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Diese
Anmeldung beansprucht die Begünstigung
unter U.S.C. 119(e) für
die vorläufige
Anmeldung mit der Serien Nummer 60/200,198, eingereicht am 28. April
2000.
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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
Erfindung ist auf Moleküle
gerichtet, die Mitglieder einer Polypeptidfamilie sind, welche als
Pellino bezeichnet oder auch Conserved Inflammatory Signal Target
(CIST) genannt wird. Genauer gesagt schließt die vorliegende Erfindung
Pellinopolypeptide sowie Fragmente davon, die Nukleinsäuren, welche
für diese
Polypeptide und deren Fragmente kodieren; Verfahren zur Herstellung
von rekombinanten Formen dieser Polypeptide, Antikörper gegen
diese Polypeptide, transgene oder Knock-out-Zellen und -Tiere sowie
deren Verwendungen ein.
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STAND DER
TECHNIK
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Die
Interleukin-1 (IL-1) Wirkungskaskade (pathway) ist eine zelluläre, signalgebende
Wirkungskaskade, die eine entscheidende Rolle bei der Immunantwort
von Säugern
auf Entzündungen
in Säugetieren
spielt. Mehrere verschiedene Rezeptoren und Liganden sind in diese
Wirkungskaskade involviert, einschließlich der Liganden IL-1-alpha,
IL-1-beta und IL-1-Rezeptorantagonist (IL-Ira) und von zwei IL-1-Rezeptoren,
die als IL-1-Rezeptoren vom Typ I (IL-1RI) und IL-1-Rezeptoren vom
Typ Π (IL-1RII)
bezeichnet werden; es existiert auch eine lösliche Form des letzteren.
Es sieht so aus, als ob IL-1RI
der signalgebende Rezeptor ist, während IL-1RII kein Signal in
eine Zelle transduziert, sondern stattdessen in die Regulation einer
durch IL-1 vermittelten Immunantwort involviert sein kann (Colotta
et al., Immunol. Today 15:562, 1995). Die Signalgebung über die
IL-1-Wirkungskaskade ist komplex und erfordert zusätzlich zu
IL-1RI eine Anzahl von Helfermolekülen, einschließlich einer
Rezeptor-assoziierten Kinase (IRAK). Eine Serin/Threonin-Kinase
mit Homologie zu IRAK, die als Pelle bezeichnet wird, ist in Drosophila
gefunden worden (siehe Belvin und Armstrong, Annu. Rev. Cell Dev.
Biol. 12:393, 1996). Von einem anderen Protein der Drosophila, Pellino,
ist berichtet worden, dass es mit Pelle in Wechselwirkung steht
(Grosshans et al., Mech. Dev. 81:127, 1999).
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Die
dorsal-ventrale Polarisation in Embryonen von Drosophila hängt davon
ab, dass ein Gradient der nuklearen Lokalisation des Rel-artigen
Transkriptionsfaktors Dorsal aufgebaut wird. Das Transkriptionsprogramm,
das durch Dorsal vermittelt wird, resultiert aus einer Signalkaskade,
die durch die Bindung eines extrazellulären Liganden Spaetzle an seinen
Rezeptor Toll ausgelöst
wird. Zu den Zwischengliedern dieser Signalkaskade gehören das
Adaptorprotein Tube, die Serin/Threonin-Kinase Pelle sowie Cactus,
ein cytolytischer Bindungspartner von Dorsal. Durch Toll übermittelte
Signale führen
zu einem Abbau von Cactus und erlauben dadurch den nuklearen Import
von Dorsal. Die Ähnlichkeit
zwischen den cytosolischen Domänen
von Toll und dem Interleukin-1 Rezeptor Il-1RI ist zuerst von Gay
und Keith (Gay, N. und Keith, F., 1991, Nature 351:355-356) beobachtet
worden, und die Zahl der Proteine, die die homologen, Toll/IL-IR
(TIR) Domänen
genannten Regionen enthalten, ist danach gewachsen und schließt heute
eine größere Familie
von Rezeptoren und intrazellulären
signalgebenden Molekülen
aus einer Vielzahl von Organismen ein. Diejenigen Rezeptoren oder
Moleküle,
die in ihren extrazellulären
Domänen
Leucin-reiche sich wiederholende Segmente enthalten, haben weitgehend
mit angeborenen Immunantworten zu tun und schließen mindestens zehn Toll-artige
Rezeptoren (TLRs) von Säugern
ein, die entzündliche
Reaktionen auf mikrobielle Pathogene initiieren, wie z.B. auf Peptidoglykan,
bakterielle Lipopeptide, bakterielle Lipopolysaccharide, Zymosan,
CpG-DNA, Flagellin, Lipoteichonsäuren
und respiratorische, syncytiale Virusproteine; sowie auf Pflanzenproteine,
wie z.B. das Produkt des N-Resistenzgens, das Widerstandsfähigkeit
gegen Krankheiten vermittelt. Weiterhin ist jetzt klar, dass eine
wichtige Funktion der Signalgebung durch Toll in erwachsenen Drosophila
darin besteht, dass die Immunantwort auf Pilzinfektionen kontrolliert
wird.
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Komponenten
im weiteren Verlauf der Toll Signalkaskade sind ebenfalls in TLR
und Interleukin-1
Rezeptor-Signalkaskaden von Säugern,
die in einer nuklearen Translokation des Transkriptionsfaktors Nuclear Factor
kappa B (NF-kB) kulminieren, evolutionär konserviert. Die Proteinkinasen
IRAK-1 und IRAK-2, enge Homologe von Pelle, werden durch das Adaptorprotein
MyD88 zu den aktivierten IL-1R oder TLR Rezeptorkomplexen herbei
gerufen und unterliegen einer Autophosphorylierung. Obwohl MyD88
im strengen Sinne kein Analogon von Tube ist, enthalten beide Proteine
eine so genannte tote Domäne,
und Tube dient wahrscheinlich dazu, die Signaltransmission zwischen
Toll und Pelle, woran Tube bindet, zu vermitteln. IRAK tritt danach
in Wechselwirkung mit einem anderen Adaptormolekül, TRAF-6, das eine Homologes
zu dem kürzlich beschriebenen
D-TRAF ist. Signale unterhalb von TRAF scheinen divergent zu sein,
und nicht alle von ihnen sind vollständig verstanden. Eine Konsequenz
in Säugerzellen
ist jedoch die Aktivierung des IkB Kinase (IKK) Komplexes, der das
inhibierende Cactus-Homologe
IkB an zwei N-terminalen Serinbausteinen direkt phosphoryliert und
dadurch seine weite Verbreitung (ubiquitination) und seinen Abbau
verursacht. Wenn NF-kB aus seiner cytoplasmatischen Assoziation
mit IkB freigesetzt wird, wandert NF-kB in den Kern. Kürzlich wurde
ein Kandidat für
ein weiteres Zwischenglied bei der Wechselwirkung von Tube und Pelle
durch Hefe-Zweihybrid-Screening mit Pelle als „bait sequence" gefunden. Es wurde
gezeigt, dass dieses Protein, Pellino genannt, mit katalytisch kompetentem
Pelle in Wechselwirkung tritt, aber nicht mit einer mutierten Form
von Pelle, der die Kinaseaktivität
fehlte. Wenn es auch nicht Ziel der Studie war, die Funktion von
Pellino zu klären,
so wurde doch spekuliert, dass Pellino entweder die aktivierte Form
von Pelle stabilisiert oder eine Wechselwirkung mit nachfolgenden
Pellesubstraten vermittelt.
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Es
wurde berichtet, dass vermutlich Homologe von Drosophila-Pellino
in C.elegans (Rioch et al., Trends in Genetics, 16(7):292-294, 2000)
und in Menschen (Rich et al., Immunogenetics 52:145.149, 2000) extistieren.
Ein zweites homologes Gen, Pellino-2, wurde in Menschen und Mäusen gefunden
(Resch et al., Cytogenetics and Cell Genetics 92(1-2):172-174, 2001).
In derselben Publikation wurde eine Fußnote eingefügt, die
auf Anzeichen für
die Existenz eines dritten, humanen Pellino-Gens hinweist, das Pellino-3
genannt wird. Kennedy et al. (FASEB J. 15(7):A209, 2001 berichteten,
dass Pellino-1, dort als PRISM bezeichnet, die NF-kB-Aktivierung
stimuliert und dass eine dominante negative Pellino-1-Mutante die Toll-
und die IL-1-Stimulierung von NF-kB blockiert.
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IL-1
und andere entzündungsfördernde
Cytokine sind an einer Vielzahl von Krankheiten und Zustanden beteiligt,
einschließlich
rheumatoider Arthritis, multiplen Myelomen, Osteoporose, Endotoximie
und Sepsis, Osteoarthritis, entzündlicher
Darmkrankheiten und Allergie. Es ist gezeigt worden, dass die Inhibierung
der Signalfunktion von IL-1 mittels löslicher Formen von IL-1Rs und
durch IL-Ira nützlich
für die
Behandlung oder Linderung von Krankheiten ist, die durch ein Übermaß von IL-1
gekennzeichnet sind (Rosenwasser, J. Allerg. Clin. Immunol. 102:344,
1998). Andere Teile der IL-1-Signalkaskade
und andere, entzündungsfördernde, durch
MAP Kinase aktivierte Kaskaden sind ebenfalls das Ziel von Versuchen
gewesen, weitere Moleküle
zu identifizieren, die therapeutisch eingesetzt werden können, um
bei Zuständen
zu intervenieren, die allgemein mit IL-1 und entzündungsfördernden
Zytokinen zusammenhängen.
Es besteht somit in der Medizin ein Bedürfnis, neue Moleküle zu identifizieren,
die an den durch IL-1 und MAP Kinase aktivierten entzündungsfördernden Signalkaskaden
beteiligt sind, sowohl als Stoffe, mit deren Hilfe die Signalwege
in der Zelle untersucht werden können,
als auch zur Verwendung bei der Identifizierung von Inhibitoren
für die
entzündungsfördernde
Signalwirkung. Von besonderem Interesse sind neue Polypeptide, die
an der Stimulierung von mehreren entzündungsfördernden Signalkaskaden beteiligt
sind, weil die Inhibierung dieser Polypeptide entzündliche
Effekte wirksamer inhibieren würde
als die Inhibierung eines Kaskade-spezifischen Polypeptids.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Der
vorliegenden Erfindung liegt die Entdeckung neuer muriner und humaner
Pellinopolypeptide, des murinen Pellino-1 und -2 sowie des humanen
Pellino-1, -2 und -3 zugrunde.
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Die
Erfindung stellt im einzelnen ein isoliertes Polypeptid zur Verfügung, das
NF-kB-abhängige
oder p38-abhängige
Transkription zu inhibieren vermag, wobei das Polypeptid ausgewählt ist
aus der Gruppe, bestehend aus:
- (a) einer Aminosäuresequenz,
ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:8 und SEQ ID
NO:12, wobei die Aminosäuren
1 bis x1 aus der Sequenz beseitigt wurden und wobei x1 eine der
Aminosäuren
in Position 50 bis 98 der besagten Sequenz ist;
- (b) SEQ ID NO:4, wobei die Aminosäuren x1 bis x2 aus besagter
Sequenz beseitigt wurden und wobei x1 eine der Aminosäuren in
Position 99 bis 178 und x2 eine der Aminosäuren in Position 100 bis 179
ist;
- (c) SEQ ID NO:8, wobei die Aminosäuren x1 bis x2 aus besagter
Sequenz beseitigt wurden und x1 eine der Aminosäuren in Position 1 bis 180
ist und x2 eine der Aminosäuren
in Position 2 bis 181 ist;
- (d) SEQ ID NO:12, wobei die Aminosäuren x1 bis x2 aus der Sequenz
beseitigt wurden und x1 eine der Aminosäuren in Position 1 bis 206
ist und x2 eine der Aminosäuren
in Position 2 bis 207 ist;
- (e) einer Aminosäuresequenz,
ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:8 und SEQ ID
NO:12, wobei ein oder mehrere Cysteinreste in der RING-Finger-ähnlichen
Domäne
beseitigt oder durch Nicht-Cysteinreste ersetzt wurden;
- (f) einer allelischen Variante der Sequenzen (a) bis (e);
- (g) Fragmenten der Aminosäuresequenzen
gemäß einer
der Sequenzen (a) bis (d) und (f), die Aminosäuresequenzen der RING-Finger-ähnlichen
Domäne
umfassen; und
- (h) einem Fragment der Aminosäuresequenzen gemäß einer
der Sequenzen (a) bis (g), wobei ein Polypeptid, welches aus besagtem
Fragment besteht, in der Lage ist, die NF-kB-abhängige Transkription zu inhibieren.
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Die
Erfindung stellt auch eine isolierte genomische Nukleinsäure zur
Verfügung,
die den Nukleinsäuren
nach der Erfindung entspricht.
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Weiterhin
werden durch die Erfindung Expressionsvektoren und rekombinante
Wirtszellen zur Verfügung
gestellt, die mindestens eine Nukleinsäure nach der Erfindung umfassen,
sowie bevorzugte rekombinante Wirtszellen, bei denen die besagte
Nukleinsäure
in das Genom der Wirtszelle integriert ist.
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Ebenfalls
wird ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids zur Verfügung gestellt,
welches durch eine Nukleinsäure
nach der Erfindung kodiert wird, wobei das Verfahren umfasst das
Kultivieren einer rekombinanten Wirtszelle unter Bedingungen, die
die Expression des besagten Polypeptids fördern, wobei die rekombinante
Wirtszelle mindestens eine Nukleinsäure nach der Erfindung umfasst.
Ein bevorzugtes Verfahren nach der Erfindung umfasst außerdem die
Reinigung des besagten Polypeptids. Nach einem anderen Aspekt der
Erfindung wird das nach diesem Verfahren hergestellte Polypeptid
zur Verfügung
gestellt.
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Nach
einem anderen Aspekt der Erfindung werden Methoden zur Identifizierung
von Stoffen zur Verfügung
gestellt, die die Aktivität
(oder eine dominant-negative Aktivität) von Pellinopolypeptiden
verändern,
wobei man
- (a) eine Testverbindung mit einem
Polypeptid nach der Erfindung mischt; und
- (b) bestimmt, ob die Testverbindung die Aktivität des Pellinopolypeptids
(oder die dominantnegative Pellinoaktivität) verändert.
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Nach
einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Identifizierung
von Verbindungen zur Verfügung
gestellt, die die Bindungsaktivität von Pellinopolypeptiden inhibieren,
wobei das Verfahren die Schritte umfasst, in denen man
- (a) eine Testverbindung mit einem Polypeptid nach der Erfindung
und einem Bindungspartner dieses Polypeptids mischt; und
- (b) bestimmt, ob die Testverbindung die Bindungsaktivität des Polypeptids
inhibiert. Bei bevorzugten Ausführungsformen
ist der Bindungspartner ein Molekül aus der intrazellulären Signalkaskade;
besonders bevorzugte Bindungspartner werden ausgewählt aus
der Gruppe, die aus TRAF2, TRAF6, IRAK, TRAF1 und den TRAFs 3, 4
und 5 besteht.
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Weiterhin
wird durch die Erfindung eine in vitro-Methode zur Inhibierung der
NF-kB-abhängigen
Transkription zur Verfügung
gestellt, bei der man mindestens ein Polypeptid nach der Erfindung
einsetzt.
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Ebenfalls
wird durch die Erfindung ein in vitro-Verfahren zur Inhibierung
von durch IL-1 vermittelter p38-Kinase-Signalgebung
zur Verfügung
gestellt, wobei das Verfahren die Bereitstellung mindestens eines
Antagonisten eines Polypeptids nach der Erfindung umfasst, wobei
der Antagonist ein Antikörper
ist, der die Aktivität
des Polypeptids inhibiert.
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Ein
anderer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung der Polypeptide
nach der Erfindung als Arzneimittel.
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Eine
weitere Ausführungsform
der Erfindung stellt die Verwendung der „dominant-negativen" Pellinopolypeptide
nach der Erfindung für
die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines entzündlichen
Zustands dar; wobei bei einer bevorzugten Ausführungsform der entzündliche
Zustand ausgewählt
ist aus der Gruppe, die aus Asthma, rheumatoider Arthritis, entzündlicher
Darmkrankheit, Morbus Crohn, ulcerativer Colitis, Atherosklerose
und Alzheimer Krankheit besteht.
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Weiterhin
gehören
zum Bereich der vorliegenden Erfindung Fusionsproteine, die jedes
der zuvor erwähnten
Polypeptide und ein Polypeptid umfassen können, das ausgewählt ist
aus der Gruppe, bestehend aus einer Immunoglobulin-Fc-Domäne, einem
FLAG-Peptid, einem Peptid mit mindestens etwa sechs His-Bausteinen,
einem Leucin-Zipper, einem GFP-Peptid, einem PkA-Peptid, einem birA-Peptid
und einem GST-Peptid. Nukleinsäuremoleküle, die
für diese
Fusionsproteine kodieren, sind ebenfalls in die vorliegende Erfindung
einbezogen, ebenso wie rekombinante Expressionsvektoren, die eine
der zuvor erwähnten
DNAs enthalten, Wirtszellen, die mit diesen Expressionsvektoren
transformiert oder transfiziert sind, und Verfahren zur Herstellung
von Polypeptiden, in denen man diese Wirtszellen unter Bedingungen
kultiviert, die die Expression fördern,
und die Polypeptide isoliert. Die Erfindung stellt weiterhin transgene
oder knock-out-Tiere zur Verfügung, die
unter Verwendung der DNAs nach der Erfindung erzeugt wurden. Die
Erfindung stellt auch Antikörper
zur Verfügung,
die Polypeptide nach der Erfindung spezifisch binden, einschließlich von
monoklonalen Antikörpern und
humanen Antikörpern.
Schließlich werden
Assays zur Identifizierung von kleinen Molekülen zur Verfügung gestellt,
die die IL-1-Signalgebung
regulieren, wobei ein Peptid nach der Erfindung verwendet wird.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Wir
haben murine und humane Pellino-1 und -2 sowie humanes Pellino-3
identifiziert, neue Pellinopolypeptide mit strukturellen Merkmalen,
die für
die Pellinofamilie charakteristisch sind. Durch Expression einer dieser
in Säugern
vorkommenden Pellino-Isoformen, nämlich von murinem Pellino-1,
in COS-Zellen zeigen wir, dass verschiedene NF-kB induzierende Stoffe
spezifisch bewirken, dass Pellino-1 proteolytisch in eine unlösliche Form
umgewandelt wird. Weiterhin zeigen wir, dass die Expression von
Pellinopolypeptiden, wie z.B. Pellino-1 und Pellino-2, NF-kB-abhängige Reportergene
stark aktiviert und die Jub N-terminale Kinase-, p38-Kinase- sowie
die durch 1L-1 vermittelte ERK-Signalgebung vermehrt bzw. verstärkt und
dass mutierte Formen von Pellino, denen konservierte Motive fehlen,
eine basale und Zytokin-induzierte NF-kB-Aktivierung ebenso wie
die von p38 abhängige
Transkription unterdrücken.
Die Moleküle
nach dieser Erfindung sind nützlich
für, oder
führen
zu, Therapien gegen entzündliche
Prozesse. Die Entdeckung der Polynukleotide nach der Erfindung ermöglicht die
Konstruktion von Expressionsvektoren, die DNA enthalten, welche
für Polypeptide
kodiert; von Wirtszellen, die mit den Expressionsvektoren transformiert
oder transfiziert sind, die Entwicklung von transgenen oder knock-out
Zellen oder -Tieren; die Gewinnung von isolierten und gereinigten
Polypeptiden sowie Fragmenten davon; die Verwendung der entsprechenden
Polynukleotide als Sonden oder Primer, um für Proteine mit Pellino-Aktivität kodierende
DNA zu identifizieren; Die Verwendung von einsträngigen, von den Nukleinsäuren abgeleiteten
Sinn- oder Antisinn-Oligonukleotiden, um die Expression und/oder
Funktion von Polynukleotiden zu inhibieren, die durch die Pellinogene
kodiert werden; die Verwendung solcher Polynukleotide oder Polypeptide
zur Identifizierung kleiner molekularer Inhibitoren der Proteinassoziation
oder -funktion von Pellino; Die Verwendung solcher Polynukleotide
oder Polypeptide zur Identifizierung anderer Moleküle, die bei
der IL-1-Signalgebung beteiligt sind; die Verwendung solcher Polypeptide
und deren Fragmente zur Herstellung von Antikörpern; und die Verwendung solcher
Antikörper
zur Reinigung der Pellinopolypeptide.
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Die
Aminosäuresequenzen
von murinem und humanem Pellino-1, murinem und humanem Pellino-2 sowie
humanem Pellino-3 Polypeptid sind in SEQ ID NOs:2, 4, 6, 8 bzw.
12 wiedergegeben, und ein Vergleich, der die Ähnlichkeiten in den Sequenzen
zwischen murinem und humanem Pellino-1 und -2, humanem Pellino-3
und anderen Pellinopolypeptiden zeigt, ist in Tabelle 1 im nachfolgenden
Beispiel 1 dargestellt. Die Pellinopolypeptid-Familie ist bemerkenswert
gut konserviert, wobei die humanen Familienmitglieder einander sehr ähnlich sind
und homologen Mitgliedern der Pellinofamilie von anderen Spezies,
wie z.B. Mus musculus, extrem ähnlich
sind.
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Zu
den typischen strukturellen Elementen, die die Mitglieder der Pellinopolypeptid-Familie
teilen, zählen
eine besonders gut konservierte zentrale Domäne, die sich von der Aminosäure 132
bis einschließlich
zur Aminosäure
193 in Pellino-1 erstreckt (SEQ ID NOs: 2 und 4; die Aminosäuren 134
bis einschließlich
195 in SEQ ID NO:8 und den Aminosäuren 158 bis einschließlich 219
in SEQ ID NO:12 entsprechen); ein absolut konserviertes Motiv von
dem Baustein 245 bis zum Baustein 254 der SEQ ID NOs:2 und 4 (den
Aminosäuren 247
bis einschließlich
256 in SEQ ID NO:8 und den Aminosäuren 271 bis einschließlich 280
in SEQ ID NO:12 entsprechend); und eine Domäne („die RING-Finger-artige Domäne"), die der C3HC4
RING-Finger Unterfamilie von Zink-Finger Domänen ähnlich ist, von der Aminosäure 333
bis einschließlich
zur Aminosäure
398 der SEQ ID NOs:2 und 4 (den Aminosäuren 335 bis einschließlich 400
in SEQ ID NO:8 und den Aminosäuren
360 bis einschließlich
425 in SEQ ID NO:12 entsprechend). Es gibt innerhalb der RING-Finger-artigen
Domäne
bestimmte Cysteinbausteine mit Schlüsselfunktion, sodass Substitutionen
dieser Bausteine wahrscheinlich zu einer veränderten Funktion oder zu einem
Ausfall von Funktionen der betreffenden Pellinopolypeptide führen werden.
Die konservierten Cycsteinbausteine innerhalb der Pellinopolypeptide
befinden sich an den Positionen 333, 336, 367, 371, 395 und 398
der SEQ ID NOs:2 und 4 (und an den Positionen 335, 338, 369, 373,
397 und 400 von SEQ ID NO:8 sowie an den entsprechenden Positionen
von SQ ID NO:6; und an den Positionen 360, 363, 394, 398, 422 und
425 von SEQ ID NO:12). Der Fachmann wird erkennen, dass die zuvor
beschriebenen Grenzen der Regionen von murinem und humanem Pellino-1
und -2 und von humanen Pellino-3- Polypeptiden ungefähre Grenzen
sind und dass die genauen Grenzen dieser Domänen zwischen den einzelnen Mitgliedern
der Pellinopolypeptid-Familie auch von Mitglied zu Mitglied differieren
können.
Es geht jedoch aus den obigen Erläuterungen und aus Tabelle 1
klar hervor, dass alle murinen und humanen Pellino-1- und -2 sowie
alle humanen Pellino-3-Polypeptide eine Gesamtstruktur aufweisen,
die untereinander und mit der Struktur anderer Pellinopolypeptide
konsistent ist.
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Zu
den biologischen Aktivitäten,
die mit murinem und humanem Pellino-1 und -2 sowie mit humanen Pellino-3-Polypeptiden
verbunden sind, gehören
die Stimulierung von MAP Kinase-aktivierten Signaltransduktionen,
wie z.B. die proinflammatorischen Signaltransduktionen und insbesondere
die Stimulierung der Transkription von „Downstreampromotoren", wie z.B. von NF-kB-
und p38-abhängigen
Promotoren. Dass murines und humanes Pellino-1 und -2 sowie humane
Pellino-3-Polypeptide MAP Kinase-aktivierte Signaltransduktionen
zu aktivieren vermögen,
hängt mit
vielen Domänen
der Pellinopolypeptide zusammen (wie z.B. mit der N-terminalen Domäne, der
zentral konservierten Domäne,
der RING-Finger-artigen Domäne
und der C-terminalen Domäne)
oder mit den Polypeptiden insgesamt zusammen, weil gezeigt worden
ist, dass Deletionen von N- oder C-terminalen Domänen und
bestimmte Modifikationen von Schlüsselbausteinen in Pellino-1
entweder die stimulierende Aktivität aufheben oder „dominant-negative" Pellino-1-Mutanten
ergeben, die die MAP Kinase-aktivierten Signaltransduktionen inhibieren.
Dass und in welchem Maße
murines und humanes Pellino-1 oder -2 sowie humane Pellino-3-Polypeptide MAP Kinase-aktivierte
Signaltransduktionen zu stimulieren vermögen, kann z.B. in einem Assay
bestimmt werden, der die Transkription von Reportergenen, wie z.B.
der für Luciferase
kodierenden Sequenz oder der für
Chloramphenicolacetyltransferase (CAT) kodierenden Sequenz, von Downstreampromotoren,
wie z.B. der NF-kB-abhängige
IL-8-Promotor oder der p38-abhängige CHOP-Promotor, misst.
Pellinopolypeptide, die die MAP Kinase-abhängige Signaltransduktion stimulieren, zeigen
mindestens 10% (vorteilhaft mindestens 25% und insbesonder mindestens
50%) dieser stimulierenden Aktivität, verglichen mit derjenigen
von murinem Pellino-1, gemessen mit den NF-kB-abhängigen
IL-8-Promotor-Luciferasereportergen-Assays des Beispiels 2.
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Marines
und humanes Pellino-1 und -2 sowie humane Pellino-3-Polypeptide
sind auch Substrate für Proteasen,
wie z.B. Chymotrypsin-artige Serinproteasen, und zeigen eine Veränderung
in der Löslichkeit
als Antwort auf die Stimulierung von Zellen durch stimulierende
Moleküle,
wie z.B. TNF-alpha
und PMA. Die Proteasesubstrataktivität hängt mit der zentralen Domäne von murinem
und humanem Pellino-1 und -2 sowie humanen Pellino-3-Polypeptiden
zusammen. Diese zentrale Domäne
umfasst die Bausteine 154 und 165 von SEQ ID NO:2 (oder die entsprechenden
Bausteine von anderen Pellinopolypeptiden). Es ist gezeigt worden, dass
Substitutionen dieser Bausteine die Spaltung von Pellino-1 reduziert.
Daher zählen
für Verwendungen, welche
Pellino-Proteasesubstrataktivität
erfordern, zu den bevorzugten murinen und humanen Pellino-1 oder -2
und humanen Pellino-3-Polypeptiden diejenigen, die die Bausteine
154 und 165 von SEQ ID NO:2 (oder die entsprechenden Bausteine von
anderen Pellinopolypeptiden) enthalten oder die konservierte Zentraldomäne besitzen,
und die eine proteolytische Spaltung als Antwort auf eine geeignete
Zellstimulierung, wie z.B. eine Behandlung mit TNF-alpha oder PMA,
zeigen. Zu den bevorzugten murinen und humanen Pellino-1- und -2- sowie
humanen Pellino-3-Polypeptiden zählen
weiterhin Oligomere oder Fusionsproteine, die zumindest eine konservierte
Zentraldomäne
von einem oder mehreren murinen oder humanen Pellino-1- oder -2
oder humanen Pellino-3-Polypetiden oder Fragmente dieser Polypeptide
enthalten, die eine proteolytische Spaltung als Antwort auf eine
geeignete Zellstimulierung, z.B. durch Behandlung mit TNF-alpha
oder PMA, zeigen. Die Proteasesubstrataktivität von murinem und humanem Pellino-1
und -2 sowie von humanen Pellino-3-Polypeptiden kann z.B. in einem
Assay bestimmt werden, in dem das Ausmaß der Spaltung der Pellinopolypeptide
gemessen wird, wie in den folgenden Beispielen 3 und 4 beschrieben
ist. Pellinopolypeptide mit Proteasesubstrataktivität haben
vorteilhaft mindestens 10% (vorteilhafter mindestens 25% und besonders
vorteilhaft mindestens 50%) der Proteasesubstrataktivität von murinem
Pellino-1-FLAG, gemessen in den Assays der Beispiele 3 und 4.
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Zu
den biologischen Aktivitäten
oder Funktionen, die mit bestimmten Mutanten oder veränderten
Formen von murinem oder humanem Pellino-1 oder -2 und humanen Pellino-3-Polypeptiden
verbunden sind, zählen
die Inhibierung von MAP Kinase-aktivierten Signal-transduktionen,
wie z.B. die proinflammatorische Signaltransduktion, und insbesondere
die Inhibierung der Transkription von Downstreampromotoren, wie
z.B. NF-kB- und p38-abhängige
Promotoren. Dass diese mutierten murinen und humanen Pellino-1 und
-2-Polypeptide und humanen Pellino-3-Polypeptide die MAP Kinaseaktivierte
Signaltransduktion zu inhibieren vermögen, hängt mit Änderungen in bestimmten Domänen der
Pellinopolypeptide zusammen, wie z.B. in der N-terminalen Region,
der zentralen konservierten Domäne und
der RING-Finger-artige Domäne,
weil gezeigt worden ist, dass Deletionen der N-terminalen Aminosäuren 50
oder 99 und bestimmte Modifikationen in der zentralen konservierten
Domäne
und der RING-Fingerdomäne
in murinem Pellino-1 zu „dominant
negativen" Pellino-1-Mutanten
führen,
die MAP Kinase-aktivierte Signaltransduktionen inhibieren (siehe
das folgende Beispiel 2). Dass, und in welchem Maße murine
und humane Pellino-1 und -2 Polypeptide sowie humane Pellino-3-Polypeptide
die MAP Kinase-aktivierte Signaltransduktion inhibieren, kann z.B.
in einem Assay bestimmt werden, in dem die Transkription von Reportergenen
gemessen wird, z.B. der für
Luciferase kodierenden Sequenz oder der für Chloramphenicolacetyltransferase
(CAT) kodierenden Sequenz, oder der Sequenz von Downstreampromotoren,
wie z.B. der NF-kB-abhängige
IL-8-Promotor oder der p38-abhängige
CHOP-Promotor. Pellinopolypeptide,
die MAP Kinase-aktivierte Transduktionswege inhibieren, haben vorteilhaft
mindestens 10% (vorteilhafter mindestens 25% und besonders vorteilhaft
mindestens 50%) dieser inhibierenden Aktivität im Vergleich mit derjenigen
der murinen Pellino-1-FLAG „d133-156-FLAG" Mutante, gemessen
mit den NF-kB-abhängigen
IL-8-Promotor-Luciferasereportergen-Assay des Beispiels 2.
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Die
Bezeichnung „Pellinopolypeptidaktivität", wie sie hierin
gebraucht wird, schließt
eine oder mehrere der folgenden Aktivitäten ein: Stimulierung der MAP
Kinase-aktivierten Signaltransduktionen, Proteasesubstrat-Aktivität und Defensivaktivität von Wirtsorganismen
gegen Pathogene, ebenso wie die ex vivo und in vivo-Aktivitäten von
natürlichen
Pellinopolypeptiden. Die Bezeichnung „dominant-negative Aktivität eines
Pellinopolypeptids",
wie sie hierin gebraucht wird, schließt die Inhibierung von MAP
Kinase-aktivierten Signaltransduktionen, anti-inflammatorische Aktivität und die
Fähigkeit
ein, Bindungspartner in den unlöslichen
Zellfraktionen zu sequestrieren, ebenso wie die ex vivo- und in
vivo-Aktivitäten von
mutierten Pellinopolypeptiden, die dieses inhibierenden Aktivitäten in Reportergenassays
zeigen. Das Ausmaß,
in dem die einzelnen Mitglieder der Pellinopolypeptid-Familie sowie
Fragmente und andere Derivate dieser Polypeptide diese Aktivitäten zeigen,
kann mittels üblicher
Standardassays bestimmt werden, insbesondere mittels Assays, wie
sie in den folgenden Beispielen 2, 3 und 4 beschrieben werden. Hierin
werden beispielhafte Assays beschrieben; Der Fachmann wird erkennen,
dass andere, ähnliche
Arten von Assays ebenfalls verwendet werden können, um biologische Aktivitäten von
Pellinopolypeptiden zu bestimmen.
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Ein
anderer Aspekt der biologischen Aktivitäten von Pellinopolypeptiden
ist ihre Eigenschaft, mit bestimmten intrazellulären Signaltransduktionsmolekülen in Wechselwirkung
zu treten, wie z.B. mit TRAF2, TRAF6, IRAK, TRAF1 und den TRAFs3,
4 und 5, wobei die RING-Finger-artige Domäne der Pellinopolypeptide wahrscheinlich
in die Bindung an solche Bindungspartner involviert ist. Die konservierte
zentrale Domäne der
Pellinopolypeptide tritt in Wechselwirkung mit einer Chymotrypsinartigen
Serinprotease, welche Pellinopolypeptide spaltet, und es wird angenommen,
dass der N-terminale Teil von Pellinopolypeptiden einen Faktor bindet,
der daran beteiligt ist, Pellinopolypeptide in dem Teil der zellulären Umgebung
zu lokalisieren, der nach der Lyse der Zellen zu der löslichen
Fraktion wird, oder sie dorthin zu transportieren. Somit wird, wenn
der N-terminale Teil von Pellino-1 deletiert wird, dieses Pellinopolypeptid
konstitutiv in der unlöslichen
Fraktion lokalisiert, bleibt jedoch noch in der Lage, die MAP Kinase-aktivierte
Signaltransduktion zu inhibieren, wahrscheinlich durch Bindung von
signaltransduzierenden Molekülen
mittels seiner RING-Finger-artigen Domäne. Die Bezeichnung „Bindungspartner", wie sie hierin
gebraucht wird, schließt
Liganden, Rezeptoren, Substrate, Antikörper, andere Pellinopolypeptide,
dasselbe Pellinopolypeptid (im Fall von homotypischen Wechselwirkungen)
sowie jedes andere Molekül
ein, das mit einem Pellinopolypeptid durch Kontakt oder die Nähe von bestimmten
Teilen des Bindungspartners und des Pellinopolypeptids in Wechselwirkung
tritt. Weil angenommen wird, dass die RING-Finger-artige Domäne von Pellinopolypeptiden
bei der Signaltransduktion an einen Bindungspartner bindet, ist
zu erwarten, dass die RING-Finger-artige Domäne, wenn sie als separates
Fragment von dem Rest eines Pellinopolypeptids exprimiert wird,
aber mit einem Anteil der N-terminalen Domäne, der genügend groß ist, um eine Lokalisierung
des Pellinopolyptids in der nicht löslichen Fraktion zu ermöglichen, die
Bindung der natürlichen
Pellinopolypeptide an ihre Bindungspartner unterbricht. Zu den besonders
geeigneten Assays zur Feststellung und Messung einer Bindung zwischen
Pellinopolypeptiden und ihren Bindungspartnern zählen der Biolumineszenzresonanzenergie-Transfer
(BRET), der mit einer Biolumineszenzluciferase arbeitet, die genetisch
mit einem der Kandidatenproteine fusioniert ist, beispielsweise
mit einem Pellinopolypeptid, sowie ein mutiertes, grün fluoreszierendes
Protein, das mit einem anderen interessierenden Protein fusioniert
ist, beispielsweise mit TRAF2, IRAK, TRAF6 oder einem anderen potentiellen
Proteinbindungspartner. Wechselwirkungen zwischen den beiden Fusionsproteinen
bringen die Luciferase und das grüne Fluoreszenzprotein eng genug
zusammen, so dass ein Resonanzenergietransfer stattfinden kann,
wodurch die Farbe der Biolumineszenzemission verändert wird. Am besten können die
Partner-bindenden Aktivitäten
von Pellinopolypeptiden durch Verwendung des Proteinfragmentkomplementierungs-Assays
bestimmt werden, wie er von Remy und Michnik, 1999, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 96:5394-5399 und in WO 01/00866 beschrieben wurde.
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Es
wird angenommen, dass Pellinopolypeptide, wie z.B. murines und humanes
Pellino-1 oder -2 und humane Pellino-3-Polypeptide, mit der Fähigkeit,
die MAP Kinase-aktivierte Signaltransduktion zu stimulieren, eine
Rolle beim Schutz von Wirtsorganismen gegen virale, bakterielle,
fungale und andere Arten von Pathogenen spielen, indem sie Immunantworten
induzieren. Weiterhin sind Pellinopolypeptide in Immun- oder entzündliche
Krankheiten oder Zustände
involviert, die in ihrer Ätiologie
als gemeinsames Merkmal die Stimulierung einer MAP Kinase-aktivierten
Signaltransduktion sowie eine NF- kB-
und/oder p38-abhängige
Transkription aufweisen. Der therapeutische Effekt der Stimulierung
der MAP Kinase-aktivierten Transduktionen, z.B. durch Verabreichung
eines Pellinopolypeptids mit natürlicher
Aktivität,
oder eines Agonisten eines solchen Pellinopolypeptids, wird in den
folgenden Beispielen von Zuständen
gezeigt, in denen die Stimulierung der NF-kB-abhängigen Transkription von Nutzen
war (Yamamato und Gaynor, 2001, J. Clin. Invest. 107:135-142). Die
NF-kB-abhängige Transkription
moduliert das Überleben
von B-Lymphozyten, die Mitogen-abhängige Zellproliferation und
den Wechsel zwischen Isotypen (isotype switching), die zu der Differenzierung
von B-Lymphozyten zu Plasmazellen führen. Weiterhin reguliert NF-kB
die Produktion von IL-2, wodurch die Proliferation und Differenzierung
von T-Lymphozyten erhöht
und auch die Entwicklung von Helfer-T-Zellen erhöht wird, und wodurch die Zell-vermittelte
Immunität
verstärkt
wird. Somit führt
die Aktivierung von NF-kB zur Induzierung einer Mehrzahl von Genen,
die die Immunantwort regulieren. Der NF-kB-Weg ist auch ein Mediator
von Genen mit Schlüsselfunktion,
die bei der Kontrolle der zellulären
Proliferation und Apoptose eine Rolle spielen. Zu den anti-apoptotischen
Genen, die durch NF-kB direkt aktiviert werden, gehören die
zellulären
Inhibitoren der Apoptose (c-IAP1, c-IAP2 und IXAP), TNF-Rezeptor
assoziierte Faktoren (TRAF-1 und TRFA-2), das Bc12-Homologe A1/Bfll
und IEX-IL. Die anti-apoptotischen Proteine blockieren die Aktivierung
von Caspase-8, einer Initiatorprotease, die an einer frühen Phase
beteiligt ist, in der die apoptotische Schrittfolge stimuliert wird,
und die Induzierung der Expression von A1/Bfl-1 durch NF-kB verhindert
die Freisetzung von Cytochrom c durch Mitochondrien sowie die Aktivierung
von Caspase-3. Die NF-kB-Aktivierung kann somit durch Steigerung
der Expression von antiapoptotischen zellulären Proteinen die Apoptose
als Antwort auf eine Behandlung mit verschiedenen chemotherapeutischen
Wirkstoffen vermindern. Weiterhin ist NF-kB am Schutz von Zellen
vor dem Untergang durch Apoptose als Antwort auf eine Schädigung von
DNA oder eine Behandlung mit Zytokinen beteiligt.
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Der
therapeutische Effekt der Inhibierung von MAP Kinase-aktivierten
Wegen, beispielsweise durch Verabreichung eines Pellinopolypeptids
mit "dominant-negativer" inhibierender Aktivität oder von
deren Fragmenten oder Fusionsproteinen mit „dominant-negativer" Aktivität oder anderen
Antagonisten von Pellinopolypeptiden mit natürlicher Aktivität, wird
in den folgenden Beispielen für
Zustände
gezeigt, in denen die Inhibierung der NF-kB-abhängigen Transkription von Nutzen
ist (Yamamoto und Gaynor, 2001, J. Clin. Invest. 107:135-142). NF-kB
reguliert die Antwort von Wirtsorganismen auf Entzündungen,
indem es die Expression von spezifischen zellulären Genen steigert, einschließlich von
Genen, die für
mindestens 27 verschiedene Zytokine und Chemokine kodieren. Zytokine,
die durch NF-kB stimuliert werden, wie z.B. IL-1-beta und TNF-alpha,
können
auch den NF-kB-Weg aktivieren und somit einen positiven autonom
regulierten Regelkreis etablieren, der die Antwort auf die Entzündung amplifizieren
und die Dauer der chronischen Entzündung verlängern kann. NF-kB stimuliert
auch die Expression von Enzymen, deren Produkte zu der Pathogenese
des Entzündungsprozesses
beitragen, einschließlich
der induzierbaren Form von Stickstoffoxidsynthase (iNOS), die Stickstoffinonoxid
generiert, und der induzierbaren Cyclooxygenase (COX-2), die Prostanoide
generiert. Die Aktivierung des NF-kB-Weges spielt bei der Pathogenese
von chronischen entzündlichen
Krankheiten eine Rolle, wie z.B. bei Asthma, rheumatoider Arthritis
und entzündlichen
Darmkrankheiten, sowie von anderen Krankheiten, bei denen Entzündung eine
Rolle spielt, wie z.B. Atherosklerose und Alzheimer. Verschiedene Evidenzlinien
legen nahe, dass die NF-kB-Aktivierung von für Zytokine kodierenden Genen
einen wichtigen Beitrag zu der Pathogenese von Asthma leistet, das
durch die Infiltration von entzündeten
Zellen und Disregulierung von vielen Zytokinen und Chemokinen in
der Lunge gekennzeichnet ist. Der Spiegel von Zytokinen, wie z.B.
TNF-alpha, die NF-kB aktivieren, sind in der Synovialflüssigkeit
von Patienten mit rheumatoider Arthritis erhöht und tragen zu den chronischen
entzündlichen
Veränderungen
und der synovialen Hyperplasie bei, die in den Gelenken dieser Patienten
beobachtet werden. Steigerungen der Produktion von proinflammatorischen Zytokinen
sowohl durch Lymphozyten als auch durch Makrophagen ist ebenfalls
in der Pathogenese von entzündlichen
Darmkrankeiten impliziert gewesen, mit Einschluss von Morbus Crohn
und Magengeschwüren
(Colitis ulcerosa). Die NF-kB-Aktivierung wird in mittels Biopsie
gewonnenen Schleimproben von Patienten mit Morbus Crohn oder Magengeschwüren festgestellt.
Die Behandlung von Patienten, die an entzündlichen Darmkrankheiten leiden,
mit Steroiden setzt die NF-kB-Aktivität in Biopsieproben herab und
mildert die klinischen Symptome. Diese Resultate legen nahe, dass
die Stimulierung des NF-kB-Weges in die verstärkte Antwort auf entzündliche
Vorgänge,
die mit diesen Krankheiten einhergehen, involviert sein kann. Atherosklerose wird
durch zahlreiche Einwirkungen auf das Endothelium und die glatten
Muskeln der beschädigten
Gefäßwand ausgelöst. Eine
große
Zahl von Wachstumsfaktoren, Zytokinen, und Chemokinen, die von endothelialen Zellen,
glatten Muskeln, Makrophagen und Lymphozyten frei gesetzt werden,
sind an diesem chronischen entzündlichen
und fibroproliferativen Prozess beteiligt. Die Regulierung von Genen,
die an der Antwort auf Entzündungen
sowie an der Kontrolle der zellulären Proliferation durch NF-kB
beteiligt sind, spielt wahrscheinlich eine wichtige Rolle bei der
Initiierung und dem weiteren Verlauf von Atherosklerose. Anomalien
bei der Regulierung des NF-kB-Weges können bei der Pathogenese der
Alzheimer-Krankheit beteiligt sein. Beispielsweise wird NF-kB-Immunreaktivität vornehmlich
in den und rund um die frühen,
für die
Alzheimer-Krankheit typischen neuritischen Plaques gefunden, während reife
Plaques stark verminderte NF-kB-Aktivität zeigen. Somit könnte die
NF-kB-Aktivierung in die Initierung von neuritischen Plaques und
neuronale Apotose in den frühen
Stadien der Alzheimer-Krankheit involviert sein. Zu anderen Zuständen, bei
denen Entzündungen
eine Rolle spielen und bei denen man erwarten kann, dass sie durch
eine Verminderung der MAP Kinase-aktivierten pro-inflammatorishen
Signaltransduktion gebessert werden, zählen Osteoporose, Schlaganfälle, multiple
Sklerose und multiple Myelome. Weitere Beispiele für Krankheiten,
bei denen Entzündungen
und/oder zelluläre
Antworten auf Entzündungen
eine Rolle spielen, sind im U.S. Patent Nr. 6,204,261 in Spalte
206, Zeile 25 bis Spalte 207, Zeile 44 beschrieben. Zusätzlich zu
einer Rolle bei der Pathogenese von Krankheiten, die durch eine
Verstärkung
der Antwort des Wirtsorganismus auf eine Entzündung charakterisiert sind,
ist auch eine konstitutive Aktivierung des NF-kB-Weges bei der Pathogenese
einiger humaner Krebsarten festgestellt worden. Anomalien in der
Regulierung des NF-kB-Weges werden oft bei verschiedenen bösartigen
Krankheiten, einschließlich
von Leukämie,
Lymphomen und festen Tumoren beobachtet. Diese Anomalien führen zu
konstitutiv hohen Graden von NF-kB in den Kernen einer Vielzahl
von Tumoren mit Einschluss von Brust-, Eierstock, Prostata- und Darmkrebs.
Die Mehrzahl dieser Veränderungen
geht wahrscheinlich auf Änderungen
in regulatorischen Proteinen zurück,
die Signaltransduktionswege aktivieren, welche zur Aktivierung des
NF-kB-Weges führen.
Die Verhinderung, Blockierung und/oder Inhibierung der Wechselwirkung
zwischen Pellinopolypeptiden und ihren Bindungspartnern ist einer
der Aspekte der Erfindung, die Methoden für die Behandlung und Besserung
dieser Krankheiten und Zustände
zur Verfügung
stellt, wozu sie Inhibitoren für
Aktivitäten
von natürlichen
Pellinomolekülen
verwendet, wie z.B. die Stimulierung der NF-kB-abhängigen Transkription.
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POLYNUKLEOTIDMOLEKÜLE
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In
einer besonderen Ausführungsform
betrifft die Erfindung bestimmte isolierte Polynukleotidmoleküle, die
frei von kontaminierendem endogenen Material sind. Die Bezeichnung „Polynukleotidmoleküle" bezieht sich auf
Polynukleotidmoleküle
in Form von separaten Fragmenten oder einer Komponente von größeren Polynukleotidkonstrukten.
Die Polynukleotidmoleküle
sind vorzugsweise von DNA oder RNA abgeleitet worden, die zumindest
einmal in im wesentlichen reiner Form und in einer Menge oder Konzentration
isoliert worden ist, die eine Identifizierung, Handhabung und Gewinnung
der Nukleotidsequenzen nach üblichen
chemischen Methoden gestatteten (wie sie z.B. in Sambrok et al.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989 beschrieben sind).
Die Sequenzen werden vorteilhaft dargestellt und/oder konstruiert
in der Form eines offenen Leserasters, das nicht durch interne,
nicht translatierte Sequenzen oder Introns unterbrochen wird, die
typischerweise in eukaryotischen Genen vorhanden sind. Die Sequenzen
von nicht translatierter DNA können
3' oder 5' von einem offenen
Leseraster vorhanden sein, wo sie bei der Manipulation oder Expression
der kodierenden Region nicht stören.
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Polynukleotidmoleküle nach
der Erfindung schließen
DNA sowohl in einsträngiger
als auch in doppelsträngiger
Form ein, ebenso wie die entsprechenden komplementären Sequenzen.
Die Bezeichnung DNA schließt
z.B. cDNA, genomische DNA, chemisch synthetisierte DNA, mittels
PCR amplifizierte DNA sowie Kombinationen daraus ein. Genomische
DNA kann nach üblichen
Techniken isoliert werden, beispielsweise unter Verwendung der cDNA
der SEQ ID NOs: 1, 3, 5 oder 7 oder eines geeigneten Fragments davon
als Sonde. Zu den DNA-Molekülen
nach der Erfindung zählen
DNAs, die für
Pellinopolypeptide von voller Länge
kodieren, ebenso wie Polynukleotide und Fragmente davon. Die Polynukleotide
nach der Erfindung sind vorzugsweise humanen Ursprungs, aber die
Erfindung schließt
auch von anderen Spezies abgeleitete Polynukleotide ein.
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Die
vorliegende Anmeldung beschreibt murine Pellino-1-DNA, die die Polynukleotidsequenz
gemäß SEQ ID
NO:1 aufweist, und das Polypeptid, für das die DNA gemäß SEQ ID
NO:1 kodiert und das die Aminosäuresequenz
gemäß SEQ ID
NO:2 hat. Das Polypeptid mit den Aminosäuren von 132 bis einschließlich 189 der
SEQ ID NO:2 ist ein Zielort für
die Proteaseaktivität
eines Mitglieds der Chymotripsinfamilie von Proteasen. Die vorliegende
Anmeldung beschreibt weiterhin humane Pellino-1-DNA mit der Polynukleotidsequenz, die durch
SEQ ID NO:3 wiedergegeben wird, und das Polypeptid, für das die
DNA gemäß SEQ ID
NO:3 kodiert und das die Aminosäuresequenz
gemäß SEQ ID
NO:4 aufweist. Ein spezifischer Zielort für eine Protease ist auch in
diesem Polypeptid vorhanden und wird durch die Aminosäuren 132
bis einschließlich
189 von SEQ ID NO:4 definiert. Weiterhin beschrieben wird die DNA
von murinem Pellino-2, die die in SEQ ID NO:5 wiedergegebene Polynukleotidsequenz
besitzt, sowie das Polypeptid, für
das das Polynukleotid gemäß SEQ ID
NO:5 kodiert und das die Aminosäuresequenz
aufweist, die in SEQ ID NO:6 wiedergegeben ist. Der Zielort für die Protease
liegt zwischen den Aminosäuren
133 und 190 von murinem Pellino-2. In ähnlicher Weise liegt der Zielort
für die
Protease bei humanem Pellino-2 wahrscheinlich zwischen den Aminosäuren 134
und 191 von SEQ ID NO:8. Die zuvor beschriebenen Proteasezielortsequenzen
in SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 und SEQ ID NO:6 können um eine oder mehrere Aminosäuren variieren.
So kann der Aminoterminus der Proteasezielregion für SEQ ID
NO:2 und SEQ ID NO:4 bei den Aminosäuren 130 bis einschließlich 134
und der Carboxyterminus der Zielregion bei den Aminosäuren 187
bis einschließlich
191 liegen. In ähnlicher
Weise liegt bei SEQ ID NO:6 der Aminoterminus der Proteasezielregion
bei einer der Aminosäuren
131 bis einschließlich
135 (Aminosäuren
132 bis einschließlich
136 von SEQ ID NO:8) und der Carboxyterminus bei einer der Aminosäuren 188
bis einschließlich
192 (Aminosäuren
189 bis 193 von SEQ ID NO:8).
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Infolge
der bekannten Degeneration des genetischen Codes, nach der mehrere
Kodons für
die selbe Aminosäure
kodieren können,
kann eine DNA von der in SEQ ID NO:1 dargestellten Sequenz abweichen
und dennoch für
ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO:2 kodieren. Solche DNA-Varianten können durch stille Mutationen
verursacht werden, die natürlich
stattfinden, oder bei der Amplifizierung mittels PCR entstehen,
oder sie können
das Produkt einer willkürlichen
Mutagenese einer natürlichen
Sequenz sein. Das selbe gilt für
die DNAs, die in den SEQ ID NOs: 3, 5 und 7 wiedergegeben sind.
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Die
Anmeldung beschreibt isolierte DNA, die für Polypeptide nach der Erfindung
kodiert und ausgewählt
ist aus: (a) DNAs, die die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:1 enthalten;
(b) DNAs, die die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:3 enthalten; (c)
DNAs, die die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:5 enthalten; (d) DNAs, die
für die
Polypeptide kodieren, für
die die DNAs von (a), (b) oder (c) kodieren; (e) DNAs, die mit der
DNA von (a), (b) oder (c) unter moderat stringenten Bedingungen
zu hybridisieren vermögen
und für
ein Polypeptid nach der Erfindung kodieren; (f) DNAs, die mit der
DNA von (a), (b) oder (c) unter hoch stringenten Bedingungen zu hybridisieren
vermögen
und für
ein Polypeptid nach der Erfindung kodieren; und (g) DNAs, die als
Ergebnis der Degenration des genetischen Codes zu einer der unter
(a), (b), (c), (d), (e) oder (f) definierten DNAs degeneriert sind
und für
ein Polypeptid nach der Erfindung kodieren.
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Die
grundlegenden Parameter, die die Wahl der Hybridisierungsbedingungen
beeinflussen, und Leitlinien für
die Wahl geeigneter Bedingungen sind von Sambrook et al., 1989,
beschrieben. Bedingungen von moderater Stringenz im Sinne dieser
Erfindung können
von einem Fachmann, z.B. auf der Grundlage der Länge und/oder der Basenzusammensetzung
der DNA ohne weiteres bestimmt werden. Bei Hybridisierungssonden mit
einer Länge
von mehr als etwa 100 Nukleotiden und auf einem Filter gebundener
Ziel-DNA oder -RNA schließt
eine der Möglichkeiten,
moderat stringente Bedingungen einzustellen, die Verwendung einer
Lösung für die Vorwäsche, die
5XSSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0) enthält, von Hybridisierungspuffer
mit etwa 50% Formamid, 6XSSC und einer Hybridisierungstemperatur
von etwa 42°C
ein (oder anderer, ähnlicher
Hybridisierungslösungen,
wie z.B. einer Lösung,
die 50% Formamid enthält,
bei einer Temperatur von etwa 42°C),
und schließt
weiter Waschbedingungen von etwa 60°C in 0,5XSSC, 0,1% SDS ein.
Die Bedingungen einer hohen Stringenz im Sinne dieser Erfindung
können
von einem Fachmann, z.B. auf der Grundlage der Länge und/oder der Basenzusammensetzung
der DNA, ebenfalls ohne weiteres bestimmt werden. Im allgemeinen
sind diese Bedingungen definiert wie die obigen Hybridisierungsbedingungen,
jedoch mit einer Wäsche
bei etwa 68°C
mit 0,2XSSC,0,1% SDS. Es sollte weiterhin verstanden werden, dass
die Waschtemperatur und die Salzkonzentration der Waschlösung variiert
werden können,
wie es nötig
ist, um unter Anwendung der grundlegenden Prinzipien, die für Hybridisierungsreaktion
und die Stabilität
des Duplex gelten und die dem Fachmann geläufig sind, den gewünschten
Grad an Stringenz zu erreichen (siehe z.B. Sambrook et al., 1989). Es
sollte weiterhin verstanden werden, dass die Hybridisierungsbedingungen
für Oligonukleotidsonden
von definierter Länge
und mit definierter Sequenz mittels Formeln bestimmt werden können, die
in der Technik bekannt sind (siehe z.B. bei Sambrook et al., 1989
unter 11.4511.47).
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Weiterhin
wird in der Anmeldung DNA beschrieben, die für Polypeptidfragmente kodiert,
welche mindestens eine der Aktivitäten von Pellinopolypeptiden
zeigen, sowie DNA, die für
Polypeptide mit mindestens etwa 16 Aminosäuren oder mit mindestens etwa
32 Aminosäuren
kodiert, wobei diese Polypeptide als Immunogene nützlich sind.
Auch DNAs, die für
Polypeptide kodieren, welche einen oder mehrere inaktivierte N-Glykosylierungsorte,
einen oder mehrere inaktivierte Orte für die Einwirkung von Proteasen
oder eine oder mehrere konservative Aminosäuresubstitutionen aufweisen,
wie in der Folge erläutert
werden wird, sind ebenfalls in die Erfindung einbezogen. Beispielsweise
kann die homologe IL-IR-Domäne als ein
negativ-dominanter Regulator für
die IL-IR-Signalübermittelung
oder in einem Assay brauchbar sein, in dem kleine Moleküle identifiziert
werden, die die IL-1-Signalübermittelung
inhibieren oder anderweitig die IL-1 Signalübertragung regulieren.
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Die
in dieser Anmeldung beschriebenen DNA-Moleküle schließen auch Polynukleotide ein,
die zu mindestens 80% mit einer natürlichen Sequenz identisch sind,
ebenso wie Polynukleotidmoleküle,
die zu mindestens 85% mit einem natürlichen Molekül identisch
sind. Weiterhin werden Ausführungsformen
in Betracht gezogen, bei denen ein DNA-Molekül zu mindestens 90% identisch,
zu mindestens 95% identisch, zu mindestens 98% identisch, zu mindesten
99% identisch oder zu mindestens 99,9% identisch ist mit einer natürlichen
Sequenz. „Prozent
Identität" ist definiert als
die Anzahl der zugeordneten Symbole, d.h. der Nukleotide oder Aminosäuren, die
identisch sind, dividiert durch die Gesamtzahl der Symbole in der
kürzeren
der beiden Sequenzen. Der Grad an Homologie (prozentuale Identität) zwischen zwei
Sequenzen kann bestimmt werden, indem man die Alignment-Methode
von Needleman und Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970), überarbeitet
von Smith und Waterman (Adv. Appl. Math. 2:482, 1981) anwendet,
mit einer unären
Matrix (die einen Wert von 1 für
Identität
und einen Wert von 0 für
Nicht-Identität enthält) für Nukleotide
und der gewichteten Vergleichsmatrix nach Gribskov und Burgess (Nuil.
Acids. Res. 14:6745,1986), wie sie von Schwartz und Dayhoff (Atlas
of Protein Sequence and Structure, National Biomediccal Research
Foundation, Seiten 353 bis 358, 1979) beschrieben wurde, für Aminosäuren. Vorteilhaft
wird der Vergleich mittels eines Computerprogramms durchgeführt. Ein Beispiel
für ein
bevorzugtes Computerprogramm ist das Programm der Genetics Computer
Group; (GCG; Madison, WI) Wisconsin Package Version 10.0 'GAP'. Die bevorzugten
voreingestellten Parameter des GAP-Programms schließen ein:
(1) Die GCG-Implementierung der zuvor erwähnten Vergleichsmatrices für Nukleotide und
Aminosäuren;
(2) eine Nachteil „Penalty" von 30 für jede Lücke und
eine zusätzlichen „Penalty" von 1 für jedes
Symbol in jeder Lücke
bei Aminosäuresequenzen;
sowie einen Nachteil von 50 für
jede Lücke
und einen zusätzlichen
Nachteil von 3 für
jedes Symbol in jeder Lücke
für Nukleotidsequenzen;
(3) keine „Penalty" für Endlücken (end
gaps); und (4) keine maximale „Penalty" für längere Lücken. Andere
Programme für
den Vergleich von Sequenzen, die in der Fachwelt bekannt sind, können ebenfalls
benutzt werden.
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In ähnlicher
Weise schließen
die DNAs nach der Erfindung Varianten ein, die von der natürlichen DNA-Sequenz
durch eine oder mehrere Deletionen, Insertierungen oder Substitutionen
abweichen, aber trotzdem für
ein biologisch aktives Polypeptid kodieren. Weiterhin sind DNAs
in die Erfindung einbezogen, die für verschiedene zusätzliche
oder substituierte Aminosäurebausteine
oder -sequenzen oder für
Deletionen von terminalen oder internen Bausteinen oder Sequenzen
kodieren.
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Zu
den Beispielen für
solche DNAs zählen
diejenigen DNAs, die modifiziert wurden, um die Expression eines
Polypeptids mit einem veränderten
Ort für
eine N-Glykosylierung oder für
die Einwirkung einer KEX-2-Protease zu erleichtern, ebenso wie diejenigen
DNAs, in denen für
Cys kodierende Kodons, sofern Cys für die biologische Aktivität nicht
nötig ist,
eliminiert oder so verändert
sind, dass sie für
andere Aminosäuren kodieren.
Diese und andere variierten Peptide sind hierin offenbart; DNAs,
welche für
sie kodieren, sind ebenfalls in die Erfindung eingeschlossen.
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Die
Erfindung stellt auch isolierte DNAs zur Verfügung, die für die Herstellung von Polypeptiden
nützlich
sind. Solche Polypeptide können
nach jeder einer Anzahl von üblichen
Techniken hergestellt werden. DNA-Sequenzen, die für ein Pellinopolypeptid
oder ein gewünschtes
Fragment davon kodieren, können
zur Herstellung des Polypeptids oder Fragments in einen Expressionsvektor
subkloniert werden. Die DNA-Sequenz wird vorteilhaft mit einer Sequenz
fusioniert, die für
ein geeignetes Leader- oder Signalpeptid kodiert.
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Das
gewünschte
DNA-Fragment kann nach bekannten Methoden chemisch synthetisiert
werden. DNA-Fragmente können
auch durch Verdauung einer in voller Länge klonierten DNA-Sequenz
mittels Restriktionsendonukleasen hergestellt und durch Elektrophorese
auf Agarosegelen isoliert werden. Zur Rekonstruktion des 3'- oder 5'-Terminus bis zu
einem bestimmten Punkt können
Oligonukleotide mit einem durch Verdauung mit einem Restriktionsenzym
erhaltenen DNA-Fragment ligiert werden, wenn dies erforderlich ist.
Solche Oligonukleotide können
zusätzlich
einen Ort für
eine Spaltung mittels einer Restriktionsendonuklease oberhalb der
gewünschten
kodierenden Sequenz sowie ein Initiationscodon (ATG) am N-Terminus
der kodierenden Sequenz aufweisen.
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Die
wohlbekannte Polymerasekettenreaktion (PCR) kann ebenfalls verwendet
werden, um eine DNA zu isolieren und amplifizieren, die für ein gewünschtes
Protein oder ein Fragment davon kodiert. Oligonukleotide, die die
gewünschten
Termini des DNA-Fragments definieren, werden als 3'- und 5'-Primer verwendet. Die Oligonukleotide
können
zusätzlich
Erkennungsstellen für
Restriktionsendonukleasen enthalten, die die Inserition des amplifizierten
DNA-Fragments in einen Expressionsvektor erleichtern. PCR-Verfahren
wurden beschrieben von Saiki et al., Science 239:487, 1988; Recombinant
DNA Methodology, Herausgeber Wu et al., Academic Press, Inc., San
Diego, CA (1989), Seiten 189 bis 196; und in PCR Protocols: A Guide
to Methods and Applications, Herausgeber Innis et al., Academic
Press, Inc. (1990).
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch Gene zur Verfügung, die den hierin offenbarten
Nukleinsäuresequenzen
entsprechen. „Entsprechende
Gene" oder „entsprechende
genomische Nukleinsäuren" sind diejenigen
Regionen des Genoms, die transkribiert werden und so die mRNAs hervorbringen,
von denen die cDNA-Nukleinsäuresequenzen
abgeleitet werden, und die aufeinander folgende Sequenzen des Genoms
enthalten können,
die für
die geregelte Expression dieser Gene erforderlich sind. Entsprechende
Gene können
daher, wenn auch nicht hierauf beschränkt, kodierende Sequenzen,
5'- und 3'-untranslatierte
Regionen, alternativ gespleißte
Exons, Introns, Promotoren, Verstärker und Silencer- oder Suppressor-Elemente
enthalten. Entsprechende genomische Nukleinsäuren können genomische Nukleinsäuresequen-zen
mit 10.000 Basenpaaren (vorteilhafter 5.000 Basenpaaren, noch vorteilhafter
2.500 Basenpaaren und am vorteilhaftesten 1.000 Basenpaaren) genomischer
Nukleinsäuresequenz
oberhalb des ersten Nukleotids der genomischen Sequenz umfassen,
die dem Initiationscodon der für
das Pellinopolypeptid kodierenden Sequenz entspricht, und können genomische
Nukleinsäuresequenzen
mit 10.000 Basenpaaren (vorteilhaft 5.000 Basenpaaren, vorteilhafter 2.500
Basenpaaren und am vorteilhaftesten 1.000 Basenpaaren) genomischer
Nukleinsäuresequenz
unterhalb (downstream) des letzten Nukleotids der genomischen Sequenz
umfassen, die dem Terminierungscodon (Stopcodon) der für das Pellinopolypeptid
kodierenden Sequenz entspricht. Die entsprechenden Gene oder genomischen
Nukleinsäuren
können
nach bekannten Methoden auf der Grundlage der hierin gegebenen Sequenzinformation
isoliert werden. Zu diesen Methoden zählen die Herstellung von Sonden
oder Primern aufgrund der ofenbarten Sequenzinformation zur Identifizierung
und/oder Amplifizierung von Genen in geeigneten Genbibliotheken
oder anderen Quellen von genomischen Materialien. Ein „isoliertes
Gen" oder „eine isolierte genomische
Nukleinsäure" ist eine genomische
Nukleinsäure,
die von den benachbarten genomischen Sequenzen abgetrennt wurde,
die in dem Genom des Organismus vorhanden waren, aus dem die genomische Nukleinsäure isoliert
wurde.
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POLYPEPTIDE UND DEREN
FRAGMENTE
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Die
Erfindung umfasst Polypeptide und deren Fragmente in verschiedenen
Formen, einschließlich derjenigen,
die natürlich
vorkommen oder mittels verschiedener Techniken hergestellt werden,
einschließlich von
Verfahren, die rekombinante DNA-Technologie involvieren. Zu diesen
Formen zählen,
wenn auch nicht hierauf beschränkt,
Derivate, Varianten und Oligomere, ebenso wie Fusionsproteine oder
Fragmente davon.
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Die
hierin beschriebenen Polypeptide schließen Proteine mit der vollen
Länge ein,
für die
die zuvor beschriebenen Nukleinsäuresequenzen
kodieren. Zu den Polypeptidsequenzen mit der vollen Länge zählen Aminosäuresequnzen,
wie sie in SEQ ID NOs:2, 4 und 6 mit nützlichen Fragmenten, die die
Aminosäuren
132 bis 289 der SEQ ID NOs:2 und 4 und die Aminosäuren 133
bis 190 von SEQ ID NO:6 umfassen, beschrieben sind. Wie zuvor erwähnt, können die
C-terminalen und die N-terminalen Aminosäuren dieser und anderer Fragmente
um etwa zwei Aminosäuren
von den angegebenen Grenzen abweichen, d.h. der N-Terminus kann zwischen
den Aminosäuren
130 bis 134 der SEQ ID NOs:2 und 4 zwischen den Aminosäuren 131
bis 135 von SEQ ID NO:6 variieren; und der C-Terminus kann zwischen
den Aminosäuren
187 bis 191 von SEQ ID NOs:2 und 4 und zwischen den Aminosäuren 188
bis 192 von SEQ ID NO:6 variieren.
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Die
erfindungsgemäßen Peptide
und deren Fragmente können
als intrazelluläre
Polypeptide rekombinant exprimiert werden, vorteilhaft in Zellen,
die nicht von Säugern
stammen. Die Peptide können
erhalten werden, indem man Zellen aus ihrem Kulturmedium isoliert,
welche das Polypeptid exprimieren (z.B. durch Zentrifugieren oder
Filtrieren), die Zellen solubilisiert und das Peptid von den solubilisierten
Zellen isoliert. Die Auswahl der Solubilisierungsmethode hängt von
der Art der Zellen ab, in denen das Polypeptid exprimiert wurde. Die
Abtrennung des Polypeptids von den rekombinanten Wirtszellen und
dessen Reinigung wird erleichtert, wenn man das Polypeptid als Fusionsprotein
mit einem Markierungsprotein (tag protein) exprimiert, wie hierin diskutiert.
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Die
erfindungsgemäßen Peptide
und deren Fragmente können
auch als lösliches
Polypeptid rekombinant exprimiert werden, das aus den Zellen sekretiert
wird, in denen es hergestellt wird. Solche löslichen Polypeptide können hergestellt
werden, indem man aus dem Kulturmedium intakte Zellen abtrennt,
die das lösliche
Polypeptid exprimieren (z.B. durch Zentrifugieren oder Filtrieren)
und das lösliche
Polypeptid aus dem Medium (dem Überstand)
isoliert. Die Abtrennung des löslichen
Polypeptids von den rekombinanten Wirtszellen und dessen Reinigung
werden erleichtert, wenn man das Polypeptid als sekretiertes Protein
exprimiert, was nützlich
sein kann, wenn man größere Mengen
Polypeptid als therapeutischen Wirkstoff oder für diagnostische Zwecke oder
zur Verwendung in Assays benötigt.
Weil der N-Terminus und der C-Terminus von rekombinant exprimierten
Polypeptiden um mehrere Aminosäuren
variieren können
(z.B. um etwa eine Aminosäure
bis etwa 10 Aminosäuren),
können
die Polypeptide nach der Erfindung in gleicher Weise variieren.
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Die
Erfindung stellt auch Pellinopolypeptide und deren Fragmente zur
Verfügung,
die eine gewünschte Aktivität zurückbehalten
haben. Besondere Ausführungsformen
betreffen Polypeptidfragmente, die ein Mitglied der Chymotrypsin-Familie
der Proteasen zu binden vermögen.
Ein solches Fragment kann ein lösliches Polypeptid
sein, wie zuvor beschrieben. Bei einer anderen Ausführungsform
schließen
die Polypeptide und deren Fragmente vorteilhaft Regionen ein, die
in der Pellinofamilie konserviert sind, wie zuvor beschrieben,
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Es
werden hierin auch Polypeptidfragmente zur Verfügung gestellt, die mindestens
8, 12, 16 oder mindestens 32 aufeinander folgende Aminosäure der
Sequenz SEQ ID NO:2 umfassen. Diese Polypeptidfragmente können bei
der Herstellung von Antikörpern
als Immunogene, als „Small-molecule" Antagonisten oder Agonisten
für Pellinoaktivität sowie
in verschiedenen Assays auf Pellinoaktivität verwendet werden.
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Natürlich vorkommende
Varianten und ebenso abgeleitete Varianten der Polypeptide und deren
Fragmente werden hierin zur Verfügung
gestellt. Varianten können
Aminosäuresequenzen
aufweisen, die zu mindestens 80% identisch oder mindestens zu etwa
85% identisch mit den hierin offenbarten natürlichen Polypegtiden sind.
Auch werden Ausführungsformen
in Betracht gezogen, in denen ein Polypeptid oder ein Fragment davon
zu mindestens 90% identisch, zu mindestens 95% identisch, zu mindestens
99% identisch oder zu mindestens 99,9% identisch mit dem bevorzugten
Polypeptid oder dessen Fragment ist. Die prozentuale Identität kann bestimmt
werden, wie zuvor beschrieben wurde.
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Zu
den Varianten gemäß der Erfindung
gehören
z.B. diejenigen, die aus einer alternativen mRNA-Spleißung oder einer proteolytischen
Spaltung stammen. Eine alternative Spleißung von mRNA kann z.B. ein
verkürztes,
aber biologisch aktives Protein ergeben, wie z.B. eine natürlich vorkommende
verkürzte Form
des Proteins. Wie zuvor erwähnt,
zählen
zu den Variationen, die auf eine proteolytische Spaltung zurückgehen,
z.B. Unterschiede in den N- oder C-Termini aufgrund von Expressionen
in unterschiedlichen Arten von Wirtszellen, was zu einer proteolytischen
Abtrennung von einer oder mehreren terminalen Aminosäuren von dem
Protein (im allgemeinen etwa 1 bis etwa 5 Aminosäuren) führen kann, oder aufgrund anderer
Unterschiede in der Proteinexpression. Weiterhin sind in die Erfindung
Proteine einbezogen, in denen Unterschiede in der Aminosäuresequenz
auf genetische Polymorphie zurückgehen
(allelische Variationen zwischen den einzelnen Organismen, die das
Protein produzieren).
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Zu
den anderen Varianten zählen
Fusionsproteine, wie z.B. diejenigen, die in rekombinanten Kulturen als
N-terminale oder C-terminale Fusionsproteine erzeugt werden. Beispiele
für Fusionsproteine
sind u.a. Fusionsproteine, die Oligomere bilden, wie z.B. ein Pellino/Fc-Fusionsprotein
(beispielsweise wie im U.S. Patent Nr. 5,962,406 beschrieben, erteilt
am 5. Oktober 1999) oder ein Reißverschlussfusionsprotein (zipper
fusion protein) (U.S. Patent Nr. 5,716,805, erteilt am 10. Februar 1998).
Weiterhin können
Fusionsproteine Peptide umfassen, die hinzugefügt wurden, um die Reinigung
und Identifizierung zu erleichtern (oft als Markierungsproteine „tag proteins" bezeichnet). Zu
solchen Proteinen zählen
z.B. Poly-His oder die antigenischen Identifizierungsproteine, die
im U.S. Patent Nr. 5,011,912 sowie von Hopp et al. in Bio/Technology
6:1204, 1988, beschrieben wurden. Zu den weiteren nützlichen
Markierungsproteinen gehören
das grün
fluoreszierende Protein (GFP; Chalfie et al., Science 263:802, 1994)
ein N-terminales Polypeptid, welches Erkennungsorte für einen monoklonalen
Antikörper
besitzt, eine spezifische Endopeptidase sowie eine ortsspezifische
Proteinkinase (PKA; Blanar und Rutter, Science 256:1014, 1992),
birA (Altman et al., Science 274:94, 1996) und Glutathion-S-transferase
(GST; Smith und Johnson, Gene 67:31, 1988).
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Ein
solches Markierungspeptid ist das FLAG-Peptid, das in hohem Maße antigen
ist und ein Epitop liefert, das reversibel an einen spezifischen
monoklonalen Antikörper
bindet, wodurch ein schneller Assay und eine leichtere Reinigung
des exprimierten rekombinanten Proteins ermöglicht werden. Ein murines
Hybridoma, das als 4E11 bezeichnet wird, erzeugt einen monoklonalen
Antikörper,
der das FLAG-Peptid bei Anwesenheit bestimmter zweiwertiger Metallkationen
bindet, wie im U.S. Patent Nr. 5,011,912 beschrieben ist. Die 4E11-Hybridoma-Zelllinie
ist bei der American Type Culture Collection unter der Zugangsnummer
HB 9259 deponiert worden. Monoklonale Antikörper, die das FLAG-Peptid binden,
können
von Eastman Kodak Co., Scientific Imaging Systems Division, New
Haven, Connecticut, bezogen werden.
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Ein
anderes brauchbares Markierungspeptid ist das GST-Peptid, das Glutathion
bindet und auch die Reinigung von exprimiertem rekombinanten Protein
erleichtert. Rekombinante Proteine können durch Affinitätschromatographie
unter Verwendung einer geeigneten Chromatographiematrix, an die
Glutathion gebunden wurde, gereinigt werden, wie von Smith und Johnson
a.a.O. beschrieben wurde. Zu den geeigneten Chromatographiematrices
zählen
Beads aus Glutathion-Agarose (Pharmacia). Die rekombinaten Proteine
können
mit einem Überschuss
von Glutathion eluiert werden. Alternativ kann ein spezifischer
enzymatischer Spaltungsort (wie z.B. ein Spaltungsort für Thrombin)
in das rekombinante Fusionsprotein eingebaut und das gewünschte Polypeptid
von der Affinitätsmatrix
entfernt werden, indem man das Fusionsprotein mit dem Enzym behandelt, das
das Fusionsprotein am Spaltungsort spaltet.
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Unter
den varianten Polypeptiden, die hierin offenbart werden, gibt es
Varianten von natürlichen
Polypeptiden, die die natürliche
biologische Aktivität
oder ein wesentliches Äquivalent
davon behalten haben. Ein Beispiels dafür ist eine Variante, die einen
Bindungspartner mit im wesentlichen der selben Bindungsaffinität bindet
wie die natürliche
Form. Die Bindungsaffinität
kann mittels üblicher
Verfahren gemessen werden, wie im U.S. Patent Nr. 5,512,447 beschrieben
ist und in der Folge erläutert
werden wird. Zu den Varianten gehören Polypeptide, die im wesentlichen
homolog zu der natürlichen
Form sind, die aber infolge einer oder mehrerer Deletionen, Substitutionen
oder Insertionen Abweichungen von der Aminosäuresequenz der natürlichen
Form zeigen. Zu den besonderen Ausführungsformen zählen, ohne
hierauf beschränkt
zu sein, Polypeptide mit 1 bis 10 Deletionen, Insertionen oder Substitutionen
von Aminosäuren,
im Vergleich mit der Sequenz der natürlichen Form. Eine gegebene
Aminosäure
kann z.B. durch eine Aminosäure
mit ähnlicher
physikochemischer Charakteristik ersetzt werden. Zu den Beispielen
für solche
pysikochemisch konservativen Substitutionen zählen die Substitution einer
aliphatischen Aminosäure
durch eine andere aliphatische Aminosäure, (z.B. können Ile,
Val, Leu oder Ala untereinander ausgetauscht werden); Substitutionen
einer polaren Aminosäuren
durch eine andere polare Aminosäure
(z.B. können
Lys und Arg, Glu und Asp oder Gln und Asn gegeneinander ausgetauscht
werden); und Substitutionen einer aromatischen Aminosäure gegen
eine andere aromatische Aminosäure
(z.B. können
Phe, Trp oder Tyr untereinander ausgetauscht werden). Andere Substitutionen,
wie z.B. Substitutionen ganzer Regionen mit ähnlichen hydrophoben Eigenschaften,
sind gut bekannt.
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Die
Erfindung schließt
weiterhin Polypeptide nach der Erfindung mit oder ohne assoziiertem(s)
natürlichen(s)
Glykosylierungsmuster ein. Polypeptide, die in Hefe- oder Säugerexpresseionssystemen
exprimiert werden (wie z.B. in CHO- oder COS7-Zellen), können im
Glykosylierungsmuster und im Molekulargewicht ähnlich wie oder signifikant
verschieden von natürliche(n)
Polypeptide(n) sein, je nach der Wahl des Expressionssystems. Weiterhin
kann eine gegebene Präparation
mehrere verschieden glykosylierte Spezies des Proteins enthalten.
Die Expression von Polypeptiden nach der Erfindung in bakteriellen
Expressionssystemen, wie z.B. in E. coli, ergibt nicht-glykosylierte
Moleküle.
Glykosylgruppen können
auch durch übliche
chemische oder enzymatische Methoden entfernt werden, insbesondere
durch solche, die Glykopeptidase verwenden. Im allgemeinen können glykosylierte
Polypeptide nach der Erfindung mit einem molaren Überschuss
von Glykopeptidase (Boehringer, Mannheim) inkubiert werden. Auch
rekombinante Techniken können
angewandt werden, um Glykosylierungen zu vermindern, die in eukaryotischen
Expressionssystemen stattfinden, wie dies z.B. im U.S. Patent Nr.
5,071,972 und in
EP 276 846 beschrieben
ist. Andere Varianten werden durch Modifizierung von benachbarten
zweibasischen Aminosäuren
hergestellt, um die Expression in Hefesystemen zu steigern, in denen
KEX2-Proteaseaktivität
vorhanden ist, wie in
EP 212 914 offenbart
wurde. Nach einem anderen Beispiel für Varianten können Sequenzen,
die für
Cys-Moleküle
kodieren, welche für
die biologische Aktivität
nicht wesentlich sind, so verändert
werden, dass Cys deletiert oder durch eine andere Aminosäure ersetzt
wird, wie im U.S. Patent Nr. 5,962,406, erteilt am 5. October 1999,
beschrieben ist.
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Weitere
Varianten innerhalb des Bereichs der Erfindung schließen Polypeptide
ein, die so modifiziert sein können,
dass Derivate davon dadurch geschaffen werden, dass kovalente oder
aggregative Konjugate mit anderen chemischen Bausteinen gebildet
werden, wie z.B. mit Glykosylgruppen, Lipiden, Phosphat- oder Acetylgruppen
u.ä. Kovalente
Derivate können
hergestellt werden, indem man die chemischen Bausteine mit funktionellen
Gruppen an Aminosäureseitenketten
oder am C-Terminus oder N-Terminus eines Polypeptids verknüpft. Auch
Konjugate mit angefügten
diagnostischen (nachweisbaren) oder therapeutischen Agenzien werden
in Betracht gezogen, wie in der Folge näher erläutert werden wird.
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HERSTELLUNG
VON POLYPEPTIDEN UND DEREN FRAGMENTEN
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch DNA enthaltende rekombinante Klonierungs-
und Expressionsvektoren zur Verfügung,
ebenso wie Wirtszellen, die die rekombinanten Vektoren enthalten.
DNA enthaltende Expressionsvektoren können verwendet werden, um die
Polypeptide oder deren Fragmente nach der Erfindung herzustellen,
für die
die DNA kodiert. Bei einem Verfahren zur Herstellung der Polypeptide
kultiviert man die mit einem für
das Polypeptid kodierenden Expressionsvektor transformierten Wirtszellen
unter Bedingungen, die für
die Expression des Polypeptids günstig
sind, und isoliert dann das exprimierte Polypeptid aus der Kultur.
Der Fachmann wird erkennen, dass die Prozeduren für die Herstellung
und die Reinigung des exprimierten Polypeptids variieren werden,
je nach solchen Faktoren, wie z.B. der Typ der verwendeten Wirtszellen und
ob das Polypeptid ein an eine Membran gebundenes oder ein lösliches,
von den Wirtszellen sekretiertes Polypeptid ist
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Jedes
geeignete Expressionssystem kann verwendet werden. Die Vektoren
schließen
eine DNA ein, die für
ein Polypeptid oder dessen Fragment nach der Erfindung kodiert,
funktionell verbunden mit geeigneten, die Transkription und die
Translation regelnden Nukleotidsequenzen, beispielsweise mit solchen,
die von einem Säuger-Gen,
einem mikrobiellen, viralen oder Insekten-Gen abgeleitet sind. Zu
den Beispielen für
regulatorische Sequenzen gehören
Transkriptions-Promotoren, -Operatoren oder -Verstärker, ein
ribosomaler Bindungsort für
mRNA sowie geeignete Sequenzen, die den Beginn und die Beendigung
der Transkription und der Translation regeln. Ein Ursprung der Replikation,
der die Fähigkeit
zur Replikation der gewünschten
Wirtszellen vermittelt, sowie ein Selektionsgen, durch das die Transformanten
identifiziert werden, sind im allgemeinen in dem Expressionsvektor
enthalten. Nukleotidsequenzen sind funktionell verbunden, wenn die
regulierende Sequenz in einem funktionellen Zusammenhang mit der
DNA-Sequenz steht. So ist eine als Promotor wirkende Nukleotidsequenz
mit einer DNA-Sequenz funktionell verbunden, wenn die Promotornukleotidsequenz die
Transkription der DNA-Sequenz regelt.
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Zusätzlich kann
in dem Expressionsvektor eine Sequenz enthalten sein, die für ein geeignetes
Signalpeptid (das natürlich
oder heterolog sein kann) kodiert. Eine DNA-Sequenz, die für ein Signalpeptid
(secretory Leader) kodiert, kann im Leseraster mit der Nukleotidsequenz
nach der Erfindung fusioniert sein, sodass zuerst die DNA transkribiert
und die mRNA zu einem Fusionsprotein translatiert wird, das das
Signalpeptid enthält.
Ein Signalpeptid, das in der ausgewählten Wirtszelle funktionell
ist, fördert
die extrazelluläre
Sekretion des Polypeptids. Das Signalpeptid wird nach der Sekretion
des Polypeptids aus der Zelle abgespalten.
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Der
Fachmann wird auch erkennen, dass die Position(en), an der bzw.
denen das Signalpeptid abgespalten wird, von der bzw. den von einem
Computerprogramm vorhergesagten Stelle(n) abweichen und variieren
können
in Abhängigkeit
von Faktoren, wie z.B. die An der Wirtszellen, die für die Expression
des rekombinanten Polypeptids verwendet wurden. Dementsprechend
kann ein Proteinprodukt eine Mischung von Proteinmolekülen mit
verschiedenen N-terminalen Aminosäuren enthalten, die von der
Abspaltung des Signalpeptids an mehr als einer Stelle herrührt.
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Zu
den geeigneten Wirtszellen für
die Expression von Polypeptiden zählen Prokaryonten, Hefe- oder höhere eukaryotische
Zellen. Geeignete Klonierungs- und Expressionsvektoren zur Verwendung
in bakteriellen, fungalen, Hefe- oder Säugerwirtszellen sind z.B. beschrieben
in Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier,
New York (1985). Auch zellfreie Translationssysteme könnten zur
Herstellung von Polypeptiden verwendet werden, wobei man mit RNAs
arbeitet, die von hierin offenbarten DNA-Konstrukten abgeleitet
sind.
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Kultursysteme
mit Säuger-
oder Insektenwirtszellen können
ebenfalls benutzt werden, um rekombinante Polypeptide zu exprimieren.
Systeme mit Bacculoviren für
die Herstellung von heterologen Proteinen in Insektenzellen sind
zusammenfassend beschrieben von Luckow und Summers, Bio/Technology
6:47 (1988). Etablierte Zelllinien mit Säugerursprung können ebenfalls
verwendet werden. Zu den Beispielen für geeignete Zelllinien gehören die
COS-7 Linie von Affen-Nierenzellen (ATCC CRL 1651) (Gluzman et al.,
Cell 23:175, 1981); L-Zellen; C127-Zellen; 3T3-Zellen (ATCC CCL
163); Ovarialzellen von chinesischen Hamstern (CHO-Zellen), HeLa-Zellen;
und BHK-Zellen (ATCC CRL 10) sowie die CV1/EBNA-Zelllinie, die von
Nierenzellinie von afrikanischen grünen Affen CV1 (ATCC CCL 70)
abstammt, wie von MeMahan et al. (EMBOJ. 10:2821, 1991) beschrieben.
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Eine übliche verwendete
Zelllinie sind Dihydrofolat-Reduktase (DHFR) CHO-Zellen, die auxotrophisch für Glycin,
Thymidin und Hypoxanthin sind und unter Verwendung von DHFR cDNA
als amplifizierbarem dominanten Marker in den DHFR+-phänotyp umgewandelt
werden können.
Eine solche DHFR- CHO-Zellinie, DXB11, wurde von Urlaub und Chasin
(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216, 1980) beschrieben. Ein anderes Beispiel
für eine
DHFR- CHO-Zelllinie ist DG44 (siehe z.B. Kaufman, R., Meth. Enzymology
185:537 (1988)). Andere Zelllinien, die für spezifische Selektionen oder
Amplifikationsschemata entwickelt wurden, werden auch brauchbar
für die
Erfindung sein.
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Verschiedene
Transfektionsprotokolle sind in der Technik bekannt und von Kaufman
R.J. a.a.O. beschrieben worden. Die Auswahl des Transfektionsprotokolls
hängt vom
Typus der Wirtszelle sowie der Natur des interessierenden Gens ab
und kann aufgrund von Routineversuchen getroffen werden. Die grundlegenden Erfordernisse
jedes dieser Protokolle bestehen darin, dass man zunächst für das interessierende
Protein kodierende DNA in eine geeignete Wirtszelle einführt und
dann Wirtszellen identifiziert und isoliert, die die heterologe
DNA auf stabile, exprimierbare Art und Weise inkorporiert haben.
Andere brauchbare Transfektionsprotokolle werden im U.S. Patent
Nr. 6,027,915 diskutiert, das am 22. Februar 2000 erteilt wurde.
Die Transfizierung von Zellen mit heterologer DNA und die Selektion
von Zellen, die die heterologe DNA aufgenommen haben und den selektierbaren
Marker exprimieren, führt
zu einem Kollektiv von transfizierten Zellen. Die einzelnen Zellen
dieses Kollektivs werden hinsichtlich der Menge der aufgenommenen
DNA sowie der chromosomalen Lokation der aufgenommenen DNA variieren.
Um stabile Zelllinien zu schaffen, können einzelne Zellen aus dem
Kollektiv isoliert und kultiviert werden (ein Verfahren, das man
als Klonierung bezeichnet).
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Ein
Verfahren zur Amplifizierung des interessierenden Gens ist auch
für die
Expression des rekombinanten Gens erwünscht und schließt typischerweise
die Verwendung eines Selektionsmarkers ein (Übersicht von Kaufman, R.J.
a.a.O.). Widerstandsfähigkeit
gegen cytotoxische Wirkstoffe ist die Eigenschaft, die am häufigsten
als Selektionsmarker dient und entweder eine dominante Eigenschaft
(traft) sein (d.h. sie kann unabhängig vom Typ der Zellen benutzt
werden) oder eine rezessive Eigenschaft sein (d.h. brauchbar in
bestimmten Typen von Wirtszellen, denen eine Aktivität fehlt,
auf die hin selektiert wird). Verschiedene amplifizierbare Marker
eignen sich zur Verwendung in den Expressionsvektoren nach der Erfindung,
wie sie z.B. von Maniatis, Molecular Biology: A Laboratory Manual
Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1989, Seiten 16.9 bis 16.14)
beschrieben sind.
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Brauchbare
selektierbare Marker für
die Genamplifizierung in Säugerzellen,
die gegen einen Wirkstoff sind, werden in Tabelle 1 von Kaufman
R.J. a.a.O. aufgeführt
und schließen
DHFR-MTX-Resistenz,
P-Glycoprotein- und multiple Wirkstoffresistenz (MDR), Resistenz
gegen verschiedene lipophile cytotoxische Agenzien (d.h. Adriamycin,
Colchicin und Vincristin) und Adenosindeaminase (ADA-Xyl-A) oder
Adenosin und 2'-Deoxyformycin.
Andere dominante selektierbare Macker werden im U.S. Patent Nr.
6,027,915, erteilt am 22. Februar 2000, diskutiert.
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Brauchbare
regulatorische Elemente, wie zuvor beschrieben, können ebenfalls
in den Plasmiden oder Expressionsvektoren, die für die Transfizierung der Säugerzellen
verwendet werden, enthalten sein. Die Auswahl des Transfizierungsprotokolls
und die ausgewählten,
darin verwendeten Elemente hängen
von der Art der verwendeten Zellen ab. Dem Fachmann sind zahlreiche
Protokolle und mögliche
Wirtszellen bekannt, und er kann auf der Grundlage der Erfordernisse
des ausgewählten
Zellkultursystems (oder der-systeme) ein geeignetes System für die Expression
eines gewünschten
Proteins auswählen.
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Ein
brauchbarer Hochleistungsexpressionsvektor, pCAVNOT, ist von Mosley
et al, Cell 59:335-348, 1989,
beschrieben worden. Andere Expressionsvektoren zur Verwendung in
Säugerwirtszellen
können
konstruiert werden, wie dies von Okayama und Berg in Mol. Cell.
Biol. 3:280, 1983 beschrieben wurde. Ein brauchbares stabiles System
mit hoher Leistungsfähigkeit
für die
Expression von Säuger-cDNA in C127 murinen
Säugerepithelialzellen
kann im wesentlichen so konstruiert werden, wie es von Cosman et
al., Mol. Immunol. 23:935, 1986, beschrieben worden ist. Ein brauchbarer
Expressionsvektor mit hoher Leistungsfähigkeit, PMLSV N1/N4, wurde
von Cosman et al. Nature 312:768, 1984 beschrieben und ist als ATCC
39890 deponiert worden. Weitere brauchbare Säugerexpressionsvektoren sind
in EP A 0 367 566 sowie in WO 91/18982 beschrieben. Bei einer noch
anderen Alternative können
die Vektoren von Retroviren abgeleitet werden.
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Weitere
geeignete Expressionsvektoren, pFLAG und pDC311, können ebenfalls
verwendet werden. Mittelpunkt der FLAG-Technologie ist die Fusion
eines niedermolekularen (1kD) hydrophilen FLAG-Markerpeptids an den N-Terminus eines
rekombinanten Proteins, das von einem FLAG- Expressionsvektor exprimiert wird. pDC311
ist ein anderer spezialisierter Vektor, der für die Expression in CHO-Zellen
verwendet wird. pDC311 ist durch eine bicistronische Sequenz, die
das interessierende Gen enthält,
sowie durch ein Gen für eine
Dihydrofolat-Reduktase (DHF), das einen internen Ribosomenbindungsort
für die
DHFR-Translation enthält,
ein die Expression vermehrendes Sequenzelement (expression augmenting
sequence element, EASE), den humanen CMV-Promotor, eine dreiseitige
(tripartite) Leader-Sequenz und einen Ort für Polyadenylierung gekennzeichnet.
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Ein
Signalpeptid kann, wenn dies erwünscht
ist, verwendet werden, um die Sekretion des Proteins zu begünstigen.
Die Auswahl des Signalpeptids oder Leaders kann von Faktoren abhängen, wie
z.B. dem Typ der Wirtszellen, in denen das rekombinante Protein
hergestellt werden soll. Zur Erläuterung
sei erwähnt,
dass zu den Beispielen für
heterologe Signalpeptide, die in Säugerwirtszellen funktionell
sind, die folgenden gehören:
die Signalsequenz für
Interleukin-7 (IL-7), die im U.S. Patent Nr. 4,965,195 beschrieben
ist; die Signalsequenz für
den Interleukin-2-Rezeptor, die von Crosman et al. in Nature 312:768
(1984) beschrieben wurde; das in
EP
0 367 566 beschriebene Signalpeptid für den Interleukin-4-Rezeptor; das Signalpeptid
für den
Interleukin-1-Rezeptor vom Typ I, das im U.S. Patent Nr. 4,968,607
offenbart wurde; und das in
EP
0 460 846 beschriebene Signalpeptid für den Interleukin-1-Rezeptor
vom Typ II.
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REINIGUNG
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Die
in den Bereich dieser Erfindung fallenden „isolierten" Polypeptide oder
deren Fragmente sind Polypeptide oder Fragmente, die sich in einer
Umgebung befinden, die mit der Umgebung, in der sie in der Natur gefunden
werden, nicht identisch ist. Die „gereinigten" Polypeptide oder
deren Fragmente, die in den Bereich dieser Erfindung fallen, sind
im wesentlichen frei von Assoziationen mit anderen zellulären Komponenten,
wie z.B. mit nicht in Beziehung zu ihnen stehenden (oder verwandten)
Polypeptiden, Lipiden, und DNA oder RNA; sie sind beispielsweise
ein Reinigungsprodukt von Material aus rekombinanten Expressionssystemen,
wie z.B. die zuvor beschriebenen, oder gereinigte Produkte aus einer
nicht rekombinanten Quelle, wie z.B. aus natürlich vorkommenden Zellen und/oder
Geweben.
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Bei
einer Ausführungsform
kann die Reinigung von rekombinanten Polypeptiden oder deren Fragmenten
bewirkt werden, indem man das oder die Polypeptid(e) nach der Erfindung
als Fusionsprotein mit einem Peptid (das oft als Markierungspeptid
(tag peptide) bezeichnet wird) exprimiert, für das in der Technik ein Schema
für eine
Affinitätsreinigung
bekannt ist. Als solchen Fusionspartner können Poly-His oder andere Tag-Peptide
dienen, die zuvor beschrieben wurden, ebenso wie ein Fc-Baustein
oder ein Zipper-Baustein.
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Was
die Reinigung betrifft, so ist dem Fachmann bekannt, dass Verfahren
zur Reinigung von rekombinanten Polypeptiden oder deren Fragmenten
variieren können,
abhängig
von solchen Faktoren, wie z.B. dem Typ der verwendeten Wirtszellen
und ob, oder ob nicht, das rekombinante Polypeptid oder dessen Fragment
in das Kulturmedium sekretiert wurde. Im allgemeinen kann das Polypeptid
oder dessen Fragment, wenn keine Sekretion stattfand, aus den Wirtszellen
oder, wenn das Pellinopolypeptid als lösliches Protein sekretiert worden
war, aus dem Kulturmedium oder dem Überstand des Kulturmediums
isoliert werden, worauf einer oder mehrere weitere Schritte folgen,
nämlich
Konzentrieren, Aussalzen, Ionenaustausch, hydrophobe Wechselwirkung,
Affinitätschromatographie
und/oder Größenausschlusschromato-graphie
(size exclusion chromatography).
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Was
die spezielle Art und Weise betrifft, um diese Schritte durchzuführen, so
kann das Kulturmedium zunächst
mittels eines im Handel erhältlichen
Proteinkonzentrationsfilters konzentriert werden, beispielsweise mittels
einer Ultrafiltrationseinheit von Amocon oder Millipore Pellicon.
Nach dem Konzentrieren kann das Konzentrat auf eine Reinigungsmatrix
aufgebracht werden, beispielsweise auf ein Gelfiltrationsmedium.
Alternativ kann man ein Anionenaustauschharz verwenden, z.B. eine
Matrix oder ein Substrat mit anhängenden
Diethylaminoethyl (DEAE) Gruppen. Die Matrices können Polyacrylamid, Agarose,
Dextran, Zellulose oder andere üblicherweise
bei der Proteinreinigung verwendete Materialien sein.
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Alternativ
kann man auch einen Schritt mit Kationenaustausch durchführen. Zu
den geeigneten Kationenaustauschern gehören verschiedene unlösliche Matrices,
die Sulfopropyl- oder Carboxymethylgruppen enthalten. Zusätzlich kann
ein Chromatofokussierschritt (chromatofocusing Step) vorgesehen
werden. Alternativ kann Chromatographie mit hydrophober Wechselwirkung
stattfinden. Hierfür
geeignete Matrices können an
Harz gebundene Phenyl- oder Octylgruppen enthalten. Weiterhin kann
man Affinitätschromatographie
mit einer Matrix anwenden, die das rekombinante Protein selektiv
bindet. Beispiele für
solche Harze sind Lektinsäulen,
Farbstoffsäulen
(dye columns) und Metallionen chelatisierende Säulen.
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Schließlich kann
ein Schritt, oder können
mehrere Schritte, mit Hochleistungsflüssigkeitschromatographie mit
Phasenumkehr (RP-HLC) unter Verwendung von hydrophoben HPLC-Medien
(wie z.B. Silikagel oder Polymerharze mit anhängenden Methyl-, Octyl-, Octadecyl-
oder anderen aliphatischen Gruppen) durchgeführt werden, um die Polypeptide
weiter zu reinigen. Einige oder alle dieser aufgezählten, in
verschiedenen Kombinationen möglichen
Reinigungsschritte sind gut bekannt und können angewandt werden, um ein
isoliertes und gereinigtes Polypeptid herzustellen.
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Es
ist auch möglich,
mit einer Affinitätssäule zu arbeiten,
die ein Polypeptid bindendes Protein nach der Erfindung enthält, wie
z.B. einen monoklonalen Antikörper
gegen ein Polypeptid nach der Erfindung, um eine Affinitätsreinigung
der exprimierten Polypeptide durchzuführen. Nach diesem Aspekt der
Erfindung können
bindende Proteine, wie z.B. Antikörper gegen Pellino, oder andere
Pellino bindende Moleküle,
auf einem festen Träger
gebunden werden, beispielsweise auf einer Matrix für Säulenchromatographie
oder einem ähnlichen,
für die
Identifizierung, Abtrennung oder Reinigung von Pellino geeigneten
Substrat. Die Adhäsion
von Pellino auf der Kontaktoberfläche eines festen Substrats
kann auf jede geeignete, bekannte Art und Weise erreicht werden.
Beispielsweise können
magnetische Mikrokugeln mit Pellino bindenden Proteinen (oder anderen
Pellino bindenden Molekülen)
beschichtet werden und in dem Inkubationsgefäß durch ein magnetisches Feld
gehalten werden.
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Pellinopolypeptide
enthaltende Lösungen
werden mit der festen Phase unter Bedingungen in Kontakt gebracht,
die die Bindung der Pellinopolypeptide an ihre Bindungspartner fördern, und
das nicht gebundene Material wird dann fort gewaschen. Verfahren
zur Ablösung
von positiv selektierten Peptiden von der festen Phase sind in der
Technik bekannt und schließen
z.B. die Verwendung eines Eluierungspuffers mit hohem Salzgehalt
(high salt solution buffer) ein, gefolgt von einer Dialyse in einen
Puffer mit niedrigerem Salzgehalt oder einer Veränderung des pH (oder einer
anderen, von der verwendeten Affinitätsmatrix abhängigen Eigenschaft),
oder einer kompetitiven Entfernung unter Verwendung eines natürlich vorkommenden
Substrats für den
Affinitätsbaustein.
Die Methoden sind vorteilhaft nicht schädlich für die Pellinopolypeptide.
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Bei
einem beispielhaften Verfahren können
Pellinopolypeptide enthaltende Lösungen
zuerst mit einem biotinylierten Bindungspartner für Pellino
inkubiert werden. Die Inkubationszeiten betragen typischerweise mindestens
eine Stunde, um eine genügende
Bindung der Polypeptide nach der Erfindung sicherzustellen. Die entstehende
Mischung wird dann durch eine Säule
geleitet, die mit Beads beschickt ist, welche mit Avidin beschichtet
wurden, wobei die hohe Affinität
von Biotin und Avidin bewirkt, dass die Pellinopolypeptide auf den Beads
gebunden werden. Die Verwendung von mit Avidin beschichteten Beads
ist in der Technik bekannt. Siehe Berenson et al., J. Cell Biochem.
10D:239 (1986). Das Waschen des ungebundenen Materials und die Ablösung der
gebundenen Zellen erfolgt nach bekannten Methoden.
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Der
gewünschte
Reinheitsgrad hängt
von der beabsichtigten Verwendung des Proteins ab. Ein relativ hoher
Reinheitsgrad ist z.B. erwünscht,
wenn das Polypeptid in vivo verabreicht werden soll. In einem solchen Fall
wird das Polypeptid so weit gereinigt, dass bei der Gelelektrophorese
an einem SDS-Polyacrylamidgel (SDS-PAGE)
keine Banden nachweisbar sind, die anderen Proteinen entsprechen.
Es wird für
einen Fachmann auf dem betreffenden Gebiet der Technik erkennbar
sein, dass infolge verschiedener Glykosylierung, verschiedener Ereignisse
nach der Translation usw. bei SDS-PAGE mehrere dem Polypeptid entsprechende Banden
sichtbar werden können.
Am meisten wird bevorzugt, das Polypeptid nach der Erfindung so
weit zu reinigen, dass es im wesentlichen homogen ist, was durch
eine einzige Proteinbande bei der Analyse mittels SDS-PAGE angezeigt
wird. Die Proteinbande kann durch Anfärben mittels Silber oder Comassie
Blue oder, wenn das Protein radioaktiv markiert ist, durch Autoradiographie
sichtbar gemacht werden.
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VERWENDUNG VON PELLINO-NUKLEINSÄUREN ODER
-OLIGONUKLEOTIDEN
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Zu
den Verwendungen der Nukleinsäuren
nach der Erfindung gehört
die Verwendung von Fragmenten als Sonden oder Primer. Diese Fragmente
enthalten im allgemeinen mindestens etwa 17 aufeinander folgende Nukleotide
einer DNA-Sequenz. Bei anderen Ausführungsformen umfasst ein DNA-Fragment mindestens
30 oder mindestens 60 aufeinander folgende Nukleotide einer DNA-Sequenz.
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Weil
Homologe von Pellinoproteinen, die von anderen Säugerspezies stammen, hierin
in Betracht gezogen werden, können
Sonden, die auf den DNA-Sequenzen gemäß SEQ ID NOs:I, 3, 5, 7 oder
11 basieren, verwendet werden, um cDNA-Bibliotheken zu durchsuchen,
die von anderen Säugerspezies
abgeleitet sind, wobei übliche,
die Speziesgrenzen überschreitende
Hybridisierungstechniken (crossspecies hybridization) angewandt
werden.
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Auf
der Grundlage der Kenntnis des genetischen Codes und in Kombination
mit den zuvor offenbarten Aminosäuresequenzen
können
Sätze von
degenerierten Oligonukleotiden hergestellt werden. Diese Oligonukleotide
sind als Primer z.B. bei der Polymerasekettenreaktion (PCR) brauchbar,
wodurch DNA-Fragmente isoliert und amplifiziert werden.
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Alle
oder ein Teil der Nukleinsäuren
gemäß SEQ ID
NOs:I, 3, 5, 7 oder 11, mit Einschluss von Oligonukleotiden, können von
einem Fachmann verwendet werden, um unter Anwendung gut bekannter
Techniken das humane Chromosom und den spezifischen Locus zu identifizieren,
der die DNA eines Mitglieds der Pellinofamilie enthält. Zu den
brauchbaren Techniken zählen,
wenn auch nicht hierauf beschränkt,
die Verwendung der Sequenz oder von Teilen davon, mit Einschluss
von Oligonukleotiden, als Sonden in verschiedenen gut bekannten
Verfahren, wie z.B. Stralilungshybridkartierung (radiation hybrid
mapping) mit hoher Auflösung
(resolution), in situ-Hybridisierung mit Chromosomen (chromosome
spreads) (moderate Auflösung)
und Southern Blot-Hybridisierung mit Hybridzelllinien, die individuelle
humane Chromosomen enthalten (niedrige Auflösung).
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Beispielsweise
können
Chromosomen durch Strahlungshybridisierung kartiert werden, unter
Verwendung von Primern, die innerhalb eines vermuteten Exons des
interessierenden Gens liegen und die ein Produkt von humaner genomischer
DNA amplifizieren, aber keine genomische DNA von anderen Spezies
amplifizieren. Die Ergebnisse der PCR werden in einen Datenvektor
konvertiert, und die chromosomale Zuordnung und die Platzierung
in Bezug auf bekannte Sequence Tag Site (STS) Marker auf der Strahlungshybridkarte
(radiation hybrid map) wird bestimmt. Humanes Pellino-1 ist auf
dem Chromosom 2, Plätze
(places) 7.15 cR von WI-6130 kartiert.
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Die
Nukleinsäuren
der SEQ ID NOs:I, 3, 5, 7 und 11 oder Fragmente davon können vom
Fachmann unter Verwendung gut bekannter Techniken benutzt werden,
um Anomalien zu analysieren, die mit der Genkartierung auf einem
Chromosom verbunden sind, das ein für Pellino kodierendes Gen enthält. Dadurch
wird es möglich,
Bedingungen zu unterscheiden, unter denen dieser Marker anders angeordnet
oder deletiert wird. Weiterhin können
Nukleotide der SEQ ID NOs:I, 3, 5, 7 oder 11 oder ein Fragment davon
als Positionsmarker benutzt werden, um andere Gene mit unbekannter
Lokation zu kartieren.
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Die
DNA kann benutzt werden, um Behandlungen für Krankheiten zu entwickeln,
die (direkt oder indirekt) durch schadhafte Gene oder ungenügende Mengen
an den Genen vermittelt werden, die den Nukleinsäuren nach der Erfindung entsprechen.
Die hierin offenbarten natürlichen
Nukleotidsequenzen ermöglichen die
Entdeckung von schadhaften Genen sowie deren Ersatz durch oder Ergänzung mit
normale(n) Gene(n) mittels verschiedener Verfahren der Gentherapie,
die in der Technik bekannt sind.
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Schadhafte
Gene können
in diagnostischen in vitro Assays und durch einen Vergleich einer
hierin offenbarten natürlichen
Nukleotidsequenz mit derjenigen eines Gens nachgewiesen werden,
das von einer Person stammt, bei der ein Verdacht auf einen Defekt
an diesem Gen besteht.
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Zu
den anderen brauchbaren Fragmenten der Nukleinsäuren gehören Antisinn- oder Sinn-Oligonukleotide,
die eine einsträngige
Nukleinsäuresequenz
(entweder RNA oder DNA) enthalten, die in der Lage ist, an Zielsequenzen
zu binden, nämlich
an mRNA (Sinn) oder DNA (Antisinn). Antisinn- oder Sinn-Oligonukleotide
nach der vorliegenden Erfindung enthalten ein Fragment der DNA gemäß den SEQ
ID NOs:I, 3, 5, 7 oder 11. Ein solches Fragment umfasst im allgemeinen
mindestens etwa 17 Nukleotide, vorteilhaft von etwa 17 bis etwa
30 Nukleotide. Die Methode, ein Antisinn- oder Sinn-Oligonukleotid
auf der Grundlage einer für
ein gegebenes Protein kodierenden cDNA zu entwickeln, ist z.B. von
Stein und Cohen, Cancer Res. 48:2659, 1988) und von van der Krol
et al. (Bio Techniques 6:958, 1988) beschrieben. Die Bindung von
Antisinn- oder Sinn-Oligonukleotiden an Nukleinsäurezielsequenzen führt zur
Bildung von Komplexen, die die Expression von Proteinen auf eine
von mehreren möglichen
Mechanismen blockieren oder inhibieren, wie im U.S. Patent Nr. 5,783,665,
erteilt am 21. Juli 1998, diskutiert wird. Organische Bausteine
und andere Bausteine, die die Affinität des Oligonukleotids zu der
Nukleinsäurezielsequenz
verstärken,
oder einschließende
Agenzien können
an die Sinn- oder Antisinn-Oligonukleotide
angefügt
werden, um die Bindungsspezifitäten
der Antisinn- oder Sinn-Oligonukleotide für die Nukleinsäurezielsequenz
zu modifizieren. Die Antisinn- oder Sinn-Oligonukleotide können auch
durch bekannte Methoden für
den Gentransfer in eine Zelle eingeführt werden, die die Nukleinsäurezielsequenz
enthält,
beispielsweise durch Lipofektion, CaP04-vermittelte DNA-Transfektion,
Elektroporation oder durch Verwendung von Gentransfervektoren, wie
z.B. das Eppstein-Barr-Virus. Sinn- oder Antisinn-Oligonukleotide
können
auch durch Bildung eines Konjugats mit einem einen Liganden bindenden
Molekül
in eine Zelle eingeführt
werden, die die Nukleinsäurezielsequenz
enthält,
wie in WO 91/04753 beschrieben ist. Alternativ kann ein Sinn- oder
Antisinn-Oligonukleotid durch Bildung eines Oligonukleotid-Lipid-Komplexes in
eine Zelle eingeführt
werden, die die Nukleinsäurezielsequenz
enthält,
wie in WO 90/10448 beschrieben ist.
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Die
DNAs nach der Erfindung werden auch bei der Entwicklung von transgenen
und/oder knock out-Zellen und -Tieren von Nutzen sein. Dem Fachmann
sind verschiedene Methoden bekannt, durch die solche Zellen oder
Tiere erzeugt werden können;
eine beispielhafte Methode ist im U.S. Patent Nr. 5,565,321, erteilt
am 15. Oktober 1996, beschrieben. Die hierin beschriebene Technik
kann durch Routineexperimente mit den Sequenzen nach der Erfindung
verwendet werden.
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VERWENDUNGEN VON PELLINOPOLYPEPTIDEN
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Weil
Pellinopolypeptide homolog zu den Pellinpolypeptiden von Drosophila
sind, wichtigen Molekülen für die Signalkaskade
für die
IL-IR/Toll-Rezeptorfamilie, können
niedermolekulare (small molecule) Inhibitoren ihrer Funktion oder
Proteinassoziationen (oder Antisinn- oder andere Inhibitoren für ihre Synthese)
nützlich
für die
Behandlung von Autoimmunkrankheiten und/oder entzündlichen
Krankheiten sein. Dementsprechend können die Pellinopolypeptide
nach der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um einen Sreening-Assay
zur Identifizierung von Verbindungen und kleinen Molekülen durchzuführen, welche
die Polypeptide nach der gegenwärtigen
Erfindung inhibieren (als Antagonisten) oder stimulieren (als Agonisten).
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So
können
Polypeptide nach der Erfindung beispielsweise verwendet werden,
um Antagonisten und Agonisten aus Zellen, zellfreien Präparationen,
chemischen Bibliotheken und natürlichen
Produktgemischen zu identifizieren. Die Antagonisten und Agonisten
können
natürliche
oder modifizierte Substrate, Liganden, Enzyme, Rezeptoren usw. der
Polypeptide nach der vorliegenden Erfindung sein, oder sie können strukturell
oder funktionell mimetisch zu den Polypeptiden sein. Zu den potentiellen
Antagonisten nach der Erfindung können kleine Moleküle, Peptide
und Antikörper
zählen,
die an einem Bindungsort der erfindungsgemäßen Polypeptide oder ihrer
Bindungspartner binden und dadurch den Bindungsort okkupieren. Dadurch
besteht für
die natürlichen
Bindungspartner keine Möglichkeit
zur Bindung, sodass die normale biologische Aktivität verhindert wird.
Zu den potentiellen Agonisten gehören kleine Moleküle, Peptide
und Antikörper,
die an die Polypeptide nach der Erfindung oder an deren Bindungspartner
binden und Wirkungen hervorbringen, die gleich groß sind wie
oder größer sind
als diejenigen Wirkungen, die durch die Bindung der Polypeptide
nach der vorliegenden Erfindung hervorgebracht werden.
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Kleinmolekulare
Agonisten und Antagonisten haben üblicherweise ein Molekulargewicht
unterhalb von 10K und können
eine Anzahl von physikochemischen und pharmakologischen Eigenschaften
besitzen, die die Penetration in die Zelle verstärken, die Beständigkeit
gegen Abbau erhöhen
und die physiologische Halbwertszeit verlängern (Gibbs, J. Pharmaceutical
Research in Molecular Oncology, Cell, Band 79 (1994)). Antikörper, zu
denen sowohl intakte Moleküle
als auch Fragmente, wie z.B. die Fragmente Fab und F(ab)2, als auch
von ihnen abgeleitete rekombinante Moleküle zählen, können verwendet werden, um an
die Polypeptide nach der vorliegenden Erfindung zu binden und sie
zu inhibieren, indem sie die Fortsetzung der Signalkaskade blockieren.
Es ist vorteilhaft, dass die Antikörper humanisiert sind, und
es ist vorteilhafter, dass die Antikörper human sind. Die Antikörper nach
der vorliegenden Erfindung können
nach jeder der vielen gut bekannten Methoden hergestellt werden.
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Spezifische
Sreeningmethoden sind in der Technik bekannt und zusammen mit integrierten
automatischen Systemen und Sammlungen von chemischen Stoffen und
Naturprodukten im Screening mit hohem Durchsatz extensiv einbezogen,
so dass eine große
Zahl von Testmolekülen
innerhalb kurzer Zeit auf antagonistische oder agonistische Aktivität untersucht
werden kann. Zu diesen Methoden gehören homogene Assayformate,
wie z.B. Fluoreszenzresonanzenergietransfer, Fluoreszenzpolarisation,
timeresolved Fluoreszenzresonanzenergietransfer, Scintillationsnäheassays
(scintillation proximity assays), Reportergenassays, Fluoreszenz-quenched
Enzymsubstrat, chromogenes Enzymsubstrat und Elektrochemolumineszenz,
ebenso wie mehr traditionelle Assayformate, wie z.B. Enzym-verbundene
Immunoabsorptionsassays (ELISA) oder Radioimmunassays.
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Homogene
Assays sind „Mix
and Read" Assays,
die sich sehr für
automatische Anwendungen eignen, während heterologe Assays die
Abtrennung des gebundenen Analyten durch komplexere Grundoperationen, wie
z.B. Filtrieren, Zentrifugieren oder Waschen, erfordern. Diese Assays
werden verwendet, um eine große Vielzahl
von spezifischen biomolekularen Wechselwirkungen und deren Inhibierung
durch kleine Moleküle
zu entdecken, einschließlich
von Protein-Protein-, Rezeptor-Ligand- und Enzym-Substrat-Wechselwirkungen usw.
Diese Assaymethoden und -techniken sind in der Technik gut bekannt
und eingehend in den folgenden Veröffentlichungen beschrieben:
High Throughput Screening: The Discovery of Bioactive Substances,
John P. Devlin (Herausgeber), Marcel Dekker, New York, 1997, ISBN:
0-8247-0067-8; und auf den Internetseiten lab-robotics-org und sbsonline.org.
Die Screeningassays nach der vorliegenden Erfindung sind für das Screening
von chemischen Bibliotheken mit hohem Durchsatz gut geeignet, und
ebenso geeignet für
die Identifizierung von kleinen Molekülen als Kandidaten für Wirkstoffe,
Antikörper,
Peptide und andere Antagonisten und/oder Agonisten.
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Bei
einer Ausführungsform
einer Methode zur Identifizierung von Molekülen, die die Polypeptide inhibieren
oder antagonisieren, setzt man ein Kandidatenmolekül einem
Medium zu, welches Zellen enthält,
die die Polypeptide nach der vorliegenden Erfindung exprimieren;
verändert
die Bedingungen in dem Medium so, dass ohne die Gegenwart des Kandidatenmoleküls die Polypeptide
an ihre natürlichen
Liganden, Substraten oder Effektormoleküle gebunden werden würden, und
beobachtet die Bindung und die Stimulierung oder Inhibierung einer
funktionellen Antwort. Die Aktivität der Zellen, die mit dem Kandidatenmolekül in Berührung gebracht
wurden, kann dann mit der Aktivität von Zellen verglichen werden,
die nicht mit dem Kandidatenmolekül in Berührung gebracht wurden, und
Antagonisten oder Agonisten der Polypeptide nach der vorliegenden
Erfindung können
so identifiziert werden. Die Messungen der biologischen Aktivität können nach
einer Reihe gut bekannter Methoden erfolgen, beispielsweise die
Messung der Menge des vorhandenen Proteins (z.B. mittels eines ELISA)
oder der Aktivierung der Proteine. Eine Abnahme der biologischen
Stimulierung oder Aktivierung würde
einen Antagonisten anzeigen. Eine Zunahme würde einen Agonisten anzeigen.
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Screeningsassays
können
weiterhin so ausgestaltet werden, dass Moleküle gefunden werden, die die Aktivität der Polypeptide
nach der vorliegenden Erfindung nachahmen. Moleküle, die die biologische Aktivität eines
Polypeptids nachahmen, können
von Nutzen sein, wenn es gilt, die biologische Aktivität des Peptids
zu steigern. Um Verbindungen für
therapeutisch aktive Wirkstoffe zu identifizieren, die die biologische
Aktivität
eines Polypeptids nachahmen, nuss zunächst untersucht werden, ob
ein Kandidatenmolekül
an das Polypeptid bindet. Ein bindendes Kandidatenmolekül wird dann
einem biologischen Assay zugesetzt, um seine biologischen Wirkungen
zu bestimmen. Die biologischen Wirkungen des Kandidatenmoleküls werden
dann mit denen des Polypeptids oder der Polpeptide verglichen.
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Eine
andere Ausführungsform
der Erfindung betrifft die Verwendung von Pellinopolypeptiden für das Studium
der Signaltransduktion in der Zelle. Die zelluläre Signalweiterleitung ist
oft mit einer molekularen Aktivierungskaskade verbunden, innerhalb
derer ein Rezeptor ein durch eine Rezeptor-Liganden-Beziehung vermitteltes Signal
weiterleitet, indem er intrazelluläre Kinasen spezifisch aktiviert,
welche dann Zielsubstrate phosphorylieren. Diese Substrate können selbst
Kinasen sein, die nach der Phosphorylierung aktiviert werden. Alternativ
können
sie Adaptormoleküle
sein, die die nachfolgende (downstream) Signalweiterleitung durch
eine auf die Phosphorylierung folgende Wechselwirkung zwischen Proteinen
erleichtern. Dementsprechend können
die neuen Pellinopolypeptide als Reagenzien zur Identifizierung
von neuen Molekülen
verwendet werden, die an der Signaltransduktion beteiligt sind.
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Die
Polypeptide nach der Erfindung sind bei der IL-1-Signalkaskade beteiligt
und können
als solche zur Inhibierung der Signaltransduktion benutzt werden.
Daher verwendet man sie in in vitro-Screeningsassays und bei der in vivo-Therapie.
Da die Therapeutika durchgängig
durch Zellmembranen sind, können
die Pellinopolypeptide und deren Fragmente verabreicht werden, um
die IL-IR-vermittelte Signaltransduktion zu agonisieren oder zu
antagonisieren; sie stellen also nützliche Immunoregulatoren dar.
Verschiedene Zusammensetzungen von Polypeptiden nach der Erfindung
auf Basis von Liposomen werden hierin in Aussicht genommen (envisioned
herein).
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Zusammensetzungen
nach der vorliegenden Erfindung können Polypeptide in jeder der
hierin beschriebenen Formen enthalten, beispielsweise als natürliche Proteine,
Varianten, Derivate, Oligomere und biologisch aktive Fragmente.
In besonderen Ausführungsformen
enthalten die Zusammensetzungen ein lösliches Polypeptid oder ein
Oligomer, das lösliche
Pellinopolypeptide einschließt.
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Durch
diese Anmeldung werden Zusammensetzungen zur Verfügung gestellt,
die eine wirksame Menge eines Polypeptids nach der Erfindung in
Kombination mit anderen Komponenten enthalten, beispielsweise mit
einem physiologisch akzeptablen Trägerstoff oder Hilfsstoff Die
Polypeptide können
nach bekannten Methoden formuliert werden, um pharmazeutisch brauchbare
Zusammensetzungen zu schaffen. Sie können in Mischungen kombiniert
werden, entweder als einziger aktiver Wirkstoff oder zusammen mit
anderen bekannten, für
eine gegebene Indikation geeigneten aktiven Materialien mit pharmakologisch
akzeptablen Verdünnungsmitteln
(wie z.B. Kochsalzlösung,
Tris-HCl, Acetat- und Phosphat-gepufferte Lösungen), Konservierungsstoffen
(wie z.B. Thiomersal, Benzylalkohol und Parabene), Emulgatoren,
Solubilisierungsmitteln, Adjuvantien und/oder Trägerstoffen. Geeignete Formulierungen
für pharmazeutische
Zusammensetzungen schließen
diejenigen ein, die in Remington's
Pharmaceutical Sciences, 16. Ausgabe, Mack Publishing Company, Easton,
PA beschrieben sind.
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Weiterhin
können
diese Zusammensetzungen mit Polyethylenglykol (PEG), Metallionen
komplexiert oder in Polymere inkorporiert werden, beispielsweise
in Polyessigsäure,
Polyglykolsäure,
Hydrogele, Dextran usw., oder in Liposome, Mikroemulsionen, Micellen,
unilamellare oder multilamellare Vesikel, „Erythrocyten ghosts" oder Sphäroblasten
inkorporiert werden. Solche Zusammensetzungen werden den physikalischen
Zustand, die Löslichkeit,
Stabilität,
die Freisetzungsrate in vivo und die Abklingrate in vivo (clearance
rate in vivo) beeinflussen und werden daher der beabsichtigten Anwendung
entsprechend gewählt.
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Die
Zusammensetzungen nach der Erfindung können auf jede geeignete Weise
verabreicht werden, wie z.B. topisch, parenteral oder durch Inhalation.
Die Bezeichnung „parenteral" schließt Injektion,
z.B. subkutane, intravenöse
oder intramuskuläre
Injektion, sowie eine lokalisierte Verabreichung ein, z.B. am Ort
der Krankheit oder Verletzung ein (z.B. in die Herzkranzgefäße, in einen
Tumor oder eine Injektion in ein Gelenk, das eine entzündliche
Reaktion aufweist). Eine fortgesetzte Freisetzung aus einem Implantat
wird ebenfalls in Erwägung
gezogen. Der Fachmann auf dem betreffenden Gebiet wird erkennen,
dass die geeigneten Dosierungen variieren werden, in Abhängigkeit
von solchen Faktoren, wie z.B. der Art der zu behandelnden Krankheit,
dem Körpergewicht,
dem Alter und dem Allgemeinzustand des Patienten sowie der Art der
Verabreichung. Vorläufige
Dosen können
aufgrund von Tierversuchen festgelegt werden, und die Anpassung
der Dosen für
die Verabreichung an Menschen wird entsprechend der für die Behandlung
von Krankheiten gültigen Praxis
vorgenommen.
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Die
Polypeptide nach der vorliegenden Erfindung können auch nach der Methode
der Proteintransduktion verabreicht werden. Bei dieser Methode wird
das Pellinopolypeptid kovalent mit einer Proteintransduktionsdomäne (PTD)
verbunden, beispielsweise, aber nicht ausschließlich mit TAT, Antp oder VP22
(Schwarze et al., 2000, Cell Biology 10:290-295). Die mit einer
PTD verbundenen Pellinopolypeptide können dann in Zellen transduziert
werden, indem man sie dem Gewebekulturmedium zusetzt, in dem sich
die Zellen befinden (Schwarze et al., 1999, Science 285:1569; Lindgren
et al., 2000, TiPS 21:99; Derossi et al., 1998, Cell Biology 8:84;
WO 00/34308; WO 99/29721; und WO 99/10376). Überdies ist gefunden worden,
dass für
ein Polypeptid kodierende DNA einem Säuger auf eine solche Art und
Weise zugeführt
werden kann, dass sie von Zellen aufgenommen und exprimiert wird.
Das resultierende Protein ist dann verfügbar, um eine therapeutische
Wirkung auszuüben.
Dementsprechend werden auch Zusammensetzungen in Betracht gezogen,
die Nukleinsäuren
in physiologisch akzeptablen Formulierungen enthalten. Beispielsweise
kann DNA zur Injektion formuliert werden.
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ANTIKÖRPER
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Durch
die Erfindung werden mit den Polypeptiden nach der Erfindung immunoreaktive
Antikörper
zur Verfügung
gestellt. Die Antikörper
binden über
die Antigenbindungsorte des Antikörpers spezifisch an die Polypeptide
(im Gegensatz zu einer nicht-spezifischen Bindung). Somit können die
hierin beschriebenen Polypeptide, Fragmente, Varianten, Fusionsproteine
usw. als „Immunogene" für die Herstellung
von Antikörpern benutzt
werden, die mit ihnen immunoreaktiv sind. Genauer gesagt enthalten
die Polypeptide, deren Fragmente, Varianten, Fusionsproteine usw.
antigenische Determinanten oder Epitope, die die Bildung von Antikörpern auslösen.
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Diese
antigenischen Determinanten oder Epitope können entweder linear oder konformational
(diskontinuierlich) sein. Lineare Epitope sind aus einer einzelnen
Sektion von Aminosäuren
des Polypeptids zusammengesetzt, während konformationale oder
diskontinuierliche Epitope aus Aminosäuresektionen aus verschiedenen
Regionen der Polypeptidkette zusammengesetzt sind, die infolge einer
Faltung des Proteins in enge räumliche
Nähe gebracht
werden. (C.A. Janeway, Jr. Und P. Travers, Immuno Biology 3:9 (Garland
Publishing Inc., 2. Auflage, 1996)). Weil gefaltete Proteine komplexe
Oberflächen
besitzen, ist die Anzahl der verfügbaren Epitope recht groß. Infolge
der Konformation des Proteins und sterischer Hinderung ist jedoch
die Anzahl der Antikörper,
die tatsächlich
an die Epitope binden, kleiner als die Anzahl der verfügbaren Epitope (C.A.
Janeway und P. Travers, Immuno Biology 2:14 (Garland Publishing,
Inc., 2. Auflage 1996)). Epitope können nach jeder der in der
Technik bekannten Methoden identifiziert werden.
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Somit
bezieht sich ein Aspekt der vorliegenden Erfindung auf die antigenischen
Epitope der Polypeptide nach der Erfindung. Diese Epitope sind wertvoll
für die
Herstellung von Antikörpern,
insbesondere von monoklonalen Antikörpern, wie in der Folge näher beschrieben
werden wird. Weiterhin können
Epitope der Polypeptide nach der Erfindung in der Forschung als
Reagenzien für
Assays verwendet werden und um spezifische bindende Antikörper von
Substanzen, wie z.B. polyklonalen Seren oder Überständen von kultivierten Hybridoma,
zu reinigen. Solche Epitope oder deren Varianten können unter
Verwendung von Methoden hergestellt werden, die in der Technik gut
bekannt sind, wie z.B. die Synthese in fester Phase, chemische oder
enzymatische Spaltung eines Polypeptids oder mittels rekombinanter
DNA-Technologie.
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Was
die Antikörper
betrifft, die durch die Epitope der Polypeptide nach der Erfindung
hervorgerufen werden, so gilt, dass, unabhängig davon, ob die Epitope
isoliert werden oder ein Teil des Polypeptids bleiben, sowohl monoklonale
als auch polyklonale Antikörper
nach üblichen
Techniken hergestellt werden können.
Siehe z.B. Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in
Biological Analyses, Kennet et al. (Herausgeber), Plenum Press,
New York (1980)); und Antibodies: A Laboratory Manual Harlow und
Land (Herausgeber), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, N.Y. (1988).
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Hybridomazelllinien,
die monoklonale Antikörper
erzeugen, welche spezifisch für
die Polypeptide nach der Erfindung sind, werden ebenfalls hierin
in Erwägung
gezogen. Solche Hybridoma können
nach üblichen Verfahren
hergestellt und identifiziert werden. Bei einem der Verfahren zur
Herstellung einer solchen Hybridomazelllinie immunisiert man ein
Tier mit einem Polypeptid oder einer DNA, die für ein Polypeptid kodiert; erntet Milzzellen
von dem immunisierten Tier; fusioniert diese Milzzellen mit einer
Myelomzellinie und erzeugt dadurch Hybridomazellen; und identifiziert
eine Hybridomazelllinie, welche monoklonale Antikörper erzeugt,
die an das Polypeptid binden. Die monoklonalen Antikörper können nach üblichen
Techniken gewonnen werden.
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Die
monoklonalen Antikörper
nach der vorliegenden Erfindung schließen chimärische Antikörper ein, d.h.
humanisierte Versionen von murinen monoklonalen Antikörpern. Diese
humanisierten Antikörper
können nach
bekannten Techniken hergestellt werden und bieten den Vorteil einer
verminderten Immunogenität,
wenn die Antikörper
Menschen verabreicht werden. Bei einer Ausführungsform umfasst ein humanisierter
monoklonaler Antikörper
die variable Region eines murinen Antikörpers (oder nur dessen Antigen-bindenden
Ort) sowie eine konstante Region, die von einem humanen Antikörper abgeleitet
ist. Alternativ kann ein humanisiertes Antikörperfragment den Antigen-bindenden
Ort eines murinen monoklonalen Antikörpers sowie ein variables Regionsfragment
(ohne einen Antigen-bindenden Ort), das von einem humanen Antikörpers abgeleitet
ist, enthalten. Zu den Verfahren zur Herstellung von chimärischen
und weiterhin genetisch veränderten
monoklonalen Antikörpern
gehören
die Verfahren, die von Richmann et al. in Nature 332:323, 1988;
Liu et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439, 1987; Larrick
et al. in Bio/Technology 7:934 (1989) und Winter und Harris in TIPS 14:139,
Mai 1993 beschrieben wurden. Verfahren zur transgenen Herstellung
von Antikörpern
sind in
GB 2,272,440 ,
U.S. Patent Nr. 5,569,825 und U.S. Patent Nr. 5,545,806 sowie in
den verwandten Patenten offenbart, die deren Priorität beanspruchen.
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Antigen-bindende
Fragmente dieser Antikörper,
die nach üblichen
Methoden hergestellt werden können,
sind ebenfalls in die vorliegende Erfindung einbezogen. Zu den Beispielen
für solche
Fragmente gehören, wenn
auch nicht ausschließlich,
Fab- und F(ab)2-Fragmente. Auch mittels gentechnischer Methoden
erzeugte Fragmente von Antikörpern
und Derivate davon werden durch die Erfindung zur Verfügung gestellt.
-
Bei
einer Ausführungsform
sind die Antikörper
spezifisch für
die Polypeptide nach der vorliegenden Erfindung und gehen keine
Kreuzreaktion mit anderen Proteinen ein. Screeningverfahren zur
Identifizierung solcher Antikörper
sind gut bekannt und können
beispielsweise mit Immunoaffinitätschromatographie
verbunden sein.
-
Die
Antikörper
nach der Erfindung können
in Assays verwendet werden, um die Anwesenheit der Polypeptide oder
von deren Fragmenten nach der Erfindung festzustellen, sei es in
vivo oder in vitro. Die Antikörper
können
auch verwendet werden, um Polypeptide oder deren Fragmente nach
der Erfindung durch Immunoaffinitätschromatographie zu reinigen.
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Die
folgenden Beispiele werden gegeben, um besondere Ausführungsformen
der Erfindung zu erläutern
und sollen nicht als den Umfang der Erfindung limitierend ausgelegt
werden.
-
Beispiel 1: Identifizierung
von Pellinonukleinsäure-
und -polypeptid-Sequenzen
-
Die
Polynukleotidsequenzen von ESTs, die aus dendritischen Zellen der
Maus isoliert wurden, identifizierten zwei Klone, die offene Leseraster
mit einem hohen Grad von Ähnlichkeit
mit dem Drosophila-Protein Pellino zeigten (Grosshans et al., supra).
Geeignete flankierende PCR-Primer wurden konstruiert, und eine neue
Nukleinsäure
wurde aus einer murinen cDNA-Bibliothek amplifiziert und kloniert:
die Nukleotidsequenz und die durch sie kodierte Aminosäuresequenz
dieses Klons, Pellino-1 genannt (zuvor als Conserved Inflammatory
Signal Target-1 bezeichnet), sind in SEQ ID NO:1 bzw. SEQ ID NO:2
wiedergegeben. Humane Sequenzen aus den High Throughput Genomic
(HTG) und EST- Divisions
der öffentlichen
Datenbank GenBank wurden mit murinem Pellino-1 verglichen, und ein
offenes Leseraster für
das humane Pellino-1-Homologe wurde zusammengestellt. Auf der Basis
dieser humanen Sequenz wurden PCR-Primer konstruiert, und ein cDNA-Klon
wurde durch PCR-Amplifizierung
aus einer cDNA-Bibliothek von humanen dermalen Fibroblasten isoliert.
Die Nukleotid- und
die Aminosäuresequenz
dieses Proteins sind in SEQ ID NO:3 bzw. SEQ ID NO:4 dargestellt.
Danach haben Rich et al. die kodierende und die Aminosäuresequenz
von „humanem
Pellino" (GenBank
Zugangsnummern AJ278859 und CAC04320, 23. August 2000) publiziert;
die Aminosäuresequenz
des „humanen
Pellino" Polypeptids
ist identisch mit der des humanen Pellino-1 (SEQ ID NO:4), außer einer
Substitution von Ser durch Phe in der Position 11. Der Unterschied
zwischen dem „humanen
Pellino" und der
Aminosäuresequenz
gemäß SEQ ID
NO:4 kann eine natürlich
vorkommende allelische Variation der Nukleinsäuren reflektieren, die innerhalb
der humanen Population für
diese Aminosäuresequenzen
kodieren. Partielle Pellino-1-Aminosäuresequenzen sind auch in WO
2000/58350,
EP 1 074 617 und
WO 2001/09318 veröffentlicht.
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Durch
Abfrage von öffentlichen
EST-Datenbanken wurde ein Teil eines zweiten, verwandten Gens, als Pellino-2
bezeichnet, in der Maus und im Menschen identifiziert. Die Aminosäuresequenz
von Pellino-2 ist
zu 80% identisch mit den entsprechenden Teilen von Pellino-1. Geeignete
Primer wurden konstruiert, und die DNA von Pellino-2 wurde im wesentlichen
so kloniert, wie das für
Pellino-1 beschrieben wurde. Die Nukleotid- und die Aminosäuresequenz
von murinem Pellino-2 sind in SEQ ID NO:5 bzw. SEQ ID NO:6 wiedergegeben. Die
vorhergesagten Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von humanem Pellino-2
sind in SEQ ID NO:7 und SEQ ID NO:8 dargestellt.
-
In
einem von Celera Genomics (Rockville, Maryland) erhaltenen Datensatz
war eine Liste von Aminosäuresequenzen
enthalten, die als vom humanen Genom kodierend vorhergesagt waren.
Dieser Datensatz wurde mittels eines BLAST-Algorithmus durchsucht,
um Pellinopolypeptidsequenzen zu identifizieren, und mehrere Aminosäureteilsequenzen
wurden gefunden, die mit einem neuen humanen Pellinopolypeptid,
Pellino-3, verwandt zu sein schienen. Ein Vergleich dieser partiellen
Aminosäuresequenzen
von Pellino-3 mit genomischen und cDNA-Sequenzen erlaubte es, die
vorhergesagten Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von humanem Pellino-3,
SEQ ID NO:11 bzw. SEQ ID NO:12, zu konstruieren. Zwei mögliche allelische
Variationen sind innerhalb der Aminosäuresequenz von humanem Pellino-3
(SEQ ID NO:12) entdeckt worden: Eine Deletion von Leu in Position
96 und eine Substitution von Arg durch Ala in Position 353.
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Die
Aminosäuresequenzen
von murinem (Mm")
und humanem („Hs") Pellino-1- und
Pellino-2-Polypeptid
sowie von humanem Pellino-3-Polypeptid (SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4,
SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8 und SEQ ID NO:12) wurden mit den Aminosäuresequenzen
von Pellino-verwandten Pellinopolypeptiden von anderen Spezies (Drosophila
melanogaster, „Dm"; Ciona intestinalis „Ci",SEQ ID NO:14 und
Caenorhabditis elegans „Ce" SEQ ID NO:15) unter
Verwendung des „pretty" Multiple Sequence
Alignment Programms mit einer Aminosäureähnlichkeitsmatrix (amino acid
similarity scoring matrix) = blosum62, Gap Creation Penalty = 8
und Gap Extension Penalty = 2 verglichen. Die Zuordnung dieser Sequenzen
wird in Tabelle 1 wiedergegeben und zeigt in der Zeile „consensus" die Konsensaminosäuren, die
bei mindestens drei der Aminosäuresequenzen
der Zuordnung identisch sind. Die in großen Buchstaben wiedergegebenen
Aminosäuren
sind diejenigen, die Konsensaminosäuren, wie zuvor definiert,
sind. Pellino-1 und -2 zeigen 82% Identität auf der Aminosäureebene,
und der Grad der Konservierung zwischen humanem und murinem Pellino
ist außerordentlich hoch;
in nur einer Aminosäure
unterscheiden sich murines und humanes Pellino-1, und Pellino-2
ist zwischen diesen beiden Spezies zu 95% konserviert. Die vorhergesagte
Aminosäuresequenz
von Pellino-3 ist zu 70 bzw. 71% identisch mit humanem Pellino-1
bzw. -2. Es gibt ein überraschendes
Ausmaß an Ähnlichkeit
z.B. zwischen humanem Pellino-1 und dem homologen Protein von C.
elegans (SEQ ID NO:15), bei denen 44% der Aminosäuren identisch sind und die
53% ähnliche
Aminosäuren
gemeinsam haben. Eine kursorische Inspektion der Zuordnung zeigt
klar, dass die Konservierung der Sequenzen nicht in bestimmten Regionen
des Pellinoproteins konzentriert ist, sondern sich über die
gesamte Länge
der Ketten erstreckt. Dieser Umstand und die Tatsache, dass all
die Pellinopolypeptide (mit Ausnahme von Drosophila Pellino und
humanem Pellino-3, die kleine N-terminale Anfügungen aufweisen) von sehr ähnlicher
Größe sind,
lassen die Annahme zu, dass (1) alle Teile des Proteins an seiner
natürlichen
Funktion beteiligt sind und (2) indem Polypeptid nur wenige oder
keine Aminosäuren
existieren, die für
diese natürliche
Funktion unwesentlich sind. Es gibt eine besonders gut konservierte
zentrale Domäne,
die sich von der Aminosäure
132 bis zur Aminosäure
193 einschließlich
in Pellino-1 erstreckt (SEQ ID NOs:2 und 4; entsprechend den Aminosäuren 134
bis einschließlich 195
in SEQ ID NO:8 und den Aminosäuren
158 bis einschließlich
219 in SEQ ID NO:12), sowie ein absolut konserviertes Motiv von
der Aminosäure
245 bis einschließlich
der Aminosäure
254 von SEQ ID NOs:2 und 4 (entsprechend den Aminosäure 247
bis einschließlich
256 von SEQ ID NO:8 und den Aminosäuren 271 bis einschließlich 280
in SEQ ID NO:12). In die C-terminalen Anteile der Pellinopolypeptide
ist eine Reihe von kurzen, unveränderten
Motiven eingestreut, in denen Cystein, Prolin, Histidin und große hydrophobe
Bausteine überwiegen.
Die Anordnung von einigen dieser konservierten Sequenzen, einschließlich eines Cys-Gly-His-Tripletts
und zwei Cys-Pro-X-Cys-Motiven, erinnert an die Struktur der C3H4-RING-Finger-Unterfamilie
der Zink-Finger
Domänen,
welche Protein-Protein- und Protein-DNA-Wechselwirkungen in einer
unterschiedlichen Gruppe von Proteinen vermitteln, einschließlich von
Tumorsuppressoren, Protoonkogenen, und signalgebenden Molekülen, einschließlich von
TRAFs, mit spezifischen Beispielen von Polypeptiden, welche ähnliche
RING-Finger-Domänen
enthalten, einschließlich
des humanem RING-Finger-Proteins-1
(hRINGI, GenBank NP_002922); des RING-Finger-Proteins des Huhns
(C-RZF, GenBank 1589724); des humanem Proto-onkogens CBL (hC-CBL,
GenBank P22681); des murinen TNFR2-TRAF Signalkomplexproteins (mc-IAF1,
GenBank AAC42078); des humanen TRAF Wechselwirkungsproteins (hTRIP,
GenBank NP_005870); des humanen TNF-Rezeptor-assoziierten Faktors
3 (hTRAF3, GenBank NP_003291); des humanen TNF-Rezeptor-assoziierten
Faktors 2 (hTRAF2, GenBank NP_0066961); und des neuralisierten Proteins
von Drosophila (neu; GenBank 535371). Die RING-Finger-artigen Domänen von
Pellino umfassen die folgenden Aminosäuresequenzen: Aminosäure 333
bis einschließlich
Aminosäure
398 von SEQ ID NOs:2 und 4; Aminosäure 335 bis einschließlich Aminosäure 400
von SEQ ID NO:8; und die entsprechende Region von SEQ ID NO:6; sowie
die Aminosäure
360 bis einschließlich
Aminosäure
425 von SEQ ID NO:12. Es gibt konservierte Cysteinbausteine innerhalb
der RING-Finger-artigen Domänen
der Pellinopolypeptide, die in den Positionen 333, 336, 367, 371,
395 und 398 der SEQ ID NOs:2 und 4 (und in den Positionen 335, 338,
369, 373, 397 und 400 von SEQ ID NO:8 sowie in den entsprechenden
Positionen von SEQ ID NO:6 und in den Positionen 360, 363, 394,
398, 422 und 425 von SEQ ID NO:12) lokalisiert sind. In Pellinopolypeptiden
sind die konservierten Cystein- und Histidinbausteine weiter voneinander
entfernt als dies in klassischen RING-Finger Domänen, in denen die dazwischen
liegenden Sequenzen die fingerartigen Loops bilden, der Fall ist.
Das erste Cystein, das dem konservierten Histidin der kanonischen
RING-Finger-Domäne
folgt, fehlt bei Pellino, aber wir bemerken, dass es ein beinahe
invariantes Histidin in Position 362 von SEQ ID NOs:2 und 4 (und
in Position 364 von SEQ ID NO:8 sowie der entsprechenden Position
von SEQ ID NO:6 und in der Position 389 von SEQ ID NO:12) gibt,
das für
eine Koordination an ein Metallion zur Verfügung stehen könnte. Ein
zweites, invariantes Cys-Gly-His-Triplett an den Positionen 311
bis 313. von SEQ ID NOs:2 und 4 (und an den Aminosäuren 313
bis 315 in SEQ ID NO:8 sowie an den entsprechenden Positionen von
SEQ ID NO:6 und an den Aminosäuren
338 bis 340 von SEQ ID NO:12) erstreckt die ZINK-Finger-Ähnlichkeit
weiter in Richtung auf den N-Terminus. Daher scheint die C-terminale
Region von Pellinopolypeptiden einen neuen Typ von Zink-Finger-artigen Domänen zu enthalten.
-
Regionen
mit Aminosäureähnlichkeit
zwischen Pellinopolypeptiden und einem Pockenvirusgen von Insekten,
Melanoplus sanguinipes (MsEPV) ORF244, von dem man annimmt, dass
es bei der Umgehung der Immunabwehr von Wirtsorganismen eine Rolle
spielt, indem es deren defensive Proteinwechselwirkungen blockiert
(Rich et al., Immunogenetics 52:145-149, 2000) sind ebenfalls identifiziert
worden.
-
Es
wird vorhergesagt, dass Substitutionen von Aminosäuren und
andere Veränderungen
(Deletionen, Insertionen usw.) in den Aminosäuresequenzen (SEQ ID NO:2,
SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12) wahrscheinlicher
zu einer Änderung
oder Unterbrechung der Aktivitäten
der Pellinopolypeptide führen
werden, wenn sie zu Änderungen
der in Tabelle 1 mit großen
Buchstaben wiedergegebenen Aminosäuren führen, und insbesondere dann,
wenn durch diese Veränderungen
nicht ein Baustein ersetzt wird, der in anderen Polypeptiden der
in Tabelle 1 gezeigten Zuordnung in dieser Position vorkommt. Wenn
umgekehrt eine Veränderung
in der Aminosäuresequenz
von Pellino vorgenommen wird, die zu einer Substitution von einer
oder mehreren Aminosäuren
der Konsensaminosäuresequenz
gemäß Tabelle
1 führt,
ist es weniger wahrscheinlich, dass eine solche Veränderung
einen Einfluss auf die Funktion des Pellinopolypeptids hat. Ausführungsformen
der Erfindung schließen
Pellinopolypeptide und Fragmente von Pellinopolypeptiden ein, die
veränderte
Aminosäuresequenzen
umfassen. Veränderte
Pellinopolypeptidsequenzen weisen mindesten 30%, oder vorteilhaft
mindestens 40%, oder vorteilhafter mindestens 50%, oder vorteilhafter
mindestens 55%, oder vorteilhafter mindestens 60%, oder vorteilhafter
mindestens 65%. oder vorteilhafter mindestens 70%, oder vorteilhafter
mindestens 75%, oder vorteilhafter mindestens 80%, oder vorteilhafter
mindestens 85%, oder vorteilhafter mindestens 90%, oder vorteilhafter
mindestens 95%, oder vorteilhafter mindestens 97,5%, oder vorteilhafter
mindestens 99%, oder insbesondere mindestens 99,5% Aminosäureidentität mit den
Aminosäuresequenzen
von Pellino gemäß den Sequenzen
von SEQ ID NO:2, SEQ ID NO,4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8 und SEQ ID
NO:12 auf.
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Tabelle
1. Vergleich der Aminosäuresequenzen
von Pellinopolypeptiden verschiedener Spezies
-
Tabelle
1. Vergleich der Aminosäuresequenzen
von Pellinopolypeptiden verschiedener Spezies (Fortsetzung)
-
Tabelle
1. Vergleich der Aminosäuresequenzen
von Pellinopolypeptiden verschiedener Spezies (Fortsetzung)
-
Die
für humanes
Pellino-1, -2 und -3 kodierenden Sequenzen mit öffentlich zugänglichen
vorläufigen humanen
genomischen DNA-Sequenzen verglichen, und die folgenden Contigs
auf den Chromosomen 2, 14 und 11 wurden als Sequenzen enthaltend,
die für
Pellino-1, -2 bzw. -3 kodieren, identifiziert: AC013466.3 (Pellino-1),
AL138995.4 und AL355073.4 (Pellino-2) und AC027270.3 (Pellino-3).
Die ungefähren
Positionen der Exons mit den für
Pellino-1, -2 bzw. -3 kodierenden Sequenzen in den obigen Contigs
sind der folgenden Tabelle zu entnehmen, zusammen mit ihren Lokationen
in Bezug auf SEQ ID NOs:3, 7 und 11. Es ist bemerkenswert, dass
die 5'- und 3'-untranslatierten
Regionen sich längs
der Contig-Sequenz über
die Regionen, die den 5EQ ID NOs:3, 7 und 11 entsprechen, hinaus erstrecken können, was in der Tabelle durch
die Klammern rund um die Endpunkte der Contigs angezeigt ist. Es
ist auch bemerkenswert, dass die Positionen der Exongrenzen innerhalb
der für
humanes Pellino-1, -2 bzw. -3 kodierenden Sequenzen sehr hoch konserviert
sind, wobei Unterschiede in der Größe der Exons vornehmlich bei
Pellino-1 bestehen, Pellino-2 im Vergleich zu Pellino-1 zwei zusätzliche
Kodons im Exon 1 aufweist, und Pellino-3 im Vergleich zu Pellino-1
27 zusätzliche
Kodons im Exon 1 hat. Infolge der Vorläufigkeit der Sequenz und der
Zusammenfügung
der Contig-Sequenz sind die Exons innerhalb des
Contigs nicht immer in der richtigen Ordnung oder der richtigen
Orientierung in Bezug aufeinander angegeben und können Sequenzvariationen
infolge nicht akkurater Sequenzdaten oder allelischer Polymorphie
enthalten. Beispielsweise enthält
das genomische Contig AC013466.3 im Exon 1 zwei Kopien der Pellino-1-Sequenz,
die in Bezug aufeinander in entgegen gesetzter Orientierung vorliegen,
wie in der folgenden Tabelle angezeigt ist.
-
Einander
entsprechende Positionen von Exons mit Pellino-1-, -2- und -3-Genen
in humanen Contigs und in cDNA-Sequenzen
-
Die
Exons, welche für
humanes Pellino-1 kodierende genomische Sequenzen enthalten, kartieren
in der 2p13.3 Region des humanen Chromosoms 2. Humane Pellinonukleinsäuren, wie
z.B. SEQ ID NO:3, und deren Fragmente sind für die cytologische Identifizierung
dieser chromosomalen Region und für die genomische Kartierung
von humanen genetischen Funktionsstörungen nützlich, wie z.B. für die folgenden
Funktionsstörungen,
die in dieser Region kartiert sind: Präeklampsia/Eciampsia-Gen 1,
Alstrom-Syndrom, Parkinsons Krankheit Gen 3, orofaciales Cleft Gen
2 und Welanders distale Myopathie. Die genomischen Exons mit Sequenzen,
die die für
humanes Pellino-2 kodierenden Sequenzen enthalten, kartieren in
der 14q24.3 Region des humanen Chromosoms 14. Humane Nukleinsäuren, wie
z.B. SEQ ID NO:7, und deren Fragmente sind für die zytologische Identifizierung
dieser chromosomalen Region und für die genomische Kartierung
von humanen genetischen Funktionsstörungen nützlich, wie z.B. für die folgenden
Funktionsstörungen,
die in dieser Region kartiert sind: Achromatopsie-Gen 1, erbliche
benigne Chorea, multinodulare Goiter, Myopathie (distal), Tyrosinämie vom
Typ IB und Alzheimers Krankheit Gen 3. Die genomischen Sequenzen,
die humane Pellino-3 Exons enthalten, kartieren in einer Region
des humanen Chromosoms 11 zwischen 11.1 und 11q13, und es wird angenommen,
dass sie sehr dicht an der 11q12.1 Region kartieren. Humane Pellinonukleinsäuren, wie z.B.
SEQ ID NO:3, und deren Fragmente sind für die zytologische Identifizierung
dieser chromosomalen Region und für die genomische Kartierung
von humanen genetischen Funktionsstörungen nützlich, wie z.B. für die folgenden
Funktionsstörungen,
die in dieser Region kartiert sind: Osteoporose-Pseudoglioma-Syndrom und
Spinocerebrales Ataxie-Gen 5. In einem kürzlich erschienenen Bericht
(Schmitt-John et al., 2000, „Mouse Homolgue
of the Drosophila Pellino Gene, Pli1 on Chr 11 is Affected in the
Wobbler Mutant",
Abstract B12, posted at Imgs.org/abstracts/2000-abstracts/toc_b.html)
wird nahe gelegt, dass murines Pellino-1 möglicherweise das Protein ist,
das in der Wobbler Mutante eine Rolle spielt, die durch eine Degeneration
der spinalen Motoneuronen charakterisiert ist. Es ist interessant,
dass alle drei humanen Pellinogene in der Nähe von humanen genetischen
Orten kartieren, die mit neuromuskulären Defekten zu tun haben:
Welanders distale Myopathie; Myopathie (distal); und spinozerebrales
Ataxiegen 5 (das mit dem Versagen der muskulären Koordination und/oder irregulären muskulären Aktionen
zu tun hat). Dies lässt
vermuten, dass diese humanen genetischen Defekte mit Defekten in
der Aktivität
der humanen Pellinopolypeptide zusammenhängen.
-
Beispiel 2. Reportergen-Assay
auf Aktivität
von Pellinopolypeptiden
-
Die
für murines
Pellino-1 kodierende DNA-Sequenz wurde, im Leseraster an dem 3'-Ende, mit einer DNA
fusioniert, die für
das FLAG Epitop kodiert, gefolgt von einem Stopkodon im Raster.
Dieses Konstrukt wurde in den Säugerexpressionsvektor
pDC304 (identisch mit pDC302, beschrieben im U.S. Patent Nr. 5,599,905, erteilt
am 4. Februar 1999, außer
dass die frühe
Spliceregion, bestehend aus den Orten für den Splicedonor und den Akzeptor
des viralen Elements SV40, entfernt worden war) kloniert und mittels
der DEAE-Dextranmethode in eine IL-1-responsive Linie von COS-7
Zellen transfiziert.
-
Um
die Wirkung des Pellino-1-FLAG-Polypeptids und anderer Formen der
Pellinopolypeptide auf die Aktivität von Reportergenen zu untersuchen,
kann man im wesentlichen eine Methode verwenden, die von Born et
al. in J. Biol. Chem. 273:29445-29450 beschrieben wurde. Als ein
Beispiel für
diese Methode wurden COS7-Zellen mittels der DEAE-Dextran-methode
transfiziert, wie von Cosman et al., 1984, in Nature 312:768-771
beschrieben wurde, wobei jeweils 150 ng des Expressionskonstrukts
für das
Pellinopolypeptid und 700 ng des Reporterplasmids für 45.000
Zellen verwendet wurden. Zwei Tage nach der Transfektion wurden
die Zellen mit 10 ng/ml IL-18 (Pepro Tech Inc.) 4 Stunden lang stimuliert.
Die Zellen wurden lysiert, und die Luciferase-Aktivität wurde
unter Verwendung von Reporter-Lysepuffer und Luceferaseassay-Reagenz (Promega
Corp., Madison, WI untersucht. IL-8-Promotor-Reporter und NF-kB-abhängige Reporterkonstrukte können als
Reporterplasmide verwendet werden. Alternativ kann die Wirkung der
Expression von Pellinopolypeptid in COS-Zellen bestimmt werden.
Bei einer bevorzugten alternativen Methode werden COS-7-Zellen in Platten
mit 12 Wells kultiviert, wie zuvor beschrieben. Die Zellen wurden
mit dem zu testenden Pellinoplasmid, 50 ng Reporterplasmid-DNA und
leerem Vektor, wie erforderlich, mit insgesamt 1 Mikrogramm DNA
pro Well transfiziert. Nach 24 Stunden wurden stimulierender Agenzien
in einer kleinen Menge (weniger als 0,5% endgültiges Volumen) Medium oder
Dimethylsulfoxid zugesetzt, und die Zellen wurden 5 Stunden reinkubiert.
Die Zellen wurden mittels Luciferase-Reporter-Lysepuffer (Promega
Corp., Madison, WI, 0,25 ml pro Well)) lysiert, und die Luciferaseaktivität wurde
nach Zusatz von Luciferaseassay-Reagenz mittels eines Luminometers
von EG&GBerthold
nach den Vorschriften des bzw. der Lieferanten gemessen. Alle Ergebnisse
wurden auf den Gesamtgehalt der Lysate an Protein, gemessen mittels
des Mikro-BCA Assays (Pierce, Rockford, IL) normalisiert.
-
In
einem vorläufigen
Experiment wurde gefunden, dass die auf diese Weise erfolgte Expression
von murinem Pellino-1-FLAG die durch IL-1 induzierte NF-kB-abhängige Reportergenaktivität partiell
inhibierte. Diese inhibierende Wirkung von Pellino-1-FLAG kann möglicherweise
auf eine Überexpression
des Pellinopolypeptids zurückzuführen gewesen
sein, weil gefunden worden ist, dass die Transfizierung von COS-Zellen
mit hohen Konzentrationen eines Pellino-1- oder Pellino-2-Expressionskonstrukts
einen inhibierenden Effekt auf die NF-kB-abhängige Reportergenaktivität hat, möglicherweise
infolge der Bildung von Homodimeren oder höheren Multimeren von Pellinopolypeptiden,
die eine inhibierende Wirkung haben könnten, im Gegensatz zu der stimulierenden
Wirkung von mäßigen Konzentrationen
von monomeren Pellinopolypeptiden. Andere Erklärungsmöglichkeiten für die inhibierende
Wirkung einer Präparation
von Pellino-1-FLAG auf die NF-kB-abhängige Reportergenaktivität sind die
Anwesenheit von mutierten Formen des Polypeptids, wie in der Folge
beschrieben wird, oder die relative Anwesenheit oder Abwesenheit
eines noch zu charakterisierenden Faktors in einer bestimmten Zelllinie.
-
In
späteren
Experimenten mit einem murinen Pellino-1-FLAG-Konstrukt, das, wie
nachgewiesen wurde, eine natürliche
Pellino-1-Aminosäuresequenz
enthielt, hatte das Pellino-1-FLAG-Konstrukt mit der natürlichen
Aminosäuresequenz
jedoch eine stimulierende Wirkung auf die durch IL-1 induzierte
NF-kB-abhängige Reportergenaktivität (siehe
die folgende Tabelle 2); natürliches
Pellino-1-FLAG verstärkte
auch in geringem Umfang die Jun N-terminale Kinase, die p38 Kinase
sowie die durch IL-1 vermittelte ERK-Signaltransduktion. Wenn natürliche Pellino-1-Polypeptide
in COS-1-Zellen exprimiert wurden, stimulierten sie die IL-8 Promotor-Reportergen-Aktivität und die
NF-kB-abhängige
Reporteraktivität
sowohl bei Anwesenheit als auch bei Abwesenheit einer Behandlung
mit TNF-alpha, im Vergleich zu einem Kontrollversuch nur mit dem
Vektor. In ähnlichen
Experimenten stimulierte die Transfizierung von COS-Zellen mit mäßigen Mengen
des natürliches
Pellino-2-Polypeptid exprimierenden Konstrukts die NF-kB-abhängige Reportergenaktivität.
-
Um
Regionen von Pellino zu definieren, die dessen Antwort auf entzündungsfördernde
Mediatoren bestimmen, wurde eine Reihe von mutierten Pellinoexpressionsvektoren
konstruiert. Das scheinbare Mr von FLAG-Pellino-1 auf SDS-PAGE-Gelen
liegt nahe an dem Wert von 47.224 Dalton, der aus der primären Sequenz
errechnet wurde. Dies ist ein Anzeichen dafür, dass keine extensive Modifizierung
nach der Translation stattgefunden hat. Es ist daher möglich, den
ungefähren
Ort in der primären
Sequenz von Pellino-1 vorherzusagen, an dem die Spaltung stattfinden
sollte, um ein N-terminales Produkt mit 30 kDa zu erzeugen. Der
diesem Punkt am nächsten
liegende zweckentsprechende Baustein ist Phe-158; eine Spaltung
der Peptidbindung, die diesem Baustein vorhergeht, würde zu einem
Polypeptid mit einer Masse von 30.044 Dalton führen. Diese Region des Pellino-1-Polypeptids
wurde daher zur Mutation ausgewählt,
da erwartet werden könnte, dass
einige der resultierenden Mutanten der Spaltung widerstehen oder
auf eine andere Weise in ihrer Antwort auf pro-entzündliche
Stimulanzien verändert
würden.
Die Spaltung von Pellino ist empfindlich gegen einen Chymotripsininhibitor,
TPCK, und Chymotripsin erfordert zur Spaltung die Anwesenheit eines
großen
aromatischen Bausteins an einer Seite des Ortes der Spaltung. Mit
der Überlegung,
dass das Pellino spaltende Enzym die selben spezifischen Determinanten
teilen könnte,
beschlossen wir, vier der aromatischen Aminosäuren zu mutieren, die in dieser
Region der von Säugern
stammenden Pellinopolypeptide als invariabel befunden wurden. Die
beiden internen Deletionsmutanten wurden so ausgewählt, dass
sie den vorhergesagten Spaltungsort flankierten und auch hoch konservierte
Bausteine einschlossen. Zusätzlich
wurde eine Reihe von verkürzten Varianten
konstruiert, indem Bausteine sowohl am N- als auch am Carboxyterminus
deletiert wurden, sowie Mutanten, in denen Cysteinbausteine in der
RING-Finger-artigen Domäne
fehlten, und zwar auf die folgende Weise. Um eine Reihe von N-terminalen
Deletionen zu erreichen, wurden kurze Sinnstrang-Oligonukleotid-Primer
synthetisiert, in denen eine einen Kpnl-Restriktionsort sowie ein
Methioninkodon enthaltende Sequenz mit murinen Pellino-1-Sequenzen
fusioniert wurden, beginnend mit den Kodons für Gly-S1, Phe-100, Asp-181 und Val-231.
Diese wurden mit einem Antisinn-FLAG-BgIll-adaptierten Primer fusioniert,
um PCR-Fragmente
von muriner Pellino-1-FLAG Templat-DNA zu amplifizieren. Diese Fragmente
wurden in den pDC304-Vektor rekloniert, um die Konstrukte zu generieren,
die für
die dN50-FLAG-, dN99-FLAG; dN180-FLAG- und dN230-Flag-Mutanten kodieren.
Eine ähnliche
Strategie wurde gewählt,
um eine Reihe von Mutanten zu konstruieren, die am C-Terminus progressiv
verkürzt
waren. Antisinn-Oligonukleotide
wurden synthetisiert, die mit den Kodons für Thr-150, Thr-250 bzw. Glu-350
endeten, zusammen mit einer Sequenz, die ein Stopkodon und einen
BgIII-Restriktionsort enthielt. Diese Primer wurden verwendet, um
PCR-Fragmente herzustellen, die danach in pDC304 kloniert und als
für die
Mutanten 1-150, 1-250 bzw. 1-350 kodierend bezeichnet wurden. Die Konstrukte
die für
die Substitutionen einer Aminosäure
kodierten, F137L-FLAG, Y154A-FLAG, F158A-FLAG und F165L-FLAG, wurden unter
Verwendung des Quick-Change ortsspezifischen Mutagenesekits (Stratagene, LaJolla,
CA) konstruiert. Um die Mutanten mit internen Deletionen, d133-156-FLAG
und d155-158FLAG, zu
konstruieren, haben wir in beiden Fällen ein Paar PCR-Fragmente
eingeführt,
die einen Restriktionsort enthielten, um die zu deletierende Sequenz
zu flankieren. Nach der Restriktionsverdauung und der Reinigung
der PCR-Fragmente wurden sie mittels Dreiwegbindung in den Vektor
pDC304 eingeführt.
Es wurde auch eine Mutante konstruiert, in der die vier Aminosäuren Cys-333
bis Cys336 in der oder einer RING-Finger-artigen Domäne durch
die beiden Aminosäuresequenzen
Gly-Ser ersetzt wurden; diese Mutante wurde als C333-C336GS-FLAG
bezeichnet.
-
Im
Gegensatz zu dem natürlichen
Pellino-1 inhibierten mutierte Formen von Pellino-1-Polypeptiden, in denen
die Aminosäuren
133-156 oder die Aminosäuren
155-158 von SEQ ID NO:2 deletiert wurden, oder in denen die Aminosäuren 50
oder 99 in der N-terminalen Region des Polypeptids deletiert wurden
oder in denen durch Substitutionen in der RING-Finger-artigen Domäne Cystein-Bausteine entfernt
wurden, die IL-8 Promotor-Reportergenaktivität sowohl bei Anwesenheit als
auch bei Abwesenheit einer Behandlung mit TNF-alpha, und die mutierte
Form von Pellino-1, in der die Aminosäuren 155-158 deletiert waren,
inhibierten die NF-kB-abhängige
Reporteraktivität
sowohl bei Anwesenheit als auch bei Abwesenheit einer Behandlung
mi PMA, verglichen mit einem Versuch nur mit einem Vektor. Die Stimulierung
der Aktivität
dieser Reportergene ist konsistent mit einer stimulierenden Wirkung
auf eine ent-zündungsfördernde
regulatorische Kaskade, während
die Inhibierung der Aktivität
dieser Reportergene mit einer inhibierenden Wirkung auf eine entzündungsfördernde regulatorische
Kaskade konsistent ist. Eine Zusammenfassung der Wirkungen der natürlichen
und der mutierten Formen von murinem Pellino-1 auf die NF-kB-abhängige Reportergenaktivität ist in
Tabelle 2 dargestellt; alle Aminosäurepositionen beziehen sich
auf die Aminosäuresequenz
gemäß SEQ ID
NO:2. Die Resultate hinsichtlich „Löslich oder Unlöslich" und „Gespalten
(cleaved)" sind
in den folgenden Beispielen 3 und 4 beschrieben.
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Aus
der folgenden Tabelle ist ersichtlich, dass Deletionen in der N-terminalen
Region von Pellino-1-Polypeptiden
(d.h. die Deletionen der N-terminalen Aminosäuren 50 Oder 99) Mutanten mit
inhibierender Aktivität auf
MAP Kinase-aktivierte Signaltransduktion erzeugt (wie z.B. durch
die Inhibierung der NF-kB-abhängigen Transkription
demonstriert wird), die Deletion von wichtigeren Teilen (d.h. der
N-terminalen Aminosäuren
180 oder 230) hebt jedoch die Fähigkeit
von Pellino-1 auf, Reportergenaktivität zu stimulieren oder zu inhibieren. Daher
sollte es möglich
sein, Mutanten von Pellinopolypeptiden mit weiteren N-terminalen
Deletionen zu generieren, die inhibierende Aktivität auf die
NF-kB-abhängige
Transkription ausüben,
wie z.B. Mutanten, in denen N-terminale Aminosäuren fehlen, die den N-terminalen
Aminosäuren
in den Positionen 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150,
155, 160, 165, 170 oder 175 von SEQ ID NO:2 entsprechen, die aber
trotzdem noch inhibierende Wirkungen zeigen. Alternativ können andere
Bausteine innerhalb der N-terminalen Aminosäuren von Pellinopolypeptiden,
die den 180 N-terminalen Aminosäuren
von SEQ ID NO:2 entsprechen, deletiert werden, um mutierte Formen
von Pellinopolypeptiden zu schaffen, die eine inhibierende Wirkung
auf die NF-kB-abhängige
Transkription haben. In ähnlicher
Weise können
Mutanten, in denen in der zentralen, konservierten Domäne und/oder
in der RING-Finger-artigen Domäne
1 bis 50 Aminosäuren,
vorteilhafter 1 bis 30 Aminosäuren
deletiert wurden, ebenfalls eine inhibierende Wirkung auf die NF-kB-abhängige Transkription ausüben. Alle
diese Mutanten können
ohne weiteres mittels des hierin beschriebenen Reportergenassays
auf ihre Aktivität
untersucht werden.
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In ähnlichen
Experimenten unter Verwendung von COS-Zellen, die mit einem CHOP
einschließenden Reporterkonstrukt
transfiziert waren, inhibierte ein p38-abhängiger Promotor, die 155-158-FLAG-mutierte Form
von Pellino-1, die Stimulierung der CHOP Reportergenaktivität durch
TNF-alpha. Dieser
Befund ist signifikant, weil er zeigt, dass mutierte Formen von
Pellinopolypeptiden in der Lage sind, eine Mehrzahl von MAP Kinase-aktivierten
entzündungsfördernden
Signaltransduktionen zu inhibieren, was durch die von ihnen bewirkte
Inhibierung sowohl der NF-kB-abhängigen
Transkription als auch der p38-abhängigen Tran-skription angezeigt
wird. Weil natürliche
Formen von Pellinopolypeptiden stimulierende Wirkungen auf Schlüsselkomponenten
der vier hauptsächlichen
MAP Kinase-aktivierten Signal-transduktionen ausüben (auf die Stimulierung von
Jun N-terminaler Kinase, von p38-Kinase, die ERK-Signaltransduktion
und die Stimulierung der NF-kB-abhängigen Transkription) ist zu
erwarten, dass die „dominant-negativen" mutierten Formen
von Pellinopolypeptiden die Jun Kinase- und die ERK MAP Kinase-aktivierten
Signaltransduktionen in ähnlicher
Weise inhibieren wie die Inhibierung der p38- und der MAP Kinase-aktivierten
Signaltransduktionen.
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Beispiel 3. Intrazelluläre Lokalisierung
von Pellinopolypeptiden
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Dieses
Beispiel beschreibt ein Verfahren zur Überwachung der Regulation (durch
IL-1 oder andere Zytokine oder Moleküle) der intrazellulären Lokalisation
von Pellino-1 in Zellen. COS-7-Zellen, die einen endogenen IL-1-Rezeptor
exprimieren, werden mit einem Expressionsvektor transfeziert, der
FLAG-Pellino-1,
wie in Beispiel 2 beschrieben, enthält. Die Zellen können auch
gleichzeitig mit anderen cDNAs transfiziert werden, die ein Entzündungssignal
vermitteln, wie z.B. die IL-1Rezeptor-assoziierte Kinase (IRAK);
GenBank NP001560). Die transfizierten Zellen werden etwa 48 Stunden
kultiviert. IL-1 (20 ng/ml) oder ein anderes Zytokin oder Molekül in einer
geeigneten Konzentration werden dem Kulturmedium für die letzten
15 Minuten (Kurzzeitstimulierung) oder für die letzten 24 Stunden (verlängerte Stimulierung)
zugesetzt.
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Die
Zellkulturen werden mit eiskalter, Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS)
gewaschen, und Lysate der Zellen werden hergestellt, in dem man
die Zellen in einen Lysierpuffer schabt, der 50 mM Tris-Chlorid, vom pH 8,0,
ergänzt
durch 1% Nonidet (NP 40), 0,5% Natriumdeoxycholat, 0,1 mM Natriumorthovanadat, 30
mM para-Nitrophenyl-phosphat, 30 mM beta-Glycerophosphat, 140 mM
NaCl, 5 mM Dithiothreitol, 2 mM EDTA, 10 mM Leupeptin, 10 mM Pepstatin
A und 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid enthält; die Chemikalien wurden
von Sigma, St.Louis, MO bezogen. Die Solubilisierung der zellulären Proteine
kann erleichtert werden, indem man die Lysate mehrmals durch hypodermische
Nadeln von 25 Gauge laufen lässt.
Das Lysat wird bei 4°C
und 13.000xG zentrifugiert. Das verbleibende Pellet wird in 1X SDS-PAGE
Probepuffer (Laemmli et al, Nature 227:680; 1970) solubilisiert;
dieses Material wird als die „unlösliche Fraktion" bezeichnet.
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Bei
einem alternativen Verfahren, bei dem man lösliche und nicht lösliche,
Pellinopolypeptide enthaltende Fraktionen erhält, werden COS7 (Affennieren)
Zellen bei 35°C
und 5% CO2 in Dulbeccos modifiziertem Eagles-Medium
gehalten, das 5% bovines Serum enthielt und mit 100 Einheiten/ml
Penicillin und 100 Mikrogramm/ml Streptomycin versehen war. Für Pellino-FLAG
kodierende Plasmide oder andere Expressionsplasmide wurden in Gewebekulturplatten
mit 6 Wells (Costar) in COS7-Zellen transfiziert, wozu DEAB-Dextran
verwendet wurde. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Transfizierung
wurden Zellen in 0,4 ml eines Lyse/Extraktions-Puffers geschabt,
der aus 50 mM Tris-HCl vom pH 7,8, 1 % NP-40, 0,15M NaCl, 2 mM EGTA,
5 MikroM NaF, 30 mM beta-Glycerophosphat, 1 mM Orthovanadat, 1 mM
Dithiothreitol, 0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 10 Mikrogramm/ml
Leupeptin und d10 Mikrogramm/ml Pepstatin A bestand. Man ließ die Zellsuspensionen
15 Minuten auf Eis lysieren und zentrifugierte sie dann in einer
Mikrozentrifuge 10 Minuten lang bei 13.000 U/min und 4°C. Die Überstände wurden
sorgfältig
in frische Gefäße transferiert
und mit einem Drittel ihres Volumens mit Merkaptoethanol enthaltendem
4x-konzentriertem SDS-PAGE Probepuffer verdünnt. Die Überstände („Detergens-lösliche Fraktion") wurden für 5 Minuten
zum Sieden erhitzt. Die Zellen wurden reextrahiert, indem man sie
in der Hälfte
des ursprünglichen
Volumens in 1x-konzentriertem SDS-PAGE-Probepuffer resuspendierte und sie dann
zum Sieden erhitzte.
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Aliquote
Teile der löslichen
Fraktion und der unlöslichen
Fraktion können
dann mittels Gelelektrophorese auf SDA-Polyacrylamid-Gelen mit 4-20%
Gradienten (Novex, Invitrogen Corp., Carlsbad, CA).analysiert werden,
auf Nitrozellulosemembranen transferiert und einem Assay mittels
Western Immunoblotting unterzogen werden, wozu man Anti-FLAG-Antikörper (wie
z.B. FLAG M2) zur Bindung an die Proteinprodukte der transfizierten
cDNAs verwendet. Die Proteine werden sichtbar gemacht durch Inkubation
von Western Blots mit Horseradish peroxidase-konjugiertem Antimaus-IgG
(BioRad, San Diego, CA), gefolgt von einer Detektion mittels des
ECL-Systems (Amersham, Arlington Heights, IL).
-
Beispiel 4. Wirkung von
Zellstimulation auf Lokation und Spaltung von Pellinopolypeptiden
-
Dieses
Beispiel beschreibt die Wirkung der Stimulierung von COS7-Zellen,
die mit einem für FLAG-Pellino-1
kodierenden Expressionsvektor transfeziert waren, mittels IL-1 oder
anderer Moleküle.
Transfizierte Zellen wurden im wesentlichen so hergestellt, wie
zuvor beschrieben wurde. In einigen Fällen wurden die Zellen mit
einem pDC304-Vektor co-transfiziert, der eine cDNA-Insertion enthielt,
die für
humanes IRAK kodierte das mit einem Tandem 3' FLAG und Poly-His „Schwanz" versehen war. In anderen Fällen werden
die Zellen mit einem katalytisch inaktiven humanen FLAG-Poly-His-IRAK
Expressionsvektor co-transfiziert, in dem das Lysin 293 in der ATP-Bindungstasche
von IRAK durch ein Alanin ersetzt ist. Da das Pellino von Drosophila aufgrund
seiner Fähigkeit,
mit Pelle zu assoziieren, entdeckt wurde, sind Versuche unternommen
worden, in denen Pellino mit IRAK co-exprimiert wurde, um zu bestimmen,
ob von Säugern
stammendes Pellino mit IRAK, dem vermuteten Pelle entsprechenden
Protein in Säugern,
in Wechselwirkung trat.
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Die
Analysen zeigten, dass bei Abwesenheit von überexprimiertem aktiven IRAK,
FLAG-Pellino-1 in erheblichen Mengen in der löslichen Fraktion als ein Polypeptid
mit einer Größe in der
Nähe der
vorhergesagten Größe von 46
kDa vorkommt. Wenn IRAK überexprimiert
wird, ist FLAG-Pellino-1 in erheblichen Mengen in der nicht löslichen
Fraktion vertreten, und ein erheblicher Teil des Pellinos in der
nicht löslichen
Fraktion erschien in Western Blots als eine Spezies mit 30 kDa.
Da sie reaktiv mit Anti-FLAG-Antikörper war,
besteht die Spezies mit 30 kDa vermutlich aus einem Amino-terminalen
Fragment. In einigen Experimenten, in denen größere Mengen von plasmidischer
Expressions-cDNA verwendet wurden, ist ein weiteres N-terminales
Spaltprodukt von Pellino mit 17 kDa entdeckt worden. Die unlösliche Form
von Pellino-1 mit 30 kDa, die sich in Zellen fand, die mit natürlichem
IRAK transfizier worden waren, wanderte etwas langsamer als die
Form aus Zellen, die mit Kinase-inaktiver IRAK co-transfiziert worden
waren. Dies könnte
ein Zeichen dafür
sein, dass die Pellino-1-Fragmente von 30 kD unterschiedlich phosphoryliert
oder vielleicht auf eine andere Weise unterschiedlich modifiziert
waren. In ähnlicher
Weise war eine allgemeine Verschiebung in der Mobilität von natürlichem IRAK
Zellen evident, die mit Pellino-1 co-transfiziert worden waren,
was konsistent mit einem Modell ist, wonach sowohl Kinase-aktives
IRAK als auch Pellino an der Regulation des Standes der Modifizierung
des jeweils anderen Partners nach der Translation (Modifikationen,
wie z.B. Phosphorylierung, Ubiquitinylierung, Myristolisierung,
Farnesylierung und Geranylgeranylisierung). Kinase-inaktives IRAK
kann jedoch weder Modifikationen von Pellino-1 beeinflussen, noch
kann Kinase-inaktives IRAK auf diese Weise durch Pellino-1 modifiziert
werden. Im Gegensatz dazu erfordern die Spaltung von Pellino-1 und
die Relokalisierung der nicht löslichen
Fraktion nicht die Kinaseaktivität
von IRAK.
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Um
zu entscheiden, ob die beobachtete Redistribution und die proteolytische
Veränderung
von Pellino-1 spezifisch IRAK verlangten, wurden mit Pellino-1 transfizierte
Zellen mit Agenzien stimuliert, die NF-kB auf von IRAK unabhängige Weise
aktivieren, wie z.B. Phorbolmyristat-acetat (PMA,100 ng/ml), von
dem bekannt ist, dass es viele der selben intrazellulären Signale
wie IL-1 fördert,
und TNF-alpha (20
ng/ml). TNF-alpha aktiviert NF-kB durch einen Mechanismus, an dem
das Adaptorprotein TRADD, die Kinase RIP und TRAF2 beteiligt sind,
während
PMA die Aktivität
der Proteinkinase C stimuliert, von der bekannt ist, dass sie mit
der NF-kB-Kaskade zusammenwirkt (to cross-talk). Beide Agenzien
bewirken einen Zeit-abhängigen
Anstieg der Redistribution von Pellino-1 in die nicht lösliche Fraktion,
in der es überwiegend
als Spaltprodukt mit 30 kDa vorlag. In beiden Fällen bedurfte es 2 oder 3 Stunden
Einwirkung des Stimulans, bevor eine Spaltung von Pellino in signifikantem
Ausmaß zu
beobachten war. Die Gesamtmenge an detektierbaren Pellino-1-Polypeptiden
(die Summe der löslichen
und der nicht löslichen
Fraktionen) vergrößerte sich
bei Gegenwart von PMA oder TNF-alpha, was vermutlich eine Veränderung
der Nettoraten der Synthese von Pellino-1 und/oder dessen Abbaus
refklektiert. Die Inkubation mit mehreren Wachstumsfaktoren (wie
z.B. der epidermale Wachstumsfaktor (EGF), der grundlegende Fibroblastenwachs-tumsfaktor,
der transformierende beta-Wachstumsfaktor oder der von Blutplättchen abgeleitete
Wachstumsfaktor) hatte eine geringe oder gar kein Wirkung auf Pellino-1; nur der epidermale
Wachstumsfaktor war sehr schwach aktiv. Es ist berichtet worden,
dass EGF in einigen Zellen durch Induzierung des IkB-alpha-Abbaus
NF-kB aktiviert. Diese Befunde sind konsistent mit der Spaltung
und der Redistribution von Pellino-1, die spezifisch als Antworten
auf Stimulierungen auftreten, welche NF-kB aktivieren, mit Einschluss
derjenigen mit Signalmechanismen, an denen IRAK nicht teilnimmt. Zeit-Verlaufs-Experimente
zeigten, dass die Spaltung und die Relokation von Pellino-1 etwa
zwei Stunden nach der Induzierung durch PMA einsetzten, und nach
etwa drei Stunden nach der Stimulierung durch TNF-alpha, wobei die
durch TNF-alpha vermittelte NF-kB-Aktivierung in COS7-Zellen nach 15 Minuten
maximal war. Dies lässt
vermuten, dass die Spaltung und die Veränderungen in der Löslichkeit
wahrscheinlicher ein Teil der zellulären Effekte der NF-kB-Aktivierung
sind, als dass sie kausal in den Aktivierungsprozess involviert
sind. Es zeigt weiterhin an, dass die Spaltung und die Relokalisierung
von Pellino-1 von einer de novo-Proteinsynthese abhängen könnten. Diese
Beobachtung wurde durch Experimente bestätigt, in denen eine Vorbehandlung
von mit FLAG-Pellino-1 transfizierten Zellen mit einem Inhibitor
für die
Proteinsynthese, Cycloheximid, weitgehend verhinderte, dass PMA
danach die Spaltung und die Relokation von Pellino-1 induzierte.
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Mit
dem Ziel zu bestimmen, welche Protease an der Regulation der Spaltung
von Pellino-1 beteiligt sein könnte,
wurden mit einem Pellino-1-Expressionskonstrukt transfizierte COS7-Zellen
mit PMA und gleichzeitig mit Inhibitoren von verschiedenen Klassen
von Proteinasen behandelt, wie in der folgenden Tabelle 3 dargelegt
ist.
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Tabelle
3. Wirkung verschiedener Proteaseinhibitoren auf die Spaltung und
die Rlokation von Pellino-1
-
Diese
Resultate zeigten, dass ein Mitglied der Chymotripsin-artigen Serinproteasenfamilie
an der Spaltung und der Relokation von Pellino-1 beteiligt war.
Dies steht im Gegensatz zu anderen IL-1- und TNF-alpha-Signalkaskaden,
von denen bekannt ist, dass eine Aktivierung durch Caspase (wie
z.B. bei der durch TNF-alpha induzierten Apoptose; Rath et al.,
J. Clin. Immunol. 19:350, 1990) oder Proteasome (wie z.B. bei dem
durch IL-1 induzierten Abbau von IkB; Karin et al., Semin. Immunol.
2000, 12:85, 2000). Die langsame Kinetik der Pellino-1-Veränderung
würde konsistent
sein mit einem Erfordernis für
de novo-Proteinsynthese, und damit wiederum konsistent verhinderte
eine Behandlung von COS7-Zellen mit dem Inhibitor für die Proteinsynthese
Cycloheximid vollständig
die PMA-induzierte Spaltung. Es ist daher möglich, dass PMA die Synthese
einer Protease induziert, die Pellino spaltet, oder aber die Synthese
eines mitwirkenden Faktors für
eine konstitutiv exprimierte Proteinase induziert. Diese Resultate
haben zusätzliche
wichtige Implikationen für
den Mechanismus, der in die Veränderung
von Pellinopolypeptid involviert ist. MG132 (26) und ALLN (27, 28)
sind beide aufgrund ihrer Fähigkeit,
den Proteosomvermittelten Abbau von IkB zu verhindern, potente Inhibitoren für die NF-kB-Aktivierung.
Daraus folgt, dass die Veränderung
von Pellino, die unempfindlich gegenüber MG132 und ALLN ist, nicht
von zellulären
Ereignissen unterhalb (downstream) des IkB-Abbaus abhängig sein kann.
Obwohl TPCK ebenfalls als Inhibitor für den Abbau von IkB gut bekannt
ist, schließt
der Umstand, dass, wie zuvor diskutiert, die anderen Proteasominhibitoren
die Spaltung von Pellino-1 nicht blockieren, aus, dass dies der
Mechanismus ist, der der Wirksamkeit von TPCK zugrunde liegt.
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Für die Erzeugung
eines Pellino-1-Fragments von 30 kDa wird vorhergesagt, dass eine
proteolytische Spaltung innerhalb der Region mit den Aminosäuren 132
bis 189 von SEQ ID NO:2 stattfinden wird. Eine Prüfung der
Aminosäuresequenzen
von Pellino-1 zeigt, dass sie extrem gut in denjenigen Spezies konserviert
ist, für
die EST-Sequenzdaten verfügbar
sind (murines und humanes Pellino-1 und Pellino-2, hierin offenbart;
Pellino von Drosophila, GenBank Zugangsnummer AF091624; und das
Genprodukt F25B4.2 von Caenorhabditis elegans, GenBank Zugangsnummer
U64842). Eine Anzahl von konservierten Phenylalanin- und Tyrosinbausteinen
sind in dieser Region vorhanden, von denen jeder als Erkennungsort
für eine
Chymotrypsin-artige Serinprotease dienen könnte.
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Beispiel 5. GST-Pellino
Fusionsprotein
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Dieses
Beispiel beschreibt die Konstruktion und Expression eines rekombinanten
Fusionsproteins aus Glutathion-S-transferase (GST) und Pellino-1.
PCR-Primer mit den Sequenzen ATATTCACTGAATTCTGATGTTTTCTCCTGATCAA
(Primer Nr.1; SEQ ID NO:9) und AGTGAATATGAATTCCTACTTATCATCGTCATCTTTG
(Primer Nr.2; SEQ ID NO:10) zur Verwendung als Sinn- bzw. Antisinnprimer
wurden synthetisiert. Diese Primer wurden zur Verwendung mit einem
Pellino-1-FLAG-Templat entworfen und fügen einen EcoR1-Ort an jedes
Ende des amplifizierten Produkts an. Dieses PCR-Produkt wurde in
den einzigen EcoR1-Klonierungsort des Vektors pGEX2T (beschrieben
in EP 0 293 249-A) so ligiert, dass die kodierenden Sequenzen des
Gens der Glutathion-S-transferase und von FLAG-Pellino-1 in dem
selben Leseraster lagen. Der E.coli-Stamm DH10B wurde mit dem resultierenden
Vektor transformiert, und eine Kultur im 1-Litermaßstab wurde
angelegt. Die Transkription des GST-Pellino-1-FLAG-Gens wurde durch
Zusatz von IPTG (0,1 mM) zu der Bakterienkultur für 3 Stunden
induziert. Die Bakterienzellen wurden geerntet und lysiert nach
Methoden, die in der Technik gut bekannt sind (siehe z.B. Smith
D.B. und Johnson K.S., Gene 67:31-40 (1988)). Das Lysat, das solubilisiertes
GST-Pellino-1-FLAG enthielt wurde an 1 ml Glutathion-Aga-rose-Perlen (Pharmacia) gemäß den Instruktionen
des Herstellen gereinigt.
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Beispiel 6: Monoklonale
Anti-Pellino-Antikörper
-
Dieses
Beispiel erläutert
die Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen Pellinopolypeptide. Präparationen
beispielsweise von gereinigten rekombinanten Pellinopolypeptiden
oder von transfizierten Zellen, die Pellinopolypeptide auf hohem
Niveau exprimieren, werden verwendet, um mittels konventioneller
Verfahren, wie sie z.B. im U.S. Patent Nr. 4,411,993 beschrieben,
monoklonale Antikörper
gegen Pellinopolypeptide herzustellen. Für Pellinopolypeptide kodierende
DNAs können
ebenfalls als Immunogene verwendet werden, eine Übersicht geben beispielsweise
Pardoll und Beckerleg in Immunity 3:165, 1995. Es ist wahrscheinlich,
dass solche Antikörper
als Komponenten für
Diagnosen oder Forschungsassays für Pellino oder Pellinoaktivität oder aber
bei der Affinitätsreinigung
von Pellinopolypeptiden von Nutzen sein könnten.
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Um
Nagetiere zu immunisieren wird ein Pellinopolypeptid (wie z.B. ein
Pellino-1-Polypeptid, das die Aminosäuren 2 bis einschließlich 20,
die Aminosäuren
von 118 bis einschließlich
131 oder die Aminosäuren 318
bis einschließlich
340 der SEQ ID NOs:2 und 4 enthält),
vorteilhaft mit einem immunogenen Molekül verknüpft, wie z.B. dem Hämocyanin
der Schlüssellochnapfschnecke
(keyhole limpet), in einem Adjuvans (wie z.B. komplettem oder nicht
komplettem Freund'schen
Adjuvans, Alaun (alum) oder einem anderen Adjuvans, wie z.B. Ribi-Adjuvans
R700 (Ribi, Hamilton, MT) emulgiert, und die Emulsion wird in Dosen
im Bereich von 10 bis 100 Mikrogramm subkutan in ausgewählte Nagetiere
injiziert, z.B. in BALB/c-Mäuse
oder Lewis-Ratten. DNA kann intradermal (Raz et al., Proc. Natl.
Acad. Sci USA, 91:9549, 1994) oder intramuskulär (Wang et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 90:4156, 1993) appliziert werden. Kochsalzlösung ist
als geeignetes Verdünnungsmittel
für Antigene
auf Basis DNA gefunden worden. Zehn Tage oder drei Wochen später werden
die Tiere mit weiterem Immunogen stimuliert, und weiter periodisch
in wöchentlichen
oder zweiwöchentlichen
Abständen oder
jede dritte Woche erneut mit Immunogen stimuliert.
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Serumproben
werden periodisch durch retroorbitale Blutabnahme oder Excision
an der Schwanzspitze entnommen, um mittels Dot-Blot-Assays (Antikörper-Sandwich),
ELISA, (Enzymverbundener Immunosorbent-Assay), Immunofällung oder
anderer geeigneter Assays, einschließlich von FACS-Analyse, zu
testen, ob und wie viel Antikörper
gebildet ist. Wenn ein geeigneter Antikörpertiter erreicht ist, wird
den positiven Tieren eine intravenöse Injektion von Antikörpern in
Kochsalzlösung
verabfolgt. Drei oder vier Tage später werden die Tiere getötet, die
Splenozyten geerntet und mit einer murinen Myelomzelllinie (wie
z.B. NS 1 oder vorzugsweise Ag 8.653 (ATTC CRL 1580)) fusioniert.
Auf diese Weise hergestellte Hybridomazelllinien werden in einem selektiven
Medium (z.B. in einem Medium, das Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin
oder HAT enthält)
auf mehrere Mikrotiterplatten plattiert, um die Proliferation von
nicht fusionierten Zellen, Myelom-Myelom-Hybriden und Splenozyt-Splenozyt-Hybriden
zu inhibieren.
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Die
so geschaffenen Hybridomaklone können
mittels ELISA auf Reaktivität
mit Pellinopolypeptiden durchmustert werden, beispielsweise durch
Adaption von Techniken, die von Engvall et al. Immunochem. 8:871
(1971) beschrieben wurden, oder gemäß dem U.S. Patent Nr. 4,703,004.
Eine bevorzugte Screeningmethode ist die Antikörperfangmethode (antibody capture
method), die von Beckman et al., J. Immunol. 44:4212 (1990) beschrieben
wurde. Positive Klone werden dann in die peritonealen Höhlen von
syngeneischen Nagern injiziert, damit diese Ascites mit hohen Konzentrationen
(> 1 mg/ml) von monoklonalen
Anti-Pellino-Antikörpern
produzieren. Der entstandene monoklonale Antikörper kann durch Fällung mit
Ammoniumsulfat und anschließende
Gelausschlusschromatographie gereinigt werden. Alternativ kann auch
Affinitätschromatographie
auf der Basis der Bindung des Antikörpers an Protein A oder Protein
G zur Reinigung der Antikörper
eingesetzt werden, ebenso Affinitätschromatographie auf Basis
der Bindung an Pellinopolypeptide.
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Beispiel 7: Northern Blot-Analyse
der Expression von Pellino-1
-
Ein
PCR Fragment mit 234 bp, entsprechend dem vorhergesagten 3'-Ende der mRNA von
humanem Pellino-1, wurde mittels üblicher Amplifizierungstechniken
hergestellt. Das PCR-Fragment wurde gereinigt (Qiagen PCR Purification
Kit) und markiert mittels eines Random Prime Oligonukeotide DNA
Labeling Kits von Gibco. Die cDNA-Ribosonde wurde bei 100°C während 5
Minuten denaturiert und dann auf Eis platziert. Die cDNA-Sonde wurde
bei 100°C
während
5 Minuten denaturiert, bevor sie der Hybridisierungslösung zugesetzt wurde.
Ein Mehrgewebe-Northern Blot, enthaltend RNA aus humanen Geweben – Hirn,
Herz, Skelettmuskel, Darm (keine Mucosa), Thymus, Milz, Niere, Leber,
Dünndarm,
Plazenta, Lunge und periphere Blutleukozyten – wurde von Clonetech (Palo
Alto, CA) bezogen. Der Blot wurde mit 5 ml ExpressHyb-Lösung 30
Minuten lang bei 68°C
blockiert. Frische ExpressHyb-Lösung,
die die denaturierte, radioaktiv markierte cDNA-Sonde enthielt,
wurde der Membran zugesetzt, und das Ganze wurde eine Stunde lang
bei 68°C
unter ständigem
Schütteln
inku-biert. Der Blot wurde in 2X SSC, 0,05% SDS bei Raumtemperatur
mit vier Wechseln innerhalb von 40 Minuten gespült, worauf eine Wäsche mit
0,1X SSC, 0,1% SDS bei 50°C
mit zwei Wechseln innerhalb von 40 Minuten folgte. Die Ribosonde
für Pellino-1
hybridisierte in allen vorhandenen Geweben des Northern Blots mit
einer Hauptbande bei 4,4 Kilobasen, wobei eine erhöhte Expression
in peripheren Blutleukozyten, Lunge, Plazenta, Leber, Niere, Skelettmuskel
und Hirn beobachtet wurde. Das Protein scheint in peripheren Leukozyten
in höherem
Maße exprimiert
zu werden, und es scheinen bei diesem Gewebe zwei zusätzliche
Banden bei 7,5 und 9,5 kb vorhanden zu sein, die in den Bahnen der
anderen Gewebe nicht auftauchen. Es wurde vorhergesagt, dass die
cDNA für
humanes Pellino-1 1251 Basenpaare in der kodierenden Region und
1931 Basenpaare in der nicht translatierten 3'-Region aufweisen würde. Es wurde bis jetzt kein
Beweis für
eine alternative Spleißung
gefunden.
-
Die
Spezifikation wird am besten im Lichte der Lehren der in der Spezifikation
zitierten Referenzen verstanden. Die Ausführungsformen in der Spezifikation
bieten eine Erläuterung
der Ausführungsformen
der Erfindung und sollten nicht als den Umfang der Erfindung begrenzend
ausgelegt werden. Der Fachmann wird ohne weiteres erkennen, dass
viele andere Ausführungsformen
in die Erfindung eingeschlossen sind.
-
In
der Sequenzliste enthaltene Sequenzen:
SEQUENZLISTE