DE60117601T2 - Bakterielle wirtstämme - Google Patents

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    • C12R2001/19—Escherichia coli

Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • 1. Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von bezüglich der Proteolyse defizienten, bakteriellen Wirtsstämmen. In besonderer Weise bezieht sich die Erfindung auf solche Wirtsstämme, bei denen der Abbau heterologer Polypeptide ausgeschaltet ist,– und bei denen die Ausbeute solcher Polypeptide verbessert ist.
  • 2. Beschreibung der verwandten Technik
  • E.-coli-Stämme, die bezüglich Proteasen oder Genen, die die Regulation von Proteasen kontrollieren, defizient sind, sind bekannt. Siehe zum Beispiel Beckwith und Strauch, WO 88/05821, veröffentlicht am 11. August 1988; Chaudhury und Smith, J. Bacteriol., 160: 788-791 (1984); Elish et al., J. Gen. Microbiol., 134: 1355-1364 (1988); Baneyx und Georgiou, "Expression of proteolytically sensitive polypeptides in Escherichia coli" in Stability of Protein Pharmaceuticals, Bd. 3: Chemical and Physical Pathways of Protein Degradation, Ahern und Manning, Hrsg. (Plenum Press, New York, 1992), S. 69-108.
  • Einige dieser Stämme wurden in Versuchen eingesetzt, gegenüber Proteolyse empfindliche Proben, insbesonders diejenigen von potentieller medizinischer oder kommerzieller Bedeutung, auf effiziente Weise herzustellen. U.S.-Pat.-Nr. 5,508,192 (für Georgiou et al.) beschreibt die Konstruktion vieler Protease-defizienter und/oder Hitzeschockprotein-defizienter bakterieller Wirte. Solche Wirte schließen einfach-, doppelt-, dreifach- oder vierfach-Protease-defiziente Bakterien und Bakterien mit einer einzelnen Protease, die auch eine Mutation in dem rpoH-Gen tragen, ein. Beispiele der offenbarten, Protease-defizienten Stämme schließen diejenigen ein, denen degP, ompT, ptr3, und/oder prc (tsp) fehlt, sowie einen degP-rpoH-Stamm, von dem berichtet wurde, dass er hohe Titer von rekombinanten Proteinen in E. coli herstellt. Park et al., Biotechnol. Prog., 15: 164-167 (1999) berichteten außerdem, dass ein Stamm (HM114), der bezüglich zweier Zellhüll-Proteasen (degP, prc) defizient ist, geringfügig schneller wuchs und mehr Fusionsprotein produzierte als die anderen Stämme, denen mehrere Proteasen fehlten. Sie gaben an, dass dieser Stamm bis zu einem Trockenzellgewicht von 47,86 g/l innerhalb von 29 Stunden bei der Verwendung eines pH-Staten in einer Zulaufkultivierung wuchs. Das hergestellte Protein war das A-β-Lactamase-Fusionsprotein, das eine um 30 % höhere β-Lactamase-Aktivität ergab, als diejenige, die aus seinem Elternstamm KS272 gewonnen wurde.
  • Das Prc-Protein wurde zuerst von Hara et al., J. Bacteriol., 173: 4799-4813 (1991) als die plasmatische Protease isoliert, die den Carboxyterminus des periplasmatischen Penicillin-Bindungsproteins 3 (PBP3) spaltet. Danach wurde es auch als eine Protease, die selektiv Proteine mit einem unpolaren C-Terminus abbaut, identifiziert und in Tsp umbenannt (Silber et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 295-299 (1992)). Es wurde gezeigt, dass das prc-Gen ein 75-kDa-Protein kodiert, das für den Schutz von Zellen vor kombiniertem thermischem und osmotischem Stress erforderlich ist (Hara et al., supra). Es wurde bestätigt, dass die C-terminalen Sequenzen die Substratpräferenz bestimmen (Keiler et al., Protein Sci, 4: 1507-1515 (1995)). Das Ausmaß der Spaltung hängt von der Identität der Reste oder funktionellen Gruppen an dem C-Terminus des Substratproteins ab. Die Anwesenheit einer freien δ-Carboxylgruppe ist wichtig, um zu bestimmen, ob nahe verwandte Peptide mit unpolaren C-terminalen Sequenzen von Prc effizient gespalten werden.
  • Prc-Homologe wurden in einer divergenten Gruppe von Prokaryonten identifiziert, die mehrere Cyanobakterien (Brand et al., Plant Mol. Bio, 20: 481-491 (1992); Shestakov et al., J. Biol. Chem., 269: 19354-19359 (1994)), Neisseria gonorrhoeae (Black et al., J. Bacteriol., 177: 1952-1958 (1995)), Haemophilus influenzae (Fleischmann et al., Science, 269: 496-512 (1995)) und Bartonella bacilliformis (GenBank-Zugangsnr. L37094) einschließen. Eine Domäne in der Prc-Proteinfamilie ist ähnlich zu einer Domäne bei den Retinol-Bindungsproteinen, was auf eine gemeinsame Faltungsdomäne hinweist, die bei diesen Proteinen eine Bindungstasche für hydrophobe Substrate bilden könnte (Silber et al., supra; Shestakov et al., supra).
  • Hara et al., supra, entdeckten, dass die thermoresistenten Revertanten von Δprc-Mutanten extragene Suppressor(spr)-Mutationen enthalten. Sie identifizierten außerdem das Wildtyp-spr-Genprodukt als ein Lipoprotein in der Hüllfraktion. Sie vermuteten, dass das Wildtyp-spr-Gen ein Peptidoglycan-hydrolysierendes Enzym sein könnte (Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2: 63-72 (1996)). Wenn das spr in einem prc-positiven Hintergrund nicht funktionell ist, wurde ein Suppressor für die spr-Mutation als PBP7, ein weiteres Penicillin-Bindungsprotein, identifiziert (Hara et al., 1996, supra). Die Klonierung von spr und die Herstellung einer Δprc-Mutante, in der Spr von der Protease nicht abgebaut wird, ist ebenfalls in Hara et al., Abstract for Table Ronde Roussel Uclat Nr. 86, Versailles, Mai 1997, beschrieben, wo die Autoren schlussfolgerten, dass prc und spr wechselseitige Suppressoren sind.
  • Drei Mehrfachkopie prc-Suppressoren wurden auch unter Verwendung des konditional letalen Phänotyps eines prc(tsp)-Nullstammes von E. coli isoliert (Bass et al., J. Bacteriol., 178: 1154-1161 (1996)). Keiner von ihnen steht in Beziehung zu dem spr-Gen. Ein Satz dieser Suppressoren besteht aus zwei vermutlichen Proteasegenen, die in einer Tandemanordnung angeordnet sind, die bei 72,5 min auf dem Chromosom kartieren. Diese beiden Gene sind htrA-Homologe, die Proteine kodieren, die zu 58 bzw. 35 % mit der HtrA(DegP)-Serinprotease identisch sind. Ein weiterer Typ eines identifizierten Suppressors ist das dksA(dnak-Suppressor)-Gen, das ebenfalls ein Mehrfachkopie-Suppressor von Defekten in den Hitzeschockgenen dnak, dnaj und grpE ist. Das dksA-Gen wurde auch unabhängig als ein Mehrfachkopie-Suppressor einer mukB-Mutation isoliert, der für die chromosomale Verteilung erforderlich ist. Der dritte Typ ist ein verkürztes Lipoprotein-A(rlpA)-Gen.
  • Das Gen degP scheint die Synthese einer Zellhüllprotease DegP (HtrA) zu kontrollieren. Eine degP-defiziente Mutante wurde zuerst von Beckwith und Strauch, supra, konstruiert und in ein E.-coli-Chromosom rekombiniert. HtrA weist eine hohe molekulare Masse von in etwa 500 kDa auf, welches ein Hitzeschockprotein ist, dessen proteolytische Aktivität essentiell für das Überleben von E. coli bei hohen Temperaturen, so wie über 42 °C, ist (Skorko-Glonek et al., Gene, 163: 47-52 (1995)). Eine Anzahl von normalerweise unstabilen Zellhüllproteinen kann durch die degP-Mutation stabilisiert werden (Strauch und Beckwith, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 1676-1580 (1988)). Kürzlich wurde mittels Elektronenmikroskopie und chemischer Kreuzvernetzungsanalysen berichtet, dass das HtrA-Protein sich wie ein 12mer verhält, das aus zwei Stapeln von sechsgliedrigen Ringen besteht (Kim et al., J. Mol. Biol., 294: 1363-1374 (1999)). Das Entfalten von Proteinsubstraten, so wie durch Exponierung an hohe Temperatur oder Reduktion von Disulfid-Bindungen, ist essentiell für deren Zugang in die innere Kammer des HtrA mit Doppelringstruktur, wo die Spaltung von Peptidbindungen erfolgen kann (Kim et al., supra).
  • Viele heterologe Polypeptide wurden in verschiedenen Stämmen hergestellt, die bezüglich Proteasen defizient sind. Jedoch wiesen viele der Stämme relativ niedrige Produkttiter und/oder ein schwaches Wachstum auf. Es besteht ein Bedarf, einen bakteriellen Stamm bereitzustellen, der bezüglich Proteasen defizient ist, bei dem es nicht zur Spaltung des Produkts kommt, und der einen hohen Produkttiter liefert.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Dementsprechend ist die Erfindung wie beansprucht. Gemäß einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung E.-coli-Stämme bereit, die bezüglich der chromosomalen degP und prc defizient sind, die die Protease DegP bzw. Prc kodieren, und die eine Mutante des spr-Gens enthalten, wobei das Produkt dieses Gens Wachstumsphänotypen unterdrückt, die von Stämmen gezeigt werden, die prc-Mutanten enthalten. Vorzugsweise ist der Stamm bezüglich des chromosomalen ptr3, das die Protease III kodiert, und/oder bezüglich des chromosomalen ompT, das die Protease OmpT kodiert, nicht defizient. Vorzugsweise wird der E.-coli-Stamm hergestellt, indem die Mutante des spr-Gens in einen degPΔ-prcΔ-Stamm für das Überleben in der stationären Phase eines E.-coli-Fermentationsverfahrens mit hoher Zelldichte eingeführt wird.
  • In einem weiteren Ausführungsbeispiel umfasst der Stamm eine Nukleinsäure, die ein Polypeptid kodiert, das heterolog zu dem Stamm ist, vorzugsweise ein Polypeptid, das gegenüber Proteolyse empfindlich ist, und mehr bevorzugt ein eukaryontisches Polypeptid.
  • Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines heterologen Polypeptids, d.h. das heterolog zu dem Stamm ist, bereit. Dieses Verfahren umfasst zunächst das Kultivieren eines wie in den Ansprüchen definierten E. coli-Stammes. Dieser Stamm umfasst auch eine Nukleinsäure, die das heterologe Polypeptid kodiert. Das Kultivieren erfolgt in einer solchen Weise, dass die Nukleinsäure exprimiert wird. In einem zweiten Schritt dieses Verfahrens wird das Polypeptid aus dem Stamm, entweder aus dem Cytoplasma, Periplasma oder dem Kulturmedium vorzugsweise dem Periplasma oder dem Kulturmedium, und am meisten bevorzugt aus der Gesamt-Fermentationsbrühe, gewonnen. Vorzugsweise ist das Polypeptid der Apo2-Ligand oder ein Antikörper, einschließlich eines Antikörperfragments.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Die 1A–1E zeigen die vollständigen Nukleotid- und kodierten Aminosäuresequenzen (SEQ ID Nr: 1 bzw. 2) der Expressionkassette für die Herstellung von pY0317, eines Produktionsplasmids für anti-VEGF-Fab. Die Reste im Fettdruck bezeichnen die CDR-Reste des ursprünglichen murinen A.4.6.1-Antikörpers. Die kursiv gedruckten und unterstrichenen Reste bezeichnen murine Gerüstreste, die für die Antigenbindung erforderlich waren.
  • Die 2A und 2B zeigen ein Plasmiddiagram für pY0317 (2A), sowie die Plasmidkonstruktion von pY0317tet20 (2A und 2B).
  • Die 3 zeigt das Plasmiddiagram für pAPApo2-P2RU.
  • Die 4 zeigt die Nukleotidsequenz der humanen Apo2-Ligand-cDNA (SEQ ID Nr: 3) und ihre abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr: 4). Das „N" an der Nukleotidposition 447 (in SEQ ID Nr: 3) wird verwendet, um anzuzeigen, dass die Nukleotidbase ein „T" oder „G" sein kann.
  • Die 5 stellt ein Diagramm der Ableitung der E. coli-Stämme 59A7, 49A5 und 43H1 dar.
  • Die 6 stellt das 2-D-Gel-Ergebnis des Fermentationszellsediments dar, das aus dem Stamm 49A5 (prc-plus-Stamm) abgeleitet ist, der die rhuFab'2-anti-CD18-LZ-Fusion als ein heterologes Polypeptid exprimiert. Alle LC-verwandten Flecken sind eingekreist.
  • Die 7 stellt das 2-D-Gel-Ergebnis des Fermentationszellsediments dar, das von dem Stamm 43H1 (prc-minus-Stamm) abgeleitet ist, der die rhuFab'2-anti-CD18-LZ-Fusion als ein heterologes Polypeptid exprimiert. In diesem Gel verschwinden die LC-Spaltungsprodukte.
  • Die 8 zeigt die fünf Scheitelpunkte, die in einem Test unter Verwendung von AME5TM/Umkehrphase-Säulen aufgelöst wurden, und liefert dadurch einen Vergleich der Aufteilung von rhuFab'2-LZ-(xCD18)-Antikörperfragmenten, die auf diese Weise aufgelöst wurden. Die y-Achse ist die spezifische Scheitelpunktfläche der Scheitelpunkte 1 bis 5. Die x-Achse zeigt die drei rhuFab'2-LZ-(xCD18)-Produktionsstämme 43H1 (prc–), 49A5 (prc+) und 58H2 (prc-repariertes 43H1). Der graue Balken mit dem dicken Rand ist LC-115, der schwarze Balken ist LC, der weiße Balken ist das LC-Dimer, der graue Balken mit dem dünnen Rand ist das Fab-ähnliche Molekül, und der Balken mit dem ziegelartigem Muster ist Fab'2-LZ. Es ist zu erkennen, dass der Scheitelpunkt 1 (LC-115) aus dem prc-Deletionsstamm verschwand.
  • Die 9 zeigt die Wachstumsprofile von Standardfermentationen mit hoher Zelldichte in prc-minus-Stämmen ohne ein mutiertes spr-Gen (58B3 transformiert mit pS1130) (Quadrate) und prc-minus-Stämmen mit einem mutiertem spr-Gen (59A7 transformiert mit pS1130) (Diamanten), ausgedrückt als OD550 als eine Funktion der Fermentationsstunden.
  • Die 10 stellt die humanisierte anti-CD18-Kappa-LC-Sequenz (SEQ ID Nr: 5) mit den berechneten pI-Werten von postulierten LC-Abbauprodukten dar. Die hervorgehobenen Spaltungen mit Querstrichen wurden mittels Massenspektrometrie bestätigt. Siehe Tabelle 3 unten.
  • Die 11 stellt ein Gel mit sieben Spuren dar, bei dem verschiedene Wirte und drei Typen von Proteinen verwendet wurden. Dieses Gel zeigt, dass der 20-kD-LC-Abschnitt (LC182) in 43H1(prc–)-Zellen, die anti-VEGF-Fab und anti-Prothrombinase(„tissue factor")-Fab'2-LZ-Fusionsmoleküle exprimieren, nicht vorhanden ist. Die Spur 1 ist anti-Prothrombinase(„tissue factor")-F(ab')2-LZ-6xHis, Wirtsstamm 33B6, die Spur 2 ist anti-Prothrombinase(„tissue factor")-F(ab')2-LZ-6xHis, Wirtsstamm 43H1, die Spur 3 ist anti-CD18-F(ab')2-LZ-6xHis, Wirtsstamm 49A5, die Spur 4 ist anti-CD18-F(ab')2-LZ-6xHis, Wirtsstamm 41H1, die Spur 5 ist pBR322, Wirtsstamm 49A5, die Spur 6 ist anti-VEGF-Fab, Wirtsstamm 43H1, und die Spur 7 ist anti-VEGF-Fab, Wirtsstamm 43E7. Die Bezeichnungen HC und H stellen die schwere Kette dar, und LC und L stellen die leichte Kette dar.
  • Die 12 stellt das 2-D-Gel-Ergebnis des Schüttelflaschen-Zellsediments dar, das von dem Stamm 59A7 (prc-minus-Stamm) abgeleitet ist, der anti-VEGF-Fab (pY0317tet20) als ein heterologes Polypeptid exprimiert. In diesem Gel verschwinden die LC-Spaltungsprodukte und die beiden HC-Spaltungsprodukte, die in prc-plus-Zellen gefunden werden. Es wurden auch zwei gesonderte HC-Abschnitte gezeigt, die nur in 59A7 nachgewiesen wurden, die entweder OmpT- oder Ptr3-gespaltene Produkte sind.
  • Die 13 stellt das 2-D-Gel-Ergebnis des Schüttelflaschen-Zellsediments dar, das aus dem Stamm 60C1 (prc-plus-Stamm) abgeleitet ist, der anti-VEGF-Fab (pY0317tet20) als ein heterologes Polypeptid exprimiert. In diesem Gel wurden mehrere LC-Spaltungsfragmente und zwei HC-Spaltungsfragmente nachgewiesen.
  • Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführunsgbeispiele
  • Definitionen
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich „Polypeptid" im Allgemeinen auf Peptide und Proteine, die mehr als in etwa zehn Aminosäuren aufweisen. „Heterologe" Polypeptide sind diejenigen Polypeptide, die fremd zu der verwendeten Wirtszelle sind, so wie ein von E. coli hergestelltes, humanes Protein. Während das Polypeptid prokaryontisch oder eukaryontisch sein kann, ist es vorzugsweise eukaryontisch, mehr bevorzugt ein Säugerpolypeptid.
  • Beispiele von Säugerpolypeptiden schließen Moleküle, so wie z.B. Renin, ein Wachstumshormon, einschließlich das humane Wachstumshormon, das Rinderwachstumshormon, den Wachstumsfaktor-Releasing-Faktor, das Parathormon, das Thyreotropin, Lipoproteine, 1-Antitrypsin, die Insulin-A-Kette, die Insulin-B-Kette, Proinsulin, Thrombopoietin, das follikelstimulierende Hormon, Calcitonin, das Gelbkörperreifungshormon, Glucagon, Gerinnungsfaktoren, so wie Faktor VIIIC, Faktor IX, Prothrombinase(„tissue factor") und Willebrand-Faktor, Antigerinnungsfaktoren, so wie Protein C, den atrialen natriuretrischen Faktor, Lung Surfactant, einen Plasminogenaktivator, so wie die Urokinase oder den humanen Urin- oder Gewebetyp-Plasminogenaktivator (t-PA), Bombesin, Thrombin, den hämatopoetischen Wachstumsfaktor, den Tumornekrosefaktor Alpha und Beta, Antikörper gegen (eine) ErbB2-Domäne(n), so wie 2C4 (WO 01/00245, Hybridom ATCC HB-12697), der an eine Region in der extrazellulären Domäne von ErbB2 bindet (z.B. einen beliebigen oder mehrere Reste in der Region von in etwa Rest 22 bis einschließlich in etwa Rest 584 von ErbB2), die Enkephalinase, ein Serumalbumin, so wie humanes Serumalbumin, das Anti-Müller-Hormon, die Relaxin-A-Kette, die Relaxin-B-Kette, Prorelaxin, das Maus-Gonadotropin-assoziierte Peptid, ein mikrobielles Protein, so wie die beta-Lactamase, DNase, Inhibin, Activin, den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF), Rezeptoren für Hormone oder Wachstumsfaktoren, Integrin, Protein A oder D, Rheumafaktoren, einen neurotrophen Faktor, so wie den Brain-Derived-Neurotrophic-Factor (BDNF), Neurotrophin-3, -4, -5 oder -6 (NT-3, NT-4, NT-5 oder NT-6) oder einen Nervenwachstumsfaktor, so wie NGF, Cardiotrophine (Herzhypertrophie-Faktor), so wie Cardiotrophin-1 (CT-1), den Plättchenwachstumsfaktor (PDGF), einen Fibroblasten-Wachstumsfaktor, so wie aFGF und bFGF, den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), einen Transforming-Growth-Factor (TGF), so wie TGF-alpha und TGF-beta, einschließlich TGF-1, TGF-2, TGF-3, TGF-4 oder TGF-5, Insulin-Like-Growth-Factor-I und -II (IGF-I und IGF-II), des(1-3)-IGF-I (Gehirn-IGF-I), Insulin-Like-Growth-Factor-Bindungsproteine, CD-Proteine, so wie CD-3, CD-4, CD-8 und CD-19, Erythropoietin, Osteoinductive-Factors, Immuntoxine, ein knochenmorphogenetisches Protein (BMP), ein Interferon, so wie Interferon-Alpha, -Beta und -Gamma, Serumalbumin, so wie humanes Serumalbumin (HSA) oder Rinderserumalbumin (BSA), kolo niestimulierende Faktoren (CSF), z.B. M-CSF, GM-CSF und G-CSF, Interleukine (ILs), z.B. IL-1 bis IL-10, anti-HER-2-Antikörper, Apo-2-Ligand, die Superoxiddismutase, T-Zell-Rezeptoren, Oberflächenmembranproteine, Decay Accelerating Factor, virales Antigen, so wie z.B. einen Teil der AIDS-Hülle, Transportproteine, Homing-Rezeptoren, Addressine, regulatorische Proteine, Antikörper und Fragmente eines beliebigen der oben genannten Polypeptide, ein.
  • Die bevorzugten Polypeptide von Interesse schließen Polypeptide, so wie HSA, BSA, anti-IgE, anti-CD20, anti-IgG, t-PA, gp120, anti-CD11a, anti-CD18, 2C4, anti-VEGF, VEGF, TGF-beta, Activin, Inhibin, anti-HER-2, DNase, IGF-I, IGF-II, Gehirn-IGF-I, Wachstumshormon, Relaxinketten, Wachstumshormon-Releasing-Factor, Insulinketten oder Proinsulin, NGF, NT-3, BDNF, Apo2-Ligand und die Urokinase ein. Besonders bevorzugte Säugerpolypeptide sind Antikörper, die Antikörper mit vollständiger Länge, Antikörperfragmente und Apo2-Ligand einschließen. Mehr bevorzugt sind diese Antikörper humane oder humanisierte Antikörper. Diese schließen z.B. anti-IgE, anti-IgG, anti-Her-2, anti-CD11a, anti-CD18, anti-CD20 und anti-VEGF, 2C4, BSA oder HSA ein. Noch mehr bevorzugt, ist der Antikörper ein anti-CD18-, anti-VEGF-, anti-Prothrombinase(„tissue factor")-, 2C4-, anti-Her-2-, anti-CD20-, anti-CD40- oder anti-CD11a-Antikörper. Antikörperfragmente, die in der Definition von Polypeptid umfasst sind, schließen z.B. ein Fab, Fab', Fab'2 oder einen Fab'2-Leucinzipper (LZ) ein und sind am meisten bevorzugt anti-CD18-Fab'2-LZ, anti-Prothrombinase(„tissue factor")-Fab'2-LZ-6xHis, anti-VEGF-Fab, anti-CD8-His-getaggtes-Fab'2-LZ und anti-CD18-Lys-getaggtes-Fab'2-LZ.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich die Bezeichnung „gegenüber Proteolyse empfindlich" für Polypeptide auf Polypeptide, die dazu neigen, gespalten zu werden, gegenüber einer Spaltung empfindlich sind oder von einer oder mehreren E-coli-Proteasen, entweder im nativen Zustand oder während der Sekretion, gespalten werden.
  • Fermentation oder Kultivierung „mit hoher Zelldichte" bezieht auf ein Verfahren, bei dem typischerweise zunächst einige Nährstoffe als Dosis zugegeben werden, um das Zellwachstum zu ermöglichen, und das Verhältnis zwischen dem O2-Verbrauch und dem Glucoseverbrauch genutzt wird, um den gelösten Sauerstoff, der leicht zu messen ist, dazu zu verwenden, um die Glucosezugabe zu steuern. Um höhere Zelldichten zu erreichen, kann Ammoniak kontinuierlich zugegeben werden, und zusätzliche Nebennährstoffe (z.B. P, K, S und Mg) können bei bestimmten Phasen der Fermentation zugegeben werden, um das Wachstum zu unterstützen, wie in den Beispielen unten näher erläutert wird.
  • Eine „Mutante des spr-Gens, deren Produkt Wachstumsphänotypen unterdrückt, die von Stämmen gezeigt werden, die prc-Mutanten enthalten", bezieht sich auf einen E-coli-prc-Suppressor (spr) (Prcsup kodierend) mit der von Hara et al., 1996, supra, angegebenen Sequenz oder einen, der mutiert ist, vorausgesetzt, das Genprodukt funktioniert als ein Suppressor von Wachstumsphänotypen von Stämmen mit prc-Mutanten. Vorzugsweise besteht die Mutation aus einer Punktmutation. Am meisten bevorzugt ist die Punktmutation W148R, worin ein TGG-Kodon zu CGG verändert ist, was zu einer Veränderung von Tryptophan zu Arginin bei der Aminosäure 148 führt.
  • Der Ausdruck „Antikörper" wird hierin in der breitesten Bedeutung verwendet und umfasst besonders intakte monoklonale Antikörper, polyklonale Antikörper, multispezifische Antikörper (z.B. bispezifische Antikörper), die aus wenigstens zwei intakten Antikörpern gebildet sind, und Antikörperfragmente, solange sie die gewünschte biologische Aktivität zeigen.
  • Der Ausdruck „monoklonaler Antikörper", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf einen Antikörper, der aus einer Population von im Wesentlichen homogenen Antikörpern gewonnen wird, d.h. die einzelnen Antikörper, die in der Population enthalten sind, sind identisch mit Ausnahme von möglichen, natürlicherweise vorkommenden Mutationen, die in geringen Mengen vorhanden sein können. Monoklonale Antikörper sind hochspezifisch, da sie gegen eine einzige antigene Stelle gerichtet sind. Außerdem ist jeder monoklonale Antikörper im Unterschied zu polyklonalen Antikörperzuberitungen, die verschiedene Antikörper umfassen, die gegen verschiedene Determinanten (Epitope) gerichtet sind, gegen eine einzige Determinante auf dem Antigen gerichtet. Zusätzlich zu ihrer Spezifität sind die monoklonalen Antikörper vorteilhaft, weil sie in nicht durch andere Antikörper kontaminierter Form hergestellt werden können. Der Ausdruck „monoklonal" zeigt die Eigenschaft des Antikörpers als aus einer im Wesentlichen homogenen Population von Antikörpern gewonnen an und soll nicht so ausgelegt werden, dass er die Herstellung des Antikörpers durch irgendein bestimmtes Verfahren erfordert. Z.B. können die monoklonalen Antikörper, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden sollen, mittels des zuerst von Koehler et al., Nature, 256; 495 (1975) beschriebenen Hybridomverfahrens hergestellt sein oder können durch rekombinante DNA-Verfahren (siehe z.B. US-Patent Nr. 4,816,567) hergestellt sein. Die „monoklonalen Antikörper" können auch aus Phagen-Antikörperbibliotheken unter Verwendung der zum Beispiel in Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) und Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991) beschriebenen Techniken isoliert sein.
  • Die monoklonalen Antikörper hierin schließen besonders „chimäre" Antikörper ein, in denen ein Teil der schweren und/oder leichten Kette identisch mit oder homolog zu korrespondierenden Sequenzen in Antikörpern ist, die von einer bestimmten Spezies abgeleitet sind oder zu einer bestimmten Antikörperklasse oder -unterklasse gehören, während der Rest der Kette(n) identisch mit oder homolog zu korrespondierenden Sequenzen in Antikörpern ist, die von einer anderen Spezies abgeleitet sind oder zu einer anderen Antikörperklasse oder -unterklasse gehören, sowie Fragmente von solchen Antikörpern, solange sie die gewünschte biologische Aktivität zeigen (US-Patent Nr. 4,816,567 und Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)). Chimäre Antikörper von Interesse hierin schließen „primatisierte" Antikörper ein, die Antigen-bindende Sequenzen der variablen Domäne, die von einem nicht-humanen Primaten (z.B. Altwelt-Affen, Menschenaffen etc.) abgeleitet sind, und Sequenzen der humanen konstanten Region umfassen.
  • „Antikörperfragmente" umfassen einen Teil eines intakten Antikörpers, wobei sie vorzugsweise dessen Antigenbindungs- oder variable Region umfassen. Beispiele von Antikörperfragmenten schließen Fab-, Fab'-, F(ab')2- und Fv-Fragmente, Diabodies, lineare Antikörper, einzelkettige Antikörpermoleküle und aus Antikörperfragmenten) gebildete, multispezifische Antikörper ein.
  • Ein „intakter" Antikörper ist einer, der eine Antigen-bindende variable Region sowie eine konstante Domäne der leichten Kette (CL) und konstante Domänen der schweren Kette, CH1, CH2 und CH3, umfasst. Die konstanten Domänen können konstante Domänen mit der nativen Sequenz (z.B. humane konstante Domänen mit der nativen Sequenz) oder Aminosäuresequenz-Varianten davon sein. Vorzugsweise weist der intakte Antikörper eine oder mehrere Effektorfunktionen auf.
  • Antikörper-„Effektorfunktionen" beziehen sich auf diejenigen biologischen Aktivitäten, die der Fc-Region (einer Nativsequenz-Fc-Region oder einer Fc-Region mit Aminosäuresequenz-Variation) eines Antikörpers zugeschrieben werden können. Beispiele für Antikörper-Effektorfunktionen schließen die C1q-Bindung, die Komplement-abhängige Zytotoxizität, die Fc-Rezeptorbindung, die Antikörper-abhängige, zellvermittelte Zytotoxizität (ADCC), die Phagozytose, das Herunterregulieren von Zelloberflächenrezeptoren (z.B. B-Zellrezeptor, BCR), etc. ein.
  • Abhängig von der Aminosäuresequenz der konstanten Domäne ihrer schweren Ketten, können intakte Antikörper verschiedenen „Klassen" zugeordnet werden. Es gibt fünf Hauptklassen von intakten Antikörpern: IgA, IgD, IgE, IgG und IgM, und mehrere von diesen können weiter in „Unterklassen" (Isotypen), z.B. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA und IgA2, unterteilt werden. Die konstanten Domänen der schweren Kette, die den verschiedenen Klassen von Antikörpern entsprechen, werden ∀, *, „ (, bzw. μ genannt. Die Untereinheit-Strukturen und dreidimensionalen Konfigurationen verschiedener Klassen von Immunglobulinen sind wohl bekannt.
  • „Antikörper-abhängige, zellvermittelte Zytotoxizität" und „ADCC" beziehen sich auf eine zellvermittelte Reaktion, bei der unspezifische zytotoxische Zellen, die Fc-Rezeptoren (FcRs) exprimieren (z.B. natürliche Killerzellen (NK), Neutrophile und Makrophagen), gebundenen Antikörper auf einer Zielzelle erkennen und anschließend die Lyse der Zielzelle verursachen. Die primären Zellen für die Vermittlung von ADCC, NK-Zellen, exprimieren nur FcRIII, wogegen Monozyten FcRI, FcRII und FcRIII exprimieren. Die FcR-Expression auf hämatopoetischen Zellen ist in der Tabelle 3 auf der Seite 464 von Ravetch und Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9: 457-492 (1991) zusammengefasst. Um die ADCC-Aktivität eines Moleküls von Interesse zu beurteilen, kann ein in-vitro-ADCC-Test, so wie derjenige, der in dem US-Patent Nr. 5,500,362 oder 5,821,337 beschrieben ist, durchgeführt werden. Nützliche Effektorzellen für solche Tests schließen mononukleäre Zellen aus peripherem Blut (PBMC) und natürliche Killer(NK)-Zellen ein. Alternativ oder zusätzlich kann die ADCC-Aktivität des Moleküls von Interesse in vivo, z.B. in einem Tiermodell, so wie dem in Clynes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 652-656 (1998) offenbarten, beurteilt werden.
  • „Humane Effektorzellen" sind Leukozyten, die ein oder mehrere FcRs exprimieren und Effektorfunktionen ausüben. Vorzugsweise exprimieren die Zellen wenigstens FcRIII und führen die ADCC-Effektorfunktion aus. Beispiele humaner Leukozyten, die ADCC vermitteln, schließen mononukleäre Zellen aus demperipherem Blut (PBMC), natürliche Killer(NK)-Zellen, Monozyten, zytotoxische T-Zellen und Neutrophile ein, wobei PBMCs und NK-Zellen bevorzugt sind. Die Effektorzellen können aus einer nativen Quelle dafür, z.B. aus Blut oder PBMCs, wie hierin beschrieben, isoliert werden.
  • „Native Antikörper" sind normalerweise heterotetramere Glycoproteine von in etwa 150.000 Dalton, die aus zwei identischen leichten (L-) Ketten und zwei identischen schweren (H-) Ketten zusammengesetzt sind. Jede leichte Kette ist mittels einer kovalenten Disulfidbindung mit einer schweren Kette verbunden, während die Anzahl der Disulfidbindungen zwischen den schweren Ketten verschiedener Immunglobulinisotypen variiert. Jede schwere und leichte Kette weist außerdem regelmäßig beabstandete Disulfidbrücken innerhalb der Kette auf. Jede schwere Kette weist an einem Ende eine variable Domäne (VH), gefolgt von einer Anzahl von konstanten Domänen auf. Jede leichte Kette weist eine variable Domäne an einem Ende (VL) und eine konstante Domäne an ihrem anderen Ende auf. Die konstante Domäne der leichten Kette ist an der ersten konstanten Domäne der schweren Kette ausgerichtet, und die variable Domäne der leichten Kette ist an der variablen Domäne der schweren Kette ausgerichtet. Man nimmt an, dass bestimmte Aminosäurereste eine Grenzfläche zwischen den variablen Domänen der leichten Kette und der schweren Kette bilden.
  • Der Ausdruck „variabel" bezieht sich auf die Tatsache, dass bestimmte Teile der variablen Domänen sich beträchtlich in der Sequenz zwischen Antikörpern unterscheiden und bei der Bindung und der Spezifität jedes bestimmten Antikörpers für sein bestimmtes Antigen verwendet werden. Jedoch ist die Variabilität nicht gleichmäßig über die variablen Domänen von Antikörpern verteilt. Sie ist in drei Segmenten, die hypervariable Regionen genannt werden, sowohl in den variablen Domänen der leichten Kette als auch der schweren Kette konzentriert. Die stärker konservierten Teile der variablen Domänen werden die Gerüstregionen (FRs) genannt. Die variablen Domänen von nativen schweren und leichten Ketten umfassen jeweils vier FRs, die weitgehend eine β-Blatt-Konfiguration annehmen, die durch drei hypervariablen Regionen verbunden sind, die Schlaufen bilden, die die β-Blatt-Struktur verbinden und in einigen Fällen einen Teil von ihr bilden. Die hypervariablen Regionen in jeder Kette werden durch die FRs in naher Nachbarschaft zueinander gehalten und tragen mit den hypervariablen Regionen der anderen Kette zu der Bildung der Antigen-Bindungsstelle von Antikörpern bei (siehe Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. Aufl. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Die konstanten Domänen sind nicht direkt an der Bindung eines Antikörpers an ein Antigen beteiligt, sondern zeigen verschiedene Effektorfunktionen, so wie die Beteiligung des Antikörpers an der Antikörper-abhängigen zellulären Zytotoxizität (ADCC).
  • Der Ausdruck „hypervariable Region" bezieht sich, wenn er hierin verwendet wird, auf die Aminosäurereste eines Antikörpers, die verantwortlich für die Antigenbindung sind. Die hypervariable Region umfasst im Allgemeinen Aminosäurereste von einer „Komplementaritäts-bestimmenden Region" oder „CDR" (z.B. die Reste 24-34 (L1), 50-56 (L2) und 89-97 (L3) in der variablen Domäne der leichten Kette und 31-35 (H1), 50-65 (H2) und 95-102 (H3) in der variablen Domäne der schweren Kette; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. Aufl. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) und/oder die Reste aus einer „hypervariablen Schlaufe" (z.B. die Reste 26-32 (L1), 50-52 (L2) und 91-96 (L3) in der variablen Domäne der leichten Kette und 26-32 (H1), 53-55 (H2) und 96-101 (H3) in der va riablen Domäne der schweren Kette; Chothia und Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901-917 (1987)). „Gerüstregion"- oder „FR"-Reste sind diejenigen Reste der variablen Domäne außer den hierin definierten Reste der hypervariablen Region.
  • Die Papain-Spaltung von Antikörpern erzeugt zwei identische Antigen-bindende Fragmente, genannt „Fab"-Fragmente, jeweils mit einer einzigen Antigen-Bindungsstelle, und ein restliches „Fc"-Fragment, dessen Name seine Fähigkeit, leicht zu kristallisieren, widerspiegelt. Die Pepsin-Behandlung ergibt ein F(ab')2-Fragment, das zwei Antigen-Bindungsstellen aufweist und noch fähig ist, Antigen kreuzzuvernetzen.
  • „Fv" ist das minimale Antikörperfragment, das eine vollständige Antigenerkennungs- und Antigen-Bindungsstelle enthält. Diese Region besteht aus einem Dimer einer variablen Domäne einer schweren Kette und einer leichten Kette in einer festen, nicht-kovalenten Bindung. In dieser Anordnung interagieren die drei hypervariablen Regionen jeder variablen Domäne miteinander, um eine Antigen-Bindungsstelle auf der Oberfläche des VH-VL-Dimers zu definieren. Zusammen verleihen die sechs hypervariablen Regionen dem Antikörper die Antigen-Bindungsspezifität. Jedoch weist auch eine einzelne variable Domäne (oder die Hälfte eines Fv, die nur drei für ein Antigen spezifische hypervariable Regionen umfasst) die Fähigkeit auf, ein Antigen zu erkennen und zu binden, wenn auch mit einer niedrigeren Affinität als die gesamte Bindungsstelle.
  • Das Fab-Fragment enthält auch die konstante Domäne der leichten Kette und die erste konstante Domäne (CH1) der schweren Kette. Fab'-Fragmente unterscheiden sich von Fab-Fragmenten durch den Zusatz weniger Reste an dem Carboxyterminus der CH1-Domäne der schweren Kette, die ein oder mehrere Cysteine aus der Antikörper-Scharnier(„hinge")-Region einschließt. Fab'-SH ist hierin die Bezeichnung für Fab', worin der(die) Cysteinrest(e) der konstanten Domänen zumindest eine freie Thiogruppe tragen. F(ab')2-Antikörperfragmente wurden ursprünglich als Paare von Fab'-Fragmenten hergestellt, die Scharnier(„hinge")-Cysteine zwischen sich aufweisen. Andere chemische Kopplungen von Antikörperfragmenten sind ebenfalls bekannt.
  • Die „leichten Ketten" von Antikörpern aus einer beliebigen Vertebratenspezies lassen sich auf der Basis der Aminosäuresequenzen ihrer konstanten Domänen einem von zwei klar unterschiedlichen Typen, die als Kappa (6) und Lambda (8) bezeichnet werden, zuordnen.
  • „Einzelkette-Fv"- oder „scFv"-Antikörperfragmente umfassen die VH- und VL-Domänen eines Antikörpers, wobei diese Domänen in einer einzelnen Polypeptidkette vorhanden sind. Vorzugsweise umfasst das Fv-Polypeptid außerdem einen Polypeptidlinker zwischen den VH- und VL-Domänen, der es scFv ermöglicht, die gewünschte Struktur für die Antigenbindung zu bilden. Für einen Übersichtsartikel über scFv siehe Plückthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Bd. 113, Rosenburg und Moore Hrsg. (Springer-Verlag, New York, 1994), S. 269-315. Anti-ErbB2-Antikörper-scFv-Fragmente sind in WO 93/16185, US-Patent Nr. 5,571,894 und US-Patent Nr. 5,587,458 beschrieben.
  • Der Ausdruck „Diabodies" bezieht sich auf kleine Antikörperfragmente mit zwei Antigen-Bindungsstellen, wobei die Fragmente eine variable schwere Domäne (VH), die mit einer variablen leichten Domäne (VL) in der gleichen Polypeptidkette (VH-VL) verbunden ist, umfassen. Durch die Verwendung eines Linkers, der zu kurz ist, um die Paarung zwischen den beiden Domänen auf der gleichen Kette zu erlauben, werden die Domänen gezwungen, sich mit den komplementären Domänen einer weiteren Kette zu paaren und zwei Antigen-Bindungsstellen zu binden. Diabodies sind ausführlicher in zum Beispiel EP 404,097 , WO 93/11161 und Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993) beschrieben.
  • „Humanisierte" Formen von nicht-humanen (z.B. Nager-) Antikörpern sind chimäre Antikörper, die eine Minimalsequenz enthalten, die von nicht-humanem Immunglobulin abgeleitet ist. Zumeist sind humanisierte Antikörper humane Immunglobuline (Rezipienten-Antikörper), in denen Reste aus einer hypervariablen Region des Rezipienten durch Reste aus einer hypervariablen Region einer nicht-humanen Spezies (Donor-Antikörper), so wie Maus, Ratte, Kaninchen oder einem nicht-humanem Primaten, die die gewünschte Spezifität, Affinität und Kapazität aufweist, ersetzt sind. Bei einigen Beispielen sind Gerüstregion(FR)-Reste des humanen Immunglobulins durch entsprechende nicht-humane Reste ersetzt. Außerdem können humanisierte Antikörper Reste umfassen, die in dem Rezipienten-Antikörper oder in dem Donor-Antikörper nicht gefunden werden. Diese Modifikationen werden hergestellt, um die Leistung des Antikörpers weiter zu verbessern. Im Allgemeinen wird der humanisierte Antikörper im Wesentlichen alle von wenigstens einer und typischerweise zwei variablen Domänen umfassen, wobei alle oder im Wesentlichen alle hypervariablen Schlaufen denjenigen eines nicht-humanen Immunglobulins entsprechen, und alle oder im Wesentlichen alle FRs diejenigen einer humanen Immunglobulinsequenz sind. Der humanisierte Antikörper wird wahlweise auch wenigstens einen Teil einer konstanten Immunglobulinregion (Fc) umfassen, typischerweise denjenigen eines humanen Immunglobulins. Für weitere Details siehe Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988) und Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992).
  • Ein „isolierter" Antikörper ist einer, der aus einem Bestandteil seiner natürlichen Umgebung identifiziert und abgetrennt und/oder gewonnen wurde. Verunreinigende Bestandteile seiner natürlichen Umgebung sind Stoffe, die diagnostische oder therapeutische Verwendungen für den Antikörper stören würden, und können Enzyme, Hormone und andere proteinartige oder nicht-proteinartige gelöste Stoffe einschließen. In bevorzugten Ausführungsbeispielen wird der Antikörper (1) bis zu mehr als 95 Gew.-% des Antikörpers, wie mittels des Lowry-Verfahrens bestimmt, und am meisten bevorzugt zu mehr als 99 Gew.-%, (2) bis zu einem ausreichenden Grad, um wenigstens 15 Reste N-terminaler oder interner Aminosäuresequenz mittels eines Spinning-Cup-Sequenators zu erhalten, oder (3) bis zur Homogenität in der SDS-PAGE unter reduzierenden oder nicht-reduzierenden Bedingungen, unter Verwendung von Coomassie-Blau oder vorzugsweise einer Silberfärbung gereinigt werden. Der isolierte Antikörper schließt den Antikörper in situ innerhalb rekombinanter Zellen ein, da wenigstens ein Bestandteil der natürlichen Umgebung des Antikörpers nicht vorhanden sein wird. Gewöhnlicher Weise wird der isolierte Antikörper jedoch durch wenigstens einen Reinigungsschritt hergestellt werden.
  • Der Ausdruck „Kontrollsequenzen" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die für die Expression einer funktionell verbundenen kodierenden Sequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus erforderlich sind. Die Kontrollsequenzen, die für Prokaryonten geeignet sind, schließen einen Promotor, wahlweise eine Operatorsequenz und eine Ribosomenbindungsstelle ein.
  • Eine Nukleinsäure ist „funktionell verbunden", wenn sie in einem funktionellen Verhältnis mit einer weiteren Nukleinsäuresequenz angeordnet ist. Zum Beispiel ist eine DNA für eine Präsequenz oder einen sekretorischen Leader mit einer DNA für ein Polypeptid funktionell verbunden, wenn sie als ein Prä-Protein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids beteiligt ist; ein Promotor ist funktionell mit einer kodierenden Sequenz verbunden, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflusst; oder eine Ribosomenbindungsstelle ist funktionell mit einer kodierenden Sequenz verbunden, wenn sie so angeordnet ist, dass sie die Translation erleichtert. Im Allgemeinen bedeutet „funktionell verbunden", dass die DNA-Sequenzen aufeinanderfolgend und, in dem Fall eines sekretorischen Leaders, aufeinanderfolgend und im Leserahmen miteinander verbunden sind. Das Verbinden wird durch Ligation an passenden Restriktionsstellen erreicht. Falls solche Stellen nicht vorhanden sind, können die synthetischen Oligo nukleotidadapter oder Linker in Übereinstimmung mit der herkömmlichen Praxis verwendet werden.
  • Wie hierin verwendet, werden die Ausdrücke „Zelle", „Zelllinie" und „Zellkultur" austauschbar verwendet, und alle diese Bezeichnungen schließen die Nachkommenschaft ein. Somit schließen die Worte „Transformanten" und „transformierte Zellen" die primären gegenständlichen Zellen und die davon abgeleiteten Kulturen ohne Berücksichtigung der Anzahl der Transfers ein. Es ist auch klar, dass aufgrund von beabsichtigten oder unbeabsichtigten Mutationen nicht die gesamte Nachkommenschaft bezüglich des DNA-Gehalts exakt identisch sein muss. Mutierte Nachkommen, die die gleiche Funktion oder biologische Aktivität aufweisen, wie diejenige, auf die die ursprünglich transformierte Zelle gescreent wurde, sind eingeschlossen. Wo bestimmte Festlegungen beabsichtigt sind, wird sich dies aus dem Zusammenhang ergeben.
  • Ausführungsformen der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt E-coli-Stämme bereit, die bezüglich der chromosomalen degP und prc defizient sind, die die Protease DegP bzw. Prc kodieren und die eine Mutante des spr-Gens enthalten, wobei das Produkt dieses Gens Wachstumsphänotypen unterdrückt, die von Stämmen gezeigt werden, die prc-Mutanten enthalten. Der Stamm ist wahlweise außerdem bezüglich des chromosomalen ptr3, das die Protease III kodiert, und/oder des chromosomalen ompT, das die Protease OmpT kodiert, defizient.
  • Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel umfasst der Stamm eine Nukleinsäure, die ein Polypeptid kodiert, das heterolog zu dem Stamm ist. Der Stamm ist vorzugsweise mit der Nukleinsäure, die vorzugsweise DNA (cDNA oder genomische DNA) ist, wie unter Verwendung eines rekombinanten Expressionsvektors, transformiert.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung solcher heterologer Polypeptide bereit. Bei diesem Verfahren wird der oben genannte E. coli-Stamm, der auch eine Nukleinsäure umfasst, die das Polypeptid kodiert, auf solche eine Weise kultiviert, dass die Nukleinsäure exprimiert wird. Dann wird das Polypeptid aus dem Stamm gewonnen. Die Gewinnung kann aus dem Periplasma oder dem Kulturmedium des Stamms erfolgen. Vorzugsweise findet die Kultivierung in einem Fermenter und, mehr bevorzugt, unter Bedingungen einer Fermentation mit hoher Zelldichte statt.
  • Die Verwendung von Kulturparametern und die Polypeptidherstellung werden auf eine herkömmliche Weise durchgeführt, so wie bei den unten beschriebenen Verfahren.
  • A. Auswahl der Nukleinsäure und ihre Modifizierungen
  • Die Nukleinsäure, die das Polypeptid von Interesse kodiert, ist geeigneter Weise RNA, cDNA oder genomische DNA aus einer beliebigen Quelle, vorausgesetzt, dass sie das(die) Polypeptid(e) von Interesse kodiert. Verfahren für die Auswahl der geeigneten Nukleinsäure für die Expression heterologer Polypeptide (einschließlich Varianten davon) in E. coli sind wohlbekannt.
  • Falls monoklonale Antikörper hergestellt werden, wird die DNA, die die monoklonalen Antikörper kodiert, auf einfache Weise unter Verwendung herkömmlicher Verfahren isoliert und sequenziert (z.B. unter Verwendung von Oligonukleotidsonden, die fähig sind, spezifisch an Gene zu binden, die die schweren und leichten Ketten von murinen Antikörpern kodieren). Die Hybridomzellen dienen als eine bevorzugte Quelle von solcher DNA. Einmal isoliert, kann die DNA in Expressionsvektoren eingefügt werden, die dann in die hierin genannten bakteriellen Wirtszellen transformiert werden, um die Synthese von monoklonalen Antikörpern in den rekombinanten Wirtszellen zu erhalten. Übersichtsartikel über die rekombinante Expression von DNA, die Antikörper kodiert, in Bakterien schließen Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256-262 (1993) und Plückthun, Immunol. Revs., 130: 151-188 (1992) ein.
  • Verfahren zur Humanisierung von nicht-humanen Antikörpern wurden in der Technik beschrieben. Vorzugsweise weist ein humanisierter Antikörper ein oder mehrere Aminosäurereste auf, die in ihn aus einer Quelle eingeführt wurden, die nicht-human ist. Diese nicht-humanen Aminosäurereste werden oft als „Import"-Reste bezeichnet, die typischerweise aus einer variablen „Import"-Domäne stammen. Die Humanisierung kann im Wesentlichen gemäß dem Verfahren von Winter und Mitarbeitern (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)) durchgeführt werden, indem Sequenzen einer hypervariablen Region durch die entsprechenden Sequenzen eines humanen Antikörpers ausgetauscht werden. Folglich sind solche „humanisierte" Antikörper chimäre Antikörper (US-Pat. Nr. 4,816,567), worin erheblich weniger als eine intakte humane variable Domäne durch die entsprechende Sequenz aus einer nicht-humanen Spezies ausgetauscht wurde. In der Praxis sind humanisierte Antikörper typischerweise humane Antikörper, in denen einige Reste einer hypervariablen Region und möglicherweise einige FR-Reste durch Reste aus analogen Stellen in Nager-Antikörpern ersetzt wurden.
  • Die Auswahl von humanen variablen Domänen, sowohl leicht als auch schwer, die bei der Herstellung der humanisierten Antikörper verwendet werden sollen, ist sehr wichtig, um die Antigenität zu verringern. Gemäß dem so genannten „Best-Fit"-Verfahren wird die Sequenz der variablen Domäne eines Nager-Antikörpers gegen die gesamte Bibliothek bekannter humaner variable-Domäne-Sequenzen gescreent. Die humane Sequenz, die derjenigen des Nagers am nächsten kommt, wird dann als die humane Gerüstregion (FR) für den humanisierten Antikörper akzeptiert (Sims et al., J. Immunol., 151: 2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196: 901 (1987)). Ein weiteres Verfahren benutzt eine bestimmte Gerüstregion, die von der Konsensussequenz aller humanen Antikörper einer bestimmten Untergruppe von leichten oder schweren Ketten abgeleitet ist. Das gleiche Gerüst kann für mehrere verschiedene humanisierte Antikörper verwendet werden (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151: 2623 (1993)).
  • Es ist außerdem wichtig, dass die Antikörper unter Beibehaltung einer hohen Affinität für das Antigen und anderer vorteilhafter biologischer Eigenschaften humanisiert werden. Um dieses Ziel zu erreichen, werden gemäß einem bevorzugten Verfahren humanisierte Antikörper mittels eines Verfahrens der Analyse der Elternsequenzen und von verschiedenen konzeptionellen humanisierten Produkten unter Verwendung dreidimensionaler Modelle der Eltern- und humanisierten Sequenzen hergestellt. Dreidimensionale Immunglobulinmodelle sind allgemein verfügbar und sind dem Fachmann bekannt. Computerprogramme sind verfügbar, die wahrscheinliche dreidimensionale Konformationsstrukturen von ausgewählten Kandidaten-Immunglobulinsequenzen veranschaulichen und darstellen. Die Untersuchung dieser Darstellungen erlaubt die Analyse der wahrscheinlichen Rolle der Reste bei der Funktion der Kandidaten-Immunglobulinsequenz, d.h. die Analyse von Resten, die die Fähigkeit des Kandidaten-Immunglobulins, sein Antigen zu binden, beeinflussen. Auf diese Weise können FR-Reste aus den Rezipienten- und Import-Sequenzen ausgewählt und kombiniert werden, sodass die gewünschte Antikörpereigenschaft, so wie eine erhöhte Affinität für das(die) Zielantigen(e) erreicht wird. Im Allgemeinen sind die Reste einer hypervariablen Region direkt und am wesentlichsten daran beteiligt, die Antigenbindung zu beeinflussen.
  • Verschiedene Formen des humanisierten Antikörpers oder des Affinitäts-gereiften Antikörpers werden in Betracht gezogen. Zum Beispiel kann der humanisierte Antikörper oder der Affinitäts-gereifte Antikörper ein Antikörperfragment sein, so wie ein Fab, das wahlweise mit einem oder mehreren Targeting-Mittel(n) konjugiert ist, um ein Immunkonjugat zu erzeugen. Alternativ kann der humanisierte Antikörper oder der Affinitäts-gereifte Antikörper ein intakter Antikörper, so wie ein intakter IgG1-Antikörper, sein.
  • Fab'-SH-Fragmente können direkt aus E. coli gewonnen und chemisch gekoppelt werden, um F(ab')2-Fragmente zu bilden (Carter et al., Bio/Technology, 10: 163-167 (1992)). Gemäß einer weiteren Herangehensweise können F(ab')2-Fragmente direkt aus einer rekombinanten Wirtszellkultur isoliert werden. Andere Techniken für die Herstellung von Antikörperfragmenten werden für den Fachmann ersichtlich sein. In anderen Ausführungsbeispielen ist der Antikörper der Wahl ein einzelkettiges Fv-Fragment (scFv) (WO 93/16185; US-Pat. Nr. 5,571,894 und 5,587,458). Das Antikörperfragment kann auch ein „linearer Antikörper" sein, z.B. wie in US-Pat. Nr. 5,641,870 beschrieben. Solche linearen Antikörperfragmente können monospezifisch oder bispezifisch sein.
  • Bispezifische Antikörper sind Antikörper, die Bindungsspezifitäten für wenigstens zwei verschiedene Epitope aufweisen. Exemplarische bispezifische Antikörper können an zwei verschiedene Epitope des Dkk-1-Proteins binden. Bispezifische Antikörper können als Antikörper mit vollständiger Länge oder als Antikörperfragmente (z.B. F(ab')2-bispezifische Antikörper) hergestellt werden.
  • Gemäß einer anderen Herangehensweise werden variable Antikörperdomänen mit den gewünschten Bindungsspezifitäten (Antikörper-Antigen-Bindungsstellen) an Sequenzen konstanter Immunglobulindomänen gekoppelt. Die Kopplung erfolgt vorzugsweise mit einer konstanten Domäne einer schweren Kette eines Immunglobulins, die wenigstens einen Teil der Scharnier(„hinge")-, CH2- und CH3-Regionen umfasst. Es ist bevorzugt, dass die erste konstante Region der schweren Kette (CH1), die die notwendige Stelle für die Bindung der leichten Kette enthält, in wenigstens einer der Fusionen vorhanden ist. DNAs, die die Fusionen der schweren Immunglobulinkette und, falls gewünscht, die leichte Immunglobulinkette kodieren, werden in getrennte Expressionsvektoren insertiert und werden in einen geeigneten bakteriellen Wirtsorganismus kotransfiziert. Dies liefert eine große Flexibilität bei der Anpassung der wechselseitigen Anteile der drei Polypeptidfragmente in Ausführungsbeispielen, bei denen ungleiche Verhältnisse der drei bei der Konstruktion verwendeten Polypeptidketten die optimalen Ausbeuten liefern. Es ist jedoch möglich, die kodierenden Sequenzen für zwei oder alle drei Polypeptidketten in einen Expressionsvektor zu insertieren, wenn die Ex pression von wenigstens zwei Polypeptidketten in gleichen Verhältnissen zu hohen Ausbeuten führt oder wenn die Verhältnisse nicht von besonderer Bedeutung sind.
  • In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel dieser Herangehensweise bestehen die bispezifischen Antikörper aus einer hybriden schweren Immunglobulinkette mit einer ersten Bindungsspezifität auf einem Arm und einem hybriden schwere-leichte-Immunglobulinkette-Paar (das die zweite Bindungsspezifität liefert) auf dem anderen Arm. Es wurde gefunden, dass diese asymmetrische Struktur die Abtrennung der gewünschten bispezifischen Verbindung von unerwünschten Kombinationen von Immunglobulinketten erleichtert, da die Anwesenheit einer leichten Immunglobulinkette in nur einer Hälfte des bispezifischen Moleküls eine leichte Art der Trennung ermöglicht. Diese Herangehensweise ist in WO 94/04690 offenbart. Für weitere Details der Herstellung bispezifischer Antikörper siehe, zum Beispiel, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986).
  • Gemäß einer weiteren, in US-Pat. Nr. 5,731,168 beschriebenen Herangehensweise kann die Grenzfläche zwischen einem Paar von Antikörpermolekülen manipuliert werden, um den Prozentsatz an Heterodimeren, die aus der rekombinanten Zellkultur gewonnen werden, zu maximieren. Die bevorzugte Grenzfläche umfasst wenigstens einen Teil der CH3-Domäne einer konstanten Antikörperdomäne. Bei diesem Verfahren werden eine oder mehrere kleine Aminosäure-Seitenketten aus der Grenzfläche des ersten Antikörpermoleküls durch größere Seitenketten (z.B. Tyrosin oder Tryptophan) ersetzt. Kompensatorische „Kavitäten" von identischer oder ähnlicher Größe zu der(den) großen Seitenkette(n) werden auf der Grenzfläche des zweiten Antikörpermoleküls durch Ersetzen großer Aminosäure-Seitenketten durch kleinere (z.B. Alanin oder Threonin) erzeugt. Dies stellt einen Mechanismus für die Erhöhung der Ausbeute des Heterodimers gegenüber unerwünschten Endprodukten, so wie Homodimeren, bereit.
  • Bispezifische Antikörper schließen kreuzvernetzte oder „Heterokonjugat"-Antikörper ein. Zum Beispiel kann einer der Antikörper in dem Heterokonjugat an Avidin, der andere an Biotin gekoppelt sein. Solche Antikörper wurden zum Beispiel vorgeschlagen, um Zellen des Immunsystems gegen unerwünschte Zellen zu richten (US-Pat. Nr. 4,676,980), sowie zur Behandlung der HIV-Infektion (WO 91/00360, WO 92/200373 und EP 03089 ). Heterokonjugat-Antikörper können unter Verwendung aller beliebigen geeigneten Kreuzvernetzungsverfahren hergestellt werden. Geeignete kreuzvernetzende Mittel sind in der Technik wohlbekannt und sind in US-Pat. Nr. 4,676,980 gemeinsam mit einer Anzahl von Kreuzvernetzungsverfahren offenbart.
  • Techniken für die Herstellung bispezifischer Antikörper aus Antikörperfragmenten wurden ebenfalls in der Literatur beschrieben. Zum Beispiel können bispezifische Antikörper unter Verwendung einer chemischer Kopplung hergestellt werden. Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) beschreiben ein Verfahren, wobei intakte Antikörper proteolytisch gespalten werden, um F(ab')2-Fragmente herzustellen. Diese Fragmente werden in der Gegenwart des Dithiol-Komplexierungsmittels Natriumarsenit reduziert, um benachbarte Dithiole zu stabilisieren und eine intermolekulare Disulfidbildung zu verhindern. Die hergestellten Fab'-Fragmente werden dann in Thionitrobenzoat(TNB)-Derivate umgewandelt. Eines der Fab'-TNB-Derivate wird dann durch Reduktion mit Mercaptoethylamin in das Fab'-Thiol rückumgewandelt und mit einer äquimolaren Menge des anderen Fab'-TNB-Derivats gemischt, um den bispezifischen Antikörper herzustellen. Die hergestellten bispezifischen Antikörper können als Mittel für die selektive Immobilisierung von Enzymen verwendet werden.
  • Außerdem können Fab'-SH-Fragmente direkt aus E. coli gewonnen und chemisch gekoppelt werden, um bispezifische Antikörper zu bilden (Shalaby et al., J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992)).
  • Verschiedene Techniken für die Herstellung und Isolierung bispezifischer Antikörperfragmente direkt aus der rekombinanten Zellkultur wurden ebenfalls beschrieben. Zum Beispiel wurden bispezifische Antikörper unter Verwendung von Leucinzippern hergestellt (Kostelny et al., J. Immunol., 148: 1547-1553 (1992)). Die Leucinzipperpeptide aus den Fos- und Jun-Proteinen werden an die Fab'-Teile von zwei verschiedenen Antikörpern mittels Genfusion gekoppelt. Die Antikörper-Homodimere werden an der Scharnier(„hinge")-Region reduziert, um Monomere zu bilden, und dann reoxidiert, um die Antikörper-Heterodimere zu bilden. Dieses Verfahren kann auch für die Herstellung von Antikörper-Homodimeren verwendet werden. Die von Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993) beschriebene „Diabody"-Technologie hat einen alternativen Mechanismus für die Herstellung bispezifischer Antikörperfragmente bereitgestellt. Diese Fragmente umfassen eine variable Domäne der schweren Kette (VH), die mit einer variablen Domäne der leichten Kette (VL) mittels eines Linkers verbunden ist, der zu kurz ist, um eine Paarung zwischen den beiden Domänen auf der gleichen Kette zu erlauben. Somit werden die VH- und VL-Domänen eines Fragments gezwungen, mit den komplementären VL- und VH-Domänen eines weiteren Fragments zu paaren, wodurch zwei Antigen-Bindungsstellen gebildet werden. Es wurde auch über eine weitere Strategie für die Herstellung bispezifischer Antikörperfragmente unter der Verwendung von einzelkettigen Fv(sFV)-Dimeren berichtet (Gruber et al., J. Immunol., 152: 5368 (1994)).
  • Es werden Antikörper mit mehr als zwei Valenzen in Betracht gezogen. Zum Beispiel können trispezifische Antikörper hergestellt werden (Tutt et al., J. Immunol., 147: 60 (1991)).
  • Nukleinsäuremoleküle, die Polypeptidvarianten kodieren, werden mittels einer Vielzahl von in der Technik bekannten Verfahren hergestellt. Diese Verfahren schließen, ohne darauf beschränkt zu sein, die Isolierung aus einer natürlichen Quelle (in dem Fall von natürlicherweise vorkommenden Aminosäure-Sequenzvarianten) oder die Herstellung durch Oligonukleotid-vermittelte (oder ortsspezifische) Mutagenese, PCR-Mutagenese oder Kassettenmutagenese einer zuvor hergestellten Variante oder einer nicht-varianten Version des Polypeptids ein.
  • Es kann wünschenswert sein, den erfindungsgemäßen Antikörper im Hinblick auf die Effektorfunktion zu modifizieren, z.B. um die Fc-Rezeptorbindung zu verstärken. Dies kann erreicht werden, indem eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen in eine Fc-Region des Antikörpers eingeführt werden. Alternativ oder zusätzlich kann (können) (ein) Cysteinrest(e) in die Fc-Region eingeführt werden, wodurch die Bildung von Disulfidbindungen zwischen Ketten in dieser Region ermöglicht wird.
  • Um die Serumhalbwertszeit des Antikörpers zu erhöhen, kann ein Rettungsrezeptor-Bindungsepitop in den Antikörper (speziell ein Antikörperfragment), zum Beispiel wie in US-Pat. 5,739,277 beschrieben, eingeführt werden. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „Rettungsrezeptor-Bindungsepitop" auf ein Epitop der Fc-Region eines IgG-Moleküls (z.B. IgG1, IgG2, IgG3 oder IgG4), das verantwortlich für die Erhöhung der in-vivo-Serumhalbwertszeit des IgG-Moleküls ist.
  • Andere Modifikationen des Antikörpers werden hierin in Betracht gezogen. Zum Beispiel kann der Antikörper an eines aus einer Vielzahl von nicht-Protein-Polymeren, z.B. Polyethylenglycol, Polypropylenglycol, Polyoxyalkylenen oder Kopolymeren von Polyethylenglycol und Polypropylenglycol, gekoppelt sein.
  • B. Insertion von Nukleinsäure in einen replizierbaren Vektor
  • Die heterologe Nukleinsäure (z.B. cDNA oder genomische DNA) wird passender Weise in einen replizierbaren Vektor für die Expression in dem Bakterium unter der Kontrolle eines passenden Promotors insertiert. Viele Vektoren sind für diesen Zweck erhältlich, und die Auswahl des geeigneten Vektors wird hauptsächlich von der Größe der Nukleinsäure, die in den Vektor insertiert werden soll, und der jeweiligen Wirtszelle, die mit dem Vektor transformiert werden soll, abhängen. Jeder Vektor enthält verschiedene Komponenten, die von der jeweiligen Wirtszelle abhängen, mit der er kompatibel ist. Abhängig von dem jeweiligen Wirtstyp, schließen die Vektorkomponenten im Allgemeinen, aber ohne Beschränkung, ein oder mehrere der folgenden ein: eine Signalsequenz, einen Replikationsursprung, ein oder mehrere Markergene, einen Promotor und eine Transkriptionsterminationssequenz.
  • Im Allgemeinen werden Plasmidvektoren, die ein Replikon und Kontrollsequenzen enthalten, die von Spezies abgeleitet sind, die mit der Wirtszelle kompatibel sind, in Verbindung mit E.-coli-Wirten verwendet. Der Vektor trägt gewöhnlich eine Replikationsstelle, sowie Markersequenzen, die fähig sind, eine phenotypische Selektion in transformierten Zellen zu gewährleisten. Zum Beispiel wird E. coli typischerweise unter Verwendung von pBR322 transformiert, einem Plasmid, das von einer E.-coli-Spezies abgeleitet ist (siehe z.B. Bolivar et al., Gene, 2: 95 (1977)). pBR322 enthält Gene für eine Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz, und stellt somit einfache Mittel für die Identifizierung transformierter Zellen bereit. Das pBR322-Plasmid oder ein anderes bakterielles Plasmid oder Phage enthält im Allgemeinen Promotoren, die von dem E.-coli-Wirt für die Expression der selektierbaren Markergene verwendet werden können, oder ist so modifiziert, dass es diese enthält.
  • (i) Signalsequenz-Komponente
  • Die DNA, die das hierin interessierende Polypeptid kodiert, kann nicht nur direkt, sondern auch als eine Fusion mit einem weiteren Polypeptid, vorzugsweise einer Signalsequenz oder einem anderen Polypeptid, das eine spezifische Schnittstelle an dem N-Terminus des reifen Polypeptids aufweist, exprimiert werden. Im Allgemeinen kann die Signalsequenz ein Bestandteil des Vektors sein, oder sie kann ein Teil der Polypeptid-DNA sein, die in den Vektor insertiert wird. Die ausgewählte heterologe Signalsequenz sollte solcherart sein, dass sie von der Wirtszelle erkannt und prozessiert (d.h. durch eine Signalpeptidase gespalten) wird.
  • Bei prokaryontischen Wirtszellen, die die native oder eine eukaryontische Polypeptid-Signalsequenz nicht erkennen und prozessieren, wird die Signalsequenz durch eine prokaryontische Signalsequenz ersetzt, die zum Beispiel aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus der Alkalischen Phosphatase, der Penicillinase, 1pp oder hitzestabilen Enterotoxin-II-Leadern besteht.
  • (ii) Replikationsursprung-Bestandteil
  • Expressionsvektoren enthalten eine Nukleinsäuresequenz, die den Vektor in die Lage versetzt, in einer oder mehreren ausgewählten Wirtszellen zu replizieren. Solche Sequenzen sind für eine Vielzahl von Bakterien wohlbekannt. Der Replikationsurspung aus dem Plasmid pBR322 ist für Gram-negative Bakterien, so wie E. coli, geeignet.
  • (iii) Selektionsgen-Bestandteil
  • Expressionsvektoren enthalten im Allgemeinen ein Selektionsgen, das auch als selektierbarer Marker bezeichnet wird. Dieses Gen kodiert ein Protein, das für das Überleben oder das Wachstum von transformierten Wirtszellen erforderlich ist, die in einem selektiven Kulturmedium wachsen gelassen werden. Wirtszellen, die nicht mit dem Vektor transformiert sind, der das Selektionsgen enthält, werden in dem Kulturmedium nicht überleben. Dieser selektierbare Marker ist getrennt von den in dieser Erfindung verwendeten und definierten genetischen Markern. Typische Selektionsgene kodieren Proteine, die (a) eine Resistenz gegenüber Antibiotika oder anderen Toxinen, z.B Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetracyclin, verleihen, (b) andere auxotrophe Mängel als diejenigen, die durch die Gegenwart des(der) genetischen Marker(s) verursacht werden, komplementieren oder (c) kritische Nährstoffe bereitstellen, die aus Komplexmedien nicht verfügbar sind, z.B. das Gen, das die D-Alanin-Racemase für Bacilli kodiert.
  • Ein Beispiel eines Selektionsschemas verwendet ein Arzneimittel, um das Wachstum einer Wirtszelle anzuhalten. In diesem Fall produzieren diejenigen Zellen, die erfolgreich mit der Nukleinsäure von Interesse transformiert sind, ein Polypeptid, das Resistenz gegen das Arzneimittel verleiht, und überleben somit die Selektionsstrategie. Beispiele einer solchen dominanten Selektion verwenden die Arzneimittel Neomycin (Southern et al., J. Molec. Appl. Genet., 1: 327 (1982)), Mycophenolsäure (Mulligan et al., Science, 209: 1422 (1980)) oder Hygromycin (Sugden et al., Mol. Cell. Biol., 5: 410-413 (1985)). Die oben angegebenen drei Beispiele verwenden bakterielle Gene unter eukaryontischer Kontrolle, um eine Resistenz gegen das entsprechende Arzneimittel G418 oder Neomycin (Geneticin), xgpt (Mycophenolsäure) bzw. Hygromycin zu verleihen.
  • (iv) Promotorbestandteil
  • Der Expressionsvektor für die Herstellung des Polypeptids von Interesse enthält einen geeigneten Promotor, der von dem Wirtsorganismus erkannt wird und funktionell mit der Nukleinsäure verbunden ist, die das Polypeptid von Interesse kodiert. Geeignete Promotoren für die Verwendung bei prokaryontischen Wirten schließen die beta-Lactamase- und Lactose-Promotorsysteme (Chang et al., Nature, 275: 615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281: 544 (1979)), das Arabinose-Promotorsystem (Guzman et al., J. Bacteriol., 174: 7716-7728 (1992)), das Alkalische Phosphatase-, ein Tryptophan(trp)-Promotorsystem (Goeddel, Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980) und EP 36,776 ) und Hybridpromotoren, so wie den tac-Promotor (deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 21-25 (1983)) ein. Andere bekannte bakterielle Promotoren sind jedoch geeignet. Ihre Nukleotidsequenzen wurden veröffentlicht, wodurch ein Fachmann in die Lage versetzt wurde, sie unter Verwendung von Linkern oder Adaptern, um jede beliebige erforderliche Restriktionsstelle bereitzustellen, mit DNA zu koppeln, die das Polypeptid von Interesse kodiert (Siebenlist et al., Cell., 20: 269 (1980)).
  • Promotoren für die Verwendung in bakteriellen Systemen enthalten außerdem im Allgemeinen eine Shine-Dalgarno(S.D.)-Sequenz, die funktionell mit der DNA verbunden ist, die das Polypeptid von Interesse kodiert. Der Promotor kann aus der bakteriellen Ursprungs-DNA durch Restriktionsenzymspaltung entfernt und in den Vektor insertiert werden, der die gewünschte DNA enthält.
  • (v) Konstruktion und Analyse von Vektoren
  • Die Konstruktion von geeigneten Vektoren, die ein oder mehrere der oben aufgelisteten Bestandteile enthalten, verwendet Standard-Ligationstechniken. Isolierte Plasmide oder DNA-Fragmente werden gespalten, zurecht geschnitten und in der gewünschten Form religiert, um die erforderlichen Plasmide zu erzeugen.
  • Für die Analyse zur Bestätigung der korrekten Sequenzen in den konstruierten Plasmiden werden Ligationsgemische verwendet, um E. coli K12, Stamm 294 (ATCC 31,446) oder andere Stämme zu transformieren, und erfolgreiche Transformanten werden mittels Ampicillin- oder Tetracyclinresistenz, soweit zutreffend, selektiert. Die Plasmide aus den Transformanten werden präpariert, durch Restriktionsendonukleasespaltung analysiert und/oder nach dem Verfahren von Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467 (1977) oder Messing et al., Nucleic Acids Res., 9: 309 (1981) oder nach dem Verfahren von Maxam et al., Methods of Enzymology, 65: 499 (1980) sequenziert.
  • C. Selektion und Transformation von Wirtszellen
  • E.-coli-Wirte, die als parentale Wirte für erfindungsgemäße Expressionplasmide geeignet sind, schließen E.coli W3110 (ATCC 27,325), E. coli 294 (ATCC 31,446) E. coli B und E. coli X1776 (ATCC 31,537) ein. Diese Beispiele sind illustrativ und nicht beschränkend. Mutierte Zellen eines beliebigen der oben genannten Stämme können ebenfalls als die Ausgangswirte verwendet werden, die dann weiter mutiert werden, um zumindest den minimalen, erfindungsgemäß erforderlichen Genotyp zu enthalten. Der E.-coli-Stamm W3110 ist ein bevorzugter parentaler Wirt, weil er ein gebräuchlicher Wirt für rekombinante DNA-Produkt-Fermentationen ist. Beispiele von Ausgangs-E.-coli-Wirten, die als parentale Wirte verwendet werden sollen, sind gemeinsam mit ihren Genotypen in der Tabelle unten eingeschlossen:
  • Figure 00260001
  • Ebenfalls geeignet sind die Intermediate bei der Herstellung von Stamm 36F8, d.h. 27B4 (US-Pat. Nr. 5,304,472) und 35E7 (ein spontanes, temperaturresistentes Kolonieisolat, das besser als 27B4 wächst). Ein zusätzlicher geeigneter Stamm ist der E.-coli- Stamm, der die in US-Pat. Nr. 4,946,783, erteilt am 7. August 1990, offenbarte(n), mutierte(n) periplasmatische(n) Protease(n) aufweist.
  • Die erfindungsgemäßen Stämme können durch chromosomale Integration des Parentalstammes oder andere Techniken, einschließlich der in den Beispielen unten dargestellten, hergestellt werden.
  • Die Nukleinsäure, die das Polypeptid kodiert, wird in die Wirtszellen insertiert. Vorzugsweise wird dies durch Transformieren der Wirtszellen mit den oben beschriebenen Expressionsvektoren und Kultivieren in herkömmlichen Nährmedien, die wie für die Induktion der verschiedenen Promotoren geeignet modifiziert wurden, erreicht.
  • Transformation bedeutet Einführen von DNA in einen Organismus, so dass die DNA entweder als ein extrachromosomales Element oder durch chromosomale Integration replizierbar ist. Abhängig von der verwendeten Wirtszelle wird die Transformation unter Verwendung von Standardtechniken, die für solche Zellen geeignet sind, durchgeführt. Die, wie in dem Abschnitt 1.82 von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) beschriebene Kalziumbehandlung unter Verwendung von Kalziumchlorid wird im Allgemeinen für prokaryontische Zellen und andere Zellen verwendet, die erhebliche Zellwandbarrieren enthalten. Ein weiteres Verfahren für die Transformation verwendet Polyethylenglycol/DMSO, wie beschrieben in Chung und Miller, Nucleic Acids Res., 16: 3580 (1988). Ein noch weiteres Verfahren ist die Verwendung der Elektroporation genannten Technik.
  • D. Kultivieren der Wirtszellen
  • Prokaryontische Zellen, die verwendet werden, um das Polypeptid von Interesse herzustellen, werden in geeigneten, wie im Allgemeinen in Sambrook et al., supra, beschriebenen Medien kultiviert. Die Kulturbedingungen, so wie Temperatur, pH und dergleichen, sind diejenigen, die zuvor bei der Wirtszelle verwendet wurden, die für die Expression ausgewählt wurde, und sind dem Fachmann bekannt.
  • Wenn der Alkalische-Phosphatase-Promotor verwendet wird, werden E.-coli-Zellen, die verwendet werden, um das erfindungsgemäße Polypeptid von Interesse herzustellen, in geeigneten Medien kultiviert, in denen der Alkalische-Phosphatase-Promotor zum Teil oder vollständig, wie im Allgemeinen in z.B. Sambrook et al., supra, beschrieben, induziert werden kann. Die Kultivierung darf nie in der Abwesenheit von anorganischem Phosphat oder bei Phosphat-Hungerspiegeln stattfinden. Zunächst enthält das Medium anorganisches Phosphat in einer Menge oberhalb des Induktionsspiegels der Proteinsynthese und ausreichend für das Wachstum des Bakteriums. Während die Zellen wachsen und das Phosphat verwenden, verringern sie den Spiegel an Phosphat in dem Medium, wodurch sie die Induktion der Synthese des Polypeptids auslösen.
  • Alle beliebigen anderen notwendigen Medienbestandteile außer Kohlenstoff-, Stickstoff- und anorganischen Phosphat-Quellen können auch in geeigneten Konzentrationen enthalten sein, die alleine oder als ein Gemisch mit einem weiteren Bestandteil oder Medium, so wie einer komplexen Stickstoffquelle, eingeführt werden. Der pH des Mediums kann jeder beliebige pH von in etwa 5-9 sein, der hauptsächlich von dem Wirtsorganismus abhängt.
  • Falls der Promotor ein induzierbarer Promotor ist, werden die Zellen für die Induktion typischerweise kultiviert, bis eine bestimmte optische Dichte erreicht ist, z.B. eine A550 von in etwa 200, wobei ein Verfahren mit hoher Zelldichte verwendet wird, wobei an diesem Punkt die Induktion eingeleitet wird (z.B. durch Zugabe eines Induktors, durch Depletieren eines Mediumbestandteils, etc.), um die Expression des Gens, das das Polypeptid von Interesse kodiert, zu induzieren.
  • E. Nachweis der Expression
  • Die Genexpression kann direkt in einer Probe gemessen werden, z.B. durch konventionelles Southern-Blotting, Northern-Blotting, um die Transkription von mRNA zu quantifizieren (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205 (1980)), Dot-Blotting (DNA-Analyse) oder in situ-Hybridisierung unter Verwendung einer entsprechend markierten Sonde auf der Basis der Sequenzen des Polypeptids. Verschiedene Markierungen können verwendet werden, am häufigsten radioaktive Isotope, insbesondere 32P. Jedoch können auch andere Techniken verwendet werden, so wie die Verwendung von Biotin-modifizierten Nukleotiden für den Einbau in ein Polynukleotid. Das Biotin dient dann als Bindungsstelle für Avidin oder Antikörper, die mit einer großen Vielzahl von Markierungen, so wie Radionukliden, Fluoreszenzien, Enzymen oder dergleichen markiert sein können. Alternativ können Tests oder Gele für den Nachweis von Protein verwendet werden.
  • Für die Sekretion eines exprimierten Genprodukts wird die Wirtszelle unter Bedingungen kultiviert, die für die Sekretion des Genprodukts ausreichen. Solche Bedingungen schließen z.B. Temperatur-, Nährstoff- und Zelldichte-Bedingungen ein, die die Sekretion durch die Zelle erlauben. Außerdem sind solche Bedingungen diejenigen, unter denen die Zelle grundlegende Zellfunktionen der Transkription, Translation und Passage von Proteinen aus einem zellulären Kompartiment in ein anderes durchführen kann, die dem Fachmann bekannt sind.
  • F. Reinigung von Polypeptiden
  • Die folgenden Verfahren sind einzeln oder in Kombination beispielhaft für geeignete Reinigungsverfahren, wobei das(die) verwendete(n) spezifische(n) Verfahren von dem Typ des Polypeptids abhängt: Fraktionierung auf Immunaffinitäts- oder Ionenaustauschsäulen, Ethanolfällung, Umkehrphasen-HPLC, Hydrophobe-Wechselwirkungs-Chromatographie, Chromatographie auf Siliciumdioxid, Chromatographie auf einem Ionenaustauschharz, so wie S-SEPHAROSETM und DEAE, Chromatofokusierung, SDS-PAGE, Ammoniumsulfatfällung und Gelfiltration unter Verwendung von zum Beispiel SEPHADEXTM G-75.
  • Die monoklonalen Antikörper können in geeigneter Weise mittels konventioneller Antikörper-Reinigungsverfahren, so wie zum Beispiel Protein-A-Sepharose, Hydroxylapatit-Chromatographie, Gelelektrophorese, Dialyse oder Affinitätschromatographie, vom Kulturmedium abgetrennt werden.
  • Die Erfindung wird vollständiger unter Verweis auf die folgenden Beispiele verstanden werden. Sie sollten jedoch nicht in der Weise ausgelegt werden, dass sie den Umfang der Erfindung begrenzen. Alle Literatur- und Patentzitate hierin sind durch Verweis einbezogen.
  • BEISPIEL 1
  • Material und Methoden
  • A. Expressionsplasmide
  • 1. Plasmide für die Expression von rhuFab'2-LZ(xCD18) und getaggten Derivaten pS1130
  • Das Plasmid pS1130 ist ein auf pBR322 basierendes Plasmid, das in US-Pat. Nr. 6, 180,367 und 6,258,560 beschrieben ist. Die Synthese von rhuFab'2-LZ(xCD18) wird von dem Promotor der Alkalischen Phosphatase (AP) von E. coli reguliert. Wenn der AP-Promotor durch die Depletierung von Phosphat induziert wird, bildet er eine bi cistronische Messenger-RNA in der Reihenfolge der STII-Signal-leichte-Kette-Kappa-kodierende Sequenz, STII-Signal-schwere-Kette-kodierende Sequenz, gefolgt von einer Leucinzipper-Sequenz. Ein Lambda-Transkriptionsterminator wurde nahe des Translationsterminations-Kodons angeordnet.
  • pcyc34
  • Das Plasmid pcyc34 ist ein tacII-Promotor-Gegenstück von pS1130.
  • pxCD18-7T3
  • Das zwei-Promotor-Plasmid pxCD18-7T3, das zwei getrennte Translationseinheiten enthält, erlaubt die zeitliche Trennung der Transkription der leichten Kette von der Transkription der schweren Kette. Wie in pS1130 bleibt die leichte Kette unter der Kontrolle des phoA-Promotors. Jedoch folgt in pxCD18-7T3 ein λt0-Transkriptionsterminator auf die kodierende Sequenz der leichten Kette. Stromabwärts dieses Terminators wurde der tacII-Promotor hinzugefügt, um die Transkription des Schwere-Kette-Fragments/C-terminalen Leucinzippers zu kontrollieren (DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 80: 21-25 (1983)). Ein zweiter λt0-Transkriptionsterminator folgt auf diese kodierende Sequenz. Stille Kodonvarianten der STII-Signalsequenz wurden verwendet, um die Sekretion beider Ketten zu steuern (Simmons und Yansura, Nature Biotechnology, 14: 629-634 (1996)). Insbesondere wurden die Nukleotide in der STII-Signalsequenz so modifiziert, dass die leichte Kette eine relative TIR-Stärke von 7 und die schwere Kette eine relative TIR-Stärke von 3 aufwies, und die letzten drei Nukleotide der Signalsequenz, die sowohl der leichten als auch der schweren Kette vorausgingen, waren GCT. In diesem Zwei-Promotor-System sind die phoA-Promotorsequenz und die DNA für die leichten und schweren Antikörperketten die gleichen wie in pS1130.
  • pAB3
  • Das Plasmid pAB3 ist dafür entworfen, ein anti-CD18-F(ab')2 in dem Periplasma von E. coli unter der Kontrolle des Alkalische-Phosphatase-Promotors zu exprimieren (Kikuchi et al., Nucleic Acids Res., 9 (21) 5671-5678 (1981)) und weist einen Leucinzipper auf und ist His-getaggt. Die Signalsequenz des hitzestabilen Enterotoxins II (Picken et al., Infect. Immun., 42: 269-275 (1983)) geht den leichten und schweren Ketten voran, und an das C-terminale Ende der schweren Kette ist der GCN4-Leucinzipper aus Hefe fusioniert, gefolgt von sechs Histidinresten. Die kodierenden Sequenzen der leichten und schweren Kette befinden sich in einer polycistronischen Anordnung, wobei der λt0-Transkriptionsterminator (Scholtissek und Grosse, Nucleic Acids Res., 15: 3185 (1987)) auf das Gen der schweren Kette folgt.
  • Das Plasmid pAB3 wurde durch Zusammenligieren von drei DNA-Fragmenten konstruiert, wobei das erste der Vektor pS1130 war, in dem das kleine KpnI-SphI-Fragment entfernt worden war. Der zweite Teil bei der Ligation war ein KpnI-HindIII-Fragment von in etwa 645 Basenpaaren von pS1130. Der Endteil bei der Ligation war eine synthetische DNA-Duplex mit der folgenden Sequenz:
    5'-AGCTTGTCGGGGAGCGCCATCACCATCACCATCACTAAGCATG (SEQ ID Nr: 6)
    ACAGCCCCTCGCGGTAGTGGTAGTGGTAGTGATTC-5' (SEQ ID Nr: 7)
  • pAB21
  • Das Plasmid pAB21 ist ein Derivat von pAB3, in dem die sechs Histidinreste an dem C-terminalen Ende der schweren Kette durch sechs Lysinreste ersetzt wurden. Dieses Plasmid wurde auf eine identische Weise wie pAB3 hergestellt, mit der Ausnahme, dass die synthetische DNA, die bei der Ligation verwendet wurde, die folgende war:
    5'-AGCTTGTCGGGGAGCGCAAAAAGAAAAAGAAAAAGTAAGCATG (SEQ ID Nr.:8)
    ACAGCCCCTCGCGTTTTTCTTTTTCTTTTTCATTC-5' (SEQ ID Nr.:9)
  • 2. Plasmid für die Expression von anti-TF-Fab'2-LZ-6xHis
  • Das Plasmid D3H44-F(ab')2 (auch als pD3h44f2 bekannt), das konstruiert wurde, um die Produktion von anti-Prothrombinase("tissue factor")-Fab'2-Leucinzipper-6xHis zu steuern, besitzt exakt die gleiche Rückgrat-DNA-Sequenz wie pAB3, mit der Ausnahme, dass die variablen Regionen für HC und LC von xCD18-VL/VH zu xTF-VL/VH geändert wurden. Die Konstruktion dieses Plasmids ist in WO 01/70984, veröffentlicht am 27. September 2001, beschrieben.
  • Insbesondere wurde zuerst das Plasmid für die Expression von anti-TF-Fab (D3H44-F(ab)) wie folgt hergestellt: Das Plasmid pEMX1, das für die Mutagenese und Expression von F(ab)s in E. coli verwendet wurde, wurde in Werther et al., J. Immunol., 157: 4986-4995 (1996) beschrieben. Kurz gesagt, enthält das Plasmid ein DNA-Fragment, das eine Konsensus-leichte Kette der humanen Kappa-Untergruppe-I (VLκI-CL), eine Konsensus-schwere Kette der humanen Untergruppe-III (CHIII-CHI) und einen Alkali sche-Phosphatase-Promotor kodiert. Die Verwendung der Konsensussequenzen für VL und VH wurde in Carter et al., Bio/Technology, 10: 163-167 (1992), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285-4289 (1992) beschrieben.
  • Die ortsspezifische Mutagenese (Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 488-492 (1985)) wurde an einer Desoxyuridin-enthaltenden Vorlage von pEMX1 durchgeführt. Die sechs CDRs wurden in die murine D3-Sequenz umgewandelt; die in jeder CDR enthaltenen Reste stammen aus den Sequenz-basierten CDR-Definitionen (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5. Aufl., Public Health Service (National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991)), mit der Ausnahme von CDR-H1, die unter Verwendung einer Kombination von CDR-H1-Definitionen von Kabat et al., supra, und Chothia et al. K, Nature, 342: 877-883 (1989) definiert wurde, d.h. CDR-H1 wurde so definiert, dass sie sich von den Resten H26-H35 in der schweren Kette erstreckt. D3H44-F(ab) kodierte deshalb ein F(ab), das aus einem vollständigen humanen Gerüst (VLκ-Untergruppe I und VH-Untergruppe III) mit den sechs vollständigen murinen CDR-Sequenzen bestand.
  • D3H44-F(ab')2 wurde durch Hinzufügen des Schwere-Kette-Scharniers("hinge") (CPPCPAPELLGG, SEQ ID Nr: 10) an den C-Terminus von D3H44-F(ab), gefolgt von dem GCN4-Leucinzipper und einem (His)6-Tag für die Reinigung erzeugt (siehe die Beschreibung für pAB3, oben, für den Leucinzipper und das Hisx6-Tag).
  • 3. Plasmide für die Expression von anti-VEGF-Fab
  • Yp0317
  • Das Affinitäts-gereifte anti-VEGF-Fab-Protein Y0317 ist in Chen et al., J. Mol. Biol., 293: 865-881 (1999) beschrieben. Für die Konstruktion eines Plasmids für seine Herstellung, pY0317, wurde, kurz gesagt, eine Expressionskassette in das Gerüst des E.-coli-Plasmids pBR322 an der EcoRI-Stelle kloniert (Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 43: 77-90 (1978)). Die Expressionskassette enthielt wenigstens die folgenden Grundbestandteile: (1) phoA-Promotor für die Kontrolle der Transkription; (2) λt0-Terminator, um die Transkription zu beenden, und (3) die Shine-Dalgarno-Sequenz aus dem E.-coli-trp- oder dem hitzestabilen Enterotoxin II(STII)-Gen oder eine Kombination von beiden, um die Translation zu ermöglichen. Die grundlegenden Komponenten von bakteriellen Expressionskassetten sind in der Technik bekannt und wurden zum Beispiel in Kikuchi et al., Nucleic Acids Res., 9(21): 5671-5678 (1981) (für den phoA-Promotor), Scholtissek und Grosse, Nucleic Acids Res., 15: 3185 (1987) (für den λt0-Terminator), Yanofsky et al., Nucleic Acids Res., 9: 6647-6668 (1981) (für trp), Picken et al., Infect. Immun., 42: 269-275 (1983) (für STII) und Chang et al., Gene, 55: 189-196 (1987) (für die gemeinsame Verwendung von trp und der STII-Shine-Dalgarno-Sequenz) beschrieben. Außerdem ging die STII-Signalsequenz oder stille Kodonvarianten davon der kodierenden Sequenz für sowohl die leichten als auch die schweren Ketten in pY0317 voran, um anti-VEGF-Fab herzustellen, und steuerten die Sekretion des Proteins in das Periplasma. Picken et al., Infect. Immun., 42: 269-275 (1983), Simmons und Yansura, Nature Biotechnology, 14: 629-634 (1996). Die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen für die 1952-Basenpaar-Expressionskassette, die für die Herstellung des rekombinanten Proteins in die EcoRI-Stelle insertiert war, sind in der 1 gezeigt (SEQ ID Nr. 1 bzw. 2).
  • RhuFab-V2-Y0317 wurde durch die Humanisierung des murinen monoklonalen Antikörpers A.4.6.1 (Presta et al., Cancer Res., 57: 4593-4599 (1997)) unter Verwendung eines zuvor für andere Antikörper beschriebenen Verfahrens (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89: 4285-4289 (1992), Presta et al., J. Immunol., 151: 2623-2632 (1993), Werther et al., J. Immunol. 157: 4986-4995 (1996)) hergestellt. Kurz gesagt, wurden cDNAs, die die variablen leichten und variablen schweren Ketten von muMAb A.4.6.1 kodierten, unter Verwendung von RT-PCR aus Hybridomzellen isoliert, die den murinen monoklonalen Antikörper produzieren. Diese cDNAs wurden kloniert und an humane CL- und humane CH1-Domänen fusioniert (Werther et al., J. Immunol., 157: 4986-4995 (1996)), wodurch ein Maus-Mensch-chimäres Fab erzeugt wurde. Die sechs Komplementarität-bestimmenden Regionen (CDRs) (in der 1 in Fettdruck angegeben) wurden in einen zuvor humanisierten Antikörpervektor überführrt, der eine humane Konsensus-leichte-Kette der κ-Untergruppe und eine humane Konsensus-schwere-Kette der Untergruppe III kodierte (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285-4289 (1992)). Der Transfer alleine der CDR-Reste in das humane Gerüst verursachte eine 1000fache Verringerung der Bindung an das VEGF-Antigen. Mehrere Gerüstreste nahe den CDRs (in der 1 durch kursive und unterstrichene Schreibweise angegeben) wurden ebenfalls verändert, um die Bindung an das Ziel zu verbessern (Presta et al., Cancer Res., 57: 4593-4599 (1977)). Insgesamt wurden sieben Reste der schweren Kette und ein Rest der leichten Kette außerhalb der CDRs verändert. Die schweren und leichten Ketten wurden dann in einen Phagendisplay-Vektor überführt (Baca et al., J. Biol. Chem., 272: 10678-10684 (1997)), wobei das hGH-Gen durch pHGHam-g3 ersetzt wurde (Bass et al., Proteins, 8: 309-314 (1990)). Die ortsspezifische Mutagenese wurde verwendet, um VL-Met4Leu zu verändern, um die Methioninoxidation zu verhindern und um VH-Thr231Leu zu verändern, um die Klonierung an die GenIII-Fusion zu erleichtern. Dieser Vektor wird Y0101 genannt und wurde als der Ausgangspunkt für die Optimierung der CDRs bei der Bindung an das VEGF-Antigen verwendet (Muller et al., Structure, 6: 1153-1167 (1998)). Es wurde nur bei Mutationen in den CDRs H1 und H3 gefunden, dass sie die Bindung verbesserten, und sie wurden in die Endversion pY0317 eingefügt. Die Veränderungen von dem Plasmid pY0101 zu dem Plasmid pY0317 sind: Thr28Asp, Asn31His, His101Tyr, Ser105Thr. Alle diese Veränderungen befinden sich in der variablen Region der schweren Kette. Das pY0317-Plasmid ist ein Fab-Phagendisplay-Vektor. Ein Plasmiddiagramm dieses Plasmids erscheint in der 2A.
  • pY0317tet20
  • Das Plasmid pY0317tet20 wurde konstruiert, um die Produktion des rhuFab-V-2 in E. coli zu steuern. Die 2A und 2B zeigen ein Flussdiagramm der Plasmidkonstruktion, die mit pY0317 beginnt. Das Plasmid pY0317tet20 ist eine modifizierte Version des gut charakterisierten Plasmids pBR322. Das 639-Basenpaar-AvaI-PvuII-Fragment wurde aus dem pBR322-Teil des Plasmids entfernt. Diese Deletion entfernt das rop-Gen, das an der Kontrolle der Kopienzahl beteiligt ist (Cesareni et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79: 6313-6317 (1982)). Folglich weist das Plasmid eine leicht erhöhte Kopienzahl im Vergleich zu pBR322 auf. Die 1952-Basenpaar-Expressionskassette (1) wurde für die rekombinante Proteinherstellung in die EcoRI-Stelle insertiert. Das Plasmid pY0317tet20 ist sowohl gegenüber Tetracyclin als auch gegenüber β-Lactam-Antibiotika resistent. Die Expressionskassette enthält eine einzige Kopie der leichten Kette und der schweren Kette, die hintereinander angeordnet und miteinander verbunden sind. Die Transkription jedes Gens in eine einzige bicistronische mRNA wird von dem phoA-Promotor von E. coli gesteuert (Chang et al., Gene, 44: 121-125 (1986)). Translations-Initiationssignale für jede Kette werden von E.-coli-STII(hitzestabiles Enterotoxin)-Shine-Dalgarno-Sequenzen bereitgestellt. Die Translation jeder Kette beginnt an einem 23-Rest-STII-Signalpeptid (Picken et al., Infection and Immunity, 42: 269-275 (1983)), das die Translokation des Peptids über die Cytoplasmamembran in den periplasmatischen Raum steuert. Das STII-Signalpeptid wird dann von einer E.-coli-Leaderpeptidase entfernt. Die leichten und schweren Ketten falten sich nach der Sekretion in das Periplasma in ihren nativen Konformationen und werden durch eine intermolekulare Disulfidbindung kovalent miteinander verbunden.
  • Die Tetracyclinresistenz wurde durch Modifikationen von pY0317 in den endgültigen Vektor eingefügt (siehe die 2A und 2B). Ein 3642-Basenpaar-SapI/ApaI-Fragment von pY0317, das den Replikationsursprung von pBR322, das β-Lactamasegen, den phoA-Promotor, die gesamte leichte Kette und die aminoterminale Hälfte der schweren Kette (VH) enthält, wurde an ein 2738-Basenpaar-SapI/ApaI-Fragment von p6G4V11N35A.PEG ligiert. Dieses zweite Fragment enthält die CH1-Region der schweren Kette und das Tetracyclin-Resistenzgen von pBR322. Dieses Fragment enthält auch vier zusätzliche Aminosäuren an dem Carboxylterminus der schweren Kette zur ortsspezifischen Modifizierung des Proteins. Die Region, die die vier zusätzlichen Reste enthält, und die CH1-Region wurden durch eine BssHII/HpaI-Spaltung entfernt und durch das BssHII/XbaI-Fragment von pY0317 ersetzt, wodurch die ursprüngliche Sequenz der schweren Kette wiederhergestellt und die ortsspezifische Modifizierungsregion deletiert wurde. Die XbaI-Spaltung wurde zuerst durchgeführt, und der Überhang wurde mit Klenow und Desoxynukleotiden aufgefüllt. Dem folgte die BssHII-Spaltungs-Gelreinigung des 433-Basenpaar-Fragments. Eine abschließende Manipulation des Plasmids wurde durchgeführt, indem das NheI-bis-NdeI-Fragment von pBR322 durch ein NheI/NdeI-Fragment von pBR322, das eine 639-Basenpaar-AvaI-PvuII-Deletion enthielt, ersetzt wurde. Das endgültige Plasmid pY0317tet20 ist resistent gegenüber Tetracyclin und β-Lactam-Antibiotika, und enthält den phoA-Promotor und die Gene, die für die leichten und schweren Ketten von anti-VEGF kodieren.
  • 4. Plasmid für die Expression von Apo2L
  • pAPApo2-P2RU ist in WO 01/00832, veröffentlicht am 4. Januar 2001, beschrieben. Kurz gesagt, kodiert dieses Plasmid, dessen Konstruktion in der 3 gezeigt ist, die Koexpression von Apo-2L (Aminosäurereste 114-281) und der von pro2 und argU kodierten tRNAs, wobei die Koexpression von dem alkalische-Phosphatase-Promotor reguliert wird. Das auf pBR322 basierende Plasmid pAPApo2-P2RU (Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 43: 77-90 (1978)) wurde verwendet, um das Apo-2L in E. coli herzustellen. Die für die Expression von Apo-2L erforderlichen transkriptionellen und translationellen Sequenzen werden von dem alkalische-Phosphatase-Promotor und der trp-Shine-Dalgarno, wie für das Plasmid phGH1 beschrieben (Chang et al., Gene, 55: 189-196 (1987)), bereitgestellt. Die kodierende Sequenz für Apo-2L (von 114-281) ist stromabwärts des Promotors und der Shine-Dalgarno-Sequenzen angeordnet, und ihr geht ein Initiations-Metheonin voran. Die kodierende Sequenz schließt Nukleotide ein (in der 4 gezeigt), die die Reste 114-281 von Apo-2L kodieren (4 (SEQ ID Nr. 3 bzw. 4 für die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen)), mit der Ausnahme, dass das Kodon, das den Rest Pro119 kodiert, zu „CCG" anstelle von „CCT" verändert ist, um eine potentielle Sekundärstruktur zu beseitigen. Die Sequenz, die den Lambda-t0-Transkriptionsterminator kodiert (Scholtissek et al., Nucleic Acids Res., 15: 3185 (1987)) folgt der kodierenden Sequenz von Apo-2L.
  • Außerdem schließt dieses Plasmid Sequenzen für die Expression der pro2-tRNAs (Komine et al., J. Mol. Biol., 212: 579-598 (1990)) und von argU/dnaY (Garcia et al., Cell, 45: 453-459 (1986)) ein. Diese Gene wurden mittels PCR aus E. coli W3110 kloniert und stromabwärts der Lambda-t0-Transkriptionsterminatorsequenz angeordnet. Dieses Plasmid verleiht dem Produktionswirt sowohl Resistenz gegenüber Tetracyclin als auch gegenüber Ampicillin.
  • B. Zelltransformationen
  • Kompetente Zellen des entsprechenden Stamms wurden hergestellt und mit dem passenden Plasmid unter Verwendung von Standardverfahren transformiert, und erfolgreiche Transformanten wurden selektiert und in Kultur wachsen gelassen. Bei Plasmiden, die gegenüber Tetracyclin resistent waren, wurden die Transformanten von LB-Platten gepickt, die 20 μg/ml Tetracyclin (LB+Tet20) enthielten, durch Ausstreichen gereinigt und in LB-Brühe mit 20 μg/ml Tetracyclin in einem 30-°C-Schüttler/Inkubator wachsen gelassen, bevor sie in DMSO bei –80 °C aufbewahrt wurden.
  • In dem Fall der Plasmide pxCD18-7T3 und pcyc34 wurde ein zusätzliches Plasmid, pMS421, gemeinsam mit pxCD18-7T3 oder pcyc34 kotransformiert. pMS421 ist ein auf pSC101 basierendes Plasmid, das den lacIq-Suppressor überexprimiert, der die Induktion des tacII-Promotors unterdrückt, bis IPTG zugegeben wurde, um ihn zu entsupprimieren, und das außerdem Resistenz gegenüber Spectinomycin und Streptomycin verleiht. Dieses Plasmid liefert zusätzliche Kopien des chromosomalen lacIq-Gens unter der Kontrolle von dessem eigenem Promtors aus einem lacIq-Stamm, wobei das Gen in das kompatible Plasmid pSC101 eingefügt ist.
  • C. Antikörperextraktion
  • Die lösliche Fraktion von E-coli-Zellen wurde hergestellt, indem ein 20-OD-ml-Sediment in 500 μl 200 mM TRIS-HCl (pH 8,0) mit 20 μl 0,1 M EDTA (pH 8,0) und 10 μl Lysozym (6 mg/ml) suspendiert wurde. Die Mischung wurde gevortext, durch 7–10 Impulse mit Ultraschall behandelt, dann bei 15.000 upm für 15 Minuten bei 4 °C zentrifugiert. Die Überstandsfraktion nach der Zentrifugation wird der Hochsalzextrakt (HSE) genannt. Das verbleibende Sediment wurde für die Analyse der unlöslichen Fraktion verwendet.
  • D. Proteinidentifizierung
  • Die eindimensionale SDS-PAGE-Gelelektrophorese wurde in einem 4–12% linearen Acrylamidgradienten von Novex durchgeführt. Insbesondere wurde das NOVEX®-NuPageTM-System verwendet, das aus vorgefertigten NuPAGE-Bis-TRIS-Gelen (für Proteine mit niedrigem bis mittlerem Molekulargewicht) besteht.
  • Die zweidimensionale Gelelektrophorese wurde, wie von Champion et al., Electrophoresis, 20 (4-5): 994-1000 (1999)) beschrieben, mit immobilisierten pH-Gradienten (pH 3–10) in der ersten Dimension und einem linearen Acrylamidgradienten (9–18 % T) in der zweiten Dimension, die von Amersham Pharmacia Biotech gekauft wurden, durchgeführt. Die Proteinidentifizierung wurde unter Verwendung einer Kombination einer Silber/Coomassie-Färbung, NH2-terminaler Sequenzierung und massenspektormetrischer Analyse bestimmt. Für analytische Gele wurden die E.-coli-Zelllysate (~40 μg Protein) wie von Champion et al., supra, beschrieben, mit Rehydratisierungslösung zusammengegeben. 18-cm-Gelstreifen eines nicht-linearen, immobilisierten pH-Gradienten (IPG) mit pH 3–10 (Amersham Pharmacia Biotech) wurden für die isoelektrische Fokussierung bis zu einem Gesamtbetrag von 50.000 VStd verwendet.
  • Präparativ beladene Gele wurden auf Polyvinylidendifluorid(PVDF)-Membranen (ProBlott; Applied Biosystems), wie von dem Hersteller beschrieben, geblottet. Die NH2-terminale Sequenzierung wurde unter Verwendung eines 20-minütigen Edman-Zyklus und eines Horizontalflussreaktors für mehrere Proben für die Sequenzanalyse der PVDF-elektrogeblotteten Proteine durchgeführt (Henzel et al., Analytical Biochemistry, 267: 148-160 (1999)). Das Molekulargewicht der für die leichte Kette spezifischen Flecken wurde mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie und Kapillar-LC-MS von Proben, die aus Gelen eluiert waren, durchgeführt (Champion et al., supra):
  • E. Messung der Zielproteinspezies
  • Der AME5TM-Umkehrphasen-Doppelsäulen-Test (AME5TM/RP-Doppelsäulentest) wurde, wie unten beschrieben, für die Titerbestimmung von anti-CD18-F(ab')2-LZ verwendet.
  • F. AME5TM/RP-Doppelsäulen-Test
  • 1. Geräte und Ausrüstung
  • Eine INTEGRALTM-Workstation (von PerSeptive Biosystems) wurde in der Doppelsäulen-Gradientenkonfiguration eingerichtet. Eine Affinitätssäule, die einen antileichte-Kette(Kappa)-Fab-Antikörper enthielt (AME5TM), der auf Glas mit definierten Poren (CPG) immobilisiert war, wurde verwendet, um das Zielprotein zu fangen. Eine Umkehrphasensäule, Temperatur bei 60 °C geregelt, wurde verwendet, um die gefangenen Antikörperspezies weiter aufzulösen. Aktiviertes Aldehyd-Immunaffinitätsharz (AL-20), Umkehrphasen-POROS-Harze (R220) und Säulenpackmittel wurden von PerSeptive Biosystems (Cambridge, MA, USA) bezogen. CPG-Empty-PEEK-Säulen, 30 × 2,1 mm (100 μl), wurden von Upchurch Scientific (Oak Harbor, WA, USA) gekauft. E-coli-Proben wurden unter Verwendung von 5-Micron-ACRODISCTM-PF-Spritzenfiltern (von Gelman Sciences) filtriert.
  • 2. Reinigung von AME5TM-anti-humanes-Kappa-FAb-(His-Gly)4-His-(Lys)
  • Phosphat-gepufferte Saline, pH 7,2 (PBS), die 9,4 mM Natriumphosphat, 136,9 mM Natriumchlorid und 2,7 mM Kaliumchlorid enthält, wird hierin als Auftragspuffer bezeichnet. Monoklonale Antikörper wurden von einem murinen Fab, AME5TM-anti-humanes-Kappa-FAb-(His-Gly)4-His-(Lys)3, erhalten, das aus E-coli-Masse gereinigt wurde und für die vorliegenden Zwecke AME5TM-FAb-hgk genannt wird. Die E.-coli-Masse wurde aus einer 10-Liter-Fermentation von 27C7-Zellen erhalten. Ein Microfluidizer wurde verwendet, um die Zellen nach der Suspendierung in 20 mM Natriumphosphat, 0,25 M Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 2 mM Immidazol bei pH 7,0 zu homogenisieren. Der E.-coli-Extrakt wurde durch Zugabe von 0,2 % Polyethylenimin (PEI) geklärt und zentrifugiert. Der geklärte Extrakt wurde unter Verwendung einer Kombination von Innenaustausch- und immobilisierte-Metallionen-Chelatbildungs(IMAC)-Chromatographie-Schritten gereinigt. Die chelatbildenden SEPHAROSE-FAST-FLOWTM- und SP-SEPHAROSE-FAST-FLOWTM-Harze stammen von Amersham Pharmacia.
  • 3. Immobilisierung von AME5TM-FAb-hgk an aktiviertes, Glyceryl-beschichtetes CPG
  • Das gereinigte Fab wurde auf Periodat-aktiviertem, Glyceryl-beschichtetem Glass mit definierten Poren (CPG) immobilisiert, um das affinitätsharz herzustellen. Der AME5TM-Fab-hgk-Antikörper wurde unter Verwendung einer Abwandlung des Verfahrens von Roy et al. J. Chromatography, 303: 225-228 (1984) auf aktiviertem, Glyceryl-beschichtetem CPG immobilisiert.
  • Trockenes CPG wurde mit gereinigtem Wasser befeuchtet, in eine Chromatographiesäule gepackt und für 30 Minuten aktiviert, indem 1 % Natriummetaperiodat (Sigma S-1878TM) durch die Säule rezirkuliert wurde. Das aktivierte Harz wurde dann in 20 mM Natriumphosphat, 0,15 M Natriumchlorid, pH 7,2 (Kopplungspuffer) gewaschen.
  • AME5TM-FAb-hgk-Antikörper mit einer Konzentration von in etwa 5 mg/ml in Kopplungspuffer, der 1 λg/ml (1 :g/ml) des Reduktionsmittels Natriumcyanborhydrid (Sigma S8628) enthielt, wurde durch das aktivierte Harzbett rezirkuliert. Die Kopplung des Antikörpers an das Harz wurde durch die Abnahme der Absorption bei 280 nm überwacht. Sobald keine weitere Abnahme der Absorption erfolgte, wurde jeglicher möglicherweise übrig gebliebener Antikörper mit Kopplungspuffer ausgewaschen und gewonnen. Die Kopplungsdichte wurde als die Differenz zwischen der Ausgangsmenge und der gewonnenen Menge nach dem Abschluss der Reaktion bestimmt und wird in mg FAb pro ml Harz angegeben.
  • Sämtliche möglicherweise verbliebenen aktiven Stellen auf dem Harz wurden dann durch Rezirkulieren von 1 M Ethanolamin, pH 8,0, (ICN, Katalog-Nr. 151078) in der Gegenwart von 1 λg/ml (1 :g/ml) Natriumcyanborhydrid für 2 Stunden zur Reaktion gebracht. Das Harz wurde dann für die Lagerung in Kopplungspuffer, der 0,01 % Thimerosal (GDL International) enthielt, gewaschen. Vor dem Auftrag von Protein wurde das Harz dreimal einer Vorbehandlung mit einem Wechsel zwischen den zu verwendenden Äquilibrierungs- und Eluierungspuffern unterzogen.
  • 4. Reagenzien und Testverfahren
  • Die Lösungsmittelreservoirs waren: Lösungsmittel 1A, Affinitäts-Auftragspuffer; Lösungsmittel 1B, wässriger Umkehrphasenpuffer und Affinitäts-Eluierungspuffer, 0,1 % TFA in Wasser, Lösungsmittel 2A, Wasser. Lösungsmittel 2B, organischer Umkehrphasen-Eluierungspuffer, 0,09 % TFA/80 % Acetonitril. 50 μl E-coli-HSEs (1:2 verdünnt) oder der Überstand der Fermentationsbrühe in Auftragspuffer wurden injiziert. Alle Formen von anti-CD-18, die in Fermentationszellextrakten gefunden wurden, wurden von diesem AME5TM-Antikörper gebunden, wie durch den Vergleich von 2-D-Gelen eines Leer-Laufs, eines Produktionslaufs und des Affinitäts-gefangenen (AME5TM-) Materials aus einem Produktionslauf bestimmt wurde. Nachdem die unspezifische Adsorption verringert worden war (durch Waschen mit PBS) wurde die Affinitätssäule in einer In-line-Anordnung mit einer Umkehrphasen-Säule angeordnet, und die gefangenen Bestandteile wurden durch Eluieren mit verdünnter Säure transferiert. Diese Bestandteile wurden nachfolgend durch Eluieren der Umkehrphasen-Säule mit einem flachen Acetonitrilgradienten aufgelöst. Der Nachweis wurde durch Messung der dekadischen Extinktion bei 280 nm durchgeführt, und der intakte Antikörper wurde durch Vergleich der Scheitelpunktsflächen von ähnlich behandelten Standards quantifiziert.
  • G. Chromatgramm-Scheitelpunktidentifizierung
  • Dieser Test löste anti-CD18-Fragmente in fünf Scheitelpunkte auf, die mit Antikörper im Zusammenhang stehen, die die folgenden Antikörperfragmente repräsentieren:
    • Scheitelpunkt 1: LC-115 (115-Aminosäuren-Abbauprodukt der leichten Kette Kappa)
    • Scheitelpunkt 2: nicht-assemblierte, freie leichte Kette und glutathionierte leichte Kette
    • Scheitelpunkt 3: Dimer der leichten Kette
    • Scheitelpunkt 4: das Fab-ähnliche Fragment
    • Scheitelpunkt 5: das Fab'2-LZ- oder Fab'2-Fragment
  • Ein gereinigtes Material mit dem Großteil des freigesetzten anti-CD18-Fab'2 (5 mg/ml) wurde als der Standard verwendet. Ein E-coli-Extrakt, der aus einer Fermentation mit hoher Zelldichte von 49A5/pS1130 gewonnen wurde, wurde bei –70 °C eingefroren und als die positive Kontrolle verwendet. Bei allen verglichenen Proben wurde eine gleiche Zellmasse aufgetragen.
  • H. Gesamt-HC/LC-POROSTM-Umkehrphasen-Test
  • Um die Gesamtmenge an Fragmenten der leichten Kette und der schweren Kette zu bestimmen, die bei den Fermentationen hergestellt wurden, wurde ein alternativer Umkehrphasen-HPLC-Test (RP-HPLC) verwendet. Für die Gesamt-Antikörperexpression wurden zu 100 μl Gesamtbrühe 100 μl 0,2 M TRISpH 8,0 zugegeben. Nach Ultraschallbehandlung für 10 Impulse wurden 650 μl Guanidinium-HCl/50 mM TRIS, pH 9, und 50 μl 2 M DTT zugegeben und bei Raumtemperatur für 15 Minuten inkubiert. Vor dem Laden auf die Säule wurden 200 μl Acetonitril zugegeben und durch eine Größenausschluss-Zentrifugationssäule (Pharmacia) filtriert. 5 μl dieser Suspension wurden mittels des POROSTM-Umkehrphasen-Tests analysiert.
  • Für die Umkehrphasen-Methode wurde eine HEWLETT-PACKARDTM-1100-HPLC mit einer Perseptive-POROSTM-R-1-Umkehrphasen-Säule verwendet. Die Analysen wurden durchgeführt, wobei die Säule auf 60 °C erhitzt wurde, und die dekadische UV-Extinktion bei 278 nm wurde überwacht. Die Säule wurde in einer 28%igen Acetonitrillösung in Wasser mit 0,1 % Trifluoressigsäure äquilibriert. 25 μl pro Probe wur den als Nächstes auf die Säule geladen, und die Eluierung wurde unter Verwendung eines linearen Gradienten von 28 % bis 38 % Acetonitril während 28 Minuten, gefolgt von einem 17-minütigen Regenerierungsintervall bei 95 % Acetonitril und einer Reäquilibrierung bei 28 % Acetonitril durchgeführt. Scheitelpunkte für Spezies, die im Zusammenhang mit der leichten Kette und der schweren Kette standen, wurden durch Vergleich mit Standards und durch eine Analyse unter Verwendung eines HEWLETT-PACKARDTM-Massenselektions-Detektors zur Bestätigung identifiziert. Fermentationsproben aus einem Leer-Lauf, in dem der gleiche Wirt mit der Ausnahme eines Plasmids, das die Sequenzen für die schwere und leichte Kette nicht enthielt, verwendet wurde, wurden auf ähnliche Weise hergestellt und analysiert, um die passenden Basislinien für die Analysen zu bestimmen. Die Integration der Scheitelpunktflächen wurde unter Verwendung der HEWLETT-PACKARDTM 1100-Software durchgeführt, und die Standards wurden in Proben von Leer-Läufen eingeführt, um eine Kalibrierungskurve zu erzeugen, um die relative Menge der verschiedenen Spezies in der Probe zu bestimmen.
  • Für die löslichen Proben wurden Lysate wie für den Ionenaustausch-Test hergestellt. Typischerweise wurden 100 μl Probe mit 650 μl 6 M Guanidinium-HCl, 50 mM TRIS-HCl, pH 9, verdünnt. 50 μl 2 M Dithiothreitol (frisch aufgetaut) wurden dann zugegeben, gefolgt von 200 μl Acetonitril, gefolgt von einer Filtration mit einem 0,2-μm-Filter vor dem Auftrag auf die HPLC.
  • Die unlöslichen Lysatproben wurden auch auf ähnliche Weise analysiert, indem die mit PBS gewaschenen, unlöslichen Sedimente, die nach der Zellextraktion erhalten wurden, in 100 μl 0,2 M TRISpH 8,0 resuspendiert und gut gemischt wurden. Dann wurden 650 μl 6 M Guanidinium-HCl/50 mM TRIS-HCl, pH 9,50 μl 2 M DTT und 200 μl Acetonitril zugegeben. Die Proben wurden dann filtriert, und 10 μl der filtrierten Proben wurden unter Verwendung des gleichen Verfahrens wie für die löslichen Lysatproben analysiert.
  • I. CSX-Test
  • Die Spaltung des anti-CD18-Fab'2-LZ wurde mittels HPLC-Kationenaustauschchromatographie analysiert. Insbesondere wurden die Proben wenigstens 1:1 verdünnt, und 200 μl wurden auf eine BAKERBONDJTM-Carboxysulfon(CsX)-50x4,6-mm-Säule aufgetragen (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ), die in einem Hewlett-Packard-1090-HPLC-System bei 55 °C unterhalten wurde. Die Proben wurden unter Verwendung eines Gradienten von in etwa 5 bis 50 mM Natrium phosphat (pH 7,0) während 14 Minuten eluiert, und die Scheitelpunkte wurden unter Verwendung der dekadischen UV-Extinktion bei 278 nm überwacht. Der Scheitelpunkt, der den anti-CD18-Fab'2-Leucinzipper enthielt, wurde identifiziert und durch Vergleich mit gereinigten Standards quantifiziert.
  • J. Zelllinien-Konstruktionen
  • Die Wirte, die in der rhuFab'2-LZ(xCD18)-Fermentation verwendet wurden, sind Derivate von E. coli W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, Bd. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), S. 1190-1219) und werden wie folgt bezeichnet: 49A5, 58B3, 59A7, 43H1, 58H2, 45F8, 41H1 und 33D3. Die 5 zeigt ein Diagramm der Ableitung der E-coli-Stämme 59A7, 49A5 und 43H1.
  • 1. Stamm 49A5
  • Der vollständige Genotyp von 49A5 ist ΔfhuA phoA ΔE15Δ (argF-lac)169 deoC2 degP41(Δpst1-Kanr)IN(rrD-rrE)1 ilvG2096 (Valr) ΔfucP ΔmalE. Der Ausgangsstamm, E. coli W3110, ist ein Derivat von E. coli K-12, das F'- und Lambda-minus ist. Es wurde gezeigt, dass er eine Inversion des Chromosoms zwischen rrnD und rrnE trägt (Bachmann, supra; Hill und Harnish, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 7069-7072 (1981)). Das fhuA-Gen (früher als tonA bezeichnet) wurde aus W3110 durch ungenaue Exzision von Tn10 nach dessen Insertion in das fhuA-Gen deletiert. Der resultierende Stamm, 1A2, ist resistent gegenüber den Bakteriophage T1, T5 und ø80.
  • Die beiden Deletionsmutationen, phoA ΔE15 (Sarthy A. et al., J. Bacteriol., 145: 288-292 (1981)) und Δ(arg-lac)169 (Schweizer et al., Mol. Gen. Genet., 192: 293-294 (1983)), wurden gleichzeitig in den Stamm 1A2 durch P1-Kotransduktion mit einer gekoppelten Tn5-Insertion in das proC-Gen eingeführt. Die präzise Exzision des Transposons stellte das proC-Gen wieder her. Die Mutation phoA ΔE15 beseitigt die Expression der Alkalischen Phosphatase, und die Mutation Δ(argF-lac)169 ist für den lac–-Phänotyp dieses Stamms, der als 7C1 bezeichnet wird, verantwortlich.
  • Die Mutation deoC2, die die Expression der Desoxyribosephosphat-Aldolase beseitigte, wurde durch die P1-Kotransduktion eingeführt. Der deoC-Locus ist genetisch an den Threonin-Biosynthese-Locus gekoppelt. Eine Threonin-Auxotrophe wurde durch Tn10-Insertion und ungenaue Exzision erzeugt. Diese Threonin-Auxotrophe wurde dann mit dem P1-Phagen, der auf einer deoC2-Mutante gezogen war, zur Threonin-Prototrophen transduziert. Die Anwesenheit der deoC2-Mutation wurde durch die Un fähigkeit des resultierenden Stamms, 16C9, auf 0,2 % Thymidin als einer Kohlenstoffquelle zu wachsen, bestätigt.
  • Die degP41(ΔPst1-Kannr)-Mutation, eine Mutation in dem Gen für eine periplasmatische Protease, wurde durch Transduktion eingeführt. Diese Mutation wurde in vitro konstruiert, indem ein Abschnitt des degP-Gens durch ein Kanamycin-Resistenzgen ersetzt wurde (Strauch und Beckwith, J. Bacteriol., 171: 2689-2696 (1989)). Dieses ist kein Transposon, aber erlaubt die Selektion der Deletion unter Verwendung der Kanamycinresistenz. Der resultierende Stamm wird als 23E3 bezeichnet.
  • Die Mutation ilvG2096 (Valr) (Lawther et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 922-925 (1981)) wurde durch Homogenotisierung eingeführt. Diese Mutation repariert eine Leserahmenverschiebung, die verursacht, dass der Wildtyp E. coli K-12 gegenüber Valin empfindlich ist. Der Stamm 23E3 wurde mit dem Plasmid pAH29 (Lawther et al., supra) transformiert, das den Marker ilvG2096 (Valr) und ein Ampicillin-Resistenzgen enthält. Ein als 33B6 bezeichneter Stamm, der das Plasmid spontan verloren hatte, und der das gewünschte Allel erworben hatte, wurde durch Screenen von Ampicillin-empfindlichen Klonen auf Valinresistenz identifiziert.
  • Schließlich wurden zwei Mutationen in dem Stoffwechselweg für die Kohlenhydrat-Nutzung eingeführt, um diesen Wirt, von anderen rekombinanten Wirten durch einen einfachen Kohlenhydrat-Nutzungstest unterscheiden zu können. Deletionsmutationen von fucP und malE wurden mittels PCR konstruiert und wurden unabhängig voneinander in einen Plasmidvektor eingefügt, der die beta-Lactamase und die Levansucrase enthielt (Bass et al., supra). Jedes vollständige Plasmid wurde in das Chromosom eines W3110-Derivats rekombiniert, das die unabhängige Replikation des Vektorplasmids nicht unterstützte (Bass et al., supra). Der Stamm 33B6 wurde dann mit dem P1-Phagen, der auf dem W3110-Derivat gewachsen war, das das fucP-Deletionsplasmid in integrierter Form in seinem Chromosom trug, zur Carbenicillinresistenz transduziert. Derivate, die die Levansucrase nicht länger exprimierten und deshalb gegenüber Saccharose resistent waren, wurden selektiert und auf den Verlust der Carbenicillinresistenz und die Unfähigkeit, Fucose zu verwenden, gescreent. Es wurde unter Verwendung von PCR bestätigt, dass der resultierende Stamm, 49B2, die geplante fucP-Deletion trug.
  • Diese Schritte wurden wiederholt, um die malE-Deletion einzuführen. Der Stamm 49B2 wurde unter Verwendung des P1-Phagen, der auf dem Stamm gewachsen war, der das malE-Deltionsplasmid in integrierter Form in seinem Chromosom trug, zur Carbenicillinresistenz transduziert. Dann wurden Saccharose-resistente Derivate selektiert und auf den Verlust der Carbenicilllinresistenz und die Unfähigkeit, Maltose zu verwenden, gescreent, und die Anwesenheit der malE-Deletion wurde mittels PCR bestätigt.
  • Die wichtigen Merkmale des Stamms 49A5 schließen die folgenden ein:
    • • Er ist resistent gegenüber dem T1-Phagen.
    • • Er führt keine Überproduktion der alkalischen Phosphatase durch, wenn das Phosphat depletiert wird (welches die Bedingung ist, die verwendet wird, um die Produktsynthese zu induzieren).
    • • Ihm fehlt eine Protease.
    • • Er ist gegenüber der Toxizität von Valin nicht empfindlich.
    • • Er kann von anderen Wirten durch einen Kohlenhydrat-Nutzungstest unterschieden werden.
  • 2. Stamm 58B3
  • Der Stamm 58B3 wurde ebenfalls von dem 33B6-Stamm abgeleitet. Der Genotyp Δprc::pS1080 (Bass et al., supra; Metcalf et al., Gene, 138: 1-7 (1994)) wurde in ein kans-Derivat des Stamms 33B6 (56G4) mittels P1-Transduktion eingeführt, wobei auf Kolonien selektiert wurde, die auf LB mit halber Stärke mit niedrigem Salz bei 42 °C nicht gut wuchsen. Der kans-Stamm trägt die degP-Deletion, die von pKS16 abgeleitet ist (Strauch und Beckwith, 1989, supra), was zu einem Kanamycin-empfindlichen Phänotyp führt. Deshalb ist der 58B3-Stamm ein kans-Stamm, der sowohl die degP- als auch die prc-Deletion trägt.
  • Der vollständige Genotyp des Stamms 58B3 ist W3110 ΔfhuA phoAΔE15 Δ(argF-lac)169 deoC degP41 IN(rrD-rrE)1 Kans ilvG2096(Valr) Δprc.
  • 3. Stamm 59A7
  • Dieser Stamm wird konstruiert, indem der Prc-Suppressor (Spr-Mutante) in den 58B3-Stamm eingeführt wird. Das P1-Phagenlysat des Stamms 51B9 (tonA prc prc sup zeg722::Tn10) wurde in den 58B3-Stamm transduziert, indem auf Tet-resistente Kolonien selektiert und auf den Prc-Suppressorphänotyp gescreent wurde (gutes Wachstum auf LB mit halber Stärke mit niedrigem Salz bei 42 °C). Der neue Stamm wird 58F1 genannt. Die Δprc-Mutante kann bei 42 °C nicht überleben. Das Tetracyclin-Resistenzgen wurde durch Plattieren auf Malloy-Platten aus 58F1 entfernt, was zu ei nem tets-empfindlichen Stamm führte, der 59A7 genannt wurde. Der vollständige Genotyp des Stamms 59A7 ist W3110 ΔfhuA phoAΔE15 Δ(argF-lac)169 deoC degP41 IN(rrD-rrE)1 Kans ilvG2096(Valr) Δprc sprW148R.
  • Der ursprüngliche Stamm 51B9 weist einen Prc-Suppressor Spr auf, der eine Punktmutation W148R trug, die die gleiche wie Spr in den Stämmen 43H1 und 59A7 ist.
  • 4. Stamm 43H1
  • Der vollständige Genotyp des Stamms 43H1 ist sehr ähnlich zu demjenigen von 49A5: W3110 ΔfhuA phoAΔE15(argF-lac)169 degP41(ΔpstI-Kanr) IN(rrD-rrE)1 ilvG2096 (Valr) ptr3 ΔompT prc::kanr sprW148R. Er trägt im Vergleich zu 49A5 drei weitere Proteasemarker, Ptr3, OmpT und Prc. Dieser Stamm weist die Punktmutation (W148R) in Spr auf. Er ist Kanr.
  • 5. Stamm 58H2
  • Der Stamm 43H1 wurde mit dem P1-Phagen, der auf dem Stamm 42E3 gewachsen war, zur tetr transduziert. Dieser Stamm (58F9) wurde bezüglich der prc::kanr-Mutation repariert; deshalb wurde er kans. Dieser Stamm wurde dann auf Minimal-Glucuronsäuremedium plattiert, um das eda::Tn10 zu entfernen. Der erzeugte neue Stamm, 58H2, ist kans und wurde eine Dreifach-Proteasemutante mit dem Wildtyp-prc. Der vollständige Genotyp des Stamms 58H2 ist W3110 ΔfhuA phoAΔE15 Δ(argF-lac)169 degP41(ΔpstI-Kanr) IN(rrD-rrE)1 ilvG2096(Valr)ptr3 ΔompT sprW148R.
  • 6. Stamm 45F8
  • Der vollständige Genotyp des Stamms 45F8 ist W3110 ΔfhuA Δ(argF-lac)169 degP41 Kans ΔompT ptr3 ilvG2096(Valr) phoS*(T104). Dies ist ein phoS-Stamm mit dreifachen Proteasemarkern.
  • 7. Stamm 41H1
  • Der vollständige Genotyp des Stamms 41H1 ist W3110 ΔfhuA phoS*(T104) Δ(argF-lac)169 degP41 (Δpst1-Kanr) ptr3 ilvG2096(Valr), der bei 37 °C T-adaptiert ist. Dies ist ein phoS-Stamm mit doppelten Proteasemarkern.
  • B. Stamm 33D3
  • Der vollständige Genotyp des Stamms 33D3 ist W3110 ΔfhuA ptr3 lacIq lacL8 ΔompT degP41 (ΔpstI-kanR). Eine Beschreibung der Konstruktion kann z. B. in US-Pat. Nr. 5,789,199 gefunden werden.
  • K. Schüttelflaschen- und Fermentationskulturen
  • Für das Schüttelflaschenexperiment wurden Luria-Bertani(LB)-Brühe und C.R.A.P.-Minimalmedium mit 5 μg/ml des AMPICILLINETM-Antibiotikums verwendet. Das C.R.A.P.-Minimalmedium wurde wie folgt zubereitet: 3,57 g (NH4)2SO4, 0,71 g Na-Citrat-2H2O, 1,07 g KCl, 5,36 g Hefeextrakt und 5,36 g HYCASE SF-SHEFFIELDTM wurden gemischt, der pH wurde mit KOH auf 7,3 eingestellt, und das Volumen wurde mit entionisiertem Wasser auf 872 ml angepasst. Dieses Gemisch wurde dann autoklaviert und auf 55 °C abgekühlt. 110 ml 1M MOPS-Puffer mit pH 7,3, 11 ml 50 %ige Glucose und 7,0 ml 1 M MgSO4 wurden zugegeben.
  • Das hierin verwendete E-coli-Fermentationsverfahren war ein wie oben definiertes Verfahren mit hoher Zelldichte. Um höhere Zelldichten zu erreichen, wurde kontinuierlich Ammoniak zugegeben, und zusätzliche Nebennährstoffe (P, K, S und Mg) wurden an bestimmten Stadien der Fermentation zugegeben, um das Zellwachstum zu unterstützen. Die Verringerung der Menge von Nährstoffen führte zu einem weiteren Verfahren, das eine geringere endgültige optische Dichte der Brühe bei der gleichen Qualität des Produkts aufwies, das hierin als Verfahren mit niedriger Zelldichte bezeichnet wird.
  • Ein einzelnes Röhrchen, das 1,5 ml Kultur in 10–15 % DMSO enthielt, wurde in eine 1-l-Schüttelflasche aufgetaut, die 500 ml LB-Medium enthielt, das mit 0,5 ml Tetracyclinlösung (5 mg/ml) und 2,5 ml 1 M Natriumphosphat-Lösung supplementiert war. Diese Saatkultur wurde für in etwa 16 Stunden bei 30 °C wachsen gelassen und dann verwendet, um einen 10-l-Fermenter zu inokulieren.
  • Der Fermenter startete anfänglich mit in etwa 6,5 l Medium, das in etwa 4,4 g Glucose, 100 ml 1 M Magnesiumsulfat, 10 ml einer Spurenelementlösung (100 ml Salzsäure, 27 g Eisen-(III)-chlorid-Hexahydrat, 8 g Zinksulfat-Heptahydrat, 7 g Kobaltchlorid-Hexahydrat, 7 g Natriummolybdat-Dihydrat, 8 g Kupfersulfat-Pentahydrat, 2 g Borsäure und 5 g Mangansulfat-Monohydrat in einem Endvolumen von 1 l), 20 ml einer Tetracyclinlösung (5 mg/ml in Ethanol), 10 ml FERMAX ADJUVANT 27TM (oder irgendein gleichwirkendes Antischaummittel), einen Beutel HCD-Salze (37,5 g Ammo niumsulfat, 19,5 g dibasisches Kaliumphosphat, 9,75 g monobasisches Natriumphosphat-Dihydrat, 7,5 g Natriumcitrat-Dihydrat und 11,3 g monobasisches Kaliumphosphat) und 200 g NZ Amine A (ein Proteinhydrolysat) enthielt. Die Fermentationen wurden bei 30 °C mit 10 slpm Luftfluss durchgeführt und bei einem pH von 7,0 ± 0,2 reguliert (obwohl in einigen Fällen gelegentlich Abweichungen außerhalb dieses Bereichs vorkamen). Der Gegendruck des Fermenters und die Rührgeschwindigkeit wurden variiert, um die Sauerstoff-Transferrate in dem Fermenter zu manipulieren und folglich die zelluläre Atmungsrate zu kontrollieren.
  • Nach der Inokulation des Fermenters mit dem Zell-enthaltenden Medium aus der Schüttelflasche wurde die Kultur in dem Fermenter bis zu hohen Zelldichten wachsen gelassen, wobei ein Computer-basierter Algorithmus verwendet wurde, um dem Fermenter eine konzentrierte Glucoselösung zuzuführen. Ammoniumhydroxid (58%ige Lösung) und Schwefelsäure (24%ige Lösung) wurden dem Fermenter ebenfalls wie erforderlich, um den pH zu steuern, zugeführt. Weitere Zugaben von Antischaum wurden außerdem in einigen Fällen verwendet, um die Schaumbildung zu kontrollieren. Wenn die Kultur eine Zelldichte von in etwa 40 OD550 erreichte, wurden zusätzlich 100 ml 1 M Magnesiumsulfat zu dem Fermenter zugegeben. Zusätzlich wurde mit einer Zugabe von konzentriertem Salz (das aus in etwa 10 g Ammoniumsulfat, 26 g dibasischem Kaliumphosphat, 13 g monobasischem Natriumphosphat-Dihydrat, 2 g Natriumcitrat-Dihydrat und 15 g monobasischem Kaliumphosphat in 1 l Wasser bestand) zu dem Fermenter mit einer Rate von 2,5 ml/min begonnen, sobald die Kultur in etwa 20 OD550 erreichte, und wurde fortgesetzt, bis in etwa 1250 ml zu der Fermentation zugegeben waren. Die Fermentationen wurden typischerweise für 72–80 Stunden fortgesetzt.
  • Während der Fermentation wurde, sobald der Sollwert für den gelösten Sauerstoff für die Fermentation erreicht war, die konzentrierte Glucoselösung auf der Basis des Signals der Sonde für gelösten Sauerstoff zugeführt, um die Konzentration des gelösten Sauerstoffs bei dem Sollwert zu steuern. Folglich manipulierten bei diesem Regulationsschema Manipulationen der Fermenter-Betriebsparameter, so wie die Rührgeschwindigkeit oder der Gegendruck, die die Sauerstoff-Transferkapazität in der Fermentation beeinflussen, in entsprechender Weise die Sauerstoff-Aufnahmerate oder Stoffwechselrate der Zellen.
  • Ein Massenspektrometer wurde verwendet, um die Zusammensetzung des Abgases aus der Fermentation zu überwachen und ermöglichte die Berechnung der Sauerstoffaufnahme- und Kohlendioxid-Bildungsraten bei der Fermentation.
  • Wenn die Kultur eine Zelldichte von in etwa 220 OD550 erreichte, wurde das Rühren von einer anfänglichen Rate von 1000 upm auf in etwa 725 upm während in etwa 12 Stunden verringert.
  • Für die Fermentation von Zellen, die mit pMS421 und pcyc34 (worin der tacII-Promotor verwendet wurde, um die Expression sowohl der schweren als auch der leichten Kette zu steuern) transformiert waren, oder von Zellen, die mit pMS241 und dem zwei-Promotorplasmid pxCD18-7T3 (worin der tacII-Promotor verwendet wurde, um die Expression der schweren Kette zu steuern) transformiert waren, wurden 50 ml 200 mM IPTG in etwa 12 Stunden, nachdem die Kultur eine Zelldichte von 220 OD550 erreichte, zugegeben, um die Synthese der schweren und leichten Kette bei pcyc34 und die Synthese der schweren Kette bei pxCD18-7T3 zu induzieren.
  • Ergebnisse
  • A. Die entdeckten und identifizierten Spaltungsprodukte der leichten Kette Kappa
  • Lösliche E-coli-Extrakte (siehe HSE in Material und Methoden) und die verbleibenden Sedimente, die in SDS-Probenpuffer suspendiert waren (ein allgemein erhältliches kommerzielles Produkt für den Betrieb eines SDS-Gels) wurden mittels SDS-PAGE analysiert. Die Proben wurden von den 20-OD-ml-Sedimenten, die während der Fermentation von E. coli mit hoher Zelldichte (HCD) in dem Stamm 49A5, der das Plasmid pS1130 trug, für die Herstellung von rhuF(ab)'2LZ(xCD18) gesammelt wurden, abgeleitet. In der löslichen Fraktion wurde das Fragment der Kappa-LC-Spaltung mit 115 Aminosäuren Länge identifiziert. Die unlösliche Fraktion des Fragments der Kappa-LC-Spaltung mit 182 Aminosäuren Länge, wurde identifiziert. Alle Fragmente wurden auf eine PVDF-Membran transferiert und sequenziert. Beide besaßen den korrekten N-Terminus wie die prozessierten Formen von Kappa-LC. Die Massen wurden mittels einer massenspektroskopischen Analyse als 12488,5 bzw. 19857,2 bestimmt. Die Stellen der proteolytischen Spaltung befanden sich zwischen den Resten Val 115 und Phe 116 für LC-115 und zwischen den Resten Ser182 und Lys183 für LC-182. Nur eine Stelle sah wie eine typische Prc-Schnittstelle aus.
  • Ein weiteres 20-OD-ml-Sediment von E.-coli an dem Ende dieser Fermentation wurde mittels zweidimensionaler Gelelektorphorese analysiert. Das E-coli-Zelllysat des Sediments (~40 μg Protein) wurde wie von Champion et al., supra, beschrieben, mit Rehydratisierungslösung zusammengegeben. In dem 2-D-Gelmuster der aus der 49A5/pS1130-Fermentation gewonnenen Zellen wurden die spezifischen Flecken der leichten Kette Kappa identifiziert, indem das Produktionsgel mit einem Leerwert-2-D-Gel verglichen wurde, das von Zellsedimenten einer (49A5/pBR322)-Fermentation an einem ähnlichen Zeitpunkt gewonnen wurden. Die Sedimente wurden von dem gleichen Zeitpunkt zweier Fermentationen gewählt, wobei angenommen wurde, dass die Zellen sich in vergleichbaren Stoffwechselzuständen befinden sollten. Alle Kappa-LC-Flecken wurden durch Immunblot unter Verwendung eines anti-Alkalische-Phospatase-konjugierten anti-humanen Kappa-LC-Antikörpers identifiziert.
  • Außer den beiden Hauptabschnitten, die mittels 1-D-Gelanalyse identifiziert wurden, zeigte das 2-D-Gel intaktes LC, eine Isoform des intakten LCs und wenigstens 5 weitere kleinere LC-Abschnitte (siehe 6). Die entsprechenden Flecken wurden eluiert und sequenziert. Alle LC-spezifischen Peptide wiesen den korrekten N-Terminus auf, was darauf hindeutete, dass sie alle korrekt prozessiert waren, wobei das STII-Signal gespalten wurde. Alle diese Peptide wurden mittels des Massenspektrometers analysiert, um die annähernde Masse zu bestimmen. Aufgrund der Spurenmenge der vorhandenen kleineren Abschnitte konnte eine korrekte Masse nicht erhalten werden, um die Schnittstellen dieser Fragmente zu bestimmen.
  • Drei kleinere Abschnitte bildeten eine Gruppe mit dem Kappa-LC-115-Abschnitt bei einem pI-Wert um 9. Der vierte wies einen pI-Wert um 6,5 auf, und der fünfte wies den gleichen pI-Wert wie der LC-182-Abschnitt bei einem pI um 6 auf. Um die Löslichkeit dieser LC-Fragmente zu bestimmen, wurde ein HSE eines identischen Sediments auf ein 2-D-Gel geladen. Das LC 182-Fragment kam nur in der unlöslichen Fraktion vor.
  • B. Prc ist die einzige für die Spaltung der leichten Kette Kappa verantwortliche Protease
  • 1-D-SDS-PAGE-Gele, die mit der unlöslichen Fraktion der Zellen, die von den vier verschiedenen Fermentationen Proteasemutanten 49A5, 45F8, 41H1 und 43H1 von E. coli abgeleitet waren, die das anti-CD18-Fab'2-LZ-Molekül exprimierten, beladen waren, wurden verglichen. Die proteolytische Spaltung LC-182 war in drei der vier Proben vorhanden (nicht in dem prc-Deletionsstamm 43H1), was darauf hindeutete, dass die Prc-Protease an der Kappa-LC-Spaltung beteiligt sein könnte. Der Scheitelpunkt 1, der dem LC-115-Abschnitt entspricht, der in den von dem Stamm 49A5 (prc-plus) abgeleiteten Proben vorhanden war, verschwand ebenfalls aus den von 43H1 abgeleiteten Proben, wenn Chromatogramme verglichen wurden, die durch den AME5TM/RP-Doppelsäulen-Test aufgelöst worden waren. Dieser Test adsorbierte selektiv Kappa- LC-enthaltende Antikörperspezies und löste sie dann, wie oben in dem Abschnitt Material und Methoden beschrieben, in fünf Scheitelpunkte auf.
  • Wenn das 2-D-Gel von Sedimenten analysiert wurde, die aus 43H1-Zellen gewonnen wurden, wurde gefunden, dass nicht nur die LC-115- und LC-182-Fragmente aus dem Gel verschwanden, sondern dass auch alle anderen LC-verwandten kleineren Spezies verschwanden (siehe 7). Dieses Ergebnis deutet stark darauf hin, dass Prc das einzige Enzym ist, das für die Kappa-LC-Spaltungen verantwortlich ist. Dieses 43H1-Zellsediment wurde aus einer Fermentation mit niedriger Zelldichte gewonnen.
  • C. Stammkonstruktion, um zu bestätigen, dass Prc das einzige an der Spaltung der leichten Kette Kappa beteiligte Enzym ist
  • 1. Ein prc-Deletionsstamm, der prc-plus werden soll
  • Der Beweis, dass Prc das einzige Enzym ist, das an der Kappa-LC-Spaltung beteiligt ist, wurde erhalten, indem der 43H1-Stamm (ein prc-minus-Wirt mit vierfachen Proteasemarkern) repariert wurde, um ein prc-positiver, dreifach-Proteasestamm (58H2) zu werden. Ein Stamm 42E3 trägt eda-51::Tn10, das mit prc kotransduzierbar ist. Der 43H1-Stamm wurde mit dem P1-Phagen, der auf 42E3 gewachsen war, zu tetr transduziert. Der resultierende Stamm (58F9) wurde bezüglich der prc::kanr-Mutationen repariert; dadurch wurde er kanr. Der Stamm wurde dann auf Minimal-Glucuronsäuremedium plattiert, um das eda::Tn10 zu entfernen. Der erzeugte neue Stamm, 58H2, wurde eine dreifach-Protease-Mutante mit dem Wildtyp prc. Dieses Isolat ist entweder eine Transduktante oder ein spontanes Eda+-Isolat. Der prc-plus-Genotyp wurde mittels PCR bestätigt. Dieser Stamm 58H2 trägt immer noch den von 43H1 abgeleiteten prc-Suppressor (sprW148R) und ist kans. Das Wiedertreten von LC-Abschnitten in diesem Stamm 58H2 wurde mittels des AME5TM/RP-Doppelsäulen-Tests nachgewiesen (siehe 8).
  • 2. Das prc-Gen wurde aus einem nativen Stamm deletiert, damit dieser prc-minus wurde
  • Der Stamm 49A5 war ein wie oben beschriebener prc-Wildtypstamm. Als die prc-Deletion in diesen Stammhintergrund eingeführt wurde, um den Stamm 58B3 zu konstruieren, und die Zellextrakte mittels des AME5TM/RP-Doppelsäulen-Verfahrens getestet wurden, verschwand der LC-115-Abschnitt (Scheitelpunkt 1). Der Stamm 58B3 war von dem Stamm 33B6 abgeleitet, der nur einen Proteasemarker, DegP, trägt. Die Δprc:.pS1080 (Bass et al., supra; Metcalf et al., supra) wurde mittels P1-Transduktion in ein kans-Derivat von 33B6 (56G4) eingeführt, um einen degP-Δprc-Doppelproteasestamm, 59A7, zu erzeugen.
  • Die Zusammenfassung der Spaltungsergebnisse für alle sieben Stämme ist in der Tabelle 1 gezeigt.
  • Tabelle 1: E.-coli-Wirtsstämme, die anti-CD18-(Fab)'2-Leucinzipper exprimieren
    Figure 00510001
  • D. Verbesserung der Ausbeute von rhuFab'2-LZ-(xCD18) in prc-minus-Wirten
  • 1. Schüttelflaschen-Ergebnisse
  • Drei Stämme (49A5, 43H1 und 58H2), die rhuFab'2-LZ-(xCD18) exprimierten, wurden zunächst in LB-Brühe +Amp über Nacht bei 30 °C wachsen gelassen. Dann wurden alle Kulturen in gleicher Weise in Schüttelflaschen inokuliert, die 25 ml des C.R.A.P.-Minimalmediums +Amp enthielten, und über Nacht bei 30 °C weitergeschüttelt. 20-OD-ml-Sedimente wurden gesammelt, um lösliche Lysate (HSE) herzustellen. 25 μl von 530 μl wurden auf die AME5TM/Umkehrphasensäulen geladen.
  • Die 8 zeigt das Balkendiagramm, das die fünf Scheitelpunkte repräsentiert, die in diesem Test aufgelöst wurden. Die y-Achse ist die spezifische Scheitelpunktfläche von Scheitelpunkt 1 bis 5 (siehe Material & Methoden). Die x-Achse zeigt die rhuFab'2-LZ-(xCD18)-Produktionsstämme. Beide prc+-Stämme, 49A5 und 58H2, produzierten nahezu gleiche Mengen des Produkts, und beide von ihnen zeigten nahezu gleiche Mengen des LC-115-Fragments (Scheitelpunkt 1) im Vergleich zu nahezu nichts in dem Scheitelpunkt 1 und mehr Scheitelpunkt-5-Produkt in dem Δprc-Stamm (43H1). Dieses Diagramm zeigte die Verteilung von Antikörperfragmenten. Größere Mengen von löslichem, intaktem LC und LC-Dimer wurden in dem 43H1-Wirt als in den 49A5- und 58H2-Wirten beobachtet. In den Schüttelflaschen produzierte der prc–-Wirt nahezu 5-fach mehr von dem rhuFab'2-LZ-(xCD18)-Produkt als die nativen prc-Stämme.
  • 2. Fermentationsergebnisse
  • Der durchschnittliche rhuFab'2-LZ-(xCD18)-Titer, der bei der Standardfermentation mit hoher Zelldichte (HCD) erhalten wurde, betrug 893 mg/l in dem Wildtyp-prc-Wirt (49A5, n=6) auf der Basis des AME5TM/RP-Doppelsäulen-Tests. Eine nahezu zweifache Verbesserung des Titers wurde in der 43H1/pS1130-Fermentation beobachtet. Der dramatische Unterschied zwischen den Titern der Schüttelflasche (5×) und der Fermentation (< oder gleich 2×) für die 43H1- bzw. 49A5-Wirte beruhte, ohne Beschränkung auf irgendeine Theorie, vermutlich auf dem Unterschied der Sekretionseffizienz der Produkte. Wenn die Gesamtlysate von Schüttelflaschensedimenten analysiert wurden, waren in dem prc-plus-Hintergrund nur 50% der Antikörperfragmente korrekt prozessiert, während die Lysate, die von 43H1-Schüttelflaschen-Zellen abgeleitet waren oder alle Zellen, die von einer Fermentation abgeleitet waren (prc-plusv und -minus) 100% Prozessierung zeigten. Es wurde gefunden, dass die Prozessierung des Prc-Proteins von secY, secA abhängig war (Hara et al., 1991, supra). Ohne Begrenzung auf irgendeine Theorie wird angenommen, dass das Schüttelflaschenergebnis zeigt, dass das Prc-Protein mit den Antikörperfragmenten um die Translokation kompetitierte.
  • 3. Die Gesamtexpression von Antikörperfragmenten wurde gemessen
  • Ein POROSTM-Säulentest der Gesamt-Fermentationsbrühe-Proben wurde, wie in dem Abschnitt Material & Methoden beschrieben, entwickelt, um die Effizienz der Antikörperfaltung und -assemblierung zu beurteilen. Wenn gleiche Injektionen von Gesamtbrühe-Proben, die von drei anti-CD18-HCD-Fermentationen gewonnen wurden, in verschiedenen Wirten verglichen wurden, wurde gefunden, dass die 43H1-Fermentation eine ähnliche Menge an HC wie die 49A5-Fermentation, aber eine höhere Menge an intaktem Kappa-LC exprimierte (siehe Tabelle 2). Der rhuFab'2-LZ-(xCD18)-Titer betrug 1830 mg/l für 43H1 im Vergleich zu 887,8 mg/l für 49A5. Die 59A7-Fermentation produzierte nicht nur extra Antikörperfragmente, sondern sie führte auch zu dem höchsten Titer von rhuFab'2-LZ-(xCD18) mit 2403 mg/l.
  • Tabelle 2: Die Gesamtexpression von Antikörperfragmenten und die Fab'2-LZ-Titer von verschiedenen Stämmen, die rhuFab'2-LZ-(xCD18) exprimieren, in einem Standard-HCD-Fermentationsverfahren
    Figure 00520001
  • E. Der Prc-Suppressor ist für das Überleben in der stationären Phase erforderlich
  • Es wurde gefunden, dass der Stamm 58B3, der die degP- und prc-Deletionen trägt, eine Lyse während des Wachstums in der verlängerten stationären Phase einer HCD-Fermentation zeigte, wobei er das anti-CD18-Fab'2-LZ-Molekül exprimierte. Die Zelllyse begann bei 50 Stunden nach der Inokulation. Sie erzeugte nur 320 mg/l rhu-Fab'2LZ(xCD18), während die 59A7/pS1130-Fermentation ein gutes Wachstum in der stationären Phase bis zu 72 Stdn einer HCD-Fermentation aufrechterhielt, wobei eine hohe Zelldichte (in etwa 300 OD550-ml) erreicht wurde. Die 9 zeigt den Wachstumsvergleich der beiden Fermentationen. Außerdem wurde eine besonders hohe Expression sowohl der HC- als auch der LC-Fragmente in diesem Stammhintergrund gefunden, die die Ausbeute des rhuFab'2-LZ-(xCD18)-Moleküls auf 2403 mg/l erhöhte. Wiederum wurden keine Kappa-LC-Abschnitte in Proben gefunden, die sowohl aus dem 58B3- als auch dem 59A7 prc-Deletionsstamm gewonnen wurden.
  • Der prc-Suppressor (spr) (der Prcsup kodiert) wurde hierin ursprünglich aus dem Stamm 40A6 (prc::kan spr) als eine spontane Mutation, d.h. eine thermoresistente Revertante der prc-Deletionsmutante, isoliert. Nachdem das Gen sequenziert und durch Konjugationskartierung war, wurde gefunden, dass es bei in etwa 48 min auf dem E.-coli-Chromosom lokalisiert ist. Die Nukleotidsequenz seines PCR-Produkts entsprach derjenigen des E.-coli-spr-Gens, die von Hara et al., 1996, supra, berichtet wurde, mit Ausnahme einer Punktmutation bei der Aminosäure 148, bei der ein TGG-Kodon zu CGG verändert war, was zu einer Änderung eines Tryptophanrestes zu einem Arginin (W148R) führte. Dieser prc-Suppressor wies die W148R-Mutation auf, wenn er in den Stamm 59A7 eingeführt wurde. Es wurde berichtet, dass das Wildtyp-spr-Gen ein Li poprotein in der Hüllfraktion kodiert, von dem angenommen wird, dass es ein Peptidoglycan-hydrolysierendes Enzym ist (Hara et al., 1996, supra).
  • Der Prc-Suppressor wurde mittels eines Tn10, das mit diesem Suppressor verbunden war, in den Stamm 59A7 eingeführt, und es wurde auf Kotransduktanten selektiert, die sowohl Tetracyclin-resistent als auch fähig waren, auf einer LB-Platte mit halber Stärke und Niedrigsalz bei 42 °C zu wachsen. Die neue Punktmutation ereignete sich zu der Zeit, als Tn10 mittels Malloy-Platten entfernt wurde.
  • Auf der Basis der Ergebnisse der anti-CD18-Fab'2-Fermentation des 58B3- im Vergleich zu dem 59A7-Stamm wurde gezeigt, dass der Prc-Suppressor für das erfolgreiche Wachstum einer ΔPrc-Mutante erforderlich ist, speziell in einer E.-coli-Fermentation mit hoher Zelldichte. Der Stamm, als 58B3 bezeichnet, trägt exakt denselben Genotyp wie 59A7, mit Ausnahme von spr (W148R), und konnte in einer Standard-HCD-Fermentation nach 50 Stunden nicht lebensfähig bleiben.
  • F. Die Prc-Deletionsmutante kann aufgrund der Anordnung der Prc-Spaltungstellen die Produktionsspiegel verschiedener Antikörper erhöhen
  • Die 10 zeigt die humanisierte Kappa-LC-Sequenz (SEQ ID Nr: 5). Die berechneten pI-Werte von potentiellen Prc-Abschnitten sind in der Tabelle 3 gezeigt.
  • Tabelle 3: Berechnete pI-Werte von potentiellen Prc-Abschnitten
    Figure 00540001
  • Ohne Beschränkung auf irgendeine Theorie wird auf der Grundlage der 10 und der Tabelle 3 angenommen, dass die Prc-Protease begann, das Kappa-LC von dessen C-Terminus aus 9 oder 18 Aminosäuren innerhalb der LC-Sequenz zu spalten und es dann nach und nach in Richtung auf den N-Terminus zu abzuknabbern, um die S/K-Stelle für die Wirkung einer Serin-spezifischen Protease zu öffnen. Es war möglich, dass eine weitere Kappa-LC-Spezies (möglicherweise in einem anderen Faltungszustand) hauptsächlich bis auf 115 Aminosäuren gespalten wurde. Viele mögliche Spal tungsprodukte weisen Molekulargewichte und berechnete pI-Werte auf, die mit den in dem 2-D-Gel gefundenen Kappa-LC-Flecken ziemlich gut übereinstimmt.
  • Die 11 zeigt, dass der prc-Deletionsstamm (43H1) den LC-182-Abschnitt aus Zellen entfernte, die anti-VEGF-Fab-, anti-CD19-Fab'2-LZ-, anti-CD18-Fab'2-LZ-6xHis-Moleküle und anti-Prothrombinase("tissue factor")-Fab'2-LZ-6xHis-Moleküle exprimierten. Die von cab2826 (33B6/D3H44-F(ab')2) und cab2847 (43H1/D3H44-F(ab')2) abgeleiteten Fermentationsproben waren Fermentationen mit hoher Zelldichte, die das anti-Prothrombinase("tissue factor")-Fab'2-LZ-6xHis-Molekül exprimieren sollten. Das Fermentationsverfahren war das gleiche Standard-HCD-Verfahren wie oben für die anti-CD18-Fab'2-LZ-Fermentationen beschrieben. Cab2793 war die 49A5/pAB3-Fermentation, die das anti-CD18-Fab'2-LZ-6xHis-Molekül exprimieren sollte. Cab2846 war die 41H1/pS1130-Fermentation, die das anti-CD18-Fab'2-LZ-Molekül exprimieren sollte. Die JJ81(43H1/pY0317)- und die JJ67(43E7/pY0317)-Fermentationen sollten anti-VEGF-Fab erzeugen. Cab2814 war (49A5/pBR322), die Leerwert-Fermentation, die das gleiche Plasmidrückgrat ohne Antikörper-exprimierende Gene enthält.
  • Die 20-OD-Fermentationssedimente wurden mit TRIS/EDTA/Lysozym extrahiert, um die löslichen HSEs zu entfernen. Die verbliebenen Sedimente wurden in 400 μl 1x-SDS-Probenpuffer plus 20 μl beta-Mercaptoethanol suspendiert und dann bei 95 °C auf einem Heizblock für 5 Minuten erhitzt. Dann wurden 5 μl auf ein 4–12%iges NUPA-GETM-Gel aufgetragen. Die Stämme 33B6, 41H1, 49A5 und 43E7 sind prc-plus-Stämme. Der Stamm 43H1 war ein prc-minus-Stamm. Alle von dem nativen prc-Stamm abgeleiteten Proben weisen das abgebaute 19,8-kD-LC-Produkt auf. Die cab2829(33B6/pD3H44TB)-Fermentationsprobe, die anti-TF-Fab exprimierte, konnte ebenfalls das LC-Abbaufragment mit der gleichen Größe nachweisen. Alle diese Fragmente wurden Aminosäure-sequenziert, und es wurde bei allen gefunden, dass sie die korrekten N-terminalen LC-Sequenzen aufwiesen.
  • G. Der Stamm 59A7 zeit in Schüttelflaschen eine höhere Expression von anti-CD18-His- und -Lys-getaggtem Fab'2-LZ- und Apo2L-cytoplasmatischem Protein
  • Zusätzliche Schüttelflaschendaten, die in der Tabelle 4 gezeigt sind, zeigen, dass der Stamm 59A7 pAB3 (das anti-CD18-His-getaggte Fab'2-LZ) besser exprimierte als der Stamm 43H1 und 49A5. Der Stamm 59A7 exprimierte pAB21 (Lys-getaggtes Fab'2-LZ) um das 2,4-fache besser als der Stamm 33B6. Die Stämme 59A7 und 43H1 exprimierten pS1130 (Fab'2-LZ ohne Tag) um das 2,9-fache besser als der 49A5-Stamm.
  • Jedoch zeigten die Fermentationsergebnisse stets, dass der Stamm 59A7 bei der pS1130-Expression besser als der Stamm 43H1 ist.
  • Für das cytoplasmatische Nicht-Antikörper-Protein Apo2L ist die spezifische Aktivität in etwa 20–30 % höher, wenn es in dem Stamm 59A7 exprimiert wird, als in dem Stamm 43E7 (in Schüttelflaschen). Da der Stamm 43E7 bis zu einer höheren OD550 wuchs, war die Gesamtexpression ähnlich. Der 43E7-Stamm ist ein ompT-ptr3-degP-Stamm ohne prc und spr.
  • Tabelle 4: Die höheren spezifischen Titer von verschiedenen Proteinen, die in 59A7 und anderen Stämmen in Schüttelflaschenkulturen exprimiert wurden
    Figure 00560001
  • H. Der Stamm 59A7 zeit eine bessere Expression mittels Fermentation für anti-CD18-Fab'2-LZ
  • Die Tabelle 5 zeigt, dass der Stamm 59A7 anti-CD18-Fab'2-LZ von dem zwei-Promotor-Plasmid pxCD18-7T3 überlegen war und 49A5 bei der Expression von anti-CD18-Fab'2-LZ von dem Plasmid pcyc34 überlegen war.
  • Tabelle 5: Die höheren spezifischen Titer von anti-CD 18-Fab'2-LZ, das in 59A7 im Vergleich zu 33D3 und 49A5 unter Verwendung von zwei verschiedenen Plasmiden mittels Fermentation exprimiert wurde
    Figure 00560002
  • Figure 00570001
  • Diskussion
  • In der vorliegenden Arbeit wurde der Abbau von Kappa-LC in E.-coli-Zellen untersucht, die das anti-CD18-Fab'2-LZ-Molekül exprimieren. Frühere Studien haben viele potentielle Prc-Substrate gezeigt, aber, so sicher wie festgestellt werden kann, hat niemand die Entdeckung von Antikörperfragmenten als das Substrat dieser Protease berichtet. Hierin wird gezeigt, dass Prc die einzige Protease ist, die an der Kappa-LC-Spaltung innerhalb von E.-coli-Zellen beteiligt ist. Das Prc-Protein schien Kappa-LC selektiv an bestimmten Stellen zu schneiden, was zu zwei Hauptabschnitten (LC-115 & LC-182) und fünf zusätzlichen kleinen Spaltungsprodukten führte, wie anhand von 2-D-Gel-Ergebnissen beobachtet wurde. Da einer der Hauptabschnitte ein S/K-Spaltungsprodukt war, das den Charakteristika der Prc-Spaltungsstellen nicht entsprach (Keiler et al., supra), wurde es genauer untersucht. Es wurde jetzt gefunden, dass der Abbau der leichten Kette Kappa in E.-coli-Zellen mit einer periplasmatischen Protease von E. coli in Beziehung steht (Prc/Tsp). Produkte der gespaltenen leichten Kette Kappa wurden durch analytische Verfahren (1-D/2-D-SDS-PAGE, Massenspektrometrie und N-terminale Sequenzanalyse) an E.-coli-Extrakten identifiziert, die von verschiedenen, proteolytisch defizienten Stämmen stammen, die das anti-CD18-F(ab)'2-Leucinzipper-Molekül exprimieren, um zu bestätigen, dass Prc/Tsp die einzige Protease ist, die für die Spaltung der leichten Kette Kappa verantwortlich ist.
  • Es wird gefunden, dass die spezielle Kombination der degP prc-Deletion mit einem prc-Suppressor (spr-Mutante) einen einzigartigen E.-coli-Stamm darstellt, der fähig ist, sehr hohe Mengen an rekombinantem Protein oder eine höhere spezifische Aktivität des Proteins zu produzieren, wie hierin anhand des Apo2-Liganden und aktiven Antikörpers veranschaulicht wird.
  • Die Fermentation unter Verwendung des vorliegenden degP prc-spr-Stammes führt zu einem Wachstum mit hoher Zelldichte (bis 300 OD oder mehr) und zu der Produktion von hohen Ausbeuten des rhuxCD18-Fab'2-Leucinzipper-Produkts im Vergleich zut der Expression von Antikörpern in dem Wildtypstamm oder in proteolytisch defizienten Stämmen.
  • Das vorliegende Fermentationsverfahren erlaubt die Produktion von 100–200 g/l an Zelltrockengewicht in 72 Stunden mit einer mehr 200%igen Zunahme des aktiven Antikörpers, der in einem bevorzugten Stamm 59A7 produziert wird, der die Kombination degP prc spr aufweist. Der vollständige Genotyp des Stamms 59A7 ist W3110 ΔfhuA phoA ΔE15 Δ(argF-lac)169 deoC degP41 IN(rrD-rrE)l kans ilvG2096(Valr) Δprc sprW148R. Sein Elternstamm ist 58B3, der identische genetische Marker wie der Stamm 59A7 mit der Ausnahme ohne den prc-Suppressor, spr, aufweist. Der Stamm 58B3 war nicht fähig, sein Wachstum in der stationären Phase eines Fermentationsverfahrens von E. coli mit hoher Zelldichte aufrecht zu erhalten. Er produzierte weniger Antikörperprodukt als ein nativer prc-Stamm (49A5), der auch den degP-Deletionsmarker und andere identische Genotypen wie der 59A7-Stamm trägt, mit der Ausnahme, dass 49A5 ein Kanamycin-resistenter, bezüglich prc nativer Stamm ist, während 59A7 ein Kanamycin-sensitiver Δprc-Stamm ist.
  • Somit wurde hiermit entdeckt, dass die Anwesenheit des prc-Suppressors (spr) essentiell für ein gutes Wachstum und einen hohen Spiegel der Antikörperproduktion in einem degP prc-Deletionsstamm ist, speziell in einem Fermentationsverfahren mit hoher Zelldichte, aber auch in einem Fermentationsverfahren mit niedriger Zelldichte.
  • Eine DegPΔ-Einzelprotease-Mutante und andere mehrfach-proteasedefiziente Stämme, die degPΔ enthielten, produzierten keinen besonders hohen Spiegel an rekombinanten Proteinen. Die beiden zuvor erwähnten Stämme, degP rpoH und degP prc, exprimierten mehr Produkt als viele andere Stämme, mit denen sie verglichen wurden, aber nicht annähernd so viel wie der Stamm 59A7. In spezifischerer Weise zeigte der Stamm 58B3 mit der degP prc-Kombination ohne den spr-Suppressor keinerlei Vorteil bei der Produktion von Antikörperfragmenten, wie anhand des anti-CD18-Fab'2-LZ-Moleküls veranschaulicht wurde.
  • Es werden analytische Ergebnisse vorgestellt, um zu beweisen, dass die Spaltung von Kappa-LC in E.-coli-Zellen, die ein humanisiertes anti-CD18-Fab'2-Leucinzipper-Molekül exprimieren, mit dem periplasmatischen, C-terminalen Prozessierungsprotein (Prc) in Zusammenhang steht. Das Prc-Protein ist die einzige Protease, die für die Spaltung der leichten Kette Kappa verantwortlich ist, was sowohl mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese als auch durch genetische Manipulation von Antikörper-Produktionsstämmen bewiesen wurde. Um zu bestätigen, dass die Prc-Protease wirklich das einzige Enzym ist, das an Kappa-LC-Spaltungen beteiligt ist, erschienen die Kappa-LC-gespaltenen Produkte erneut, wenn ein Δprc-Stamm zu einem nativen prc-Stamm repariert wurde. Auf ähnliche Weise verschwanden die LC-gespaltenen Pro dukte, wenn das prc-Gen aus einem nativen prc-Stamm deletiert wurde. Beide Stammkonstruktionen wurden mittels P1-Transduktion durchgeführt.
  • Zusätzlich werden die Titervergleiche des anti-CD18-Fab'2-Leucinzipper-Moleküls, das aus proteolytischen Mutanten von E. coli mit oder ohne prc-Deletion, gewonnen wurde, bereitgestellt. Diese Daten bewiesen, dass der Stamm 59A7 ein starker Produzent der Antikörperexpression ist. Verschiedene Nukleinsäuren, die für die Expression des anti-CD18-F(ab)'2-Leucinzipper-Moleküls konstruiert wurden, werden beschrieben; alle Expressionsplasmide, die in den Stamm 59A7 transformiert wurden, produzierten größere Mengen an Antikörperfragmenten als im Vergleich eine degPΔ-Einzelprotease-Mutante oder eine degP-prc-Mutante ohne spr. Ein weiterer Stamm, 43H1, der den Genotyp degP prc spr zusätzlich zu den ompP- und ptr3-Mutationen aufwies, wuchs nicht so gut wie der Stamm 59A7, obwohl der Stamm 43H1 die gleiche spr-Mutation aufwies wie diejenige in 59A7, weil er an der Position 520 eine Veränderung von T nach C enthält, die zu einer Veränderung von der Aminosäure W zu R an der Position 148 führt. Er produzierte anti-CD18-Fab'2-LZ mit einem höheren Titer als derjenige, der von dem degP-Stamm (49A5) produziert wurde, aber nicht so hoch wie derjenige, der von dem Stamm 59A7 in dem Fermentor produziert wurde.
  • Es wurde berichtet, dass die Prc-Protease ihre Substrate an einer bestimmten Anzahl von Stellen, aber mit einer ziemlich breiten Sequenzspezifität schneidet (Keiler et al., supra). Es wurde hierin gefunden, dass die Prc-Schnittstellen sich in dem Kappa-LC-Fragment in der konstanten Region befinden, die die Rückgratsequenz ist, im Allgemeinen für die Konstruktion verschiedener Expressionsplasmide für humanisierte Antikörper verwendet wird. Auf der Basis der vorliegenden Ergebnisse wird erwartet, dass die Prc-Deletionsmutante die Titer von verschiedenen Antikörperfragmenten, so wie: Fab, Fab', Fab'2 (mit oder ohne Leucinzipper), einschließlich Antikörpern mit voller Länge, die in Zellen von Escherichia coli exprimiert werden, erhöhen sollte. Es wird auch erwartet, dass das Antikörperfragment, das von einer His-Tag- oder einer Lys-Tag-Sequenz an dem C-Terminus von HC flankiert ist, profitiert.
  • Es wurde gefunden, dass der Stamm 59A7 dem Stamm 49A5 bei der Expression von pAB3 überlegen ist und dem Stamm 43E7 bei der spezifischen Expression des cytoplasmatischen Proteins Apo2L in Schüttelflaschen überlegen ist und den Stämmen 43H1 und 49A5 bei der Expression von pS1130 und pcyc34 (dem tacII-Promotor-Gegenstück von pS1130) mittels Fermentation überlegen ist. Außerdem war er dem Stamm 33D3 bei der Expression des Zwei-Promotor-Plasmids pxCD18-7T3 überlegen.
  • BEISPIEL 2
  • Material und Methoden
  • A. Expressionsplasmide
  • Das Plasmid D3H44-F(ab')2 ist in Beispiel 1 beschrieben. Das Plasmid pY0317tet20 ist in Beispiel 1 beschrieben.
  • B. Stämme
  • Der Stamm, der für die Expression von xVEGF Fab verwendet wurde, ist ähnlich zu anderen Stämmen, die in Beispiel 1 beschrieben wurden. Er ist ein Derivat von E. coli W3110 und wird als 60C1 bezeichnet. Der vollständige Genotyp des Stamms 60C1 ist W3110 ΔfhuA Δ(argF-lac)169 ptr3 degP41 Kans ΔompT ilvG2096(Valr) Δ(nmpc-fepE) ΔssrA. Ähnlich zu dem Stamm 45F8 trägt er dreifache Proteasemarker ohne prc.
  • Die Stämme 43H1, 59A7 und 33B6 sind alle in Beispiel 1 beschrieben.
  • C. Kulturverfahren
  • Die Kultivierung in Schüttelflaschen wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. Das Wachstum der Schüttelflaschenkulturen, die das xTF-Fab'2-LZ-6xHis-Molekül exprimierten, wurde bis 42 Stunden bei 30 °C fortgesetzt, und zwei Sätze von Proben wurden an verschiedenen Stadien des Wachstums für Vergleichszwecke entnommen. Bei dem Vergleich der xVEGF-Fab-Expression wurden doppelte Kulturen wachsen gelassen und es wurden nur die 24-Stunden-Zeitpunkte entnommen.
  • D. Proteinidentifizierung
  • Die 2-D-Gelelektrophorese wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt.
  • Ergebnisse
  • Die Daten über die Schüttelflaschenkulturen sind in der Tabelle 6 unten gezeigt. Es ist in Beispiel 1 im Hinblick auf die rhuFab'2LZ-(xCD18)-Produktion klar, dass die Prc–-Stämme 43H1 und 59A7 den Prc+-Stämmen 60C1 und 33B6 hinsichtlich der Mengen der gebildeten Produkte (anti-VEGF-Fab' und anti-Prothrombinase("tissue factor")-Fab'2-LZ-6xHis) überlegen waren.
  • Die 12 ist ein 2-D-Gel, das zeigt, dass die prc-Deletion (Stamm 59A7, der prc-negative Stamm), die anti-VEGF-Fab (pY0317tet20) produziert, das gesamte abgebaute anti-VEGF-LC und zwei abgebaute xVEGF-HC-Fragmente (die in dem prc-plus-Stamm gefunden werden) beseitigt, auch wenn zwei getrennte HC-Abschnitte in 59A7 entdeckt wurden, die entweder OmpT- oder Ptr3-gespaltene Produkte sind. Die 13 ist ein 2-D-Gel, das zeigt, dass der Stamm 60C1 (prc-plus-Stamm), der das anti-VEGF-Fab (pY0317tet20) als ein heterologes Polypeptid exprimiert, mehrere abgebaute anti-VEGF-LC- und zwei abgebaute HC-Fragmente enthielt.
  • Tabelle 6: Schüttelflaschen-Daten zum Vergleich der Expression von xVEGF-Fab in einem prc+/–-Wirt und der Expression von xTF-Fab'2-LZ-6xHis in einem prc+/–-Wirt
    Figure 00610001
  • Sequenzprotokoll
    Figure 00620001
  • Figure 00630001
  • Figure 00640001
  • Figure 00650001
  • Figure 00660001
  • Figure 00670001
  • Figure 00680001

Claims (17)

  1. E. coli-Stamm, der bezüglich der chromosomalen degP und prc defizient ist, die die Protease DegP bzw. Prc kodieren, und der eine Mutante des spr-Gens enthält, wobei das Produkt dieses Gens Wachstumsphänotypen unterdrückt, die von Stämmen gezeigt werden, die prc-Mutanten enthalten.
  2. Stamm nach Anspruch 1, der bezüglich des chromosomalen ptr3, das die Protease III kodiert, oder bezüglich des chromosomalen ompT, das die Protease OmpT kodiert, nicht defizient ist.
  3. Stamm nach Anspruch 1, der eine Nukleinsäure umfasst, die ein Polypeptid kodiert, das heterolog zu dem Stamm ist.
  4. Stamm nach Anspruch 3, wobei das Polypeptid gegenüber Proteolyse empfindlich ist.
  5. Stamm nach Anspruch 3, wobei das Polypeptid ein eukaryontisches Polyeptid ist; insbesondere wobei das Polypeptid ein Säugerpolypeptid ist.
  6. Stamm nach Anspruch 3, der mit der Nukleinsäure transformiert ist.
  7. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, umfassend (a) Kultivieren eines E. coli-Stammes, der bezüglich der chromosomalen degP und prc defizient ist, die die Proteasen DegP bzw. Prc kodieren, und der eine Mutante des spr-Gens enthält, wobei das Produkt dieses Gens Wachstumsphänotypen unterdrückt, die von Stämmen gezeigt werden, die prc-Mutanten enthalten, wobei der Stamm eine Nukleinsäure umfasst, die das Polypeptid kodiert, das heterolog zu dem Stamm ist, so dass die Nukleinsäure exprimiert wird, und (b) Gewinnen des heterologen Polypeptids aus dem Stamm.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das heterologe Polypeptid gegenüber Proteolyse empfindlich ist.
  9. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Kultivieren in einem Fermenter stattfindet; insbesondere wobei das Kultivieren unter Bedingungen einer Fermentation mit hoher Zelldichte stattfindet oder wobei das Kultivieren unter Bedingungen einer Fermentation mit niedriger Zelldichte stattfindet.
  10. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Polypeptid aus dem Periplasma oder dem Kulturmedium des Stammes gewonnen wird.
  11. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Polypeptid ein Antikörper oder Apo2-Ligand ist.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Polypeptid ein Antikörper ist.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei der Antikörper ein humanisierter Antikörper ist; insbesondere wobei der Antikörper ein Antikörper mit vollständiger Länge ist.
  14. Verfahren nach Anspruch 12, wobei der Antikörper ein anti-CD18-, anti-VEGF-, anti-Prothrombinase(„tissue factor")-, 2C4-, anti-Her-2-, anti-CD20-, anti-CD40- oder anti-CD11a-Antikörper ist.
  15. Verfahren nach Anspruch 12, wobei der Antikörper ein Antikörperfragment ist.
  16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Antikörperfragment eine leichte Kette aufweist; insbesondere wobei die leichte Kette eine leichte Kette Kappa ist.
  17. Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Antikörperfragment ein Fab, Fab', Fab'2 oder eine Fab'2-Leucinzipperfusion ist; insbesondere wobei das Antikörperfragment eine anti-CD18-Fab'2-Leucinzipperfusion, eine anti-Prothrombinase(„tissue factor")-Fab'2-Leucinzipperfusion oder ein anti-VEGF-Fab mit oder ohne ein Histidin- oder Lysin-Tag ist; insbesondere wobei das Antikörperfragment eine anti-CD18-Fab'2-Leucinzipperfusion, eine anti-Prothrombinase-Fab'2-Leucinzipperfusion mit einem 6-Histidin-Tag, ein anti-VEGF-Fab, eine anti-CD18-Fab'2-Leucinzipperfusion mit einem 6-Histidin-Tag oder eine anti-CD18-Fab'2-Leucinzipperfusion mit einem 6-Lysin-Tag ist.
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