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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Vorbeugung und Behandlung von
Schlaganfall und ischämischen Erkrankungen,
insbesondere eines ischämischen
Hirninfarktes, eines akuten Herzinfarktes und einer chronischen
Herzkrankheit, mittels spezifischer Wachstumsfaktoren. Die Erfindung
betrifft insbesondere die Verwendung von Plazenta-Wachstumsfaktor
in pharmazeutischen Zusammensetzungen und Verfahren einer solchen Vorbeugung
oder Behandlung.
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Hintergrund
der Erfindung
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Ein
Schlaganfall, der als plötzliche
Schwächung
oder Verlust des Bewusstseins, der Sinneswahrnehmung und der willkürlichen
Bewegung aufgrund des Reißens
oder der Obstruktion einer Arterie des Gehirns definiert ist, ist
die dritthäufigste
Todesursache in den Vereinigten Staaten. Weltweit ist der Schlaganfall
aufgrund seiner besonders hohen Inzidenz in Asien die Todesursache
Nr. 1. Der ischämische
Schlaganfall ist die üblichste
Form des Schlaganfalls und ist für
ungefähr
85% aller Schlaganfälle
verantwortlich, wohingegen hämorrhagische
Schlaganfälle
(beispielsweise intraparenchymale oder subarachnoidale) lediglich
für die
verbleibenden 15% verantwortlich sind. Aufgrund des durchschnittlichen
Alters der Bevölkerung
nimmt die Anzahl von Schlaganfällen
kontinuierlich zu. Weil das Gehirn sogar gegenüber einer kurzen Ischämie sehr
stark verwundbar ist und sich nur schlecht erholt, bietet die primäre Prävention
in der ischämischen
Schlaganfalls-Prävention
das größte Potential
für die
Reduktion der Inzidenz dieser Erkrankung.
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Ein
fokaler ischämischer
Hirninfarkt tritt auf, wenn der arterielle Blutstrom zu einer speziellen
Region des Gehirns unter eine kritische Ebene reduziert wird. Eine
cerebrale Arterien-okklusion erzeugt einen akuten Zentralinfarkt
und umgebende Regionen mit einer unvollständigen Ischämie (die manchmal als „Penumbra" bezeichnet werden),
die dysfunktionell, aber noch potentiell zu retten sind. Die Ischämie des
Myokards als Ergebnis einer reduzierten Perfusion aufgrund einer
chronischen Verengung von Blutgefäßen kann zu einem tödlichen
Herzversagen führen
und stellt eine Hauptbedrohung für
die Gesundheit dar. Ein akuter Myokardinfarkt bzw. Herzinfarkt,
ausgelöst
durch den Verschluss einer Coronararterie, erzeugt eine Zellnekrose über eine Zeitspanne
von mehreren Stunden hinweg. In Abwesenheit einer erneuten Durchströmung oder
einer ausreichenden Perfusion machen die cerebralen oder myokardialen
ischämischen
Regionen eine progressive bzw. fortschreitende metabolische Verschlechterung
durch, die in einem Infarkt gipfelt, wohingegen die Wiederherstellung
der Perfusion in der Penumbra des Gehirninfarktes oder in den gefährdeten,
jedoch zu rettenden Regionen des Myokards, die Gewebsschädigung lindern
können.
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Eine
Wachstumsfaktor-vermittelte verbesserte Perfusion der Penumbra im
Gehirn oder des bedrohten Myokards der Patienten, die unter ischämischen
Ereignissen leiden, entweder über
eine erhöhte
Vasodilatation oder Angiogenese (der Bildung von mit Endothel ausgekleideten
Gefäßen) kann
gemäß Isner
et al. in J. Clin. Invest (1999) 103 (9): 1231–6 einen großen therapeutischen
Wert aufweisen, jedoch sind viele Fragen nach wie vor in dieser
Hinsicht zu beantworten, beispielsweise welcher geeignete Wachstumsfaktor
oder welche Kombination von Wachstumsfaktoren ausgewählt werden
sollte und welcher Verabreichungsweg wirksam und für diesen
Zweck sicher genug ist. Zusätzlich
ist eine nach wie vor bestehende Frage, ob die Bildung von neuen,
mit Endothel ausgekleideten Gefäßen (d.
h. eine Angiogenese) alleine ausreichend ist, um eine nachhaltige
funktionelle Gewebsperfusion zu stimulieren. In der Tat stellt die
Bedeckung der Endothel-ausgekleideten Gefäße durch glatte Gefäßmuskelzellen
(d. h. Arteriogenese) eine vasomotorische Kontrolle, strukturelle Festigkeit
und Integrität
bereit und macht die neuen Gefäße gegenüber einer
Rückbildung
beständig.
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Die
kapillaren Blutgefäße bestehen
aus Endothelzellen und Pericyten, die die gesamte genetische Information
brauchen, die zur Bildung von Röhren,
Verzweigungen und Gesamtkapillarnetzwerken erforderlich ist. Spezielle
angiogenetische Moleküle
können
diesen Prozess initiieren. Mehrere Polypeptide, die die Angiogenese
stimulieren, wurden aufgereinigt und bezüglich ihrer molekularen, biochemischen
und biologischen Eigenschaften charakterisiert, siehe den Review
von Klagsbrun et al., in Ann. Rev. Physiol. (1991) 53: 217–239 und
Folkman et al., in J. Biol., Chem. (1992) 267: 10931–4. Ein
Faktor, der die Angiogenese stimulieren kann und der als Mitogen
für vaskuläre Endothelzellen
hochspezifisch ist, wird vaskulärer
endothelialer Wachstumsfaktor genannt (hierin als VEGF bezeichnet),
gemäß Ferrara
et al. in J. Cell. Biochem. (1991) 47: 211–218. VEGF ist ebenfalls als
Vasculotropin bekannt. Auch Connolly et al. beschreiben in 3. Biol.
Chem. (1989) 264: 20017–20024,
in J. Clin., Invest. (1989) 84: 1470–8 und in J. Cell. Biochem.
(1991) 47: 219– 223
einen humanen vaskulären
Permeabilitätsfaktor,
der vaskuläre
Endothelzellen stimuliert, so dass sie sich in vitro teilen, und
das Wachstum neuer Blutgefäße fördert, wenn
er heilenden Kaninchen-Knochentransplantate oder Ratten-Corneas
verabreicht wird. Der Begriff vaskulärer Permeabilitätsfaktor
(VPF als Abkürzung)
wurde wegen einer erhöhten
Flüssigkeitsleckage
aus Blutgefäßen im Anschluss
an eine intradermale Injektion übernommen und
scheint dieselbe Substanz wie VEGF zu bezeichnen. Das murine VEGF-Gen wurde charakterisiert
und sein Expressionsmuster in der Embryogenese wurde analysiert.
Eine persistierende Expression von VEGF wurde in Epithelzellen beobachtet,
die fenestriertem Endothel benachbart sind, beispielsweise im Chloroidplexus
und in den Nierenglomeruli, was mit seiner Rolle als multifunktionellem
Regulator des Endothelzellwachstums und der Differenzierung konsistent
ist, wie von Breier et al. in Development (1992) 114: 521–532 offenbart ist.
VEGF teilt gemäß Leung
et al. in Science (1989) 246: 1306–9 ungefähr 22% Sequenzidentität, einschließlich einer
vollständigen
Konservierung von acht Cysteinresten, mit dem humanen Plättchen-abgeleiteten Wachstumsfaktor
PDGF, einem Hauptwachstumsfaktor für Bindegewebe. Alternativ gespleißte mRNAs
wurden sowohl für
VEGF als auch PDGF identifiziert und diese Spleißprodukte unterscheiden sich
in ihrer biologischen Aktivität
und Rezepturbindungsspezifität.
VEGF ist ein potentes vasoaktives Protein, das in Medien nachgewiesen
und aus diesen aufgereinigt wurde, die durch mehrere Zelllinien
konditioniert wurden, einschließlich
Hirnanhangsdrüsen-Zellen,
wie beispielsweise follikuläre
Rinderhirnanhangsdrüsenzellen
(wie von Ferrara et al. in Biochem. Biophys. Res. Comm. (1989) 161:
851–858
und von Gospodarowicz et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989)
86: 7311–5
offenbart), Ratten-Gliomzellen (wie offenbart von Conn et al. in
Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87: 1323–1327) und mehrere Tumorzelllinien.
In ähnlicher
Weise wurde ein endothelialer Wachstumsfaktor, isoliert aus der
Maus-Neuroblastomzelllinie NB41, mit einer unreduzierten Molekülmasse von
43–51
kDa von Levy et al. in Growth Factors (1989) 2: 9–19 beschrieben.
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VEGF
wurde als glycosyliertes kationisches 46-kDa-Dimer charakterisiert,
das aus zwei Untereinheiten bestand, die jeweils mit einer apparenten
Molekülmasse
von 23 kDa hergestellt waren. Es wird durch Sulfhydryl-Reduktionsmittel
inaktiviert, ist resistent gegenüber
saurem pH und gegenüber
Erhitzen, und bindet an immobilisiertes Heparin. VEGF weist vier
unterschiedliche Formen von 121, 165, 189 und 206 Aminosäuren aufgrund
eines alternativen Spleißens
der mRNA auf. Die verschiedenen VEGF-Spezies werden durch dasselbe
Gen codiert. Eine Analyse genomischer Klone im Bereich einer putativen
bzw. vermeintlichen mRNA-Spleißung
zeigt ebenfalls eine Intron/Exon-Struktur, die mit einem alternativen
Spleißen
konsistent ist. Die VEGF-165-Spezies ist die molekulare Form, die
in vorherrschender Weise in normalen Zellen und Geweben zu finden
ist. Die VEGF-121- und VEGF-165-Spezies sind lösliche Proteine und sind dazu
in der Lage, die Angiogenese zu fördern, wohingegen die VEGF-189-
und VEGF-206-Spezies die am meisten Zell-assoziierten Spezies sind. Alle VEGF-Isoformen
sind biologisch aktiv, beispielsweise ist jede der Spezies, wenn
sie intradermal verabreicht wird, dazu in der Lage, eine Extravasation
von Evans-Blau zu induzieren. Jedoch weisen die VEGF-Isoformen unterschiedliche
biochemische Eigenschaften auf, die möglicherweise die Signalgebungseigenschaften
der Wachstumsfaktoren modulieren können. Die VEGF-165-, VEGF-189-
und VEGF-206-Spezies
enthalten acht zusätzliche
Cysteinreste innerhalb der Carboxy-terminalen Region. Der Amino-terminalen
Sequenz von VEGF gehen 26 Aminosäuren
voran, die einer typischen Signalsequenz entsprechen. Das reife
Protein wird direkt im Anschluss an eine Signalsequenzspaltung ohne
jede dazwischenliegende Prosequenz erzeugt. Weitere VEGF-Polypeptide aus der
PDGF-Familie von Wachstumsfaktoren wurden im US-Patent Nr. 5,840,693
offenbart. Aufgereinigte und isolierte VEGF-C-Cystein-Deletionsvarianten, die
an einen VEGF-Typrosinkinaserezeptor binden, wurden in US-Patent
Nr. 6,130,071 offenbart.
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Wie
andere Cytokine kann VEGF unterschiedliche Wirkungen aufweisen,
die vom spezifischen biologischen Kontext abhängig sind, in dem diese zu
finden sind. Die Expression von VEGF ist in vaskularisierten Geweben
hoch (beispielsweise Lunge, Herz, Plazenta und festen Tumoren) und
korreliert mit der Angiogenese sowohl temporär als auch räumlich.
Es wurde gezeigt, dass VEGF direkt zur Induktion einer Angiogenese durch
Fördern
des Endothelzellwachstums während
einer normalen embryonalen Entwicklung, der Wundheilung, der Gewebsregeneration
und Reorganisation in vivo beiträgt.
Deswegen wurde VEGF zur Verwendung in der Förderung der vaskulären Gewebsreparatur
vorgeschlagen, wie von EP-A-0 506 477 offenbart. VEGF ist ebenfalls
in pathologische Prozesse wie beispielsweise Wachstum und Metastase
von festen Tumoren und Ischämie-induzierten
retinalen Störungen
involviert, wie sie beispielsweise im US-Patent Nr. 6,114,320 offenbart
sind. Die VEGF-Expression wird durch eine Hypoxie ausgelöst, so dass
die Endothelzellproliferation und Angiogenese insbesondere in ischämischen
Bereichen stimuliert zu sein scheint. Zuletzt offenbart US-Patent Nr.
6,040,157 humane VEGF2-Polypeptide,
die vermeintlich aufgrund ihrer Aminosäuresequenzhomologie zu humanem VEGF
als neue vaskuläre
Endothelwachstumsfaktoren identifiziert wurden. Das letztere Dokument offenbart
weiterhin eine Wiederherstellung bestimmter Parameter in ischämischen
Gliedmaßen
durch Verwendung eines VEGF2-Proteins. Es ist jedoch von Hariawala
et al. in J. Surg. Res. (1996) 63 (1): 77–82 ebenfalls bekannt, dass
eine systemische Verabreichung von VEGF in hohen Dosen über kurze
Zeitspannen den myokardialen Blutstrom verbessert, jedoch in Schweineherzen
eine Hypotension erzeugt.
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Plazenta-Wachstumsfaktor
(hierin als PlGF bezeichnet) wurde von Maglione et al. in Proc.
Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88 (20): 9267–71 als Protein entdeckt, das
mit dem vaskulären
Permeabilitätsfaktor
verwandt war. US-Patent Nr. 5,919,899 offenbart Nukleotidsequenzen,
die für
ein Protein mit dem Namen PlGF codieren, das in der Behandlung inflammatorischer
Erkrankungen und in der Behandlung von Wunden oder von Geweben nach
chirurgischen Operationen, Transplantationen, Verbrennungen von
Ulzera usw. verwendet werden kann. Lösliche nicht-Heparin-bindende
und Heparin-bindende Formen, die jeweils aus 131 bzw. 152 Aminosäuren zusammengebaut
sind, wurden für
PlGF beschrieben, das in der Plazenta, trophoplastischen Tumoren
und kultivierten humanen Endothelzellen exprimiert wird, gemäß US-Patent
Nr. 5,776,755.
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Ein
durch die vorliegende Erfindung zu lösendes Problem besteht darin,
pharmazeutische Zusammensetzungen und Verfahren zur Verbesserung
der Perfusion der Penumbra im Gehirn oder der Perfusion des gefährdeten
Myokards von Patienten, die unter ischämischen Ereignissen leiden,
bereitzustellen, die sich zur Vorbeugung und Behandlung von Schlaganfällen und
ischämischen
Erkrankungen als nützlich
erweisen, insbesondere bei ischämischem
Gehirninfarkt, akutem Myokardinfarkt und chronischer Herzkrankheit.
Ein weiteres durch die vorliegende Erfindung zu lösendes Problem
besteht in der Bereitstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen
und Verfahren zum Reduzieren oder Unterdrücken einer Infarktexpansion
der Penumbra im Gehirn oder dem Myokard, der Verbesserung der Perfusion
oder Reduktion oder der Unterdrückung
der Infarktexpansion oder einem in anderer Weise Verbessern der
Revaskularisierung von Infarkten. Ein noch weiteres durch die vorliegende
Erfindung zu lösendes
Problem besteht in der Bereitstellung eines wirksamen Mittels zur
Vorbeugung und Behandlung von Schlaganfällen und ischämischen
Erkrankungen, insbesondere dem ischämischen Gehirninfarkt, dem
akuten Myokardinfarkt und der chronischen Herzkrankheit, dem abträgliche Nebenwirkungen
wie beispielsweise eine Hypotension fehlen.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die
verschiedenen oben erwähnten
Ziele bzw. Aufgaben der vorliegenden Erfindung wurden erfolgreich
und unerwartet durch eine geeignete Anwendung von Plazenta-Wachstumsfaktor
oder eines Fragments, Derivates oder Homologen hiervon, wie es beispielsweise
hierin nachstehend offenbart ist, erreicht.
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Gemäß eines
Aspektes betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Plazenta-Wachstumsfaktor,
eines Fragmentes, eines Derivates oder eines Homologen hiervon zur
Behandlung von Krankheiten wie beispielsweise von Schlaganfällen (einschließlich hämorrhagischen
Schlaganfällen)
und ischämischen
Erkrankungen bei Säugetieren.
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Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer
Zusammensetzung, die Plazenta-Wachstumsfaktor, ein Fragment, ein
Derivat oder ein Homologes hiervon umfasst, zur Herstellung eines Medikamentes.
Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung von Plazenta-Wachstumsfaktor,
eines Fragments, eines Derivats und eines Homologen hiervon, das
zumindest 50% Aminosäuresequenzidentität mit Plazenta-Wachstumsfaktor als
aktivem Inhaltsstoff in Mischung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, zur
Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Reduktion
der Infarktgröße während der
Behandlung einer ischämischen
Erkrankung in einem Säugetier
umfasst. Gemäß einer
speziellen Ausführungsform
der pharmazeutischen Zusammensetzung, die Plazenta-Wachstumsfaktor
umfasst, wird diese zur Verwendung in der Behandlung einer ischämischen
Erkrankung in einem Säugetier
eingesetzt, das dem Risiko von Nebenwirkungseffekten unterliegt,
wie beispielsweise einer Hypotension. Weitere spezielle Ausführungsformen
der Erfindung betreffen die Verwendung von Plazenta-Wachstumsfaktor in
der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Reduktion
einer Infarktgröße in der
Behandlung von Schlaganfall oder akutem Myokardinfarkt. Gemäß einer
noch weiteren speziellen Ausführungsform
weist die pharmazeutische Zusammensetzung keine systemischen hämodynamischen
Nebenwirkungen auf.
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Gemäß eines
weiteren Aspekts betrifft die vorliegende Erfindung pharmazeutische
Zusammensetzungen zur Prävention
oder Behandlung von Schlaganfällen
und ischämischen Erkrankungen
in Säugetieren,
umfassend Plazenta-Wachstumsfaktor, ein Fragment, ein Derivat oder
ein Homologes hiervon als aktiven Inhaltsstoff in Mischung mit zumindest
einem pharmazeutisch verträglichen
Träger.
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Die
vorliegende Erfindung umfasst weiterhin ein Verfahren zur Behandlung
oder Prävention
eines Schlaganfalles (einschliesslich eines hämorrhagischen Schlaganfalls)
oder einer ischämischen
Erkrankung in einem Säugetier,
umfassend die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge
eines Plazenta-Wachstumsfaktors, eines Fragments, eines Derivates
oder eines Homologes hiervon an ein Säugetier, das einer solchen
Behandlung oder Prävention
bedarf.
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Definitionen
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In
all den verschiedenen Aspekten der vorliegenden Erfindung weisen
die Begriffe „Schlaganfall" und „ischämische Erkrankung" die Bedeutung und
Definitionen auf, wie sie im Abschnitt „Hintergrund der Erfindung" angegeben sind.
Beispiele für
ischämische
Erkrankungen innerhalb des Umfangs dieser Erfindung schließen u. a.
Folgendes ein:
- – ischämischer Schlaganfall oder fokaler
ischämischer
Hirninfarkt,
- – akuter
Myokardinfarkt oder koronare Ischämie,
- – chronische
ischämische
Herzkrankheit,
- – ischämische Erkrankung
eines anderen Organs als des Myokards oder einer Region des Gehirns,
beispielsweise einer peripheren Gliedmaße (beispielsweise Gliedmaßen-Ischämie oder
periphere arterielle Erkrankung).
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In
all den verschiedenen Aspekten der vorliegenden Erfindung soll der
Begriff „Säugetier" seine übliche Bedeutung
aufweisen und schließt
namentlich Menschen, Pferde, Katzen, Hunde, Schweine, Rinder, Schafe
und dergleichen ein.
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Der
Begriff „Homolog" bzw. „Homologes", wie hierin bezüglich Wachstumsfaktoren
der vorliegenden Erfindung verwendet, betrifft Moleküle, die
zumindest 50%, besonders bevorzugt zumindest 70% und am meisten
bevorzugt zumindest 90% Aminosäuresequenzidentität mit dem
relevanten Wachstumsfaktor aufweisen. Bezüglich des vaskulären epithelialen
Wachstumsfaktors schließt
dieser sowohl die Dimere als auch die Untereinheit hiervon ein.
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Der
Begriff „Fragment", wie hierin bezüglich von
Wachstumsfaktoren der vorliegenden Erfindung verwendet, betrifft
Moleküle,
die den aktiven Anteil des Wachstumsfaktors enthalten, d. h. den
Anteil, der funktionell dazu in der Lage ist, eine Perfusion oder
Reduktion oder Unterdrückung
einer Infarktexpansion oder eine in anderer Weise Verbesserung der
Revaskularisierung von Infarkten zu verbessern und der mehrere nicht-essentielle
(bezüglich
Angiogenese und/oder Arteriogenese) Eigenschaften des ursprünglichen
Wachstumsfaktor verloren haben mag. Vorzugsweise ist das in der
vorliegenden Erfindung verwendete Fragment das angiogenetische und/oder
arteriogenetische Fragment des relevanten Wachstumsfaktors.
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Der
Begriff „Derivat", wie hierin bezüglich von
Wachstumsfaktoren der vorliegenden Erfindung verwendet, betrifft
Moleküle,
die zumindest den aktiven Anteil des Wachstumsfaktors (wie hierin
definiert) und einen komplementären
Anteil enthalten, der sich von demjenigen, der in Wildtyp-Wachstumsfaktor
vorliegt, beispielsweise durch weitere Manipulationen wie beispielsweise
Einbringen von Mutationen unterscheidet.
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Der
Begriff „vaskulärer Endothel-Wachstumsfaktor", wie hierin verwendet,
betrifft, gleichgültig
ob humanen oder Tier-Ursprungs, alle Isoformen hiervon, wie sie
beispielsweise im Abschnitt „Hintergrund
der Erfindung" offenbart
sind. Jedoch wird die 165-Aminosäureisoform
bevorzugt. Der Begriff „Plazenta-Wachstumsfaktor", wie hierin verwendet,
betrifft, gleichgültig
ob humanen oder tierischen Ursprungs, alle Isoformen hiervon, nämlich die
131- und 152-Aminosäureformen,
die oben offenbart sind.
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Ausführliche
Beschreibung der Erfindung
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In
den Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung, die verschiedene Aspekte
der vorliegenden Erfindung bilden, kann die Verabreichen von aktiven
Inhaltsstoffen chronisch oder diskontinuierlich erfolgen, abhängig vom
medizinischen Status bzw. Zustand und den Bedürfnissen des Säugetiers.
Der (die) aktiven Inhaltsstoff(e) kann dem Patienten durch orale, intranasale,
subkutane, intramuskuläre,
intradermale, intravenöse,
intraarterielle oder parenterale Verabreichung oder durch Katheterisierung,
vorzugsweise subkutan, verabreicht werden. Jedoch ist der am meisten
bevorzugte Verabreichungsweg eine chronische kontinuierliche subkutane Abgabe
wie beispielsweise mittels einer osmotischen Pumpe. Der Begriff „therapeutisch
wirksame Menge", wie
hierin verwendet, bedeutet vorzugsweise eine Menge, die zur Verbesserung
der Perfusion oder zur Reduktion oder Unterdrückung einer Infarktexpansion
oder eine in anderer Weise Verbesserung der Revaskularisierung von
Infarkten in der Lage ist, und betrifft insbesondere vorzugsweise
eine Menge von ungefähr
2 bis 2.000 μg
pro kg Körpergewicht
des Säugetiers,
das behandelt werden soll, und pro Woche für jeden aktiven Inhaltsstoff.
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In
den pharmazeutischen Zusammensetzungen, die verschiedene Aspekte
der vorliegenden Erfindung darstellen, bedeutet der Begriff „pharmazeutisch
verträglicher
Träger" irgendein Material
oder Substanz, mit dem der (die) aktive Inhaltsstoff(e) formuliert
wird, um seine Verabreichung oder Verbreitung zu erleichtern, beispielsweise
durch Lösen,
Dispergieren oder Diffundieren des Inhaltsstoffes und/oder zur Erleichterung
seiner Lagerung, seines Transports oder seiner Handhabung ohne Beeinträchtigung
seiner Wirksamkeit. Der pharmazeutisch verträgliche Träger kann fest oder flüssig oder
ein Gas sein, das zur Bildung einer Flüssigkeit komprimiert wurde,
d. h. die Zusammensetzungen dieser Erfindung können in geeigneter Weise als
Konzentrate, Emulsionen, Lösungen,
Granulate, Stäube,
Sprays, Aerosole, Pellets oder Pulver verwendet werden. Jedoch ist
eine Formulierung, die zur subkutanen Anwendung geeignet ist, in
hohem Maße
bevorzugt.
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Geeignete
pharmazeutische Träger
zur Verwendung in den vorliegenden Zusammensetzungen sind dem Fachmann
auf dem Gebiet wohlbekannt, und es besteht keine spezielle Einschränkung gegenüber ihrer Auswahl
innerhalb der Erfindung. Sie können
ebenfalls Additive, wie beispielsweise Benetzungsmittel, Dispergiermittel,
Klebemittel, Klebstoffe, Emulgiermittel, Lösungsmittel, Umhüllungen
bzw. Beschichtungen, antibakterielle und Antipilz-Mittel (beispielsweise
Phenol, Sorbinsäure,
Chlorbutanol), isotonische Mittel (beispielsweise Zucker oder Natriumchlorid
und dergleichen einschließen,
vorausgesetzt, dass dieselben mit der pharmazeutischen Praxis in Übereinstimmung
stehen, d. h. Träger
und Additive, die keine permanente Schädigung für Säugetiere darstellen. Die pharmazeutischen
Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können in jeder bekannten Art
und Weise hergestellt werden, beispielsweise durch homogenes Mischen,
Beschichten und/oder Vermahlen der aktiven Inhaltsstoffe, in einem
Ein-Schritt- oder Viel-Schrittverfahren mit dem ausgewählten Trägermaterial,
und, wo geeignet, den anderen Additiven wie beispielsweise oberflächenaktiven
Mitteln, die ebenfalls durch Mikronisierung hergestellt werden können, beispielsweise
bezüglich
deren Gewinnung in Form von Mikrosphären, die üblicherweise einen Durchmesser
von ungefähr
1 bis 10 μm
aufweisen, nämlich
zur Herstellung von Mikrokapseln zur kontrollierten oder verzögerten bzw.
anhaltenden Freisetzung der aktiven Inhaltsstoffe.
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Geeignete
oberflächenaktive
Mittel, die in den pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden
Erfindung verwendet werden können,
sind nicht-ionische, kationische und/oder anionische Materialien,
die gute Emulgier-, Dispergier- und/oder Benetzungseigenschaften
aufweisen. Geeignete anionische oberflächenaktive Stoffe bzw. Tenside
schließen
sowohl wasserlösliche
Seifen als auch wasserlösliche
synthetische oberflächenaktive
Mittel ein. Geeignete Seifen sind Alkali- oder Erdalkalimetallsalze,
unsubstituierte oder substituierte Ammoniumsalze höherer Fettsäuren (C10-C22), beispielsweise
Dinatrium- oder Caliumsalze von Öl- oder
Stearinsäure,
oder von natürlichen
Fettsäuregemischen,
die aus Kokosnussöl
oder Talgöl
gewinnbar sind. Synthetische Tenside schließen Natrium- oder Calciumsalze
von Polyacrylsäuren;
Fettsäuresulfonate und
-sulfate, sulfonierte Benzimidazol-Derivate und Alkylarylsulfonate
ein. Fettsäuresulfonate
oder -sulfate liegen üblicherweise
in Form von Alkali- oder Erdalkalimetallsalzen, unsubstituierten
Ammoniumsalzen oder Ammoniumsalzen vor, die mit einem Alkyl- oder
Acylradikal mit von 8 bis 22 Kohlenstoffatomen substituiert sind, beispielsweise
dem Natrium- oder Calciumsalz von Lignosulfonsäure oder Dodecylsulfonsäure oder
einem Gemisch von Fettalkoholsulfaten, die aus natürlichen
Fettsäuren
gewonnen werden, Alkali- oder Erdalkalimetallsalzen von Schwefel
oder Sulfonsäureestern
(wie beispielsweise Natriumlaurylsulfat) und Sulfonsäuren von Fettalkohol/Ethylenoxid-Addukten.
Geeignete sulfonierte Benzimidazolderivate enthalten vorzugsweise
8 bis 22 Kohlenstoffatome. Beispiele für Alkylarylsulfonate sind Dinatrium-,
Calcium- oder Alkanolamin-Salze von Dodecylbenzolsulfonsäure oder
Dibutylnaphthalinsulfonsäure
oder ein Naphthalinsulfonsäure/Formaldehyd-Kondensationsprodukt.
Ebenfalls geeignet sind die entsprechenden Phosphate, beispielsweise
Salze eines Phosphorsäureester
und eines Adduktes von p-Nonylphenyl mit Ethylen- und/oder Propylenoxid
oder Phospholipide. Geeignete Phospholipide zu diesem Zweck sind
die natürlichen
(von tierischen oder pflanzlichen Zellen herrührenden) oder synthetischen
Phospholipide des Cephalin- oder Lecitin-Typs wie beispielsweise
Phosphatidyl-ethanolamin, Phosphatidylserin, Phosphatidylglycerin,
Lysolecithin, Cardiolipin, Dioctanylphosphatidylcholin, Dipalmitoylphosphatidylcholin
und deren Gemische.
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Geeignete
nicht-ionische oberflächenaktive
Stoffe schließen
polyethoxylierte und polypropoxylierte Derivate von Alkylphenolen,
Fettsäurealkoholen,
Fettsäuren,
aliphatische Amine oder Amide ein, die zumindest 12 Kohlenstoffatome
im Molekül
enthalten, Alkylarensulfonate und Dialkylsulfonsuccinate, wie beispielsweise
Polyglycoletherderivate, aliphatische und cycloaliphatische Alkohole,
gesättigte
und ungesättigte
Fettsäuren
und Alkylphenole, wobei diese Derivate vorzugsweise 3 bis 10 Glycolethergruppen
und 8 bis 20 Kohlenstoffatome im (aliphatischen) Kohlenwasserstoffanteil
und 6 bis 18 Kohlenstoffatome im Alkyl-Anteil des Alkylphenols enthalten.
Weitere geeignete nicht-ionische
oberflächenaktive
Stoffe sind wasserlösliche
Addukte von Polyethylenoxid mit Polypropylenglycol, Ethylendiaminopolypropylenglycol,
das 1 bis 10 Kohlenstoffatome in der Alkylkette enthält, wobei
die Addukte 20 bis 250 Ethylenglycolethergruppen und/oder 10 bis
100 Propylenethergruppen enthalten. Derartige Verbindungen enthalten üblicherweise
von 1 bis 5 Ethylenglycol-Einheiten pro Propylenglycol-Einheit.
Repräsentative
Beispiele von nicht-ionischen oberflächenaktiven Stoffen sind Nonylphenylpolyethoxyethanol,
Rhizinusölpolyglycolsäureether,
Polypropylen/Polyethylenoxid-Addukte, Tributylphenoxypolyethoxyethanol,
Polyethylenglycol und Octylphenoxypolyethoxyethanol. Fettsäureester
von Polyethylensorbitan (wie beispielsweise Polyoxyethylensorbitantrioleat),
Glycerol, Sorbitan, Saccharose und Pentaerythritol sind ebenfalls
geeignete nicht-ionische Tenside.
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Geeignete
kationische Tenside schließen
quartäre
Ammoniumsalze, bevorzugt Halogenide, mit 4 Kohlenstoffatomradikalen
ein, die wahlweise mit Halo-, Phenyl-, substituiertem Phenyl- oder Hydroxy-substituiert sind;
beispielsweise quartäre
Ammoniumsalze, die als N-Substituenten
zumindest ein C8-C22 Alkylradikal
(beispielsweise Cetyl, Lauryl, Palmityl, Myristyl, Oleyl und dergleichen)
und als weitere Substituenten, unsubstituiertes oder halogeniertes
niederes Alkyl, Benzyl und/oder Hydroxy-niedere Alkylradikale enthalten.
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Eine
ausführlichere
Beschreibung oberflächenaktiver
Stoffe, die zu diesem Zweck geeignet sind, ist beispielsweise in „McCutcheon's Detergents and
Emulsifiers Annual" (MC
Publishing Corp., Ridgewood, New Jersey, 1981), „Tensid-Taschenbuch". 2. Ausgabe (Han ser
Verlag, Wien, 1981) und „Encyclopaedia
of Surfactants" (Chemical
Publishing Co., New York, 1981) zu finden.
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Zusätzliche
Inhaltsstoffe können
enthalten sein, um die Wirkdauer des aktiven Inhaltsstoffes in der pharmazeutischen
Zusammensetzung der Erfindung zu steuern. Die Zusammensetzungen
mit kontrollierter Freisetzung können
somit durch Auswählen
geeigneter Polymerträger,
wie beispielsweise Polyester, Polyaminosäuren, Polyvinylpyrrolidon,
Ethylen-vinylacetat-Copolymere, Methylcellulose, Carboxymethylcellulose, Protaminsulfat
und dergleichen erhalten werden. Die Geschwindigkeit der Arzneistofffreisetzung
und die Wirkdauer können
ebenfalls durch Einbau des aktiven Inhaltsstoffes in Teilchen, beispielsweise
Mikrokapseln, einer Polymersubstanz, wie beispielsweise von Hydrogelen,
Polymilchsäure,
Hydroxymethylcellulose, Polymethylmethacrylat und den anderen oben
beschriebenen Polymere kontrolliert werden. Solche Verfahren schließen Colloidarzneistoff-Abgabesysteme
wie Liposomen, Microsphären,
Microemulsionen, Nanopartikel, Nanokapseln usw. ein. Abhängig vom
Verabreichungsweg kann die pharmazeutische Zusammensetzung ebenfalls Schutzumhüllungen
erfordern.
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Pharmazeutische
Formen, die zur injizierbaren Anwendung geeignet sind, schließen sterile
wässrige Lösungen oder
Dispersionen und sterile Pulver zur Zubereitung hiervon ohne großen Aufwand
ein. Typische Träger
zu diesem Zweck schließen
deswegen biokompatible wässrige
Puffer, Ethanol, Glycerol, Propylenglycol, Polyethylenglycol und
dergleichen und Gemische hiervon ein.
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Ohne
an eine Theorie gebunden sein zu wollen, wird auf Grundlage der
nachfolgenden experimentellen Beweise angenommen, dass, obwohl die
Abwesenheit beider PlGF-Allele keine nachweisbaren Gefäßdefekte
verursacht, jedoch der Plazenta-Wachstumsfaktor (PlGF) dazu erforderlich
ist, um die Wirkung von vaskulärem
Endothel-Wachstumsfaktor (VEGF) in Wachstum, Migration und Überleben
von Endothel- und glatten Muskelzellen zu vermitteln. Weiterhin
scheint die Abwesenheit von PlGF die VEGF-vermittelte Angiogenese und
Arteriogenese während
verschiedener pathologischer Prozesse in vivo signifikant zu verschlechtern.
Somit ist PlGF ein alternatives therapeutisches Mittel für VEGF,
das nur ein vaskuläres
Wachstum an angiogenen Stellen einer erhöhten VEGF-Expression stimuliert, ohne
systemische Wirkungen wie beispielsweise eine Hypotension oder ein
generalisiertes Ödem
zu verursachen.
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Die
nachfolgenden experimentellen Daten werden beweisen, dass die cerebrale
Infarktgröße, die durch
Verschluss der mittleren Hirnarterie (hierin als MCA bezeichnet)
in Mäusen
verursacht wird, durch kontinuierliche subkutane Abgabe von PlGF
(das aus verschiedenen Quellen wie beispielsweise von R&D, Abingdon, Vereinigtes
Königreich;
Pharma Biotechnologie, Hannover, Deutschland; ICN, Costa Mesa, Kalifornien; und
Geymonat SpA, Anagni, Italien bezogen werden kann), VEGF (beispielsweise
rVEGF165 kann u. a. von R&D, Abingdon, Vereinigtes
Königreich;
Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, Kalifornien; Pharma Biotechnologie,
Hannover, Deutschland; ICN, Costa Mesa, Kalifornien; Endogen, Woburn,
Massachussets; Harlan Sera Laboratories, LeicesterShire, Vereinigtes
Königreich;
Peprotech, Rocky Hill, New Jersey bezogen werden) oder vorzugsweise
beides in Kombination, über
eine osmotische Minipumpe, reduziert wird. Zusätzlich wird die Revaskularisierung
von ischämischem
Myokard nach Okklusion der linken Coronararterie (hierin nachstehend
als LCA bezeichnet) ebenfalls signifikant durch kontinuierliche
subkutane Abgabe von PlGF, VEGF (rVEGF165)
oder beidem, über
eine osmotische Minipumpe verbessert. Eine chronische Abgabe kleiner Mengen
an PlGF war zur Reduktion der Größe eines
ischämischen
Infarktes zumindest genauso wirksam wie VEGF. Darüber hinaus
war eine Co-Administration sowohl von VEGF als auch PlGF effektiver
als es für
jeden Wachstumsfaktor alleine angenommen wurde. Diese Daten zeigen,
dass VEGF, vorzugsweise PlGF oder beide in Kombination, erfolgreich
zur Behandlung und Vorbeugung von Schlaganfällen und ischämischen
Erkrankungen verwendet werden können,
insbesondere von ischämischem
Schlaganfall und akutem Myokardinfarkt, ohne dem Patienten dem Risiko
von Nebenwirkungen auszusetzen.
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Einige
der folgenden Beispiele wurden lediglich zu Referenzzwecken aufgenommen
und fallen nicht in den Umfang der Ansprüche.
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Beispiel 1 – Schutz
gegen eine cerebrale ischämische
Infarktexpansion durch chronische Verabreichung von VEGF, PlGF oder
eine Kombination von beidem
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Tierexperimente
wurden gemäß den Leitprinzipien
der American Physiological Society und dem International Committee
on Thrombosis and Haemostasis durchgeführt, wie von A. Giles in Thromb.
Haemost. (1987) 58: 1078–1084
veröffentlicht.
Eine fokale cerebrale Ischämie
wurde durch persistierende Okklusion der MCA gemäß Welsh et al. in J. Neurochem.
(1987) 49: 846–51
erzeugt. Kurz gesagt, wurden Mäuse
jeden Geschlechts, die 20 bis 30 g wogen, mit einem genetischen
Hintergrund von 50% Swiss/50% 129 durch intraperitoneale Injektion
von Ketamin (25 mg/ml, erhältlich
von Apharmo, Arnheim, Niederlande) und Xylazin (5 mg/ml, erhältlich von
Bayer, Leverkusen, Deutschland) anästhesiert. Atropin (1 mg/kg,
erhältlich
von Federa, Brüssel,
Belgien) wurde intramuskulär
verabreicht und die Körpertemperatur
wurde durch Halten der Tiere auf einem Heizkissen aufrechterhalten.
Ein „U"-förmiger Einschnitt
wurde zwischen dem linken Ohr und dem linken Auge vorgenommen. Die
oberen und hinteren Segmente des temporalen Muskels wurden durchtrennt
und der Schädel
wurde durch Retraktion des temporalen Muskels exponiert. Eine kleine Öffnung (1
bis 2 mm Durchmesser) wurde im Bereich oberhalb des MCA mit einem
von Hand betriebenen Bohrer vorgenommen, mit einer Salzlösungssuperperfusion
zur Vermeidung einer Hitzeverletzung. Die Meningen wurden mit einer Zange
entfernt und die MCA wurde durch Ligation mit 10-0 Nylonfaden (erhältlich von
Ethylon, Neuilly, Frankreich) okkludiert und distal zum Ligationspunkt
durchtrennt. Zuletzt wurden der temporale Muskel und die Haut wieder
am Ort vernäht.
Man ließ die
Tiere sich erholen und sie wurden dann in ihre Käfige zurückverbracht. Mäuse mit
Infarkt wurden mit Salzlösung
(zur Kontrolle), PlGF (715 ng/Tag), VEGF (425 ng/Tag) oder der Kombination
von beiden unter Verwendung einer osmotischen Minipumpe (Alzet type
2001, Broekman Institute, Someren, Niederlande) behandelt, die subkutan
auf dem Rücken
implantiert war, so dass die Wachstumsfaktoren kontinuierlich über eine
Zeitspanne von 7 Tagen verabreicht wurden. Nach dieser Zeitspanne
wurden die Tiere mit einer Überdosis
Nembutal (500 mg/kg, erhältlich
von Abbott Laboratories, North Chicago, Illinois) getötet, über die
linke Ventrikel mit 4% Formalin in Phosphat-gepufferter Salzlösung fixiert
und enthauptet. Das Gehirn wurde entfernt und zur Histologie wie
von P. Carmeliet et al. in Nature (1996) 380: 435–439, Nature (1996)
383: 73–75
und Nature (1998) 394: 485–490
beschrieben vorbereitet und bezüglich
Mikrotubulus-assoziiertem Protein-2 (hierin nachstehend als MAP2
bezeichnet) immungefärbt,
ein Strukturprotein, das früh während eines
irreversiblen ischämischen
Todes auftritt. MAP-2-negative Infarktgegenden im gesamten Gehirn
wurden morphometrisch in 420 μm
Distanzen unter Verwendung eines geeigneten Bildanalysesystems (Quantimed
6000, erhältlich
von Leica) quantifiziert. Das Infarktvolumen wurde als die Summe
der ungefärbten Areale
der Schnitte, multipliziert mit ihrer Dicke, definiert. Die Daten
dieser Experimente, präsentiert
in Tabelle 1 nachstehend, sind Durchschnitt ± Standardabweichung des Mittelwerts
(SEM) Werte der Infarktgröße, ausgedrückt in mm3, und wurden als Mittel zur Messung des
cerebralen Infarkts verwendet, einschließlich der Anzahl der Beobachtungen
zwischen den Klammern, und wobei ein Sternchen p = 0,001 gegenüber der
Kontrolle bedeutet. Die Signifikanz der Unterschiede wurde durch
den ungepaarten t-Test bestimmt.
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Eine
intracerebrale Blutung wurde bei keiner der Mäuse beobachtet. Zusammengenommen
weisen diese Daten darauf hin, dass VEGF und PlGF und noch mehr
ihre Kombination bei der Unterdrückung
der Infarktexpansion der Penumbra wirksam sind.
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Beispiel 2 – murines
akutes Myokardinfarkt-Modell
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Ein
Myokardinfarkt wurde durch permanente Ligation der linken Coronararterie
(LCA) ausgelöst,
wie von Lutgens et al. in Cardiovasc. Res. (1999) 41: 586–59 beschrieben.
Kurz gesagt, wurden Mäuse
durch intraperitoneale Injektion von 60 mg/kg Natriumpentobarbital
anästhesiert.
Die Tiere wurden in einer auf dem Rücken liegenden Position angeordnet,
mit einer stumpfen 21-Gauge-Nadel intubiert und mit einer Positiven-Druckrespiration
mit einem Atemvolumen von 1,0 ml bei einer Respirationsgeschwindigkeit
von 100/min unter Verwendung eines Rodent Ventilator, Modell 683
(erhältlich
von Harvard Apparatus Inc., Holliston, Massachussets) angeordnet.
Ein Querschnitt in der Haut oberhalb des dritten Intercostalraums
und eine linke Thoraktomie zwischen der dritten und vierten Rippe
wurden vorgenommen und ein 6,0-Filament wurde um die LCA ungefähr 1 mm
distal von der Spitze des linken Aurikels angebunden. Eine leichte
Drehung des Tieres zur Rechten richtete das Herz aus, um die linke
Ventrikel besser zu exponieren. Nach Verschluss der Brustkavität und Reexpansion
der Lungen unter Verwendung eines positiven Druckes bei Endexpiration
ließ man
die Infarkt-Mäuse
sich auf einem Wärmekissen
erholen.
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Eine
osmotische Minipumpe (Alzet type 2001, erhältlich von Broekman Institute,
Someren, Niederlande), die VEGF, PlGF oder beides während 7
Tagen abgibt, wurde subkutan auf dem Rücken der Mäuse sofort nach Durchführung des
Myokardinfarktes implantiert. Chirurgische Wunden heilten ohne offensichtliche
Infektion. Die perioperative Mortalität betrug 10%.
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Bei
7 Tagen nach dem chirurgischen Eingriff wurden die Infarkt-Mäuse wie
oben anästhesiert,
mit 0,9% Salzlösung
perfundiert und mit 1% Paraformaldehyd in 0,1 m Phosphat-gepufferter
Salzlösung
(pH 7,0) über die
abdominale Aorta bei physiologischem Druck Perfusions-fixiert. Vor
der Perfusionsfixierung wurde den Herzen 100 μl 0,1 M Cadmiumchlorid injiziert,
um das Herz in einem entspannten Zustand anzuhalten. Die fixierten
Herzen wurden ausgeschnitten und zur Histologie wie von Heymans
et al. in Nat. Med. (1999) beschrieben präpariert.
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6-μg-dünne Schnitte
wurden zum Hämatoxylin-Eosin-Färben verwendet.
Die Endothelzellen wurden nach Thrombomodulin (Thrombomodulin-Antikörper von
Harvard Unversity, Boston, Massachussets) gefärbt, wohingegen die glatten
Gefäßmuskelzellen
bezüglich
Glatten-Muskel-Alpha-Actin (Sigma) gefärbt wurden, wie von Heymans
et al. (oben erwähnt)
beschrieben. Die Anzahl der Gefäße pro Infarkt
wurden morphometrisch unter Verwendung eines Quantimed Q600 Bildanalysesystem
(erhältlich
von Leica, Brüssel,
Belgien) gezählt.
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Beispiel 3 – gesteigerte
Revaskularisierung von akuten Myokardinfarkten durch chronische
Verabreichung von VEGF, PlGF oder einer Kombination von beidem in
Mäusen
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Die
therapeutische Wirkung von VEGF und PlGF wurde durch Abgabe dieser
Wachstumsfaktoren kontinuierlich über 7 Tage durch das in Beispiel
2 beschriebene Verfahren getestet. Die Ergebnisse dieser Tests sind
in den Tabellen 2 und 3 unten dargestellt, wobei:
- – Tabelle
2 die Anzahl von Gefäßen (Durchschnittswert
+ SEM-Werte) bereitstellt, identifiziert durch Thrombomodulin-Färbung von
Endothelzellen als Maß der
Angiogenese, während
des gesamten Infarkts in den Gruppen von jeweils 8 bis 10 Mäusen. Ein
Sternchen bedeutet p < 0,05
gegenüber
der Kontrolle.
- – Tabelle
3 stellt die Anzahl der Gefäße (Durchschnitt
+ SEM-Werte) bereit, identifiziert durch Glattes-Muskel-Alpha-Actin-Färben von
Endothelzellen als Maß der
Arteriogenese, während
des gesamten Infarkts in den Gruppen von jeweils 8 bis 10 Mäusen. Ein
Sternchen bedeutet p < 0,05
gegenüber
der Kontrolle.
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Sie
zeigen, dass die Behandlung von Infarktmäusen mit 715 ng/Tag PlGF-Dimer
die Bildung von neuen Endothel-ausgekleideten Gefäßen (Angiogenese)
stimulierte und die Reifung dieser Coronargefäße durch Bedeckung mit glatten
Gefäßmuskelzellen
(Arteriogenese) mit ischämischen
Myokard, das in allen Typen von Gefäßen besser war als die Behandlung
von Infarkt-Mäusen
mit 430 ng/Tag VEGF-Dimer. Eine höhere Dosis (3,5 μg/Tag) von
PlGF-Dimer verbesserte
die Infarkt-Angiogenese und Arteriogenese ebenfalls.
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Beispiel 4 – erhöhte Revaskularisierung
von akuten Myokardinfarkten durch chronische Verabreichung von VEGF,
PlGF oder einer Kombination von beidem in Urokinase-Typ Plasminogen
Aktivator defizienten Mäusen
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Ein
Synergismus zwischen PlGF und VEGF beim Stimulieren der Angiogenese
und Arteriogenese in ischämischem
Myokard wurde bei Infarkt-Mäusen
getestet, denen der Urokinase-Typ Plasminogen Aktivator (u-PA–/–)
fehlte, weil diese Mäuse
gegenüber
einer therapeutischen Angiogenese durch VEGF alleine resistent sind.
Eine Behandlung von u-PA–/– -Mäusen mit einer Kombination
von VEGF (450 ng/Tag) und PlGF (3,5 μg/Tag) war effektiver als VEGF
(450 ng/Tag) oder PlGF (3,5 μg/Tag)
alleine beim Verbessern der Myokard-Angiogenese und -Arteriogenese,
wie es in Tabellen 4 und 5 dargestellt ist, wobei Ergebnisse in
derselben Weise wie in den Tabellen 2 bzw. 3 bereitgestellt wurden.
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Beispiel 5 – Nebenwirkungen
von PlGF- gegen VEGF-Verabreichung
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Der
durchschnittliche arterielle Blutdruck (MAP), gemessen durch hoch-genaue
Druckmikromanometer (Millar Instruments, Houston, Texas) war 93 ± 5 mm
Hg bei Kontrollmäusen.
Eine intravenöse
Bolus-Injektion von 3 μg
aktivem VEGF-Dimer verursachte eine signifikante Hypotension (68 ± 3 mm
Hg; p < 0,05).
Die Bolus-Verabreichung
von 5 μg
aktivem PlGF-Dimer reduzierte den arteriellen Blutdruck (91 ± 11 mm
Hg) nicht. Diese Daten zeigen, dass nach akuter Verabreichung von
3-μg-Mengen
PlGF keine systemischen hämodynamischen
Nebenwirkungen aufweist, wohingegen VEGF den Blutdruck absenkt.
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Beispiel 6 – Verwendung
von PlGF-VEGF-Heterodimeren
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VEGF
und PlGF müssen
als Dimere an ihre verwandten Rezeptoren binden. Die Aktivität von VEGF/VEGF-Homodimeren
und PlGF/PlGF-Homodimeren ist oben beschrieben. Jedoch können VEGF
und PlGF ebenfalls Heterodimere formen und wurden in vivo dokumentiert
(Cao, Y., Linden, P., Shima, D., Browne, F. & Folkman, J., In vivo angiogenic
activity and hypoxia induction of heterodimers of Plazenta growth
factor/vascular endothelial growth factor. J. Clin. Invest. 98,
2507–11,
1996; DiSalvo, J. et al., Purification and characterization of a
naturally occurring vascular endothelial growth factor. Plazenta
growth factor heterodimer. J. Bial. Chem. 270, 7717–23, 1995).
Ihre Rolle in der Angiogenese und Arteriogenese in vivo bleibt.
kontrovers und es ist keine Information verfügbar, ob VEGF/PlGF-Heterodimere
für therapeutische
Anwendungen verwendet werden können.
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Unter
Verwendung desselben Modells einer Infarktrevaskularisierung wie
es in Tabelle 2 und Tabelle 3 von Beispiel 3 beispielhaft aufgeführt ist,
wurde das VEGF/PlGF-Heterodimer (von R&D, Abbingdon, Vereinigtes Königreich) über osmotische
Minipumpen für
eine Woche in einer Dosis von 10 μg
VEGF/PlGF-Heterodimer in Wildtyp-Mäusen verabreicht. Die experimentellen
Daten sind in den Tabelle 6 und 7 als Gefäße/mm2 anstelle
von Gefäßen/Infarkt
dargestellt. Jedoch können
die Tabellen qualitativ in derselben Weise wie die vorherigen Tabellen
interpretiert werden.
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Tabelle
6 Mit
Endothel ausgekleidete Gefäße (Angiogenese)
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Tabelle
7 Mit
glatten Muskelzellen ausgekleidete Gefäße (Arteriogenese)
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Alle
Werte sind statistisch signifikant (p < 0,05; Behandlung gegen Kontrolle).