DE60118359T2

DE60118359T2 - Humanische pellino-polypeptide

Info

Publication number: DE60118359T2
Application number: DE60118359T
Authority: DE
Inventors: A. Timothy Bainbridge Island BIRD; J. David Bainbridge Island COSMAN
Original assignee: Immunex Corp
Current assignee: Immunex Corp
Priority date: 2000-04-28
Filing date: 2001-04-27
Publication date: 2006-12-07
Anticipated expiration: 2021-04-28
Also published as: US6703487B2; WO2001083739A3; EP1290160B1; WO2001083739A2; ATE321853T1; US20020168683A1; US20070264711A1; EP1290160A2; AU2001259217A1; DE60118359D1; US7169891B2; US20040034199A1; ES2261412T3; CY1105555T1; PT1290160E; DK1290160T3

Description

Diese Anmeldung beansprucht die Begünstigung unter U.S.C. 119(e) für die vorläufige Anmeldung mit der Serien Nummer 60/200,198, eingereicht am 28. April 2000.
GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung ist auf Moleküle gerichtet, die Mitglieder einer Polypeptidfamilie sind, welche als Pellino bezeichnet oder auch Conserved Inflammatory Signal Target (CIST) genannt wird. Genauer gesagt schließt die vorliegende Erfindung Pellinopolypeptide sowie Fragmente davon, die Nukleinsäuren, welche für diese Polypeptide und deren Fragmente kodieren; Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Formen dieser Polypeptide, Antikörper gegen diese Polypeptide, transgene oder Knock-out-Zellen und -Tiere sowie deren Verwendungen ein.
STAND DER TECHNIK
Die Interleukin-1 (IL-1) Wirkungskaskade (pathway) ist eine zelluläre, signalgebende Wirkungskaskade, die eine entscheidende Rolle bei der Immunantwort von Säugern auf Entzündungen in Säugetieren spielt. Mehrere verschiedene Rezeptoren und Liganden sind in diese Wirkungskaskade involviert, einschließlich der Liganden IL-1-alpha, IL-1-beta und IL-1-Rezeptorantagonist (IL-Ira) und von zwei IL-1-Rezeptoren, die als IL-1-Rezeptoren vom Typ I (IL-1RI) und IL-1-Rezeptoren vom Typ Π (IL-1RII) bezeichnet werden; es existiert auch eine lösliche Form des letzteren. Es sieht so aus, als ob IL-1RI der signalgebende Rezeptor ist, während IL-1RII kein Signal in eine Zelle transduziert, sondern stattdessen in die Regulation einer durch IL-1 vermittelten Immunantwort involviert sein kann (Colotta et al., Immunol. Today 15:562, 1995). Die Signalgebung über die IL-1-Wirkungskaskade ist komplex und erfordert zusätzlich zu IL-1RI eine Anzahl von Helfermolekülen, einschließlich einer Rezeptor-assoziierten Kinase (IRAK). Eine Serin/Threonin-Kinase mit Homologie zu IRAK, die als Pelle bezeichnet wird, ist in Drosophila gefunden worden (siehe Belvin und Armstrong, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12:393, 1996). Von einem anderen Protein der Drosophila, Pellino, ist berichtet worden, dass es mit Pelle in Wechselwirkung steht (Grosshans et al., Mech. Dev. 81:127, 1999).
Die dorsal-ventrale Polarisation in Embryonen von Drosophila hängt davon ab, dass ein Gradient der nuklearen Lokalisation des Rel-artigen Transkriptionsfaktors Dorsal aufgebaut wird. Das Transkriptionsprogramm, das durch Dorsal vermittelt wird, resultiert aus einer Signalkaskade, die durch die Bindung eines extrazellulären Liganden Spaetzle an seinen Rezeptor Toll ausgelöst wird. Zu den Zwischengliedern dieser Signalkaskade gehören das Adaptorprotein Tube, die Serin/Threonin-Kinase Pelle sowie Cactus, ein cytolytischer Bindungspartner von Dorsal. Durch Toll übermittelte Signale führen zu einem Abbau von Cactus und erlauben dadurch den nuklearen Import von Dorsal. Die Ähnlichkeit zwischen den cytosolischen Domänen von Toll und dem Interleukin-1 Rezeptor Il-1RI ist zuerst von Gay und Keith (Gay, N. und Keith, F., 1991, Nature 351:355-356) beobachtet worden, und die Zahl der Proteine, die die homologen, Toll/IL-IR (TIR) Domänen genannten Regionen enthalten, ist danach gewachsen und schließt heute eine größere Familie von Rezeptoren und intrazellulären signalgebenden Molekülen aus einer Vielzahl von Organismen ein. Diejenigen Rezeptoren oder Moleküle, die in ihren extrazellulären Domänen Leucin-reiche sich wiederholende Segmente enthalten, haben weitgehend mit angeborenen Immunantworten zu tun und schließen mindestens zehn Toll-artige Rezeptoren (TLRs) von Säugern ein, die entzündliche Reaktionen auf mikrobielle Pathogene initiieren, wie z.B. auf Peptidoglykan, bakterielle Lipopeptide, bakterielle Lipopolysaccharide, Zymosan, CpG-DNA, Flagellin, Lipoteichonsäuren und respiratorische, syncytiale Virusproteine; sowie auf Pflanzenproteine, wie z.B. das Produkt des N-Resistenzgens, das Widerstandsfähigkeit gegen Krankheiten vermittelt. Weiterhin ist jetzt klar, dass eine wichtige Funktion der Signalgebung durch Toll in erwachsenen Drosophila darin besteht, dass die Immunantwort auf Pilzinfektionen kontrolliert wird.
Komponenten im weiteren Verlauf der Toll Signalkaskade sind ebenfalls in TLR und Interleukin-1 Rezeptor-Signalkaskaden von Säugern, die in einer nuklearen Translokation des Transkriptionsfaktors Nuclear Factor kappa B (NF-kB) kulminieren, evolutionär konserviert. Die Proteinkinasen IRAK-1 und IRAK-2, enge Homologe von Pelle, werden durch das Adaptorprotein MyD88 zu den aktivierten IL-1R oder TLR Rezeptorkomplexen herbei gerufen und unterliegen einer Autophosphorylierung. Obwohl MyD88 im strengen Sinne kein Analogon von Tube ist, enthalten beide Proteine eine so genannte tote Domäne, und Tube dient wahrscheinlich dazu, die Signaltransmission zwischen Toll und Pelle, woran Tube bindet, zu vermitteln. IRAK tritt danach in Wechselwirkung mit einem anderen Adaptormolekül, TRAF-6, das eine Homologes zu dem kürzlich beschriebenen D-TRAF ist. Signale unterhalb von TRAF scheinen divergent zu sein, und nicht alle von ihnen sind vollständig verstanden. Eine Konsequenz in Säugerzellen ist jedoch die Aktivierung des IkB Kinase (IKK) Komplexes, der das inhibierende Cactus-Homologe IkB an zwei N-terminalen Serinbausteinen direkt phosphoryliert und dadurch seine weite Verbreitung (ubiquitination) und seinen Abbau verursacht. Wenn NF-kB aus seiner cytoplasmatischen Assoziation mit IkB freigesetzt wird, wandert NF-kB in den Kern. Kürzlich wurde ein Kandidat für ein weiteres Zwischenglied bei der Wechselwirkung von Tube und Pelle durch Hefe-Zweihybrid-Screening mit Pelle als „bait sequence" gefunden. Es wurde gezeigt, dass dieses Protein, Pellino genannt, mit katalytisch kompetentem Pelle in Wechselwirkung tritt, aber nicht mit einer mutierten Form von Pelle, der die Kinaseaktivität fehlte. Wenn es auch nicht Ziel der Studie war, die Funktion von Pellino zu klären, so wurde doch spekuliert, dass Pellino entweder die aktivierte Form von Pelle stabilisiert oder eine Wechselwirkung mit nachfolgenden Pellesubstraten vermittelt.
Es wurde berichtet, dass vermutlich Homologe von Drosophila-Pellino in C.elegans (Rioch et al., Trends in Genetics, 16(7):292-294, 2000) und in Menschen (Rich et al., Immunogenetics 52:145.149, 2000) extistieren. Ein zweites homologes Gen, Pellino-2, wurde in Menschen und Mäusen gefunden (Resch et al., Cytogenetics and Cell Genetics 92(1-2):172-174, 2001). In derselben Publikation wurde eine Fußnote eingefügt, die auf Anzeichen für die Existenz eines dritten, humanen Pellino-Gens hinweist, das Pellino-3 genannt wird. Kennedy et al. (FASEB J. 15(7):A209, 2001 berichteten, dass Pellino-1, dort als PRISM bezeichnet, die NF-kB-Aktivierung stimuliert und dass eine dominante negative Pellino-1-Mutante die Toll- und die IL-1-Stimulierung von NF-kB blockiert.
IL-1 und andere entzündungsfördernde Cytokine sind an einer Vielzahl von Krankheiten und Zustanden beteiligt, einschließlich rheumatoider Arthritis, multiplen Myelomen, Osteoporose, Endotoximie und Sepsis, Osteoarthritis, entzündlicher Darmkrankheiten und Allergie. Es ist gezeigt worden, dass die Inhibierung der Signalfunktion von IL-1 mittels löslicher Formen von IL-1Rs und durch IL-Ira nützlich für die Behandlung oder Linderung von Krankheiten ist, die durch ein Übermaß von IL-1 gekennzeichnet sind (Rosenwasser, J. Allerg. Clin. Immunol. 102:344, 1998). Andere Teile der IL-1-Signalkaskade und andere, entzündungsfördernde, durch MAP Kinase aktivierte Kaskaden sind ebenfalls das Ziel von Versuchen gewesen, weitere Moleküle zu identifizieren, die therapeutisch eingesetzt werden können, um bei Zuständen zu intervenieren, die allgemein mit IL-1 und entzündungsfördernden Zytokinen zusammenhängen. Es besteht somit in der Medizin ein Bedürfnis, neue Moleküle zu identifizieren, die an den durch IL-1 und MAP Kinase aktivierten entzündungsfördernden Signalkaskaden beteiligt sind, sowohl als Stoffe, mit deren Hilfe die Signalwege in der Zelle untersucht werden können, als auch zur Verwendung bei der Identifizierung von Inhibitoren für die entzündungsfördernde Signalwirkung. Von besonderem Interesse sind neue Polypeptide, die an der Stimulierung von mehreren entzündungsfördernden Signalkaskaden beteiligt sind, weil die Inhibierung dieser Polypeptide entzündliche Effekte wirksamer inhibieren würde als die Inhibierung eines Kaskade-spezifischen Polypeptids.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Der vorliegenden Erfindung liegt die Entdeckung neuer muriner und humaner Pellinopolypeptide, des murinen Pellino-1 und -2 sowie des humanen Pellino-1, -2 und -3 zugrunde.
Die Erfindung stellt im einzelnen ein isoliertes Polypeptid zur Verfügung, das NF-kB-abhängige oder p38-abhängige Transkription zu inhibieren vermag, wobei das Polypeptid ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:

(a) einer Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:8 und SEQ ID NO:12, wobei die Aminosäuren 1 bis x1 aus der Sequenz beseitigt wurden und wobei x1 eine der Aminosäuren in Position 50 bis 98 der besagten Sequenz ist;
(b) SEQ ID NO:4, wobei die Aminosäuren x1 bis x2 aus besagter Sequenz beseitigt wurden und wobei x1 eine der Aminosäuren in Position 99 bis 178 und x2 eine der Aminosäuren in Position 100 bis 179 ist;
(c) SEQ ID NO:8, wobei die Aminosäuren x1 bis x2 aus besagter Sequenz beseitigt wurden und x1 eine der Aminosäuren in Position 1 bis 180 ist und x2 eine der Aminosäuren in Position 2 bis 181 ist;
(d) SEQ ID NO:12, wobei die Aminosäuren x1 bis x2 aus der Sequenz beseitigt wurden und x1 eine der Aminosäuren in Position 1 bis 206 ist und x2 eine der Aminosäuren in Position 2 bis 207 ist;
(e) einer Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:8 und SEQ ID NO:12, wobei ein oder mehrere Cysteinreste in der RING-Finger-ähnlichen Domäne beseitigt oder durch Nicht-Cysteinreste ersetzt wurden;
(f) einer allelischen Variante der Sequenzen (a) bis (e);
(g) Fragmenten der Aminosäuresequenzen gemäß einer der Sequenzen (a) bis (d) und (f), die Aminosäuresequenzen der RING-Finger-ähnlichen Domäne umfassen; und
(h) einem Fragment der Aminosäuresequenzen gemäß einer der Sequenzen (a) bis (g), wobei ein Polypeptid, welches aus besagtem Fragment besteht, in der Lage ist, die NF-kB-abhängige Transkription zu inhibieren.

Die Erfindung stellt auch eine isolierte genomische Nukleinsäure zur Verfügung, die den Nukleinsäuren nach der Erfindung entspricht.
Weiterhin werden durch die Erfindung Expressionsvektoren und rekombinante Wirtszellen zur Verfügung gestellt, die mindestens eine Nukleinsäure nach der Erfindung umfassen, sowie bevorzugte rekombinante Wirtszellen, bei denen die besagte Nukleinsäure in das Genom der Wirtszelle integriert ist.
Ebenfalls wird ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids zur Verfügung gestellt, welches durch eine Nukleinsäure nach der Erfindung kodiert wird, wobei das Verfahren umfasst das Kultivieren einer rekombinanten Wirtszelle unter Bedingungen, die die Expression des besagten Polypeptids fördern, wobei die rekombinante Wirtszelle mindestens eine Nukleinsäure nach der Erfindung umfasst. Ein bevorzugtes Verfahren nach der Erfindung umfasst außerdem die Reinigung des besagten Polypeptids. Nach einem anderen Aspekt der Erfindung wird das nach diesem Verfahren hergestellte Polypeptid zur Verfügung gestellt.
Nach einem anderen Aspekt der Erfindung werden Methoden zur Identifizierung von Stoffen zur Verfügung gestellt, die die Aktivität (oder eine dominant-negative Aktivität) von Pellinopolypeptiden verändern, wobei man

(a) eine Testverbindung mit einem Polypeptid nach der Erfindung mischt; und
(b) bestimmt, ob die Testverbindung die Aktivität des Pellinopolypeptids (oder die dominantnegative Pellinoaktivität) verändert.

Nach einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen zur Verfügung gestellt, die die Bindungsaktivität von Pellinopolypeptiden inhibieren, wobei das Verfahren die Schritte umfasst, in denen man

(a) eine Testverbindung mit einem Polypeptid nach der Erfindung und einem Bindungspartner dieses Polypeptids mischt; und
(b) bestimmt, ob die Testverbindung die Bindungsaktivität des Polypeptids inhibiert. Bei bevorzugten Ausführungsformen ist der Bindungspartner ein Molekül aus der intrazellulären Signalkaskade; besonders bevorzugte Bindungspartner werden ausgewählt aus der Gruppe, die aus TRAF2, TRAF6, IRAK, TRAF1 und den TRAFs 3, 4 und 5 besteht.

Weiterhin wird durch die Erfindung eine in vitro-Methode zur Inhibierung der NF-kB-abhängigen Transkription zur Verfügung gestellt, bei der man mindestens ein Polypeptid nach der Erfindung einsetzt.
Ebenfalls wird durch die Erfindung ein in vitro-Verfahren zur Inhibierung von durch IL-1 vermittelter p38-Kinase-Signalgebung zur Verfügung gestellt, wobei das Verfahren die Bereitstellung mindestens eines Antagonisten eines Polypeptids nach der Erfindung umfasst, wobei der Antagonist ein Antikörper ist, der die Aktivität des Polypeptids inhibiert.
Ein anderer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung der Polypeptide nach der Erfindung als Arzneimittel.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung stellt die Verwendung der „dominant-negativen" Pellinopolypeptide nach der Erfindung für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines entzündlichen Zustands dar; wobei bei einer bevorzugten Ausführungsform der entzündliche Zustand ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Asthma, rheumatoider Arthritis, entzündlicher Darmkrankheit, Morbus Crohn, ulcerativer Colitis, Atherosklerose und Alzheimer Krankheit besteht.
Weiterhin gehören zum Bereich der vorliegenden Erfindung Fusionsproteine, die jedes der zuvor erwähnten Polypeptide und ein Polypeptid umfassen können, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer Immunoglobulin-Fc-Domäne, einem FLAG-Peptid, einem Peptid mit mindestens etwa sechs His-Bausteinen, einem Leucin-Zipper, einem GFP-Peptid, einem PkA-Peptid, einem birA-Peptid und einem GST-Peptid. Nukleinsäuremoleküle, die für diese Fusionsproteine kodieren, sind ebenfalls in die vorliegende Erfindung einbezogen, ebenso wie rekombinante Expressionsvektoren, die eine der zuvor erwähnten DNAs enthalten, Wirtszellen, die mit diesen Expressionsvektoren transformiert oder transfiziert sind, und Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden, in denen man diese Wirtszellen unter Bedingungen kultiviert, die die Expression fördern, und die Polypeptide isoliert. Die Erfindung stellt weiterhin transgene oder knock-out-Tiere zur Verfügung, die unter Verwendung der DNAs nach der Erfindung erzeugt wurden. Die Erfindung stellt auch Antikörper zur Verfügung, die Polypeptide nach der Erfindung spezifisch binden, einschließlich von monoklonalen Antikörpern und humanen Antikörpern. Schließlich werden Assays zur Identifizierung von kleinen Molekülen zur Verfügung gestellt, die die IL-1-Signalgebung regulieren, wobei ein Peptid nach der Erfindung verwendet wird.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Wir haben murine und humane Pellino-1 und -2 sowie humanes Pellino-3 identifiziert, neue Pellinopolypeptide mit strukturellen Merkmalen, die für die Pellinofamilie charakteristisch sind. Durch Expression einer dieser in Säugern vorkommenden Pellino-Isoformen, nämlich von murinem Pellino-1, in COS-Zellen zeigen wir, dass verschiedene NF-kB induzierende Stoffe spezifisch bewirken, dass Pellino-1 proteolytisch in eine unlösliche Form umgewandelt wird. Weiterhin zeigen wir, dass die Expression von Pellinopolypeptiden, wie z.B. Pellino-1 und Pellino-2, NF-kB-abhängige Reportergene stark aktiviert und die Jub N-terminale Kinase-, p38-Kinase- sowie die durch 1L-1 vermittelte ERK-Signalgebung vermehrt bzw. verstärkt und dass mutierte Formen von Pellino, denen konservierte Motive fehlen, eine basale und Zytokin-induzierte NF-kB-Aktivierung ebenso wie die von p38 abhängige Transkription unterdrücken. Die Moleküle nach dieser Erfindung sind nützlich für, oder führen zu, Therapien gegen entzündliche Prozesse. Die Entdeckung der Polynukleotide nach der Erfindung ermöglicht die Konstruktion von Expressionsvektoren, die DNA enthalten, welche für Polypeptide kodiert; von Wirtszellen, die mit den Expressionsvektoren transformiert oder transfiziert sind, die Entwicklung von transgenen oder knock-out Zellen oder -Tieren; die Gewinnung von isolierten und gereinigten Polypeptiden sowie Fragmenten davon; die Verwendung der entsprechenden Polynukleotide als Sonden oder Primer, um für Proteine mit Pellino-Aktivität kodierende DNA zu identifizieren; Die Verwendung von einsträngigen, von den Nukleinsäuren abgeleiteten Sinn- oder Antisinn-Oligonukleotiden, um die Expression und/oder Funktion von Polynukleotiden zu inhibieren, die durch die Pellinogene kodiert werden; die Verwendung solcher Polynukleotide oder Polypeptide zur Identifizierung kleiner molekularer Inhibitoren der Proteinassoziation oder -funktion von Pellino; Die Verwendung solcher Polynukleotide oder Polypeptide zur Identifizierung anderer Moleküle, die bei der IL-1-Signalgebung beteiligt sind; die Verwendung solcher Polypeptide und deren Fragmente zur Herstellung von Antikörpern; und die Verwendung solcher Antikörper zur Reinigung der Pellinopolypeptide.
Die Aminosäuresequenzen von murinem und humanem Pellino-1, murinem und humanem Pellino-2 sowie humanem Pellino-3 Polypeptid sind in SEQ ID NOs:2, 4, 6, 8 bzw. 12 wiedergegeben, und ein Vergleich, der die Ähnlichkeiten in den Sequenzen zwischen murinem und humanem Pellino-1 und -2, humanem Pellino-3 und anderen Pellinopolypeptiden zeigt, ist in Tabelle 1 im nachfolgenden Beispiel 1 dargestellt. Die Pellinopolypeptid-Familie ist bemerkenswert gut konserviert, wobei die humanen Familienmitglieder einander sehr ähnlich sind und homologen Mitgliedern der Pellinofamilie von anderen Spezies, wie z.B. Mus musculus, extrem ähnlich sind.
Zu den typischen strukturellen Elementen, die die Mitglieder der Pellinopolypeptid-Familie teilen, zählen eine besonders gut konservierte zentrale Domäne, die sich von der Aminosäure 132 bis einschließlich zur Aminosäure 193 in Pellino-1 erstreckt (SEQ ID NOs: 2 und 4; die Aminosäuren 134 bis einschließlich 195 in SEQ ID NO:8 und den Aminosäuren 158 bis einschließlich 219 in SEQ ID NO:12 entsprechen); ein absolut konserviertes Motiv von dem Baustein 245 bis zum Baustein 254 der SEQ ID NOs:2 und 4 (den Aminosäuren 247 bis einschließlich 256 in SEQ ID NO:8 und den Aminosäuren 271 bis einschließlich 280 in SEQ ID NO:12 entsprechend); und eine Domäne („die RING-Finger-artige Domäne"), die der C3HC4 RING-Finger Unterfamilie von Zink-Finger Domänen ähnlich ist, von der Aminosäure 333 bis einschließlich zur Aminosäure 398 der SEQ ID NOs:2 und 4 (den Aminosäuren 335 bis einschließlich 400 in SEQ ID NO:8 und den Aminosäuren 360 bis einschließlich 425 in SEQ ID NO:12 entsprechend). Es gibt innerhalb der RING-Finger-artigen Domäne bestimmte Cysteinbausteine mit Schlüsselfunktion, sodass Substitutionen dieser Bausteine wahrscheinlich zu einer veränderten Funktion oder zu einem Ausfall von Funktionen der betreffenden Pellinopolypeptide führen werden. Die konservierten Cycsteinbausteine innerhalb der Pellinopolypeptide befinden sich an den Positionen 333, 336, 367, 371, 395 und 398 der SEQ ID NOs:2 und 4 (und an den Positionen 335, 338, 369, 373, 397 und 400 von SEQ ID NO:8 sowie an den entsprechenden Positionen von SQ ID NO:6; und an den Positionen 360, 363, 394, 398, 422 und 425 von SEQ ID NO:12). Der Fachmann wird erkennen, dass die zuvor beschriebenen Grenzen der Regionen von murinem und humanem Pellino-1 und -2 und von humanen Pellino-3- Polypeptiden ungefähre Grenzen sind und dass die genauen Grenzen dieser Domänen zwischen den einzelnen Mitgliedern der Pellinopolypeptid-Familie auch von Mitglied zu Mitglied differieren können. Es geht jedoch aus den obigen Erläuterungen und aus Tabelle 1 klar hervor, dass alle murinen und humanen Pellino-1- und -2 sowie alle humanen Pellino-3-Polypeptide eine Gesamtstruktur aufweisen, die untereinander und mit der Struktur anderer Pellinopolypeptide konsistent ist.
Zu den biologischen Aktivitäten, die mit murinem und humanem Pellino-1 und -2 sowie mit humanen Pellino-3-Polypeptiden verbunden sind, gehören die Stimulierung von MAP Kinase-aktivierten Signaltransduktionen, wie z.B. die proinflammatorischen Signaltransduktionen und insbesondere die Stimulierung der Transkription von „Downstreampromotoren", wie z.B. von NF-kB- und p38-abhängigen Promotoren. Dass murines und humanes Pellino-1 und -2 sowie humane Pellino-3-Polypeptide MAP Kinase-aktivierte Signaltransduktionen zu aktivieren vermögen, hängt mit vielen Domänen der Pellinopolypeptide zusammen (wie z.B. mit der N-terminalen Domäne, der zentral konservierten Domäne, der RING-Finger-artigen Domäne und der C-terminalen Domäne) oder mit den Polypeptiden insgesamt zusammen, weil gezeigt worden ist, dass Deletionen von N- oder C-terminalen Domänen und bestimmte Modifikationen von Schlüsselbausteinen in Pellino-1 entweder die stimulierende Aktivität aufheben oder „dominant-negative" Pellino-1-Mutanten ergeben, die die MAP Kinase-aktivierten Signaltransduktionen inhibieren. Dass und in welchem Maße murines und humanes Pellino-1 oder -2 sowie humane Pellino-3-Polypeptide MAP Kinase-aktivierte Signaltransduktionen zu stimulieren vermögen, kann z.B. in einem Assay bestimmt werden, der die Transkription von Reportergenen, wie z.B. der für Luciferase kodierenden Sequenz oder der für Chloramphenicolacetyltransferase (CAT) kodierenden Sequenz, von Downstreampromotoren, wie z.B. der NF-kB-abhängige IL-8-Promotor oder der p38-abhängige CHOP-Promotor, misst. Pellinopolypeptide, die die MAP Kinase-abhängige Signaltransduktion stimulieren, zeigen mindestens 10% (vorteilhaft mindestens 25% und insbesonder mindestens 50%) dieser stimulierenden Aktivität, verglichen mit derjenigen von murinem Pellino-1, gemessen mit den NF-kB-abhängigen IL-8-Promotor-Luciferasereportergen-Assays des Beispiels 2.
Marines und humanes Pellino-1 und -2 sowie humane Pellino-3-Polypeptide sind auch Substrate für Proteasen, wie z.B. Chymotrypsin-artige Serinproteasen, und zeigen eine Veränderung in der Löslichkeit als Antwort auf die Stimulierung von Zellen durch stimulierende Moleküle, wie z.B. TNF-alpha und PMA. Die Proteasesubstrataktivität hängt mit der zentralen Domäne von murinem und humanem Pellino-1 und -2 sowie humanen Pellino-3-Polypeptiden zusammen. Diese zentrale Domäne umfasst die Bausteine 154 und 165 von SEQ ID NO:2 (oder die entsprechenden Bausteine von anderen Pellinopolypeptiden). Es ist gezeigt worden, dass Substitutionen dieser Bausteine die Spaltung von Pellino-1 reduziert. Daher zählen für Verwendungen, welche Pellino-Proteasesubstrataktivität erfordern, zu den bevorzugten murinen und humanen Pellino-1 oder -2 und humanen Pellino-3-Polypeptiden diejenigen, die die Bausteine 154 und 165 von SEQ ID NO:2 (oder die entsprechenden Bausteine von anderen Pellinopolypeptiden) enthalten oder die konservierte Zentraldomäne besitzen, und die eine proteolytische Spaltung als Antwort auf eine geeignete Zellstimulierung, wie z.B. eine Behandlung mit TNF-alpha oder PMA, zeigen. Zu den bevorzugten murinen und humanen Pellino-1- und -2- sowie humanen Pellino-3-Polypeptiden zählen weiterhin Oligomere oder Fusionsproteine, die zumindest eine konservierte Zentraldomäne von einem oder mehreren murinen oder humanen Pellino-1- oder -2 oder humanen Pellino-3-Polypetiden oder Fragmente dieser Polypeptide enthalten, die eine proteolytische Spaltung als Antwort auf eine geeignete Zellstimulierung, z.B. durch Behandlung mit TNF-alpha oder PMA, zeigen. Die Proteasesubstrataktivität von murinem und humanem Pellino-1 und -2 sowie von humanen Pellino-3-Polypeptiden kann z.B. in einem Assay bestimmt werden, in dem das Ausmaß der Spaltung der Pellinopolypeptide gemessen wird, wie in den folgenden Beispielen 3 und 4 beschrieben ist. Pellinopolypeptide mit Proteasesubstrataktivität haben vorteilhaft mindestens 10% (vorteilhafter mindestens 25% und besonders vorteilhaft mindestens 50%) der Proteasesubstrataktivität von murinem Pellino-1-FLAG, gemessen in den Assays der Beispiele 3 und 4.
Zu den biologischen Aktivitäten oder Funktionen, die mit bestimmten Mutanten oder veränderten Formen von murinem oder humanem Pellino-1 oder -2 und humanen Pellino-3-Polypeptiden verbunden sind, zählen die Inhibierung von MAP Kinase-aktivierten Signal-transduktionen, wie z.B. die proinflammatorische Signaltransduktion, und insbesondere die Inhibierung der Transkription von Downstreampromotoren, wie z.B. NF-kB- und p38-abhängige Promotoren. Dass diese mutierten murinen und humanen Pellino-1 und -2-Polypeptide und humanen Pellino-3-Polypeptide die MAP Kinaseaktivierte Signaltransduktion zu inhibieren vermögen, hängt mit Änderungen in bestimmten Domänen der Pellinopolypeptide zusammen, wie z.B. in der N-terminalen Region, der zentralen konservierten Domäne und der RING-Finger-artige Domäne, weil gezeigt worden ist, dass Deletionen der N-terminalen Aminosäuren 50 oder 99 und bestimmte Modifikationen in der zentralen konservierten Domäne und der RING-Fingerdomäne in murinem Pellino-1 zu „dominant negativen" Pellino-1-Mutanten führen, die MAP Kinase-aktivierte Signaltransduktionen inhibieren (siehe das folgende Beispiel 2). Dass, und in welchem Maße murine und humane Pellino-1 und -2 Polypeptide sowie humane Pellino-3-Polypeptide die MAP Kinase-aktivierte Signaltransduktion inhibieren, kann z.B. in einem Assay bestimmt werden, in dem die Transkription von Reportergenen gemessen wird, z.B. der für Luciferase kodierenden Sequenz oder der für Chloramphenicolacetyltransferase (CAT) kodierenden Sequenz, oder der Sequenz von Downstreampromotoren, wie z.B. der NF-kB-abhängige IL-8-Promotor oder der p38-abhängige CHOP-Promotor. Pellinopolypeptide, die MAP Kinase-aktivierte Transduktionswege inhibieren, haben vorteilhaft mindestens 10% (vorteilhafter mindestens 25% und besonders vorteilhaft mindestens 50%) dieser inhibierenden Aktivität im Vergleich mit derjenigen der murinen Pellino-1-FLAG „d133-156-FLAG" Mutante, gemessen mit den NF-kB-abhängigen IL-8-Promotor-Luciferasereportergen-Assay des Beispiels 2.
Die Bezeichnung „Pellinopolypeptidaktivität", wie sie hierin gebraucht wird, schließt eine oder mehrere der folgenden Aktivitäten ein: Stimulierung der MAP Kinase-aktivierten Signaltransduktionen, Proteasesubstrat-Aktivität und Defensivaktivität von Wirtsorganismen gegen Pathogene, ebenso wie die ex vivo und in vivo-Aktivitäten von natürlichen Pellinopolypeptiden. Die Bezeichnung „dominant-negative Aktivität eines Pellinopolypeptids", wie sie hierin gebraucht wird, schließt die Inhibierung von MAP Kinase-aktivierten Signaltransduktionen, anti-inflammatorische Aktivität und die Fähigkeit ein, Bindungspartner in den unlöslichen Zellfraktionen zu sequestrieren, ebenso wie die ex vivo- und in vivo-Aktivitäten von mutierten Pellinopolypeptiden, die dieses inhibierenden Aktivitäten in Reportergenassays zeigen. Das Ausmaß, in dem die einzelnen Mitglieder der Pellinopolypeptid-Familie sowie Fragmente und andere Derivate dieser Polypeptide diese Aktivitäten zeigen, kann mittels üblicher Standardassays bestimmt werden, insbesondere mittels Assays, wie sie in den folgenden Beispielen 2, 3 und 4 beschrieben werden. Hierin werden beispielhafte Assays beschrieben; Der Fachmann wird erkennen, dass andere, ähnliche Arten von Assays ebenfalls verwendet werden können, um biologische Aktivitäten von Pellinopolypeptiden zu bestimmen.
Ein anderer Aspekt der biologischen Aktivitäten von Pellinopolypeptiden ist ihre Eigenschaft, mit bestimmten intrazellulären Signaltransduktionsmolekülen in Wechselwirkung zu treten, wie z.B. mit TRAF2, TRAF6, IRAK, TRAF1 und den TRAFs3, 4 und 5, wobei die RING-Finger-artige Domäne der Pellinopolypeptide wahrscheinlich in die Bindung an solche Bindungspartner involviert ist. Die konservierte zentrale Domäne der Pellinopolypeptide tritt in Wechselwirkung mit einer Chymotrypsinartigen Serinprotease, welche Pellinopolypeptide spaltet, und es wird angenommen, dass der N-terminale Teil von Pellinopolypeptiden einen Faktor bindet, der daran beteiligt ist, Pellinopolypeptide in dem Teil der zellulären Umgebung zu lokalisieren, der nach der Lyse der Zellen zu der löslichen Fraktion wird, oder sie dorthin zu transportieren. Somit wird, wenn der N-terminale Teil von Pellino-1 deletiert wird, dieses Pellinopolypeptid konstitutiv in der unlöslichen Fraktion lokalisiert, bleibt jedoch noch in der Lage, die MAP Kinase-aktivierte Signaltransduktion zu inhibieren, wahrscheinlich durch Bindung von signaltransduzierenden Molekülen mittels seiner RING-Finger-artigen Domäne. Die Bezeichnung „Bindungspartner", wie sie hierin gebraucht wird, schließt Liganden, Rezeptoren, Substrate, Antikörper, andere Pellinopolypeptide, dasselbe Pellinopolypeptid (im Fall von homotypischen Wechselwirkungen) sowie jedes andere Molekül ein, das mit einem Pellinopolypeptid durch Kontakt oder die Nähe von bestimmten Teilen des Bindungspartners und des Pellinopolypeptids in Wechselwirkung tritt. Weil angenommen wird, dass die RING-Finger-artige Domäne von Pellinopolypeptiden bei der Signaltransduktion an einen Bindungspartner bindet, ist zu erwarten, dass die RING-Finger-artige Domäne, wenn sie als separates Fragment von dem Rest eines Pellinopolypeptids exprimiert wird, aber mit einem Anteil der N-terminalen Domäne, der genügend groß ist, um eine Lokalisierung des Pellinopolyptids in der nicht löslichen Fraktion zu ermöglichen, die Bindung der natürlichen Pellinopolypeptide an ihre Bindungspartner unterbricht. Zu den besonders geeigneten Assays zur Feststellung und Messung einer Bindung zwischen Pellinopolypeptiden und ihren Bindungspartnern zählen der Biolumineszenzresonanzenergie-Transfer (BRET), der mit einer Biolumineszenzluciferase arbeitet, die genetisch mit einem der Kandidatenproteine fusioniert ist, beispielsweise mit einem Pellinopolypeptid, sowie ein mutiertes, grün fluoreszierendes Protein, das mit einem anderen interessierenden Protein fusioniert ist, beispielsweise mit TRAF2, IRAK, TRAF6 oder einem anderen potentiellen Proteinbindungspartner. Wechselwirkungen zwischen den beiden Fusionsproteinen bringen die Luciferase und das grüne Fluoreszenzprotein eng genug zusammen, so dass ein Resonanzenergietransfer stattfinden kann, wodurch die Farbe der Biolumineszenzemission verändert wird. Am besten können die Partner-bindenden Aktivitäten von Pellinopolypeptiden durch Verwendung des Proteinfragmentkomplementierungs-Assays bestimmt werden, wie er von Remy und Michnik, 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:5394-5399 und in WO 01/00866 beschrieben wurde.
Es wird angenommen, dass Pellinopolypeptide, wie z.B. murines und humanes Pellino-1 oder -2 und humane Pellino-3-Polypeptide, mit der Fähigkeit, die MAP Kinase-aktivierte Signaltransduktion zu stimulieren, eine Rolle beim Schutz von Wirtsorganismen gegen virale, bakterielle, fungale und andere Arten von Pathogenen spielen, indem sie Immunantworten induzieren. Weiterhin sind Pellinopolypeptide in Immun- oder entzündliche Krankheiten oder Zustände involviert, die in ihrer Ätiologie als gemeinsames Merkmal die Stimulierung einer MAP Kinase-aktivierten Signaltransduktion sowie eine NF- kB- und/oder p38-abhängige Transkription aufweisen. Der therapeutische Effekt der Stimulierung der MAP Kinase-aktivierten Transduktionen, z.B. durch Verabreichung eines Pellinopolypeptids mit natürlicher Aktivität, oder eines Agonisten eines solchen Pellinopolypeptids, wird in den folgenden Beispielen von Zuständen gezeigt, in denen die Stimulierung der NF-kB-abhängigen Transkription von Nutzen war (Yamamato und Gaynor, 2001, J. Clin. Invest. 107:135-142). Die NF-kB-abhängige Transkription moduliert das Überleben von B-Lymphozyten, die Mitogen-abhängige Zellproliferation und den Wechsel zwischen Isotypen (isotype switching), die zu der Differenzierung von B-Lymphozyten zu Plasmazellen führen. Weiterhin reguliert NF-kB die Produktion von IL-2, wodurch die Proliferation und Differenzierung von T-Lymphozyten erhöht und auch die Entwicklung von Helfer-T-Zellen erhöht wird, und wodurch die Zell-vermittelte Immunität verstärkt wird. Somit führt die Aktivierung von NF-kB zur Induzierung einer Mehrzahl von Genen, die die Immunantwort regulieren. Der NF-kB-Weg ist auch ein Mediator von Genen mit Schlüsselfunktion, die bei der Kontrolle der zellulären Proliferation und Apoptose eine Rolle spielen. Zu den anti-apoptotischen Genen, die durch NF-kB direkt aktiviert werden, gehören die zellulären Inhibitoren der Apoptose (c-IAP1, c-IAP2 und IXAP), TNF-Rezeptor assoziierte Faktoren (TRAF-1 und TRFA-2), das Bc12-Homologe A1/Bfll und IEX-IL. Die anti-apoptotischen Proteine blockieren die Aktivierung von Caspase-8, einer Initiatorprotease, die an einer frühen Phase beteiligt ist, in der die apoptotische Schrittfolge stimuliert wird, und die Induzierung der Expression von A1/Bfl-1 durch NF-kB verhindert die Freisetzung von Cytochrom c durch Mitochondrien sowie die Aktivierung von Caspase-3. Die NF-kB-Aktivierung kann somit durch Steigerung der Expression von antiapoptotischen zellulären Proteinen die Apoptose als Antwort auf eine Behandlung mit verschiedenen chemotherapeutischen Wirkstoffen vermindern. Weiterhin ist NF-kB am Schutz von Zellen vor dem Untergang durch Apoptose als Antwort auf eine Schädigung von DNA oder eine Behandlung mit Zytokinen beteiligt.
Der therapeutische Effekt der Inhibierung von MAP Kinase-aktivierten Wegen, beispielsweise durch Verabreichung eines Pellinopolypeptids mit "dominant-negativer" inhibierender Aktivität oder von deren Fragmenten oder Fusionsproteinen mit „dominant-negativer" Aktivität oder anderen Antagonisten von Pellinopolypeptiden mit natürlicher Aktivität, wird in den folgenden Beispielen für Zustände gezeigt, in denen die Inhibierung der NF-kB-abhängigen Transkription von Nutzen ist (Yamamoto und Gaynor, 2001, J. Clin. Invest. 107:135-142). NF-kB reguliert die Antwort von Wirtsorganismen auf Entzündungen, indem es die Expression von spezifischen zellulären Genen steigert, einschließlich von Genen, die für mindestens 27 verschiedene Zytokine und Chemokine kodieren. Zytokine, die durch NF-kB stimuliert werden, wie z.B. IL-1-beta und TNF-alpha, können auch den NF-kB-Weg aktivieren und somit einen positiven autonom regulierten Regelkreis etablieren, der die Antwort auf die Entzündung amplifizieren und die Dauer der chronischen Entzündung verlängern kann. NF-kB stimuliert auch die Expression von Enzymen, deren Produkte zu der Pathogenese des Entzündungsprozesses beitragen, einschließlich der induzierbaren Form von Stickstoffoxidsynthase (iNOS), die Stickstoffinonoxid generiert, und der induzierbaren Cyclooxygenase (COX-2), die Prostanoide generiert. Die Aktivierung des NF-kB-Weges spielt bei der Pathogenese von chronischen entzündlichen Krankheiten eine Rolle, wie z.B. bei Asthma, rheumatoider Arthritis und entzündlichen Darmkrankheiten, sowie von anderen Krankheiten, bei denen Entzündung eine Rolle spielt, wie z.B. Atherosklerose und Alzheimer. Verschiedene Evidenzlinien legen nahe, dass die NF-kB-Aktivierung von für Zytokine kodierenden Genen einen wichtigen Beitrag zu der Pathogenese von Asthma leistet, das durch die Infiltration von entzündeten Zellen und Disregulierung von vielen Zytokinen und Chemokinen in der Lunge gekennzeichnet ist. Der Spiegel von Zytokinen, wie z.B. TNF-alpha, die NF-kB aktivieren, sind in der Synovialflüssigkeit von Patienten mit rheumatoider Arthritis erhöht und tragen zu den chronischen entzündlichen Veränderungen und der synovialen Hyperplasie bei, die in den Gelenken dieser Patienten beobachtet werden. Steigerungen der Produktion von proinflammatorischen Zytokinen sowohl durch Lymphozyten als auch durch Makrophagen ist ebenfalls in der Pathogenese von entzündlichen Darmkrankeiten impliziert gewesen, mit Einschluss von Morbus Crohn und Magengeschwüren (Colitis ulcerosa). Die NF-kB-Aktivierung wird in mittels Biopsie gewonnenen Schleimproben von Patienten mit Morbus Crohn oder Magengeschwüren festgestellt. Die Behandlung von Patienten, die an entzündlichen Darmkrankheiten leiden, mit Steroiden setzt die NF-kB-Aktivität in Biopsieproben herab und mildert die klinischen Symptome. Diese Resultate legen nahe, dass die Stimulierung des NF-kB-Weges in die verstärkte Antwort auf entzündliche Vorgänge, die mit diesen Krankheiten einhergehen, involviert sein kann. Atherosklerose wird durch zahlreiche Einwirkungen auf das Endothelium und die glatten Muskeln der beschädigten Gefäßwand ausgelöst. Eine große Zahl von Wachstumsfaktoren, Zytokinen, und Chemokinen, die von endothelialen Zellen, glatten Muskeln, Makrophagen und Lymphozyten frei gesetzt werden, sind an diesem chronischen entzündlichen und fibroproliferativen Prozess beteiligt. Die Regulierung von Genen, die an der Antwort auf Entzündungen sowie an der Kontrolle der zellulären Proliferation durch NF-kB beteiligt sind, spielt wahrscheinlich eine wichtige Rolle bei der Initiierung und dem weiteren Verlauf von Atherosklerose. Anomalien bei der Regulierung des NF-kB-Weges können bei der Pathogenese der Alzheimer-Krankheit beteiligt sein. Beispielsweise wird NF-kB-Immunreaktivität vornehmlich in den und rund um die frühen, für die Alzheimer-Krankheit typischen neuritischen Plaques gefunden, während reife Plaques stark verminderte NF-kB-Aktivität zeigen. Somit könnte die NF-kB-Aktivierung in die Initierung von neuritischen Plaques und neuronale Apotose in den frühen Stadien der Alzheimer-Krankheit involviert sein. Zu anderen Zuständen, bei denen Entzündungen eine Rolle spielen und bei denen man erwarten kann, dass sie durch eine Verminderung der MAP Kinase-aktivierten pro-inflammatorishen Signaltransduktion gebessert werden, zählen Osteoporose, Schlaganfälle, multiple Sklerose und multiple Myelome. Weitere Beispiele für Krankheiten, bei denen Entzündungen und/oder zelluläre Antworten auf Entzündungen eine Rolle spielen, sind im U.S. Patent Nr. 6,204,261 in Spalte 206, Zeile 25 bis Spalte 207, Zeile 44 beschrieben. Zusätzlich zu einer Rolle bei der Pathogenese von Krankheiten, die durch eine Verstärkung der Antwort des Wirtsorganismus auf eine Entzündung charakterisiert sind, ist auch eine konstitutive Aktivierung des NF-kB-Weges bei der Pathogenese einiger humaner Krebsarten festgestellt worden. Anomalien in der Regulierung des NF-kB-Weges werden oft bei verschiedenen bösartigen Krankheiten, einschließlich von Leukämie, Lymphomen und festen Tumoren beobachtet. Diese Anomalien führen zu konstitutiv hohen Graden von NF-kB in den Kernen einer Vielzahl von Tumoren mit Einschluss von Brust-, Eierstock, Prostata- und Darmkrebs. Die Mehrzahl dieser Veränderungen geht wahrscheinlich auf Änderungen in regulatorischen Proteinen zurück, die Signaltransduktionswege aktivieren, welche zur Aktivierung des NF-kB-Weges führen. Die Verhinderung, Blockierung und/oder Inhibierung der Wechselwirkung zwischen Pellinopolypeptiden und ihren Bindungspartnern ist einer der Aspekte der Erfindung, die Methoden für die Behandlung und Besserung dieser Krankheiten und Zustände zur Verfügung stellt, wozu sie Inhibitoren für Aktivitäten von natürlichen Pellinomolekülen verwendet, wie z.B. die Stimulierung der NF-kB-abhängigen Transkription.
POLYNUKLEOTIDMOLEKÜLE
In einer besonderen Ausführungsform betrifft die Erfindung bestimmte isolierte Polynukleotidmoleküle, die frei von kontaminierendem endogenen Material sind. Die Bezeichnung „Polynukleotidmoleküle" bezieht sich auf Polynukleotidmoleküle in Form von separaten Fragmenten oder einer Komponente von größeren Polynukleotidkonstrukten. Die Polynukleotidmoleküle sind vorzugsweise von DNA oder RNA abgeleitet worden, die zumindest einmal in im wesentlichen reiner Form und in einer Menge oder Konzentration isoliert worden ist, die eine Identifizierung, Handhabung und Gewinnung der Nukleotidsequenzen nach üblichen chemischen Methoden gestatteten (wie sie z.B. in Sambrok et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989 beschrieben sind). Die Sequenzen werden vorteilhaft dargestellt und/oder konstruiert in der Form eines offenen Leserasters, das nicht durch interne, nicht translatierte Sequenzen oder Introns unterbrochen wird, die typischerweise in eukaryotischen Genen vorhanden sind. Die Sequenzen von nicht translatierter DNA können 3' oder 5' von einem offenen Leseraster vorhanden sein, wo sie bei der Manipulation oder Expression der kodierenden Region nicht stören.
Polynukleotidmoleküle nach der Erfindung schließen DNA sowohl in einsträngiger als auch in doppelsträngiger Form ein, ebenso wie die entsprechenden komplementären Sequenzen. Die Bezeichnung DNA schließt z.B. cDNA, genomische DNA, chemisch synthetisierte DNA, mittels PCR amplifizierte DNA sowie Kombinationen daraus ein. Genomische DNA kann nach üblichen Techniken isoliert werden, beispielsweise unter Verwendung der cDNA der SEQ ID NOs: 1, 3, 5 oder 7 oder eines geeigneten Fragments davon als Sonde. Zu den DNA-Molekülen nach der Erfindung zählen DNAs, die für Pellinopolypeptide von voller Länge kodieren, ebenso wie Polynukleotide und Fragmente davon. Die Polynukleotide nach der Erfindung sind vorzugsweise humanen Ursprungs, aber die Erfindung schließt auch von anderen Spezies abgeleitete Polynukleotide ein.
Die vorliegende Anmeldung beschreibt murine Pellino-1-DNA, die die Polynukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:1 aufweist, und das Polypeptid, für das die DNA gemäß SEQ ID NO:1 kodiert und das die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:2 hat. Das Polypeptid mit den Aminosäuren von 132 bis einschließlich 189 der SEQ ID NO:2 ist ein Zielort für die Proteaseaktivität eines Mitglieds der Chymotripsinfamilie von Proteasen. Die vorliegende Anmeldung beschreibt weiterhin humane Pellino-1-DNA mit der Polynukleotidsequenz, die durch SEQ ID NO:3 wiedergegeben wird, und das Polypeptid, für das die DNA gemäß SEQ ID NO:3 kodiert und das die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:4 aufweist. Ein spezifischer Zielort für eine Protease ist auch in diesem Polypeptid vorhanden und wird durch die Aminosäuren 132 bis einschließlich 189 von SEQ ID NO:4 definiert. Weiterhin beschrieben wird die DNA von murinem Pellino-2, die die in SEQ ID NO:5 wiedergegebene Polynukleotidsequenz besitzt, sowie das Polypeptid, für das das Polynukleotid gemäß SEQ ID NO:5 kodiert und das die Aminosäuresequenz aufweist, die in SEQ ID NO:6 wiedergegeben ist. Der Zielort für die Protease liegt zwischen den Aminosäuren 133 und 190 von murinem Pellino-2. In ähnlicher Weise liegt der Zielort für die Protease bei humanem Pellino-2 wahrscheinlich zwischen den Aminosäuren 134 und 191 von SEQ ID NO:8. Die zuvor beschriebenen Proteasezielortsequenzen in SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 und SEQ ID NO:6 können um eine oder mehrere Aminosäuren variieren. So kann der Aminoterminus der Proteasezielregion für SEQ ID NO:2 und SEQ ID NO:4 bei den Aminosäuren 130 bis einschließlich 134 und der Carboxyterminus der Zielregion bei den Aminosäuren 187 bis einschließlich 191 liegen. In ähnlicher Weise liegt bei SEQ ID NO:6 der Aminoterminus der Proteasezielregion bei einer der Aminosäuren 131 bis einschließlich 135 (Aminosäuren 132 bis einschließlich 136 von SEQ ID NO:8) und der Carboxyterminus bei einer der Aminosäuren 188 bis einschließlich 192 (Aminosäuren 189 bis 193 von SEQ ID NO:8).
Infolge der bekannten Degeneration des genetischen Codes, nach der mehrere Kodons für die selbe Aminosäure kodieren können, kann eine DNA von der in SEQ ID NO:1 dargestellten Sequenz abweichen und dennoch für ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2 kodieren. Solche DNA-Varianten können durch stille Mutationen verursacht werden, die natürlich stattfinden, oder bei der Amplifizierung mittels PCR entstehen, oder sie können das Produkt einer willkürlichen Mutagenese einer natürlichen Sequenz sein. Das selbe gilt für die DNAs, die in den SEQ ID NOs: 3, 5 und 7 wiedergegeben sind.
Die Anmeldung beschreibt isolierte DNA, die für Polypeptide nach der Erfindung kodiert und ausgewählt ist aus: (a) DNAs, die die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:1 enthalten; (b) DNAs, die die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:3 enthalten; (c) DNAs, die die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:5 enthalten; (d) DNAs, die für die Polypeptide kodieren, für die die DNAs von (a), (b) oder (c) kodieren; (e) DNAs, die mit der DNA von (a), (b) oder (c) unter moderat stringenten Bedingungen zu hybridisieren vermögen und für ein Polypeptid nach der Erfindung kodieren; (f) DNAs, die mit der DNA von (a), (b) oder (c) unter hoch stringenten Bedingungen zu hybridisieren vermögen und für ein Polypeptid nach der Erfindung kodieren; und (g) DNAs, die als Ergebnis der Degenration des genetischen Codes zu einer der unter (a), (b), (c), (d), (e) oder (f) definierten DNAs degeneriert sind und für ein Polypeptid nach der Erfindung kodieren.
Die grundlegenden Parameter, die die Wahl der Hybridisierungsbedingungen beeinflussen, und Leitlinien für die Wahl geeigneter Bedingungen sind von Sambrook et al., 1989, beschrieben. Bedingungen von moderater Stringenz im Sinne dieser Erfindung können von einem Fachmann, z.B. auf der Grundlage der Länge und/oder der Basenzusammensetzung der DNA ohne weiteres bestimmt werden. Bei Hybridisierungssonden mit einer Länge von mehr als etwa 100 Nukleotiden und auf einem Filter gebundener Ziel-DNA oder -RNA schließt eine der Möglichkeiten, moderat stringente Bedingungen einzustellen, die Verwendung einer Lösung für die Vorwäsche, die 5XSSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0) enthält, von Hybridisierungspuffer mit etwa 50% Formamid, 6XSSC und einer Hybridisierungstemperatur von etwa 42°C ein (oder anderer, ähnlicher Hybridisierungslösungen, wie z.B. einer Lösung, die 50% Formamid enthält, bei einer Temperatur von etwa 42°C), und schließt weiter Waschbedingungen von etwa 60°C in 0,5XSSC, 0,1% SDS ein. Die Bedingungen einer hohen Stringenz im Sinne dieser Erfindung können von einem Fachmann, z.B. auf der Grundlage der Länge und/oder der Basenzusammensetzung der DNA, ebenfalls ohne weiteres bestimmt werden. Im allgemeinen sind diese Bedingungen definiert wie die obigen Hybridisierungsbedingungen, jedoch mit einer Wäsche bei etwa 68°C mit 0,2XSSC,0,1% SDS. Es sollte weiterhin verstanden werden, dass die Waschtemperatur und die Salzkonzentration der Waschlösung variiert werden können, wie es nötig ist, um unter Anwendung der grundlegenden Prinzipien, die für Hybridisierungsreaktion und die Stabilität des Duplex gelten und die dem Fachmann geläufig sind, den gewünschten Grad an Stringenz zu erreichen (siehe z.B. Sambrook et al., 1989). Es sollte weiterhin verstanden werden, dass die Hybridisierungsbedingungen für Oligonukleotidsonden von definierter Länge und mit definierter Sequenz mittels Formeln bestimmt werden können, die in der Technik bekannt sind (siehe z.B. bei Sambrook et al., 1989 unter 11.4511.47).
Weiterhin wird in der Anmeldung DNA beschrieben, die für Polypeptidfragmente kodiert, welche mindestens eine der Aktivitäten von Pellinopolypeptiden zeigen, sowie DNA, die für Polypeptide mit mindestens etwa 16 Aminosäuren oder mit mindestens etwa 32 Aminosäuren kodiert, wobei diese Polypeptide als Immunogene nützlich sind. Auch DNAs, die für Polypeptide kodieren, welche einen oder mehrere inaktivierte N-Glykosylierungsorte, einen oder mehrere inaktivierte Orte für die Einwirkung von Proteasen oder eine oder mehrere konservative Aminosäuresubstitutionen aufweisen, wie in der Folge erläutert werden wird, sind ebenfalls in die Erfindung einbezogen. Beispielsweise kann die homologe IL-IR-Domäne als ein negativ-dominanter Regulator für die IL-IR-Signalübermittelung oder in einem Assay brauchbar sein, in dem kleine Moleküle identifiziert werden, die die IL-1-Signalübermittelung inhibieren oder anderweitig die IL-1 Signalübertragung regulieren.
Die in dieser Anmeldung beschriebenen DNA-Moleküle schließen auch Polynukleotide ein, die zu mindestens 80% mit einer natürlichen Sequenz identisch sind, ebenso wie Polynukleotidmoleküle, die zu mindestens 85% mit einem natürlichen Molekül identisch sind. Weiterhin werden Ausführungsformen in Betracht gezogen, bei denen ein DNA-Molekül zu mindestens 90% identisch, zu mindestens 95% identisch, zu mindestens 98% identisch, zu mindesten 99% identisch oder zu mindestens 99,9% identisch ist mit einer natürlichen Sequenz. „Prozent Identität" ist definiert als die Anzahl der zugeordneten Symbole, d.h. der Nukleotide oder Aminosäuren, die identisch sind, dividiert durch die Gesamtzahl der Symbole in der kürzeren der beiden Sequenzen. Der Grad an Homologie (prozentuale Identität) zwischen zwei Sequenzen kann bestimmt werden, indem man die Alignment-Methode von Needleman und Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970), überarbeitet von Smith und Waterman (Adv. Appl. Math. 2:482, 1981) anwendet, mit einer unären Matrix (die einen Wert von 1 für Identität und einen Wert von 0 für Nicht-Identität enthält) für Nukleotide und der gewichteten Vergleichsmatrix nach Gribskov und Burgess (Nuil. Acids. Res. 14:6745,1986), wie sie von Schwartz und Dayhoff (Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomediccal Research Foundation, Seiten 353 bis 358, 1979) beschrieben wurde, für Aminosäuren. Vorteilhaft wird der Vergleich mittels eines Computerprogramms durchgeführt. Ein Beispiel für ein bevorzugtes Computerprogramm ist das Programm der Genetics Computer Group; (GCG; Madison, WI) Wisconsin Package Version 10.0 'GAP'. Die bevorzugten voreingestellten Parameter des GAP-Programms schließen ein: (1) Die GCG-Implementierung der zuvor erwähnten Vergleichsmatrices für Nukleotide und Aminosäuren; (2) eine Nachteil „Penalty" von 30 für jede Lücke und eine zusätzlichen „Penalty" von 1 für jedes Symbol in jeder Lücke bei Aminosäuresequenzen; sowie einen Nachteil von 50 für jede Lücke und einen zusätzlichen Nachteil von 3 für jedes Symbol in jeder Lücke für Nukleotidsequenzen; (3) keine „Penalty" für Endlücken (end gaps); und (4) keine maximale „Penalty" für längere Lücken. Andere Programme für den Vergleich von Sequenzen, die in der Fachwelt bekannt sind, können ebenfalls benutzt werden.
In ähnlicher Weise schließen die DNAs nach der Erfindung Varianten ein, die von der natürlichen DNA-Sequenz durch eine oder mehrere Deletionen, Insertierungen oder Substitutionen abweichen, aber trotzdem für ein biologisch aktives Polypeptid kodieren. Weiterhin sind DNAs in die Erfindung einbezogen, die für verschiedene zusätzliche oder substituierte Aminosäurebausteine oder -sequenzen oder für Deletionen von terminalen oder internen Bausteinen oder Sequenzen kodieren.
Zu den Beispielen für solche DNAs zählen diejenigen DNAs, die modifiziert wurden, um die Expression eines Polypeptids mit einem veränderten Ort für eine N-Glykosylierung oder für die Einwirkung einer KEX-2-Protease zu erleichtern, ebenso wie diejenigen DNAs, in denen für Cys kodierende Kodons, sofern Cys für die biologische Aktivität nicht nötig ist, eliminiert oder so verändert sind, dass sie für andere Aminosäuren kodieren. Diese und andere variierten Peptide sind hierin offenbart; DNAs, welche für sie kodieren, sind ebenfalls in die Erfindung eingeschlossen.
Die Erfindung stellt auch isolierte DNAs zur Verfügung, die für die Herstellung von Polypeptiden nützlich sind. Solche Polypeptide können nach jeder einer Anzahl von üblichen Techniken hergestellt werden. DNA-Sequenzen, die für ein Pellinopolypeptid oder ein gewünschtes Fragment davon kodieren, können zur Herstellung des Polypeptids oder Fragments in einen Expressionsvektor subkloniert werden. Die DNA-Sequenz wird vorteilhaft mit einer Sequenz fusioniert, die für ein geeignetes Leader- oder Signalpeptid kodiert.
Das gewünschte DNA-Fragment kann nach bekannten Methoden chemisch synthetisiert werden. DNA-Fragmente können auch durch Verdauung einer in voller Länge klonierten DNA-Sequenz mittels Restriktionsendonukleasen hergestellt und durch Elektrophorese auf Agarosegelen isoliert werden. Zur Rekonstruktion des 3'- oder 5'-Terminus bis zu einem bestimmten Punkt können Oligonukleotide mit einem durch Verdauung mit einem Restriktionsenzym erhaltenen DNA-Fragment ligiert werden, wenn dies erforderlich ist. Solche Oligonukleotide können zusätzlich einen Ort für eine Spaltung mittels einer Restriktionsendonuklease oberhalb der gewünschten kodierenden Sequenz sowie ein Initiationscodon (ATG) am N-Terminus der kodierenden Sequenz aufweisen.
Die wohlbekannte Polymerasekettenreaktion (PCR) kann ebenfalls verwendet werden, um eine DNA zu isolieren und amplifizieren, die für ein gewünschtes Protein oder ein Fragment davon kodiert. Oligonukleotide, die die gewünschten Termini des DNA-Fragments definieren, werden als 3'- und 5'-Primer verwendet. Die Oligonukleotide können zusätzlich Erkennungsstellen für Restriktionsendonukleasen enthalten, die die Inserition des amplifizierten DNA-Fragments in einen Expressionsvektor erleichtern. PCR-Verfahren wurden beschrieben von Saiki et al., Science 239:487, 1988; Recombinant DNA Methodology, Herausgeber Wu et al., Academic Press, Inc., San Diego, CA (1989), Seiten 189 bis 196; und in PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Herausgeber Innis et al., Academic Press, Inc. (1990).
Die vorliegende Erfindung stellt auch Gene zur Verfügung, die den hierin offenbarten Nukleinsäuresequenzen entsprechen. „Entsprechende Gene" oder „entsprechende genomische Nukleinsäuren" sind diejenigen Regionen des Genoms, die transkribiert werden und so die mRNAs hervorbringen, von denen die cDNA-Nukleinsäuresequenzen abgeleitet werden, und die aufeinander folgende Sequenzen des Genoms enthalten können, die für die geregelte Expression dieser Gene erforderlich sind. Entsprechende Gene können daher, wenn auch nicht hierauf beschränkt, kodierende Sequenzen, 5'- und 3'-untranslatierte Regionen, alternativ gespleißte Exons, Introns, Promotoren, Verstärker und Silencer- oder Suppressor-Elemente enthalten. Entsprechende genomische Nukleinsäuren können genomische Nukleinsäuresequen-zen mit 10.000 Basenpaaren (vorteilhafter 5.000 Basenpaaren, noch vorteilhafter 2.500 Basenpaaren und am vorteilhaftesten 1.000 Basenpaaren) genomischer Nukleinsäuresequenz oberhalb des ersten Nukleotids der genomischen Sequenz umfassen, die dem Initiationscodon der für das Pellinopolypeptid kodierenden Sequenz entspricht, und können genomische Nukleinsäuresequenzen mit 10.000 Basenpaaren (vorteilhaft 5.000 Basenpaaren, vorteilhafter 2.500 Basenpaaren und am vorteilhaftesten 1.000 Basenpaaren) genomischer Nukleinsäuresequenz unterhalb (downstream) des letzten Nukleotids der genomischen Sequenz umfassen, die dem Terminierungscodon (Stopcodon) der für das Pellinopolypeptid kodierenden Sequenz entspricht. Die entsprechenden Gene oder genomischen Nukleinsäuren können nach bekannten Methoden auf der Grundlage der hierin gegebenen Sequenzinformation isoliert werden. Zu diesen Methoden zählen die Herstellung von Sonden oder Primern aufgrund der ofenbarten Sequenzinformation zur Identifizierung und/oder Amplifizierung von Genen in geeigneten Genbibliotheken oder anderen Quellen von genomischen Materialien. Ein „isoliertes Gen" oder „eine isolierte genomische Nukleinsäure" ist eine genomische Nukleinsäure, die von den benachbarten genomischen Sequenzen abgetrennt wurde, die in dem Genom des Organismus vorhanden waren, aus dem die genomische Nukleinsäure isoliert wurde.
POLYPEPTIDE UND DEREN FRAGMENTE
Die Erfindung umfasst Polypeptide und deren Fragmente in verschiedenen Formen, einschließlich derjenigen, die natürlich vorkommen oder mittels verschiedener Techniken hergestellt werden, einschließlich von Verfahren, die rekombinante DNA-Technologie involvieren. Zu diesen Formen zählen, wenn auch nicht hierauf beschränkt, Derivate, Varianten und Oligomere, ebenso wie Fusionsproteine oder Fragmente davon.
Die hierin beschriebenen Polypeptide schließen Proteine mit der vollen Länge ein, für die die zuvor beschriebenen Nukleinsäuresequenzen kodieren. Zu den Polypeptidsequenzen mit der vollen Länge zählen Aminosäuresequnzen, wie sie in SEQ ID NOs:2, 4 und 6 mit nützlichen Fragmenten, die die Aminosäuren 132 bis 289 der SEQ ID NOs:2 und 4 und die Aminosäuren 133 bis 190 von SEQ ID NO:6 umfassen, beschrieben sind. Wie zuvor erwähnt, können die C-terminalen und die N-terminalen Aminosäuren dieser und anderer Fragmente um etwa zwei Aminosäuren von den angegebenen Grenzen abweichen, d.h. der N-Terminus kann zwischen den Aminosäuren 130 bis 134 der SEQ ID NOs:2 und 4 zwischen den Aminosäuren 131 bis 135 von SEQ ID NO:6 variieren; und der C-Terminus kann zwischen den Aminosäuren 187 bis 191 von SEQ ID NOs:2 und 4 und zwischen den Aminosäuren 188 bis 192 von SEQ ID NO:6 variieren.
Die erfindungsgemäßen Peptide und deren Fragmente können als intrazelluläre Polypeptide rekombinant exprimiert werden, vorteilhaft in Zellen, die nicht von Säugern stammen. Die Peptide können erhalten werden, indem man Zellen aus ihrem Kulturmedium isoliert, welche das Polypeptid exprimieren (z.B. durch Zentrifugieren oder Filtrieren), die Zellen solubilisiert und das Peptid von den solubilisierten Zellen isoliert. Die Auswahl der Solubilisierungsmethode hängt von der Art der Zellen ab, in denen das Polypeptid exprimiert wurde. Die Abtrennung des Polypeptids von den rekombinanten Wirtszellen und dessen Reinigung wird erleichtert, wenn man das Polypeptid als Fusionsprotein mit einem Markierungsprotein (tag protein) exprimiert, wie hierin diskutiert.
Die erfindungsgemäßen Peptide und deren Fragmente können auch als lösliches Polypeptid rekombinant exprimiert werden, das aus den Zellen sekretiert wird, in denen es hergestellt wird. Solche löslichen Polypeptide können hergestellt werden, indem man aus dem Kulturmedium intakte Zellen abtrennt, die das lösliche Polypeptid exprimieren (z.B. durch Zentrifugieren oder Filtrieren) und das lösliche Polypeptid aus dem Medium (dem Überstand) isoliert. Die Abtrennung des löslichen Polypeptids von den rekombinanten Wirtszellen und dessen Reinigung werden erleichtert, wenn man das Polypeptid als sekretiertes Protein exprimiert, was nützlich sein kann, wenn man größere Mengen Polypeptid als therapeutischen Wirkstoff oder für diagnostische Zwecke oder zur Verwendung in Assays benötigt. Weil der N-Terminus und der C-Terminus von rekombinant exprimierten Polypeptiden um mehrere Aminosäuren variieren können (z.B. um etwa eine Aminosäure bis etwa 10 Aminosäuren), können die Polypeptide nach der Erfindung in gleicher Weise variieren.
Die Erfindung stellt auch Pellinopolypeptide und deren Fragmente zur Verfügung, die eine gewünschte Aktivität zurückbehalten haben. Besondere Ausführungsformen betreffen Polypeptidfragmente, die ein Mitglied der Chymotrypsin-Familie der Proteasen zu binden vermögen. Ein solches Fragment kann ein lösliches Polypeptid sein, wie zuvor beschrieben. Bei einer anderen Ausführungsform schließen die Polypeptide und deren Fragmente vorteilhaft Regionen ein, die in der Pellinofamilie konserviert sind, wie zuvor beschrieben,
Es werden hierin auch Polypeptidfragmente zur Verfügung gestellt, die mindestens 8, 12, 16 oder mindestens 32 aufeinander folgende Aminosäure der Sequenz SEQ ID NO:2 umfassen. Diese Polypeptidfragmente können bei der Herstellung von Antikörpern als Immunogene, als „Small-molecule" Antagonisten oder Agonisten für Pellinoaktivität sowie in verschiedenen Assays auf Pellinoaktivität verwendet werden.
Natürlich vorkommende Varianten und ebenso abgeleitete Varianten der Polypeptide und deren Fragmente werden hierin zur Verfügung gestellt. Varianten können Aminosäuresequenzen aufweisen, die zu mindestens 80% identisch oder mindestens zu etwa 85% identisch mit den hierin offenbarten natürlichen Polypegtiden sind. Auch werden Ausführungsformen in Betracht gezogen, in denen ein Polypeptid oder ein Fragment davon zu mindestens 90% identisch, zu mindestens 95% identisch, zu mindestens 99% identisch oder zu mindestens 99,9% identisch mit dem bevorzugten Polypeptid oder dessen Fragment ist. Die prozentuale Identität kann bestimmt werden, wie zuvor beschrieben wurde.
Zu den Varianten gemäß der Erfindung gehören z.B. diejenigen, die aus einer alternativen mRNA-Spleißung oder einer proteolytischen Spaltung stammen. Eine alternative Spleißung von mRNA kann z.B. ein verkürztes, aber biologisch aktives Protein ergeben, wie z.B. eine natürlich vorkommende verkürzte Form des Proteins. Wie zuvor erwähnt, zählen zu den Variationen, die auf eine proteolytische Spaltung zurückgehen, z.B. Unterschiede in den N- oder C-Termini aufgrund von Expressionen in unterschiedlichen Arten von Wirtszellen, was zu einer proteolytischen Abtrennung von einer oder mehreren terminalen Aminosäuren von dem Protein (im allgemeinen etwa 1 bis etwa 5 Aminosäuren) führen kann, oder aufgrund anderer Unterschiede in der Proteinexpression. Weiterhin sind in die Erfindung Proteine einbezogen, in denen Unterschiede in der Aminosäuresequenz auf genetische Polymorphie zurückgehen (allelische Variationen zwischen den einzelnen Organismen, die das Protein produzieren).
Zu den anderen Varianten zählen Fusionsproteine, wie z.B. diejenigen, die in rekombinanten Kulturen als N-terminale oder C-terminale Fusionsproteine erzeugt werden. Beispiele für Fusionsproteine sind u.a. Fusionsproteine, die Oligomere bilden, wie z.B. ein Pellino/Fc-Fusionsprotein (beispielsweise wie im U.S. Patent Nr. 5,962,406 beschrieben, erteilt am 5. Oktober 1999) oder ein Reißverschlussfusionsprotein (zipper fusion protein) (U.S. Patent Nr. 5,716,805, erteilt am 10. Februar 1998). Weiterhin können Fusionsproteine Peptide umfassen, die hinzugefügt wurden, um die Reinigung und Identifizierung zu erleichtern (oft als Markierungsproteine „tag proteins" bezeichnet). Zu solchen Proteinen zählen z.B. Poly-His oder die antigenischen Identifizierungsproteine, die im U.S. Patent Nr. 5,011,912 sowie von Hopp et al. in Bio/Technology 6:1204, 1988, beschrieben wurden. Zu den weiteren nützlichen Markierungsproteinen gehören das grün fluoreszierende Protein (GFP; Chalfie et al., Science 263:802, 1994) ein N-terminales Polypeptid, welches Erkennungsorte für einen monoklonalen Antikörper besitzt, eine spezifische Endopeptidase sowie eine ortsspezifische Proteinkinase (PKA; Blanar und Rutter, Science 256:1014, 1992), birA (Altman et al., Science 274:94, 1996) und Glutathion-S-transferase (GST; Smith und Johnson, Gene 67:31, 1988).
Ein solches Markierungspeptid ist das FLAG-Peptid, das in hohem Maße antigen ist und ein Epitop liefert, das reversibel an einen spezifischen monoklonalen Antikörper bindet, wodurch ein schneller Assay und eine leichtere Reinigung des exprimierten rekombinanten Proteins ermöglicht werden. Ein murines Hybridoma, das als 4E11 bezeichnet wird, erzeugt einen monoklonalen Antikörper, der das FLAG-Peptid bei Anwesenheit bestimmter zweiwertiger Metallkationen bindet, wie im U.S. Patent Nr. 5,011,912 beschrieben ist. Die 4E11-Hybridoma-Zelllinie ist bei der American Type Culture Collection unter der Zugangsnummer HB 9259 deponiert worden. Monoklonale Antikörper, die das FLAG-Peptid binden, können von Eastman Kodak Co., Scientific Imaging Systems Division, New Haven, Connecticut, bezogen werden.
Ein anderes brauchbares Markierungspeptid ist das GST-Peptid, das Glutathion bindet und auch die Reinigung von exprimiertem rekombinanten Protein erleichtert. Rekombinante Proteine können durch Affinitätschromatographie unter Verwendung einer geeigneten Chromatographiematrix, an die Glutathion gebunden wurde, gereinigt werden, wie von Smith und Johnson a.a.O. beschrieben wurde. Zu den geeigneten Chromatographiematrices zählen Beads aus Glutathion-Agarose (Pharmacia). Die rekombinaten Proteine können mit einem Überschuss von Glutathion eluiert werden. Alternativ kann ein spezifischer enzymatischer Spaltungsort (wie z.B. ein Spaltungsort für Thrombin) in das rekombinante Fusionsprotein eingebaut und das gewünschte Polypeptid von der Affinitätsmatrix entfernt werden, indem man das Fusionsprotein mit dem Enzym behandelt, das das Fusionsprotein am Spaltungsort spaltet.
Unter den varianten Polypeptiden, die hierin offenbart werden, gibt es Varianten von natürlichen Polypeptiden, die die natürliche biologische Aktivität oder ein wesentliches Äquivalent davon behalten haben. Ein Beispiels dafür ist eine Variante, die einen Bindungspartner mit im wesentlichen der selben Bindungsaffinität bindet wie die natürliche Form. Die Bindungsaffinität kann mittels üblicher Verfahren gemessen werden, wie im U.S. Patent Nr. 5,512,447 beschrieben ist und in der Folge erläutert werden wird. Zu den Varianten gehören Polypeptide, die im wesentlichen homolog zu der natürlichen Form sind, die aber infolge einer oder mehrerer Deletionen, Substitutionen oder Insertionen Abweichungen von der Aminosäuresequenz der natürlichen Form zeigen. Zu den besonderen Ausführungsformen zählen, ohne hierauf beschränkt zu sein, Polypeptide mit 1 bis 10 Deletionen, Insertionen oder Substitutionen von Aminosäuren, im Vergleich mit der Sequenz der natürlichen Form. Eine gegebene Aminosäure kann z.B. durch eine Aminosäure mit ähnlicher physikochemischer Charakteristik ersetzt werden. Zu den Beispielen für solche pysikochemisch konservativen Substitutionen zählen die Substitution einer aliphatischen Aminosäure durch eine andere aliphatische Aminosäure, (z.B. können Ile, Val, Leu oder Ala untereinander ausgetauscht werden); Substitutionen einer polaren Aminosäuren durch eine andere polare Aminosäure (z.B. können Lys und Arg, Glu und Asp oder Gln und Asn gegeneinander ausgetauscht werden); und Substitutionen einer aromatischen Aminosäure gegen eine andere aromatische Aminosäure (z.B. können Phe, Trp oder Tyr untereinander ausgetauscht werden). Andere Substitutionen, wie z.B. Substitutionen ganzer Regionen mit ähnlichen hydrophoben Eigenschaften, sind gut bekannt.
Die Erfindung schließt weiterhin Polypeptide nach der Erfindung mit oder ohne assoziiertem(s) natürlichen(s) Glykosylierungsmuster ein. Polypeptide, die in Hefe- oder Säugerexpresseionssystemen exprimiert werden (wie z.B. in CHO- oder COS7-Zellen), können im Glykosylierungsmuster und im Molekulargewicht ähnlich wie oder signifikant verschieden von natürliche(n) Polypeptide(n) sein, je nach der Wahl des Expressionssystems. Weiterhin kann eine gegebene Präparation mehrere verschieden glykosylierte Spezies des Proteins enthalten. Die Expression von Polypeptiden nach der Erfindung in bakteriellen Expressionssystemen, wie z.B. in E. coli, ergibt nicht-glykosylierte Moleküle. Glykosylgruppen können auch durch übliche chemische oder enzymatische Methoden entfernt werden, insbesondere durch solche, die Glykopeptidase verwenden. Im allgemeinen können glykosylierte Polypeptide nach der Erfindung mit einem molaren Überschuss von Glykopeptidase (Boehringer, Mannheim) inkubiert werden. Auch rekombinante Techniken können angewandt werden, um Glykosylierungen zu vermindern, die in eukaryotischen Expressionssystemen stattfinden, wie dies z.B. im U.S. Patent Nr. 5,071,972 und in EP 276 846 beschrieben ist. Andere Varianten werden durch Modifizierung von benachbarten zweibasischen Aminosäuren hergestellt, um die Expression in Hefesystemen zu steigern, in denen KEX2-Proteaseaktivität vorhanden ist, wie in EP 212 914 offenbart wurde. Nach einem anderen Beispiel für Varianten können Sequenzen, die für Cys-Moleküle kodieren, welche für die biologische Aktivität nicht wesentlich sind, so verändert werden, dass Cys deletiert oder durch eine andere Aminosäure ersetzt wird, wie im U.S. Patent Nr. 5,962,406, erteilt am 5. October 1999, beschrieben ist.
Weitere Varianten innerhalb des Bereichs der Erfindung schließen Polypeptide ein, die so modifiziert sein können, dass Derivate davon dadurch geschaffen werden, dass kovalente oder aggregative Konjugate mit anderen chemischen Bausteinen gebildet werden, wie z.B. mit Glykosylgruppen, Lipiden, Phosphat- oder Acetylgruppen u.ä. Kovalente Derivate können hergestellt werden, indem man die chemischen Bausteine mit funktionellen Gruppen an Aminosäureseitenketten oder am C-Terminus oder N-Terminus eines Polypeptids verknüpft. Auch Konjugate mit angefügten diagnostischen (nachweisbaren) oder therapeutischen Agenzien werden in Betracht gezogen, wie in der Folge näher erläutert werden wird.
HERSTELLUNG VON POLYPEPTIDEN UND DEREN FRAGMENTEN
Die vorliegende Erfindung stellt auch DNA enthaltende rekombinante Klonierungs- und Expressionsvektoren zur Verfügung, ebenso wie Wirtszellen, die die rekombinanten Vektoren enthalten. DNA enthaltende Expressionsvektoren können verwendet werden, um die Polypeptide oder deren Fragmente nach der Erfindung herzustellen, für die die DNA kodiert. Bei einem Verfahren zur Herstellung der Polypeptide kultiviert man die mit einem für das Polypeptid kodierenden Expressionsvektor transformierten Wirtszellen unter Bedingungen, die für die Expression des Polypeptids günstig sind, und isoliert dann das exprimierte Polypeptid aus der Kultur. Der Fachmann wird erkennen, dass die Prozeduren für die Herstellung und die Reinigung des exprimierten Polypeptids variieren werden, je nach solchen Faktoren, wie z.B. der Typ der verwendeten Wirtszellen und ob das Polypeptid ein an eine Membran gebundenes oder ein lösliches, von den Wirtszellen sekretiertes Polypeptid ist
Jedes geeignete Expressionssystem kann verwendet werden. Die Vektoren schließen eine DNA ein, die für ein Polypeptid oder dessen Fragment nach der Erfindung kodiert, funktionell verbunden mit geeigneten, die Transkription und die Translation regelnden Nukleotidsequenzen, beispielsweise mit solchen, die von einem Säuger-Gen, einem mikrobiellen, viralen oder Insekten-Gen abgeleitet sind. Zu den Beispielen für regulatorische Sequenzen gehören Transkriptions-Promotoren, -Operatoren oder -Verstärker, ein ribosomaler Bindungsort für mRNA sowie geeignete Sequenzen, die den Beginn und die Beendigung der Transkription und der Translation regeln. Ein Ursprung der Replikation, der die Fähigkeit zur Replikation der gewünschten Wirtszellen vermittelt, sowie ein Selektionsgen, durch das die Transformanten identifiziert werden, sind im allgemeinen in dem Expressionsvektor enthalten. Nukleotidsequenzen sind funktionell verbunden, wenn die regulierende Sequenz in einem funktionellen Zusammenhang mit der DNA-Sequenz steht. So ist eine als Promotor wirkende Nukleotidsequenz mit einer DNA-Sequenz funktionell verbunden, wenn die Promotornukleotidsequenz die Transkription der DNA-Sequenz regelt.
Zusätzlich kann in dem Expressionsvektor eine Sequenz enthalten sein, die für ein geeignetes Signalpeptid (das natürlich oder heterolog sein kann) kodiert. Eine DNA-Sequenz, die für ein Signalpeptid (secretory Leader) kodiert, kann im Leseraster mit der Nukleotidsequenz nach der Erfindung fusioniert sein, sodass zuerst die DNA transkribiert und die mRNA zu einem Fusionsprotein translatiert wird, das das Signalpeptid enthält. Ein Signalpeptid, das in der ausgewählten Wirtszelle funktionell ist, fördert die extrazelluläre Sekretion des Polypeptids. Das Signalpeptid wird nach der Sekretion des Polypeptids aus der Zelle abgespalten.
Der Fachmann wird auch erkennen, dass die Position(en), an der bzw. denen das Signalpeptid abgespalten wird, von der bzw. den von einem Computerprogramm vorhergesagten Stelle(n) abweichen und variieren können in Abhängigkeit von Faktoren, wie z.B. die An der Wirtszellen, die für die Expression des rekombinanten Polypeptids verwendet wurden. Dementsprechend kann ein Proteinprodukt eine Mischung von Proteinmolekülen mit verschiedenen N-terminalen Aminosäuren enthalten, die von der Abspaltung des Signalpeptids an mehr als einer Stelle herrührt.
Zu den geeigneten Wirtszellen für die Expression von Polypeptiden zählen Prokaryonten, Hefe- oder höhere eukaryotische Zellen. Geeignete Klonierungs- und Expressionsvektoren zur Verwendung in bakteriellen, fungalen, Hefe- oder Säugerwirtszellen sind z.B. beschrieben in Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York (1985). Auch zellfreie Translationssysteme könnten zur Herstellung von Polypeptiden verwendet werden, wobei man mit RNAs arbeitet, die von hierin offenbarten DNA-Konstrukten abgeleitet sind.
Kultursysteme mit Säuger- oder Insektenwirtszellen können ebenfalls benutzt werden, um rekombinante Polypeptide zu exprimieren. Systeme mit Bacculoviren für die Herstellung von heterologen Proteinen in Insektenzellen sind zusammenfassend beschrieben von Luckow und Summers, Bio/Technology 6:47 (1988). Etablierte Zelllinien mit Säugerursprung können ebenfalls verwendet werden. Zu den Beispielen für geeignete Zelllinien gehören die COS-7 Linie von Affen-Nierenzellen (ATCC CRL 1651) (Gluzman et al., Cell 23:175, 1981); L-Zellen; C127-Zellen; 3T3-Zellen (ATCC CCL 163); Ovarialzellen von chinesischen Hamstern (CHO-Zellen), HeLa-Zellen; und BHK-Zellen (ATCC CRL 10) sowie die CV1/EBNA-Zelllinie, die von Nierenzellinie von afrikanischen grünen Affen CV1 (ATCC CCL 70) abstammt, wie von MeMahan et al. (EMBOJ. 10:2821, 1991) beschrieben.
Eine übliche verwendete Zelllinie sind Dihydrofolat-Reduktase (DHFR) CHO-Zellen, die auxotrophisch für Glycin, Thymidin und Hypoxanthin sind und unter Verwendung von DHFR cDNA als amplifizierbarem dominanten Marker in den DHFR+-phänotyp umgewandelt werden können. Eine solche DHFR- CHO-Zellinie, DXB11, wurde von Urlaub und Chasin (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216, 1980) beschrieben. Ein anderes Beispiel für eine DHFR- CHO-Zelllinie ist DG44 (siehe z.B. Kaufman, R., Meth. Enzymology 185:537 (1988)). Andere Zelllinien, die für spezifische Selektionen oder Amplifikationsschemata entwickelt wurden, werden auch brauchbar für die Erfindung sein.
Verschiedene Transfektionsprotokolle sind in der Technik bekannt und von Kaufman R.J. a.a.O. beschrieben worden. Die Auswahl des Transfektionsprotokolls hängt vom Typus der Wirtszelle sowie der Natur des interessierenden Gens ab und kann aufgrund von Routineversuchen getroffen werden. Die grundlegenden Erfordernisse jedes dieser Protokolle bestehen darin, dass man zunächst für das interessierende Protein kodierende DNA in eine geeignete Wirtszelle einführt und dann Wirtszellen identifiziert und isoliert, die die heterologe DNA auf stabile, exprimierbare Art und Weise inkorporiert haben. Andere brauchbare Transfektionsprotokolle werden im U.S. Patent Nr. 6,027,915 diskutiert, das am 22. Februar 2000 erteilt wurde. Die Transfizierung von Zellen mit heterologer DNA und die Selektion von Zellen, die die heterologe DNA aufgenommen haben und den selektierbaren Marker exprimieren, führt zu einem Kollektiv von transfizierten Zellen. Die einzelnen Zellen dieses Kollektivs werden hinsichtlich der Menge der aufgenommenen DNA sowie der chromosomalen Lokation der aufgenommenen DNA variieren. Um stabile Zelllinien zu schaffen, können einzelne Zellen aus dem Kollektiv isoliert und kultiviert werden (ein Verfahren, das man als Klonierung bezeichnet).
Ein Verfahren zur Amplifizierung des interessierenden Gens ist auch für die Expression des rekombinanten Gens erwünscht und schließt typischerweise die Verwendung eines Selektionsmarkers ein (Übersicht von Kaufman, R.J. a.a.O.). Widerstandsfähigkeit gegen cytotoxische Wirkstoffe ist die Eigenschaft, die am häufigsten als Selektionsmarker dient und entweder eine dominante Eigenschaft (traft) sein (d.h. sie kann unabhängig vom Typ der Zellen benutzt werden) oder eine rezessive Eigenschaft sein (d.h. brauchbar in bestimmten Typen von Wirtszellen, denen eine Aktivität fehlt, auf die hin selektiert wird). Verschiedene amplifizierbare Marker eignen sich zur Verwendung in den Expressionsvektoren nach der Erfindung, wie sie z.B. von Maniatis, Molecular Biology: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1989, Seiten 16.9 bis 16.14) beschrieben sind.
Brauchbare selektierbare Marker für die Genamplifizierung in Säugerzellen, die gegen einen Wirkstoff sind, werden in Tabelle 1 von Kaufman R.J. a.a.O. aufgeführt und schließen DHFR-MTX-Resistenz, P-Glycoprotein- und multiple Wirkstoffresistenz (MDR), Resistenz gegen verschiedene lipophile cytotoxische Agenzien (d.h. Adriamycin, Colchicin und Vincristin) und Adenosindeaminase (ADA-Xyl-A) oder Adenosin und 2'-Deoxyformycin. Andere dominante selektierbare Macker werden im U.S. Patent Nr. 6,027,915, erteilt am 22. Februar 2000, diskutiert.
Brauchbare regulatorische Elemente, wie zuvor beschrieben, können ebenfalls in den Plasmiden oder Expressionsvektoren, die für die Transfizierung der Säugerzellen verwendet werden, enthalten sein. Die Auswahl des Transfizierungsprotokolls und die ausgewählten, darin verwendeten Elemente hängen von der Art der verwendeten Zellen ab. Dem Fachmann sind zahlreiche Protokolle und mögliche Wirtszellen bekannt, und er kann auf der Grundlage der Erfordernisse des ausgewählten Zellkultursystems (oder der-systeme) ein geeignetes System für die Expression eines gewünschten Proteins auswählen.
Ein brauchbarer Hochleistungsexpressionsvektor, pCAVNOT, ist von Mosley et al, Cell 59:335-348, 1989, beschrieben worden. Andere Expressionsvektoren zur Verwendung in Säugerwirtszellen können konstruiert werden, wie dies von Okayama und Berg in Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983 beschrieben wurde. Ein brauchbares stabiles System mit hoher Leistungsfähigkeit für die Expression von Säuger-cDNA in C127 murinen Säugerepithelialzellen kann im wesentlichen so konstruiert werden, wie es von Cosman et al., Mol. Immunol. 23:935, 1986, beschrieben worden ist. Ein brauchbarer Expressionsvektor mit hoher Leistungsfähigkeit, PMLSV N1/N4, wurde von Cosman et al. Nature 312:768, 1984 beschrieben und ist als ATCC 39890 deponiert worden. Weitere brauchbare Säugerexpressionsvektoren sind in EP A 0 367 566 sowie in WO 91/18982 beschrieben. Bei einer noch anderen Alternative können die Vektoren von Retroviren abgeleitet werden.
Weitere geeignete Expressionsvektoren, pFLAG und pDC311, können ebenfalls verwendet werden. Mittelpunkt der FLAG-Technologie ist die Fusion eines niedermolekularen (1kD) hydrophilen FLAG-Markerpeptids an den N-Terminus eines rekombinanten Proteins, das von einem FLAG- Expressionsvektor exprimiert wird. pDC311 ist ein anderer spezialisierter Vektor, der für die Expression in CHO-Zellen verwendet wird. pDC311 ist durch eine bicistronische Sequenz, die das interessierende Gen enthält, sowie durch ein Gen für eine Dihydrofolat-Reduktase (DHF), das einen internen Ribosomenbindungsort für die DHFR-Translation enthält, ein die Expression vermehrendes Sequenzelement (expression augmenting sequence element, EASE), den humanen CMV-Promotor, eine dreiseitige (tripartite) Leader-Sequenz und einen Ort für Polyadenylierung gekennzeichnet.
Ein Signalpeptid kann, wenn dies erwünscht ist, verwendet werden, um die Sekretion des Proteins zu begünstigen. Die Auswahl des Signalpeptids oder Leaders kann von Faktoren abhängen, wie z.B. dem Typ der Wirtszellen, in denen das rekombinante Protein hergestellt werden soll. Zur Erläuterung sei erwähnt, dass zu den Beispielen für heterologe Signalpeptide, die in Säugerwirtszellen funktionell sind, die folgenden gehören: die Signalsequenz für Interleukin-7 (IL-7), die im U.S. Patent Nr. 4,965,195 beschrieben ist; die Signalsequenz für den Interleukin-2-Rezeptor, die von Crosman et al. in Nature 312:768 (1984) beschrieben wurde; das in EP 0 367 566 beschriebene Signalpeptid für den Interleukin-4-Rezeptor; das Signalpeptid für den Interleukin-1-Rezeptor vom Typ I, das im U.S. Patent Nr. 4,968,607 offenbart wurde; und das in EP 0 460 846 beschriebene Signalpeptid für den Interleukin-1-Rezeptor vom Typ II.
REINIGUNG
Die in den Bereich dieser Erfindung fallenden „isolierten" Polypeptide oder deren Fragmente sind Polypeptide oder Fragmente, die sich in einer Umgebung befinden, die mit der Umgebung, in der sie in der Natur gefunden werden, nicht identisch ist. Die „gereinigten" Polypeptide oder deren Fragmente, die in den Bereich dieser Erfindung fallen, sind im wesentlichen frei von Assoziationen mit anderen zellulären Komponenten, wie z.B. mit nicht in Beziehung zu ihnen stehenden (oder verwandten) Polypeptiden, Lipiden, und DNA oder RNA; sie sind beispielsweise ein Reinigungsprodukt von Material aus rekombinanten Expressionssystemen, wie z.B. die zuvor beschriebenen, oder gereinigte Produkte aus einer nicht rekombinanten Quelle, wie z.B. aus natürlich vorkommenden Zellen und/oder Geweben.
Bei einer Ausführungsform kann die Reinigung von rekombinanten Polypeptiden oder deren Fragmenten bewirkt werden, indem man das oder die Polypeptid(e) nach der Erfindung als Fusionsprotein mit einem Peptid (das oft als Markierungspeptid (tag peptide) bezeichnet wird) exprimiert, für das in der Technik ein Schema für eine Affinitätsreinigung bekannt ist. Als solchen Fusionspartner können Poly-His oder andere Tag-Peptide dienen, die zuvor beschrieben wurden, ebenso wie ein Fc-Baustein oder ein Zipper-Baustein.
Was die Reinigung betrifft, so ist dem Fachmann bekannt, dass Verfahren zur Reinigung von rekombinanten Polypeptiden oder deren Fragmenten variieren können, abhängig von solchen Faktoren, wie z.B. dem Typ der verwendeten Wirtszellen und ob, oder ob nicht, das rekombinante Polypeptid oder dessen Fragment in das Kulturmedium sekretiert wurde. Im allgemeinen kann das Polypeptid oder dessen Fragment, wenn keine Sekretion stattfand, aus den Wirtszellen oder, wenn das Pellinopolypeptid als lösliches Protein sekretiert worden war, aus dem Kulturmedium oder dem Überstand des Kulturmediums isoliert werden, worauf einer oder mehrere weitere Schritte folgen, nämlich Konzentrieren, Aussalzen, Ionenaustausch, hydrophobe Wechselwirkung, Affinitätschromatographie und/oder Größenausschlusschromato-graphie (size exclusion chromatography).
Was die spezielle Art und Weise betrifft, um diese Schritte durchzuführen, so kann das Kulturmedium zunächst mittels eines im Handel erhältlichen Proteinkonzentrationsfilters konzentriert werden, beispielsweise mittels einer Ultrafiltrationseinheit von Amocon oder Millipore Pellicon. Nach dem Konzentrieren kann das Konzentrat auf eine Reinigungsmatrix aufgebracht werden, beispielsweise auf ein Gelfiltrationsmedium. Alternativ kann man ein Anionenaustauschharz verwenden, z.B. eine Matrix oder ein Substrat mit anhängenden Diethylaminoethyl (DEAE) Gruppen. Die Matrices können Polyacrylamid, Agarose, Dextran, Zellulose oder andere üblicherweise bei der Proteinreinigung verwendete Materialien sein.
Alternativ kann man auch einen Schritt mit Kationenaustausch durchführen. Zu den geeigneten Kationenaustauschern gehören verschiedene unlösliche Matrices, die Sulfopropyl- oder Carboxymethylgruppen enthalten. Zusätzlich kann ein Chromatofokussierschritt (chromatofocusing Step) vorgesehen werden. Alternativ kann Chromatographie mit hydrophober Wechselwirkung stattfinden. Hierfür geeignete Matrices können an Harz gebundene Phenyl- oder Octylgruppen enthalten. Weiterhin kann man Affinitätschromatographie mit einer Matrix anwenden, die das rekombinante Protein selektiv bindet. Beispiele für solche Harze sind Lektinsäulen, Farbstoffsäulen (dye columns) und Metallionen chelatisierende Säulen.
Schließlich kann ein Schritt, oder können mehrere Schritte, mit Hochleistungsflüssigkeitschromatographie mit Phasenumkehr (RP-HLC) unter Verwendung von hydrophoben HPLC-Medien (wie z.B. Silikagel oder Polymerharze mit anhängenden Methyl-, Octyl-, Octadecyl- oder anderen aliphatischen Gruppen) durchgeführt werden, um die Polypeptide weiter zu reinigen. Einige oder alle dieser aufgezählten, in verschiedenen Kombinationen möglichen Reinigungsschritte sind gut bekannt und können angewandt werden, um ein isoliertes und gereinigtes Polypeptid herzustellen.
Es ist auch möglich, mit einer Affinitätssäule zu arbeiten, die ein Polypeptid bindendes Protein nach der Erfindung enthält, wie z.B. einen monoklonalen Antikörper gegen ein Polypeptid nach der Erfindung, um eine Affinitätsreinigung der exprimierten Polypeptide durchzuführen. Nach diesem Aspekt der Erfindung können bindende Proteine, wie z.B. Antikörper gegen Pellino, oder andere Pellino bindende Moleküle, auf einem festen Träger gebunden werden, beispielsweise auf einer Matrix für Säulenchromatographie oder einem ähnlichen, für die Identifizierung, Abtrennung oder Reinigung von Pellino geeigneten Substrat. Die Adhäsion von Pellino auf der Kontaktoberfläche eines festen Substrats kann auf jede geeignete, bekannte Art und Weise erreicht werden. Beispielsweise können magnetische Mikrokugeln mit Pellino bindenden Proteinen (oder anderen Pellino bindenden Molekülen) beschichtet werden und in dem Inkubationsgefäß durch ein magnetisches Feld gehalten werden.
Pellinopolypeptide enthaltende Lösungen werden mit der festen Phase unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die die Bindung der Pellinopolypeptide an ihre Bindungspartner fördern, und das nicht gebundene Material wird dann fort gewaschen. Verfahren zur Ablösung von positiv selektierten Peptiden von der festen Phase sind in der Technik bekannt und schließen z.B. die Verwendung eines Eluierungspuffers mit hohem Salzgehalt (high salt solution buffer) ein, gefolgt von einer Dialyse in einen Puffer mit niedrigerem Salzgehalt oder einer Veränderung des pH (oder einer anderen, von der verwendeten Affinitätsmatrix abhängigen Eigenschaft), oder einer kompetitiven Entfernung unter Verwendung eines natürlich vorkommenden Substrats für den Affinitätsbaustein. Die Methoden sind vorteilhaft nicht schädlich für die Pellinopolypeptide.
Bei einem beispielhaften Verfahren können Pellinopolypeptide enthaltende Lösungen zuerst mit einem biotinylierten Bindungspartner für Pellino inkubiert werden. Die Inkubationszeiten betragen typischerweise mindestens eine Stunde, um eine genügende Bindung der Polypeptide nach der Erfindung sicherzustellen. Die entstehende Mischung wird dann durch eine Säule geleitet, die mit Beads beschickt ist, welche mit Avidin beschichtet wurden, wobei die hohe Affinität von Biotin und Avidin bewirkt, dass die Pellinopolypeptide auf den Beads gebunden werden. Die Verwendung von mit Avidin beschichteten Beads ist in der Technik bekannt. Siehe Berenson et al., J. Cell Biochem. 10D:239 (1986). Das Waschen des ungebundenen Materials und die Ablösung der gebundenen Zellen erfolgt nach bekannten Methoden.
Der gewünschte Reinheitsgrad hängt von der beabsichtigten Verwendung des Proteins ab. Ein relativ hoher Reinheitsgrad ist z.B. erwünscht, wenn das Polypeptid in vivo verabreicht werden soll. In einem solchen Fall wird das Polypeptid so weit gereinigt, dass bei der Gelelektrophorese an einem SDS-Polyacrylamidgel (SDS-PAGE) keine Banden nachweisbar sind, die anderen Proteinen entsprechen. Es wird für einen Fachmann auf dem betreffenden Gebiet der Technik erkennbar sein, dass infolge verschiedener Glykosylierung, verschiedener Ereignisse nach der Translation usw. bei SDS-PAGE mehrere dem Polypeptid entsprechende Banden sichtbar werden können. Am meisten wird bevorzugt, das Polypeptid nach der Erfindung so weit zu reinigen, dass es im wesentlichen homogen ist, was durch eine einzige Proteinbande bei der Analyse mittels SDS-PAGE angezeigt wird. Die Proteinbande kann durch Anfärben mittels Silber oder Comassie Blue oder, wenn das Protein radioaktiv markiert ist, durch Autoradiographie sichtbar gemacht werden.
VERWENDUNG VON PELLINO-NUKLEINSÄUREN ODER -OLIGONUKLEOTIDEN
Zu den Verwendungen der Nukleinsäuren nach der Erfindung gehört die Verwendung von Fragmenten als Sonden oder Primer. Diese Fragmente enthalten im allgemeinen mindestens etwa 17 aufeinander folgende Nukleotide einer DNA-Sequenz. Bei anderen Ausführungsformen umfasst ein DNA-Fragment mindestens 30 oder mindestens 60 aufeinander folgende Nukleotide einer DNA-Sequenz.
Weil Homologe von Pellinoproteinen, die von anderen Säugerspezies stammen, hierin in Betracht gezogen werden, können Sonden, die auf den DNA-Sequenzen gemäß SEQ ID NOs:I, 3, 5, 7 oder 11 basieren, verwendet werden, um cDNA-Bibliotheken zu durchsuchen, die von anderen Säugerspezies abgeleitet sind, wobei übliche, die Speziesgrenzen überschreitende Hybridisierungstechniken (crossspecies hybridization) angewandt werden.
Auf der Grundlage der Kenntnis des genetischen Codes und in Kombination mit den zuvor offenbarten Aminosäuresequenzen können Sätze von degenerierten Oligonukleotiden hergestellt werden. Diese Oligonukleotide sind als Primer z.B. bei der Polymerasekettenreaktion (PCR) brauchbar, wodurch DNA-Fragmente isoliert und amplifiziert werden.
Alle oder ein Teil der Nukleinsäuren gemäß SEQ ID NOs:I, 3, 5, 7 oder 11, mit Einschluss von Oligonukleotiden, können von einem Fachmann verwendet werden, um unter Anwendung gut bekannter Techniken das humane Chromosom und den spezifischen Locus zu identifizieren, der die DNA eines Mitglieds der Pellinofamilie enthält. Zu den brauchbaren Techniken zählen, wenn auch nicht hierauf beschränkt, die Verwendung der Sequenz oder von Teilen davon, mit Einschluss von Oligonukleotiden, als Sonden in verschiedenen gut bekannten Verfahren, wie z.B. Stralilungshybridkartierung (radiation hybrid mapping) mit hoher Auflösung (resolution), in situ-Hybridisierung mit Chromosomen (chromosome spreads) (moderate Auflösung) und Southern Blot-Hybridisierung mit Hybridzelllinien, die individuelle humane Chromosomen enthalten (niedrige Auflösung).
Beispielsweise können Chromosomen durch Strahlungshybridisierung kartiert werden, unter Verwendung von Primern, die innerhalb eines vermuteten Exons des interessierenden Gens liegen und die ein Produkt von humaner genomischer DNA amplifizieren, aber keine genomische DNA von anderen Spezies amplifizieren. Die Ergebnisse der PCR werden in einen Datenvektor konvertiert, und die chromosomale Zuordnung und die Platzierung in Bezug auf bekannte Sequence Tag Site (STS) Marker auf der Strahlungshybridkarte (radiation hybrid map) wird bestimmt. Humanes Pellino-1 ist auf dem Chromosom 2, Plätze (places) 7.15 cR von WI-6130 kartiert.
Die Nukleinsäuren der SEQ ID NOs:I, 3, 5, 7 und 11 oder Fragmente davon können vom Fachmann unter Verwendung gut bekannter Techniken benutzt werden, um Anomalien zu analysieren, die mit der Genkartierung auf einem Chromosom verbunden sind, das ein für Pellino kodierendes Gen enthält. Dadurch wird es möglich, Bedingungen zu unterscheiden, unter denen dieser Marker anders angeordnet oder deletiert wird. Weiterhin können Nukleotide der SEQ ID NOs:I, 3, 5, 7 oder 11 oder ein Fragment davon als Positionsmarker benutzt werden, um andere Gene mit unbekannter Lokation zu kartieren.
Die DNA kann benutzt werden, um Behandlungen für Krankheiten zu entwickeln, die (direkt oder indirekt) durch schadhafte Gene oder ungenügende Mengen an den Genen vermittelt werden, die den Nukleinsäuren nach der Erfindung entsprechen. Die hierin offenbarten natürlichen Nukleotidsequenzen ermöglichen die Entdeckung von schadhaften Genen sowie deren Ersatz durch oder Ergänzung mit normale(n) Gene(n) mittels verschiedener Verfahren der Gentherapie, die in der Technik bekannt sind.
Schadhafte Gene können in diagnostischen in vitro Assays und durch einen Vergleich einer hierin offenbarten natürlichen Nukleotidsequenz mit derjenigen eines Gens nachgewiesen werden, das von einer Person stammt, bei der ein Verdacht auf einen Defekt an diesem Gen besteht.
Zu den anderen brauchbaren Fragmenten der Nukleinsäuren gehören Antisinn- oder Sinn-Oligonukleotide, die eine einsträngige Nukleinsäuresequenz (entweder RNA oder DNA) enthalten, die in der Lage ist, an Zielsequenzen zu binden, nämlich an mRNA (Sinn) oder DNA (Antisinn). Antisinn- oder Sinn-Oligonukleotide nach der vorliegenden Erfindung enthalten ein Fragment der DNA gemäß den SEQ ID NOs:I, 3, 5, 7 oder 11. Ein solches Fragment umfasst im allgemeinen mindestens etwa 17 Nukleotide, vorteilhaft von etwa 17 bis etwa 30 Nukleotide. Die Methode, ein Antisinn- oder Sinn-Oligonukleotid auf der Grundlage einer für ein gegebenes Protein kodierenden cDNA zu entwickeln, ist z.B. von Stein und Cohen, Cancer Res. 48:2659, 1988) und von van der Krol et al. (Bio Techniques 6:958, 1988) beschrieben. Die Bindung von Antisinn- oder Sinn-Oligonukleotiden an Nukleinsäurezielsequenzen führt zur Bildung von Komplexen, die die Expression von Proteinen auf eine von mehreren möglichen Mechanismen blockieren oder inhibieren, wie im U.S. Patent Nr. 5,783,665, erteilt am 21. Juli 1998, diskutiert wird. Organische Bausteine und andere Bausteine, die die Affinität des Oligonukleotids zu der Nukleinsäurezielsequenz verstärken, oder einschließende Agenzien können an die Sinn- oder Antisinn-Oligonukleotide angefügt werden, um die Bindungsspezifitäten der Antisinn- oder Sinn-Oligonukleotide für die Nukleinsäurezielsequenz zu modifizieren. Die Antisinn- oder Sinn-Oligonukleotide können auch durch bekannte Methoden für den Gentransfer in eine Zelle eingeführt werden, die die Nukleinsäurezielsequenz enthält, beispielsweise durch Lipofektion, CaP04-vermittelte DNA-Transfektion, Elektroporation oder durch Verwendung von Gentransfervektoren, wie z.B. das Eppstein-Barr-Virus. Sinn- oder Antisinn-Oligonukleotide können auch durch Bildung eines Konjugats mit einem einen Liganden bindenden Molekül in eine Zelle eingeführt werden, die die Nukleinsäurezielsequenz enthält, wie in WO 91/04753 beschrieben ist. Alternativ kann ein Sinn- oder Antisinn-Oligonukleotid durch Bildung eines Oligonukleotid-Lipid-Komplexes in eine Zelle eingeführt werden, die die Nukleinsäurezielsequenz enthält, wie in WO 90/10448 beschrieben ist.
Die DNAs nach der Erfindung werden auch bei der Entwicklung von transgenen und/oder knock out-Zellen und -Tieren von Nutzen sein. Dem Fachmann sind verschiedene Methoden bekannt, durch die solche Zellen oder Tiere erzeugt werden können; eine beispielhafte Methode ist im U.S. Patent Nr. 5,565,321, erteilt am 15. Oktober 1996, beschrieben. Die hierin beschriebene Technik kann durch Routineexperimente mit den Sequenzen nach der Erfindung verwendet werden.
VERWENDUNGEN VON PELLINOPOLYPEPTIDEN
Weil Pellinopolypeptide homolog zu den Pellinpolypeptiden von Drosophila sind, wichtigen Molekülen für die Signalkaskade für die IL-IR/Toll-Rezeptorfamilie, können niedermolekulare (small molecule) Inhibitoren ihrer Funktion oder Proteinassoziationen (oder Antisinn- oder andere Inhibitoren für ihre Synthese) nützlich für die Behandlung von Autoimmunkrankheiten und/oder entzündlichen Krankheiten sein. Dementsprechend können die Pellinopolypeptide nach der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um einen Sreening-Assay zur Identifizierung von Verbindungen und kleinen Molekülen durchzuführen, welche die Polypeptide nach der gegenwärtigen Erfindung inhibieren (als Antagonisten) oder stimulieren (als Agonisten).
So können Polypeptide nach der Erfindung beispielsweise verwendet werden, um Antagonisten und Agonisten aus Zellen, zellfreien Präparationen, chemischen Bibliotheken und natürlichen Produktgemischen zu identifizieren. Die Antagonisten und Agonisten können natürliche oder modifizierte Substrate, Liganden, Enzyme, Rezeptoren usw. der Polypeptide nach der vorliegenden Erfindung sein, oder sie können strukturell oder funktionell mimetisch zu den Polypeptiden sein. Zu den potentiellen Antagonisten nach der Erfindung können kleine Moleküle, Peptide und Antikörper zählen, die an einem Bindungsort der erfindungsgemäßen Polypeptide oder ihrer Bindungspartner binden und dadurch den Bindungsort okkupieren. Dadurch besteht für die natürlichen Bindungspartner keine Möglichkeit zur Bindung, sodass die normale biologische Aktivität verhindert wird. Zu den potentiellen Agonisten gehören kleine Moleküle, Peptide und Antikörper, die an die Polypeptide nach der Erfindung oder an deren Bindungspartner binden und Wirkungen hervorbringen, die gleich groß sind wie oder größer sind als diejenigen Wirkungen, die durch die Bindung der Polypeptide nach der vorliegenden Erfindung hervorgebracht werden.
Kleinmolekulare Agonisten und Antagonisten haben üblicherweise ein Molekulargewicht unterhalb von 10K und können eine Anzahl von physikochemischen und pharmakologischen Eigenschaften besitzen, die die Penetration in die Zelle verstärken, die Beständigkeit gegen Abbau erhöhen und die physiologische Halbwertszeit verlängern (Gibbs, J. Pharmaceutical Research in Molecular Oncology, Cell, Band 79 (1994)). Antikörper, zu denen sowohl intakte Moleküle als auch Fragmente, wie z.B. die Fragmente Fab und F(ab)2, als auch von ihnen abgeleitete rekombinante Moleküle zählen, können verwendet werden, um an die Polypeptide nach der vorliegenden Erfindung zu binden und sie zu inhibieren, indem sie die Fortsetzung der Signalkaskade blockieren. Es ist vorteilhaft, dass die Antikörper humanisiert sind, und es ist vorteilhafter, dass die Antikörper human sind. Die Antikörper nach der vorliegenden Erfindung können nach jeder der vielen gut bekannten Methoden hergestellt werden.
Spezifische Sreeningmethoden sind in der Technik bekannt und zusammen mit integrierten automatischen Systemen und Sammlungen von chemischen Stoffen und Naturprodukten im Screening mit hohem Durchsatz extensiv einbezogen, so dass eine große Zahl von Testmolekülen innerhalb kurzer Zeit auf antagonistische oder agonistische Aktivität untersucht werden kann. Zu diesen Methoden gehören homogene Assayformate, wie z.B. Fluoreszenzresonanzenergietransfer, Fluoreszenzpolarisation, timeresolved Fluoreszenzresonanzenergietransfer, Scintillationsnäheassays (scintillation proximity assays), Reportergenassays, Fluoreszenz-quenched Enzymsubstrat, chromogenes Enzymsubstrat und Elektrochemolumineszenz, ebenso wie mehr traditionelle Assayformate, wie z.B. Enzym-verbundene Immunoabsorptionsassays (ELISA) oder Radioimmunassays.
Homogene Assays sind „Mix and Read" Assays, die sich sehr für automatische Anwendungen eignen, während heterologe Assays die Abtrennung des gebundenen Analyten durch komplexere Grundoperationen, wie z.B. Filtrieren, Zentrifugieren oder Waschen, erfordern. Diese Assays werden verwendet, um eine große Vielzahl von spezifischen biomolekularen Wechselwirkungen und deren Inhibierung durch kleine Moleküle zu entdecken, einschließlich von Protein-Protein-, Rezeptor-Ligand- und Enzym-Substrat-Wechselwirkungen usw. Diese Assaymethoden und -techniken sind in der Technik gut bekannt und eingehend in den folgenden Veröffentlichungen beschrieben: High Throughput Screening: The Discovery of Bioactive Substances, John P. Devlin (Herausgeber), Marcel Dekker, New York, 1997, ISBN: 0-8247-0067-8; und auf den Internetseiten lab-robotics-org und sbsonline.org. Die Screeningassays nach der vorliegenden Erfindung sind für das Screening von chemischen Bibliotheken mit hohem Durchsatz gut geeignet, und ebenso geeignet für die Identifizierung von kleinen Molekülen als Kandidaten für Wirkstoffe, Antikörper, Peptide und andere Antagonisten und/oder Agonisten.
Bei einer Ausführungsform einer Methode zur Identifizierung von Molekülen, die die Polypeptide inhibieren oder antagonisieren, setzt man ein Kandidatenmolekül einem Medium zu, welches Zellen enthält, die die Polypeptide nach der vorliegenden Erfindung exprimieren; verändert die Bedingungen in dem Medium so, dass ohne die Gegenwart des Kandidatenmoleküls die Polypeptide an ihre natürlichen Liganden, Substraten oder Effektormoleküle gebunden werden würden, und beobachtet die Bindung und die Stimulierung oder Inhibierung einer funktionellen Antwort. Die Aktivität der Zellen, die mit dem Kandidatenmolekül in Berührung gebracht wurden, kann dann mit der Aktivität von Zellen verglichen werden, die nicht mit dem Kandidatenmolekül in Berührung gebracht wurden, und Antagonisten oder Agonisten der Polypeptide nach der vorliegenden Erfindung können so identifiziert werden. Die Messungen der biologischen Aktivität können nach einer Reihe gut bekannter Methoden erfolgen, beispielsweise die Messung der Menge des vorhandenen Proteins (z.B. mittels eines ELISA) oder der Aktivierung der Proteine. Eine Abnahme der biologischen Stimulierung oder Aktivierung würde einen Antagonisten anzeigen. Eine Zunahme würde einen Agonisten anzeigen.
Screeningsassays können weiterhin so ausgestaltet werden, dass Moleküle gefunden werden, die die Aktivität der Polypeptide nach der vorliegenden Erfindung nachahmen. Moleküle, die die biologische Aktivität eines Polypeptids nachahmen, können von Nutzen sein, wenn es gilt, die biologische Aktivität des Peptids zu steigern. Um Verbindungen für therapeutisch aktive Wirkstoffe zu identifizieren, die die biologische Aktivität eines Polypeptids nachahmen, nuss zunächst untersucht werden, ob ein Kandidatenmolekül an das Polypeptid bindet. Ein bindendes Kandidatenmolekül wird dann einem biologischen Assay zugesetzt, um seine biologischen Wirkungen zu bestimmen. Die biologischen Wirkungen des Kandidatenmoleküls werden dann mit denen des Polypeptids oder der Polpeptide verglichen.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung betrifft die Verwendung von Pellinopolypeptiden für das Studium der Signaltransduktion in der Zelle. Die zelluläre Signalweiterleitung ist oft mit einer molekularen Aktivierungskaskade verbunden, innerhalb derer ein Rezeptor ein durch eine Rezeptor-Liganden-Beziehung vermitteltes Signal weiterleitet, indem er intrazelluläre Kinasen spezifisch aktiviert, welche dann Zielsubstrate phosphorylieren. Diese Substrate können selbst Kinasen sein, die nach der Phosphorylierung aktiviert werden. Alternativ können sie Adaptormoleküle sein, die die nachfolgende (downstream) Signalweiterleitung durch eine auf die Phosphorylierung folgende Wechselwirkung zwischen Proteinen erleichtern. Dementsprechend können die neuen Pellinopolypeptide als Reagenzien zur Identifizierung von neuen Molekülen verwendet werden, die an der Signaltransduktion beteiligt sind.
Die Polypeptide nach der Erfindung sind bei der IL-1-Signalkaskade beteiligt und können als solche zur Inhibierung der Signaltransduktion benutzt werden. Daher verwendet man sie in in vitro-Screeningsassays und bei der in vivo-Therapie. Da die Therapeutika durchgängig durch Zellmembranen sind, können die Pellinopolypeptide und deren Fragmente verabreicht werden, um die IL-IR-vermittelte Signaltransduktion zu agonisieren oder zu antagonisieren; sie stellen also nützliche Immunoregulatoren dar. Verschiedene Zusammensetzungen von Polypeptiden nach der Erfindung auf Basis von Liposomen werden hierin in Aussicht genommen (envisioned herein).
Zusammensetzungen nach der vorliegenden Erfindung können Polypeptide in jeder der hierin beschriebenen Formen enthalten, beispielsweise als natürliche Proteine, Varianten, Derivate, Oligomere und biologisch aktive Fragmente. In besonderen Ausführungsformen enthalten die Zusammensetzungen ein lösliches Polypeptid oder ein Oligomer, das lösliche Pellinopolypeptide einschließt.
Durch diese Anmeldung werden Zusammensetzungen zur Verfügung gestellt, die eine wirksame Menge eines Polypeptids nach der Erfindung in Kombination mit anderen Komponenten enthalten, beispielsweise mit einem physiologisch akzeptablen Trägerstoff oder Hilfsstoff Die Polypeptide können nach bekannten Methoden formuliert werden, um pharmazeutisch brauchbare Zusammensetzungen zu schaffen. Sie können in Mischungen kombiniert werden, entweder als einziger aktiver Wirkstoff oder zusammen mit anderen bekannten, für eine gegebene Indikation geeigneten aktiven Materialien mit pharmakologisch akzeptablen Verdünnungsmitteln (wie z.B. Kochsalzlösung, Tris-HCl, Acetat- und Phosphat-gepufferte Lösungen), Konservierungsstoffen (wie z.B. Thiomersal, Benzylalkohol und Parabene), Emulgatoren, Solubilisierungsmitteln, Adjuvantien und/oder Trägerstoffen. Geeignete Formulierungen für pharmazeutische Zusammensetzungen schließen diejenigen ein, die in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Ausgabe, Mack Publishing Company, Easton, PA beschrieben sind.
Weiterhin können diese Zusammensetzungen mit Polyethylenglykol (PEG), Metallionen komplexiert oder in Polymere inkorporiert werden, beispielsweise in Polyessigsäure, Polyglykolsäure, Hydrogele, Dextran usw., oder in Liposome, Mikroemulsionen, Micellen, unilamellare oder multilamellare Vesikel, „Erythrocyten ghosts" oder Sphäroblasten inkorporiert werden. Solche Zusammensetzungen werden den physikalischen Zustand, die Löslichkeit, Stabilität, die Freisetzungsrate in vivo und die Abklingrate in vivo (clearance rate in vivo) beeinflussen und werden daher der beabsichtigten Anwendung entsprechend gewählt.
Die Zusammensetzungen nach der Erfindung können auf jede geeignete Weise verabreicht werden, wie z.B. topisch, parenteral oder durch Inhalation. Die Bezeichnung „parenteral" schließt Injektion, z.B. subkutane, intravenöse oder intramuskuläre Injektion, sowie eine lokalisierte Verabreichung ein, z.B. am Ort der Krankheit oder Verletzung ein (z.B. in die Herzkranzgefäße, in einen Tumor oder eine Injektion in ein Gelenk, das eine entzündliche Reaktion aufweist). Eine fortgesetzte Freisetzung aus einem Implantat wird ebenfalls in Erwägung gezogen. Der Fachmann auf dem betreffenden Gebiet wird erkennen, dass die geeigneten Dosierungen variieren werden, in Abhängigkeit von solchen Faktoren, wie z.B. der Art der zu behandelnden Krankheit, dem Körpergewicht, dem Alter und dem Allgemeinzustand des Patienten sowie der Art der Verabreichung. Vorläufige Dosen können aufgrund von Tierversuchen festgelegt werden, und die Anpassung der Dosen für die Verabreichung an Menschen wird entsprechend der für die Behandlung von Krankheiten gültigen Praxis vorgenommen.
Die Polypeptide nach der vorliegenden Erfindung können auch nach der Methode der Proteintransduktion verabreicht werden. Bei dieser Methode wird das Pellinopolypeptid kovalent mit einer Proteintransduktionsdomäne (PTD) verbunden, beispielsweise, aber nicht ausschließlich mit TAT, Antp oder VP22 (Schwarze et al., 2000, Cell Biology 10:290-295). Die mit einer PTD verbundenen Pellinopolypeptide können dann in Zellen transduziert werden, indem man sie dem Gewebekulturmedium zusetzt, in dem sich die Zellen befinden (Schwarze et al., 1999, Science 285:1569; Lindgren et al., 2000, TiPS 21:99; Derossi et al., 1998, Cell Biology 8:84; WO 00/34308; WO 99/29721; und WO 99/10376). Überdies ist gefunden worden, dass für ein Polypeptid kodierende DNA einem Säuger auf eine solche Art und Weise zugeführt werden kann, dass sie von Zellen aufgenommen und exprimiert wird. Das resultierende Protein ist dann verfügbar, um eine therapeutische Wirkung auszuüben. Dementsprechend werden auch Zusammensetzungen in Betracht gezogen, die Nukleinsäuren in physiologisch akzeptablen Formulierungen enthalten. Beispielsweise kann DNA zur Injektion formuliert werden.
ANTIKÖRPER
Durch die Erfindung werden mit den Polypeptiden nach der Erfindung immunoreaktive Antikörper zur Verfügung gestellt. Die Antikörper binden über die Antigenbindungsorte des Antikörpers spezifisch an die Polypeptide (im Gegensatz zu einer nicht-spezifischen Bindung). Somit können die hierin beschriebenen Polypeptide, Fragmente, Varianten, Fusionsproteine usw. als „Immunogene" für die Herstellung von Antikörpern benutzt werden, die mit ihnen immunoreaktiv sind. Genauer gesagt enthalten die Polypeptide, deren Fragmente, Varianten, Fusionsproteine usw. antigenische Determinanten oder Epitope, die die Bildung von Antikörpern auslösen.
Diese antigenischen Determinanten oder Epitope können entweder linear oder konformational (diskontinuierlich) sein. Lineare Epitope sind aus einer einzelnen Sektion von Aminosäuren des Polypeptids zusammengesetzt, während konformationale oder diskontinuierliche Epitope aus Aminosäuresektionen aus verschiedenen Regionen der Polypeptidkette zusammengesetzt sind, die infolge einer Faltung des Proteins in enge räumliche Nähe gebracht werden. (C.A. Janeway, Jr. Und P. Travers, Immuno Biology 3:9 (Garland Publishing Inc., 2. Auflage, 1996)). Weil gefaltete Proteine komplexe Oberflächen besitzen, ist die Anzahl der verfügbaren Epitope recht groß. Infolge der Konformation des Proteins und sterischer Hinderung ist jedoch die Anzahl der Antikörper, die tatsächlich an die Epitope binden, kleiner als die Anzahl der verfügbaren Epitope (C.A. Janeway und P. Travers, Immuno Biology 2:14 (Garland Publishing, Inc., 2. Auflage 1996)). Epitope können nach jeder der in der Technik bekannten Methoden identifiziert werden.
Somit bezieht sich ein Aspekt der vorliegenden Erfindung auf die antigenischen Epitope der Polypeptide nach der Erfindung. Diese Epitope sind wertvoll für die Herstellung von Antikörpern, insbesondere von monoklonalen Antikörpern, wie in der Folge näher beschrieben werden wird. Weiterhin können Epitope der Polypeptide nach der Erfindung in der Forschung als Reagenzien für Assays verwendet werden und um spezifische bindende Antikörper von Substanzen, wie z.B. polyklonalen Seren oder Überständen von kultivierten Hybridoma, zu reinigen. Solche Epitope oder deren Varianten können unter Verwendung von Methoden hergestellt werden, die in der Technik gut bekannt sind, wie z.B. die Synthese in fester Phase, chemische oder enzymatische Spaltung eines Polypeptids oder mittels rekombinanter DNA-Technologie.
Was die Antikörper betrifft, die durch die Epitope der Polypeptide nach der Erfindung hervorgerufen werden, so gilt, dass, unabhängig davon, ob die Epitope isoliert werden oder ein Teil des Polypeptids bleiben, sowohl monoklonale als auch polyklonale Antikörper nach üblichen Techniken hergestellt werden können. Siehe z.B. Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet et al. (Herausgeber), Plenum Press, New York (1980)); und Antibodies: A Laboratory Manual Harlow und Land (Herausgeber), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988).
Hybridomazelllinien, die monoklonale Antikörper erzeugen, welche spezifisch für die Polypeptide nach der Erfindung sind, werden ebenfalls hierin in Erwägung gezogen. Solche Hybridoma können nach üblichen Verfahren hergestellt und identifiziert werden. Bei einem der Verfahren zur Herstellung einer solchen Hybridomazelllinie immunisiert man ein Tier mit einem Polypeptid oder einer DNA, die für ein Polypeptid kodiert; erntet Milzzellen von dem immunisierten Tier; fusioniert diese Milzzellen mit einer Myelomzellinie und erzeugt dadurch Hybridomazellen; und identifiziert eine Hybridomazelllinie, welche monoklonale Antikörper erzeugt, die an das Polypeptid binden. Die monoklonalen Antikörper können nach üblichen Techniken gewonnen werden.
Die monoklonalen Antikörper nach der vorliegenden Erfindung schließen chimärische Antikörper ein, d.h. humanisierte Versionen von murinen monoklonalen Antikörpern. Diese humanisierten Antikörper können nach bekannten Techniken hergestellt werden und bieten den Vorteil einer verminderten Immunogenität, wenn die Antikörper Menschen verabreicht werden. Bei einer Ausführungsform umfasst ein humanisierter monoklonaler Antikörper die variable Region eines murinen Antikörpers (oder nur dessen Antigen-bindenden Ort) sowie eine konstante Region, die von einem humanen Antikörper abgeleitet ist. Alternativ kann ein humanisiertes Antikörperfragment den Antigen-bindenden Ort eines murinen monoklonalen Antikörpers sowie ein variables Regionsfragment (ohne einen Antigen-bindenden Ort), das von einem humanen Antikörpers abgeleitet ist, enthalten. Zu den Verfahren zur Herstellung von chimärischen und weiterhin genetisch veränderten monoklonalen Antikörpern gehören die Verfahren, die von Richmann et al. in Nature 332:323, 1988; Liu et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439, 1987; Larrick et al. in Bio/Technology 7:934 (1989) und Winter und Harris in TIPS 14:139, Mai 1993 beschrieben wurden. Verfahren zur transgenen Herstellung von Antikörpern sind in GB 2,272,440 , U.S. Patent Nr. 5,569,825 und U.S. Patent Nr. 5,545,806 sowie in den verwandten Patenten offenbart, die deren Priorität beanspruchen.
Antigen-bindende Fragmente dieser Antikörper, die nach üblichen Methoden hergestellt werden können, sind ebenfalls in die vorliegende Erfindung einbezogen. Zu den Beispielen für solche Fragmente gehören, wenn auch nicht ausschließlich, Fab- und F(ab)2-Fragmente. Auch mittels gentechnischer Methoden erzeugte Fragmente von Antikörpern und Derivate davon werden durch die Erfindung zur Verfügung gestellt.
Bei einer Ausführungsform sind die Antikörper spezifisch für die Polypeptide nach der vorliegenden Erfindung und gehen keine Kreuzreaktion mit anderen Proteinen ein. Screeningverfahren zur Identifizierung solcher Antikörper sind gut bekannt und können beispielsweise mit Immunoaffinitätschromatographie verbunden sein.
Die Antikörper nach der Erfindung können in Assays verwendet werden, um die Anwesenheit der Polypeptide oder von deren Fragmenten nach der Erfindung festzustellen, sei es in vivo oder in vitro. Die Antikörper können auch verwendet werden, um Polypeptide oder deren Fragmente nach der Erfindung durch Immunoaffinitätschromatographie zu reinigen.
Die folgenden Beispiele werden gegeben, um besondere Ausführungsformen der Erfindung zu erläutern und sollen nicht als den Umfang der Erfindung limitierend ausgelegt werden.
Beispiel 1: Identifizierung von Pellinonukleinsäure- und -polypeptid-Sequenzen
Die Polynukleotidsequenzen von ESTs, die aus dendritischen Zellen der Maus isoliert wurden, identifizierten zwei Klone, die offene Leseraster mit einem hohen Grad von Ähnlichkeit mit dem Drosophila-Protein Pellino zeigten (Grosshans et al., supra). Geeignete flankierende PCR-Primer wurden konstruiert, und eine neue Nukleinsäure wurde aus einer murinen cDNA-Bibliothek amplifiziert und kloniert: die Nukleotidsequenz und die durch sie kodierte Aminosäuresequenz dieses Klons, Pellino-1 genannt (zuvor als Conserved Inflammatory Signal Target-1 bezeichnet), sind in SEQ ID NO:1 bzw. SEQ ID NO:2 wiedergegeben. Humane Sequenzen aus den High Throughput Genomic (HTG) und EST- Divisions der öffentlichen Datenbank GenBank wurden mit murinem Pellino-1 verglichen, und ein offenes Leseraster für das humane Pellino-1-Homologe wurde zusammengestellt. Auf der Basis dieser humanen Sequenz wurden PCR-Primer konstruiert, und ein cDNA-Klon wurde durch PCR-Amplifizierung aus einer cDNA-Bibliothek von humanen dermalen Fibroblasten isoliert. Die Nukleotid- und die Aminosäuresequenz dieses Proteins sind in SEQ ID NO:3 bzw. SEQ ID NO:4 dargestellt. Danach haben Rich et al. die kodierende und die Aminosäuresequenz von „humanem Pellino" (GenBank Zugangsnummern AJ278859 und CAC04320, 23. August 2000) publiziert; die Aminosäuresequenz des „humanen Pellino" Polypeptids ist identisch mit der des humanen Pellino-1 (SEQ ID NO:4), außer einer Substitution von Ser durch Phe in der Position 11. Der Unterschied zwischen dem „humanen Pellino" und der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:4 kann eine natürlich vorkommende allelische Variation der Nukleinsäuren reflektieren, die innerhalb der humanen Population für diese Aminosäuresequenzen kodieren. Partielle Pellino-1-Aminosäuresequenzen sind auch in WO 2000/58350, EP 1 074 617 und WO 2001/09318 veröffentlicht.
Durch Abfrage von öffentlichen EST-Datenbanken wurde ein Teil eines zweiten, verwandten Gens, als Pellino-2 bezeichnet, in der Maus und im Menschen identifiziert. Die Aminosäuresequenz von Pellino-2 ist zu 80% identisch mit den entsprechenden Teilen von Pellino-1. Geeignete Primer wurden konstruiert, und die DNA von Pellino-2 wurde im wesentlichen so kloniert, wie das für Pellino-1 beschrieben wurde. Die Nukleotid- und die Aminosäuresequenz von murinem Pellino-2 sind in SEQ ID NO:5 bzw. SEQ ID NO:6 wiedergegeben. Die vorhergesagten Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von humanem Pellino-2 sind in SEQ ID NO:7 und SEQ ID NO:8 dargestellt.
In einem von Celera Genomics (Rockville, Maryland) erhaltenen Datensatz war eine Liste von Aminosäuresequenzen enthalten, die als vom humanen Genom kodierend vorhergesagt waren. Dieser Datensatz wurde mittels eines BLAST-Algorithmus durchsucht, um Pellinopolypeptidsequenzen zu identifizieren, und mehrere Aminosäureteilsequenzen wurden gefunden, die mit einem neuen humanen Pellinopolypeptid, Pellino-3, verwandt zu sein schienen. Ein Vergleich dieser partiellen Aminosäuresequenzen von Pellino-3 mit genomischen und cDNA-Sequenzen erlaubte es, die vorhergesagten Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von humanem Pellino-3, SEQ ID NO:11 bzw. SEQ ID NO:12, zu konstruieren. Zwei mögliche allelische Variationen sind innerhalb der Aminosäuresequenz von humanem Pellino-3 (SEQ ID NO:12) entdeckt worden: Eine Deletion von Leu in Position 96 und eine Substitution von Arg durch Ala in Position 353.
Die Aminosäuresequenzen von murinem (Mm") und humanem („Hs") Pellino-1- und Pellino-2-Polypeptid sowie von humanem Pellino-3-Polypeptid (SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8 und SEQ ID NO:12) wurden mit den Aminosäuresequenzen von Pellino-verwandten Pellinopolypeptiden von anderen Spezies (Drosophila melanogaster, „Dm"; Ciona intestinalis „Ci",SEQ ID NO:14 und Caenorhabditis elegans „Ce" SEQ ID NO:15) unter Verwendung des „pretty" Multiple Sequence Alignment Programms mit einer Aminosäureähnlichkeitsmatrix (amino acid similarity scoring matrix) = blosum62, Gap Creation Penalty = 8 und Gap Extension Penalty = 2 verglichen. Die Zuordnung dieser Sequenzen wird in Tabelle 1 wiedergegeben und zeigt in der Zeile „consensus" die Konsensaminosäuren, die bei mindestens drei der Aminosäuresequenzen der Zuordnung identisch sind. Die in großen Buchstaben wiedergegebenen Aminosäuren sind diejenigen, die Konsensaminosäuren, wie zuvor definiert, sind. Pellino-1 und -2 zeigen 82% Identität auf der Aminosäureebene, und der Grad der Konservierung zwischen humanem und murinem Pellino ist außerordentlich hoch; in nur einer Aminosäure unterscheiden sich murines und humanes Pellino-1, und Pellino-2 ist zwischen diesen beiden Spezies zu 95% konserviert. Die vorhergesagte Aminosäuresequenz von Pellino-3 ist zu 70 bzw. 71% identisch mit humanem Pellino-1 bzw. -2. Es gibt ein überraschendes Ausmaß an Ähnlichkeit z.B. zwischen humanem Pellino-1 und dem homologen Protein von C. elegans (SEQ ID NO:15), bei denen 44% der Aminosäuren identisch sind und die 53% ähnliche Aminosäuren gemeinsam haben. Eine kursorische Inspektion der Zuordnung zeigt klar, dass die Konservierung der Sequenzen nicht in bestimmten Regionen des Pellinoproteins konzentriert ist, sondern sich über die gesamte Länge der Ketten erstreckt. Dieser Umstand und die Tatsache, dass all die Pellinopolypeptide (mit Ausnahme von Drosophila Pellino und humanem Pellino-3, die kleine N-terminale Anfügungen aufweisen) von sehr ähnlicher Größe sind, lassen die Annahme zu, dass (1) alle Teile des Proteins an seiner natürlichen Funktion beteiligt sind und (2) indem Polypeptid nur wenige oder keine Aminosäuren existieren, die für diese natürliche Funktion unwesentlich sind. Es gibt eine besonders gut konservierte zentrale Domäne, die sich von der Aminosäure 132 bis zur Aminosäure 193 einschließlich in Pellino-1 erstreckt (SEQ ID NOs:2 und 4; entsprechend den Aminosäuren 134 bis einschließlich 195 in SEQ ID NO:8 und den Aminosäuren 158 bis einschließlich 219 in SEQ ID NO:12), sowie ein absolut konserviertes Motiv von der Aminosäure 245 bis einschließlich der Aminosäure 254 von SEQ ID NOs:2 und 4 (entsprechend den Aminosäure 247 bis einschließlich 256 von SEQ ID NO:8 und den Aminosäuren 271 bis einschließlich 280 in SEQ ID NO:12). In die C-terminalen Anteile der Pellinopolypeptide ist eine Reihe von kurzen, unveränderten Motiven eingestreut, in denen Cystein, Prolin, Histidin und große hydrophobe Bausteine überwiegen. Die Anordnung von einigen dieser konservierten Sequenzen, einschließlich eines Cys-Gly-His-Tripletts und zwei Cys-Pro-X-Cys-Motiven, erinnert an die Struktur der C3H4-RING-Finger-Unterfamilie der Zink-Finger Domänen, welche Protein-Protein- und Protein-DNA-Wechselwirkungen in einer unterschiedlichen Gruppe von Proteinen vermitteln, einschließlich von Tumorsuppressoren, Protoonkogenen, und signalgebenden Molekülen, einschließlich von TRAFs, mit spezifischen Beispielen von Polypeptiden, welche ähnliche RING-Finger-Domänen enthalten, einschließlich des humanem RING-Finger-Proteins-1 (hRINGI, GenBank NP_002922); des RING-Finger-Proteins des Huhns (C-RZF, GenBank 1589724); des humanem Proto-onkogens CBL (hC-CBL, GenBank P22681); des murinen TNFR2-TRAF Signalkomplexproteins (mc-IAF1, GenBank AAC42078); des humanen TRAF Wechselwirkungsproteins (hTRIP, GenBank NP_005870); des humanen TNF-Rezeptor-assoziierten Faktors 3 (hTRAF3, GenBank NP_003291); des humanen TNF-Rezeptor-assoziierten Faktors 2 (hTRAF2, GenBank NP_0066961); und des neuralisierten Proteins von Drosophila (neu; GenBank 535371). Die RING-Finger-artigen Domänen von Pellino umfassen die folgenden Aminosäuresequenzen: Aminosäure 333 bis einschließlich Aminosäure 398 von SEQ ID NOs:2 und 4; Aminosäure 335 bis einschließlich Aminosäure 400 von SEQ ID NO:8; und die entsprechende Region von SEQ ID NO:6; sowie die Aminosäure 360 bis einschließlich Aminosäure 425 von SEQ ID NO:12. Es gibt konservierte Cysteinbausteine innerhalb der RING-Finger-artigen Domänen der Pellinopolypeptide, die in den Positionen 333, 336, 367, 371, 395 und 398 der SEQ ID NOs:2 und 4 (und in den Positionen 335, 338, 369, 373, 397 und 400 von SEQ ID NO:8 sowie in den entsprechenden Positionen von SEQ ID NO:6 und in den Positionen 360, 363, 394, 398, 422 und 425 von SEQ ID NO:12) lokalisiert sind. In Pellinopolypeptiden sind die konservierten Cystein- und Histidinbausteine weiter voneinander entfernt als dies in klassischen RING-Finger Domänen, in denen die dazwischen liegenden Sequenzen die fingerartigen Loops bilden, der Fall ist. Das erste Cystein, das dem konservierten Histidin der kanonischen RING-Finger-Domäne folgt, fehlt bei Pellino, aber wir bemerken, dass es ein beinahe invariantes Histidin in Position 362 von SEQ ID NOs:2 und 4 (und in Position 364 von SEQ ID NO:8 sowie der entsprechenden Position von SEQ ID NO:6 und in der Position 389 von SEQ ID NO:12) gibt, das für eine Koordination an ein Metallion zur Verfügung stehen könnte. Ein zweites, invariantes Cys-Gly-His-Triplett an den Positionen 311 bis 313. von SEQ ID NOs:2 und 4 (und an den Aminosäuren 313 bis 315 in SEQ ID NO:8 sowie an den entsprechenden Positionen von SEQ ID NO:6 und an den Aminosäuren 338 bis 340 von SEQ ID NO:12) erstreckt die ZINK-Finger-Ähnlichkeit weiter in Richtung auf den N-Terminus. Daher scheint die C-terminale Region von Pellinopolypeptiden einen neuen Typ von Zink-Finger-artigen Domänen zu enthalten.
Regionen mit Aminosäureähnlichkeit zwischen Pellinopolypeptiden und einem Pockenvirusgen von Insekten, Melanoplus sanguinipes (MsEPV) ORF244, von dem man annimmt, dass es bei der Umgehung der Immunabwehr von Wirtsorganismen eine Rolle spielt, indem es deren defensive Proteinwechselwirkungen blockiert (Rich et al., Immunogenetics 52:145-149, 2000) sind ebenfalls identifiziert worden.
Es wird vorhergesagt, dass Substitutionen von Aminosäuren und andere Veränderungen (Deletionen, Insertionen usw.) in den Aminosäuresequenzen (SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12) wahrscheinlicher zu einer Änderung oder Unterbrechung der Aktivitäten der Pellinopolypeptide führen werden, wenn sie zu Änderungen der in Tabelle 1 mit großen Buchstaben wiedergegebenen Aminosäuren führen, und insbesondere dann, wenn durch diese Veränderungen nicht ein Baustein ersetzt wird, der in anderen Polypeptiden der in Tabelle 1 gezeigten Zuordnung in dieser Position vorkommt. Wenn umgekehrt eine Veränderung in der Aminosäuresequenz von Pellino vorgenommen wird, die zu einer Substitution von einer oder mehreren Aminosäuren der Konsensaminosäuresequenz gemäß Tabelle 1 führt, ist es weniger wahrscheinlich, dass eine solche Veränderung einen Einfluss auf die Funktion des Pellinopolypeptids hat. Ausführungsformen der Erfindung schließen Pellinopolypeptide und Fragmente von Pellinopolypeptiden ein, die veränderte Aminosäuresequenzen umfassen. Veränderte Pellinopolypeptidsequenzen weisen mindesten 30%, oder vorteilhaft mindestens 40%, oder vorteilhafter mindestens 50%, oder vorteilhafter mindestens 55%, oder vorteilhafter mindestens 60%, oder vorteilhafter mindestens 65%. oder vorteilhafter mindestens 70%, oder vorteilhafter mindestens 75%, oder vorteilhafter mindestens 80%, oder vorteilhafter mindestens 85%, oder vorteilhafter mindestens 90%, oder vorteilhafter mindestens 95%, oder vorteilhafter mindestens 97,5%, oder vorteilhafter mindestens 99%, oder insbesondere mindestens 99,5% Aminosäureidentität mit den Aminosäuresequenzen von Pellino gemäß den Sequenzen von SEQ ID NO:2, SEQ ID NO,4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8 und SEQ ID NO:12 auf.
Tabelle 1. Vergleich der Aminosäuresequenzen von Pellinopolypeptiden verschiedener Spezies
Tabelle 1. Vergleich der Aminosäuresequenzen von Pellinopolypeptiden verschiedener Spezies (Fortsetzung)
Tabelle 1. Vergleich der Aminosäuresequenzen von Pellinopolypeptiden verschiedener Spezies (Fortsetzung)
Die für humanes Pellino-1, -2 und -3 kodierenden Sequenzen mit öffentlich zugänglichen vorläufigen humanen genomischen DNA-Sequenzen verglichen, und die folgenden Contigs auf den Chromosomen 2, 14 und 11 wurden als Sequenzen enthaltend, die für Pellino-1, -2 bzw. -3 kodieren, identifiziert: AC013466.3 (Pellino-1), AL138995.4 und AL355073.4 (Pellino-2) und AC027270.3 (Pellino-3). Die ungefähren Positionen der Exons mit den für Pellino-1, -2 bzw. -3 kodierenden Sequenzen in den obigen Contigs sind der folgenden Tabelle zu entnehmen, zusammen mit ihren Lokationen in Bezug auf SEQ ID NOs:3, 7 und 11. Es ist bemerkenswert, dass die 5'- und 3'-untranslatierten Regionen sich längs der Contig-Sequenz über die Regionen, die den 5EQ ID NOs:3, 7 und 11 entsprechen, ^hinaus erstrecken können, was in der Tabelle durch die Klammern rund um die Endpunkte der Contigs angezeigt ist. Es ist auch bemerkenswert, dass die Positionen der Exongrenzen innerhalb der für humanes Pellino-1, -2 bzw. -3 kodierenden Sequenzen sehr hoch konserviert sind, wobei Unterschiede in der Größe der Exons vornehmlich bei Pellino-1 bestehen, Pellino-2 im Vergleich zu Pellino-1 zwei zusätzliche Kodons im Exon 1 aufweist, und Pellino-3 im Vergleich zu Pellino-1 27 zusätzliche Kodons im Exon 1 hat. Infolge der Vorläufigkeit der Sequenz und der Zusammenfügung der Contig-Sequenz sind die Exons ^innerhalb des Contigs nicht immer in der richtigen Ordnung oder der richtigen Orientierung in Bezug aufeinander angegeben und können Sequenzvariationen infolge nicht akkurater Sequenzdaten oder allelischer Polymorphie enthalten. Beispielsweise enthält das genomische Contig AC013466.3 im Exon 1 zwei Kopien der Pellino-1-Sequenz, die in Bezug aufeinander in entgegen gesetzter Orientierung vorliegen, wie in der folgenden Tabelle angezeigt ist.
Einander entsprechende Positionen von Exons mit Pellino-1-, -2- und -3-Genen in humanen Contigs und in cDNA-Sequenzen
Die Exons, welche für humanes Pellino-1 kodierende genomische Sequenzen enthalten, kartieren in der 2p13.3 Region des humanen Chromosoms 2. Humane Pellinonukleinsäuren, wie z.B. SEQ ID NO:3, und deren Fragmente sind für die cytologische Identifizierung dieser chromosomalen Region und für die genomische Kartierung von humanen genetischen Funktionsstörungen nützlich, wie z.B. für die folgenden Funktionsstörungen, die in dieser Region kartiert sind: Präeklampsia/Eciampsia-Gen 1, Alstrom-Syndrom, Parkinsons Krankheit Gen 3, orofaciales Cleft Gen 2 und Welanders distale Myopathie. Die genomischen Exons mit Sequenzen, die die für humanes Pellino-2 kodierenden Sequenzen enthalten, kartieren in der 14q24.3 Region des humanen Chromosoms 14. Humane Nukleinsäuren, wie z.B. SEQ ID NO:7, und deren Fragmente sind für die zytologische Identifizierung dieser chromosomalen Region und für die genomische Kartierung von humanen genetischen Funktionsstörungen nützlich, wie z.B. für die folgenden Funktionsstörungen, die in dieser Region kartiert sind: Achromatopsie-Gen 1, erbliche benigne Chorea, multinodulare Goiter, Myopathie (distal), Tyrosinämie vom Typ IB und Alzheimers Krankheit Gen 3. Die genomischen Sequenzen, die humane Pellino-3 Exons enthalten, kartieren in einer Region des humanen Chromosoms 11 zwischen 11.1 und 11q13, und es wird angenommen, dass sie sehr dicht an der 11q12.1 Region kartieren. Humane Pellinonukleinsäuren, wie z.B. SEQ ID NO:3, und deren Fragmente sind für die zytologische Identifizierung dieser chromosomalen Region und für die genomische Kartierung von humanen genetischen Funktionsstörungen nützlich, wie z.B. für die folgenden Funktionsstörungen, die in dieser Region kartiert sind: Osteoporose-Pseudoglioma-Syndrom und Spinocerebrales Ataxie-Gen 5. In einem kürzlich erschienenen Bericht (Schmitt-John et al., 2000, „Mouse Homolgue of the Drosophila Pellino Gene, Pli1 on Chr 11 is Affected in the Wobbler Mutant", Abstract B12, posted at Imgs.org/abstracts/2000-abstracts/toc_b.html) wird nahe gelegt, dass murines Pellino-1 möglicherweise das Protein ist, das in der Wobbler Mutante eine Rolle spielt, die durch eine Degeneration der spinalen Motoneuronen charakterisiert ist. Es ist interessant, dass alle drei humanen Pellinogene in der Nähe von humanen genetischen Orten kartieren, die mit neuromuskulären Defekten zu tun haben: Welanders distale Myopathie; Myopathie (distal); und spinozerebrales Ataxiegen 5 (das mit dem Versagen der muskulären Koordination und/oder irregulären muskulären Aktionen zu tun hat). Dies lässt vermuten, dass diese humanen genetischen Defekte mit Defekten in der Aktivität der humanen Pellinopolypeptide zusammenhängen.
Beispiel 2. Reportergen-Assay auf Aktivität von Pellinopolypeptiden
Die für murines Pellino-1 kodierende DNA-Sequenz wurde, im Leseraster an dem 3'-Ende, mit einer DNA fusioniert, die für das FLAG Epitop kodiert, gefolgt von einem Stopkodon im Raster. Dieses Konstrukt wurde in den Säugerexpressionsvektor pDC304 (identisch mit pDC302, beschrieben im U.S. Patent Nr. 5,599,905, erteilt am 4. Februar 1999, außer dass die frühe Spliceregion, bestehend aus den Orten für den Splicedonor und den Akzeptor des viralen Elements SV40, entfernt worden war) kloniert und mittels der DEAE-Dextranmethode in eine IL-1-responsive Linie von COS-7 Zellen transfiziert.
Um die Wirkung des Pellino-1-FLAG-Polypeptids und anderer Formen der Pellinopolypeptide auf die Aktivität von Reportergenen zu untersuchen, kann man im wesentlichen eine Methode verwenden, die von Born et al. in J. Biol. Chem. 273:29445-29450 beschrieben wurde. Als ein Beispiel für diese Methode wurden COS7-Zellen mittels der DEAE-Dextran-methode transfiziert, wie von Cosman et al., 1984, in Nature 312:768-771 beschrieben wurde, wobei jeweils 150 ng des Expressionskonstrukts für das Pellinopolypeptid und 700 ng des Reporterplasmids für 45.000 Zellen verwendet wurden. Zwei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen mit 10 ng/ml IL-18 (Pepro Tech Inc.) 4 Stunden lang stimuliert. Die Zellen wurden lysiert, und die Luciferase-Aktivität wurde unter Verwendung von Reporter-Lysepuffer und Luceferaseassay-Reagenz (Promega Corp., Madison, WI untersucht. IL-8-Promotor-Reporter und NF-kB-abhängige Reporterkonstrukte können als Reporterplasmide verwendet werden. Alternativ kann die Wirkung der Expression von Pellinopolypeptid in COS-Zellen bestimmt werden. Bei einer bevorzugten alternativen Methode werden COS-7-Zellen in Platten mit 12 Wells kultiviert, wie zuvor beschrieben. Die Zellen wurden mit dem zu testenden Pellinoplasmid, 50 ng Reporterplasmid-DNA und leerem Vektor, wie erforderlich, mit insgesamt 1 Mikrogramm DNA pro Well transfiziert. Nach 24 Stunden wurden stimulierender Agenzien in einer kleinen Menge (weniger als 0,5% endgültiges Volumen) Medium oder Dimethylsulfoxid zugesetzt, und die Zellen wurden 5 Stunden reinkubiert. Die Zellen wurden mittels Luciferase-Reporter-Lysepuffer (Promega Corp., Madison, WI, 0,25 ml pro Well)) lysiert, und die Luciferaseaktivität wurde nach Zusatz von Luciferaseassay-Reagenz mittels eines Luminometers von EG&GBerthold nach den Vorschriften des bzw. der Lieferanten gemessen. Alle Ergebnisse wurden auf den Gesamtgehalt der Lysate an Protein, gemessen mittels des Mikro-BCA Assays (Pierce, Rockford, IL) normalisiert.
In einem vorläufigen Experiment wurde gefunden, dass die auf diese Weise erfolgte Expression von murinem Pellino-1-FLAG die durch IL-1 induzierte NF-kB-abhängige Reportergenaktivität partiell inhibierte. Diese inhibierende Wirkung von Pellino-1-FLAG kann möglicherweise auf eine Überexpression des Pellinopolypeptids zurückzuführen gewesen sein, weil gefunden worden ist, dass die Transfizierung von COS-Zellen mit hohen Konzentrationen eines Pellino-1- oder Pellino-2-Expressionskonstrukts einen inhibierenden Effekt auf die NF-kB-abhängige Reportergenaktivität hat, möglicherweise infolge der Bildung von Homodimeren oder höheren Multimeren von Pellinopolypeptiden, die eine inhibierende Wirkung haben könnten, im Gegensatz zu der stimulierenden Wirkung von mäßigen Konzentrationen von monomeren Pellinopolypeptiden. Andere Erklärungsmöglichkeiten für die inhibierende Wirkung einer Präparation von Pellino-1-FLAG auf die NF-kB-abhängige Reportergenaktivität sind die Anwesenheit von mutierten Formen des Polypeptids, wie in der Folge beschrieben wird, oder die relative Anwesenheit oder Abwesenheit eines noch zu charakterisierenden Faktors in einer bestimmten Zelllinie.
In späteren Experimenten mit einem murinen Pellino-1-FLAG-Konstrukt, das, wie nachgewiesen wurde, eine natürliche Pellino-1-Aminosäuresequenz enthielt, hatte das Pellino-1-FLAG-Konstrukt mit der natürlichen Aminosäuresequenz jedoch eine stimulierende Wirkung auf die durch IL-1 induzierte NF-kB-abhängige Reportergenaktivität (siehe die folgende Tabelle 2); natürliches Pellino-1-FLAG verstärkte auch in geringem Umfang die Jun N-terminale Kinase, die p38 Kinase sowie die durch IL-1 vermittelte ERK-Signaltransduktion. Wenn natürliche Pellino-1-Polypeptide in COS-1-Zellen exprimiert wurden, stimulierten sie die IL-8 Promotor-Reportergen-Aktivität und die NF-kB-abhängige Reporteraktivität sowohl bei Anwesenheit als auch bei Abwesenheit einer Behandlung mit TNF-alpha, im Vergleich zu einem Kontrollversuch nur mit dem Vektor. In ähnlichen Experimenten stimulierte die Transfizierung von COS-Zellen mit mäßigen Mengen des natürliches Pellino-2-Polypeptid exprimierenden Konstrukts die NF-kB-abhängige Reportergenaktivität.
Um Regionen von Pellino zu definieren, die dessen Antwort auf entzündungsfördernde Mediatoren bestimmen, wurde eine Reihe von mutierten Pellinoexpressionsvektoren konstruiert. Das scheinbare Mr von FLAG-Pellino-1 auf SDS-PAGE-Gelen liegt nahe an dem Wert von 47.224 Dalton, der aus der primären Sequenz errechnet wurde. Dies ist ein Anzeichen dafür, dass keine extensive Modifizierung nach der Translation stattgefunden hat. Es ist daher möglich, den ungefähren Ort in der primären Sequenz von Pellino-1 vorherzusagen, an dem die Spaltung stattfinden sollte, um ein N-terminales Produkt mit 30 kDa zu erzeugen. Der diesem Punkt am nächsten liegende zweckentsprechende Baustein ist Phe-158; eine Spaltung der Peptidbindung, die diesem Baustein vorhergeht, würde zu einem Polypeptid mit einer Masse von 30.044 Dalton führen. Diese Region des Pellino-1-Polypeptids wurde daher zur Mutation ausgewählt, da erwartet werden könnte, dass einige der resultierenden Mutanten der Spaltung widerstehen oder auf eine andere Weise in ihrer Antwort auf pro-entzündliche Stimulanzien verändert würden. Die Spaltung von Pellino ist empfindlich gegen einen Chymotripsininhibitor, TPCK, und Chymotripsin erfordert zur Spaltung die Anwesenheit eines großen aromatischen Bausteins an einer Seite des Ortes der Spaltung. Mit der Überlegung, dass das Pellino spaltende Enzym die selben spezifischen Determinanten teilen könnte, beschlossen wir, vier der aromatischen Aminosäuren zu mutieren, die in dieser Region der von Säugern stammenden Pellinopolypeptide als invariabel befunden wurden. Die beiden internen Deletionsmutanten wurden so ausgewählt, dass sie den vorhergesagten Spaltungsort flankierten und auch hoch konservierte Bausteine einschlossen. Zusätzlich wurde eine Reihe von verkürzten Varianten konstruiert, indem Bausteine sowohl am N- als auch am Carboxyterminus deletiert wurden, sowie Mutanten, in denen Cysteinbausteine in der RING-Finger-artigen Domäne fehlten, und zwar auf die folgende Weise. Um eine Reihe von N-terminalen Deletionen zu erreichen, wurden kurze Sinnstrang-Oligonukleotid-Primer synthetisiert, in denen eine einen Kpnl-Restriktionsort sowie ein Methioninkodon enthaltende Sequenz mit murinen Pellino-1-Sequenzen fusioniert wurden, beginnend mit den Kodons für Gly-S1, Phe-100, Asp-181 und Val-231. Diese wurden mit einem Antisinn-FLAG-BgIll-adaptierten Primer fusioniert, um PCR-Fragmente von muriner Pellino-1-FLAG Templat-DNA zu amplifizieren. Diese Fragmente wurden in den pDC304-Vektor rekloniert, um die Konstrukte zu generieren, die für die dN50-FLAG-, dN99-FLAG; dN180-FLAG- und dN230-Flag-Mutanten kodieren. Eine ähnliche Strategie wurde gewählt, um eine Reihe von Mutanten zu konstruieren, die am C-Terminus progressiv verkürzt waren. Antisinn-Oligonukleotide wurden synthetisiert, die mit den Kodons für Thr-150, Thr-250 bzw. Glu-350 endeten, zusammen mit einer Sequenz, die ein Stopkodon und einen BgIII-Restriktionsort enthielt. Diese Primer wurden verwendet, um PCR-Fragmente herzustellen, die danach in pDC304 kloniert und als für die Mutanten 1-150, 1-250 bzw. 1-350 kodierend bezeichnet wurden. Die Konstrukte die für die Substitutionen einer Aminosäure kodierten, F137L-FLAG, Y154A-FLAG, F158A-FLAG und F165L-FLAG, wurden unter Verwendung des Quick-Change ortsspezifischen Mutagenesekits (Stratagene, LaJolla, CA) konstruiert. Um die Mutanten mit internen Deletionen, d133-156-FLAG und d155-158FLAG, zu konstruieren, haben wir in beiden Fällen ein Paar PCR-Fragmente eingeführt, die einen Restriktionsort enthielten, um die zu deletierende Sequenz zu flankieren. Nach der Restriktionsverdauung und der Reinigung der PCR-Fragmente wurden sie mittels Dreiwegbindung in den Vektor pDC304 eingeführt. Es wurde auch eine Mutante konstruiert, in der die vier Aminosäuren Cys-333 bis Cys336 in der oder einer RING-Finger-artigen Domäne durch die beiden Aminosäuresequenzen Gly-Ser ersetzt wurden; diese Mutante wurde als C333-C336GS-FLAG bezeichnet.
Im Gegensatz zu dem natürlichen Pellino-1 inhibierten mutierte Formen von Pellino-1-Polypeptiden, in denen die Aminosäuren 133-156 oder die Aminosäuren 155-158 von SEQ ID NO:2 deletiert wurden, oder in denen die Aminosäuren 50 oder 99 in der N-terminalen Region des Polypeptids deletiert wurden oder in denen durch Substitutionen in der RING-Finger-artigen Domäne Cystein-Bausteine entfernt wurden, die IL-8 Promotor-Reportergenaktivität sowohl bei Anwesenheit als auch bei Abwesenheit einer Behandlung mit TNF-alpha, und die mutierte Form von Pellino-1, in der die Aminosäuren 155-158 deletiert waren, inhibierten die NF-kB-abhängige Reporteraktivität sowohl bei Anwesenheit als auch bei Abwesenheit einer Behandlung mi PMA, verglichen mit einem Versuch nur mit einem Vektor. Die Stimulierung der Aktivität dieser Reportergene ist konsistent mit einer stimulierenden Wirkung auf eine ent-zündungsfördernde regulatorische Kaskade, während die Inhibierung der Aktivität dieser Reportergene mit einer inhibierenden Wirkung auf eine entzündungsfördernde regulatorische Kaskade konsistent ist. Eine Zusammenfassung der Wirkungen der natürlichen und der mutierten Formen von murinem Pellino-1 auf die NF-kB-abhängige Reportergenaktivität ist in Tabelle 2 dargestellt; alle Aminosäurepositionen beziehen sich auf die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:2. Die Resultate hinsichtlich „Löslich oder Unlöslich" und „Gespalten (cleaved)" sind in den folgenden Beispielen 3 und 4 beschrieben.
Aus der folgenden Tabelle ist ersichtlich, dass Deletionen in der N-terminalen Region von Pellino-1-Polypeptiden (d.h. die Deletionen der N-terminalen Aminosäuren 50 Oder 99) Mutanten mit inhibierender Aktivität auf MAP Kinase-aktivierte Signaltransduktion erzeugt (wie z.B. durch die Inhibierung der NF-kB-abhängigen Transkription demonstriert wird), die Deletion von wichtigeren Teilen (d.h. der N-terminalen Aminosäuren 180 oder 230) hebt jedoch die Fähigkeit von Pellino-1 auf, Reportergenaktivität zu stimulieren oder zu inhibieren. Daher sollte es möglich sein, Mutanten von Pellinopolypeptiden mit weiteren N-terminalen Deletionen zu generieren, die inhibierende Aktivität auf die NF-kB-abhängige Transkription ausüben, wie z.B. Mutanten, in denen N-terminale Aminosäuren fehlen, die den N-terminalen Aminosäuren in den Positionen 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170 oder 175 von SEQ ID NO:2 entsprechen, die aber trotzdem noch inhibierende Wirkungen zeigen. Alternativ können andere Bausteine innerhalb der N-terminalen Aminosäuren von Pellinopolypeptiden, die den 180 N-terminalen Aminosäuren von SEQ ID NO:2 entsprechen, deletiert werden, um mutierte Formen von Pellinopolypeptiden zu schaffen, die eine inhibierende Wirkung auf die NF-kB-abhängige Transkription haben. In ähnlicher Weise können Mutanten, in denen in der zentralen, konservierten Domäne und/oder in der RING-Finger-artigen Domäne 1 bis 50 Aminosäuren, vorteilhafter 1 bis 30 Aminosäuren deletiert wurden, ebenfalls eine inhibierende Wirkung auf die NF-kB-abhängige Transkription ausüben. Alle diese Mutanten können ohne weiteres mittels des hierin beschriebenen Reportergenassays auf ihre Aktivität untersucht werden.
Tabelle 2
In ähnlichen Experimenten unter Verwendung von COS-Zellen, die mit einem CHOP einschließenden Reporterkonstrukt transfiziert waren, inhibierte ein p38-abhängiger Promotor, die 155-158-FLAG-mutierte Form von Pellino-1, die Stimulierung der CHOP Reportergenaktivität durch TNF-alpha. Dieser Befund ist signifikant, weil er zeigt, dass mutierte Formen von Pellinopolypeptiden in der Lage sind, eine Mehrzahl von MAP Kinase-aktivierten entzündungsfördernden Signaltransduktionen zu inhibieren, was durch die von ihnen bewirkte Inhibierung sowohl der NF-kB-abhängigen Transkription als auch der p38-abhängigen Tran-skription angezeigt wird. Weil natürliche Formen von Pellinopolypeptiden stimulierende Wirkungen auf Schlüsselkomponenten der vier hauptsächlichen MAP Kinase-aktivierten Signal-transduktionen ausüben (auf die Stimulierung von Jun N-terminaler Kinase, von p38-Kinase, die ERK-Signaltransduktion und die Stimulierung der NF-kB-abhängigen Transkription) ist zu erwarten, dass die „dominant-negativen" mutierten Formen von Pellinopolypeptiden die Jun Kinase- und die ERK MAP Kinase-aktivierten Signaltransduktionen in ähnlicher Weise inhibieren wie die Inhibierung der p38- und der MAP Kinase-aktivierten Signaltransduktionen.
Beispiel 3. Intrazelluläre Lokalisierung von Pellinopolypeptiden
Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren zur Überwachung der Regulation (durch IL-1 oder andere Zytokine oder Moleküle) der intrazellulären Lokalisation von Pellino-1 in Zellen. COS-7-Zellen, die einen endogenen IL-1-Rezeptor exprimieren, werden mit einem Expressionsvektor transfeziert, der FLAG-Pellino-1, wie in Beispiel 2 beschrieben, enthält. Die Zellen können auch gleichzeitig mit anderen cDNAs transfiziert werden, die ein Entzündungssignal vermitteln, wie z.B. die IL-1Rezeptor-assoziierte Kinase (IRAK); GenBank NP001560). Die transfizierten Zellen werden etwa 48 Stunden kultiviert. IL-1 (20 ng/ml) oder ein anderes Zytokin oder Molekül in einer geeigneten Konzentration werden dem Kulturmedium für die letzten 15 Minuten (Kurzzeitstimulierung) oder für die letzten 24 Stunden (verlängerte Stimulierung) zugesetzt.
Die Zellkulturen werden mit eiskalter, Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, und Lysate der Zellen werden hergestellt, in dem man die Zellen in einen Lysierpuffer schabt, der 50 mM Tris-Chlorid, vom pH 8,0, ergänzt durch 1% Nonidet (NP 40), 0,5% Natriumdeoxycholat, 0,1 mM Natriumorthovanadat, 30 mM para-Nitrophenyl-phosphat, 30 mM beta-Glycerophosphat, 140 mM NaCl, 5 mM Dithiothreitol, 2 mM EDTA, 10 mM Leupeptin, 10 mM Pepstatin A und 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid enthält; die Chemikalien wurden von Sigma, St.Louis, MO bezogen. Die Solubilisierung der zellulären Proteine kann erleichtert werden, indem man die Lysate mehrmals durch hypodermische Nadeln von 25 Gauge laufen lässt. Das Lysat wird bei 4°C und 13.000xG zentrifugiert. Das verbleibende Pellet wird in 1X SDS-PAGE Probepuffer (Laemmli et al, Nature 227:680; 1970) solubilisiert; dieses Material wird als die „unlösliche Fraktion" bezeichnet.
Bei einem alternativen Verfahren, bei dem man lösliche und nicht lösliche, Pellinopolypeptide enthaltende Fraktionen erhält, werden COS7 (Affennieren) Zellen bei 35°C und 5% CO₂ in Dulbeccos modifiziertem Eagles-Medium gehalten, das 5% bovines Serum enthielt und mit 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 Mikrogramm/ml Streptomycin versehen war. Für Pellino-FLAG kodierende Plasmide oder andere Expressionsplasmide wurden in Gewebekulturplatten mit 6 Wells (Costar) in COS7-Zellen transfiziert, wozu DEAB-Dextran verwendet wurde. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Transfizierung wurden Zellen in 0,4 ml eines Lyse/Extraktions-Puffers geschabt, der aus 50 mM Tris-HCl vom pH 7,8, 1 % NP-40, 0,15M NaCl, 2 mM EGTA, 5 MikroM NaF, 30 mM beta-Glycerophosphat, 1 mM Orthovanadat, 1 mM Dithiothreitol, 0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 10 Mikrogramm/ml Leupeptin und d10 Mikrogramm/ml Pepstatin A bestand. Man ließ die Zellsuspensionen 15 Minuten auf Eis lysieren und zentrifugierte sie dann in einer Mikrozentrifuge 10 Minuten lang bei 13.000 U/min und 4°C. Die Überstände wurden sorgfältig in frische Gefäße transferiert und mit einem Drittel ihres Volumens mit Merkaptoethanol enthaltendem 4x-konzentriertem SDS-PAGE Probepuffer verdünnt. Die Überstände („Detergens-lösliche Fraktion") wurden für 5 Minuten zum Sieden erhitzt. Die Zellen wurden reextrahiert, indem man sie in der Hälfte des ursprünglichen Volumens in 1x-konzentriertem SDS-PAGE-Probepuffer resuspendierte und sie dann zum Sieden erhitzte.
Aliquote Teile der löslichen Fraktion und der unlöslichen Fraktion können dann mittels Gelelektrophorese auf SDA-Polyacrylamid-Gelen mit 4-20% Gradienten (Novex, Invitrogen Corp., Carlsbad, CA).analysiert werden, auf Nitrozellulosemembranen transferiert und einem Assay mittels Western Immunoblotting unterzogen werden, wozu man Anti-FLAG-Antikörper (wie z.B. FLAG M2) zur Bindung an die Proteinprodukte der transfizierten cDNAs verwendet. Die Proteine werden sichtbar gemacht durch Inkubation von Western Blots mit Horseradish peroxidase-konjugiertem Antimaus-IgG (BioRad, San Diego, CA), gefolgt von einer Detektion mittels des ECL-Systems (Amersham, Arlington Heights, IL).
Beispiel 4. Wirkung von Zellstimulation auf Lokation und Spaltung von Pellinopolypeptiden
Dieses Beispiel beschreibt die Wirkung der Stimulierung von COS7-Zellen, die mit einem für FLAG-Pellino-1 kodierenden Expressionsvektor transfeziert waren, mittels IL-1 oder anderer Moleküle. Transfizierte Zellen wurden im wesentlichen so hergestellt, wie zuvor beschrieben wurde. In einigen Fällen wurden die Zellen mit einem pDC304-Vektor co-transfiziert, der eine cDNA-Insertion enthielt, die für humanes IRAK kodierte das mit einem Tandem 3' FLAG und Poly-His „Schwanz" versehen war. In anderen Fällen werden die Zellen mit einem katalytisch inaktiven humanen FLAG-Poly-His-IRAK Expressionsvektor co-transfiziert, in dem das Lysin 293 in der ATP-Bindungstasche von IRAK durch ein Alanin ersetzt ist. Da das Pellino von Drosophila aufgrund seiner Fähigkeit, mit Pelle zu assoziieren, entdeckt wurde, sind Versuche unternommen worden, in denen Pellino mit IRAK co-exprimiert wurde, um zu bestimmen, ob von Säugern stammendes Pellino mit IRAK, dem vermuteten Pelle entsprechenden Protein in Säugern, in Wechselwirkung trat.
Die Analysen zeigten, dass bei Abwesenheit von überexprimiertem aktiven IRAK, FLAG-Pellino-1 in erheblichen Mengen in der löslichen Fraktion als ein Polypeptid mit einer Größe in der Nähe der vorhergesagten Größe von 46 kDa vorkommt. Wenn IRAK überexprimiert wird, ist FLAG-Pellino-1 in erheblichen Mengen in der nicht löslichen Fraktion vertreten, und ein erheblicher Teil des Pellinos in der nicht löslichen Fraktion erschien in Western Blots als eine Spezies mit 30 kDa. Da sie reaktiv mit Anti-FLAG-Antikörper war, besteht die Spezies mit 30 kDa vermutlich aus einem Amino-terminalen Fragment. In einigen Experimenten, in denen größere Mengen von plasmidischer Expressions-cDNA verwendet wurden, ist ein weiteres N-terminales Spaltprodukt von Pellino mit 17 kDa entdeckt worden. Die unlösliche Form von Pellino-1 mit 30 kDa, die sich in Zellen fand, die mit natürlichem IRAK transfizier worden waren, wanderte etwas langsamer als die Form aus Zellen, die mit Kinase-inaktiver IRAK co-transfiziert worden waren. Dies könnte ein Zeichen dafür sein, dass die Pellino-1-Fragmente von 30 kD unterschiedlich phosphoryliert oder vielleicht auf eine andere Weise unterschiedlich modifiziert waren. In ähnlicher Weise war eine allgemeine Verschiebung in der Mobilität von natürlichem IRAK Zellen evident, die mit Pellino-1 co-transfiziert worden waren, was konsistent mit einem Modell ist, wonach sowohl Kinase-aktives IRAK als auch Pellino an der Regulation des Standes der Modifizierung des jeweils anderen Partners nach der Translation (Modifikationen, wie z.B. Phosphorylierung, Ubiquitinylierung, Myristolisierung, Farnesylierung und Geranylgeranylisierung). Kinase-inaktives IRAK kann jedoch weder Modifikationen von Pellino-1 beeinflussen, noch kann Kinase-inaktives IRAK auf diese Weise durch Pellino-1 modifiziert werden. Im Gegensatz dazu erfordern die Spaltung von Pellino-1 und die Relokalisierung der nicht löslichen Fraktion nicht die Kinaseaktivität von IRAK.
Um zu entscheiden, ob die beobachtete Redistribution und die proteolytische Veränderung von Pellino-1 spezifisch IRAK verlangten, wurden mit Pellino-1 transfizierte Zellen mit Agenzien stimuliert, die NF-kB auf von IRAK unabhängige Weise aktivieren, wie z.B. Phorbolmyristat-acetat (PMA,100 ng/ml), von dem bekannt ist, dass es viele der selben intrazellulären Signale wie IL-1 fördert, und TNF-alpha (20 ng/ml). TNF-alpha aktiviert NF-kB durch einen Mechanismus, an dem das Adaptorprotein TRADD, die Kinase RIP und TRAF2 beteiligt sind, während PMA die Aktivität der Proteinkinase C stimuliert, von der bekannt ist, dass sie mit der NF-kB-Kaskade zusammenwirkt (to cross-talk). Beide Agenzien bewirken einen Zeit-abhängigen Anstieg der Redistribution von Pellino-1 in die nicht lösliche Fraktion, in der es überwiegend als Spaltprodukt mit 30 kDa vorlag. In beiden Fällen bedurfte es 2 oder 3 Stunden Einwirkung des Stimulans, bevor eine Spaltung von Pellino in signifikantem Ausmaß zu beobachten war. Die Gesamtmenge an detektierbaren Pellino-1-Polypeptiden (die Summe der löslichen und der nicht löslichen Fraktionen) vergrößerte sich bei Gegenwart von PMA oder TNF-alpha, was vermutlich eine Veränderung der Nettoraten der Synthese von Pellino-1 und/oder dessen Abbaus refklektiert. Die Inkubation mit mehreren Wachstumsfaktoren (wie z.B. der epidermale Wachstumsfaktor (EGF), der grundlegende Fibroblastenwachs-tumsfaktor, der transformierende beta-Wachstumsfaktor oder der von Blutplättchen abgeleitete Wachstumsfaktor) hatte eine geringe oder gar kein Wirkung auf Pellino-1; nur der epidermale Wachstumsfaktor war sehr schwach aktiv. Es ist berichtet worden, dass EGF in einigen Zellen durch Induzierung des IkB-alpha-Abbaus NF-kB aktiviert. Diese Befunde sind konsistent mit der Spaltung und der Redistribution von Pellino-1, die spezifisch als Antworten auf Stimulierungen auftreten, welche NF-kB aktivieren, mit Einschluss derjenigen mit Signalmechanismen, an denen IRAK nicht teilnimmt. Zeit-Verlaufs-Experimente zeigten, dass die Spaltung und die Relokation von Pellino-1 etwa zwei Stunden nach der Induzierung durch PMA einsetzten, und nach etwa drei Stunden nach der Stimulierung durch TNF-alpha, wobei die durch TNF-alpha vermittelte NF-kB-Aktivierung in COS7-Zellen nach 15 Minuten maximal war. Dies lässt vermuten, dass die Spaltung und die Veränderungen in der Löslichkeit wahrscheinlicher ein Teil der zellulären Effekte der NF-kB-Aktivierung sind, als dass sie kausal in den Aktivierungsprozess involviert sind. Es zeigt weiterhin an, dass die Spaltung und die Relokalisierung von Pellino-1 von einer de novo-Proteinsynthese abhängen könnten. Diese Beobachtung wurde durch Experimente bestätigt, in denen eine Vorbehandlung von mit FLAG-Pellino-1 transfizierten Zellen mit einem Inhibitor für die Proteinsynthese, Cycloheximid, weitgehend verhinderte, dass PMA danach die Spaltung und die Relokation von Pellino-1 induzierte.
Mit dem Ziel zu bestimmen, welche Protease an der Regulation der Spaltung von Pellino-1 beteiligt sein könnte, wurden mit einem Pellino-1-Expressionskonstrukt transfizierte COS7-Zellen mit PMA und gleichzeitig mit Inhibitoren von verschiedenen Klassen von Proteinasen behandelt, wie in der folgenden Tabelle 3 dargelegt ist.
Tabelle 3. Wirkung verschiedener Proteaseinhibitoren auf die Spaltung und die Rlokation von Pellino-1
Diese Resultate zeigten, dass ein Mitglied der Chymotripsin-artigen Serinproteasenfamilie an der Spaltung und der Relokation von Pellino-1 beteiligt war. Dies steht im Gegensatz zu anderen IL-1- und TNF-alpha-Signalkaskaden, von denen bekannt ist, dass eine Aktivierung durch Caspase (wie z.B. bei der durch TNF-alpha induzierten Apoptose; Rath et al., J. Clin. Immunol. 19:350, 1990) oder Proteasome (wie z.B. bei dem durch IL-1 induzierten Abbau von IkB; Karin et al., Semin. Immunol. 2000, 12:85, 2000). Die langsame Kinetik der Pellino-1-Veränderung würde konsistent sein mit einem Erfordernis für de novo-Proteinsynthese, und damit wiederum konsistent verhinderte eine Behandlung von COS7-Zellen mit dem Inhibitor für die Proteinsynthese Cycloheximid vollständig die PMA-induzierte Spaltung. Es ist daher möglich, dass PMA die Synthese einer Protease induziert, die Pellino spaltet, oder aber die Synthese eines mitwirkenden Faktors für eine konstitutiv exprimierte Proteinase induziert. Diese Resultate haben zusätzliche wichtige Implikationen für den Mechanismus, der in die Veränderung von Pellinopolypeptid involviert ist. MG132 (26) und ALLN (27, 28) sind beide aufgrund ihrer Fähigkeit, den Proteosomvermittelten Abbau von IkB zu verhindern, potente Inhibitoren für die NF-kB-Aktivierung. Daraus folgt, dass die Veränderung von Pellino, die unempfindlich gegenüber MG132 und ALLN ist, nicht von zellulären Ereignissen unterhalb (downstream) des IkB-Abbaus abhängig sein kann. Obwohl TPCK ebenfalls als Inhibitor für den Abbau von IkB gut bekannt ist, schließt der Umstand, dass, wie zuvor diskutiert, die anderen Proteasominhibitoren die Spaltung von Pellino-1 nicht blockieren, aus, dass dies der Mechanismus ist, der der Wirksamkeit von TPCK zugrunde liegt.
Für die Erzeugung eines Pellino-1-Fragments von 30 kDa wird vorhergesagt, dass eine proteolytische Spaltung innerhalb der Region mit den Aminosäuren 132 bis 189 von SEQ ID NO:2 stattfinden wird. Eine Prüfung der Aminosäuresequenzen von Pellino-1 zeigt, dass sie extrem gut in denjenigen Spezies konserviert ist, für die EST-Sequenzdaten verfügbar sind (murines und humanes Pellino-1 und Pellino-2, hierin offenbart; Pellino von Drosophila, GenBank Zugangsnummer AF091624; und das Genprodukt F25B4.2 von Caenorhabditis elegans, GenBank Zugangsnummer U64842). Eine Anzahl von konservierten Phenylalanin- und Tyrosinbausteinen sind in dieser Region vorhanden, von denen jeder als Erkennungsort für eine Chymotrypsin-artige Serinprotease dienen könnte.
Beispiel 5. GST-Pellino Fusionsprotein
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion und Expression eines rekombinanten Fusionsproteins aus Glutathion-S-transferase (GST) und Pellino-1. PCR-Primer mit den Sequenzen ATATTCACTGAATTCTGATGTTTTCTCCTGATCAA (Primer Nr.1; SEQ ID NO:9) und AGTGAATATGAATTCCTACTTATCATCGTCATCTTTG (Primer Nr.2; SEQ ID NO:10) zur Verwendung als Sinn- bzw. Antisinnprimer wurden synthetisiert. Diese Primer wurden zur Verwendung mit einem Pellino-1-FLAG-Templat entworfen und fügen einen EcoR1-Ort an jedes Ende des amplifizierten Produkts an. Dieses PCR-Produkt wurde in den einzigen EcoR1-Klonierungsort des Vektors pGEX2T (beschrieben in EP 0 293 249-A) so ligiert, dass die kodierenden Sequenzen des Gens der Glutathion-S-transferase und von FLAG-Pellino-1 in dem selben Leseraster lagen. Der E.coli-Stamm DH10B wurde mit dem resultierenden Vektor transformiert, und eine Kultur im 1-Litermaßstab wurde angelegt. Die Transkription des GST-Pellino-1-FLAG-Gens wurde durch Zusatz von IPTG (0,1 mM) zu der Bakterienkultur für 3 Stunden induziert. Die Bakterienzellen wurden geerntet und lysiert nach Methoden, die in der Technik gut bekannt sind (siehe z.B. Smith D.B. und Johnson K.S., Gene 67:31-40 (1988)). Das Lysat, das solubilisiertes GST-Pellino-1-FLAG enthielt wurde an 1 ml Glutathion-Aga-rose-Perlen (Pharmacia) gemäß den Instruktionen des Herstellen gereinigt.
Beispiel 6: Monoklonale Anti-Pellino-Antikörper
Dieses Beispiel erläutert die Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen Pellinopolypeptide. Präparationen beispielsweise von gereinigten rekombinanten Pellinopolypeptiden oder von transfizierten Zellen, die Pellinopolypeptide auf hohem Niveau exprimieren, werden verwendet, um mittels konventioneller Verfahren, wie sie z.B. im U.S. Patent Nr. 4,411,993 beschrieben, monoklonale Antikörper gegen Pellinopolypeptide herzustellen. Für Pellinopolypeptide kodierende DNAs können ebenfalls als Immunogene verwendet werden, eine Übersicht geben beispielsweise Pardoll und Beckerleg in Immunity 3:165, 1995. Es ist wahrscheinlich, dass solche Antikörper als Komponenten für Diagnosen oder Forschungsassays für Pellino oder Pellinoaktivität oder aber bei der Affinitätsreinigung von Pellinopolypeptiden von Nutzen sein könnten.
Um Nagetiere zu immunisieren wird ein Pellinopolypeptid (wie z.B. ein Pellino-1-Polypeptid, das die Aminosäuren 2 bis einschließlich 20, die Aminosäuren von 118 bis einschließlich 131 oder die Aminosäuren 318 bis einschließlich 340 der SEQ ID NOs:2 und 4 enthält), vorteilhaft mit einem immunogenen Molekül verknüpft, wie z.B. dem Hämocyanin der Schlüssellochnapfschnecke (keyhole limpet), in einem Adjuvans (wie z.B. komplettem oder nicht komplettem Freund'schen Adjuvans, Alaun (alum) oder einem anderen Adjuvans, wie z.B. Ribi-Adjuvans R700 (Ribi, Hamilton, MT) emulgiert, und die Emulsion wird in Dosen im Bereich von 10 bis 100 Mikrogramm subkutan in ausgewählte Nagetiere injiziert, z.B. in BALB/c-Mäuse oder Lewis-Ratten. DNA kann intradermal (Raz et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 91:9549, 1994) oder intramuskulär (Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:4156, 1993) appliziert werden. Kochsalzlösung ist als geeignetes Verdünnungsmittel für Antigene auf Basis DNA gefunden worden. Zehn Tage oder drei Wochen später werden die Tiere mit weiterem Immunogen stimuliert, und weiter periodisch in wöchentlichen oder zweiwöchentlichen Abständen oder jede dritte Woche erneut mit Immunogen stimuliert.
Serumproben werden periodisch durch retroorbitale Blutabnahme oder Excision an der Schwanzspitze entnommen, um mittels Dot-Blot-Assays (Antikörper-Sandwich), ELISA, (Enzymverbundener Immunosorbent-Assay), Immunofällung oder anderer geeigneter Assays, einschließlich von FACS-Analyse, zu testen, ob und wie viel Antikörper gebildet ist. Wenn ein geeigneter Antikörpertiter erreicht ist, wird den positiven Tieren eine intravenöse Injektion von Antikörpern in Kochsalzlösung verabfolgt. Drei oder vier Tage später werden die Tiere getötet, die Splenozyten geerntet und mit einer murinen Myelomzelllinie (wie z.B. NS 1 oder vorzugsweise Ag 8.653 (ATTC CRL 1580)) fusioniert. Auf diese Weise hergestellte Hybridomazelllinien werden in einem selektiven Medium (z.B. in einem Medium, das Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin oder HAT enthält) auf mehrere Mikrotiterplatten plattiert, um die Proliferation von nicht fusionierten Zellen, Myelom-Myelom-Hybriden und Splenozyt-Splenozyt-Hybriden zu inhibieren.
Die so geschaffenen Hybridomaklone können mittels ELISA auf Reaktivität mit Pellinopolypeptiden durchmustert werden, beispielsweise durch Adaption von Techniken, die von Engvall et al. Immunochem. 8:871 (1971) beschrieben wurden, oder gemäß dem U.S. Patent Nr. 4,703,004. Eine bevorzugte Screeningmethode ist die Antikörperfangmethode (antibody capture method), die von Beckman et al., J. Immunol. 44:4212 (1990) beschrieben wurde. Positive Klone werden dann in die peritonealen Höhlen von syngeneischen Nagern injiziert, damit diese Ascites mit hohen Konzentrationen (> 1 mg/ml) von monoklonalen Anti-Pellino-Antikörpern produzieren. Der entstandene monoklonale Antikörper kann durch Fällung mit Ammoniumsulfat und anschließende Gelausschlusschromatographie gereinigt werden. Alternativ kann auch Affinitätschromatographie auf der Basis der Bindung des Antikörpers an Protein A oder Protein G zur Reinigung der Antikörper eingesetzt werden, ebenso Affinitätschromatographie auf Basis der Bindung an Pellinopolypeptide.
Beispiel 7: Northern Blot-Analyse der Expression von Pellino-1
Ein PCR Fragment mit 234 bp, entsprechend dem vorhergesagten 3'-Ende der mRNA von humanem Pellino-1, wurde mittels üblicher Amplifizierungstechniken hergestellt. Das PCR-Fragment wurde gereinigt (Qiagen PCR Purification Kit) und markiert mittels eines Random Prime Oligonukeotide DNA Labeling Kits von Gibco. Die cDNA-Ribosonde wurde bei 100°C während 5 Minuten denaturiert und dann auf Eis platziert. Die cDNA-Sonde wurde bei 100°C während 5 Minuten denaturiert, bevor sie der Hybridisierungslösung zugesetzt wurde. Ein Mehrgewebe-Northern Blot, enthaltend RNA aus humanen Geweben – Hirn, Herz, Skelettmuskel, Darm (keine Mucosa), Thymus, Milz, Niere, Leber, Dünndarm, Plazenta, Lunge und periphere Blutleukozyten – wurde von Clonetech (Palo Alto, CA) bezogen. Der Blot wurde mit 5 ml ExpressHyb-Lösung 30 Minuten lang bei 68°C blockiert. Frische ExpressHyb-Lösung, die die denaturierte, radioaktiv markierte cDNA-Sonde enthielt, wurde der Membran zugesetzt, und das Ganze wurde eine Stunde lang bei 68°C unter ständigem Schütteln inku-biert. Der Blot wurde in 2X SSC, 0,05% SDS bei Raumtemperatur mit vier Wechseln innerhalb von 40 Minuten gespült, worauf eine Wäsche mit 0,1X SSC, 0,1% SDS bei 50°C mit zwei Wechseln innerhalb von 40 Minuten folgte. Die Ribosonde für Pellino-1 hybridisierte in allen vorhandenen Geweben des Northern Blots mit einer Hauptbande bei 4,4 Kilobasen, wobei eine erhöhte Expression in peripheren Blutleukozyten, Lunge, Plazenta, Leber, Niere, Skelettmuskel und Hirn beobachtet wurde. Das Protein scheint in peripheren Leukozyten in höherem Maße exprimiert zu werden, und es scheinen bei diesem Gewebe zwei zusätzliche Banden bei 7,5 und 9,5 kb vorhanden zu sein, die in den Bahnen der anderen Gewebe nicht auftauchen. Es wurde vorhergesagt, dass die cDNA für humanes Pellino-1 1251 Basenpaare in der kodierenden Region und 1931 Basenpaare in der nicht translatierten 3'-Region aufweisen würde. Es wurde bis jetzt kein Beweis für eine alternative Spleißung gefunden.
Die Spezifikation wird am besten im Lichte der Lehren der in der Spezifikation zitierten Referenzen verstanden. Die Ausführungsformen in der Spezifikation bieten eine Erläuterung der Ausführungsformen der Erfindung und sollten nicht als den Umfang der Erfindung begrenzend ausgelegt werden. Der Fachmann wird ohne weiteres erkennen, dass viele andere Ausführungsformen in die Erfindung eingeschlossen sind.
In der Sequenzliste enthaltene Sequenzen:
SEQUENZLISTE

Claims

Ein isoliertes Polypeptid, welches in der Lage ist, NF-kB-abhängige oder p38-abhängige Transkription zu inhibieren, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:8 und SEQ ID NO:12, wobei die Aminosäuren 1 bis x1 aus besagter Sequenz beseitigt wurden und wobei x1 eine der Aminosäuren an Position 50 bis 98 der besagten Sequenz ist; (b) SEQ ID NO:4, wobei die Aminosäuren x1 bis x2 aus besagter Sequenz beseitigt wurden und wobei x1 eine Aminosäure an Position 99 bis 178 ist und x2 eine Aminosäure an Position 100 bis 179 ist; (c) SEQ ID NO:8, wobei die Aminosäuren x1 bis x2 aus besagter Sequenz beseitigt wurden und wobei x1 eine Aminosäure an Position 1 bis 180 ist und x2 eine Aminosäure an Position 2 bis 181 ist; (d) SEQ ID NO:12, wobei die Aminosäuren x1 bis x2 aus besagter Sequenz beseitigt wurden und wobei x1 eine Aminosäure an Position 1 bis 206 ist und x2 eine Aminosäure an Position 2 bis 207 ist; (e) einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:8 und SEQ ID NO:12, wobei ein oder mehrere Cysteinreste der RING-Fingerähnlichen Domäne beseitigt oder durch nicht-Cysteinreste ersetzt wurden; (f) einer allelische Variante der Sequenzen (a)-(e); (g) Fragmenten der Aminosäuresequenzen gemäß einer der Sequenzen (a)-(d) und (f), die Aminosäuresequenzen einer RING-Finger-ähnlichen Domäne umfassen; und (h) einem Fragment der Aminosäuresequenzen gemäß einer der Sequenzen (a)-(g), wobei ein Polypeptid, welches aus besagtem Fragment besteht, in der Lage ist, die NF-κB-abhängige Transkription zu inhibieren.
Ein isoliertes Polypeptid gemäß Anspruch 1, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) SEQ ID NO:4, wobei die Aminosäuren x1 bis x2 aus besagter Sequenz beseitigt wurden und wobei x1 eine Aminosäure an Position 99 bis 157 ist und x2 eine Aminosäure an Position 100 bis 158 ist; (b) SEQ ID NO:8, wobei die Aminosäuren x1 bis x2 aus besagter Sequenz beseitigt wurden und wobei x1 eine Aminosäure an Position 1 bis 159 ist und x2 eine Aminosäure an Position 2 bis 160 ist; und (c) SEQ ID NO:12, wobei die Aminosäuren x1 bis x2 aus besagter Sequenz beseitigt wurden und wobei x1 eine Aminosäure an Position 1 bis 184 ist und x2 eine Aminosäure an Position 2 bis 185 ist.
Eine isolierte Nukleinsäure, die für ein Polypeptid gemäß den Ansprüchen 1 oder 2 kodiert.
Eine isolierte Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz einer allelischen Variante der Nukleinsäure gemäß Anspruch 3 umfasst.
Ein Expressionsvektor, der mindestens eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 3 umfasst.
Eine rekombinante Wirtszelle, die mindestens eine rekombinante Nukleinsäure, welche die Nukleinsäure gemäß Anspruch 3 enthält, umfasst.
Die rekombinante Wirtszelle gemäß Anspruch 6, wobei die rekombinante Nukleinsäure in das Wirtszellgenom integriert ist.
Ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptides, welches durch die Nukleinsäure gemäß Anspruch 3 kodiert wird, umfassend das Kultivieren einer rekombinanten Wirtszelle unter Bedingungen, die die Expression des besagten Polypeptides fördern, wobei die rekombinante Wirtszelle mindestens eine rekombinante Nukleinsäure umfasst, welche eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 3 enthält.
Das Verfahren gemäß Anspruch 8, welches außerdem die Reinigung des besagten Polypeptides umfasst.
Das Polypeptid, welches durch das Verfahren gemäß Anspruch 8 hergestellt wurde.
Ein in vitro Verfahren zur Inhibition NF-κB-abhängiger Transkription, welches die Bereitstellung mindestens eines Polypeptides gemäß einem der Ansprüche 1, 2 oder 10 umfasst.
Ein in vitro Verfahren zur Inhibition IL-1-vermittelter p38-Kinase-Signalgebung, wobei das Verfahren die Bereitstellung mindestens eines Antagonisten eines Polypeptides umfasst, welches eine Aminosäuresequenz enthält, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO:4 und SEQ ID NO:8; und (b) einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: den Aminosäuren x1 bis x2 der SEQ ID NO:4, wobei x1 eine der Aminosäuren 1 bis 10 der SEQ ID NO:4 und x2 eine der Aminosäuren 409 bis 418 der SEQ ID NO:4 ist; und den Aminosäuren x1 bis x2 der SEQ ID NO:8, wobei x1 eine der Aminosäuren 1 bis 10 der SEQ ID NO:8 und x2 eine der Aminosäuren 410 bis 419 der SEQ ID NO:8 ist, wobei der Antagonist ein Antikörper ist, der die Aktivität besagten Polypeptides inhibiert.
Ein Verfahren zur Identifikation von Verbindungen, die die Stimulation der IL-1-vermittelten p38-Kinase-Signalgebung durch Pellino-Polypeptide inhibieren oder ihr entgegenwirken, wobei das Verfahren das Mischen einer Testverbindung mit einer Zelle, die ein Polypeptid exprimiert, und die Bestimmung, ob die Testverbindung die Stimulation der IL-1-vermittelten p38-Kinase-Signalgebung durch besagtes Polypeptid verändert, umfasst, wobei besagtes Polypeptid eine Aminosäuresequenz enthält, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO:4 und SEQ ID NO:8; und (b) einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: den Aminosäuren x1 bis x2 der SEQ ID NO:4, wobei x1 eine der Aminosäuren 1 bis 10 der SEQ ID NO:4 und x2 eine der Aminosäuren 409 bis 418 der SEQ ID NO:4 ist; und den Aminosäuren x1 bis x2 der SEQ ID NO:8, wobei x1 eine der Aminosäuren 1 bis 10 der SEQ ID NO:8 und x2 eine der Aminosäuren 410 bis 419 der SEQ ID NO:8 ist.
Ein Verfahren zur Identifikation von Verbindungen, die die Fähigkeit von mutierten Pellino-Polypeptiden, NF-κB-abhängige Transkription oder p38-abhängige Transkription zu inhibieren, verändern, wobei das Verfahren (a) das Mischen einer Testverbindung mit einer Zelle, die das Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1, 2 oder 10 exprimiert; und (b) die Bestimmung, ob die Testverbindung die Fähigkeit des besagten Polypeptides, NF-κB-abhängige Transkription oder p38-abhängige Transkription zu inhibieren, verändert, umfasst.
Das Verfahren gemäß Anspruch 14, welches außerdem die Behandlung der Zelle mit einem Molekül umfasst, welches ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Interleukin-1 (IL-1), TNF-alpha, IL-18 und Phorbol 12-myristat-l3-acetat (PMA), Peptidoglycan, bakteriellen Lipopeptiden, bakteriellen Lipopolysacchariden, Zymosan, CpG-DNA, Flagellin, Lipoteichonsäuren und Proteinen des respiratorischen synzytialen Virus (Respiratory Syncytial Virus).
Das Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei die Bestimmung, ob die Testverbindung besagte Fähigkeit des besagten Polypeptides verändert, die Bestimmung der Menge der Translokation von NF-κB zum Zellkern umfasst.
Das Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei die Bestimmung, ob die Testverbindung besagte Fähigkeit des besagten Polypeptides verändert, die Bestimmung der Menge an NF-κB-abhängiger Transkription umfasst.
Das Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei die Bestimmung, ob die Testverbindung besagte Fähigkeit des besagten Polypeptides verändert, die Bestimmung der Menge an p38-abhängiger Transkription umfasst.
Das Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1, 2 oder 10 zur Verwendung als Medikament.
Verwendung des Polypeptides gemäß einem der Ansprüche 1, 2 oder 10 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines entzündlichen Zustandes.
Die Verwendung gemäß Anspruch 20, wobei der entzündliche Zustand ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Asthma, rheumatoider Arthritis, entzündlicher Darmerkrankung, Morbus Crohn, Colitis ulcerosa, Atherosklerose und Alzheimerscher Krankheit.