stabil mit einem Nucleotidkonstrukt transformiert, das wenigstens
eine Nucleotidsequenz der Erfindung funktionell mit einem Promotor
verknüpft,
umfasst, der eine Expression in einer Pflanzenzelle steuert.
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Die
Ausdrücke "transformierte Pflanze" und "transgene Pflanze", wie sie hierin
verwendet werden, beziehen sich auf eine Pflanze, die in ihrem Genom
ein heterologes Polynucleotid umfasst. Im Allgemeinen ist das heterologe
Polynucleotid stabil innerhalb des Genoms einer transgenen oder
transformierten Pflanze integriert, so dass das Polynucleotid an
nachfolgende Generationen übertragen
wird. Das heterologe Polynucleotid kann allein oder als Teil einer
rekombinanten Expressionkassette in das Genom integriert werden.
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Es
ist einzusehen, dass der Ausdruck "transgen", wie er hier verwendet wird, eine beliebige
Zelle, Zelllinie, Callus, ein beliebiges Gewebe, einen beliebigen
Pflanzenteil oder eine beliebige Pflanze beinhaltet, wobei der Genotyp
davon durch Vorliegen von heterologer Nucleinsäure verändert wurde, einschließlich solcher transgenen
Produkte, die anfänglich
verändert
wurden, wie auch solche, die durch sexuelle Kreuzungen oder asexuelle
Vermehrung aus dem anfänglichen
transgenen Produkt erzeugt wurden. Der Ausdruck "transgen", wie er hier verwendet wird, umfasst
nicht die Veränderung
des Genoms (chromosomales oder extrachromosomales) durch herkömmliche
Pflanzenzüchtungsverfahren
oder durch natürlich
auftretende Ereignisse, z.B. zufällige
Fremdbefruchtung, nicht-rekombinante Virus-Infektion, nicht-rekombinante Bakterien-Transformation,
nicht-rekombinante Transposition oder spontane Mutation.
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Der
Ausdruck "Pflanze", wie er hierin verwendet
wird, umfasst die Bezugnahme auf ganze Pflanzen, Pflanzenorgane
(z.B. Blätter,
Stengel, Wurzeln usw.), Samen und Pflanzenzellen und die Nachkommenschaft derselben.
Teile von transgenen Pflanzen werden im Rah men der vorliegenden
Erfindung so verstanden, dass sie z.B. Pflanzenzellen, Protoplasten,
Gewebe, Callus, Embryos wie auch Blüten, Stengel, Früchte, Blätter, Wurzeln,
die von transgenen Pflanzen oder deren Nachkommenschaft stammen,
welche vorher mit einem DNA-Molekül der Erfindung
transformiert wurden, und daher wenigstens teilweise aus transgenen
Zellen bestehen, sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
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Der
Ausdruck "Pflanzenzelle", wie er hierin verwendet
wird, umfasst ohne Beschränkung
Samensuspensionskulturen, Embryos, Meristembereiche, Callusgewebe,
Blätter,
Wurzeln, Schößlinge,
Gametophyten, Sporophyten, Pollen und Mikrosporen. Die Klasse von
Pflanzen, die in den Verfahren der Erfindung eingesetzt werden kann,
ist im Allgemeinen so breit wie die Klasse höherer Pflanzen, die Transformationstechniken
zugänglich
ist, einschließlich
monokotyler und dikotyler Pflanzen. Eine bevorzugte Pflanze ist
Solanum tuberosum. Eine besonders bevorzugte Pflanze ist Zea mays.
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Obgleich
die Erfindung nicht von einem bestimmten geologischen Mechanismus
zur Erhöhung
der Resistenz einer Pflanze gegenüber einem Pflanzenschädling abhängt, kann
eine Expression der Nucleotidsequenzen der Erfindung in einer Pflanze
zur Produktion von pestiziden Proteinen der Erfindung und in einer
Erhöhung
der Resistenz der Pflanze gegenüber
einem Pflanzenschädling
resultieren. Die Pflanzen der Erfindung finden in der Landwirtschaft
bei Verfahren zur Bekämpfung
von Insektenschädlingen
Verwendung. Bestimmte Ausführungsformen
der Erfindung stellen transformierte Maispflanzen bereit, die in
Verfahren zur Bekämpfung von
Western und Southern Corn Rootworms Verwendung finden. Eine andere
Ausführungsform
der Erfindung stellt transformierte Kartoffelpflanzen bereit, die
in Verfahren zur Bekämpfung
des Colorado-Kartoffelkäfers Anwendung
finden.
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Ein
Fachmann auf diesem Gebiet wird leicht erkennen, dass Fortschritte
auf dem Gebiet der Molekularbiologie, z.B. ortsspezifische und statistische
Mutagenese, Polymerasekettenreaktions-Methodologien und Proteingentechniken
eine ausgedehnte Sammlung von Werkzeugen und Protokollen bereitstellen,
die zur Verwendung zur Veränderung
oder gentechnischen Manipulation sowohl der Aminosäuresequenz
als auch dieser zugrundeliegenden genetischen Sequenzen von Proteinen
von landwirtschaftlichem Interesse geeignet sind. Somit können Cry8-artige
Proteine der Erfindung auf verschiedenen Wegen, einschließlich Aminosäuresubstitutionen,
-deletionen, -verkürzungen
und -insertionen, verändert
werden. Verfahren für
solche Manipulationen sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt.
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Beispielsweise
können
Aminosäuresequenz-Varianten
der pestiziden Proteine durch Einführung von Mutationen in eine
synthetische Nucleinsäure
(z.B. DNA-Molekül)
hergestellt werden. Verfahren zur Mutagenese und Nucleinsäure-Veränderungen
sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Beispielsweise können konzipierte Änderungen
unter Verwendung einer Oligonucleotid-vermittelten, ortsspezifischen
Mutagenesetechnik eingeführt
werden. Siehe z.B. Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:
488–492;
Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 154: 367–382; US-Patent
4,873,192; Walker und Gaastra, Herausg. (1983) Techniques in Molecular
Biology (MacMillan Publishing Company, New York) und darin zitierte
Referenzen.
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Die
Wildtyp- (z.B. natürlich
vorkommenden) Nucleotidsequenzen der Erfindung wurden aus Stämmen von
Bacillus thuringiensis erhalten, die für Cry8-artige δ-Endotoxine
codieren. Es ist gut bekannt, dass natürlich vorkommende δ-Endotoxine
durch sporulierende Zellen von B. thuringiensis als proteinartiges
kristallines Einschlussprotoxin synthetisiert werden. Bei Aufnahme
durch empfindliche Insektenlarven lösen sich die Mikrokristalle
im Mitteldarm, und das Protoxin wird durch Proteasen, die charakteristische
Verdauungsenzyme sind, die im Insektendarm lokalisiert sind, in
eine biologisch aktive Gruppierung transformiert. Das aktivierte δ-Endotoxin
bindet mit hoher Affinität
an Proteinrezeptoren an Bürstensaummembranvesikel.
Die Epitelzellen, die den Mitteldarm auskleiden, sind das primäre Ziel
des Endotoxins und werden als Folge der Membranperforation, die
aus der Bildung von kontrollierten Kationen-selektiven Kanälen resultiert,
rasch durch das Toxin zerstört.
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Ein
Vergleich der Aminosäuresequenzen
von Cry-Toxinen verschiedener Spezifität zeigt fünf hoch konservierte Sequenzblöcke. Strukturell
umfassen die δ-Endotoxine
drei unterschiedliche Domänen,
die vom N- zum C-Terminus sind: ein Cluster von sieben α-Helices,
die bei der Porenbildung beteiligt sind, drei anti-parallele β-Faltblätter, die
bei der Zellbindung impliziert sind, und ein β-Sandwich.
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Die
mutanten Cry8-Polypeptide der vorliegenden Erfindung wurden im Allgemeinen
durch ein Verfahren hergestellt, das die folgenden Schritte involvierte:
Erhalt einer Nucleinsäuresequenz,
die für
ein Cry8-Polypeptid codiert; Analysieren der Struktur des Polypeptids,
um bestimmte "Target"-Stellen zur Mutagenese
der zugrundeliegenden Gensequenz zu identifizieren, und zwar auf
der Basis der Betrachtung der vorgeschlagenen Funktion der Targetdomäne im Wirkmodus
des Endotoxins; Einführen
einer oder mehrerer Mutationen in die Nucleinsäuresequenz, um eine gewünschte Änderung
in einem oder mehreren Aminosäure rest(en)
der codierten Polypeptidsequenz zu erzeugen, wobei die Änderung
so konzipiert ist, dass sie eine Protease-empfindliche Spaltstelle
an die Targetregion addiert oder die ursprüngliche Protease-empfindliche
Stelle entfernt und eine Protease-empfindliche Stelle addiert, die
gegenüber
der Aktivität
einer anderen Protease empfindlich ist; und Exprimieren der mutagenisierten
Nucleinsäuresequenz,
die für
das rekombinant manipulierte Protein der Erfindung codiert, in einer
transformierten Wirtszelle unter Bedingungen, die zur Erzielung
der Expression des modifizierten Cry8-Polypeptids wirksam sind.
-
Viele
der δ-Endotoxine
sind durch Ähnlichkeiten
in ihren Aminosäuresequenzen
und ihrer Tertiärstruktur
zu gewissen Graden verwandt, und Mittel zum Erhalten der Kristallstrukturen
von B. thuringiensis-Endotoxinen sind gut bekannt. Beispiele für eine Hochauflösungs-Kristallstruktur-Lösung der
beiden Polypeptide Cry3A und Cry3B sind in der Literatur verfügbar. Die
Erfinder der vorliegenden Erfindung verwendeten die aufgelöste Struktur
des Cry3A-Gens (Li et al. (1991) Nature 353: 815–821), um ein Homologiemodell
des Cry8-δ-Endotoxins, das hierin
als SEQ ID NO: 2 offenbart und beansprucht wird, zu erzeugen, um
Einsicht in die Beziehung zwischen Struktur und Funktion des Endotoxins
zu erlangen und um die rekombinant manipulierten Proteine zu entwickeln,
die hierin offenbart und beansprucht werden. Eine kombinierte Betrachtung
der veröffentlichten
Strukturanalysen von B. thuringiensis-Endotoxinen und die beschriebene
Funktion, die mit bestimmten Strukturen, Motiven und dergleichen
verbunden ist, zeigt, dass spezifische Regionen des Endotoxins mit
bestimmten Funktionen und getrennten Schritten des Wirkmodus des
Proteins in Korrelation stehen. Beispielsweise werden δ-Endotoxine,
die aus B. thuringiensis isoliert wurden, allgemein so beschrieben,
dass sie drei Domänen,
ein Sieben-Helix-Bündel,
das in der Porenbildung involviert ist, eine Drei-Faltblatt-Domäne, die bei
der Rezeptorbindung impliziert ist, und ein β-Sandwich-Motiv umfassen (Li
et al. (1991) Nature, 305: 815–821).
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Die
Erfinder zogen den Schluss, dass die Toxizität von Cry8-artigen Proteinen
und speziell die Toxizität des
Cry8-Proteins durch Targetieren der Region, die zwischen den α-Helices 3 und 4 von
Domäne
1 des Endotoxinproteins lokalisiert ist, verbessert werden könnte. Diese
Theorie wurde auf der Basis des Wissens, das beschrieben wurde,
dass die α-Helices
4 und 5 von Domäne
1 von Cry3A-δ-Endotoxinen
in die Lipid-Bilayer von Zellen insertiert werden, welche den Mitteldarm
von empfindlichen Insekten auskleiden (Gazit et al., (1998) PNAS
USA 95: 12289–12294);
auf der Basis der Kenntnis der Erfinder der Lage von Trypsin- und Chymotrypsin-Spaltstellen
innerhalb der Aminosäuresequenz
des Wildtyp-Proteins und der hierin beschriebenen Beobachtung, dass
das Protein, das durch 1218-1 codiert wird (d.h. SEQ ID NO: 2),
gegen bestimmte Coleopterane nach in vitro-Aktivierung durch Trypsin- oder Chymotrypsin-Behandlung
aktiver war, postuliert. Dementsprechend konstruierten die Erfinder
ein mutantes Cry8-artiges Protein, das wenigstens eine zusätzliche
Trypsin-Spaltstelle
in der Region, die zwischen den Helices 3 und 4 von Domäne 1 lokalisiert
ist, umfasst.
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Spezifischer
ausgedrückt,
die Erfinder produzierten mutagenisierte Cry8-artige Nucleotidsequenzen, die
für mutante
Cry8-Endotoxine (z.B. Polypeptide) codieren, die entweder zusätzliche
oder alternative Protease-empfindliche Stellen umfassen. Die Erfindung
stellt mutante Polypeptide zur Verfügung, die entweder in einem
1218-1- (SEQ ID NO: 6 oder 16) oder einem 49PVD (SEQ ID NO: 20)-Hintergrund
konstruiert wurden. Es sollte klar sein, dass die Bezeichnung 1218-1,
wie sie hier verwendet wird, zwei Ausführungsformen (z.B. 1218-1 und
1218-1A) der 1218-1-Nucleotid- und -Aminosäuresequenzen, die hier gezeigt
sind, umfasst. Dies gilt insbesondere im Kontext der offenbarten
Additions- und Ersatzmutanten, die entweder im 1218-1- oder 49PVD-Hintergrund
erzeugt wurden. Es ist einzusehen, dass die Nomenklatur, die hierin
verwendet wird, um eine Mutante zu bezeichnen, z.B. die NGSR.N1218-1-Mutante,
Mutanten in Betracht zieht, die im 1218-1- und im 1218-1A-Hintergrund geschaffen
wurden. Zum Zwecke der Konsistenz verkörpern die Sequenzen, die im Sequenzprotokoll
für die
1218-1-Mutanten angegeben sind, Mutanten, die in den 1218-1A-Sequenzen (SEQ ID
NO: 15 und 16) erzeugt wurden.
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Allgemein
ausgedrückt,
alle hierin beschriebenen mutanten Polypeptide sind so konzipiert,
dass sie wenigstens eine proteolytische Spaltstelle umfassen, die
sich zwischen Helix 3 und 4 von Domäne 1 befindet und die im Wildtyp-Polypeptid
nicht vorliegt. Alle hier offenbarten Mutanten wurden in das pET-Expressionssystem
cloniert, in E. coli exprimiert und auf pestizide Aktivität zuerst
gegen Southern Corn Rootworm (SCRW) und dann Western Corn Rootworm
(WCRW) (Diaprotica virgifera) getestet. Zusätzlich wurden die 49PVD-Variante
(SEQ ID NO: 20) und die NGSR.N1218-1-Mutante (SEQ ID NO: 12) auf
pestizide Aktivität
gegen den Colorado-Kartoffelkäfer
(CPB) getestet.
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Kurz
ausgedrückt,
die hierin bereitgestellten Mutanten umfassen: Mutanten, die eine
zweite Trypsin-Spaltstelle (d.h. NGSR (SEQ ID NO: 14)) in die Aminosäuresequenz
des Fragments, das in SEQ ID NO: 6 (1218-1) oder SEQ ID NO: 16 (1218-1A)
dargestellt ist, oder des Fragments, das in SEQ ID NO: 20 (49PVD) dargestellt
ist, eingeführt
umfassen; Mutanten, die eine Chymotrypsin-Spaltstelle umfassen,
die entweder die Aminosäuresequenz
LKMS (SEQ ID NO: 26) oder LRMS (SEQ ID NO: 48) eingeführt vor
der (z.B. direkt 5' der)
Trypsin-Spaltstelle, die natürlicher
Weise in der modifizierten Polypeptidsequenz vorliegt, eingeführt umfasst;
und Ersatzmutanten, in denen die native Trypsinstelle, die in der
Toxindomäne
des modifizierten Polypeptids auftritt, zerstört ist und an ihrer Stelle
eine Chymotrypsinstelle (z.B. LKMS oder LRMS) eingeführt ist.
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Die
1218-1-Reihe von Mutanten, die hierin offenbart sind, werden als
NGSR.N1218-1, LKMS.N1218-1, LKMS.R1218-1, LRMS.N1218-1 und LRMS.R1218-1
bezeichnet. Die Aminosäuresequenzen dieser
mutanten Polypeptide sind in SEQ ID NO: 12, 22, 24, 42 bzw. 44 angegeben.
Die Erfindung stellt auch eine zweite Reihe von mutanten Polypeptiden
bereit (SEQ ID NO: 30, 32, 34, 42 und 46), in die die oben beschriebenen
Additions- (Trypsin- oder Chymotrypsin-Spaltstellen) und Ersatz-
(eine Chymotrypsin-Spaltstelle anstelle der Trypsinstelle) Mutationen
in das trunkierte Polypeptid (z.B. 49PVD), das in SEQ ID NO: 20
angegeben ist, eingeführt
wurden. Diese Reihe von Mutanten werden als NGSR.N49PVD, LKMS.N49PVD, LKMS.R49PVD,
LRMS.N49PVD und LRMS.R49PVD bezeichnet. Die Aminosäuresequenzen
jedes der 49PVD-Mutanten-Polypeptide sind in SEQ ID NO: 30, 32,
34, 42 bzw. 46 angegeben.
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Die
hierin offenbarten NGSR-Mutanten umfassen eine zusätzliche
Trypsin-empfindliche
Proteasestelle in einer Region der Aminosäuresequenz, die für Domäne 1 des
Polypeptids codiert. Beispielsweise umfasst die NGSR.N1218-1-Mutante
eine NGSR-Sequenz,
die zwischen die Aminosäurereste
164 und 165 des Wildtyp-Proteins eingeführt ist. Diese Aminosäuresequenz
stellt eine zweite Trypsin-empfindliche Spaltstelle in dem mutanten
Endotoxin, das durch SEQ ID NO: 11 codiert wird, bereit. Spezifischer
ausgedrückt,
die NGSR-Sequenz (z.B. SEQ ID NO: 14) verdoppelt die endogene Trypsin-Spaltstelle,
die am Zielort vorliegt, wodurch eine zweite Protease-empfindliche
Stelle in der Schleifenregion eingeführt wird, welche zwischen den α-Helices
3 und 4 von Domäne
1 lokalisiert ist. Demnach liest sich die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 14,
beginnend am Rest 160, als NGSRNGSR. Dagegen umfassen die Aminosäurepositionen
160–164
des Wildtyp-Proteins die Sequenz NGSR.
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Obgleich
keine Bindung an eine Theorie gewünscht wird, wird angenommen,
dass das Vorliegen einer zweiten Protease-empfindlichen (z.B. Trypsin-
oder Chymotrypsin-)Stelle die intramolekulare proteolytische Spaltung
durch Erhöhung
der Fähigkeit
der Helices 4 und 5, sich vom Rest des Toxins abzutrennen, erleichtert wird.
Die Effekte einer Verstärkung
der Fähigkeit
der Helices 4 und 5, sich vom Rest des Toxins abzuspalten, würde als
effizienterer Porenbildungsprozess gezeigt werden und verleiht daher
eine Erhöhung
der insektiziden Aktivität
des Toxins. In der Tat zeigen die Cry8-Mutanten, die hierin beschrieben
werden, eine verbesserte Toxizität
gegenüber
verschiedenen Coleopteran-Schädlingen.
Die Daten legen außerdem
nahe, dass das Vorliegen der zweiten Protease-empfindlichen Stelle
ein Polypeptid produziert, das für
eine Aktivierung durch die Verdauungsprozesse von empfindlichen
Insekten zugänglicher
ist.
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Die
mutagenisierten Cry8-artigen Nucleotidsequenzen der Erfindung können so
modifiziert werden, dass etwa 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12 oder mehr
der Aminosäuren,
die in der Primärsequenz
des codierten Polypeptids vorliegen, verändert werden. Alternativ können sogar
noch mehr Änderungen
bezüglich
der nativen Sequenz eingeführt
werden, so dass das codierte Protein wenigstens etwa 1% oder 2%
oder alternativ etwa 3% oder etwa 4% oder sogar etwa 5% oder mehr
der Codons verändert
oder in anderer Weise modifiziert haben kann. Es sollte einzusehen
sein, dass die mutagenisierten Cry8-artigen Nucleotidsequenzen der
vorliegenden Erfindung dazu bestimmt sind, biologisch funktionelle äquivalente
Peptide zu umfassen. Solche Sequenzen können als Folge der Codon-Redundanz
und der funktionellen Äquivalenz,
die bekanntermaßen
innerhalb von Nucleinsäuresequenzen
und den dadurch codierten Sequenzen natürlicher Weise auftreten, entstehen.
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Ein
Fachmann wird erkennen, dass Aminosäureadditionen und/oder -substitutionen
im Allgemeinen auf der relativen Ähnlichkeit der Aminosäure-Seitenkettensubstituenten,
z.B. ihrer Hydrophobie, Ladung, Größe und dergleichen, basieren.
Beispielhafte Substitutionen, die verschiedene der vorangehenden
Charakteristika in Betracht ziehen, sind dem Fachmann gut bekannt
und umfassen: Arginin und Lysin; Glutamat und Aspartat; Serin und
Threonin; Glutamin und Asparagin; und Valin, Leucin und Isoleucin.
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Eine
Anleitung für
geeignete Aminosäuresubstitutionen,
die die biologische Aktivität
des Proteins von Interesse nicht beeinträchtigen, können im Modell von Dayhoff
et al. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed.
Res. Found., Washington, D.C.) gefunden werden, das hierin durch
Referenz aufgenommen wird. Konservative Substitutionen, z.B. Austausch
einer Aminosäure
mit einer anderen, die ähnliche Eigenschaften
hat, können
bevorzugt sein.
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Somit
umfassen die Gene und Nucleotidsequenzen der Erfindung sowohl die
natürlich
vorkommenden Sequenzen wie auch mutante Formen. Entsprechend umfassen
die Proteine der Erfindung sowohl natürlich vorkommende Proteine
wie auch Variationen (z.B. trunkierte Polypeptide) und modifizierte
(z.B. mutante) Formen davon. Solche Varianten werden weiterhin die
gewünschte
pestizide Aktivität
besitzen. Offensichtlich dürfen
die Mutationen, die in der DNA, die für die Variante codiert, die
Sequenz nicht außerhalb
des Leserasters platzieren und werden vorzugsweise keine komplementären Regionen
schaffen, die eine sekundäre mRNA-Struktur
produzieren könnten.
Siehe EP-Patentanmeldung, Veröffentlichungsnummer
0 075 444.
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Es
wird nicht erwartet, dass die hierin umfassten Deletionen, Insertionen
und Substitutionen der Proteinsequenzen radikale Veränderungen
in den Charakteristika des Proteins erzeugen. Wenn es allerdings schwierig
ist, den exakten Effekt der Substitution, Deletion oder Insertion
im voraus vorauszusagen, wird ein Fachmann erkennen, dass der Effekt
durch Routine-Screeningassays, z.B. Insektenfraßassays, beurteilt werden wird.
Siehe z.B. Marrone et al. (1985) J. Econ. Entomol., 78: 290–293 und
Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83: 2480–2485.
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Varianten-Nucleotidsequenzen
und Proteine umfassen auch Sequenzen und Proteine, die aus einem mutagenen
und rekombinogenen Verfahren, z.B. DNA-Shuffling, stammen. Mit einem
solchen Verfahren können
eine oder mehrere verschiedene Cry8-artige codierende Sequenzen
so manipuliert werden, dass sie ein neues pestizides Protein erzeugen,
das die gewünschten
Eigenschaften besitzt. Auf diese Weise werden Bibliotheken rekombinanter
Polynucleotide aus einer Population sequenzverwandter Polynucleotide
erzeugt, die Sequenzregionen umfassen, die eine wesentliche Sequenzidentität haben,
und die in vitro oder in vivo homolog rekombiniert werden können. Unter
Verwendung dieses Ansatzes können
z.B. codierende Volllängen-Sequenzen,
Sequenzmotive, die für
eine Domäne
von Interesse codieren, oder ein beliebiges Fragment einer Nucleotidsequenz
der Erfindung zwischen den Cry8-artigen
Nucleotidsequenzen der Erfindung und entsprechenden Teilen anderer
bekannter Cry-Nucleotidsequenzen
hin- und hergeschoben werden, um ein neues Gen zu erhalten, das
für ein
Protein mit einer verbesserten Eigenschaft von Interesse codiert.
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Eigenschaften
von Interesse umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, pestizide Aktivität pro Einheit an
pestizidem Protein, Proteinstabilität und Toxizität gegenüber Nicht-Zielspecies,
insbesondere Menschen, Viehbestand und Pflanzen und Mikroben, die
das pestizide Polypeptid der Erfindung exprimieren. Die Erfindung
ist nicht durch eine bestimmte Shuffling-Strategie gebunden, nur
dadurch, dass wenigstens eine Nucleotidsequenz der Erfindung oder
ein Teil davon in einer solchen Shuffling-Strategie involviert ist.
Shuffling kann nur Nucleotidsequenzen, die hierin offenbart sind,
involvieren oder kann zusätzlich
ein Shuffling von anderen Nucleotidsequenzen, die auf dem Fachgebiet
bekannt sind, involvieren; diese umfassen, sind aber nicht beschränkt auf,
GenBank-Zugangsnummern U04364, U04365 und U04366. Strategien zum
DNA-Shuffling sind auf dem Fachgebiet bekannt. Siehe z.B. Stemmer
(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747–10751; Stemmer (1994) Nature
370: 389–391;
Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15: 436–438; Moore et al. (1997) J. Mol.
Biol. 272: 336–347;
Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4504–4509; Crameri
et al. (1998) Nature 391: 288–291
und US-Patente Nrn. 5,605,793 und 5,837,458.
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Die
Nucleotidsequenzen der Erfindung können auch verwendet werden,
um entsprechende Sequenzen aus anderen Organismen, insbesondere
anderen Bakterien, und speziell anderen Bacillus-Stämmen zu isolieren.
Auf diese Weise können
Verfahren, z.B. PCR, Hybridisierung und dergleichen, eingesetzt
werden, um solche Sequenzen auf der Basis ihrer Sequenzhomologie
zu den Sequenzen, die hierin angegeben sind, zu identifizieren.
Sequenzen, die auf der Basis ihrer Sequenzidentität zu den
ganzen Cry8-artigen Sequenzen, die hierin angegeben sind, oder zu
Fragmenten davon isoliert wurden, werden durch die vorliegende Erfindung umfasst.
Solche Sequenzen umfassen Sequenzen, die Orthologe der offenbarten
Sequenzen sind. Mit "Orthologen" sind Gene gemeint,
die von einem gemeinsamen Stammgen abgeleitet sind, und die als
Speziationsresultat in verschiedenen Species gefunden werden. Gene,
die in verschiedenen Species gefunden werden, werden als Orthologe
angesehen, wenn ihre Nucleotidsequenzen und/oder ihre codierten
Proteinsequenzen wesentliche Identität teilen, wie sie an anderer
Stelle hier definiert ist. Funktionen von Orthologen werden unter Species
oft in hohem Maße
konserviert.
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In
einem PCR-Ansatz können
Oligonucleotidprimer zur Verwendung in PCR-Reaktionen entwickelt werden, um entsprechende
DNA-Sequenzen aus cDNA oder genomischer DNA, die aus einem Organismus von
Interesse extrahiert wurde, zu amplifizieren. Verfahren zur Entwicklung
von PCR-Primern und zur PCR-Klonierung sind auf dem Fachgebiet allgemein
bekannt und sind bei Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A
Laboratory Manual (2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Plainview, N.Y.), offenbart. Siehe auch Innis et al., Hrsg. (1990)
PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Aca demic Press,
New York); Innis und Gelfand, Hrsg. (1995) PCR Strategies (Academic
Press, New York); und Innis und Gelfand, Hrsg. (1999) PCR Methods
Manual (Academic Press, New York). Bekannte PCR-Verfahren umfassen,
sind aber nicht beschränkt
auf, Verfahren unter Verwendung von gepaarten Primern, verschachtelten
Primern, einzelnen spezifischen Primern, degenerierten Primern,
genspezifischen Primern, vektorspezifischen Primern, teilweise fehlgepaarten
Primern und dergleichen.
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In
Hybridisierungstechniken wird die gesamte bekannte Nucleotidsequenz
oder ein Teil davon als Sonde verwendet, die selektiv an andere
entsprechende Nucleotidsequenzen hybridisiert, die in einer Gruppe
von klonierten genomischen DNA-Fragmenten oder cDNA-Fragmenten (d.h.
genomischer oder cDNA-Bibliotheken) aus einem ausgewählten Organismus
vorliegen. Die Hybridisierungssonden können genomische DNA-Fragmente,
cDNA-Fragmente,
RNA-Fragmente oder andere Oligonucleotide sein und können mit
einer detektierbaren Gruppe, z.B. 32P, oder
einem anderen detektierbaren Marker markiert sein. So können z.B.
Sonden zur Hybridisierung durch Markierung synthetischer Oligonucleotide
basierend auf Cry8-artigen Sequenzen der Erfindung hergestellt werden.
Verfahren zur Herstellung von Sonden zur Hybridisierung und zur
Konstruktion von cDNA- und genomischen Bibliotheken sind auf dem
Fachgebiet allgemein bekannt und sind in Sambrook et al. (1989)
Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Auflage, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.) offenbart.
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Beispielsweise
kann eine ganze Cry8-artige Sequenz, die hierin offenbart ist, oder
es kann ein Teil oder es können
mehrere Teile davon als Sonde verwendet werden, die fähig ist,
spezifisch an entsprechende Cry8-artige Sequenzen und Messenger-RNAs
zu hybridisieren. Um eine spezifische Hybridisierung unter einer Vielzahl
von Bedingungen zu erreichen, umfassen solche Sonden Sequenzen,
die unter Cry8-artigen Sequenzen einzigartig sind und die vorzugsweise
wenigstens etwa 10 Nucleotide lang sind und am bevorzugtesten wenigstens
etwa 20 Nucleotide lang sind. Solche Sonden können verwendet werden, um entsprechende Cry8-artige
Sequenzen aus einem gewählten
Organismus durch PCR zu amplifizieren. Diese Technik kann verwendet
werden, um zusätzliche
codierende Sequenzen aus einem gewünschten Organismus zu isolieren, oder
als diagnostischer Assay eingesetzt werden, um das Vorliegen von
codierenden Sequenzen in einem Organismus zu bestimmen. Hybridisierungstechniken
umfassen Hybridisierungsscreenings von plattierten DNA-Bibliotheken
(entweder Pla ques oder Kolonien, siehe z.B. Sambrook et al. (1989)
Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Auflage, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.)).
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Eine
Hybridisierung von solchen Sequenzen kann unter stringenten Bedingungen
durchgeführt
werden. Mit "stringenten
Bedingungen" oder "stringenten Hybridisierungsbedingungen" sind Bedingungen
gemeint, unter welchen eine Sonde an ihre Zielsequenz zu einem detektierbar
höheren
Grad als an andere Sequenzen hybrisieren wird (z.B. wenigstens 2-fach
gegenüber
dem Hintergrund). Stringente Bedingungen sind sequenzabhängig und
werden unter unterschiedlichen Umständen verschieden sein. Indem
die Stringenz der Hybridisierung und/oder der Waschbedingungen kontrolliert
wird, können
Targetsequenzen, die zu 100% komplementär zu der Sonde sind, identifiziert
werden (homologe Sondierung). Alternativ können Stringenzbedingungen so
eingestellt werden, dass sie eine gewisse Fehlpaarung in Sequenzen
zulassen, so dass niedrigere Ähnlichkeitsgrade
detektiert werden (heterologe Sondierung). Im Allgemeinen ist eine
Sonde weniger als etwa 1.000 Nucleotide lang, vorzugsweise weniger
als 500 Nucleotide lang.
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Typischerweise
werden stringente Bedingungen solche sein, unter denen die Salzkonzentration
weniger als etwa 1,5 M Na-Ion-, typischerweise etwa 0,01 bis 1,0
M Na-Ion-Konzentration
(oder andere Salze) bei pH 7,0 bis 8,3 ist und die Temperatur wenigstens
etwa 30°C
ist, und zwar für
kurze Sonden (z.B. 10 bis 50 Nucleotide) und wenigstens etwa 60°C für lange
Sonden ist (z.B. größer als
50 Nucleotide). Stringente Bedingungen können auch mit Zusatz von destabilisierenden
Mitteln, z.B. Formamid, erreicht werden. Beispielhafte Bedingungen
niedriger Stringenz umfassen eine Hybridisierung mit einer Pufferlösung von
30 bis 35% Formamid, 1 M NaCl, 1% SDS (Natriumdodecylsulfat) bei
37°C und
einen Waschgang in 1 × bis
2 × SSC
(20 × SSC =
3,09 M NaCl/0,3 M Trinatriumcitrat) bei 50 bis 55°C. Beispielhafte
Bedingungen moderater Stringenz umfassen eine Hybridisierung in
40 bis 45% Formamid, 1,0 M NaCl, 1% SDS bei 37°C und einen Waschgang in 0,5 × bis 1 × SSC bei
55 bis 60°C.
Beispielhafte Bedingungen hoher Stringenz umfassen eine Hybridisierung
in 50% Formamid, 1,0 M NaCl, 1% SDS bei 37°C und einen Waschgang in 0,1 × SSC bei
60 bis 65°C.
Die Hybridisierungsdauer ist im Allgemeinen weniger als etwa 24
Stunden, üblicherweise
etwa 4 bis etwa 12 Stunden.
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Spezifität ist typischerweise
die Funktion von Nachhybridisierungswaschgängen, wobei die kritischen Faktoren
die Ionenstärke
und die Temperatur der Endwaschlösung
sind. Für
DNA-DNA-Hybride kann die Tm aus der Gleichung
von Meinkoth und Wahl (1984) Anal. Biochem. 138: 267–284 genähert werden:
Tm = 81,5°C +
16,6(logM) + 0,41 (% GC) – 0,61
(% Form) – 500/L,
worin M die Molarität
von einwertigen Kationen ist, % GC der %-Wert an Guanosin- und Cytosinnucleotiden
in der DNA ist, % Form der %-Gehalt an Formamid in der Hybridisierungslösung ist
und L die Länge
des Hybrids in Basenpaaren ist. Tm ist die
Temperatur (unter definierter Ionenstärke und definiertem pH), bei
der 50% einer komplementären
Zielsequenz an eine perfekt übereinstimmende
Sonde hybridisiert. Tm wird für jedes
1% Fehlpaarung um etwa 1°C
verringert; somit können Tm, Hybridisierungs- und/oder Waschbedingungen
eingestellt werden, um an Sequenzen der gewünschten Identität zu hybridisieren.
Wenn z.B. Sequenzen mit ≥ 90%
Identität
gesucht werden, kann die Tm 10°C verringert
werden. Im Allgemeinen werden stringente Bedingungen so gewählt, dass
sie etwa 5°C
niedriger sind als der thermische Schmelzpunkt (Tm)
für die
spezifische Sequenz und ihr Komplement bei einer definierten Ionenstärke und
einem definierten pH. Allerdings können stark stringente Bedingungen
eine Hybridisierung und/oder eine Waschung bei 1, 2, 3 oder 4°C unter dem
thermischen Schmelzpunkt (Tm) nutzen; moderat
stringente Bedingungen können
eine Hybridisierung und/oder Waschung bei 6, 7, 8, 9 oder 10°C unter dem
thermischen Schmelzpunkt (Tm) nutzen. Bedingungen
niedriger Stringenz können
eine Hybridisierung und/oder ein Waschen bei 11, 12, 13, 14, 15
oder 20°C
unter dem thermischen Schmelzpunkt (Tm)
nutzen. Unter Verwendung der Gleichung, der Hybridisierung und der
Waschlösungszusammensetzungen
und der gewünschten
Tm werden Fachleute verstehen, dass Veränderungen
in der Hybridisierungsstringenz und/oder der Waschlösungen inhärent beschrieben
sind. Wenn der gewünschte
Grad der Fehlpaarung in einer Tm von weniger
als 45°C (wässrige Lösung) oder
32°C (Formamidlösung) resultiert,
ist es bevorzugt, die SSC-Konzentration so zu erhöhen, dass
eine höhere
Temperatur verwendet werden kann. Eine umfangreiche Anleitung zur
Hybridisierung von Nucleinsäuren
wird in Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and
Moleculax Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Teil I,
Kapitel 2 (Elsevier, New York); und Ausubel et al., Hrsg. (1995)
Current Protocols in Molecular Biology, Kapitel 2 (Greene Publishing
and Wiley-Interscience, New York) gefunden. Siehe Sambrook et al.
(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Ausgabe, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.). Demnach werden
von der vorliegenden Erfindung isolierte Sequenzen, die für ein Cry8-artiges
Protein der Erfindung codieren und unter stringenten Bedingungen
an die hierin offenbarten Cry8-artigen Sequenzen oder Fragmente
davon hybridisieren, umfasst.
-
Die
folgenden Ausdrücke
werden verwendet, um die Sequenzbeziehungen zwischen zwei oder mehr Nucleinsäuren oder
Polynucleotiden zu beschreiben: (a) "Referenzsequenz", (b) "Vergleichsfenster", (c) "Sequenzidentität", (d) "Prozentwert der Sequenzidentität" und (e) "wesentliche Identität".
- (a) "Referenzsequenz", wie der Ausdruck
hierin verwendet wird, ist eine definierte Sequenz, die als Basis für einen
Sequenzvergleich verwendet wird. Eine Referenzsequenz kann ein Untersatz
oder eine Gesamtheit einer spezifizierten Sequenz sein, z.B. ein
Segment einer Volllängen-cDNA
oder einer Gensequenz oder die vollständige cDNA oder Gensequenz.
- (b) "Vergleichsfenster", wie der Ausdruck
hierin verwendet wird, bezieht er sich auf ein fortlaufendes und spezifiziertes
Segment einer Polynucleotidsequenz, wobei die Polynucleotidsequenz
im Vergleichsfenster Additionen oder Deletionen (d.h. Lücken bzw.
Gaps) im Vergleich zur Referenzsequenz (die keine Additionen oder
Deletionen umfasst) zur optimalen Anordnung der zwei Sequenzen umfassen
kann. Im Allgemeinen ist das Vergleichsfenster wenigstens 20 fortlaufende
Nucleotide lang und kann gegebenenfalls 30, 40, 50, 100 oder länger sein.
Der Fachmann wird erkennen, dass zur Vermeidung einer hohen Similarität mit einer
Referenzsequenz durch Einschluss von Lücken in die Polynucleotidsequenz
typischer Weise ein "Gap
Penalty" eingeführt wird
und von der Anzahl der Übereinstimmungen
subtrahiert wird.
-
Verfahren
der Anordnung von Sequenzen zum Vergleich sind auf dem Fachgebiet
gut bekannt. So kann die Bestimmung der prozentualen Identität zwischen
zwei Sequenzen unter Verwendung eines mathematischen Algorithmus
erreicht werden. Nicht-beschränkende
Beispiele für
solche mathematischen Algorithmen sind der Algorithmus von Myers
und Miller (1988) CABIOS 4: 11–17;
der lokale Homologiealgorithmus von Smith et al. (1981) Adv. Appl.
Math. 2: 482; der Homologieanordnungsalgorithmus von Needleman und Wunsch
(1970) J. Mol. Biol. 48: 443–453;
das Suche-nach-Similarität-Verfahren
von Pearson und Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 2444–2448; der
Algorithmus von Karlin und Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 87: 2264, modifiziert wie bei Karlin und Altschul (1993) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873–5877 beschrieben.
-
Computer-Implementierungen
dieser mathematischen Algorithmen können zum Vergleich von Sequenzen
unter Bestimmung der Sequenzidentität verwendet werden. Solche
Implementierungen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf:
CLUSTAL im PC/Gene- Programm
(verfügbar
von Intelligenetics, Mountain View, Kalifornien); das ALIGN-Programm (Version
2.0) und GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA und TFASTA im Wisconsin Genetics
Software Package, Version 8 (verfügbar von Genetics Computer
Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA). Anordnungen
unter Verwendung dieser Programme können unter Verwendung der Defaut-Parameter
durchgeführt
werden. Das CLUSTAL-Programm ist von Higgins et al. (1988) Gene
73: 237–244
(1988); Higgins et al. (1989) CABIOS 5: 151–153; Corpet et al. (1988)
Nucleic Acids Res. 16: 10881–90;
Huang et al. (1992) CABIOS 8: 155–65; und Pearson et al. (1994)
Meth. Mol. Biol. 24: 307–331 gut
beschrieben. Das ALIGN-Programm basiert auf dem Algorithmus von
Myers und Miller (1988) oben. Eine PAM120-Gewichtsrest-Tabelle,
ein Gap-Length-Penalty von 12 und ein Gap-Penalty von 4 können beim Vergleich von Aminosäuresequenzen
mit dem ALIGN-Programm verwendet werden. Die BLAST-Programme von Altschul
et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 basieren auf dem Algorithmus
von Karlin und Altschul (1990) oben. BLAST-Nucleotidsuchen können mit dem BLASTN-Programm,
Score = 100, Wortlänge
= 12, durchgeführt werden,
um Nucleotidsequenzen zu erhalten, die zu einer Nucleotidsequenz
homolog sind, die für
ein Protein der Erfindung codiert. BLAST-Proteinsuchen können mit
dem BASTX-Programm, Score = 50, Wortlänge = 3, durchgeführt werden,
um Aminosäuresequenzen
zu erhalten, die zu einem Protein oder Polypeptid der Erfindung
homolog sind. Um zu Vergleichszwecken Anordnungen mit Gaps zu erhalten,
kann Gapped BLAST (in BLAST 2.0) verwendet werden, wie es bei Altschul
et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389 beschrieben ist. Alternativ
kann PSI-BLAST (in BLAST 2.0) verwendet werden, um eine wiederholte
Suche durchzuführen,
die entfernte Beziehungen zwischen Molekülen detektiert. Siehe Altschul
et al. (1997) oben. Wenn BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST verwendet
werden, können
die Defaut-Parameter der jeweiligen Programme (z.B. BLASTN für Nucleotidsequenzen,
BLASTX für
Proteine) verwendet werden. Siehe http://www.ncbi.hlm.nih.gov. Eine
Anordnung kann auch manuell durch Inspektion durchgeführt werden.
-
Wenn
nichts Anderes angegeben ist, beziehen sich die hierin angegebenen
Nucleotidsequenz-Identität/Similarität-Werte
auf den Wert, der unter Verwendung von GAP Version 10 bei Verwendung
der folgenden Parameter erhalten wird: %-Identität unter Verwendung von GAP-Gewicht
von 50 und ein Längengewicht
von 3; %-Similarität
unter Verwendung eines Gap-Gewichts von 12 und eines Längengewichts
von 4 oder ein äquivalentes
Programm. Für
Aminosäuresequenzen
beziehen sich die Werte für
Aminosäuresequenz-Identität hierin
auf den Wert, der unter Verwendung von GAP Version 10 unter Verwendung
der folgenden Parameter erhalten wird: %-Identität unter Verwendung von GAP-Gewicht
von 8 und Längengewicht
von 2 oder ein äquivalentes
Programm. Mit "äquivalentes
Programm" ist ein
beliebiges Sequenzvergleichsprogramm gemeint, das für beliebige
zwei in Frage kommenden Sequenzen eine Anordnung erzeugt, die identische
Nucleotid- oder Aminosäurerest-Übereinstimmungen und eine identische
Prozentwert-Sequenzidentität
hat, wenn sie mit der entsprechenden Anordnung verglichen wird,
die durch das bevorzugte Programm erzeugt wird.
-
GAP
verwendet den Algorithmus von Needleman and Wunsch (1970) J. Mol.
Biol. 48: 443–453,
um die Anordnung von zwei vollständigen
Sequenzen zu finden, die die Anzahl der Übereinstimmungen maximiert und
die Anzahl von Gaps bzw. Lücken
miniert. GAP betrachtet alle möglichen
Anordnungen und Gap-Positionen und schafft die Anordnung mit der
größten Zahl
von übereinstimmenden
Basen und den wenigsten Gaps bzw. Lücken. Es sorgt für die Bereitstellung
eines Gap-Creation-Penalty und eines Gap-Extension-Penalty in Einheiten
von übereinstimmenden
Basen. GAP muss einen Profit der Gap-Creation-Penalty-Zahl an Übereinstimmungen
für jede
Lücke,
die es insertiert, machen. Wenn eine Gap-Extension-Penalty von größer als
Null gewählt
wird, muss GAP zusätzlich
einen Profit für
jede insertierte Lücke
der Länge
für die
Gap-Male des Gap-Extension-Penalty machen. Defaut-Gap-Creation-Penalty-Werte
und Gap-Extension-Penalty-Werte in Version 10 des Wisconsin Genetics
Software Package für
Proteinsequenzen sind 8 bzw. 2. Für Nucleotidsequenzen ist die
Defaut-Gap-Creation-Penalty 50, während die Defaut-Gap-Extension-Penalty
3 ist. Die Gap-Creation-
und die Gap-Extension-Penalties können als ganze Zahlen ausgedrückt werden,
ausgewählt aus
der Gruppe von ganzen Zahlen, die von 0 bis 200 reichen. So können beispielsweise
die Gap-Creation- und Gap-Extension-Penalties 0, 1, 2, 3, 4, 5,
6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 oder
größer sein.
-
GAP
stellt ein Glied der Familie der besten Anordnungen dar. Es kann
viele Glieder dieser Familie geben, aber kein anderes Glied hat
eine bessere Qualität.
GAP zeigt vier Verdienstmerkmale für Anordnungen: Qualität, Ratio,
Identität
und Similarität.
Die Qualität
ist die Metrik, die maximiert wird, um die Sequenzen anzuordnen.
Ratio ist die Qualität,
dividiert durch die Anzahl von Basen in dem kürzeren Segment. Der Prozentwert
der Identität
bzw. die prozentuale Identität
ist der Prozentgehalt der Symbole, die tatsächlich übereinstimmen. Der Prozentwert
der Similarität
bzw. die prozentuale Similarität
ist der Prozentgehalt der Symbole, die ähnlich sind. Symbole, die jenseits
von Lücken
sind, werden ignoriert. Eine Similarität wird bewertet, wenn der Scoring-Matrix-Wert
für ein
Symbolpaar größer oder
gleich 0,50, dem Similaritätsschwellenwert,
ist. Die in Version 10 des Wisconsin Genetics Software Package verwendete
Scoring-Matrix ist BLOSUM62 (siehe Henikoff und Henikoff (1989)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915).
-
Für Zwecke
der vorliegenden Erfindung wird ein Vergleich von Nucleotid- oder
Proteinsequenzen zur Bestimmung des Prozentwertes der Sequenzidentität bzw. der
prozentualen Sequenzidentität
mit den Cry8-artigen Sequenzen, die hierin offenbart sind, vorzugsweise
unter Verwendung des GAP-Programms im Wisconsin Genetics Software
Package (Version 8 oder später)
oder eines äquivalenten
Programms durchgeführt.
Für GAP-Analysen
von Nucleotidsequenzen wurden ein GAP-Gewicht von 50 und eine Länge von
3 verwendet.
- (c) "Sequenzidentität" oder "Identität", wie die Ausdrücke hierin verwendet werden,
beziehen sich im Kontext von zwei Nucleinsäure- oder Polypeptidsequenzen
auf Reste in den zwei Sequenzen, die bei Anordnung für maximale Übereinstimmung über ein
spezifiziertes Vergleichsfenster die gleichen sind. Wenn der Prozentwert
der Sequenzidentität
bzw. die prozentuale Sequenzidentität unter Bezugnahme auf Proteine verwendet
wird, wird erkannt, dass Restpositionen, die nicht identisch sind,
sich oft durch konservative Aminosäuresubstitutionen unterscheiden,
wobei Aminosäurereste
für andere
Aminosäurereste
mit ähnlichen chemischen
Eigenschaften (z.B. Ladung oder Hydrophobie) eingesetzt sind und
daher die funktionellen Eigenschaften des Moleküls nicht verändern. Wenn
Sequenzen sich in konservativen Substitutionen unterscheiden, kann
der Prozentwert der Sequenzidentität bzw. die prozentuale Sequenzidentität nach oben
eingestellt werden, um eine Korrektur bezüglich der konservativen Natur
der Substitution vorzunehmen. Sequenzen, die sich durch solche konservativen
Substitutionen unterscheiden, werden als mit "Sequenzsimilarität" oder "Similarität" bzw. "Ähnlichkeit" bezeichnet. Mittel
zur Durchführung
dieser Einstellung sind dem Fachmann gut bekannt. Typischerweise
involviert diese ein Scoring einer konservativen Substitution als partielle
anstatt als vollständige
Fehlpaarung, wodurch der Prozentwert der Sequenzidentität erhöht wird. Wenn
einer identischen Aminosäure
beispielsweise eine Score von 1 gegeben wird und einer nicht-konservativen
Substitution ein Score von 0 gegeben wird, so wird beispielsweise
einer konservativen Substitution ein Score zwischen 0 und 1 gegeben.
Die Bewertung bzw. das Scoring von konservativen Substitutionen wird
z.B. errechnet, wie es im Programm PC/GENE (Intelligenetics, Mountain
View, Kalifornien) implementiert ist.
- (d) Der Ausdruck "Prozentwert
der Sequenzidentität", wie er hierin verwendet
wird, meint den Wert, der durch Vergleichen von zwei optimal angeordneten
Sequenzen über
ein Vergleichsfenster bestimmt wird, wobei der Teil der Polynucleotidsequenz
im Vergleichsfenster Additionen oder Deletionen (d.h. Gaps bzw. Lücken) im
Vergleich zur Referenzsequenz (die keine Additionen oder Deletionen
umfasst) zur optimalen Anordnung der zwei Sequenzen umfassen kann.
Der Prozentwert wird durch Bestimmung der Zahl von Positionen, in
denen der identische Nucleinsäurebasen-
oder -Aminosäurerest
in beiden Sequenzen auftritt, um die Anzahl von übereinstimmenden Positionen
zu erhalten, Dividieren der Anzahl übereinstimmender Positionen
durch die Gesamtzahl an Positionen im Vergleichsfenster und Multiplizieren
des Resultats mit 100, um den Prozentwert der Sequenzidentität zu erhalten,
errechnet.
- (e)(i) Der Ausdruck "wesentliche
Identität" von Polynucleotidsequenzen
bedeutet, dass ein Polynucleotid eine Sequenz umfasst, die wenigstens
70% Sequenzidentität,
vorzugsweise wenigstens 80%, bevorzugter wenigstens 90% und am bevorzugtesten
wenigstens 95% Sequenzidentität
mit einer Referenzsequenz hat, wobei eines der Anordnungsprogramme
verwendet wird, das oben beschrieben wurde und Standardparameter
verwendet. Ein Fachmann wird erkennen, dass diese Werte geeigneter
Weise eingestellt werden können,
um eine entsprechende Identität
von Proteinen zu bestimmen, die durch zwei Nucleotidsequenzen codiert
werden, wobei Codondegeneriertheit, Aminosäuresimilarität, Leserasterpositionierung
und dergleichen berücksichtigt
werden. Wesentliche Identität
von Aminosäuresequenzen
bedeutet für
diese Zwecke normalerweise Sequenzidentität von wenigstens 60%, bevorzugter
wenigstens 70%, 80%, 90% und am bevorzugtesten wenigstens 95%.
Ein
anderer Hinweis, dass Nucleotidsequenzen im Wesentlichen identisch
sind, ist, wenn zwei Moleküle
unter stringenten Bedingungen aneinander hybridisieren. Im Allgemeinen
werden stringente Bedingungen so gewählt, dass sie bei etwa 5°C unter dem
thermischen Schmelzpunkt (Tm) für die spezifische
Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH
liegen. Allerdings umfassen stringente Bedingungen Temperaturen
im Bereich von etwa 1°C
bis etwa 20°C,
was von dem gewünschten
Stringenzgrad abhängt, wie
er an anderer Stelle hierin qualifiziert ist. Nucleinsäuren, die
unter stringenten Bedingungen nicht aneinander hybridisieren, werden
noch im Wesentlichen identisch sein, wenn die Polypeptide, die sie
codieren, im Wesentlichen identisch sind. Dies kann auftreten, z.B.
wenn eine Kopie einer Nucleinsäure
unter Verwendung der maximalen Codondegeneriertheit, die durch den genetischen
Code zugelassen wird, geschaffen wird. Ein Hinweis, dass zwei Nucleinsäuresequenzen
im Wesentlichen identisch sind, ist, wenn das durch die erste Nucleinsäure codierte
Polypeptid mit dem Polypeptid, das durch die zweite Nucleinsäure codiert
wird, immunologisch kreuzreaktiv ist.
- (e)(ii) Der Ausdruck "wesentliche
Identität" bedeutet im Kontext
eines Peptids, dass ein Peptid eine Sequenz mit wenigstens 70% Sequenzidentität zu einer
Referenzsequenz, vorzugsweise 80%, bevorzugter 85%, am bevorzugtesten
wenigstens 90% oder 95% Sequenzidentität zu der Referenzsequenz über ein spezifiziertes
Vergleichsfenster umfasst. Vorzugsweise wird eine optimale Anordnung
unter Verwendung des Homologie-Anordnungsalgorithmus
von Needleman und Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443–453 durchgeführt. Ein
Hinweis, dass zwei Peptidsequenzen im Wesentlichen identisch sind,
ist der, dass ein Peptid mit Antikörpern, die gegen das zweite
Peptid entwickelt wurden, immunologisch reaktiv ist. Somit ist ein
Peptid im Wesentlichen identisch zu einem zweiten Peptid, z.B. wenn
die zwei Peptide sich nur durch eine konservative Substitution unterscheiden.
Peptide, die "im
Wesentlichen ähnlich
sind", teilen Sequenzen,
wie sie oben angegeben wurden, außer dass Restpositionen, die
nicht identisch sind, sich durch konservativen Aminosäureaustausch
unterscheiden können.
-
Die
Verwendung des Ausdrucks "Nucleotidkonstrukte" ist hierin nicht
dazu bestimmt, die vorliegende Erfindung auf Nucleotidkonstrukte,
die DNA umfassen, zu beschränken.
Der Fachmann wird erkennen, dass Nucleotidkonstrukte, insbesondere
Polynucleotide und Oligonucleotide, die aus Ribonucleotiden und
Kombinationen von Ribonucleotiden und Desoxyribonucleotiden bestehen,
auch in den hierin offenbarten Verfahren verwendet werden können. Die
Nucleotidkonstrukte, Nucleinsäuren
und Nucleotidsequenzen der Erfindung umfassen zusätzlich alle
komplementären
Formen solcher Konstrukte, Moleküle
und Sequenzen. Ferner umfassen die Nucleotidkonstrukte, Nucleotidmoleküle und Nucleotidsequenzen
der vorliegenden Erfindung alle Nucleotidkonstrukte, -moleküle und -sequenzen,
die in den Verfahren der Erfindung zur Transformation von Pflanzen
verwendet werden können,
einschließlich,
aber nicht beschränkt
auf, jene, die aus Desoxyribonucleotiden, Ribonucleotiden und Kombinationen
davon bestehen. Solche Desoxyribonucleotide und Ribonucleotide umfassen
sowohl natürlich
vorkommende Moleküle
als auch synthetische Analoga. Die Nucleotidkonstrukte, Nucleinsäuren und
Nucleotidsequenzen der Erfindung umfassen auch alle Formen von Nuc leotidkonstrukten,
einschließlich,
aber nicht beschränkt
auf, einzelsträngige
Formen, doppelsträngige
Formen, Haarnadelstrukturen, "stem-and-loop"-Strukturen und dergleichen.
-
Eine
weitere Ausführungsform
der Erfindung bezieht sich auf einen transformierten Organismus,
vorzugsweise einen transformierten Organismus, der aus der Gruppe,
bestehend aus Pflanzen- und Insektenzellen, Bakterien, Hefe, Baculoviren,
Protozoen, Nematoden und Algen ausgewählt ist, der ein DNA-Molekül der Erfindung,
eine Expressionskassette, die das DNA-Molekül umfasst, oder einen Vektor,
der die Expressionskassette umfasst, vorzugsweise stabil in das
Genom des transformierten Organismus eingebaut umfasst.
-
Die
Cry8-artigen Sequenzen der Erfindung werden in Expressionskassetten
zur Expression in dem Organismus von Interesse bereitgestellt. Die
Kassette wird 5'-
und 3'-regulatorische
Sequenzen funktionell verknüpft
mit einer Cry8-artigen Sequenz der Erfindung umfassen. Mit "funktionell verknüpft" ist eine funktionelle Verknüpfung zwischen
einem Promotor und einer zweiten Sequenz gemeint, wobei die Promotorsequenz
die Transkription der DNA-Sequenz, die der zweiten Sequenz entspricht,
initiiert und vermittelt. Im Allgemeinen bedeutet funktionell verknüpft, dass
die Nucleinsäuresequenzen,
die verknüpft
sind, fortlautend sind und, wenn es erforderlich ist, zwei Protein-codierende
Regionen zu verknüpfen,
fortlaufend und im selben Leseraster sind. Die Kassette kann zusätzlich wenigstens
ein zusätzliches
Gen, das in den Organismus co-transformiert werden soll, enthalten.
Alternativ kann das zusätzliche
Gen/können
die zusätzlichen
Gene an mehreren Expressionskassetten bereitgestellt werden.
-
Eine
derartige Expressionskassette wird mit einer Vielzahl von Restriktionsstellen
zur Insertion der Cry8-artigen Sequenz, die unter der Transkriptionsregulierung
der regulatorischen Regionen sein soll, ausgestattet. Die Expressionskassette
kann zusätzlich
selektierbare Markergene enthalten.
-
Die
Expressionskassette wird in der 5'-3'-Richtung
der Transkription eine transkriptionale und translationale Initiationsregion,
eine Cry8-artige DNA-Sequenz der Erfindung und eine transkriptionale
und translationale Terminierungsregion, die in dem Organismus, der
als Wirt dient, funktionell ist, enthalten. Die transkriptionale
Initiationsregion, der Promotor, kann nativ oder analog oder fremd
oder heterolog zu dem Wirtsorganismus sein. Zusätzlich kann der Promotor die
natürliche
Sequenz oder alternativ eine synthetische Sequenz sein. Mit "fremd" ist gemeint, dass
die transkriptionale Initiationsregion in dem nativen Organismus,
in den die transkriptionale Initiationsregion eingeführt wird,
nicht gefunden wird. Der Ausdruck "chimäres
Gen", wie er hierin
verwendet wird, umfasst eine codierende Sequenz funktionell mit
einer Transkriptionsinitiationsregion verknüpft, die für die codierende Sequenz heterolog
ist.
-
Die
Terminierungsregion kann mit der transkriptionalen Initiationsregion
nativ sein, kann mit der funktionell verknüpften DNA-Sequenz von Interesse
nativ sein oder kann aus einer anderen Quelle stammen. Zweckdienliche
Terminationsregionen sind aus dem Ti-Plasmid von A. tumefaciens verfügbar, z.B.
die Octopinsynthase- und Nopalinsynthase-Terminationsregionen. Siehe auch Guerineau
et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262: 141–144; Proudfoot (1991) Cell
64: 671–674;
Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5: 141–149; Mogen et al. (1990) Plant
Cell 2: 1261–1272;
Munroe et al. (1990) Gene 91: 151–158; Ballas et al. (1989)
Nucleic Acids Res. 17: 7891–7903;
und Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15: 9627–9639.
-
Wo
es geeignet ist, kann eine Nucleinsäure für eine verstärkte Expression
im Wirtsorganismus optimiert werden. Wenn der Wirtsorganismus eine
Pflanze ist, können
die synthetischen Nucleinsäuren
demnach unter Verwendung Pflanzen-bevorzugter Codons für eine verbesserte
Expression synthetisiert werden. Siehe z.B. Campbell und Gowri (1990)
Plant Physiol. 92: 1–11
für eine
Diskussion der Verwendung Wirts-bevorzugter Codons. Obgleich Nucleinsäuresequenzen
der vorliegenden Erfindung beispielsweise sowohl in monokotylen wie
auch dikotylen Pflanzenspecies exprimiert werden können, können Sequenzen
im Hinblick auf spezifische Codonpräferenzen und GC-Gehalts-Präferenzen
von Monokotylen oder Dikotylen modifiziert werden, da gezeigt wurde,
dass sich diese Präferenzen
unterscheiden (Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 477–498). Somit
kann das in Mais bevorzugte Codon für eine bestimmte Aminosäure von
bekannten Gensequenzen aus Mais abgeleitet werden. Eine Maiscodonverwendung
für 28
Gene aus Maispflanzen ist in Tabelle 4 von Murray et al., supra,
aufgelistet. Auf dem Fachgebiet sind Verfahren zur Synthese von
Pflanzen-bevorzugter Gene verfügbar.
Siehe z.B. US-Patente Nrn. 5,380,831 und 5,436,391 und Murray et
al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 477–498.
-
Von
zusätzlichen
Sequenzmodifikationen ist bekannt, dass sie die Genexpression in
einem zellulären Wirt
verstärken.
Diese umfassen Eliminierungen von Sequenzen, die für falsche
Polyadenylierungssignale, Exon-Intron-Spleißstellensignale, Transposon-artige
Wiederholungen und andere derartige gut charakterisierte Sequenzen
codieren, die für
eine Genexpression schädlich
sein können.
Der G-C-Gehalt der Sequenz kann auf Level eingestellt werden, die
für einen
gegebenen Zellwirt durchschnittlich sind, wie es durch Bezugnahme auf bekannte
Gene, die in der Wirtszelle exprimiert werden, errechnet wird. Mit "Wirtszelle" ist eine Zelle gemeint,
die einen Vektor enthält
und die Replikation und/oder Expression des Expressionsvektors unterstützt. Wirtszellen
können
prokaryotische Zellen, z.B. E. coli, oder eukaryotische Zellen,
z.B. Hefe-, Insekten-, Amphibien- oder Säugerzellen, sein. Vorzugsweise
sind Wirtszellen monokotyle oder dikotyle Pflanzenzellen. Eine besonders
bevorzugte monokotyle Wirtszelle ist eine Maiswirtszelle. Wenn möglich, wird
die Sequenz modifiziert, um vorausgesagte Haarnadel-Sekundär-mRNA-Strukturen
zu vermeiden.
-
Die
Expressionskassetten können
zusätzlich
5'-Leadersequenzen
in dem Expressionskassettenkonstrukt enthalten. Solche Leadersequenzen
können
zur Verstärkung
der Translation wirken. Translationsleader sind auf dem Fachgebiet
bekannt und umfassen: Picornavirus-Leader z.B. EMCV-Leader (Encephalomyocarditis,
5'-nicht-codierende
Region) (Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:
6126–6130);
Potyvirus-Leader z.B. TEV-Leader (Tabakätzvirus) (Gallie et al. (1995)
Gene 165(2): 233–238),
MDMV-Leader (Maisverzwergungsmosaikvirus) (Virology 154: 9–20), und
humanes Immunglobulin-schwere Kette-bindendes Protein (BiP) (Macejak et
al. (1991) Nature 353: 90–94);
nicht-translatierter Leader aus der Hüllprotein-mRNA von Alfalfamosaikvirus
(AMV RNA 4) (Jobling et al. (1987) Nature 325: 622–625); Tabakmosaikvirus-Leader (TMV)
(Gallie et al. (1989) in Molecular Biology of RNA, Herausg. Cech
(Liss, New York), S. 237–256);
und chlorotisches Maisscheckungsvirus (MCMV) (Lommel et al. (1991)
Virology 81: 382–385).
Siehe auch Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84: 965–968. Andere
Verfahren, von denen bekannt ist, dass sie die Translation verstärken, können ebenfalls
verwendet werden, z.B. Introns und dergleichen.
-
Bei
der Herstellung der Expressionskassette können die verschiedenen DNA-Fragmente so manipuliert
werden, dass sie dafür
sorgen, dass die DNA-Sequenzen in der richtigen Orientierung und,
wenn zutreffend, im richtigen Leseraster sind. Zu diesem Zweck können Adapter
oder Linker verwendet werden, um die DNA-Fragmente zu verknüpfen, oder
es können
andere Manipulationen involviert sein, um für zweckmäßige Restriktionsstellen, Entfernung
von überflüssiger DNA,
Entfernung von Restriktionsstellen oder dergleichen zu sorgen. Zu
diesem Zweck können
eine in vitro-Mutagenese, Primerreparatur, Restriktion, Annealing,
Resubstitutionen, z.B. Transitionen und Transversionen, involviert
sein.
-
In
der Durchführung
der Erfindung kann eine Reihe von Promotoren verwendet werden. Die
Promotoren können
auf der Basis des gewünschten
Resultats ausgewählt
werden. Die Nucleinsäuren
können
mit konstitutiven, Gewebe-bevorzugten, induzierbaren oder ande ren
Promotoren zur Expression im Wirtsorganismus kombiniert werden.
Geeignete konstitutive Promotoren zur Verwendung in einer Pflanzenwirtszelle
umfassen z.B. den Kernpromotor des Rsyn7-Promotors und andere konstitutive
Promotoren, die in WO 99/43838 und im US-Patent Nr. 6,072,050 offenbart sind;
den Kern-CaMV 35S-Promotor (Odell et al. (1985) Nature 313: 810–812); Reisactin
(McElroy et al. (1990) Plant Cell 2: 163–171); Ubiquitin (Christensen
et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12: 619–632 und Christensen et al.
(1992) Plant Mol. Biol. 18: 675–689);
pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81: 581–588); MAS
(Velten et al. (1984) EMBO J. 3: 2723–2730); ALS-Promotor (US-Patent
Nr. 5,659,026) und dergleichen. Andere konstitutive Promotoren umfassen
z.B. solche, die in den US-Patenten Nrn. 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121;
5,569,597; 5,466,785; 5,399,680; 5,268,463; 5,608,142 und 6,177,611
diskutiert werden.
-
In
Abhängigkeit
von dem gewünschten
Ergebnis kann es günstig
sein, das Gen aus einem induzierbaren Promotor zu exprimieren. Zur
Regulierung der Expression der Nucleotidsequenzen der Erfindung
in Pflanzen sind Wund-induzierbare Promotoren von besonderem Interesse.
Solche durch Wunden induzierbare Promotoren können auf eine Schädigung reagieren,
die durch Insektenfraß verursacht
wird, und umfassen Kartoffelproteinaseinhibitor (Pin II)-Gen (Ryan
(1990) Ann. Rev. Phytopath. 28: 425–449; Duan et al. (1996) Nature
Biotechnology 14: 494–498);
wun1 und wun2, US-Patent Nr. 5,428,148; win1 und win2 (Stanford
et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 215: 200–208); Systemin (McGurl et
al. (1992) Science 225: 1570–1573);
WIP1 (Rohmeier et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22: 783–792; Eckelkamp
et al. (1993) FEBS Letters 323: 73–76); MPI-Gen (Corderok et
al. (1994) Plant J. 6(2): 141–150)
und dergleichen.
-
Zusätzlich können durch
Pathogene induzierbare Promotoren in den Verfahren und Nucleotidkonstrukten
der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Solche durch Pathogene
induzierbaren Promotoren umfassen solche aus mit Pathogenese in
Verbindung stehenden Proteinen (PR-Proteinen), die nach Infektion durch
ein Pathogen induziert werden; z.B. PR-Proteine, SAR-Proteine, β-1,3-Glucanase,
Chitinase usw. Siehe z.B. Redolfi et al. (1983) Neth. J. Plant Pathol.
89: 245–254;
Uknes et al. (1992) Plant Cell 4: 645–656; und Van Loon (1985) Plant
Mol. Virol. 4: 111–116.
Siehe auch WO 99/43819.
-
Von
Interesse sind Promotoren, die lokal an der Stelle oder nahe der
Stelle der Pathogeninfektion exprimiert werden. Siehe z.B. Marineau
et al. (1987) Plant Mol. Biol. 9: 335–342; Matton et al. (1989)
Molecular Plant-Microbe Interactions 2: 325–331; Somsisch et al. (1986) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 83: 2427–2430;
Somsisch et al. (1988) Mol. Gen. Genet. 2: 93–98; und Yang (1996) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 93: 14972–14977. Siehe
auch Chen et al. (1996) Plant J. 10: 955–966; Zhang et al. (1994) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 91: 2507–2511;
Warner et al. (1993) Plant J. 3: 191–201; Siebertz et al. (1989)
Plant Cell 1: 961–968;
US-Patent Nr. 5,750,386 (Nematoden-induzierbar); und die darin angegebenen
Referenzen. Von besonderem Interesse ist der induzierbare Promotor
für das
Mais-PRms-Gen, dessen Expression durch das Pathogen Fusarium moniliforme
induziert wird (siehe z.B. Cordero et al. (1992) Physiol. Mol. Plant
Path. 41: 189–200).
-
Chemikalien-regulierte
Promotoren können
eingesetzt werden, um die Expression eines Gens in einer Pflanze
durch die Anwendung eines exogenen chemischen Regulators zu modulieren.
In Abhängigkeit
von der Aufgabe kann der Promotor ein Chemikalien-induzierbarer Promotor
sein, wenn die Anwendung der Chemikalie eine Genexpression induziert,
oder ein durch Chemikalien unterdrückbarer Promotor sein, wenn
die Anwendung der Chemikalie die Genexpression unterdrückt. Durch
Chemikalien-induzierbare Promotoren sind auf dem Fachgebiet bekannt
und umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, den Mais-In2-2-Promotor, der durch Benzolsulfonamidherbizid-Safener
aktiviert wird, der Mais-GST-Promotor,
der durch hydrophobe elektrophile Verbindungen aktiviert wird, die
als Vorlaufherbizide eingesetzt werden, und der Tabak-PR-1a-Promotor,
der durch Salicylsäure
aktiviert wird. Andere durch Chemikalien regulierte Promotoren von
Interesse umfassen auf Steroid reagierende Promotoren (siehe z.B.
den Glucokortikoid-induzierbaren Promotor gemäß Schena et al. (1991) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 88: 10421–10425
und McNellis et al. (1998) Plant J. 14(2): 247–257) und Tetracyclin-induzierbare
und Tetracylin-reprimierbare Promotoren (siehe z.B. Gatz et al.
(1991) Mol. Gen. Genet. 227: 229–237, und US-Patente Nrn. 5,814,618
und 5,789,156).
-
Gewebe-bevorzugte
Promotoren können
verwendet werden, um eine verstärkte
pestizide Proteinexpression innerhalb eines bestimmten Pflanzengewebes
zu targetieren. Gewebe-bevorzugte
Promotoren umfassen solche, die bei Yamamoto et al. (1997) Plant
J. 12(2) 255–265;
Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol. 38(7): 792–803; Hansen
et al. (1997) Mol. Gen Genet. 254(3): 337–343; Russell et al. (1997)
Transgenic Res. 6(2): 157–168;
Rinehart et al. (1996) Plant Physiol. 112(3): 1331–1341; Van
Camp et al. (1996) Plant Physiol. 112(2): 525–535; Canevascini et al. (1996)
Plant Physiol. 112(2): 513–524;
Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5): 773–778; Lam
(1994) Results Probl. Cell Differ. 20: 181–196; Orozco et al. (1993)
Plant Mol. Biol. 23(6): 1129–1138;
Matsuoka et al. (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20): 9586–9590; und
Guevara-Garcia et al. (1993) Plant J. 4(3): 495–505 diskutiert sind. Solche
Promotoren können,
wenn es notwendig ist, für
eine schwache Expression modifiziert werden.
-
Blatt-spezifische
Promotoren sind auf dem Fachgebiet bekannt. Siehe z.B. Yamamoto
et al. (1997) Plant J. 12(2): 255–265; Kwon et al. (1994) Plant
Physiol. 105: 357–67;
Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5): 773–778; Gotor
et al. (1993) Plant J. 3: 509–18;
Orozco et al. (1993) Plant Mol. Biol. 23(6): 1129–1138; und
Matsuoka et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(20): 9586–9590.
-
Wurzel-spezifische
Promotoren sind bekannt und können
aus den vielen aus der Literatur verfügbaren ausgewählt werden
oder neu aus verschiedenen kompatiblen Species isoliert werden.
Siehe z.B. Hire et al. (1992) Plant Mol. Biol. 20(2): 207–218 (Gen
für Sojabohnenwurzel-spezifische
Glutaminsynthetase); Keller und Baumgartner (1991) Plant Cell 3(10):
1051–1061
(Wurzel-spezifisches Kontrollelement im GRP 1.8-Gen der Gartenbohne);
Sanger et al. (1990) Plant Mol. Biol. 14(3): 433–443 (Wurzel-spezifischer Promotor
des Mannopinsynthase (MAS)-Gens von Agrobacterium tumefaciens);
und Miao et al. (1991) Plant Cell 3(1): 11–22 (Volllängen-cDNA-Klon, der für cytosolische
Glutaminsynthetase (GS) codiert, die in Wurzeln und Wurzelknoten
von Sojabohnen exprimiert wird). Siehe auch Bogusz et al. (1990)
Plant Cell 2(7): 633–641,
worin zwei Wurzel-spezifische Promotoren beschrieben werden, die
aus Hämoglobingenen
aus Stickstoff-fixierenden Nicht-Legumen Andersonii und der verwandten
Nicht-Stickstoff-fixierenden Nicht-Legume Trema tomentosa isoliert
werden. Die Promotoren dieser Gene waren an ein β-Glucuronidase-Reportergen gebunden
und wurden sowohl in die Nicht-Legume Nicotiana tabacum als auch
in die Legume Lotus corniculatus eingeführt, und in beiden Fällen wurde
Wurzel-spezifische Promotoraktivität konserviert. Leach und Aoyagi
(1991) beschreiben ihre Analyse der Promotoren der stark exprimierten
Wurzel-induzierenden rolC- und rolD-Gene von Agrobacterium rhizogenes
(siehe Plant Science (Limerick) 79(1): 69–76). Sie zogen den Schluss,
dass Enhancer und Gewebe-bevorzugte
DNA-Determinanten in diesen Promotoren dissoziiert sind. Teeri et
al. (1989) verwendeten eine Genfusion an lacZ, um zu zeigen, dass
das Agrobacterium-T-DNA-Gen, das für Octopinsynthase codiert,
speziell in der Epidermis der Wurzelspitzen aktiv ist, und dass
das TR2'-Gen in
der intakten Pflanze Wurzel-spezifisch ist und durch Wundbildung
im Blattgewebe stimuliert wird, eine zur Verwendung mit einem insektiziden
oder larviziden Gen besonders wünschenswerte
Kombination von Merkmalen (siehe EMBO J. 8(2): 343–350). Das
TR1'-Gen, fusioniert
an nptII (Neomycinphosphotransferase II), zeigte ähnliche
Merkmale. Zusätzliche
Wurzel-bevorzugende Promotoren umfassen den VfENOD-GRP3-Gen-Promotor (Kuster
et al. (1995) Plant Mol. Biol. 29(4): 759–772); und den rolB-Promotor
(Capana et al. (1994) Plant Mol. Biol. 25(4): 681–691. Siehe
auch die US-Patente Nrn. 5,837,876; 5,750,386; 5,633,363; 5,459,252;
5,401,836; 5,110,732 und 5,023,179.
-
"Samen-bevorzugte" Promotoren umfassen
sowohl "Samen-spezifische" Promotoren (solche
Promotoren, die während
der Samenentwicklung aktiv sind, z.B. Promotoren von Samenspeicherproteinen),
wie auch "Samen-keimende" Promotoren (solche
Promotoren, die während
der Samenkeimung aktiv sind). Siehe Thompson et al. (1989) BioEssays
10: 108, die hier durch Referenz aufgenommen wird. Solche bevorzugt
in Samen auftretenden Promotoren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf,
Cim1 (Cytokinin-induzierte Message); cZ19B1 (Mais-19 kDa-Zein),
Milps (Myo-Inositol-1-Phosphat-Synthase) und celA (Cellulosesynthase) (siehe
WO 00/11177, hierin durch Referenz aufgenommen). Gama-Zein ist ein
bevorzugter Endosperm-spezifischer Promotor. Glob-1 ist ein bevorzugter
Embryo-spezifischer Promotor. Für
Dikotyle umfassen Samen-spezifische Promotoren, sind aber nicht
auf diese beschränkt,
Bohnen-β-Phaseolin,
Napin, β-Conglycinin,
Sojabohnenlectin, Cruciferin und dergleichen. Für Monokotyle umfassen Samen-spezifische
Promotoren Mais-15 kDa-Zein, -22 kDa-Zein, -27 kDa-Zein, g-Zein,
Waxy, Shrunken 1, Shrunken 2, Globulin 1 usw., sind aber nicht auf
diese beschränkt.
Siehe auch WO 00/12733, wo Samen-bevorzugte Promotoren von end1-
und end2-Genen offenbart sind.
-
Wenn
eine Expression auf niedrigem Level gewünscht wird, werden schwache
Promotoren verwendet werden. Im Allgemeinen ist mit "schwacher Promotor" ein Promotor gemeint,
der die Expression einer codierenden Sequenz auf niedrigem Level
steuert. Mit niedrigem Level sind Level von etwa 1/1000 Transkripten
bis etwa 1/100.000 Transkripte bis etwa 1/500.000 Transkripte gemeint.
Alternativ wird anerkannt, dass schwache Promotoren auch Promotoren
umfassen, die in nur wenigen Zellen und nicht in anderen exprimiert
werden, so dass insgesamt ein niedriger Expressionslevel erhalten
wird. Wo ein Promotor bei inakzeptabel hohen Leveln exprimiert wird,
können
Teile der Promotorsequenz deletiert oder modifiziert werden, um
die Expressionslevel zu senken.
-
Solche
schwachen konstitutiven Promotoren umfassen z.B. den Kernpromotor
des Rsyn7-Promotors (WO 99/43838 und US-Patent Nr. 6,072,050), den
Kern-35S-CaMV- Promotor
und dergleichen. Andere konstitutive Promotoren umfassen z.B. US-Patente
Nrn. 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121; 5,569,597; 5,466,785; 5,399,680;
5,268,463; 5,608,142 und 6,177,611.
-
Im
allgemeinen wird die Expressionskassette ein selektierbares Markergen
für die
Selektion von transformierten Zellen umfassen. Selektierbare Markergene
werden für
die Selektion von transformierten Zellen oder Geweben genutzt. Markergene
umfassen Gene, die für
Antibiotikumresistenz codieren, z.B. solche, die für Neomycinphosphotransferase
II (NEO) und Hygromycinphosphotransferase (HPT) codieren, wie auch
Gene, die Resistenz gegenüber
herbiziden Verbindungen, z.B. Glufosinatammonium, Bromoxynil, Imidazolinone und
2,4-Dichlorphenoxyacetat (2,4-D), verleihen. Siehe allgemein Yarranton
(1992) Curr. Opin. Biotech. 3: 506–511; Christopherson et al.
(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6314–6318; Yao et al. (1992) Cell
71: 63–72;
Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6: 2419–2422; Barkley et al. (1980)
in The Operon, S. 177–220;
Hu et al. (1987) Cell 48: 555–566;
Brown et al. (1987) Cell 49: 603–612; Figge et al. (1988) Cell
52: 713–722;
Deuschle et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Aci. USA 86: 5400–5404; Fuerst
et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2549–2553; Deuschle
et al. (1990) Science 248: 480–483;
Gossen (1993) Ph. D. Thesis, University of Heidelberg; Reines et
al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 1917–1921; Labow et al. (1990)
Mol. Cell. Biol. 10: 3343–3356;
Zambretti et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3952–3956; Baim
et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5072–5076; Wyborski
et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 4647–4653; Hillenand-Wissman (1989)
Topics Mol. Struc. Biol. 10: 143–162; Degenkolb et al. (1991)
Antimicrob. Agents Chemother. 35: 1591–1595; Kleinschnidt et al.
(1988) Biochemistry 27: 1094–1104;
Bonin (1993) Ph. D. Thesis, University of Heidelberg; Gossen et
al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547–5551; Oliva et al. (1992)
Antimicrob. Agents Chemother. 36: 913–919; Hlavka et al. (1985)
Handbook of Experimental Pharmacology, Band 78 (Springer-Verlag,
Berlin); Gill et al. (1988) Nature 334: 721–724.
-
Die
obige Liste selektierbarer Markergene ist nicht limitierend gemeint.
In der vorliegenden Erfindung kann ein beliebiges selektierbares
Markergen verwendet werden.
-
Transformationsprotokolle
sowie Protokolle zur Einführung
von Nucleotidsequenzen in Pflanzen können in Abhängigkeit vom Typ der Pflanze
oder der Pflanzenzelle, d.h. Monokotyle oder Dikotyle, die zur Transformation
targetiert wird, variieren. Geeignete Verfahren zur Einführung von
Nucleotidsequenzen in Pflanzenzellen und anschließende Insertion
in das Pflanzengenom umfassen Mikroinjektion (Crossway et al. (1986)
Biotechniques 4: 320–334),
Elektroporation (Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
83: 5602–5606,
Agrobacterium-vermittelte Transformation (Townsend et al., US-Patent
Nr. 5,563,055; Zhao et al., US-Patent
Nr. 5,981,840), direkten Gentransfer (Paszkowski et al. (1984) EMBO
J. 3: 2717–2722),
und ballistische Partikelbeschleunigung (siehe z.B. Sanford et al.,
US-Patent Nr. 4,945,050; Tomes et al., US-Patent Nr. 5,879,918; Tomes
et al., US-Patent Nr. 5,886,244; Bidney et al., US-Patent Nr. 5,932,782;
Tomes et al. (1995) "Direct
DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment," in Plant Cell, Tissue,
und Organ Culture: Fundamental Methods, Hrsg. Gamborg und Phillips
(Springer-Verlag, Berlin); und McCabe et al. (1988) Biotechnology
6: 923–926);
und Lec1-Transformation (WO 00/28058). Für eine Kartoffeltransformation
siehe Tu et al. (1998) Plant Molecular Biology 37: 829–838 und
Chong et al. (2000) Transgenic Research 9: 71–78. Weitere Tranformationsverfahren
können
in Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22: 421–477; Sanford
et al. (1987) Particulate Science and Technology 5: 27–37 (Zwiebel);
Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87: 671–674 (Sojabohne); McCabe et
al. (1988) Bio/Technology 6: 923–926 (Sojabohne); Finer und
McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P: 175–182 (Sojabohne);
Singh et al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96: 319–324 (Sojabohne); Datta et
al. (1990) Biotechnology 8: 736–740
(Reis); Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4305–4309 (Mais);
Klein et al. (1988) Biotechnology 6: 559–563 (Mais); Tomes, US-Patent
Nr. 5,240,855; Buising et al., US-Patente Nrn. 5,322,783 und 5,324,646;
Tomes et al. (1995) "Direct
DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment," in Plant Cell, Tissue,
und Organ Culture: Fundamental Methods, Hrsg. Gamborg (Springer-Verlag,
Berlin) (Mais); Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91: 440–444 (Mais);
Fromm et al. (1990) Biotechnology 8: 833–839 (Mais); Hooykaas-Van Slogteren
et al. (1984) Nature (London) 311: 763–764; Bowen et al., US-Patent
Nr. 5,736,369 (Getreide); Bytebier et al. (1987) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 84: 5345–5349
(Liliaceae); De Wet et al. (1985) in The Experimental Manipulation
of Ovule Tissues, Hersg. Chapman et al. (Longman, New York), S.
197–209
(Pollen); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9: 415–418 und
Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84: 560–566 (Whisker-vermittelte
Transformation); D'Halluin
et al. (1992) Plant Cell 4: 1495–1505 (Elektroporation); Li
et al. (1993) Plant Cell Reports 12: 250–255 und Christou und Ford
(1995) Annals of Botany 75: 407–413
(Reis); Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 745–750 (Mais
via Agrobacterium tumefaciens) gefunden werden.
-
Die
Zellen, die transformiert wurden, können auf herkömmlichen
Wegen zu Pflanzen wachsen gelassen werden. Siehe z.B. McCormick
et al. (1986) Plant Cell Reports 5: 81–84. Diese Pflanzen können dann wachsen
gelassen werden und entweder mit demselben transformierten Stamm
oder unterschiedlichen Stämmen
bestäubt
werden und die resultierenden Hybride, die eine konstitutive oder
induzierbare Expression des gewünschten
Phänotyp-Merkmals hat, identifiziert
werden. Es können
zwei oder mehr Generationen wachsen gelassen werden, um sicherzustellen,
dass eine Expression des phänotypischen
Merkmals stabil gehalten wird und vererbt wird, und dann werden
Samen geerntet, um sicherzustellen, dass die Expression des gewünschten
phänotypischen
Merkmals erreicht wurde.
-
Die
Nucleotidsequenzen der Erfindung können der Pflanze bereitgestellt
werden, indem die Pflanze mit einem Virus oder mit viralen Nucleinsäuren in
Kontakt gebracht wird. Im Allgemeinen involvieren solche Verfahren
den Einbau des Nucleotidkonstrukts von Interesse in ein virales
DNA- oder RNA-Molekül.
Es ist einzusehen, dass die rekombinanten Proteine der Erfindung
zunächst
als Teil eines viralen Polyproteins synthetisiert werden können, welches
später
durch in vivo- oder in vitro-Proteolyse prozessiert wird, um das
gewünschte
pestizide Protein zu produzieren. Es wird auch erkannt, dass ein
solches virales Polyprotein, das wenigstens einen Teil der Aminosäuresequenz
eines pestiziden Proteins der Erfindung umfasst, die gewünschte pestizide
Aktivität
haben kann. Solche viralen Polyproteine und die Nucleotidsequenzen,
die für
sie codieren, werden von der vorliegenden Erfindung umfasst. Verfahren
zur Bereitstellung von Pflanzen mit Nucleotidkonstrukten und zur
Herstellung der codierten Proteine in der Pflanze, die virale DNA-
oder RNA-Moleküle
involvieren, sind auf dem Fachgebiet bekannt. Siehe z.B. US-Patente
Nrn. 5,889,191, 5,889,190, 5,866,785, 5,589,367 und 5,316,931.
-
Die
Erfindung bezieht sich außerdem
auf Pflanzen-vermehrendes Material einer transformierten Pflanze
der Erfindung, einschließlich,
aber nicht beschränkt
auf, Samen, Knollen, Cormus, Zwiebeln, Blätter und Ableger von Wurzeln
und Schößlingen.
-
Die
vorliegende Erfindung kann zur Transformation beliebiger Pflanzenspecies,
einschließlich,
aber nicht beschränkt
auf, Monokotylen und Dikotylen, eingesetzt werden. Beispiele für Pflanzen
von Interesse umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Mais (Zea mays), Brassica
sp. (z.B. B. napus, B. rapa, B. juncea), insbesondere solche Brassica-Species,
die als Quellen für
Samenöl
nützlich
sind, Alfalfa (Medicago saliva), Reis (Oryza sativa), Roggen (Secale
cereale), Sorghum (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), Hirse (z.B.
Perlhirse (Penni setum glaucum), Rispenhirse (Panicum miliaceum),
Kolbenhirse (Setaria italica), Fingerhirse (Eleusine coracana)),
Sonnenblume (Helianthus annuus), Saflor (Carthamus tinctorius),
Weizen (Triticum aestivum), Sojabohne (Glycine max), Tabak (Nicotiana
tabacum), Kartoffel (Solanum tuberosum), Erdnüsse (Arachis hypogaea), Baumwolle
(Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), Süßkartoffel (Ipomoea batatus),
Manihot (Manihot esculenta), Kaffee (Coffea spp.), Kokosnuss (Cocos
nucifera), Ananas (Ananas comosus), Citrusbäume (Citrus spp.), Kakao (Theobroma
cacao), Tee (Camellia sinensis), Banane (Musa spp.), Avocado (Persea
americana), Feige (Ficus casica), Guava (Psidium guajava), Mango
(Mangifera indica), Olive (Olea europaea), Papaya (Carica papaya),
Cashew (Anacardium occidentale), Macadamia (Macadamia integrifolia), Mandel
(Prunus amygdalus), Zuckerrüben
(Beta vulgaris), Zuckerrohr (Saccharum spp.), Hafer, Gerste, Gemüse, Zierpflanzen
und Coniferen.
-
Gemüse umfassen
Tomaten (Lycopersicon esculentum), Salat (z.B. Lactuca sativa),
grüne Bohnen (Phaseolus
vulgaris), Limabohnen (Phaseolus limensis), Erbsen (Lathyrus spp.),
und Mitglieder der Gattung Cucumis, z.B. Gurke (C. sativus), Melone
(C. cantalupensis), und Zuckermelone (C. melo). Zierpflanzen umfassen
Azaleen (Rhododendron spp.), Hortensie (Macrophylla hydrangea),
Hibiscus (Hibiscus rosasanensis), Rosen (Rosa spp.), Tulpen (Tulipa
spp.), Narzissen (Narcissus spp.), Petunien (Petunia hybrida), Gartennelke (Dianthus
caryophyllus), Weihnachtsstern (Euphorbia pulcherrima), und Chrysanthemen.
Coniferen, die in der Durchführung
der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen z.B. Kiefern,
z.B. Weihrauchkiefer (Pinus taeda), Karibische Kiefer (Pinus elliotii),
Gelbkiefer (Pinus ponderosa), Rehkiefer (Pinus contorta), und Monterey-Kiefer (Pinus radiata);
Douglasien (Pseudotsuga menziesii); Westeramerikanische Hemlocktanne
(Tsuga canadensis); Sitka-Fichte (Picea glauca); Redwood (Sequoia
sempervirens); echte Tannen, z.B. Silbertanne (Abies amabilis) und
Balsamtanne (Abies balsamea); und Zedern, z.B. Rote Zeder (Thuja
plicata) und Alaska-Scheinzypresse (Chamaecyparis nootkatensis).
Pflanzen der vorliegenden Erfindung sind vorzugsweise Nutzpflanzen
bzw. Kulturpflanzen (z.B. Mais, Alfalfa, Sonnenblume, Brassica,
Sojabohne, Baumwolle, Saflor, Erdnuss, Sorghum, Weizen, Hirse, Tabak
usw.) und sind bevorzugter Mais- und Sojapflanzen, noch bevorzugter
Maispflanzen.
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Pflanzen
von besonderem Interesse umfassen Kornpflanzen, die Samen von Interesse
liefern, Ölsamenpflanzen
und leguminosen Pflanzen. Samen von Interesse umfassen Körnersamen
bzw. Getreidesamen, z.B. Mais, Weizen, Gerste, Reis, Sorghum, Roggen,
Hirse usw. Ölsamenpflanzen
umfassen Baumwolle, Sojabohne, Safflor, Sonnenblume, Brassica, Mais,
Alfalfa, Palme, Kokosnuss, Flachs, Rizinus, Olive usw. Leguminosenartige
Pflanzen umfassen Bohnen und Erbsen. Bohnen umfassen Guar, Johannisbrotkerne,
Boxhornklee, Sojabohne, Gartenbohnen, Kuherbse, Mungbohne, Limabohne,
Puffbohne, Linsen, Kichererbse usw.
-
Bevor
Pflanzenvermehrungsmaterial (Früchte,
Knollen, Zwiebeln, Cormus, Körner,
Samen), aber speziell Samen, als kommerzielles Produkt verkauft
wird, wird es üblicherweise
mit einer Schutzbeschichtung, die Herbizide, Insektizide, Fungizide,
Bakterizide, Nematizide, Molluscizide oder Gemische von verschiedenen dieser
Präparationen,
wenn gewünscht,
zusammen mit Trägern,
oberflächenaktiven
Mitteln oder die Ausbringung begünstigenden
Andjuvanzien, umfassen, behandelt. Dabei werden die eingesetzt,
die üblicherweise
auf dem Gebiet der Formulierung verwendet werden, um Schutz gegen
eine von Bakterien, Pilzen oder Tierschädlingen verursachter Schädigung zu
verleihen. Um die Samen zu behandeln, kann die Schutzbeschichtung
entweder durch Imprägnieren
der Knollen oder Körner
mit einer flüssigen
Formulierung oder durch Beschichten mit einer kombinierten nassen
oder trockenen Formulierung aufgetragen werden. Außerdem sind
in speziellen Fällen
andere Aufbringungsverfahren auf Pflanzen, z.B. eine Behandlung,
die auf Knospen oder Früchte
gerichtet ist, möglich.
-
Der
Pflanzensamen der Erfindung, der ein DNA-Molekül umfasst, das eine Nucleotidsequenz
umfasst, die für
ein pestizides Protein der Erfindung codiert, kann mit einer Samenschutzbeschichtung
behandelt werden, die eine Samenbehandlungsverbindung, z.B. Captan,
Carboxin, Thiram, Methalaxyl, Pirimiphos-Methyl und andere, die üblicherweise
in der Samenbehandlung eingesetzt werden, umfasst, behandelt werden.
In einer Ausführungsform
im Rahmen der Erfindung wird eine Samenschutzbeschichtung, die eine
pestizide Zusammensetzung der Erfindung umfasst, allein oder in
Kombination mit einer der Samenschutzbeschichtungen, die üblicherweise
in der Samenbehandlung eingesetzt werden, verwendet.
-
Es
ist einzusehen, dass die Gene, die für die pestiziden Proteine codieren,
eingesetzt werden können, um
pathogene Insektenorganismen zu transformieren. Solche Organismen
umfassen Baculoviren, Fungi, Protozoen, Bakterien und Nematoden.
-
Ein
Gen, das für
ein pestizides Protein der Erfindung codiert, kann über einen
geeigneten Vektor in einen mikrobiellen Wirt eingeführt werden
und dieser Wirt kann auf die Umgebung oder auf Pflanzen oder Tiere angewendet
werden. Der Ausdruck "eingeführt" im Kon text mit Insertieren
einer Nucleinsäure
in eine Zelle bedeutet "Transfektion" oder "Transformation" oder "Transduktion" und beinhaltet eine
Bezugnahme auf den Einbau einer Nucleinsäure in eine eukaryotische oder
prokaryotische Zelle, wobei die Nucleinsäure in das Genom der Zelle
(z.B. Chromosom, Plasmid, Pastid oder mitochondriale DNA) eingebaut
werden kann, in ein autonomes Replikon umgewandelt werden kann oder
transient exprimiert werden kann (z.B. transfizierte mRNA).
-
Mikroorganismenwirte,
von denen bekannt ist, dass sie die "Phytosphäre" (Blattfläche, Phyllosphäre, Rhizosphäre und/oder
Rhizoplan) einer oder mehrerer Nutzpflanzen von Interesse besetzen,
können
ausgewählt
werden. Diese Mikroorganismen werden so ausgewählt, dass sie fähig sind,
in der besonderen Umgebung mit den Wildtyp-Mikroorganismen erfolgreich
zu konkurrieren, für
eine stabile Haltung und Expression des Gens, das das pestizide
Protein exprimiert, sorgen und wünschenswerter
Weise für
einen verbesserten Schutz des Pestizids vor einem Umweltabbau und
einer Umweltinaktivierung sorgen. Solche Mikroorganismen umfassen
Bakterien, Algen und Fungi. Von besonderem Interesse sind Mikroorganismen,
z.B. Bakterien wie beispielsweise Pseudomonas, Erwinia, Serratia,
Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas,
Methylius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter,
Azotobacter, Leuconostoc und Alcaligenes, Fungi, insbesondere Hefen,
z.B. Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces,
Rhodotorula und Aureobasidium. Von besonderem Interesse sind solche
Phytosphären-Bakterienspecies
wie Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens,
Acetobacter xylinum, Agrobacteria, Rhodopseudomonas spheroides,
Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus,
Clavibacter xyli und Azotobacter vinlandir und Phytosphären-Hefespecies,
z.B. Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus
albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis,
S. cerevisiae, Sporobolomyces rosues, S. odorus, Kluyveromyces veronae
und Aureobasidium pollulans. Von besonderem Interesse sind die pigmentierten
Mikroorganismen.
-
Es
ist eine Reihe von Wegen zur Einführung eines Gens, das das pestizide
Protein exprimiert, in den Mikroorganismenwirt unter Bedingungen,
die für
eine stabile Aufrechterhaltung und Expression des Gens sorgen, verfügbar. Beispielsweise
können
Expressionskassetten konstruiert werden, welche die Nucleotidkonstrukte
von Interesse funktionell mit den transkriptionalen und translationalen
regulatorischen Signalen zur Expression der Nucleotidkonstrukte
und eine Nucleotidsequenz, welche mit einer Sequenz im Wirtsorganismus ho molog
ist, wodurch eine Integration erfolgen wird, und/oder ein Replicationssystem,
das in dem Wirt funktionell ist, wodurch eine Integration oder eine
stabile Aufrechterhaltung erfolgen wird, enthalten.
-
Transkriptionale
und translationale regulatorische Signale umfassen, sind aber nicht
beschränkt
auf, Promotoren, Transkriptioninitiationsstartstellen, Operatoren,
Aktivatoren, Enhancer, andere regulatorische Elemente, ribosomale
Bindungsstellen, ein Initiationscodon, Terminationssignale und dergleichen.
Siehe z.B. US-Patente Nrn. 5,039,523 und 4,853,331; EPO 0 480 762
A2; Sambrook et al. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
Hrsg. Maniatis et al. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, New York); Davis et al., Hrsg. (1980) Advanced Bacterial
Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory Press), Cold Spring Harbor,
New York; und die darin zitierten Referenzen.
-
Geeignete
Wirtszellen, in denen pestizides Protein-enthaltende Zellen behandelt
werden, um die Aktivität
der pestiziden Proteine in der Zelle zu verlängern, wenn die behandelte
Zelle auf die Umgebung des Zielschädlings (der Zielschädlinge)
ausgebracht wird, können
entweder Prokaryoten oder Eurkaryoten umfassen, die normalerweise
auf solche Zellen beschränkt
sind, die keine Substanzen produzieren, die für höhere Organismen, z.B. Säuger, toxisch
sind. Allerdings könnten
Organismen, die Substanzen produzieren, die für höhere Organismen toxisch sind,
verwendet werden, wobei das Toxin instabil ist oder der Ausbringungslevel
ausreichend niedrig ist, um eine Toxizitätsmöglichkeit für einen Säugerwirt zu vermeiden. Als
Wirte von besonderem Interesse werden die Prokaryoten und die niederen
Eukaryoten, z.B. Pilze, sein. Typische Prokaryoten, sowohl Gram-negative
als auch Gram-positive,
umfassen Enterobacteriaceae, z.B. Escherichia, Erwinia, Shigella, Salmonella
und Proteus; Bacillaceae; Rhizobiceae, z.B. Rhizobium; Spirillaceae,
z.B. Photobacterium, Zymomonas, Serratia, Aeromonas, Vibrio, Desulfovibrio,
Spirillum; Lactobacillaceae; Pseudomonadaceae, z.B. Pseudomonas
und Acetobacter; Azotobacteraceae und Nitrobacteraceae. Unter Eukaryoten
sind Fungi, z.B. Phycomycetes und Ascomycetes, die Hefe umfassen,
z.B. Saccharomyces und Schizosaccharomyces; und Basidiomycetes-Hefe,
z.B. Rhodotorula, Aureobasidium, Sporobolomyces und dergleichen.
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Charakteristika
von besonderem Interesse bei der Auswahl einer Wirtszelle zu Zwecken
der Produktion von pestizidem Protein umfassen die Einfachheit der
Einführung
des pestiziden Proteingens in den Wirt, die Verfügbarkeit von Expressionssystemen,
die Effizienz der Expression, die Stabilität des Proteins in dem Wirt
und das Vorliegen von unterstützenden genetischen
Möglichkeiten.
Charakteristika von Interesse zur Verwendung als Pestizid-Mikrokapseln umfassen
schützende
Qualitäten
für das
Pestizid, z.B. dicke Zellwände, Pigmentierung
und intrazelluläre
Verpackung oder Bildung von Einschlusskörpern; Blattaffinität; Fehlen
von Säugertoxizität; Anziehungsvermögen für Schädlinge zur
Aufnahme; Einfachheit des Abtötens
und der Fixierung ohne Schädigung
des Toxins und dergleichen. Weitere Betrachtungen umfassen die Einfachheit
der Formulierung und Handhabung, wirtschaftliche Aspekte, Lagerungsstabilität und dergleichen.
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Wirtsorganismen
von besonderem Interesse umfassen Hefe, z.B. Rhodotorula sp., Aureobasidium sp.,
Saccharomyces sp. und Sporobolomyces sp., phylloplane Organismen,
z.B. Pseudomonas sp., Erwinia Sp. und Flavobacterium sp., und andere
derartige Organismen, einschließlich
Pseudomonas aeurginosa, Pseudomonas fluorescens, Saccharomyces cerevisiae,
Bacillus thuringiensis, Escherichia coli, Bacillus subtilis und
dergleichen.
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Gene,
die für
die pestiziden Proteine der Erfindung codieren, können in
Mikroorganismen eingeführt werden,
die sich auf Pflanzen (Epiphyten) unter Abgabe pestizider Proteine
an potentielle Zielschädlinge
vermehren. Epiphyten können
z.B. Gram-positive oder Gramnegative Bakterien sein.
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Wurzeln-besiedelnde
Bakterien beispielsweise können
von der Pflanze von Interesse durch fachbekannte Verfahren isoliert
werden. Spezifischer ausgedrückt,
ein Bacillus cereus-Stamm,
der Wurzeln besiedelt, kann von den Wurzeln einer Pflanze isoliert
werden (siehe z.B. Handelsman et al. (1991) Appl. Environ. Microbiol.
56: 713–718).
Gene, die für
die pestiziden Proteine der Erfindung codieren, können durch
Standardverfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, in ein Wurzel-besiedelndes
Bacillus cereus eingeführt
werden.
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Gene,
die für
pestizide Proteine codieren, können
z.B. in das Wurzeln-besiedelnde Bacillus mittels Elektrotransformation
eingeführt
werden. Spezifischer ausgedrückt,
Gene, die für
die pestiziden Proteine codieren, können einen Shuttle-Vektor,
z.B. pHT3101 kloniert werden (Lerecius et al. (1989) FEMS Microbiol. Letts.
60: 211–218).
Der Shuttle-Vektor pHT3101, der die codierende Sequenz für das bestimmte
pestizide Proteingen enthält,
kann z.B. in das Wurzeln-besiedelnde Bacillus durch Elektroporation
transformiert werden (Lerecius et al. (1989) FEMS Microbiol. Letts.
60: 211–218).
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Expressionssysteme
können
so konzipiert sein, dass pestizide Proteine aus dem Cytoplasma von Gram-negativen
Bakterien, z.B. E. coli, sekretiert werden. Vorteile einer Sekretion
von pestiziden Proteinen sind: (1) Vermeiden potentieller cytotoxischer
Wirkungen des exprimierten pestiziden Proteins und (2) Verbesserung
in der Reinigungswirksamkeit des pestiziden Proteins, einschließlich, aber
nicht beschränkt
auf, erhöhte
Wirksamkeit bei der Gewinnung und Reinigung des Proteins pro Volumen
Zellbrühe
und verminderte Zeit und/oder Kosten der Gewinnung und Reinigung
pro Einheit Protein.
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Es
kann erreicht werden, dass pestizide Proteine in E. coli sezerniert
werden, indem z.B. ein geeignetes E. coli-Signalpeptid an das Amino-terminale
Ende des pestiziden Proteins fusioniert wird. Signalpeptide, die
durch E. coli erkannt werden, können
in Proteinen gefunden werden, von denen bereits bekannt ist, dass sie
in E. coli sezerniert werden, z.B. das OmpA-Protein (Ghrayeb et
al. (1984) EMBO J. 3: 2437–2442).
OmpA ist ein Hauptprotein der E. coli-Außenmembran und somit ihr Signalpeptid,
von dem angenommen wird, dass es im Translokationsprozess effizient
ist. Das OmpA-Signalpeptid braucht vor einem Prozessieren nicht
modifiziert zu werden, wie es bei anderen Signalpeptiden der Fall
sein kann, z.B. beim Lipoproteinsignalpeptid (Duffaud et al. (1987)
Meth. Enzymol. 153: 492).
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Pestizide
Proteine der Erfindung können
in einem Bakterienwirt fermentiert werden und die resultierenden
Bakterien prozessiert und als mikrobielles Spray in derselben Art
wie Bacillus thuringienses-Stämme verwendet
werden, welche als insektizide Sprays verwendet wurden. Im Fall
eines pestiziden Proteins (von pestiziden Proteinen), das/die von
Bacillus sezerniert wird/werden, wird das Sekretionssignal entfernt
oder mutiert, indem Verfahren verwendet werden, die auf dem Fachgebiet
bekannt sind. Solche Mutationen und/oder Deletionen verhindern eine
Sekretion des pestiziden Proteins (der pestiziden Proteine) in das
Wachstumsmedium während
des Fermentationsprozesses. Die pestiziden Proteine werden in der
Zelle zurückgehalten
und die Zellen werden dann prozessiert, um die verkapselten pestiziden
Proteine zu erhalten. Zu diesem Zweck kann ein beliebiger geeigneter
Mikroorganismus verwendet werden. Pseudomonas wurde verwendet, um
Bacillus thuringiensis-Endotoxine als eingekapselte Proteine zu
exprimieren, und die resultierenden Zellen wurden prozessiert und
als Insektizid versprüht
(Gaertner et al. (1993), in: Advanced Engineered Pesticides, Hrsg. Kim).
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Alternativ
werden die pestiziden Proteine produziert, indem ein heterologes
Gen in einen zellulären Wirt
eingeführt
wird. Eine Expression des heterologen Gens resultiert direkt oder
indirekt in der intrazellulären Produktion
und Aufrechterhaltung des Pestizids. Diese Zellen werden dann unter
Bedingungen behandelt, die die Aktivität des Toxins verlängern, das
in der Zelle produziert wird, wenn die Zelle auf die Umgebung eines Zielschädlings (von Zielschädlingen)
ausgetragen wird. Das resultierende Produkt behält die Toxizität des Toxins
bei. Diese natürlich
verkapselten pestiziden Proteine können dann gemäß herkömmlicher
Techniken zur Ausbringung auf die Umgebung, die einen Zielschädling beherbergt,
z.B. Boden, Wasser und Blattwerk von Pflanzen, formuliert werden.
Siehe z.B. EP-A 0 192 319 und die darin zitierten Referenzen.
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In
der vorliegenden Erfindung können
ein transformierter Mikroorganismus, welcher ganze Organismen, Zellen,
Spore(n), pestizides Protein (pestizide Proteine), pestizide Komponente(n),
Schädlinge-bekämpfende
Komponente(n), Mutante(n) umfasst; vorzugsweise lebende oder tote
Zellen und Zellkomponenten, einschließlich Gemische lebender und
toter Zellen und Zellkomponenten und einschließlich gebrochener Zellen und
Zellkomponenten, oder ein isoliertes pestizides Protein mit einem
annehmbaren Träger
zu einer pestiziden Zusammensetzung (zu pestiziden Zusammensetzungen),
d.h. z.B. eine Suspension, eine Lösung, eine Emulsion, ein Stäubungspulver,
ein dispergierbares Granulat, ein Spritzpulver und ein emulgierbares
Konzentrat, ein Aerosol, imprägnierte
Körner,
ein Adjuvans, eine auftragbare Paste und auch Verkapselungen, in
z.B. Polymersubstanzen, formuliert werden.
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Derartige
Zusammensetzungen, die oben offenbart sind, können durch Zusatz eines oberflächenaktiven
Mittels, eines inerten Trägers,
eines Konservierungsmittels, eines Feuchthaltemittels, eines Freßstimulans,
eines Lockstoffs, eines Einkapselungsmittels, eines Bindemittels,
eines Emulgators, eines Farbstoffs, eines UV-Schutzmittels, eines
Puffers, eines Fließmittels
oder Düngers,
Mikronährstoff-Donoren
oder anderer Präparationen,
die das Pflanzenwachstum beeinflussen, erhalten werden. Eine Agrochemikalie
oder mehrere Agrochemikalien, einschließlich, aber nicht beschränkt auf,
Herbizide, Insektizide, Fungizide, Bakterizide, Nematozide, Molluscizide,
Acarazide, Pflanzenwachstumsregulatoren, Erntehilfsmittel und Dünger können mit Trägerstoffen,
oberflächenaktiven
Mitteln oder Adjuvanzien, die üblicherweise
auf dem Gebiet der Formulierung verwendet werden, oder mit anderen
Komponenten zur Erleichterung der Produkthandhabung und der Anwendung
für besondere
Zielschädlinge
kombiniert werden. Geeignete Träger
und Hilfsstoffe können
fest oder flüssig
sein und entsprechen den Substanzen, die üblicherweise in der Formulierungstechnologie
verwendet werden, z.B. natürliche
oder regenerierte mineralische Substanzen, Lösungsmittel, Dispergiermittel, Netzmittel,
Klebrigmacher, Bindemittel oder Dünger. Die aktiven Ingredienzien
der vorliegenden Erfindung werden normalerweise in Form von Zusammensetzungen
angewendet und können
auf die Nutzpflanzenfläche oder
die Pflanze, die zu behandeln ist, gleichzeitig oder nacheinander
mit anderen Verbindungen angewendet werden. Verfahren zur Anwendung
bzw. Ausbringung eines aktiven Ingrediens der vorliegenden Erfindung oder
einer agrochemischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung,
die wenigstens eines der pestiziden Proteine enthält, die
durch die Bakterienstämme
der vorliegenden Erfindung produziert werden, umfassen, sind aber
nicht beschränkt
auf, Ausbringung auf Blätter,
Samenbeschichtung und Ausbringung auf den Boden. Die Anzahl der
Anwendungen bzw. Ausbringungen und die Anwendungsrate hängen von
der Intensität
des Befalls durch den entsprechenden Schädling ab.
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Geeignete
oberflächenaktive
Mittel umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, anionische Verbindungen,
z.B. ein Carboxylat von beispielsweise einem Metall; ein Carboxylat
einer langkettigen Fettsäure;
ein N-Acylsarcosinat; Mono- oder Diester von Phosphorsäure mit
Fettalkoholethoxylaten oder Salze solcher Ester; Fettalkoholsulfate,
z.B. Natriumdodecylsulfat, Natriumoctadecylsulfat oder Natriumcetylsulfat;
ethoxylierte Fettalkoholsulfate; ethoxylierte Alkylphenylsulfate;
Ligninsulfonate; Petroleumsulfonate; Alkylarylsulfonate, z.B. Alkylbenzolsulfonate
oder Niederalkylnaphthalinsulfonate, z.B. Butylnaphthalinsulfonat;
Salze von sulfonierten Naphthalin-Formaldehyd-Kondensaten; Salze
von sulfonierten Phenol-Formaldehyd-Kondensaten; komplexere
Sulfonate, z.B. die Amidsulfonate, z.B. das sulfonierte Kondensationsprodukt
von Ölsäure und N-Methyltaurin
oder die Dialkylsulfosuccinate, z.B. Natriumsulfonat oder Dioctylsuccinat.
Nicht-ionische Agenzien umfassen Kondensationsprodukte von Fettsäureestern,
Fettalkoholen, Fettsäureamiden
oder Fettalkyl- oder Alkenyl-substituierten Phenolen mit Ethylenoxid,
Fettsäureester
von mehrwertigen Alkoholethern, z.B. Sorbitanfettsäureester,
Kondensationsprodukte solcher Ester mit Ethylenoxid, z.B. Polyoxyethylensorbitanfettsäureester,
Blockcopolymere von Ethylenoxid und Propylenoxid, Acetylenglykole,
z.B. 2,4,7,9-Tetraethyl-5-decin-4,7-diol oder ethoxylierte acetylenische
Glykole. Beispiele für
ein kationisches oberflächenaktives
Mittel umfassen z.B. ein aliphatisches Mono-, Di- oder Polyamin,
z.B. ein Acetat, Naphthenat oder Oleat; oder ein sauerstoffhaltiges
Amin, z.B. ein Aminoxid von Polyoxyethylenalkylamin; ein Amid-verknüpftes Amin,
hergestellt durch Kondensation einer Carbonsäure mit einem Di- oder Polyamin,
oder ein quaternäres
Ammoniumsalz.
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Beispiele
für inerte
Materialien umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, anorganische Materialien wie
Kaolin, Phyllosilicate, Carbonate, Sulfate, Phosphate oder botanische
Materialien wie Kork, gepufferte Maiskolben, Erdnussschalen, Reishüllen und
Walnussschalen.
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Die
Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können in einer geeigneten Form
zur direkten Anwendung bzw. Ausbringung oder als Konzentrat einer
Primärzusammensetzung,
die eine Verdünnung
mit einer geeigneten Menge an Wasser oder einem anderen Verdünnungsmittel
vor der Anwendung erfordert, sein. Die pestizide Konzentration wird
in Abhängigkeit
von der Natur der bestimmten Formulierung, spezifischerweise, ob
sie ein Konzentrat ist oder direkt zu verwenden ist, abhängen. Die
Zusammensetzung enthält 1
bis 98% eines festen oder flüssigen
inerten Trägers
und 0 bis 50%, vorzugsweise 0,1 bis 50% eines oberflächenaktiven
Mittels. Diese Zusammensetzungen werden in der auf dem Etikett angegebenen
Rate für
das kommerzielle Produkt, vorzugsweise 0,01 lb bis 5,0 lb pro acre,
wenn sie in trockner Form vorliegen, und mit etwa 0,01 pts. bis
10 pts. pro acre, wenn sie in flüssiger
Form vorliegen, verabreicht werden.
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In
einer weiteren Ausführungsform
können
die Zusammensetzungen wie auch die transformierten Mikroorganismen
und pestiziden Proteine der Erfindung vor einer Formulierung behandelt
werden, um die pestizide Aktivität
zu verlängern,
wenn sie auf die Umgebung eines Zielschädlings angewendet werden, solange wie
die Vorbehandlung für
die Aktivität
nicht schädlich
ist. Eine solche Behandlung kann durch chemische und/oder physikalische
Mittel erfolgen, solange die Behandlung die Eigenschaften der Zusammensetzung(en) nicht
nachteilig beeinflusst. Beispiele für chemische Reagenzien umfassen,
sind aber nicht beschränkt
auf, Halogenierungsmittel; Aldehyde, z.B. Formaldehyd und Glutaraldehyd;
Anti-Infektiva,
z.B. Zephiranchlorid; Alkohole, z.B. Isopropanol und Ethanol; und
histologische Fixativa, z.B. Bouin's Fixativ und Helly's Fixativ (siehe z.B. Humason (1967)
Animal Tissue Techniques (W. H. Freeman und Co.)).
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In
anderen Ausführungsformen
der Erfindung kann es vorteilhaft sein, die Cry8-artigen Polypeptide mit einer Protease,
z.B. Trypsin, zu behandeln, um das Protein vor der Anwendung einer
pestiziden Proteinzusammensetzung der Erfindung auf die Umgebung
des Zielschädlings
zu aktivieren. Verfahren zur Aktivierung von Protoxin durch eine
Serinprotease sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Siehe z.B. Cooksey
(1968) Biochem. J. 6: 445–454
and Carroll und Ellar (1989) Biochem. J. 261: 99–105, deren Lehren hier durch
Referenz aufgenommen werden. Beispielsweise umfasst ein geeignetes
Aktivierungsprotokoll, ist aber nicht darauf beschränkt, ein
Kombinieren eines zu aktivierenden Polypeptids, z.B. eines gereinigten
1218-1-Polypeptids, mit Trypsin in einem Gewichtsverhältnis 1218-1-Pro tein/Trypsin
von 1/100 in 20 nM NaHCO3, pH 8, und Verdau der
Probe bei 36°C
für 3 Stunden.
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Die
Zusammensetzungen wie auch die transformierten Mikroorganismen und
pestiziden Proteine der Erfindung können auf die Umgebung eines
Insektenschädlings
z.B. durch Sprühen,
Atomisieren, Stäuben, Verstreuen,
Beschichten oder Gießen,
Einführen
in oder auf den Boden, Einführen
in Berieselungswasser, durch Samenbehandlung oder durch allgemeine
Applizierung oder Stäuben
zu der Zeit, zu der der Schädling aufzutreten
beginnt oder vor dem Auftreten von Schädlingen als Schutzmaßnahme angewendet
werden. Es ist im Allgemeinen wichtig, eine gute Schädlingsbekämpfung in
den früheren
Stadien des Pflanzenwachstums zu erreichen, da dies die Zeit ist,
zu der die Pflanze am schwersten geschädigt werden kann. Die Zusammensetzungen
der Erfindung können
zweckmäßigerweise
andere Insektizide enthalten, wenn dies als notwendig erachtet wird.
In einer Ausführungsform
der Erfindung wird die Zusammensetzung direkt auf den Boden ausgebracht,
und zwar zur Pflanzzeit in körniger
Form einer Zusammensetzung aus einem Träger und toten Zellen eines
Bacillus-Stamms oder eines transformierten Mikroorganismus der Erfindung.
Eine andere Ausführungsform
ist eine körnige
Form einer Zusammensetzung, die eine Agrochemikalie, z.B. ein Herbizid,
ein Insektizid, einen Dünger,
einen inerten Träger
und tote Zellen eines Bacillus-Stamms oder eines transformierten
Mikroorganismus der Erfindung umfasst.
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Die
Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung können
gegen eine Vielzahl von Schädlingen wirksam
sein. Zu Zwecken der vorliegenden Erfindung umfassen Schädlinge,
sind aber nicht beschränkt
auf, Insekten, Pilze, Bakterien, Nematoden, Acaride, Protozoen-Pathogene, Tier-parasitäre Leberegel
und dergleichen. Bevorzugte Schädlinge
sind Insektenschädlinge,
insbesondere Insektenschädlinge,
die eine deutliche Schädigung
verursachen, am bevorzugtesten Insektenschädlinge, die eine beachtliche
Schädigung
an landwirtschaftlichen Pflanzen verursachten. Mit "Insektenschädlinge" sind Insekten und
andere ähnliche
Schädlinge
gemeint, z.B. solche der Ordnung Acari, einschließlich, aber
nicht beschränkt
auf, Milben und Zecken. Insektenschädlinge der vorliegenden Erfindung
umfassen, sind aber nicht beschränkte
auf, Insekten der Ordnung Lepidoptera, z.B. Achoroia grisella, Acleris
gloverana, Acleris variana, Adoxophyes orana, Agrotis ipsilon, Alabama
argillacea, Alsophila pometaria, Amyelois transitella, Anagasta
kuehniella, Anarsia lineatella, Anisota senatoria, Antheraea pernyi,
Anticarsia gemmatalis, Archips sp., Argyrotaenia sp., Athetis mindara,
Bombyx mori, Bucculatrix thurberiella, Cadra cautella, Choristoneura
sp., Cochylls hospes, Colias eurytheme, Corcyra cephalonica, Cydia
latiferreanus, Cydia pomonella, Datana integerrima, Dendrolimus
sibericus, Desmia feneralis, Diaphania hyalinata, Diaphania nitidalis,
Diatraea grandiosella, Diatraea saccharalis, Ennomos subsignaria,
Eoreuma loftini, Esphestia elutella, Erannis tilaria, Estigmene
acrea, Eulia salubricola, Eupocoellia ambiguella, Eupoecilia ambiguella,
Euproctis chrysorrhoea, Euxoa messoria, Galleria mellonella, Grapholita
molesta, Harrisina americana, Helicoverpa subflexa, Helicoverpa
zea, Heliothis virescens, Hemileuca oliviae, Homoeosoma electellum,
Hyphantia cunea, Keiferia lycopersicella, Lambdina fiscellaria fiscellaria,
Lambdina fiscellaria lugubrosa, Leucoma salicis, Lobesia botrana,
Loxostege sticticalis, Lymantria dispar, Macalla thyrisalis, Malacosoma
sp., Mamestra brassicae, Mamestra configurata, Manduca quinquemaculata,
Manduca sexta, Maruca testulalis, Melanchra picta, Operophtera brumata,
Orgyia sp., Ostrinia nubilalis, Paleacrita vernata, Papilio cresphontes,
Pectinophora gossypiella, Phryganidia californica, Phyllonorycter
blancardella, Pieris napi, Pieris rapae, Plathypena scabra, Platynota
flouendana, Platynota stultana, Platyptilia carduidactyla, Plodia
interpunctella, Plutella xylostella, Pontia protodice, Pseudaletia
unipuncta, Pseudoplasia includens, Sabulodes aegrotata, Schizura
concinna, Sitotroga cerealella, Spilonta ocellana, Spodoptera sp.,
Thaurnstopoea pityocampa, Tinsola bisselliella, Trichoplusia hi,
Udea rubigalis, Xylomyges curiails und Yponomeuta padella.
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Die
Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung können
auch gegen Insektenschädlinge
wirksam sein, welche Insekten umfassen, die aus den Ordnungen Diptera,
Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthroptera,
Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera usw.,
insbesondere Coleoptera, speziell Diabrotica virgifera and Lepidoptera
ausgewählt
sind. Insektenschädlinge
der Erfindung für
die Hauptnutzpflanzen umfassen: Mais: Ostrinia nubilalis, Europäischer Maiszünsler; Agrotis
ipsilon, "black
cutworm"; Helicoverpa
zea, Baumwolleule, Spodoptera frugiperda, "fall armyworm"; Diatraea grandiosella, "southwestern corn
borer"; Elasmopalpus
lignosellus, "lesser
cornstalk borer";
Diatraea saccharalis, Zuckerrohrbohrer; Diabrotica virgifera, Western
Corn Rootworm; Diabrotica longicornis barberi, Northern Corn Rootworm;
Diabrotica undecimpunctata howardi, Southern Corn Rootworm; Melanotus
spp., Drahtwürmer;
Cyclocephala borealis, "Northern
masked chafer" (Engerling);
Cyclocephala immaculata, "Southern
masked chafer" (Engerling);
Popillia japonica, Japankäfer;
Chaetocnema pulicaria, Korn-Flohkäfer; Sphenophorus maidis, "maize billbug"; Rhopalosiphum maidis,
Maisblattlaus; Anuraphis maidiradicis, Maiswurzellaus; Blissus leucopterus
leucopterus, Lang wanze; Melanoplus femurrubrum, rotbeiniger Grashüpfer; Melanoplus
sanguinipes, Wanderheuschrecke; Hylemya platura, Saatfliegenlarve;
Agromyza parvicornis, Maisminierfliege; Anaphothrips obscrurus,
Gräserblasenfuß; Solenopsis
milesta, "thief
ant"; Tetranychus
urticae, Spinnmilbe; Sorghum bzw. Hirse: Chilo partellus, Sorghumbohrer;
Spodoptera frugiperda, "fall
armyworm"; Helicoverpa
zea, Maisährenwurm;
Elasmopalpus lignosellus, "leser
cornstalk borer";
Feltia subterranea, "granulate
cutworm"; Phyllophaga
crinita, Engerling; Eleodes, Conoderus und Aeolus spp., Drahtwürmer; Oulema melanopus,
Getreidehähnchen;
Chaetocnema pulicaria, Maisflohkäfer;
Sphenophorus maidis, "maize
billbug"; Rhopalosiphum
maidis; Maisblattlaus; Sipha flava, gelbe Zuckerrohrlaus; Blissus
leucopterus leucopterus, Langwanze; Contarinia sorghicola, Sorghum-Mücke; Tetranychus
cinnabarinus, Karminspinnmilbe; Tetranychus urticae, Spinnmilbe;
Weizen: Pseudaletia unipunctata, "army worm"; Spodoptera frugiperda, "fall armyworm"; Elasmopalpus lignosellus, "lesser cornstalk
borer"; Agrotis
orthogonia, "pale
western cutworm";
Elasmopalpus lignosellus, "lesser
cornstalk borer";
Oulema melanopus, Getreidehähnchen;
Hypera punctata, Kleeblattkäfer;
Diabrotica undecimpunctata howardi, Southern Corn Rootworm; Russische
Getreidelaus; Schizaphis graminum, grüne Schildlaus; Macrosiphum
avenae, Englische Getreidelaus; Melanoplus femurrubrum, rotbeiniger
Grashüpfer;
Melanoplus differentialis, "differential
grasshopper"; Melanoplus
sanguinipes, Wanderheuschrecke; Mayetiola destructor, Hessenfliege;
Sitodiplosis mosellana, gelbe Weizengallmücke; Meromyza americana, "wheat stem maggot"; Hylemya coarctata,
Brachfliege; Frankliniella fusca, Tabakblasenfuß; Cephus cinctus, Weizenstengelsägewespe;
Aceria tulipae, Tulpengallmilbe; Sonnenblume: Cylindrocupturus adspersus,
Sonnenblumenstengelkäfer;
Smicronyx fulus, roter Sonnenblumensamenkäfer; Smicronyx sordidus, grauer
Sonnenblumensamenkäfer;
Suleima helianthana, Sonnenblumenknospenmotte; Homoeosoma electellum,
Sonnenblumenmotte; Zygogramma exclamationis, Sonnenblumenkäfer; Bothyrus
gibbosus, Karottenkäfer;
Neolasioptera murtfeldtiana, Sonnenblumensamenmücke; Baumwolle: Heliothis virescens,
Tabak-Wicklerlarve; Helicoverpa zea, Baumwollkapselwurm; Spodoptera
exigua, Rüben-Heerwurm
bzw. Armyworm; Pectinophora gossypiella, roter Baumwollkapselwurm;
Anthonomus grandis grandis, Baumwollkapselkäfer; Aphis gossypii, Baumwollblattlaus;
Pseudatomoscelis seriatus, Baumwollfloh; Trialeurodes abutilonea,
gestreiftflügelige
Weiße
Fliege; Lygus lineolaris, Grüne
Blattwanze; Melanoplus femurrubrum, rotbeiniger Grashüpfer; Melanoplus
differentialis, "differential
grasshopper"; Thrips
tabaci, Zwiebel-Thrips; Franklinkiella fusca, Tabak-Thrips; Tetrany chus
cinnabarinus, Karminspinnmilbe; Tetranychus urticae, Spinnmilbe;
Reis: Diatraea saccharalis, Zuckerrohrbohrer; Spodoptera frugiperda, "fall armyworm"; Helicoverpa zea,
Maisährenwurm;
Calaspis brunnea, "grape
colaspis"; Lissorhoptrus
oryzophilus, Reiswasserkäfer;
Sitophilus oryzae, Reiskäfer; Nephotettix
nigropictus, Reisblatthüpfer;
Blissus leucopterus leucopterus, Langwanze; Acrosternum hilare, Grüne Reiswanze;
Sojabohne: Pseudoplusia includens, Sojabohnen-Spannerraupe; Anticarsia
gemmatalis, "velvetbean
caterpillar"; Plathypena
scabra, grüner
Kleewurm; Ostrinia nubilalis, Europäischer Maiszünsler; Agrotis
ipsilon, schwarze Erdraupe; Spodoptera exigua, Heerwurm; Heliothis
virescens, Tabak-Wicklerlarve; Helicoverpa
zea, Baumwollkapselkäfer;
Epilachna varivestis, Mexikanischer Bohnenkäfer; Myzus persicae, Grüne Pfirsichblattlaus;
Empoasca fabae, hellgrüne
Zwergzikade; Acrosternum hilare, Grüne Reiswanze; Melanoplus femurrubrum,
rotbeiniger Grashüpfer;
Melanoplus differentialis, "differential
grasshopper"; Hylemya platura,
Saatfliegenlarve; Sericothrips variabilis, Sojabohnen-Thrips; Thrips
tabaci, Zwiebel-Thrips; Tetranychus turkestani, Erdbeer-Spinnmilbe;
Tetranychus urticae, Spinnmilbe; Gerste: Ostrinia nubilalis, Europäischer Maiszünsler; Agrotis
ipsilon, schwarze Erdraupe; Schizaphis graminum, Grüne Schildlaus;
Blissus leucopterus leucopterus, Langwanze; Acrosternum hilare,
Grüne Reiswanze;
Euschistus servus, Braune Reiswanze; Jylemya platura, Saatfliegenlarve;
Mayetiola destructor, Hessenfliege; Petrobia latens, Braune Weizenmilbe; Ölraps: Vrevicoryne
brassicae, Kohlblattlaus; Phyllotreta cruciferae, Kreuzblütler-Flohkäfer; Kartoffel:
Leptinotarsa decemlineata, Colorado-Kartoffelkäfer.
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Darüber hinaus
können
Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung gegen Folgende wirksam sein: Hemiptera,
z.B Lygus hesperus, Lygus lineolaris, Lygus pratensis, Lygus rugulipennis
Popp, Lygus pabulinus, Calocoris norvegicus, Orthops compestris,
Plesiocoris rugicollis, Cyrtopeltis modestus, Cyrtopeltis notatus,
Spanagonicus albofasciatus, Diaphnocoris chlorinonis, Labopidicola
allii, Pseudatomoscelis seriatus, Adelphocoris rapidus, Poecilocapsus
lineatus, Blissus leucopterus, Nysius ericae, Nysiusraphanus, Euschistus
servus, Nezara viridula, Eurygaster, Coreidae, Pyrrhocoridae, Tinidae,
Blostomatidae, Reduviidae und Cimicidae.
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Nematoden
schließen
Pflanzen-parasitäre
Nematoden, z.B. Wurzelgallen-, Zysten- und Läsionsnematoden, einschließlich Heterodera
und Globodera spp; insbesondere Globodera rostochiensis und Globodera pailida
(Kartoffelzystennematode); Heterodera glycines (Sojabohnenzystennematode);
Heterodera schachtii (Rübenzystennematode);
und Heterodera avenae (Getreidezystennematode), ein.
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Die
bevorzugte Entwicklungsstufe zum Testen auf pestizide Aktivität ist die
der Larven oder unreifen Formen dieser oben genannten Insektenschädlinge.
Die Insekten können
in vollständiger
Dunkelheit bei etwa 20°C
bis etwa 30°C
und mit einer relativen Feuchtigkeit von etwa 30% bis etwa 70% gezüchtet werden.
Bioassays können
durchgeführt
werden, wie es bei Czapla und Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83(6):
2480–2485 beschrieben
ist. Verfahren zum Aufziehen von Insektenlarven und zur Durchführung von
Bioassays sind dem Fachmann auf diesem Gebiet gut bekannt.
-
Dem
Fachmann ist eine weite Vielzahl von Bioassaytechniken bekannt.
Allgemeine Verfahren umfassen die Zugabe der experimentellen Verbindung
oder des Organismus zu der Nahrungsquelle in einem verschlossenen
Behälter.
Pestizide Aktivität
kann gemessen werden durch, allerdings ohne Beschränkung darauf, Mortalität, Gewichtsverlust,
Anziehung, Abstoßung
und andere Verhaltensänderungen
und physische Änderungen
nach Fütterung
und Exposition für
eine geeignete Zeitlänge.
Bioassays, die hierin beschrieben werden, können mit einer beliebigen Fütterung
von Insektenschädlingen
im Larven- oder Erwachsenenstadium eingesetzt werden.
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Die
folgenden Beispiele werden zur Erläuterung, keineswegs zur Beschränkung, präsentiert.
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EXPERIMENTELLER
TEIL
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Beispiel 1: Bioassay zum
Testen der pestiziden Aktivität
von B. thuringiensis-Stämmen
-
Gegen Western Corn Rootworm
und Southern Corn Rootworm
-
Insektennahrungen
für Colorado-Kartoffelkäfer (CPB)-,
Southern Corn Rootworm (SCRW)- und Western Corn Rootworm (WCRW)-Larven
sind auf dem Fachgebiet bekannt. Siehe z.B. Rose und McCabe (1973) J.
Econ. Entomology 66: 393, die hier durch Referenz aufgenommen wird.
Die Insektennahrung wird hergestellt und in eine Pittman-Schale
gegossen. Im Allgemeinen werden 1,5 ml Nahrung in jede Zelle mit
zusätzlichen
150 μl Probenpräparation,
die auf die Nahrungsoberfläche
aufgetragen wird, verteilt.
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Bakterienkolonien
von einer ursprünglichen
Platte von Transformanten, die die pestiziden Proteine von Interesse
exprimieren, werden auf Replica-Platten aufgetüpfelt und in 5 ml 2 × YT-Brühe mit 500 μl/1000 ml Kanamycin-Antibiotikum
inokuliert. Die Röhrchen
werden über
Nacht wachsen gelassen. Wenn kein Wachstum vorliegt, werden die
Röhrchen
für weitere
24 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation werden die Röhrchen mit
3500 U/min für
5 bis 8 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und
das Pellet wird in 1000 μl PBS
resuspendiert. Die Probe wird dann in 1,5 ml-Eppendorfröhrchen transferiert
und auf Eis inkubiert, bis die Temperatur 3 bis 4°C ist, danach
folgt eine Ultraschallbehandlung für 12 bis 15 Sekunden.
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Mikrobielle
Kulturbrühen
(150 μl)
oder andere Proben (150 μl)
wurden auf 1,5 ml künstliche
Nahrungen mit einem Oberflächenbereich
von 2,54 cm2 geschichtet. Für das Screening
auf pestizide Aktivität
gegen Rootworms werden 25 μl
einer 0,8%igen Eiagar-Lösung auf
die Deckel der Schalen aufgetragen. Die Schalen und die Deckel werden
unter einem Abzug trocknen gelassen. Nach der Trocknung werden die
Deckel auf die Schalen gelegt und für 4 bis 7 Tage bei einer Temperatur
von 26°C
inkubiert. Die Bioassays werden dann bewertet, indem "lebende" versus "tote" Larven gezählt werden.
Die Mortalität
wird als Prozentwert der toten Larven aus den getesteten gesamten
Larven errechnet.
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Beispiel 2: Pestizide
Aktivität
von B. thuringiensis-Stamm-1218-Lysaten
-
Proben,
die aus Kulturen von B. thuringiensis-Stämmen 1218 hergestellt worden
waren, wurden auf das Vorliegen von pestizider Aktivität gegen
CPB, WCRW und SCRW, wie in Beispiel 1 beschrieben, getestet. Als
Kontrolle wurde die Nahrung mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) behandelt.
-
Zur
Herstellung jeder Probe wurde eine einzelne Kolonie eines Stamms,
der auf einer LB-Platte gewachsen war, selektiert und verwendet,
um das Röhrchen,
das 50 ml TB-Medium enthielt, zu beimpfen. Das Röhrchen wurde über Nacht
bei 28°C
und 250 U/min inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Röhrchen mit 4300 × g für 15 Minuten
zentrifugiert. Der Überstand
wurde verworfen und das Pellet wurde in 50 ml Sporulationsmedium
resuspendiert. Das Röhrchen
wurde erneut mit 4300 × g
für 15
Minuten zentrifugiert. Der zweite Überstand wurde verworfen und
das zweite Pellet wurde in 50 ml Sporulationsmedium resuspendiert.
Das Röhrchen
wurde dann für
48 Stunden bei 28°C
und 250 U/min inkubiert. Nach dieser Inkubation wurde das Röhrchen mit
4300 × g
für 15
Minuten zentrifugiert. Der Überstand
wurde verworfen und das Pellet wurde in 10 ml 1 × M9-Medium resuspendiert.
Die Probe wurde dann in ein 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen transferiert,
auf Eis inkubiert, bis die Temperatur etwa 3 bis 4°C war, und
dann für
12 bis 15 Sekunden mit Ultraschall behandelt. Für Bioassays wurden 150 μl einer ultraschallbehandelten
Probe verwendet.
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Sporulationsmedium
umfasst 200 ml 5 × M9-Salzlösung, 5
ml Salzlösung,
5 ml CaCl2-Lösung
und dH2O zu einem Endvolumen von 1 Liter.
Die Lösung
von 5 × M9-Salzen
umfasst: 64 g, Na2HPO4·7H2O; 15 g, KH2PO4; 2,5 g, NaCl; 5 g, NH4Cl
und dH2O zu einem Endvolumen von 1,0 Liter.
Salzlösung
umfasst: 2,46 g, MgSO4·7H2O;
0,04 g, MnSO4·H2O;
0,28 g, ZnSO4·7H2O;
0,40 g, FeSO4·7H2O;
und dH2O zu einem Endvolumen von 1,0 Liter.
CaCl2-Lösung
umfasst 3,66 g CaCl2·2H2O
und dH2O zu einem Endvolumen von 100 ml.
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Proben
wurden mit und ohne Erwärmen
getestet, um zu bestimmen, ob die Komponente (die Komponenten),
die für
die pestizide Aktivität
verantwortlich ist (sind), hitzestabil ist (sind). Für die Wärmebehandlung wurden
die Proben für
1 S Minuten vor Verwendung im Bioassay gekocht. Nicht-erhitzte Proben,
die aus Stamm 1218 hergestellt worden waren, wiesen pestizide Aktivität gegen
Western Corn Rootworm auf und eine geringere pestizide Aktivität gegen
Southern Corn Rootworm auf. Die Proben, die aus Stamm 1218-Lysaten hergestellt
worden waren, verursachten eine moderate Wuchshemmung bei den Southern
Corn Rootworm-Larven. Nach dem Erhitzen hatten die Proben eine stark
verringerte pestizide Aktivität
gegen beide Rootworm-Species.
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Die
Verringerung bei der pestiziden Aktivität nach Erhitzen zeigte, dass
die eine Komponente oder mehrere Komponenten der Probe aus Stamm
1218, die für
die pestizide Aktivität
verantwortlich ist (sind), wärmelabil
ist (sind). Eine solche Verringerung stimmt damit überein,
dass eine oder mehrere der Komponenten ein Protein sind.
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Beispiel 3: Pestizide
Aktivität
von Kristallproteinen, die aus B. thuringiensis-Stamm 1218 isoliert
wurden
-
Unter
Verwendung von Proben sporulierter Kulturen von B. thuringiensis-Stamm
1218, die wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt worden waren,
wurden Kristallproteine isoliert und dann unter Verwendung von fachbekannten
Verfahren mit Trypsin behandelt. Kurz ausgedrückt, nach Reinigung (Zonengradientenzentrifugation,
Renografin-76) wurden die gereinigten Kristalle in alkalischem Puffer
(50 mM Na2CO3, 10
mM Dithiothreitol, pH 10) gelöst.
Vor Verwendung in dem Assay wurden die gelösten Kristallproteine durch
Filtration mit Centriprep® (Millipore Corp.)-Zentrifugationsfiltereinheiten
mit einem Molekulargewichts-Cutoff von 10.000 konzentriert.
-
Es
ist einzusehen, dass es unter bestimmten experimentellen Bedingungen
vorteilhaft sein kann, die Cry8-artigen Polypeptide mit einer Protease,
z.B. Trypsin, zu behandeln, um das Protein zu aktivieren, bevor die
pestizide Aktivität
einer bestimmten Probe bestimmt wird. Verfahren für die Aktivierung
von Protoxin durch eine Serinprotease sind auf dem Fachgebiet gut
bekannt. Siehe z.B. Cooksey (1968) Biochem J. 6: 445–454 und
Carroll und Ellar (1989) Biochem J. 261: 99–105; die hier durch Referenz
aufgenommen werden. Isolierte Kristallproteine wurden auf pestizide
Aktivität
gegen Western Corn Rootworm-Larven durchgemustert, wie es in Beispiel
1 beschrieben ist. Sowohl eine neue Kristallproteinpräparation
als auch eine früher
hergestellte Präparation
("alte Präparation") von Stamm 1218
besaß deutliche
pestizide Aktivität
gegen Western Corn Rootworm. Gelöste
Kristallproteine wurden bei –80°C für 20 Tage
vor Verwendung in den Assays gelagert.
-
Ein
Fachmann wird wissen, dass es zahlreiche Indikatoren der pestiziden
Aktivität
gibt und dass Variable, z.B. Anzahl der toten Insekten oder durchschnittliches
Gewicht der behandelten Insekten, überwacht werden können. Beispielsweise
kann die pestizide Aktivität
zweckdienlicherweise als % Mortalität ausgedrückt werden, wobei dieser Ausdruck
den prozentualen Anteil bzw. den Prozentwert toter Rootworm-Larven
aus der Gesamtzahl der Larven ist.
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Beispiel 4: Nucleotidsequenzen,
isoliert aus B. thuringiensis-Stamm 1218
-
Es
wurden Anstrengungen unternommen, um die Nucleotidsequenzen zu isolieren,
die für
die Kristallproteine von B. thuringiensis-Stamm 1218 codieren. Aus
1218 wurden zwei Nucleotidsequenzen isoliert, die Nucleotidsequenz-
und Aminosäuresequenz-Homologie
zu Cry8Bal (GenBank-Eingangs-Nr. U04365) haben. Die zwei Cry8-artigen
codierenden Sequenzen, die aus Stamm 1218 isoliert wurden, wurden
Cry1218-1 (SEQ ID NO: 1) und Cry1218-2 (SEQ ID NO: 3) genannt. SEQ
ID NO: 27 und SEQ ID NO: 28 stellen die Nucleinsäuresequenzen von nativen genomischen
Klonen Cry1218-1 und Cry1218-2 bereit.
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Um
zu bestimmen, ob die Proteine, die durch variante oder mutante Polynucleotide
der Erfindung codiert werden, für
Proteine mit pestizider Aktivität
codieren, für
jede Nucleinsäuresequenz
in Escherichia coli exprimiert. Um beispielsweise zu bestimmen,
ob die 1218-1- oder
1218-2-Polynucleotidsequenzen, die hierin bereitgestellt werden,
für Polypeptide
mit pestizider Aktivität
codieren, wurden trunkierte Nucleotidsequenzen hergestellt. SEQ
ID NO: 15 entspricht den Nucleotiden 1 bis 2007 der Nucleotidsequenz
Cry1218-1 (SEQ ID NO: 1). SEQ ID NO: 17 entspricht den Nucleotiden
1 bis 2019 der Nucleotidsequenz von Cry1218-2 (SEQ ID NO: 3).
-
SEQ
ID NO: 15 und 17 codieren für
trunkierte Cry8-artige Polypeptide, die die in SEQ ID NO: 16 bzw. 18
angegebenen Aminosäuresequenzen
haben. Jede der trunkierten Nucleotidsequenzen (SEQ ID NO: 15 und
17) wurde getrennt in einen pET28a-Expressionsvektor kloniert und
dann verwendet, um E. coli zu transformieren. Transformierte Kolonien
wurden ausgewählt
und in flüssiger
Kultur wachsen gelassen, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Die
exprimierten, am N-Terminus His-markierten, trunkierten Cry8-artigen
Proteine wurden aus E. coli-Lysaten durch Affinitätschromatographie
unter Verwendung einer Nickel-Affinitätssäule isoliert.
Die Säulenfraktionen
mit dem Protein von Interesse wurden gegen 10 mM Tris-HCl (pH 8,5)
dialysiert und dann unter Verwendung von Centriprep® (Millipore
Corp.)-Zentrifugationsfiltereinheiten mit einem Molekulargewichts-Cut-off
von 10.000 nach Anweisung des Herstellers konzentriert. Die konzentrierten
Cry8-artigen Proteinproben wurden auf das Vorliegen von pestizider
Aktivität
gegen Western Corn Rootworm getestet, wie es in Beispiel 1 beschrieben
ist.
-
Bioassays,
die die pestizide Aktivität
von rekombinanten Cry8-artigen Proteinen, die aus E. coli-exprimierten
Präprationen
gereinigt wurden, bewerten, wurden wie in Beispiel 1 durchgeführt, wobei
die wässrigen Proteinproben
auf die Oberfläche
der Rootworm-Nahrung geschichtet wurden. Die pestizide Aktivität von Wildtyp-
(z.B. nativem) und mutantem Endotoxin wurden gegen Southern Corn
Rootworm bestimmt. Wie erwartet, wurde beobachtet, dass die pestizide
Aktivität
abnahm, wenn die Konzentration der trunkierten Cry8-artigen Proteine,
die auf die Nahrung aufgetragen wurden, abnahm.
-
Die
pestizide Aktivität
wurde auch bestimmt, indem die pestiziden Proteine in die Rootworm-Nahrung eingearbeitet
wurden, was zu dem oben beschriebenen Verfahren im Gegensatz steht,
das eine Einarbeitung einer proteinhaltigen Lösung in das Nahrungsgemisch
involvierte. Beispielsweise wurden Probennahrungen, die 1000, 500,
400, 300, 200 oder 100 ppm eines pestiziden Polypeptids in die Nahrung
eingearbeitet haben, analysiert.
-
Beispiel 5: Herstellung
einer Pflanzen-bevorzugten Nucleotidsequenz, die für ein pestizides
Protein codiert
-
Weil
die Codonverwendung zwischen Pflanzen und Bakterien unterschiedlich
ist, kann die Expression eines Proteins, das durch eine Nucleotidsequenz
bakteriellen Ursprungs codiert wird, durch translationale Unwirksamkeit
in der Pflanze limitiert werden. Auf dem Fachgebiet ist bekannt,
dass die Expression in einer Pflanze verstärkt werden kann, indem die
codierende Sequenz des Proteins so verändert wird, dass sie Pflanzen-bevorzugte
Codons enthält.
Für eine
optimale Expression eines Proteins in einer Pflanze kann eine synthetische
Nucleotidsequenz hergestellt werden, indem die Aminosäuresequenz
des Proteins verwendet wird und die Sequenz unter Verwendung Pflanzen-bevorzugter
Codons zurücktranslatiert
wird.
-
Unter
Verwendung eines solchen Ansatzes wurde ein Teil der Aminosäuresequenz
des Proteins, das durch Cry1218-1 (SEQ ID NO: 2) codiert wird, unter
Verwendung Mais-bevorzugter Codons zurücktranslatiert. Die resultierende
Pflanzen-bevorzugte Nucleotidsequenz ist in SEQ NO: 9 angegeben.
Die in SEQ ID NO: 9 angegebene Nucleotidsequenz codiert für ein Polypeptid
(SEQ ID NO: 10), das die ersten 669 Aminosäuren der in SEQ ID NO: 2 angegebenen
Aminosäuresequenz
umfasst. Somit codieren SEQ ID NO: 10 und 16 für Polypeptide, die dieselbe
Aminosäuresequenz
umfassen, und SEQ ID NO: 15 stellt ein zweites Polynucleotid bereit,
das in SEQ ID NO: 10 angegebenen Aminosäuren codiert.
-
Beispiel 6: Bioassay zur
Untersuchung der pestiziden Aktivität von mutanten Cry8-artigen Polypeptiden
gegen Colorado-Kartoffelkäfer
(Leptinotarsa decemlineata)
-
Protokoll
-
Kurz
ausgedrückt,
die Bioassayparameter waren wie folgt: Bio-Serv-Nahrung (Katalog-Nr.
F9800B von BIOSERV, Entomology Division, 8. Straße, Suite 1, Frenchtown, New
Jersey 08825) wurde in Pitman-Schalen mit 128 Wells (Katalog-Nr.
BIO-BA-128 von CD International, Pitman, New Jersey 08071) mit einer
Oberfläche
von 2,4 cm2 verteilt. Cry8-artige Proben (1218-1A,
49PVD und NGSR1218-1) wurden mit einer Rate von 50 μl/Well auf
die Nahrungsoberfläche
topisch aufgebracht. Es wurde ausreichend Probenmaterial geliefert,
um vier Beobachtungen/Probe bereitzustellen. Nachdem die Probe getrocknet
war, wurden zwei Colorado-Kartoffelkäfer-Neugeborene in jedes Well
gegeben. Damit waren es insgesamt acht Larven/Probe. Auf jede Schale
wurde ein Deckel (Katalog-Nr. BIO-CV-16, CD International, Pitman,
New Jersey, 08071) gelegt und die Schalen wurden in einen Inkubator
mit 25°C
gestellt.
-
Die
Assayschalen zeigten keine Oberflächenkontamination, die in den
Pufferkontrollen oder den Wells, die Cry8-artige Proben enthielten,
vorhanden war. Der Test wurde am 4. Tag dem Lebendbefall einem Scoring
auf Mortalität
unterzogen.
-
TABELLE
1. Pestizide Aktivität
von trunkierten 1218-1-Polypeptiden und einer Trypsin-Additions-Mutante
gegen Colorado-Kartoffelkäfer
-
Resultate
-
Die
Probe, die in Tabelle mit "A" markiert ist, ist
eine Kontrollprobe, die aus 10 mM Carbonatpuffer mit pH 10 besteht.
Alle trunkierten und mutierten Proteinproben 1218-1A (b–d), 49PVD
(f–h)
und NGSR1218-1 (l–n)
wurden in 10 mM Carbonatpuffer mit pH 10 solubilisiert.
-
Die
1218-1A-Proben, b–d,
umfassen eine trunkierte Polypeptidsequenz, die die Aminosäuresequenz umfasst,
die in SEQ ID NO: 16 angegeben ist. Spezifischer ausgedrückt, die
1218-1A-Proben umfassen die trunkierte Toxindomäne, die durch Aminosäure (aa)-Reste
1 bis aa 669 (von M bis E) der Aminosäuresequenzen, die in SEQ ID
NO: 2 angegeben sind, dargestellt wird.
-
Die
49PVD-Proben, f–h,
umfassen eine mutante Polypeptidsequenz, die eine Aminosäuresequenz hat,
die in SEQ ID NO: 20 angegeben ist. 49PVD wurde durch ein Trimmen
der Sequenz sowohl vom N-Terminus als auch vom C-Terminus der in
SEQ ID NO: 16 angegebenen Sequenz erzeugt. Spezifischer ausgedrückt, der
N-Terminus der 49PVD-Mutante wurde um 47 Reste getrimmt; auf diese
Weise beginnt das Polypeptid am aa-Rest 48(M), und der C-Terminus
wurde um 6 Reste bis zu aa 663(D) getrimmt. Daher ist mutantes 49PVD
1218-1A (SEQ ID
NO: 16) vom aa-Rest 48 bis aa 663.
-
Die
NGSR-Proben, l–m,
umfassen eine 1218-1 Mutantenpolypeptidsequenz, die in SEQ ID NO:
12 angegeben ist. NGSR1218-1 wurde durch die Addition eines NGSR-Motivs
an die Aminosäuresequenz,
die in SEQ ID NO: 16 angegeben ist, nach aa 164 erzeugt. Spezifischer
ausgedrückt,
die NGSR-Mutante stellt eine 1218-1A-Mutante bereit, die die Aminosäuresequenz
NGSR zwischen aa 164 und aa 165 der in SEQ ID NO: 16 angegebenen
Sequenz enthält.
Die Addition von vier Resten an 1218-1A erzeugte ein Protein mit
673 aa. Bioassays von 1218-1A, 49PVD und NGSR1218-1 zeigten, dass
alle drei Proteinproben gegen den Colorado-Kartoffelkäfer (CPB)
wirksam waren. Es wurde festgestellt, dass die Mutante NGSR1218-1
wirksamer war als das Eltern-1218-1A und die 49PVD-Mutante. Die
modifizierten (z.B. trunkierten oder mutierten) 1218-1-Polypeptide
(49PVD, NGSR1218-1) waren wenigstens so aktiv wie die relevante
1218-1- oder 1218-1A-Kontrollprobe.
-
Beispiel 7: Bioassay zum
Testen der pestiziden Aktivität
von mutanten Cry8-artigen Polypeptiden gegen Southern Corn Rootworm
und Western Corn Rootworm
-
Protokoll
-
Kurz
ausgedrückt,
die oben in Beispiel 6 beschriebenen Assayparameter wurden so modifiziert,
dass sie für
die Beurteilung der pestiziden Aktivität von zusätzlichen 1218-1-, 1218-1A-
oder 49PVD-Mutanten gegen Western Corn Rootworm (WCRW) und Southern
Corn Rootworm (SCRW) sorgten. Kurz ausgedrückt, Bio-Serv-Nahrung (Katalog-Nr.
F9800B von: BIOSERV, Entomology Division, 8. Straße, Suite
1, Frenchtown, New Jersey 08825) wurde in Pitman-Schalen mit 128
Vertiefungen (Katalog-Nr. BIO-BA-128 von CD International, Pitman,
New Jersey 08071) mit einer Oberfläche von 2,4 cm2 verteilt.
-
Cry8-artige
Proben wurden topisch auf die Nahrungsoberfläche mit einem Volumen von 50 μl/Well aufgetragen.
Es wurde ausreichend Probenmaterial zugeführt, um für Replicat-Beobachtungen/Probe
zu sorgen. Zum Screening der pestiziden Aktivität gegen Rootworm wurden 25 μl einer 0,8%
Ei-Agar-Lösung
auf die Deckel der Schalen aufgebracht. Die Schalen und die Deckel
wurden unter einem Abzug trocknen gelassen. Nach dem Trocknen wurden
die Deckel auf die Schalen gelegt, und es wurde für 4 bis
7 Tage bei einer Temperatur von 26°C inkubiert. Ein Deckel wurde
auf jede Schale (Katalog Nr. BIO-CV-16, CD International, Pitman,
New Jersey, 08071) gelegt und die Schalen wurden in einen Inkubator
mit 25°C
gestellt.
-
Für die Beurteilung
der pestiziden Aktivität
gegen SCRW wurden Insekten einer Lösung ausgesetzt, die entweder
Puffer (50 mM Carbonatpuffer (pH 10) oder ein mutantes 1218-1- oder
1218-1A-Polypeptid (z.B. 1218-1A, LKMS.N1218-1, LKMS.R1218-1, NGSR.N1218-1,
LKMS.N49PVD, LKMS.R49PVD oder NGSR.N49PVD) in Dosen von entweder
36 oder 3,6 μg/cm2 enthielt, ausgesetzt.
-
Für die Beurteilung
der pestiziden Aktivität
gegen WCRW wurden Insekten einer Lösung, die entweder Puffer (50
mM Carbonatpuffer (pH 10)) umfasst, oder einer begrenzten Anzahl
der Mutanten 1218-1-Polypeptide (LKMS.R1218-1, NGSR.N1218-1, LKMS.N49PVD,
LKMS.R49PVD oder NGSR.N49PVD) mit 88 μg/cm2 ausgesetzt.
-
Die
Bioassay wurden dann durch Zählen "lebende" gegenüber "toten" Larven einem Scoring
unterworfen. Die Mortalität
wird als Prozentwert toter Larven aus den gesamten getesteten Larven
berechnet.
-
TABELLE
2. Pestizide Aktivität
von mutanten Cry1218-1-Polypeptiden gegen Southern Corn Rootworm-Replicat
1.
-
TABELLE
3. Pestizide Aktivität
von mutanten Cry1218-1-Polypeptiden gegen Southern Corn Rootworm-Replicat
2
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TABELLE
4. Pestizide Aktivität
von mutanten Cry1218-1-Polypeptiden gegen Southern Corn Rootworm-Replicat
3
-
TABELLE
5. Pestizide Aktivität
von mutanten Cry1218-1-Polypeptiden gegen Western Corn Rootworm
-
-
Beispiel 8: Transformation
von Mais durch Partikelbeschuss und Regeneration von transgenen
Pflanzen
-
Unreife
Maisembryos aus Gewächshaus-Donorpflanzen
wurden mit einem Plasmid, das die planzenoptimierte Cry1218-1-Nucleotidsequenz
(SEQ ID NO: 9) funktionell mit einem Ubiquitinpromotor verknüpft und das
selektierbare Markergen PAT (Wohlleben et al. (1988) Gene 70: 25–37), das
Resistenz gegen das Herbizid Bialaphos verleiht, enthielt, beschossen.
Alternativ wird das selektierbare Markergen auf einem getrennten Plasmid
bereitgestellt. Die Transformation wurde wie folgt durchgeführt. Rezeütoren für Medien
folgen unten.
-
Vorbereitung von Zielgewebe
-
Die Ähren werden
von Hüllen
befreit und in 30% Clorox-Bleiche plus 0,5% Mikro-Detergens für 20 Minuten
oberflächensterilisiert
und zweimal mit sterilem Wasser gespült. Die unreifen Embryos werden
ausgeschnitten und mit der Embryoachsenseite nach unten (Scutellumseite
nach oben), 25 Embryos pro Platte auf 560Y-Medium für 4 Stunden
gelegt und dann innerhalb der 2,5 cm-Targetzone in Vorbereitung
zum Beschuss ausgerichtet.
-
Herstellung bzw. Vorbereitung
der DNA
-
Ein
Plasmidvektor, der die Pflanzen-optimiere Cry1218-1-Nucleotidsequenz
(SEQ ID NO: 9) funktionell an einen Ubiquitinpromotor verknüpft, umfasst,
wird hergestellt. Beispielsweise umfasst ein geeigneter Transformationsvektor
einen UBI1-Promotor aus Zea mays, eine 5'-UTR aus UBI1 und ein UBI1-Intron in
Kombination mit einem PinII-Terminator.
Eine Plasmid-DNA, die die Pflanzen-optimiere Nucleotidsequenz umfasst, und
eine zweite Plasmid-DNA, die einen PAT-selektierbaren Marker enthält (z.B.
CAMV35S(ACK)-Promotor, der PAT steuert, mit einem CAMV35S-Terminator),
wird auf ein 1,1 μm
(durchschnittlicher Durchmesser) Wolframpellets präzipitiert,
wobei ein CaCl2-Präzipitationsverfahren
wie folgt verwendet wird:
100 μl präparierte Wolframpartikel in
Wasser,
10 μl
(1 μg) DNA
in Tris-EDTA-Puffer (1 μg
Gesamt-DNA)
100 μl
2,5 M CaCl2
10 μl 0,1 M Spermidin
-
Jedes
Reagens wird sequenziell zu einer Wolframpartikelsuspension gegeben,
während
diese auf einem Mehrröhrchen-Vortexer
gehalten wurde. Das Endgemisch wurde kurz mit Ultraschall behandelt
und unter konstanter Vortexbehandlung für 10 Minuten inkubiert. Nach
dem Präzipitationszeitraum
wurden die Röhrchen kurz
zentrifugiert, Flüssigkeit
wurde entfernt, es wurde mit 500 ml 100% Ethanol gewaschen und für 30 Sekunden
zentrifugiert. Wiederum wurde die Flüssigkeit entfernt und 105 μl 100% Ethanol
wurden zu dem fertigen Wolframpartikelpellet gegeben. Zum Beschuss
mit einer Partikelkanone wurden die Wolfram/DNA-Partikel kurz ultraschallbehandelt
und 10 μl
wurden auf die Mitte jedes Makroträgers aufgetüpfelt und vor einem Beschuss
etwa 2 Minuten trocknen gelassen.
-
Behandlung mit einer Partikelkanone
-
Die
Probenplatten werden bei Stufe #4 mit einer Partikelkanone #HE34-1
oder #HE34-2 bombadiert. Alle Proben erhalten einen einzelnen Schuss
mit 650 PSI, wobei insbesamt 10 Aliquots aus jedem Röhrchen hergestellter
Partikel/DNA genommen werden.
-
Anschließende Behandlung
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Nach
dem Beschuss werden die Embryos für 2 Tage auf 560Y-Medium gehalten,
dann auf 560R-Selektionsmedium, das 3 mg/l Bialaphos enthält, transferiert
und alle 2 Wochen subkultiviert. Nach etwa 10 Wochen Selektion werden
selektionsresistente Callusklone auf 288J-Medium transferiert, um
eine Pflanzenregeneration zu initiieren. Nach somatischer Embryoreifung
(2–4 Wochen)
werden gut entwickelte somatische Embryos auf ein Medium zur Keimung
transferiert und in den beleuchteten Kulturraum transferiert. Etwa
7–10 Tage
später
werden sich entwickelnde Schößlinge auf
272V-Hormon-freies Medium in Röhrchen
für 7–10 Tage transferiert,
bis die Pflänzchen
gut entwickelt sind. Pflanzen werden dann in Einsätze in Flachpaletten
(entspricht 2,5'-Topf),
die Topferde enthalten, transferiert und für eine Woche in einer Wachstumskammer
wachsen gelassen, anschließend
weitere 1–2
Wochen im Gewächshaus
wachsen gelassen, dann auf klassische 600-Töpfe (1,6 Gallonen) transferiert
und zur Reife wachsen gelassen. Pflanzen werden überwacht und bezüglich der
Expression des Cry1218-1-Proteins durch fachbekannte Assays, z.B.
Immunoassays und Western-Blotting
mit einem Antikörper,
der an das Cry1218-1-Protein bindet, einem Scoring unterzogen.
-
Beschuss und Kulturmedien
-
Beschussmedium
(560Y) umfasst 4,0 g/l N6-Grundsalze (SIGMA C-1416), 1,0 ml/l Eriksson-Vitaminmischung
(1000X SIGMA-1511), 0,5 mg/l Thiamin·HCl, 120,0 g/l Saccharose,
1,0 mg/l 2,4-D und 2,88 g/l L-Prolin (mit D-I H2O
nach Einstellung auf pH 5,8 mit KOH auf ein Volumen eingestellt);
2,0 g/l Gelrite (zugesetzt nach Volumeneinstellung mit D-I H2O) und 8,5 mg/l Silbernitrat (zugesetzt
nach Sterilisation des Medium und Abkühlen auf Raumtemperatur). Selektionsmedium
(560R) umfasst 4,0 g/l N6-Grundsalze (SIGMA C- 1416), 1,0 ml/l Eriksson-Vitaminmischung
(1000X SIGMA-1511), 0,5 mg/l Thiamin·HCl, 30,0 g/l Saccharose und
2,0 mg/l 2,4-D 8 mit D-I H2O nach pH-Einstellung
auf 5,8 mit KOH auf ein bestimmtes Volumen gebracht); 3,0 g/l Gelrite
(zugesetzt nach Einstellung des Volumens mit D-I H2O)
und 0,85 mg/l Silbernitrat und 3,0 mg/l Bialaphos (beide nach Sterilisieren
des Mediums und Abkühlen
auf Raumtemperatur zugesetzt).
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Pflanzenregenerationsmedium
(288J) umfasst 4,3 g/l MS-Salze (GIBCO 11117-074), 5,0 ml/l MS-Vitaminstammlösung (0,100
g Nicotinsäure,
0,02 g/l Thiamin·HCl,
0,10 g/l Pyridoxin·HCl
und 0,40 g/l Glyin, Volumeneinstellung mit gereinigtem D-I H2O) (Murashige and Skoog (1962) Physiol.
Plant. 15: 473), 100 mg/l Myo-Inositol, 0,5 mg/l Zeatin, 60 g/l
Saccharose und 1,0 ml/l 0,1 mM Abscisinsäure (mit gereinigtem D-I H2O nach Einstellung des pH auf 5,6 im Volumen
eingestellt); 3,0 g/l Gelrite (zugegeben nach Volumeneinstellung mit
D-I H2O); und 1,0 mg/l Indolessigsäure und
3,0 mg/l Bialaphos (zugesetzt nach Sterilisieren des Mediums und
Kühlen
auf 60°C).
Hormonfreies Medium (272V) umfasst 4,3 g/l MS-Salze (GIBCO 11117-074),
5,0 ml/l MS-Vitaminstammlösung
(0,100 g/l Nicotinsäure,
0,02 g/l Thiamin·HCl,
0,10 g/l Pyridoxin·HCl
und 0,40 g/l Glycin, mit gereinigtem D-I H2O
im Volumen eingestellt), 0,1 g/l Myo-Inositol und 40,0 g/l Saccharode
(nach Einstellung des pH auf 5,6 mit gerinigtem D-I H2O
im Volumen eingestellt); und 6 g/l Bacto-Agar (zugesetzt nach Einstellung
des Volumens mit gereinigtem D-I H2O, sterilisiert
und gekühlt
auf 60°C.
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Beispiel 9: Agrobacterium-vermittelte
Transformation von Mais und Regeneration von transgenen Pflanzen
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Für eine Agrobacterium-vermittelte
Transformation von Mais mit einer Pflanzen-optimierten Cry1218-1-Nucleotidsequenz
(SEQ ID NO: 9) wird vorzugsweise das Verfahren von Zhao verwendet
(US-Patent Nr. 5,981,840 und PCT-Patentpublikation WO 98/32326;
deren Inhalte durch Referenz hier aufgenommen werden). Kurz ausgedrückt, unreife
Embryos werden aus Mais isoliert, und die Embryos werden mit einer
Agrobacterium-Suspension unter Bedingungen in Kontakt gebracht,
unter denen die Bakterien fähig
sind, die Pflanzen-optimierter
Cry1218-1-Nucleotidsequenz (SEQ ID NO: 9) auf wenigstens eine Zelle
wenigstens eines der unreifen Embryos zu übertragen (Schritt 1: der Infektionsschritt).
In diesem Schritt werden die unreifen Embryos für die Initiierung der Inokulation
vorzugsweise in einer Agrobacterium-Suspension eingetaucht. Die
Embryos werden für
eine Zeit mit dem Agrobacterium co-kultiviert (Schritt 2: der Co-Kultivierungsschritt).
Vorzugsweise werden die unreifen Embryos nach dem Infektionsschritt
auf festem Medium kultiviert. Nach diesem Co- Kultivierungszeitraum wird ein optionaler "Ruhe"-Schritt in Betracht
gezogen. In diesem Ruheschritt werden die Embryos in Gegenwart wenigstens
eines Antibiotikums, von dem bekannt ist, dass es das Wachstum von
Agrobacterium inhibiert, ohne Zusatz eines selektiven Agenses für Pflanzentransformanten
inkubiert (Schritt 3: Ruheschritt). Die unreifen Embryos werden
vorzugsweise auf festem Medium mit Antibiotikum, aber ohne ein selektierendes
Mittel, zur Eliminierung von Agrobacterium und für eine Ruhephase für die infizierten Zellen
kultiviert. Als Nächstes
werden nicht-okulierte Embryos auf Medium, das ein selektives Mittel
enthält, kultiviert
und wachsender transformierter Callus wird gewonnen (Schritt 4:
der Selektionsschritt). Vorzugsweise werden die unreifen Embryos
auf festem Medium mit einem selektiven Agens kultiviert, was im
selektiven Wachstum von transformierten Zellen resultiert. Der Callus
wird dann zu Pflanzen regeneriert (Schritt 5: der Regenerationsschritt)
und vorzugsweise werden Calli, die auf selektivem Medium gewachsen
sind, auf festem Medium kultiviert, um die Pflanzen zu regenerieren.
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Alle
in der Beschreibung genannten Publikationen und Patentanmeldungen
sind Hinweise für
den Level des Fachwissens eines Fachmanns auf diesem Gebiet.
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Obgleich
die vorstehende Erfindung durch Erläuterung und Beispiele zu Zwecken
der Klarheit des Verständnisses
in gewissem Detail beschrieben wurde, wird es klar sein, dass bestimmte Änderungen
und Modifikationen innerhalb des Rahmens der angegebenen Ausführungsformen
durchgeführt
werden können.
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