DE60116733T2

DE60116733T2 - Peptide mit antibakterieller wirkung

Info

Publication number: DE60116733T2
Application number: DE60116733T
Authority: DE
Inventors: H. Kevin Minnetonka MAYO
Original assignee: University of Minnesota
Current assignee: University of Minnesota
Priority date: 2000-01-20
Filing date: 2001-01-19
Publication date: 2006-11-02
Anticipated expiration: 2021-01-20
Also published as: ATE316097T1; EP1252181B1; WO2001053335A9; AU2001231016A1; US7144982B2; US20020146406A1; ES2252187T3; EP1252181A2; WO2001053335A2; CA2397835A1; DE60116733D1; WO2001053335A3

Description

Es wurde berichtet, dass eine Reihe von entworfenen Peptid-33-Meren (βpep-Peptiden) bakterizid ist und in der Lage ist, das bakterielle Endotoxin Lipopolysaccharid (LPS) (Mayo et al., Biochim. Biophys. Acta 1425, 81-92 (1998)) zu neutralisieren. CD- und NMR-Konformationsanalysen zeigen an, dass βpep-Peptide β-Faltblätter bilden (Mayo et al., Protein Sci. 5, 1301-1315 (1996)) und eines von ihnen, βpep-4, sich kompakt als antiparalleles β-Faltblatt-Sandwich faltet (Ilyina et al., Biochemistry 36, 5245-5250 (1997)). βpep-19 ist im Bereich von 10^–8 Mol potenziell bakterizid (Mayo et al., Biochim. Biophys. Acta 1425, 81-92 (1998)). βpep-Peptide funktionieren wie Limulus anti-LPS-Faktor (LALF) und das homologe bakterizide/Permeabilität-erhöhende Protein (B/PI) (Hoess et al., EMBO J. 12, 3351-3356 (1993)), wobei alle die Aktivität durch ein amphipatisches strukturelles β-Faltblatt-Motiv, das eine kationische β-Faltblatt-Oberfläche hat, zu exprimieren scheinen (Kelly et al., Surgery 114, 140-146 (1993); Siefferman et al., Infect. Immun. 59, 2152-2157 (1991); Beamer et al., Science 276, 1861-1864 (1997); und Gray et al., Biochim. Biophys. Acta 1244, 185-190 (1995)).
Zahlreiche Studien über bakterizide Peptide zeigen die funktionelle Wichtigkeit einer positiven Nettoladung und hoher Hydrophobie im Zusammenhang mit einer amphipathischen, üblicherweise helikalen Struktur an (Maloy et al., Biopolymers 37, 105-112 (1995)). Die positive Nettoladung fördert die Interaktion mit der negativ geladenen Oberfläche von Bakterienmembranen (Matsuzaki et al., Biochemistry 36, 2104-2111 (1997)), wohingegen Struktur-Aktivitäts-Beziehungen zeigen, dass die amphipathische Konformation des Peptids die bakterielle Zell-Lyse fördert (Andreu et al., Biochemistry 24, 1683-1688 (1985)). Bakterizide Peptide wie Cecropine (Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 9159-9162 (1989)), Magainine (Zasloff et al., J. Biol. Chem. 264, 12826-12829 (1987)), Prolin-Arginin-reiche Peptide (Agerberth et al., Eur. J. Biochem. 202, 849-854 (1991)) und Sapecin (Matsuyama et al., J. Biol. Chem. 263, 17112-17116 (1988)) haben alle, wie βpep-Peptide, eine positive Nettoladung und beträchtlichen hydrophoben Charakter. Die Cecropine und Magainine sind Helix bildende Peptide (Holak et al., Biochemistry 27, 7620-7629 (1988); und Marion et al., FEBs Lett. 227, 21-26 (1988)), wohingegen die Sapacine sowohl α-Helix- als auch β-Faltblatt-Segmente enthalten (Hanzawa et al., FEBs Lett. 269, 413-420 (1990)). Strukturen der Prolin-Arginin-reichen Peptide sind unbekannt. Tachyplesin, ein bakterizides und Endotoxin neutralisierendes Peptid, das aus Hämocyten des Pfeilschwanzkrebses („horseshoe crab") isoliert wird (Kawano et al., J. Bio. Chem. 265, 15365-15367 (1990)) sowie antibakterielle Peptid-Defensine (Selsted et al., J. Biol. Chem. 264, 4003-4007 (1989); und Lehrer et al., Cell 64, 229-230 (1991)) bilden dimere β-Faltblätter, die durch drei intramolekulare Disulfidbrücken stabilisiert werden (Hill et al., Science 251, 1481-1485 (1991)). Zusätzlich wurde, basierend auf der Struktur des anti-LPS cyclisches Peptid-Polymyxin B (Morrison et al., Immunochem. 13, 813-818 (1976)), eine Anzahl an kleinen antibiotischen Peptiden, als kurze β-Haarnadeln, verbunden durch eine Disulfidbrücke, hergestellt (Rustici et al., Science 259, 361-365 (1993)).
Die vorliegende Erfindung stellt ein Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
und Analoge davon, die wirksam sind zur Behandlung von bakterieller Infektion, zur Behandlung von Endotoxämie, zum Verringern der Menge an TNF-α, zum Hemmen endothelialer Zellproliferation, zum Hemmen angiogenetischer Faktor-vermittelter Herabregulierung interzellulärer Adhäsionsmolekülexpression, zum Hemmen von Angiogenese und/oder zum Hemmen von Tumorgenese, wobei ein Analog davon durch das Enthalten einer Deletion einer Aminosäure, von Additionen einer oder zwei Aminosäuren, von Austauschen konservierter Aminosäuren oder von chemischen und/oder enzymatischen Modifikationen an einer oder mehreren bestehenden Aminosäuren, beinhaltend Seitenkettenmodifikationen, Rückgrat modifikationen und N- und C-terminale Modifikationen; und Kombinationen davon zur Verfügung, worin X eine Aminosäure ist.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls eine Verwendung eines vorstehend aufgelisteten Polypeptids (d.h. eines oder mehrerer Polypeptide) zur Herstellung eines Arzneimittels zum Behandeln von bakterieller Infektion und/oder Endotoxämie zur Verfügung. Dabei ist das Arzneimittel, umfassend ein vorstehend aufgelistetes Polypeptid (d.h. ein oder mehrere Polypeptide) in einer Menge an einen Patienten zu verabreichen, die wirksam ist, um die bakterielle Infektion zu hemmen und/oder Endotoxin zu neutralisieren. Ein Verfahren zur Hemmung von bakterieller Infektion und/oder Endotoxämie in vitro wird ebenfalls zur Verfügung gestellt. Das Verfahren umfasst das Inkontaktbringen von Zellen mit einer Menge einer Zusammensetzung, die wirksam ist, um die bakterielle Infektion zu hemmen und/oder Endotoxin zu neutralisieren, wobei die Zusammensetzung ein vorstehend aufgelistetes Polypeptid umfasst.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls eine Verwendung eines vorstehend aufgelisteten Polypeptids (d.h. eines oder mehrerer Polypeptide) zur Herstellung eines Arzneimittels zum Verringern der Menge an TNF-α in einem Patienten zur Verfügung. Dabei ist das Arzneimittel, umfassend ein vorstehend aufgelistetes Polypeptid in einer therapeutisch wirksamen Menge an den Patienten zu verabreichen. Ein Verfahren zum Verringern der Menge von TNF-α in vitro wird ebenfalls zur Verfügung gestellt. Das Verfahren umfasst das Inkubieren von Zellen mit einer wirksamen Menge einer Zusammensetzung, enthaltend ein Polypeptid, ausgewählt aus den vorstehend aufgelisteten. Andere Peptide, die für diese Verfahren geeignet sind, umfassen Analoge der vorstehend aufgelisteten, die zum Verringern der Menge an TNF-α aktiv sind.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls eine Verwendung eines vorstehend aufgelisteten Polypeptids (d.h. eines oder mehrerer Polypeptide) zur Herstellung eines Arzneimittels zum Hemmen endothelialer Zellproliferation in einem Patienten zur Verfügung. Dabei ist eine therapeutisch wirksame Menge einer Zusammensetzung, umfassend ein vorstehend aufgelistetes Polypeptid, an den Patienten zu verabreichen. Ein Verfahren zum Hemmen endothelialer Zellproliferation in vitro wird ebenfalls zur Verfügung gestellt. Das Verfahren beteiligt das Inkontaktbringen von Zellen mit einer wirksamen Menge einer Zusammensetzung, enthaltend ein vorstehend aufgelistetes Polypeptid. Andere Polypeptide, die für diese Verfahren geeignet sind, umfassen Analoge der vorstehend aufgelisteten, die beim Hemmen der endothelialen Zellproliferation aktiv sind.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls eine Verwendung eines vorstehend aufgelisteten Polypeptids (d.h. eines oder mehrerer Polypeptide) zur Herstellung eines Arzneimittels zum Hemmen angiogenetischer Faktor-vermittelter Herabregulierung interzellulärer Adhäsionsmolekülexpression in einem Patienten zur Verfügung. Dabei ist eine therapeutisch wirksame Menge einer Zusammensetzung, enthaltend ein vorstehend aufgelistetes Polypeptid, an den Patienten zu verabreichen. Ein Verfahren zum Hemmen angiogenetischer Faktor-vermittelter Herabregulierung interzellulärer Adhäsionsmolekülexpression in vitro wird ebenfalls zur Verfügung gestellt. Das Verfahren umfasst das Inkontaktbringen von Zellen mit einer wirksamen Menge einer Zusammensetzung, enthaltend ein vorstehend aufgelistetes Polypeptid. Andere Polypeptide, die für diese Verfahren geeignet sind, umfassen Analoge der vorstehend aufgelisteten, die beim Hemmen angiogenetischer Faktor-vermittelter Herabregulierung interzellulärer Adhäsionsmolekülexpression aktiv sind.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls eine Verwendung eines vorstehend aufgelisteten Polypeptids (d.h. eines oder mehrerer Polypeptide) zur Herstellung eines Arzneimittels zum Inhibieren von Angiogenese in einem Patienten zur Verfügung. Dabei ist eine therapeutisch wirksame Menge einer Zusammensetzung, enthaltend ein vorstehend aufgelistetes Polypeptid; an den Patienten zu verabreichen. Ein Verfahren zum Hemmen von Angiogenese in vitro wird ebenfalls zur Verfügung gestellt. Das Verfahren umfasst das Inkontaktbringen von Zellen mit einer wirksamen Menge einer Zusammensetzung, enthaltend ein vorstehend aufgelistetes Polypeptid. Andere Polypeptide, die für diese Verfahren geeignet sind, umfassen Analoge der vorstehend aufgelisteten, die bei der Inhibierung von Angiogenese aktiv sind.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls eine Verwendung eines vorstehend aufgelisteten Polypeptids (d.h. eines oder mehrerer Polypeptide) zur Herstellung eines Arzneimittels zum Inhibieren von Tumorgenese in einem Patienten zur Verfügung. Dabei ist eine therapeutisch wirksame Menge einer Zusammensetzung, enthaltend ein vorstehend aufgelistetes Polypeptid, an den Patienten zu verabreichen. Andere Polypeptide, die für dieses Verfahren geeignet sind, umfassen Analoge der vorstehend aufgelisteten, die bei der Inhibierung von Tumorgenese aktiv sind.
Die vorliegende Erfindung stellt unter Verwendung von kernmagnetischer Resonanz (NMR)-Spektroskopie (z.B. ein- und zweidimensionaler NMR) und Zirkulärdichroismus (CD)-Spektroskopie ebenfalls eine dreidimensionale Struktur von bestimmten Polypeptiden zur Verfügung. Diese Information ist in Bereichen wie dem Wirkstoffnachweis von entscheidender Nützlichkeit. Somit stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Verwendung solcher struktureller Information zur Verfügung.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Polypeptid zur Verfügung, das eine amphipathische α-helikale oder 3₁₀-helikale Struktur hat und das eine Oberfläche hat, die primär aus positiv geladenen Aminosäureresten zusammengesetzt ist und eine gegenüberliegende Oberfläche, die primär aus hydrophoben Aminosäureresten zusammengesetzt ist, wobei diese eine grenzflächenaktive Domäne definieren, wobei die grenzflächenaktive Domäne die Aminosäuren K1, K4, K8 und R5, wie dargestellt in 6, umfasst, wobei Aminosäure K1 N-terminal ist und wobei das Polypeptid 12 bis 14 Aminosäurereste, vorzugsweise 12 Aminosäurereste hat.
Stärker bevorzugt umfasst die grenzflächenaktive Domäne die Atome 1 bis 24, 64-109 und 146-167, aufgelistet in Tabelle 5. Stärker bevorzugt hat das Polypeptid die Strukturkoordinaten, wie in Tabelle 5 aufgelistet, und hat am stärksten bevorzugt die Sequenz KLFKRHLKWKII (SEQ ID NO:4).
Ein spezifisches Verfahren der vorliegenden Erfindung umfasst die Beurteilung einer Kandidaten-Verbindung auf strukturelle Ähnlichkeit zu der von KLFKRHLKWKII (SEQ ID NO:4) durch: Bereitstellen einer dreidimensionalen Struktur von KLFKRHLKWKII (SEQ ID NO:4); Bereitstellen einer dreidimensionalen Struktur einer Kandidatenverbindung; und Vergleichen der dreidimensionalen Struktur der Kandidatenverbindung mit der dreidimensionalen Struktur von KLFKRHLKWKII (SEQ ID NO:4).
Wie hierin verwendet betrifft „ein" oder „eine" einen oder mehrere der Begriffe, die modifiziert wurden. Somit umfassen die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung ein oder mehrere Polypeptide.
„Aminosäure" wird hierin verwendet, um eine chemische Verbindung mit der allgemeinen Formel zu bezeichnen: NH₂-CRH-COOH, worin R, die Seitenkette, H oder eine organische Gruppe ist. Wenn R eine organische Gruppe ist, kann R variieren und ist entweder polar oder unpolar (d.h. hydrophob). Die Aminosäuren dieser Erfindung können natürlich vorkommen oder synthetisch sein (oft als nicht-proteinogen bezeichnet). Wie hierin verwendet, ist eine organische Gruppe eine Kohlenwasserstoffgruppe, die als aliphatische Gruppe, als zyklische Gruppe oder als Kombination von aliphatischen und zyklischen Gruppen klassifiziert ist. Der Begriff „aliphatische Gruppe" bedeutet eine gesättigte oder ungesättigte, lineare oder verzweigte Kohlenwasserstoffgruppe. Dieser Begriff wird verwendet, um zum Beispiel Alkyl-, Alkenyl-, und Alkinylgruppen zu umfassen. Der Begriff „zyklische Gruppe" bedeutet eine geschlossene Ring-Kohlenwasserstoffgruppe, die als eine alizyklische Gruppe, aromatische Gruppe oder heterozyklische Gruppe klassifiziert wird. Der Begriff „alizyklische Gruppe" bedeutet eine zyklische Kohlenwasserstoffgruppe, die Eigenschaften hat, die jenen von aliphatischen Gruppen ähneln. Der Begriff „aromatische" Gruppe bezieht sich auf mono- oder polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffgruppen. Wie hierin verwendet, kann eine organische Gruppe substituiert oder nicht-substituiert sein.
Die Begriffe „Polypeptid" und „Peptid", wie hierin verwendet, werden austauschbar verwendet und beziehen sich auf ein Polymer aus Aminosäuren. Diese Begriffe beinhalten keine spezifische Länge eines Polymers aus Aminosäuren. Demnach sind zum Beispiel die Begriffe Oligopeptid, Protein, und Enzym in der Definition von Polypeptid oder Peptid miteingeschlossen, ob unabhängig davon, unter Verwendung rekombinanter Verfahren, chemischer oder enzymatischer Synthese hergestellt wurden oder natürlich vorkommen. Dieser Begriff umfasst auch Polypeptide, die zum Beispiel durch Glycosylierung, Acetylierung, Phosphorylierung und Ähnliches modifiziert oder derivatisiert wurden.
Die folgenden Abkürzungen werden in der Anmeldung durchweg verwendet:

A: = Ala = Alanin
V: = Val = Valin
L: = Leu = Leucin
I: = Ile = Isoleucin
T: = Thr = Threonin
C: = Cys = Cystein
Y: = Tyr = Tyrosin
N: = Asn = Asparagin
P: = Pro = Prolin
F: = Phe = Phenylalanin
W: = Trp = Tryptophan
M: = Met = Methionin
G: = Gly = Glycin
S: = Ser = Serin
Q: = Gln = Glutamin
D: = Asp = Asparaginsäure
E: = Glu = Glutaminsäure
K: = Lys = Lysin
R: = Arg = Arginin
H: = His = Histidin

Andere Abkürzungen, die durchweg verwendet werden, umfassen: B/PI, bakterizides/Permeabilitäts-erhöhendes Protein; LALF, Limulus -anti-Lipopolysaccharid-Faktor; LPS, Lipopolysaccharid; PF4, Plättchen-Faktor 4; NMR, kernmagnetische Resonanzspektroskopie; NOE, Kern-Overhauser-Effekt; rf, Strahlenfrequenz, FID, freier Induktionsabfall; CD, Zirkulärdichroismus; HPLC, Hochleistungsflüssigchromatographie; PBS, phosphatgepufferte Kochsalzlösung; FCS, foetales Kälberserum.
1. Peptidsequenzen: Peptidsequenzen werden für βpep-19 (SEQ ID NO: 18) und βpep-25 (SEQ ID NO: 19) zusammen mit jenen von acht Dodecapeptiden gezeigt, die durch die Sequenz von βpep-25 „hindurchwandern". Die Dodecapeptide werden als SC-Peptide bezeichnet. Das -NH₂ zur Rechten jeder Sequenz zeigt eine Amidierung der C-terminalen Carboxylatgruppe an.
2. Bakterizide Dosis-Reaktionskurven für Peptide. Eine ausgewählte Anzahl an Dosisreaktionskurven wird in dieser Figur als prozentualer Anteil der getöteten Bakterien gegen den Logarithmus der Peptidkonzentration gezeigt. Die Daten für drei Bakterienstämme sind bereitgestellt: (A) rauer Stamm E. coli J5; (B) glatter Stamm E. coli IA2; und (C) ein Stamm von Gram-positivem S. aureus MNHO. Die Dosisreaktionkurven wurden, wie im Abschnitt Methoden beschrieben, erhalten.
3. Dosisreaktionkurven für Endotoxin-Neutralisation. Dosisreaktionskurven, wie im Abschnitt Methoden beschrieben, werden als prozentuale LPS-Neutralisation gegen den Logarithmus der Peptidkonzentration gezeigt. Das obere Feld veranschaulicht die Ergebnisse für SC-Peptide und für βpep-25, und das untere Feld veranschaulicht die Ergebnisse für verschiedene Varianten von SC-4, wie im Text beschrieben.
4. CD-Spektren für SC-Peptide. Stark ultralviolette zirkulärdichroische Spektren für zwei SC-Peptide, SC-5 und SC-7, werden als mittlere Rest-Elliptizität gegen Wellenlänge (nm) gezeigt. Die Peptidkonzentration in 20 mM Kaliumphosphat, pH 6,3, betrug 40 μM. Die Temperatur wurde auf 20°C gestellt. Die anderen Versuchsbedingungen werden im Abschnitt Methoden erörtert. Die gezeigten CD-Spuren wurden als eine Funktion der TFE-Konzentration von 0% bis 70% (Volumen/Volumen) erhalten. Die Insertion in der Mitte zeigt die Veränderung an (θ)222 gegen die Konzentration an Trifluorethanol (TFE).
5. NOESY-Spektren für SC-4. ¹H-NMR-Spektren bei 600 MHz werden für SC-4 in Gegenwart (A) und Abwesenheit (B) von 30% Trifluorethanol/70% Wasser gezeigt. Die Peptidkonzentration lag in 10 mM Kaliumphosphat, pH-Wert 5,5 und 25°C bei 6,3 mM. Die Spektren wurden mit 8k-Datenpunkten über eine spektrale Breite von 6000 Hz akkumuliert und mit 1 Hz Linienverbreiterung prozessiert. Nur Spektralbereiche unterhalb der HDO-Resonanz sind gezeigt und einige Resonanzzuordnungen werden angezeigt.
6. NOE-abgeleitete Strukturen von SC-4. Für das Dodecapeptid SC-4 wurden 14 finale NOE-abgeleitete Strukuren links von der Figur übereinandergelegt und Struktur-Statistiken sind in Tabelle 3 angegeben. Die Durchschnittsstruktur wird rechts gezeigt, und vier positiv geladene Reste, K1, K4, R5, und K8, die auf einer Oberfläche der amphipathischen Helix liegen, werden räumlich dargestellt.
7. Helikale Welndelprojektionen für SC-Peptide. SC-Peptidsequenzen werden in helikalen Wendelprojektionen, wie im Text erörtert, gezeigt.
Diese Erfindung trägt zur Entwicklung von Agenzien zur Bekämpfung des immer wiederkehrenden Problems wirkstoffresistenter Mikroorganismen bei. Es beteiligt den Nachweis von Polypeptiden, die bei der Behandlung von bakterieller Infektion und/oder bakterieller Endotoxämie sowie anderen Störungen wirksam sind.
Die Zusammensetzungen, die die Polypeptide dieser Erfindung umfassen, können Zellen in Kultur zugesetzt werden oder verwendet werden, um Patienten wie Säuger zu behandeln. Wenn die Polypeptide verwendet werden, um einen Patienten zu behandeln, wird das Polypeptid vorzugsweise in einem Arzneimittel mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger wie einem größeren Molekül zur Förderung der Polypeptid-Stabilität, oder mit einem pharmazeutisch verträglichen Puffer, der als Träger für das Polypeptid dient, kombiniert.
Die Behandlung kann prophylaktisch oder therapeutisch sein. Somit kann die Behandlung entweder vor, während oder nach der Entwicklung des Zustands (z.B. bakterielle Infektion oder Endotoxämie) begonnen werden. Somit umfassen die Formulierungen „Hemmung von" oder „wirksam", einen Zustand wie zum Beispiel eine bakterielle Infektion und/oder Endotoxämie „zu hemmen", sowohl die prophylaktische als auch die therapeutische Behandlung (d.h. Prävention und/oder Umkehr des Zustands).
Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung eines vorstehend aufgelisteten Polypeptids (d.h. eines oder mehrerer Polypeptide) zur Herstellung eines Arzneimittels zum Behandeln von bakterieller Infektion und/oder Endotoxämie in einem Patienten (z.B. einem Säuger wie einem Menschen) zur Verfügung. Dabei ist eine Menge eines Arzneimittels an einen Patienten zu verabreichen, die wirksam ist, um die bakterielle Infektion zu hemmen und/oder Endotoxin zu neutralisieren, wobei das Arzneimittel ein oder mehrere hierin beschriebene Polypeptide umfasst. Analog stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Hemmen von bakterieller Infektion und/oder Endotoxämie in vitro (z.B. in einer Zellkultur) zur Verfügung. Dieses Verfahren beteiligt das Inkontaktbringen von Zellen mit einer Menge einer Zusammensetzung, die wirksam ist, die bakterielle Infektion zu hemmen und/oder Endotoxin zu neutralisieren, wobei die Zusammensetzung ein oder mehrere hierin beschriebene Polypeptide umfasst.
Vor mehr als 100 Jahren wurde festgestellt, dass hitzestabile Extrakte Gram-negativer Darmbakterien stark toxisch sind. Da die Investigatoren annahmen, dass diese Toxine beim Tod des Bakteriums aus dessen Innerem freigesetzt wurden, nannten sie diese Toxine „Endotoxine". Nachfolgende chemische Untersuchungen zeigten, dass diese Endotoxine in Wirklichkeit Lipopolysaccharid (LPS)-Bestandteile der äußeren Membran von Darmbakterien sind. Toxisches LPS setzt sich aus drei Struktureinheiten zusammen – einem äußeren Polysaccharid-Bestandteil, einer Oligosaccharid-Kernregion und dem inneren Abschnitt, Lipid A, der dem Molekül seine entzündungsfördernden Aktivitäten verleiht. Toxisches LPS wird von dem Bakterium, wenn es stirbt, oder während Zeiten schnellen Bakterienwachstums freigesetzt.
Bei vielen Arten, zum Beispiel Menschen, Kühen, Kaninchen, Mäusen und Ratten bindet toxisches LPS in Serum schnell an ein Plasmapolypeptid, das Lipopolysaccharid-Bindungsprotein (LBP) genannt wird. LBP, das durch Hepatocyten als Teil der Akutphasenreaktion der Entzündung synthetisiert wird, hat eine starke Affinität zum Lipid A-Abschnitt von Endotoxin.
Die Aktivierung einer Zelle durch einen toxischen LPS enthaltenden Komplex ergibt die Synthese, Freisetzung oder Aktivierung von Zell-abgeleiteten entzündungsfördernden Vermittlern, die Cytokine (z.B. Interleukin-1, Interleukin-6, Interleukin-8, und Tumor-Nekrose-Faktor-α), Plättchen-aktivierenden Faktor, Stickstoffoxid, Komplement (z.B. C5a und C3a), Prostaglandine, Leukotriene, das Kininsystem, Sauerstoff-Metaboliten, Catecholamine und Endorphine umfassen können. Die Vermittler können Organsysteme einschließlich des Herzens, des Gefäßsystems, des Gerinnungssystems, der Lungen, der Leber, der Niere und des Zentralnervensystems beeinflussen. Diese Faktoren können zu Endotoxämie, auch als endotoxischer Schock bezeichnet, septischem Schock, Kreislaufschock und Septicämie, einer fortschreitenden Krankheit, die zum Tod führen kann, führen.
Endotoxämie wird typischerweise durch toxisches LPS von Gram-negativen Bakterien verursacht, kann jedoch auch durch Gram-positive Bakterien und gelegentlich durch Pilze verursacht werden. Bestandteile, die durch Gram-positive Bakterien freigesetzt werden, die Endotoxämie verursachen können, umfassen Peptidoglycan und Lipoteichonsäure und Lipoarabinomannan aus der Zellwand von Mycobacterium spp.
Untersuchungen haben gezeigt, dass die Serumkonzentrationen des Cytokin-Tumor-Nekrose-Faktors (TNF) nach dem Auftreten von Endotoxämie ansteigen und dass die Serum-TNF-Aktivität direkt mit dem Auftreten von Zeichen wie zum Beispiel Abdominalschmerz und Fieber in Verbindung steht. Somit kann die Endotoxin-Aktivität auch durch Bestimmen der Menge der Freisetzung von Tumor-Nekrose-Faktor alpha (TNF-α) von einer Makrophagen-Zelllinie oder durch Beurteilung der Schocksymptome bei Tieren gemessen werden. Die Herstellung von TNF-α kann, wie durch Mossman et al. (Immunological Methods 65:55, 1983) beschrieben, getestet werden.
Sowohl in den Verwendungen in vivo als auch in den Verfahren in vitro umfasst das „Hemmen" einer bakteriellen Infektion die Prävention sowie auch die Umkehrung oder Reduktion des Bakterienwachstums bei einem Patienten oder einer Zellprobe, und das „Neutralisieren" von Endotoxinen umfasst die Bindung von LPS und somit seine Entfernung aus dem System eines Patienten oder einer Zellprobe. Das Ausmaß einer Bakterieninfektion kann gemäß dem Bakterizid-Test, der im Abschnitt Beispiele beschrieben wird, bestimmt werden. Das Ausmaß der Endotoxämie kann gemäß dem LPS-Neutralisationstest, der im Abschnitt Beispiele beschrieben wird, bestimmt werden. Diese Tests können verwendet werden, um die Wirksamkeit eines Polypeptids, ob in vivo oder in vitro verwendet, zu bestimmen. Um die Wirksamkeit der Behandlung eines Patienten, der eine bakterielle Infektion hat, zu bestimmen, kann eine Blutprobe genommen, eine Kultur entwickelt und die Menge an lebenden Bakterien gemäß dem Bakterizid-Test, der im Abschnitt Beispiele beschrieben wird, bestimmt werden. Um die Wirksamkeit der Behandlung eines Patienten, der Endotoxämie hat, zu bestimmen, kann eine Blutprobe genommen, eine Kultur entwickelt und die Menge an Cytokinen (z.B. TNF-α, IL-1) unter Verwendung von Verfahren bestimmt werden, die dem Fachmann bekannt sind. Zum Beispiel kann der WEHI-Test für den Nachweis von TNF-α verwendet werden (Battafarano et al., Surgery 118, 318-324 (1995)).
Die wirksame Menge eines Peptids zur Behandlung einer bakteriellen Infektion wird von der bakteriellen Infektion, dem Ort der Infektion und dem Peptid abhängen. Eine wirksame Menge des Peptids zur Behandlung von bakterieller Infektion ist die Menge, die die Anzahl an Bakterien in dem Tier verringert und die die Symptome, die mit der bakteriellen Infektion einhergehen, wie Fieber, Schmerz und andere einhergehenden Symptome der bakteriellen Infektion verringert. Die wirksame Menge eines Peptids kann durch Standard-Dosis-Reaktionsverfahren in vitro bestimmt werden, und eine Menge an Peptid, die wirksam ist, um mindestens etwa 50% bis etwa 100% der Bakterien (LD₅₀) und stärker bevorzugt etwa 60% bis etwa 100% der Bakterien abzutöten, würde als wirksame Menge angesehen werden. Vorzugsweise hat das Peptid eine wirksame Dosis in einer Konzentration von etwa 1 × 10^–4 M bis etwa 1 × 10^–10 M und stärker bevorzugt in einer Konzentration von etwa 1 × 10^–7 M bis etwa 1 × 10^–9 M. Peptide, die als bakterizid betrachtet werden, töten in Konzentrationen von etwa 10^–10 M oder höher unter physiologischen Bedingungen (z.B. bei einem pH-Wert von 5,6) mindestens einen Organismus, ausgewählt aus der Gruppe aus P. aeruginosa, P. cepacia, E. coli B, Salmonella, Proteus mirabilis und Staphylococcus aureus ab.
Alternativ kann eine wirksame Menge des Peptids zur Behandlung einer bakteriellen Infektion in einem tierischen System wie einer Maus bestimmt werden. Akute Peritonitis kann bei Mäusen wie herausgezüchteten Schweizer Webster-Mäusen durch intraperitoneale Injektion mit Bakterien wie P. aeruginosa, wie durch Dunn et al., (Surgery, 98:283, 1985); Cody et al. (Int. Surg. Res., 52:315, 1992) beschrieben, induziert werden. Verschiedene Peptid-Mengen können eine Stunde vor der Injektion der Bakterien intravenös injiziert werden. Der prozentuale Anteil lebensfähiger Bakterien im Blut, in der Milz und der Leber kann in Gegenwart und Abwesenheit des Peptids oder anderer Antibiotika bestimmt werden. Während dies die Erfindung nicht einschränken soll, wird angenommen, dass bakterizides Peptid auch die Effizienz anderer Antibiotika wie Erythromycin und Ähnlichem verstärken könnte.
Bakterizide Aktivität kann gegen viele verschiedene Bakterien, vorzugsweise Gram-negative Bakterien bestimmt werden, jedoch können die Bakterientypen Pseudomonas spp, einschließlich P. aeruginosa und P. cepacia, E. coli-Stämme, einschließlich E. coli B, Salmonella, Proteus mirabilis und Staphylococcus-Stämme wie Staphylococcus aureus umfassen. Ein bevorzugter Organismus ist Pseudomonas aeruginosa
Peptide mit Endotoxin neutralisierender Aktivität können verwendet werden, um Säuger, die mit Gram-negativen Bakterien infiziert sind, und die Symptome von Endotoxin-Schock wie Fieber, Schock und TNF-α-Freisetzung zeigen, systemisch zu behandeln. Die Tiere sind typischerweise mit einem oder mehreren Gram-negativen Bakterien wie Pseudomonas spp., rauen Stämmen von E. coli, eingekapseltem E. coli und glattem E. coli-Stamm infiziert. Das Endotoxin neutralisierende Peptid kann mit anderen Agenzien kombiniert werden, die bekannt sind und verwendet werden, um Endotoxin-Schock zu behandeln.
Endotoxin neutralisierende Aktivität kann durch Bestimmen der molaren Konzentration, bei der das Peptid die Wirkung von Lipopolysaccharid in einem Test wie dem Limulus Amoebocyten-Lysat-Test (LAL, Sigma Chemicals, St. Louis, MO) oder dem chromogenen LAL 1000-Test (Biowhittacker, Walkersville, MD) vollständig hemmt, gemessen werden. Endotoxin neutralisierende Aktivität kann auch unter Verwendung von Standard-Dosisreaktionsverfahren durch Berechnen einer inhibitorischen Dosis 50 (LD₅₀) gemessen werden. Eine inhibitorische Dosis 50 ist die Peptidmenge, die 50% der Aktivität von Endotoxin hemmen kann. Peptide neutralisierten Endotoxin bevorzugt bei einer molaren Konzentration von etwa 1 × 10^–4 M bis etwa 10^–8 M, stärker bevorzugt etwa 10^–5 M bis etwa 10^–6 M. Peptide, von denen angenommen wird, dass sie keine Endotoxin neutralisierende Aktivität haben, neutralisieren Endotoxin bei einer molaren Konzentration von etwa 10^–4 M oder weniger nicht.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls die Verwendung eines vorstehend aufgelisteten Polypeptids (d.h. eines oder mehrerer Polypeptide) zur Herstellung eines Arzneimittels zum Verringern der Menge an TNF-α in einem Patienten (z.B. einem Säuger wie einem Menschen) zur Verfügung. Dabei ist eine Menge eines Arzneimittels, die wirksam ist, die Menge an TNF-α in dem System eines Patienten zu verringern, wie durch Bestimmen der Serumwerte von TNF-α festgestellt, wobei das Arzneimittel ein oder mehrere hierin beschriebene Polypeptide umfasst, an den Patienten zu verabreichen. Analog stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Verringern der Menge an TNF-α in vitro (z.B. in einer Zellkultur) zur Verfügung. Dieses Verfahren beteiligt das Inkubieren von Zellen mit einer Menge einer Zusammensetzung, die wirksam ist, die TNF-α-Mengen in der Zellkultur zu verringern, wobei die Zusammensetzung ein oder mehrere hier beschriebene Polypeptide einschließt. Sowohl für die Verwendungen in vivo als auch die Verfahren in vitro kann der WEHI-Test in Zellkulturen oder im Serum eines Patienten für den Nachweis von TNF-α verwendet werden (Battafarano et al., Surgery 118, 318-324 (1995)). Alternativ kann die Menge an TNF-α in einer Probe unter Verwendung eines anti-TNF-α-Antikörpers getestet werden. Ein Polypeptid, das für das Verringern von TNF-α „aktiv" ist, kann unter Verwendung eines in vitro-Tests bestimmt werden und zeigt vorzugsweise einen Rückgang der Menge an TNF-α von mindestens 10%.
Die Angiogenese ist für zahlreiche biologische Funktionen im Körper, von normalen Vorgängen wie der Embryogenese und der Wundheilung bis zu abnormalen Vorgängen wie Tumorwachstum, Arthritis, Restenose und diabetischer Retinopathie, von Bedeutung. Die Verwendung von Agenzien, insbesondere in der Antitumorforschung, die Angiogenese in vitro und in vivo hemmen können, zeigte an, dass die anti-angiogenetische Therapie in Zukunft eine vielversprechende therapeutische Modalität sein wird. Die Forschung nach angiogenetischen Inhibitoren wurde auf die Kontrolle von zwei Verfahren fokussiert, die Angiogenese fördern: Endotheliales Zell(EC)-Wachstum und -Adhäsion, vor allem weil ECs für pharmakologische Agenzien, die über das Blut transportiert werden, zugänglicher sind als andere Zellen und weil ECs genetisch stabil sind und nicht leicht in wirkstoffresistente Varianten mutiert werden. Die meisten anti-angiogenetischen Agenzien wurden durch Identifikation endogener Moleküle, vor allem Proteine, die das EC-Wachstum hemmen, nachgewiesen. Dieser traditionelle Ansatz stellte eine Vielzahl an anti-angiogenetischen Agenzien, wie Plättchen-Faktor-4 (PF4), Thrombospondin, Tumor-Nekrose-Faktor (TNF), Interferon-γ-induzierbares Protein-10, Angiostatin, Endostatin, Vasostatin und bakterizides Permeabilität-erhöhendes (BPI)-Protein her. Insgesamt sind etwa 40 anti-angiogenetische Agenzien, die unter Verwendung verschiedener Ansätze identifiziert wurden, aktuell bekannt.
Es wurde ebenfalls postuliert, dass Tumorwachstum durch Verminderung der Vaskularisation kontrolliert werden kann (Folkman, J. natl. Cancer. Inst. 82, 4-6 (1990); Folkman et al., J. biol. Chem. 267, 10931-10934 (1992)). Eine wachsende Anzahl an endogenen Inhibitoren der Angiogenese wie Plättchen-Faktor-4 (PF4), Interferon-γ-induzierbares Protein-10 (IP-10), Thrombospondin-1 (TSP-1), Angiostatin sowie synthetische Agenzien, z.B. Thalidomid, TNP-470 und Metallproteinase-Inhibitoren wurde beschrieben. Einige dieser Agenzien werden zur Zeit in klinischen Prüfungen der Phase I/II getestet. Vorherige Untersuchungen, beschrieben in Griffioen et al., Blood 88, 667-673 (1996) und Griffioen et al., Cancer Res. 56, 1111-1117 (1996), zeigten, dass pro-angiogenetische Faktoren in Tumoren die Herabregulierung von Adhäsionsmolekülen auf Endothelzellen im Tumor-Gefäßsystem induzieren und bei entzündlichen Signalen wie Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNFα), Interleukin-1 und Interferon-γ eine Anergie induzieren. EC, die vaskulärem endothelialem Zellwachstumsfaktor (VEGF) ausgesetzt wird, (Griffioen et al., Blood 88, 667-673 (1996) und basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) (Griffioen et al., Blood 88, 667-673 (1996); und Melder et al., Nature Med. 2, 992-997 (1996)) haben eine stark erschwerte Heraufregulierung von interzellulärem Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1) und Induktion von vaskulärem Zelladhäsionsmolekül-1 (VCAM-1) und E-Selectin. Dieses Phänomen, das tumorinduzierte EC-Anergie genannt wurde, ist ein Weg, auf dem Tumoren mit einem angiogenetischen Phänotyp der Infiltrierung durch cytotoxische Leukocyten entkommen können.
Da Angiogenese-vermittelte Herabregulierung endothelialer Adhäsionsmoleküle (EAM) Tumorwachstum durch Vermeiden der Immunreaktion fördern kann (Griffioen et al., Blood 88, 667-673 (1996); Kitayama et al., Cancer Res. 54, 4729-4733 (1994); und Piali et al., J. exp. Med. 181, 811-816 (1995)), wird angenommen, dass die Hemmung von Angiogenese die Herabregulierung von Adhäsionsmolekülen und das Ausbleiben einer Reaktion auf Entzündungssignale überstehen würde. Unterstützend zu dieser Hypothese wurde von einer Beziehung zwischen E-Selectin-Heraufregulierung und dem angiostatischen Agens AGM-1470 berichtet (Budson et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 225, 141-145 (1996)). Es wurde ebenfalls gezeigt, dass die Hemmung der Angiogenese durch PF4 ICAM-1 auf bFGF-simulierter EC heraufreguliert. Zusätzlich übersteht die Hemmung der Angiogenese durch PF4 die mit Angiogenese assoziierte EC-Anergie auf entzündliche Signale. Somit stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines vorstehend aufgelisteten Polypeptids (d.h. eines oder mehrerer Polypeptide) zur Herstellung eines Arzneimittels zum Inhibieren endothelialer Zellproliferation in einem Patienten (z.B.' einem Säuger wie einem Menschen) zur Verfügung. Dabei ist eine Menge eines Arzneimittels, die wirksam ist, das Wachstum von Endothelzellen zu hemmen, wobei das Arzneimittel ein oder mehrere hierin beschriebene Polypeptide umfasst, an einen Patienten zu verabreichen. Analog stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Inhibieren endothelialer Zellproliferation in vitro (z.B. in einer Zellkultur) zur Verfügung. Dieses Verfahren beteiligt das Inkontaktbringen von Zellen mit einer Menge einer Zusammensetzung, die wirksam ist, um das Wachstum von Endothelzellen zu verhindern und/oder zu verringern, wobei die Zusammensetzung ein oder mehrere hier beschriebene Polypeptide einschließt.
Zur Bestimmung der Menge der endothelialen Zellproliferation in vivo könnten verschiedene Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, verwendet werden. Zum Beispiel können für die Bestimmung von endothelialem Zellwachstum in Tumoren Gewebeproben auf geeignete Weise gefärbt werden, um die Gefäßdichte zu quantifizieren. Um die Menge der endothelialen Zellproliferation in vitro zu bestimmen, kann der EC-Proliferationstest, beschrieben im Abschnitt Beispiele, verwendet werden, der die Aufnahme von tritiunmarkiertem Thymidin durch Zellen in Zellkultur beteiligt. Ein Polypeptid, das bei der Hemmung der endothelialen Zellproliferation „aktiv" ist, ist vorzugsweise eines, das bei einer geringeren Konzentration als 10^–4 M eine Verringerung der endothelialen Zellproliferation von mindestens 10% verursacht.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls die Verwendung eines vorstehend aufgelisteten Polypeptids (d.h. eines oder mehrerer Polypeptide) zur Herstellung eines Arzneimittels zum Hemmen durch angiogenetischen Faktor-vermittelter Herabregulierung interzellularer Adhäsionsmolekülexpression in einem Patienten (z.B. einem Säuger wie einem Menschen) zur Verfügung. Dabei ist eine Menge eines Arzneimittels, die wirksam ist, die Menge der Herabregulierung der ICAM-Expression zu verhindern und/oder zur reduzieren, wobei das Arzneimittel ein oder mehrere hierin beschriebene Polypeptide umfasst, an den Patienten zu verabreichen. Analog stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Hemmen durch angiogenetischen Faktor-vermittelter Herabregulierung interzellularer Adhäsionsmolekülexpression in vitro (z.B. in einer Zellkultur) zur Verfügung. Dieses Verfahren beteiligt das Inkontaktbringen von Zellen mit einer Menge einer Zusammensetzung, die wirksam ist, um die Menge der Herabregulierung der ICAM-Expression zu verhindern und/oder zur reduzieren, wobei die Zusammensetzung ein oder mehrere hier beschriebene Polypeptide einschließt.
Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung eines vorstehend aufgelisteten Polypeptids (d.h. eines oder mehrerer Polypeptide) zur Herstellung eines Arzneimittels zum Inhibieren von Angiogenese (z.B. einer neuen Blutgefäßbildung) in einem Patienten (z.B. einem Säuger wie einem Menschen) zur Verfügung. Dabei ist eine Menge eines Arzneimittels, die wirksam ist, Angiogenese zu verhindern und/oder zur reduzieren, wobei das Arzneimittel ein oder mehrere hierin beschriebene Polypeptide umfasst, an den Patienten zu verabreichen. Analog stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Inhibieren von Angiogenese in vitro (z.B. in einer Zellkultur) zur Verfügung. Dieses Verfahren beteiligt das Inkontaktbringen von Zellen mit einer Menge einer Zusammensetzung, die wirksam ist, um die Angiogenese zu verhindern und/oder zur reduzieren, wobei die Zusammensetzung ein oder mehrere hier beschriebene Polypeptide einschließt.
Zur Bestimmung der Menge der Angiogenese in vivo könnten verschiedene Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, verwendet werden. Zum Beispiel können für die Bestimmung von Angiogenese in Tumoren Gewebeschnitte auf geeignete Weise gefärbt werden, um die Gefäßdichte zu quantifizieren. Um die Menge der Angiogenese in vitro zu bestimmen, kann der in vitro-Angiogenesetest (z.B., EC-Tube-Formation Assay), beschrieben im Abschnitt Beispiele, verwendet werden, bei dem das Verschwinden von EC-Wachstum in Zellkultur beteiligt ist. Ein Polypeptid, das bei der Angiogenese-Inhibition „aktiv" ist, ist vorzugsweise eines, das bei einer geringeren Konzentration als 10^–4 M eine Verringerung des endothelialen Zellwachstums um mindestens 10% verursacht.
Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung eines vorstehend aufgelisteten Polypeptids (d.h. eines oder mehrerer Polypeptide) zur Herstellung eines Arzneimittels zum Inhibieren von Tumorgenese in einem Patienten (z.B. einem Säuger wie einem Menschen) zur Verfügung. Dabei ist eine Menge eines Arzneimittels, die wirksam ist, Tumorwachstum zu verhindern und/oder zu reduzieren, wobei das Arzneimittel ein oder mehrere hierin beschriebene Polypeptide umfasst, an den Patienten zu verabreichen. Verfahren zur Bestimmung der Inhibition von Tumorgenese, einschließlich der Bestimmung der Tumorschrumpfung, des Überlebens, etc., sind dem Fachmann wohlbekannt.
Ein bevorzugtes Polypeptid wird ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
und Analogen davon.
Ein alternatives Polypeptid wird ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
und Analogen davon; worin X eine natürliche oder synthetische Aminosäure ist. Vorzugsweise ist X Norleucin.
Ein stärker bevorzugtes Polypeptid wird ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
Die Polypeptide der SEQ ID NO: 1 bis 6 und 9 bis 17 können in ihrer freien Säureform vorliegen oder sie können an der C-terminalen Carboxylatgruppe amidiert sein. Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls Analoge des Polypeptids der SEQ ID NO: 1 bis 6 und 9 bis 17, die typischerweise eine strukturelle Ähnlichkeit mit den SEQ ID NO: 1 bis 6 und 9 bis 17 haben. Ein „Analog" eines Polypeptids umfasst mindestens einen Abschnitt des Polypeptids, wobei der Abschnitt Deletionen oder Additionen von einem oder zwei fortlaufenden oder nicht-fortlaufenden Aminosäuren enthält oder ein oder mehrere Aminosäuresubstitutionen enthält. Austausche für eine Aminosäure in den Polypeptiden der Erfindung sind konservative Substitutionen, die aus anderen Angehörigen der Klasse, zu der die Aminosäure gehört, ausgewählt wird. Zum Beispiel ist auf dem Fachgebiet der Proteinbiochemie wohlbekannt, dass eine Aminosäure, die zu einer Aminosäure-Gruppierung gehört, die eine bestimmte Größe oder Eigenschaft (wie Ladung, Hydrophobie und Hydrophilie) hat, im Allgemeinen gegen eine andere Aminosäure ausgetauscht werden kann, ohne die Struktur des Polypeptids wesentlich zu ändern.
Für die Zwecke dieser Erfindung können konservative Aminosäuresubstitutionen so definiert werden, dass sie aus dem Austausch von Aminosäureresten aus einer der folgenden Klassen von Resten resultieren: Klasse I: Ala, Gly, Ser, Thr und Pro (repräsentieren kleine aliphatische Seitenketten und Hydroxylgruppen-Seitenketten); Klasse II: Cys, Ser, Thr und Tyr (repräsentieren Seitenketten einschließlich einer -OH- oder -SH-Gruppe); Klasse III: Glu, Asp, Asn und Gln (Carboxylgruppen enthaltende Seitenketten): Klasse IV: His, Arg und Lys (repräsentieren basische Seitenketten); Klasse V: IIe, Val, Leu, Phe und Met (repräsentieren hydrophobe Seitenketten); und Klasse VI: Phe, Trp, Tyr und His (repräsentieren aromatische Seitenketten). Die Klassen umfassen auch verwandte Aminosäuren wie 3Hyp und 4Hyp in Klasse I; Homocystein in Klasse II; 2-Aminoadipinsäure, 2-Aminopimelinsäure, γ-Carboxyglutaminsäure, β-Carboxyasparaginsäure und die entsprechenden Aminosäureamide in Klasse III; Ornithin, Homoarginin, N-Methyllysin, Dimethyllysin, Trimethyllysin, 2,3-Diaminopropionsäure, 2,4-Diaminobuttersäure, Homoarginin, Sarcosin und Hydroxylysin in Klasse IV; substituierte Phenylalanine, Norleucin, Norvalin, 2-Aminooctansäure, 2-Aminoheptansäure, Statin und β-Valin in Klasse V; und Naphthylalanine, substituierte Phenylalanine, Tetrahydroisochinolin-3-carboxylsäure und halogenierte Tyrosine in Klasse VI.
Polypeptid-Analoge, wie dieser Begriff hierin verwendet wird, umfassen ebenfalls modifizierte Polypeptide. Die Modifikationen der Polypeptide der Erfindung umfassen chemische und/oder enzymatische Derivatisierungen an einer oder mehreren konstituierenden Aminosäuren, einschließlich Seitenkettenmodifikationen, Rückgratmodifikationen und N- und C-terminaler Modifikationen einschließlich Acetylierung, Hydroxylierung, Methylierung, Amidierung und der Anheftung von Kohlehydrat- oder Lipideinheiten, Cofaktoren und Ähnlichem.
Ein bevorzugtes Polypeptid-Analog wird dadurch charakterisiert, dass es mindestens eine der hierin beschriebenen biologischen Aktivitäten hat. Ein solches Analog wird hierin als ein „biologisch aktives Analog" oder einfach „aktives Analog" bezeichnet. Die biologische Aktivität eines Polypeptids kann zum Beispiel, wie im Abschnitt Beispiele beschrieben, bestimmt werden.
Die Polypeptide der Erfindung können durch das Festphasenverfahren unter Verwendung von Standardverfahren synthetisiert werden, die entweder auf t-Butyloxycarbonyl (BOC)- oder 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (FMOC)-Schutzgruppen basieren. Diese Methodologie wird durch G.B. Fields et al. in Synthetic Peptides: A User's Guide, W.M. Freeman & Company, New York, NY, S. 77-183 (1992) beschrieben. Die vorliegenden Peptide können ebenfalls über rekombinante Verfahren, die dem Fachmann wohlbekannt sind, synthetisiert werden. Zum Beispiel beschreibt das US-Patent Nr. 5,595,887 Verfahren zur Erzeugung einer Vielzahl relativ kleiner Peptide durch die Expression eines rekombinanten Genkonstrukts, das ein Fusionsprotein codiert, das ein Bindungsprotein und ein oder mehrere Kopien des gewünschten Ziel-Peptids einschließt. Nach der Expression wird das Fusionsprotein unter Verwendung von chemischen und/oder enzymatischen Verfahren isoliert und gespalten, um das gewünschte Zielpeptid zu erhalten.
Die Polypeptide dieser Erfindung können allein in einem pharmazeutisch verträglichen Träger, als Antigen zusammen mit einem anderen Protein wie einem immunstimulatorischen Protein oder mit einem Protein-Träger wie KLH ("Keyhole limpet hemocyanin"), Rinderserumalbumin (BSA), Ovalbumin oder Ähnlichem, jedoch nicht darauf beschränkt, verabreicht werden. Sie können in einem einwertigen Zustand (d.h. freies Peptid oder ein einzelnes Peptidfragment, gekoppelt an ein Trägermolekül) verwendet werden. Sie können auch als Konjugate verwendet werden, die mehr als ein (gleiches oder verschiedenes) Peptid an ein einzelnes Trägermolekül gebunden haben. Der Träger kann ein biologisches Trägermolekül (z.B. ein Glycosaminoglycan, ein Proteoglycan, Albumin oder Ähnliches) oder ein synthetisches Polymer (z.B. ein Polyalkylenglykol oder ein synthetischer Chromatographie-Träger) sein. Typischerweise werden Ovalbumin, menschliches Serumalbumin, andere Proteine, Polyethylenglycol oder Ähnliches als Träger verwendet. Solche Modifikationen können die offensichtliche Affinität erhöhen und/oder die Stabilität eines Peptids verändern. Die Anzahl von Peptiden, die mit jedem Träger in Verbindung stehen oder an ihn gebunden sind, kann variieren, unter Standard-Kopplungsbedingungen werden pro Trägermolekül typischerweise jedoch 4 bis 8 Peptide erhalten.
Die Polypeptide können unter Verwendung von Standardverfahren wie der Aktivierung des Trägermoleküls mit einem heterobifunktionalen Sulfosuccinimidyl 4-(n-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat-Reagens mit anderen Polypeptiden konjugiert werden. Quervernetzung eines aktivierten Trägers mit einem Peptid kann durch Reaktion der Maleimid-Gruppe des Trägers mit der Sulfhydryl-Gruppe eines Peptids, das einen Cysteinrest enthält, stattfinden. Konjugate können durch die Verwendung von Gelfiltrations-Säulenchromatographie oder anderen Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, von freiem Peptid getrennt werden.
Zum Beispiel können Peptid/Trägermolekül-Konjugate durch Behandeln eines Peptidgemisches und von Trägermolekülen mit einem Kopplungsmittel wie einem Carbodiimid hergestellt werden. Das Kopplungsmittel kann entweder auf dem Peptid oder auf dem Trägermolekül eine Carboxylgruppe aktivieren, so dass die Carboxylgruppe mit einem Nucleophil (z.B. einer Amino- oder Hydroxylgruppe) auf dem anderen Mitglied des Peptid/Trägermoleküls reagieren kann, was eine kovalente Verbindung des Peptids und des Trägermoleküls ergibt.
Zum Beispiel können Konjugate eines Peptids, das an Ovalbumin gekoppelt ist, durch Lösen gleicher Mengen lyophilisierten Peptids und Ovalbumin in einem kleinen Volumen Wasser hergestellt werden. In einem zweiten Röhrchen wird 1-Ethyl-3-(3-dimethylamino-propyl)-carbodiimid-hydrochlorid (EDC; die zehnfache Menge des Peptids) in einer kleinen Menge Wasser gelöst. Die EDC-Lösung wird zu dem Peptid/Ovalbumingemisch zugesetzt und man lässt die Reaktion mehrere Stunden ablaufen. Das Gemisch kann dann dialysiert werden (z.B. in phosphatgepufferte Kochsalzlösung), um eine gereinigte Lösung von Peptid/Ovalbumin-Konjugat zu erhalten.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls eine Zusammensetzung zur Verfügung, die ein oder mehrere aktive Agenzien (d.h. Polymere) der Erfindung einschließt, sowie einen oder mehrere pharmazeutisch verträgliche Träger. Ein oder mehrere Polypeptide mit demonstrierter biologischer Aktivität können, allein oder zusammen mit anderen aktiven Agenzien und mit einem pharmazeutisch verträglichen Puffer, an einen Patienten in einer Menge verabreicht werden. Die Polypeptide können mit verschiedenen physiologisch verträglichen Trägern zur Verabreichung an einen Patienten einschließlich verschiedener Verdünnungsmittel oder Excipienten, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind, kombiniert werden. Zum Beispiel wird isotonische Kochsalzlösung für die parenterale Verabreichung vorgezogen. Für die topische Verabreichung kann eine Creme, einschließlich eines Trägers wie Dimethylsulfoxid (DMSO) oder anderen Agenzien, die typischerweise in topischen Cremes zu finden sind und die die Aktivität des Peptids nicht blockieren oder hemmen, verabreicht werden. Andere geeignete Träger umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Alkohol, phosphatgepufferte Kochsalzlösung und andere Salzlösungen im Gleichgewicht.
Die Formulierungen können praktischerweise in Einheitsdosierungsform präsentiert werden und können durch eines der Verfahren, die auf dem Fachgebiet der Pharmazie wohlbekannt sind, hergestellt werden. Vorzugsweise umfassen solche Verfahren den Schritt, das aktive Agens mit dem Träger, der aus einem oder mehreren zusätzlichen Bestandteilen besteht, in Verbindung zu bringen. Im Allgemeinen werden die Formulierungen dadurch hergestellt, dass das aktive Agens einheitlich und eng mit einem flüssigen Träger, einem fein geteilten festen Träger oder beiden in Verbindung gebracht und das Produkt dann in die gewünschten Formulierungen geformt wird.
Die Erfindung umfasst, dass die Zusammensetzung der Erfindung in einer Menge, die wirksam ist, um die erwünschte Wirkung zu erzielen, an einen Patienten, vorzugsweise einen Säuger, zu verabreichen ist. Die Peptide können als einzelne Dosis oder in mehreren Dosen verabreicht werden. Nützliche Dosierungen der aktiven Agenzien können durch einen Vergleich ihrer Aktivität in vitro mit der Aktivität in vivo in Tiermodellen bestimmt werden. Verfahren zur Extrapolierung wirksamer Dosierungen bei Mäusen und anderen Tieren auf den Menschen sind auf dem Fachgebiet bekannt; vgl. zum Beispiel US-Patent Nr. 4,938,949.
Die Agenzien der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise in Arzneimitteln formuliert und dann, in Übereinstimmung mit den Verfahren der Erfindung, in verschiedenen Formen, die an den gewählten Verabreichungsweg angepasst sind, an einen Patienten wie einen menschlichen Patienten verabreicht. Die Formulierungen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf jene, die für die orale, rektale, vaginale, topische, nasale, ophthalmische oder parenterale (einschließlich subkutane, intramuskuläre, intraperitoneale, intratumorale und intravenöse) Verabreichung geeignet sind.
Formulierungen, die für die parenterale Verabreichung geeignet sind, umfassen praktischerweise eine sterile wässrige Herstellung des aktiven Agens oder Dispersionen steriler Puder des aktiven Agens, die vorzugsweise mit dem Blut des Empfängers isotonisch sind. Isotonische Agenzien, die in die Flüssigherstellung eingeschlossen werden können, umfassen Zucker, Puffer und Natriumchlorid. Lösungen des aktiven Agens können in Wasser, das optional mit einem nicht-toxischen grenzflächenaktiven Mittel gemischt ist, hergestellt werden. Dispersionen des aktiven Agens können in Wasser, Ethanol, einem Polyol (wie Glycerin, Propylenglykol, flüssige Polyethylenglykole und Ähnliche), pflanzlichen Ölen, Glycerinestern und Gemischen davon hergestellt werden. Die perfekte Dosierungsform ist steril, flüssig und unter den Bedingungen der Herstellung und Lagerung stabil. Die nötige Fluidität kann zum Beispiel durch die Verwendung von Liposomen, durch Verwenden der geeigneten Teilchengröße im Fall von Dispersionen oder durch die Verwendung von grenzflächenaktiven Mitteln erreicht werden. Die Sterilisierung einer Flüssigherstellung kann durch jedes praktische Verfahren, das die Bioaktivität des aktiven Agens erhält, vorzugsweise durch Filter-Sterilisation, erreicht werden. Bevorzugte Verfahren zur Herstellung von Pudern umfassen Vakuumtrocknung und Gefriertrocknung der sterilen injizierbaren Lösungen. Darauffolgende mikrobielle Kontamination kann unter Verwendung verschiedener antimikrobieller Agenzien, zum Beispiel antibakterieller, antiviraler und antifungaler Agenzien, einschließlich Parabenen, Chlorbutanol, Phenol, Sorbinsäure, Thimerosal und Ähnliche verhindert werden. Die Absorption der aktiven Agenzien über einen verlängerten Zeitraum kann durch Einschließen von Agenzien zur Verzögerung, zum Beispiel Aluminium-Monostearat und Gelatine, erreicht werden.
Formulierungen der vorliegenden Erfindung, die für die orale Verabreichung geeignet sind, können als getrennte Einheiten wie Tabletten, Pastillen, Kapseln, Trochiski, Waffel, oder Oblatenkapseln dargestellt werden, wobei jedes eine vorherbestimmte Menge des aktiven Agens als Puder oder Granulat enthält, als Liposomen, die das chemopräventive Agens enthalten, oder als Lösung oder Suspension in einer wässrigen Arzneiflüssigkeit oder einer nicht-wässrigen Flüssigkeit wie einem Sirup, Elixier, einer Emulsion oder einem Trunk. Solche Zusammensetzungen und Herstellungen enthalten typischerweise mindestens 0,1 Gew.-% des aktiven Agens. Die Menge an Polypeptid (d.h. aktivem Agens) ist so, dass die Dosierungsmenge wirksam sein wird, um in dem Patienten das gewünschte Ergebnis zu erzielen.
Nasenspray-Formulierungen umfassen gereinigte wässrige Lösungen des aktiven Agens mit Konservierungsmitteln und isotonischen Agenzien. Solche Formulierungen werden vorzugsweise an einen pH-Wert und einen isotonischen Zustand, die mit den Nasenschleimhäuten kompatibel sind, angeglichen. Formulierungen für rektale oder vaginale Verabreichung können als Zäpfchen mit einem geeigneten Träger wie Kakaobutter oder hydrierten Fetten oder hydrierten Fett-Carbonsäuren dargestellt werden. Formulierungen zur ophthalmologischen Anwendung werden durch ein dem Herstellungsverfahren von Nasenspray ähnliches Verfahren hergestellt, mit der Ausnahme, dass der pH-Wert und isotonische Faktoren vorzugsweise angeglichen werden, um jenen des Auges zu entsprechen. Topische Formulierungen umfassen das aktive Agens, das in einem oder mehreren Medien wie Mineralöl, Petroleum, Polyhydroxy-Alkoholen oder anderen Grundlagen, die für topische pharmazeutische Formulierungen verwendet werden, gelöst oder suspendiert ist.
Die Tabletten, Pastillen, Pillen, Kapseln und Ähnliche können ebenfalls ein oder mehrere der folgenden Bestandteile enthalten: ein Bindemittel wie Tragantgummi, Akaziengummi, Maisstärke oder Gelatine; einen Excipienten wie Dicalcium-Phosphat; ein Disintegrationsmittel wie Maisstärke, Kartoffelstärke, Alginsäure und Ähnliche; ein Gleitmittel wie Magnesiumstearat; ein Süßungsmittel wie Saccharose, Fructose, Lactose oder Aspartam; und ein natürliches oder künstliches Geschmacksmittel. Ist die Einheits-Dosierungsform eine Kapsel, kann sie weiterhin einen flüssigen Träger wie ein pflanzliches Öl oder ein Polyethylenglykol enthalten. Verschiedene andere Materialien können als Beschichtungen vorhanden sein oder auf andere Weise die physikalische Form der festen Einheits-Dosierungsform modifizieren. Zum Beispiel können Tabletten, Pillen oder Kapseln mit Gelatine, Wachs, Schellack, Zucker und Ähnlichem beschichtet sein. Ein Sirup oder Elixier kann ein oder mehrere Süßungsmittel, ein Konservierungsmittel wie Methyl- oder Propylparaben, ein Mittel zur Verzögerung der Kristallisation des Zuckers, ein Agens zur Erhöhung der Löslichkeit jedes anderen Bestandteils wie ein mehrwertiger Alkohol, zum Beispiel Glycerin oder Sorbit, ein Färbemittel und ein Geschmacksmittel enthalten. Das Material, das bei der Herstellung einer Einheitsdosierungsform verwendet wird, ist in den verwendeten Mengen im Wesentlichen nicht toxisch. Das aktive Agens kann in Herstellungen und Vorrichtungen mit verzögerter Freisetzung eingeschlossen werden.
In den hierin dargestellten Beispielen wird eine Reihe von Dodecapeptiden (SC-1 bis SC-8), die durch die Aminosäuresequenz von βpep-25 (SEQ ID NO:19) „hindurchwandern", auf die Fähigkeit, Bakterien zu töten und LPS zu neutralisieren, hin untersucht, insbesondere darauf, Gram-negative und -positive Bakterien zu töten und Endotoxin zu neutralisieren. Eines dieser SC-Peptide, SC-4 (KLFKRHLKWKII, SEQ IS NO:4) wurde mit einem LD50 von 3 nanomolar als außergewöhnlich wirksam gegen Gram-negative Bakterien identifiziert, wirksamer sogar als das parentale Peptid βpep-25. Gegen Gram-positive zeigte SC-4 mit LD50 im sub-mikromolaren Bereich ebenfalls eine gute Aktivität.
Um eine bakterizide Aktivität mit breitem Spektrum zu zeigen, wurden mehrere Stämme untersucht: ein rauer Stamm Gram-negativer Bakterien, J5; vier klinisch relevante Gram-negative glatte Stämme (Pseudomonas aeruginosa J96, H5 und IA2) und zwei Gram-positive Stämme (MN-8 und MNHO). Darüber hinaus wurden, da Peptide, die sowohl β-Faltblatt- als auch Helix-Konformationen bilden, bakterizid sein können, und diese Dodekapeptide von einem β-Faltblatt bildenden βpep-Peptid abstammten, CD- und NMR-Daten in wässriger Lösung und in 30% Trifluorethanol (TFE)-Lösung erhoben, um zu untersuchen, unter welchen Konformationstyp diese 12-mere fallen.
Auslauf-Studien, die unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt wurden, zeigten bei 100% Peptid-Abtötungsdosen eine schnelle Bakterienmembran-Durchlässigkeit mit t1/2-Werten von etwa 10 Minuten. SC-4 neutralisierte ebenfalls Endotoxin im mikromolaren Bereich effektiv und ist unterhalb 10^–4 M nicht hämolytisch. Bei allen SC-Peptiden wiesen zirkulärdichroische Daten stark auf die Gegenwart von sowohl einer α-Helix als auch einer 3₁₀-Helix hin. NOESY-Daten, die auf SC-Peptiden in Gegenwart von 30% Trifluorethanol gewonnen wurden, zeigen auch NOE-Eigenschaften sowohl von einer α-Helix als auch von einer 3₁₀-Helix. Durch Unterschiede hinsichtlich der Aktivitäten zwischen diesen helikalen Dodecapeptiden konnte man einige Struktur-Funktions-Beziehungen ableiten. Für SC-4, das vor allem 3₁₀-Helix-ähnlich ist, ergibt die NOE-basierte Computer-Modellierung eine amphipathische 3₁₀-helikale Struktur, wobei K1, K4, R5, K8 und K10 pentagonal auf einer Seite der Helix angeordnet sind.
Mehrere durch einzelne Reste substituierte Varianten von SC-4 wurden ebenfalls untersucht. Bakterizide Aktivitäten in Lysin/Arginin-substituierten Norleucin-Varianten von SC-4 variieren, was nicht überrascht, von Bakterienstamm zu Bakterienstamm. Gegen den Stamm J5 zeigt keine Substitution einen höheren Rückgang als um das 2-fache, wohingegen gegen P.a. eine Substitution an den N-terminalen Positionen K1, K4 oder R5 die Aktivität signifikant um etwa das 20-fache reduziert. Hinsichtlich der Endotoxin-Neutralisation hat die Substitution von geladenen Gruppen eine geringe Wirkung, wohingegen die Entfernung der C-terminalen Isoleucine die Aktivität um etwa das 500-fache reduziert. Relativ zu anderen bekannten bakteriziden Peptiden in dem linearen Peptid scheint die Helix bildende Kategorie, SC-4, das stärkste bakterizide Breitspektrum-Agens zu sein, das zur Zeit identifiziert ist.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls die dreidimensionale Struktur bestimmter Polypeptide, die unter Verwendung von kernmagnetischer Resonanz (NMR)-Spektroskopie (z.B. ein- und zweidimensional) und optional unter Verwendung von Zirkulärdichroismus(CD)-Spektroskopie abgeleitet wurde, zur Verfügung. Diese Information ist in Bereichen wie dem Wirkstoffnachweis von signifikanter Nützlichkeit. Ein Verständnis der Struktur von zum Beispiel SC-4 erlaubt der Entwurf von Wirkstoffen mit ähnlicher Struktur und somit ähnlicher Aktivität. Solche Wirkstoffe können Peptide, Peptid-Mimetika (z.B. Peptidverbindungen, in denen das Peptid-Rückgrat mit einem oder mehreren Benzodiazepin-Molekülen substituiert ist, Peptide, in denen alle L-Aminosäuren mit den entsprechenden D-Aminosäuren substituiert sind, und „retro-inverso"-Peptide) sowie nicht-Peptid-Mimetika sein. Solche Wirkstoffe sind vorzugsweise nicht-Peptid-Mimetika.
Die hierin dargestellten strukturellen Daten können (vorzugsweise in Kombination mit Struktur-Aktivitäts-Beziehungs (SAR)-Information und potenziellen Pharmakophor-Stellen) verwendet werden, um eine Kandidatenverbindung (potenzieller Wirkstoff) aus einer Datenbank von dreidimensionalen Strukturen bekannter Verbindungen auszuwählen. Die dreidimensionalen Strukturen in den Datenbanken können entweder experimentell bestimmt oder durch Computer erzeugt werden. Alternativ kann eine Kandidatenverbindung auch neu hergestellt werden. Die Kandidatenverbindung wird eine dreidimensionale Struktur haben, die zumindest teilweise (und vorzugsweise im Wesentlichen) der dreidimensionalen Struktur eines der hierin dargestellten Peptide, vorzugsweise SC-4, ähnlich ist. Verschiedene Verfahren zur molekularen Modellierung und/oder zur Datenbanksuche, die dem Fachmann bekannt sind, können verwendet werden, um Kandidatenverbindungen auszuwählen. Solche Verbindungen können unter Verwendung der hierin beschriebenen Tests auf ihre biologische Aktivität hin beurteilt werden.
Spezifisch stellt die vorliegende Erfindung detaillierte Informationen über die Form und Struktur der aktiven Oberflächendomäne bestimmter hierin beschriebener Polypeptide zur Verfügung. Jede der enthaltenen Aminosäuren, die die „aktive Oberflächendomäne" bilden, wird durch die in 6 gezeigten definiert. Der Begriff „aktive Oberflächendomäne" bezieht sich auf eine Region eines Moleküls oder eines molekularen Komplexes, die als Ergebnis ihrer Form für die Behandlung einer oder mehrerer Zustände wie den hierin beschriebenen aktiv ist. Eine solche aktive Oberflächendomäne ist der Teil des Polypeptids, von dem angenommen wird, dass er für das Verleihen der gewünschten Funktion wichtig ist. Somit kann die strukturelle Information von genau dieser Domäne verwendet werden, um Kandidatenverbindungen, wie vorstehend beschrieben, zu identifizieren.
Der Begriff „Strukturkoordinaten" bezieht sich auf Kartesische Koordinaten (vgl. Tabelle 5), die aus Computer-Modellierung unter Verwendung von Kernabständen, erhalten aus spektroskopischen NMR-Versuchen, d.h. NOEs (vgl. Tabelle 6), wie im Abschnitt Beispiele beschrieben, erhalten werden. Die Strukturkoordinaten erzeugen eine einzigartige Konfiguration von Punkten im Raum. Es ist anzumerken, dass diese Koordinaten eine Darstellung zahlreicher Strukturen für jegliches Polypeptid mit statistisch bester Anpassung darstellen und dass leichte Variationen der individuellen Strukturkoordinaten zu erwarten sind. Es können durch eine vollständig verschiedene Reihe von Koordinaten ebenfalls ähnliche oder identische Konfigurationen definiert werden, vorausgesetzt, die Abstände und Winkel zwischen den Koordinaten bleiben im Wesentlichen dieselben.
Allgemein ist die Struktur hierin eine amphipathische Struktur wie eine Helix (die als Zylinder dargestellt werden kann), in der eine Oberfläche positiv geladene Aminosäurereste umfasst (vorzugsweise ist eine Oberfläche vor allem aus positiv geladenen Aminosäureresten (d.h. hydrophilen Aminosäureresten) zusammengesetzt), und die entgegengesetzte Oberfläche umfasst hydrophobe Aminosäurereste (vorzugsweise ist die entgegengesetzte Oberfläche vor allem aus hydrophoben Aminosäureresten zusammengesetzt). Die aktive Oberflächendomäne wird durch die positiv geladenen Aminosäurereste und die entgegengesetzte hydrophobe Oberfläche identifiziert. Im Falle von SC-4, das eine helikale Struktur hat, umfasst eine Oberfläche vier positiv geladenen Aminosäurereste, obwohl es mehr oder weniger für andere Strukturen sein kann, und die entgegengesetzte Oberfläche umfasst hydrophobe Aminosäurereste. Spezifischer, bei SC-4 umfasst die aktive Oberflächendomäne die Strukturkoordinaten der Atome der Aminosäurereste K1 (Atome 1-24), K4 (Atome 64-85), R5 (86-109) und K8, dargestellt in Tabelle 5, wie in 6 gezeigt. Ein alternativer Weg, die aktiven Oberflächendomänen sichtbar zu machen, ist durch Darstellung räumliche Beziehungen zwischen funktionellen Schlüsselresten, die von SAR abstammen (vgl., zum Beispiel 6).
Verschiedene Computeranalysen können verwendet werden, um festzustellen, ob eine Verbindung der gewünschten dreidimensionalen Struktur ausreichend ähnlich ist. Solche Analysen können in üblichen Software-Anwendungen, wie auf dem Fachgebiet bekannt sind, durchgeführt werden. Dies kann einen Vergleich der dreidimensionalen Struktur, Hydrophobie, sterischen Masse, elektrostatischen Eigenschaften, Bindungswinkeln, Größe oder molekularen Zusammensetzung etc. beteiligen. Zum Beispiel ermöglicht Quanta's Molecular Similarity-Packet (Molecular Simulations Inc., Waltham, MA) den Vergleich zwischen verschiedenen Strukturen, verschiedenen Konformationen derselben Struktur und verschiedenen Teilen derselben Struktur. Typischerweise wird die Struktur der analysierten Verbindung translatiert und rotiert, um eine optimale Anpassung an die Struktur des aktiven Polypeptids zu erhalten.
Bevorzugte Kandidatenstrukturen sind die, die eine Reihe an Strukturkoordinaten mit einer mittleren Quadratwurzelabweichung (d.h. die Quadratwurzel des arithmetischen Mittelwerts der Quadrate der Abweichungen des Mittelwerts) konservierter Atome des Rests von weniger als 2,0 Angstrom haben, wenn sie auf die relevanten Strukturkoordinaten gelegt werden. Stärker bevorzugt ist die mittlere Quadratwurzelabweichung weniger als 1,0 Angstrom.
Ist eine Kandidatenverbindung unter Verwendung molekularer Modellierungs- oder Datenbankvergleichsverfahren identifiziert, kann sie durch verschiedene Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, synthetisiert werden.
Ein spezifisches Verfahren der vorliegenden Erfindung beteiligt die Bestimmung einer Kandidatenverbindung für strukturelle Ähnlichkeit zu der von KLFKRHLKWKII (SEQ ID NO:4) durch: Bereitstellen einer dreidimensionalen Struktur von KLFKRHLKWKII (SEQ ID NO:4); Bereitstellen einer dreidimensionalen Struktur einer Kandidatenverbindung; und Vergleichen der dreidimensionalen Struktur der Kandidatenverbindung mit der dreidimensionalen Struktur von KLFKRHLKWKII (SEQ ID NO:4).
Ziele und Vorteile dieser Erfindung werden durch die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht, jedoch sollten die besonderen Materialen und Mengen davon, die in diesen Beispielen aufgeführt werden, sowie andere Bedingungen und Details nicht so ausgelegt werden, dass sie diese Erfindung unnötig einschränken.
Methoden & Materialien
Peptidherstellung
Die Peptide wurden unter Verwendung eines Milligen/Biosearch 9600-Peptid-Festphasen-Synthesegeräts unter Verwendung der Fluorenylmethoxycarbonyl-Chemie synthetisiert. Lyophilisierte Rohpeptide wurden durch präparative Umkehrphasen-HPLC auf einer C18-Säule mit einem Elutionsgradienten von 0-60% Acetonitril mit 0,1% Trifluoressigsäure in Wasser gereinigt. Reinheit und Zusammensetzung der Peptide wurden durch HPLC (Beckman Model 6300), Aminosäureanalyse und Massenspektrometrie überprüft.
Bakterienstämme
Pseudomonas aeruginosa vom Typ 1 ist ein klinisches Isolat von einem glatten Stamm, das unter Verwendung des Schemas von Homma et al., Japan. J. Exp. Med. 46, 329-336 (1976) serotypisiert und durch monatlichen Transfer auf Blut-Agarplatten im Labor aufrechterhalten wurde. E. coli J96, IA2 und H5 sind uropathogene klinische Isolate eines glatten Stamms, die freundlicherweise von J.R. Johnson aufrechterhalten und zur Verfügung gestellt wurden und die in Johnson et al., J. Infect. Disease 173, 920-926 (1996) für J96 und IA2 und in Johnson et al., J. Infect. Disease 173, 746-749 (1996) für H5 beschrieben wurden. J5 ist ein rauer Stamm von E. coli, der ursprünglich durch G.R. Siber vorgestellt und in Warren et al., Infect. Immunity 55, 1668-1673 (1987) diskutiert wurde, und ist zu dem glatten Stamm E. coli 0111:B4, der beim Bio Whittaker LAL-Endotoxin-Nachweis und dem nachstehend beschriebenen Quantifizierungs-Kit verwendet wird, analog. Gram-positives MN8 und MNHO sind zwei Patienten-Isolate von Staphylococcus aureus, die freundlicherweise von P.M. Schlievert zur Verfügung gestellt wurden und die in Bohach et al., Rev. Infect. Diseases 11, 75-82 (1989) für MNHO und in Schlievert et al., J. Infect. Diseases 147, 236-242 (1983) für MN8 beschrieben werden. Alle Kulturen werden auf Nährstoff-Agarplatten gehalten.
Bakterizidtest
Pyrogenfreie Lösungen wurden während des gesamten Tests verwendet. Log-Phasen-Bakterien wurden durch Überführen einer Übernacht-Kultur oder durch Abkratzen von Kristallen von –85°C-Glycerinstammlösungen von Übernacht-Kulturen erhalten. Die Bakterien wurden gewaschen und in 0,9% Natriumchlorid mit Angleichen an eine optische Dichte bei 650 nm, was 3 × 10⁸ UBE/ml ergibt, resuspendiert. Die Bakterien wurden dann 1:10 in 0,08 M Citrat-Phosphat-Puffer, pH 7,0 (hergestellt durch Mischen von 0,08 M Zitronensäure mit 0,08 M zweibasischem Natriumphosphat) verdünnt. Die Bakterien (0,15 ml) wurden mit Peptid in einem Endvolumen von 1,0 ml Puffer inkubiert. Der Test wurde in 17 × 100-Polypropylen-Röhrchen in einem reziprokem Wasserbad-Schüttler bei 37°C 30 Minuten durchgeführt. Nach dieser 30-minütigen (min) Inkubation wurden 10-fache Verdünnungen in 0,9% Natriumchlorid hergestellt. Verdünnungen wurden bis zu 10^–4 fortgeführt und 20 μl jeder Verdünnung wurden über eine Agarplatte gestrichen. Gram-positive Organismen wurden auf Nährstoff-Agarplatten ausgestrichen, die 2% Agar enthielten, und Gram-negative Organismen wurden auf MacConkey-Agar (2%) ausgestrichen. Die Platten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert und am nächsten Morgen gezählt. Die Verdünnung, die 10-100 Bakterien enthielt, wurde gezählt und die Anzahl mit 50 multipliziert, um alle Zählungen an die Anzahl der Bakterien anzugleichen, die pro Milliliter getötet wurden. Die Peptid-Konzentrationen wurden in die logarithmische Basis zehn umgewandelt und graphisch aufgetragen. Die bakterizide Aktivität wurde durch Dosis-Reaktion bestimmt, wobei die LD50-Werte durch die beste Anpassung einer sigmoidalen Kurve an die Dosis-Reaktionsdaten bestimmt wurden.
Limulus Amoebocyten-Lysattest auf LPS-Neutralisation
Die Fähigkeit synthetischer Peptide zur Neutralisierung von Endotoxin wurde unter Verwendung des chromogenen QCL-1000-Kits von Bio Whittaker, Inc. (Walkersville, MD), wie in ihrem Protokoll beschrieben, nachgewiesen. Dieses Verfahren ist für Gram-negatives Bakterien-Endotoxin (Lipopolysaccharid, LPS) quantitativ. Im Limulus-Amoebocyten-Lysat (LAL)-Test hemmen Peptide, die aktiv sind, die LPS-vermittelte Aktivierung eines Proenzyms (Young et al., J. Clin. Invest. 51, 1790-1798 (1972)), dessen aktive Form p-Nitroanilin (pNA) von einem farblosen synthetischen Substrat (Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA) freisetzen würde, wobei eine gelbe Farbe (pNA) hergestellt würde, deren Absorption spektrophotometrisch bei 405-410 nm überwacht wird. Die anfängliche Rate der Enzymaktivierung ist zur Konzentration des vorliegenden Endotoxins proportional. Die Konzentration des benötigten Peptids zur Bindung an LPS und somit zur Hemmung des Limulus- Amoebocyten-Lysats, angetrieben durch 0,04 Einheiten (oder 0,01 ng) E. coli 0,55:B5 LPS (von SIGMA), wurde durch Dosis-Reaktion bestimmt.
Auslauf-Kinetik
Die Integrität der Bakterien-Zellmembran wurde unter Verwendung des LIVE/DEADBacLight-Bakterien-Lebensfähigkeits-Kits (L-7007) von Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR) gemessen, das Gemische rot und grün fluoreszierender Färbungen verwendet, um zwischen beschädigten beziehungsweise intakten Bakterien zu unterscheiden. Zwei E. coli-Stämme (H5 und J5) und ein Staphylococcus aureus-Stamm (MN8) wurden untersucht, und die SC-Peptide wurden in einer Dosis verwendet, die 100% Tötung auslöst. Zeitpunkte zwischen null und 60 min wurden genommen. Die Fluoreszenz-Emisson (Anregung bei 470 nm und Emission bei 490 nm bis 700 nm) jeder Zellsuspension wurde in einem Fluoreszenz-Spektrophotometer gemessen. 5 μl jeder Probe wurden auf einen Mikroskop-Objektträger mit einem quadratischen Deckglas platziert und versiegelt, um Bewegungen zu verhindern.
Hämolytische Aktivität
Menschliche rote Blutzellen wurden vor der Durchführung des Versuchs dreimal unter Verwendung phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS: 35 mM Phosphatpuffer, 0,15 M NaCl, pH 7,0) gewaschen. 100 μl menschlicher roter Blutzellen, die in 0,4% (V/V) PBS suspendiert waren, wurden in Eppendorf-Röhrchen platziert, und 100 μl in Reihe verdünnte Peptide in PBS wurden zugesetzt (die Peptidkonzentration lag im Bereich von 1 μM bis 100 μM). Die Röhrchen wurden 1 Stunde bei 37°C inkubiert und bei 1000 g 5 min zentrifugiert. 100 μl-Aliquots des Überstands wurden dann in Eppendorf-Röhrchen überführt, und die Hämolyse wurde durch Absorption bei 414 nm gemessen. Hämolyse von 0% und von 100% wurde in PBS beziehungsweise in 1% Triton-X100 bestimmt. Der prozentuale Anteil der Hämolyse wurde unter Verwendung der folgenden Formel berechnet: % Hämolyse = [(A₄₁₄ in der Peptidlösung – A₄₁₄ in PBS)/(A₄₁₄ in 1% Triton-X 100 – A₄₁₄ in PBS)] × 100.
Zirkulärdichroismus
Zirkulärdichroische (CD)-Spektren wurden auf einem automatisch aufnehmenden JASCO JA-710-Spektropolarimeter, der mit einem Datenverarbeitungsgerät gekoppelt war, gemessen. Die Kurven wurden digital aufgenommen und zum Mitteln des Signals und Subtraktion der Basislinie in das Datenverarbeitungsgerät eingegeben. Die Peptide wurden in 10 mM Kalium-Phosphatpuffer (0,6 mg/ml), pH 5,5 gegeben und die CD-Spektren wurden bei 20°C unter Verwendung einer thermisch beschichteten Quartz-Kuvette von 0,5 mm innerer Weite über einen Bereich von 190 nm bis 250 nm aufgenommen. Die Temperatur wurde unter Verwendung eines NesLab-Wasserbads kontrolliert. Die Aufnahmegeschwindigkeit betrug 20 nm/min. Die Spektren wurden 8-mal Signal-gemittelt, und eine gleiche Signal-gemittelte Lösungsmittel-Basislinie wurde subtrahiert. Die CD-Spektren auf jedem Peptid wurden als eine Funktion der Konzentration von Trifluorethanol (TFE) von 0% bis 80% (Volumen/Volumen, V/V) erhalten. Die CD-Spektren wurden, wie durch Sreerama et al., Anal. Biochem. 209, 32-44 (1993) beschrieben, entfaltet.
NMR-Messungen
Für die NMR-Messungen wurde gefriergetrocknetes Peptid in H₂O gelöst. Die Peptidkonzentration lag üblicherweise bei etwa 5 bis 6 mM. Der pH-Wert wurde durch Zusetzen von μl-Mengen NaOD oder DCl zur Peptidprobe auf pH 5,5 angeglichen. Die NMR-Spektren wurden auf einem Varian UNITY Plus-600 NMR-Spektrometer erhalten. Die Wasser-Resonanz wurde während der Relaxationsverzögerung zwischen den Aufnahmen durch direkte Bestrahlung (0,8 s) bei der Wasserfrequenz unterdrückt.
Homonucleäre 2D-Magnetisierungs-Transfer (HOHAHA)-Spektren, erhalten durch Spin-Locking mit einer MLEV-17-Sequenz (Bex et al., J. Magn. Reson. 65, 355-360. (1985)) mit einer Mischungszeit von 60 ms, wurden verwendet, um die Spin-Systeme zu identifizieren. NOESY-Versuche (Wider et al., J. Magn. Reson. 56, 207-234 (1984)) wurden für die Konformationsanalyse durchgeführt. Alle 2D-NMR-Spektren wurden im sensitiven Modus der States-TPPI-Phase erhalten (States et al., J. Magn. Reson. 48, 286-293 (1982); und Bodenhausen et al., J. Magn. Reson. 37, 93-99 (1980)). Die Wasser-Resonanz wurde während der Relaxationsverzögerung zwischen den Aufnahmen durch direkte Bestrahlung (0,8 s) bei der Wasserfrequenz sowie während der Mischungszeit in NOESY-Versuchen unterdrückt. 2D-NMR-Spektren wurden als 256 bis 512-t1-Versuche, jeweils mit komplexen 2K-Datenpunkten von 2k über eine spektrale Breite von 6 kHz in beiden Dimensionen gewonnen, wobei der Träger auf die Wasser-Resonanz gesetzt wurde. Für die HOHAHA- und NOESY-Spektren wurden 16 Aufnahmen pro t1-Versuch zeitlich gemittelt. Die Daten wurden direkt auf dem Spektrometer oder offline unter Verwendung von VNMR (Varian, Inc., Palo Alto, CA) oder von NMRPipe (Delagio et al., J. Biomol. NMR 6, 277-293 (1995) auf einer SGI-Arbeitsstation prozessiert. Die Datenreihen wurden vor der Fourier-Transformation in beide Dimensionen durch eine um 30-60 Grad verschobene Sinus-Glocken-Funktion multipliziert und in der t1-Dimension auf 1 k mit dem Wert 0 aufgefüllt.
Da SC-Peptide relativ hydrophob sind und später als amphipathisch befunden werden, wurden Pulsfeldgradienten (PFG)-NMR-Eigendiffusionsmessungen als Überprüfung der Peptid-Aggregation durchgeführt. PFG-NMR-Versuche wurden, wie durch Mayo et al., Protein Sci. 5, 1301-1315 (1996) beschrieben, unter Verwendung eines Varian Unity-Plus 500 NMR-Spektrometers durchgeführt. Die maximale Größenordnung des Gradienten betrug 6-G/cm, und die longitudinale Wirbelsstrom-PFG-Verzögerungs-Pulssequenz wurde für alle Eigendiffusionsmessungen verwendet, die bei D20-Temperaturen von 5°C und 40°C durchgeführt wurden. Die Peptidkonzentrationen lagen im Bereich von 0,1 mM bis 15 mM. Die PFG-NMR-Daten wurden ebenfalls, wie durch Mayo et al., Protein Sci. 5, 1301-1315 (1996) beschrieben, durchgeführt.
Struktur-Modellierung
Die Analyse der NOE-Wachstumskurven zeigte an, dass die interprotonalen NOEs von Rückgrat zu Rückgrat normalerweise maximal 300 ms bis 400 ms betrugen. Interprotonale Abstandsbeschränkungen wurden aus NOEs abgeleitet, die in ¹H NOESY-Spektren, die mit Mischungszeiten von 200 ms und 400 ms erhalten wurden, zugeordnet wurden. Die NOEs wurden entsprechend den oberen Bindungsabstandsbeschränkungen von 2,8, 3,3, 4,0 beziehungsweise 4,5 Å als stark, mittel, schwach oder sehr schwach klassifiziert. Die untere Bindungsbeschränkung zwischen ungebundenen Protonen wurde auf 1,8 Å festgesetzt. Pseudo-Atom-Korrekturen wurden, wo es geeignet schien, zu den oberen Bindungsabstandsbeschränkungen addiert, und eine Korrektur von 0,5 Å wurde für NOE beteiligende Methylprotonen zur oberen Bindung addiert. Wasserstoff-Bindungsbeschränkungen wurden aus dem Muster aus sequenziellen und Zwischenstrang-NOEs, bei denen NH- und CαH-Protonen beteiligt sind, zusammen mit einem Hinweis auf langsamen Austausch zwischen Amid und Protonensolvens identifiziert. Jede identifizierte Wasserstoff-Bindung wurde unter Verwendung von zwei Abstandsbeschränkungen definiert: r_NH-O = 1,8 bis 2,5 Å, und r_N-O = 1,8 bis 2,5 Å.
Abgeleitete internukleäre Abstandsbeschränkungen wurden bei der Berechnung von Strukturen für das Dodecapeptid SC-4 unter Verwendung von X-PLOR (Brunger et al., X-plor Manual, Yale University Press, New Haven (1992)) verwendet. SC-4 wurde unter Verwendung von parallhdg.pro-Kraftfeldern erzeugt. Eine Matrizen-Koordinatenreihe wurde unter Verwendung des Template-Verfahrens erzeugt. Dann wurde das von Anfang an simulierte Anheftungs (SA)-Protokoll verwendet. Das SA-Verfahren lief bei hoher Temperatur-Dynamik (3000 K für 120 ps) und kühlte dann in Stufen von 50 K mit einer molekularen Dynamik von 1,5 ps bei jeder Stufe auf 100 K ab. Eine Powell-Minimierung wurde bei 100 K über 1000 Stufen durchgeführt. Eine Strukturverfeinerung wurde basierend auf simulierter Anelierung beginnend bei 1000 K und endend bei 100 K durchgeführt. Die Endstrukturen wurden dem X-PLOR-Accept-Verfahren mit der Verletzungsschwelle für NOEs von 0,5 Å und zweiflächigen Winkeln von 5°C unterzogen. Winkel, Bindungslängen oder Abweichungen durften von der idealen Geometrie nicht mehr als 5°, 0,05 Å bzw. 5° abweichen. Die Strukturen wurden unter Verwendung des BIOSYM INSIGHT-Sichtgeräts (Molecular Simulations, Inc.) übereinandergelagert und unter Verwendung von X-PLOR-Analyseverfahren analysiert.
Zellen, Kulturen und Reagenzien
Von menschlicher Nabelvene abgeleitete EC (HUVEC) kann durch Durchspülung mit 0,125% Trypsin/EDTA, wie in Groenewegen et al., J. Exp. Med. 164, 131-143 (1986) beschrieben, von normalen menschlichen Nabelschnüren gewonnen werden. Zur Bestimmung des ruhenden EC-Phänotyps werden die isolierten ECs sofort in 1% Paraformaldehyd fixiert. Menschliche mikrovaskuläre ECs (MVECs) werden isoliert. Die ECs werden in mit Fibronectin beschichteten Gewebekulturflaschen in Kulturmedium (RPMI-1640 mit 20% menschlichem Serum (HS), ergänzt mit 2 mM Glutamin und 100 U/ml Penicillin und 0,1 mg/ml Streptomycin) gezüchtet. Für die Isolierung von rekombinantem PF4 wird das synthetische Gen für natürliches menschliches PF4 als nicht-Fusionsprotein in E. coli (BL21)-Zellen (Repligen Corp., Cambridge, MA) exprimiert. Das Protein wird gereinigt, gespalten und erneut gefaltet, im Wesentlichen wie in Yang et al., J. Biol. Chem. 269, 20110-20118 (1994) beschrieben. Die Reinheit wird durch Coomassie-Färbung von SDS-PAGE, analytische C4-Umkehrphasen-HPLC und Aminosäureanalyse festgestellt. Typischerweise werden mehrere 100 Milligramm von mehr als 95% reinem Material aus 100 Gramm (g) Ausgangsmaterial isoliert.
EC-Proliferations-Test
Die EC-Proliferation wird unter Verwendung eines [³H]Thymidin-Einschlusstests gemessen. Die ECs werden zu 5000 Zellen/Vertiefung in Gewebekulturplatten mit flachem Grund ausgesät und drei Tage in Abwesenheit oder Gegenwart von Regulatoren in Kulturmedium gezüchtet. Während der letzten 6 Stunden des Tests wird die Kultur mit 0,5 μCi [Methyl-³H]Thymidin/Vertiefung gepulst.
In-vitro-Angiogenese-Test
Eine halbnatürliche Matrix von Kollagen Typ I wird durch Mischen von 8 Volumina Vitrogen 100 (Collagen Corporation, Fermont, CA, USA) mit 1 Volumen 10-fach konzentriertem MEM (Life Technologies) und 1 Volumen Natriumbicarbonat (11,76 mg/ml) hergestellt. Die Matrix wird in Kulturplatten dispensiert und man lässt sie bei 37°C gelieren. Konfluente BMEC (freundlicherweise zur Verfügung gestellt durch Dr. M. Furie, State University of New York, Stony Brook, USA) werden trypsiniert und oben auf dieser Kollagen-Matrix ausgesät. Wenn die Zellen zu einer konfluenten Einzelschicht gewachsen sind, wird das Medium durch frisches Medium ersetzt, und zwar Medium, das 25 ng/ml bFGF enthält, oder Medium, das 25 ng/ml bFGF und die Peptide enthält. Im Gegensatz zum Zusetzen des Angiogenese-Induktors oben auf die Matrix werden Colon-Zelllinien (LS174T)-Spheroide vor dem Gelieren in die Kollagen-Matrix eingebettet. Die Peptide werden gleichzeitig mit den ECs der Kultur zugesetzt. In beiden Versuchen werden die (sprossenden) endothelialen Einzelschichten mit einem Zeiss Umkehrphasenkontrast-Foto-Mikroskop fotografiert. Die Menge des Sprossens in jeder Vertiefung (d.h. die Gesamtlänge der Sprossen) wird durch das Computerprogramm NIH image (Barendsz-Janson et al., J. Vasc. Res. 35, 109-114 (1998) quantifiziert.
CAM-Test
Fruchtbare ausgewählte weiße Lohman-Leghorn-Eier werden drei Tage bei 37°C und 55% relativer Feuchtigkeit inkubiert und einmal pro Stunde gedreht. Am Tag 3 wird ein rechteckiges Fenster (1 × 2 cm) in die Eischale gemacht. Das Fenster wird mit Pflaster bedeckt, um Austrocknen zu verhindern. Das Fenster gewährt die ungestörte Überwachung des sich entwickelnden Gefäßsystems der Chorioallantoismembran (CAM). Am Tag 7 wird ein Ring aus Silikongummi (10 mm Durchmesser) auf die CAM gesetzt, um innerhalb des Rings eine lokale Wirkstoffverabreichung zu gewährleisten. Peptide, die in steriler Kochsalzlösung (0,9% NaCl) gelöst sind, werden vom Tag 10 bis zum Tag 13 täglich in Aliquots von 65 μl verabreicht. Am Tag 14 werden die CAMs fotografiert.
Immunfluoreszenz
Eine Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierungs (FACS)-Analyse unter Verwendung von indirekten Phycoerythrin (PE)-konjugierten Reagenzien benötigt 3 getrennte Inkubationen. ECs (1 × 10⁵) werden über 1 Stunde in 1% Paraformaldehyd fixiert, erneut in 20 μl passend verdünntem MAk suspendiert und 1 Stunde auf Eis inkubiert. Danach werden die Zellen 2-mal in phosphatgepufferter Kochsalzlösung/Rinderserumalbumin (PGS/BSA) (0,1%) gewaschen und weitere 30 Minuten mit biotinyliertem Kaninchen-anti-Maus-Ig (Dako, Glostrup, Dänemark) inkubiert. Nach weiteren 2 Waschungen werden die Zellen mit Streptavidin-Phycoerythrin-Konjugat (Dako) inkubiert. Gefärbte Zellen werden auf einem FACScan Durchflusscytometer analysiert. Die Datenanalyse wird unter Verwendung von PCLysys-Software (Becton Dickinson, Mountain View, CA) durchgeführt.
Hemmung von Angiogenese verhindert bFGF-induzierte ICAM-1-Herabregulierung
Um die These zu überprüfen, dass angiostatische Faktoren Angiogenese-vermittelte Herabregulierung von EAM verhindern können, kann ein Polypeptid auf seine Wirkung auf die EAM-Expression getestet werden. Diese Studien konzentrieren sich auf die Expression von ICAM-1, weil vorherige Untersuchungen, bei denen anti-ICAM-1- und anti-LFA-1-Antikörper verwendet wurden, zeigten, dass die ICAM-1/LFA-1-Interaktion bei der Leukocyten/EC-Adhäsion und -Extravasation bedeutend, d.h. sowohl essenziell als auch ausreichend ist (Bevilacqua, Ann. Rev. Immunol. 11, 767-804 (1993); und Springer Cell 76, 301-314 (1994)). Eine dreitägige Inkubation von EC mit 10 ng/ml bFGF zur Bestimmung der Schwächung der ICAM-1-Expression wird mit Kontrollzellen verglichen.
Ergebnisse
1 zeigt die Aminosäuresequenzen für βpep-19 (SEQ ID NO:18), βpep-25 (SEQ ID NO:19) und Peptid-Dodecamere (SC-Peptide), die durch die Sequenz von βpep-25 „hindurchwandern". Es wurde beobachtet, dass die bakterizide Aktivität von βpep-25 zu der von βpep-19 gleich oder besser war, und diese „Durchwanderungen" wurden konstruiert, um Segmente derjenigen Aminosäuresequenz zu identifizieren, die am meisten zu dieser Aktivität beitrugen. Es wurde vorausgesetzt, dass die bakterizide Aktivität in diesen kürzeren SC-Peptiden bedeutend geringer wäre als die des parentalen Peptids βpep-25. Wie nachstehend berichtet, war dies nicht der Fall, und dies ist die Basis für diese Arbeit.
Bakterizide Aktivitäten
Für die Untersuchung wurden sieben Bakterienstämme ausgewählt, die sowohl Gram-negative als auch -positive Bakterien repräsentieren. Für βpep-Peptide und βpep-abgeleitete Dodecapeptide sind die bakteriziden Aktivitäten gegen diese Stämme in Tabelle 1 als die Konzentration, die bei der Abtötung von 50% der Bakterien wirksam ist, d.h. die LD50, angegeben. Die LD50-Werte wurden aus Dosis-Reaktionskurven wie den in 2 gezeigten bestimmt, bei denen der prozentuale Anteil der getöteten Bakterien gegen den Logarithmus der Peptidkonzentration aufgetragen ist. Die aktuellen Datenpunkte werden mit Symbolen, wie in der Legende identifiziert, gezeigt, und jede Kurve stellt die beste Anpassung unter Verwendung einer sigmoidalen Funktion dar. Die LD50-Werte werden von der angepassten Kurve bei einer Mortalität von 50% abgelesen. Insgesamt funktioniert SC-4 bei der Abtötung sowohl der rauen als auch der glatten Stämme der Gram-negativen Bakterien am besten. Die LD50 liegen im Bereich von 3 nanomolar gegen J5 bis 250 nanomolar gegen J96. Gegen Stämme von S. aureus waren SC-4 (80 bis 400 nanomolar) und SC-5 (180 bis 350 nanomolar) hinsichtlich ihrer Aktivität mit βpep-19 und βpep-25 vergleichbar. BG-22, ein 28-meres Peptid, das die Aminosäuresequenz von der β-Faltblatt-Domäne von bakterizidem/Permeabilität-erhöhendem (BIPI)-Protein (Reste 82-108) (Gray et al., Biochim. Biophys. Acta 1244, 185-190 (1995)) hat, von der vermutet wird, dass sie die Stelle ist, die die bakterielle Aktivität fördert, ist weniger bakterizid als βpep-19 oder βpep-25 und bedeutend weniger aktiv als SC-4. Allgemein zeigt SC-4 das beste Breitenspektrum bakterizider Aktivität.
Auslauf-Kinetik
Von bakteriziden Bakterien wird angenommen, dass sie allgemein durch Integration in die Bakterienmembran und Erzeugung von Kanälen in der Weise funktionieren, dass die Bakterien „undicht" werden und sterben. Um festzustellen, ob dieser Aktionsmechanismus bei SC-Peptiden sowie bei βpep-Peptiden auftritt, wurde die Auslauf-Kinetik der Membran bei zwei E. coli-Stämmen (H5 und J5) und einem S. aureus-Stamm (MN8) untersucht. In jedem Fall wurden die Bakterien innerhalb weniger Minuten nach Zusetzen der Peptide „undicht". Bei jedem der Stämme wurden die t_1/2-Werte auf den Bereich von 10 min geschätzt.
Hämolytische Aktivität
Betrachtet man die potenzielle Verwendung dieser Peptide als antibiotische Agenzien bei Säugern, ist es wichtig, ihr Potenzial, eukaryotische Zellen zu lysieren, zu kennen. Um diese Information zu erhalten, wurden rote Blutzellen als Modell für alle eukaryontische Zellen verwendet. Rote Blutzell-Lyse (Hämolyse) wurde bei Peptidkonzentrationen von 1 × 10^–4 M, 1 × 10^–5 M und 1 × 10^–6 M überprüft. Bei 10^–6 M zeigten SC-1, SC-5 und BG-22 15% bis 30% Hämolyse, die bei 10^–4 M auf etwa 70% anstieg. Alle anderen Peptide zeigten bei 10^–6 M eine Wirkung von weniger als 5% bis 10%. Sogar bei 10^–4 M induzierte βpep-25 nur etwa 5% Hämolyse, wohingegen SC-3, SC-4 und SC-8 eine Wirkung von etwa 10% ergaben und SC-2, SC-6 und SC-7 eine Wirkung von etwa 15% ergaben. Für die meisten SC-Peptide ist die 10^–4 M- Konzentration beträchtlich höher als ihr bakterizider LD50-Wert. Zum Beispiel ist bei SC-4 die LD50 gegen P. aeruginosa und MN-8 50.000-mal beziehungsweise 500-mal geringer als diese Konzentration.
LPS-Neutralisation
Die Lyse der Gram-negativen Bakterien produziert das Endotoxin Lipopolysaccharid (LPS), das die pathologische Störung, die als Sepsis bekannt ist, auslöst. In dieser Hinsicht sind die Peptide, die nicht nur bakterizid sind, sondern auch wirksam LPS neutralisieren, von beträchtlicher Wichtigkeit bei der Bekämpfung von Endotoxämie und Sepsis. Deshalb wurden diese Peptide im Limulus Amoebocyten-Test auf ihre Fähigkeit hin getestet, an LPS zu binden und es zu neutralisieren. IC50-Werte wurden aus Dosis-Reaktionskurven bestimmt, die in 3 gezeigt sind, und sind in Micromolar-Einheiten in der Spalte rechts außen in Tabelle 1 aufgelistet. βpep-19, βpep-25 und SC-5 sind im Wesentlichen gleich wirksam (IC50-Werte bei etwa 2 micromolar), wobei SC-4 nicht weit dahinter liegt. SC-1 und SC-6 sind etwas weniger wirksam mit IC50-Werten von 3,5 micromolar. SC-3 ist um etwa das 10-fache weniger wirksam (IC50 = 25 × 10^–6 M) sowohl als SC-4 als auch als SC-5. SC-2, SC-7 und SC-8 zeigen bei oder unterhalb von 1 × 10^–4 M keine LPS-Bindungsaktivität. Dies war für SC-7 und SC-8, die im Wesentlichen bakterizid inaktiv sind, nicht überraschend, aber SC-2 zeigte recht gute bakterizide Aktivität.
Tabelle 1. SC-Peptidreihe – LD50-Werte für bakterizide Aktivität und IC50-Werte für Neutralisation von bakteriellem Lipopolysaccharid (LPS). Alle Werte sind als micromolare Mengen angegeben.

Die Bakterien J5, J96, H5 und IA2 sind Stämme von E. coli; die Bakterien MN8 und MNHO sind Stämme von S. aureus.
LD50- und IC50-Werte sind in Einheiten von 10^–6 M.
Standardabweichungen sind etwa ± 30% der angegebenen Werte.
XXX bedeutet bei Konzentrationen unterhalb von 1 × 10^–5 M im Bakterizid-Test und unterhalb von 1 × 10^–4 M im LPS-Neutralisationstest nicht aktiv.

Zirkulärdichroismus
Die CD-Spektroskopie, verwendet zur Feststellung von Konformations-Populationen von SC-Peptiden, zeigt die Gegenwart einer helikalen Struktur an. Dies wird in 4 gezeigt, die ausgewählte CD-Spuren für SC-5 und SC-7 zeigt, die bei verschiedenen TFE-Konzentrationen erhalten wurden. In allen Fällen zeigen die CD-Spuren eine Bande negativer Elliptizität bei 222 nm, was eine Eigenschaft der Helix-Konformation ist (Greenfield et al., Biochemistry 8, 4108-4116 (1969); Johnson et al., Proteins 7, 205-214 (1990); und Waterhous et al., Biochemistry 33, 2121-2128 (1994)). Bei geringeren TFE-Konzentrationen sind vor allem Populationen mit Zufallsknäuel vorhanden, wie durch ein negatives Elliptizitäts-Minimum bei etwa 200 nm (im Gegensatz zu 207/208 nm für die Helix) und ein geringes Verhältnis von [θ]₂₂₂/[θ]₂₀₀ offenbar wird. Wird die TFE-Konzentration erhöht, nimmt die Helix-Population zu, da sich die negative Elliptizitäts-Bande bei 200 nm näher zu 207 nm hin verschiebt, und die 222 nm-Bande negativer wird. Bei etwa 20% bis 30% TFE haben beide Observables ungefähr das gleiche Niveau wie in dem Einschub in 4 angezeigt ist, bei der [θ]₂₂₂ gegen % (V/V) TFE aufgetragen ist. Diese spektralen CD-Eigenschaften würden jedoch aus der Gegenwart entweder einer α-Helix oder einer 3₁₀-Helix oder aus einem Gemisch von beiden resultieren. Die rechtsgewundene 3₁₀-Helix zeigt eine negative CD-Bande bei 207 nm (λ_min) und eine Schulter, die mit dem Verhältnis von [θ]₂₂₂/[θ]₂₀₇ bei etwa 0,4 nahe 222 nm zentriert ist (Millhauser, Biochemistry 34, 3873-3877 (1995); und Toniolo et al., J. Am. Chem. Soc. 118, 2744-2745 (1996)). Bei einer α-Helix sind die 207 nm- und 222 nm-Banden ebenfalls vorhanden; das Verhältnis von [θ]₂₂₂/[θ]₂₀₇ ist einer Eins jedoch näher. Wenn λ_min 207 nm ist und das Verhältnis von [θ]₂₂₂/[θ]₂₀₇ zwischen 0,4 und 1,0 liegt, sind wahrscheinlich sich ineinander umwandelnde Populationen der 3₁₀-Helix und der α-Helix vorhanden.
Für SC-Peptide listet Tabelle 2 die Wellenlänge für das ferne UV-Minimum, λ_min und das Verhältnis von [θ]₂₂₂/[θ]₂₀₇ bei 70% TFE auf. In Fällen, in denen das [θ]₂₂₂/[θ]₂₀₇-Verhältnis näher bei 0,4 als bei 1,0 liegt und λ_min bei 207 nm liegt, sollte die Konformation dieses SC-Peptids eher die Eigenschaften einer 3₁₀-Helix als die einer α-Helix haben (Millhauser, Biochemistry 34, 3873-3877 (1995); und Toniolo et al., J. Am. Chem. Soc. 118, 2744-2745 (1996)). Für das aktivste Peptid, SC-4, ist λ_min 207 nm und [θ]₂₂₂/[θ]₂₀₇ 0,49, was die Gegenwart hauptsächlich der 3₁₀-Helix anzeigt. Obwohl die Peptide SC-1, -2, -3, -5 und -6 λ_min-Werte von 207 nm haben, weisen größere [θ]₂₂₂/[θ]₂₀₇-Verhältnisse von 0,6 bis 0,7 weniger auf einen 3₁₀-Helix-Charakter hin. Da SC-7 und SC-8 λ_min-Werte von 203 nm beziehungsweise 204 nm zeigen, sollten signifikante Populationen von Zufallsknäueln in ihrer Konformations-Gesamtheit vorliegen.
Tabelle 2. Zirkulärdichroismus-Gesamtdaten für Peptide in Gegenwart von 70% Trifluorethanol.
NMR-Konformationsanalyse
5 zeigt αH-NH- und NH-NH-Regionen von NOESY-Daten für SC-4 in Abwesenheit (Feld A) und Gegenwart (Feld B) von 30% (V/V) TFE. In jedem Falle zeigt die Reihe von NH-NH-NOEs, die von F3 bis I12 verlaufen, allein die Gegenwart einer wenigstens passierenden Helix-Konformation (Dyson et al., J. Mol. Biol. 201, 201-217 (1988)). Darüber hinaus sind sogar in Abwesenheit von TFE alle vier αH-NH i,i + 2-NOEs leicht unterscheidbar, was die Gegenwart von mehrfachen Windungen oder 3₁₀-Helix unterstützt (Wüthrich et al., NMR of Proteins and Nucleic Acids, Wiley-Interscience, New York (1986); und Wishart et al., Biochemistry 31, 1647-1651 (1992)). In Gegenwart von TFE bleiben diese NOEs und andere NOEs im längeren Bereich erscheinen. Zum Beispiel wurden zwei αH-NH i,i + 3 (8/5, 10/7)-, drei NH-NH i,i + 2 (8/6, 9/7, 10/8)- und zwei NH-NH i,i + 3- (10/7, 11/8)-NOEs in 5 markiert. Für eine reine 3₁₀-Helix sollten nur i,i + 2- und i,i + 3-NOEs zu beobachten sein, wohingegen für eine reine α-Helix nur i,i + 3- und i,i + 4-NOEs vorhanden sein sollten (Wüthrich et al., NMR of Proteins and Nucleic Acids, Wiley-Interscience, New York (1986)). Die Gegenwart von αH-NH i,i + 2-NOEs, die für eine 3₁₀-Helix charakteristisch ist, stimmt mit den CD-Ergebnissen, wie vorstehend erörtert, überein. α-Helix-Konformation muss jedoch auch zur Konformationsgesamtheit, wie durch die CD-Daten angezeigt, beitragen. Da alle SC-Peptide in unterschiedlichem Ausmaß ähnliche NOE- und CD-Trends zeigen, sind diese Peptide in wässriger Lösung vor allem als 3₁₀-Helix, α-Helix und Zufallsknäuel in einem Äquilibrium vorhanden.
Da einige SC-Peptide relativ hydrophob sind und dazu tendieren könnten, mit sich selbst zu assoziieren und dabei die Gegenwart und/oder Größenordnung der NOEs zu beeinträchtigen, wurden PFG-NMR-Diffusionsmessungen (Daten nicht gezeigt) durchgeführt. Für alle SC-Peptide bleiben die Diffusions-Koeffizienten, die von diesen Daten abgeleitet wurden, über den Peptid-Konzentrationsbereich von 0,1 mM bis 15 mM unverändert, was die Abwesenheit von Aggregation anzeigt.
Für das Peptid SC-4, das die stabilste 3₁₀-helikale Struktur bildet und im Allgemeinen am meisten bakterizid ist, wurde unter Verwendung der NOE-Daten, die für das Peptid in Gegenwart von 30% TFE/70% Wasser erhalten worden waren, eine Konformations-Modellierung durchgeführt. Es ist zu betonen, dass die meisten derselben NOEs in Abwesenheit von TFE beobachtet werden konnten; 30% TFE stabilisierte jedoch offensichtlich die Helix-Konformation und erhöhte die Gesamt-Umorientierungs ("tumbling")-Korrelationszeit, wobei allgemein die Größenordnung der NOEs erhöht wurde. Insgesamt wurden 140 NOE-Abstandsbeschränkungen von der Analyse der NOESY-Spektren abgeleitet. Diese umfassen 68 Beschränkungen innerhalb des Rests, 24 sequenzielle Beschränkungen, 20 Beschränkungen im mittleren Bereich (|i-j| < 5) und 27 Beschränkungen im langen Bereich (|i-j| ≥ 5). Zusätzlich konnten bei der Betrachtung der anfänglichen SC-4-Strukturen und von langlebigen NHs des Rückgrats insgesamt 8 Wasserstoff-Bindungen identifiziert werden, die 16 Wasserstoffbrücken-Abstandsbeschränkungen entstehen lassen. Die Gesamtzahl der experimentell abgeleiteten Beschränkungen lag somit bei 156, was durchschnittlich 13 Beschränkungen pro Rest ergibt.
Anfänglich wurden 100 Strukturen für SC-4 errechnet, wie im Abschnitt Methoden beschrieben. Die am besten angepassten Überlagerungen von Cα-Atomen des Rückgrats für die 14 Endstrukturen sind in 6 (links) gezeigt. Diese Strukturen zeigten keine NOE-Verletzungen, die größer waren als 0,5 Å. Die Struktur-Statistiken sind in Tabelle 3 zusammengefasst. Der strukturell etwas weniger definierte N-Terminus ist offensichtlich. Die Strukturen genügen den experimentellen Beschränkungen recht gut. Für die Reste 3 bis 12 sind die atomaren RMS-Unterschiede hinsichtlich der mittleren Koordinatenpositionen 0,71 ± 0,08 Å für Rückgrat (N, C^α, C)-Atome und 1,4 ± 0,4 Å für alle schweren Atome. Zusätzlich liegen alle ϕ- und Ψ-Winkelordnungsparameter bei > 0,8. Insgesamt zeigen die vorstehenden Daten an, dass diese Strukturen, die verwendet werden, um die Lösungskonformation von SC-4 darzustellen, gut konvergiert sind. Die helikale Struktur von SC-4 ist, nicht überraschenderweise, zwischen der einer α-Helix und der einer 3₁₀-Helix, wobei die durchschnittliche Anzahl der Reste pro Windung bei 3,3 liegt. Vom N-Terminus bis zu W9 ist die Helix amphipathisch, wobei K1, K4, R5 und K8 auf einer Seite angeordnet sind, wie in 6 gezeigt, wobei diese Reste hervorgehoben sind.
Tabelle 3. Struktur-Statistiken für die berechneten Strukturen von SC-4 aus NMR-Daten

^aKeine der 14 Endstrukturen zeigten Abstandsbeschränkungs-Verletzungen, die größer waren als 0,5 Å, oder zweiflächige Winkelverletzungen, die größer waren als 5°. Die RMSD-Werte repräsentieren die mittleren und Standardabweichungen für die 14 Strukturen.
^bDie Endwerte der NOE (ENOE)-Torsionswinkel (ECDIH)- und NCS (ENCS)-Potenziale wurden mit festen Konstanten von 50 kcal·mol^–1. Å^–2, beziehungsweise 200 kcal·mol^–1.rad^–1, und 300 kcal·mol^–1. Å^–2 berechnet.

Wirkungen der Modifikation der SC-4-Sequenz
Da SC-3 und SC-4 am stärksten bakterizid, am wenigsten hämolytisch waren, und SC-4 eines der besten bei der Neutralisation von Endotoxin war, wurden zusätzliche Dodecapeptid-„Durchwanderer" hergestellt, um die Verschiebungen einzelner Reste zwischen SC-3 und SC-4 zu vervollständigen:
Zusätzlich wurde eine längere Variante, die SC-4 auf jeder Seite der Sequenz durch einen Rest verlängert, untersucht:
Da bekannt ist, dass die Gegenwart von positiv geladenen Resten für bakterizide und LPS-neutralisierende Aktivitäten bedeutend ist, wurde eine Reihe von Lysin/Arginin-substitutierten SC-4-Varianten untersucht:
SC-404 bis SC-407 tauschen jedes der vier Lysine durch Norleucine aus (Lysin ohne die Seitenketten-Aminogruppe). Die Varianten SC-408 und SC-409 tauschen das Arginin, R5, durch Lysin beziehungsweise Norleucin aus.
Die CD-Daten zeigen an, dass diese Varianten sich auch helikal falten, wobei sie zwischen 3₁₀- und α-helikaler Struktur schwanken, wie die parentalen Peptide SC-3 und SC-4 (Daten nicht bekannt). Tabelle 2 listet Werte für λ_min und das [θ]₂₂₂/[θ]₂₀₇-Verhältnis bei 70% TFE auf. Während sowohl SC-401 als auch SC-403 λ_min-Werte von etwa 207 nm zeigen, liegen ihre [θ]₂₂₂/[θ]₂₀₇-Verhältnisse höher als die von entweder SC-3 oder SC-4, was anzeigt, dass diese beiden SC-4-Varianten eher einen α-Helix- und weniger einen 3₁₀-Helix-Charakter haben als das parentale Peptid SC-4. SC-402 hat jedoch eine größere Population an Zufallsknäuel in ihrer Konformations-Gesamtheit, da sein λ_min-Wert bei 204 nm liegt. Die Lysin/Arginin-Varianten, SC-404 bis SC-409, verhalten sich in ihrer Konformation wie das parentale SC-4 mit beträchtlichem 3₁₀-Helix-Charakter. Die NMR-Daten, die in Gegenwart von 30% TFE erhalten wurden (Daten nicht gezeigt), unterstützen die Gegenwart von signifikanten Populationen von helikaler Konformation, wie für SC-3 und SC-4 beobachtet.
Die bakteriziden Aktivitäten dieser Peptide wurden gegen drei der vorstehend verwendeten Stämme, E. coli J5, P. aeruginosa und S. aureus MNHO erhalten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Gegen J5 sind SC-401 und SC-402 aktiver als SC-3 und etwas weniger aktiv als SC-4. Die Verschiebung der Dodecapeptid-Einheit von SC-3 nach SC-4 erhöht daher die Aktivität. Auf der anderen Seite erhöht das Zusetzen von hydrophoben Resten an beiden terminalen Stellen in SC-4, d.h. SC-403, leicht die Aktivität. Verwendet man P. aeruginosa, so zeigen bakterizide Dosis-Reaktionskurven an, dass jedes Dodecapeptid, SC-401 oder SC-402, die Aktivität verringert. Dies ist etwas überraschend, da sowohl SC-3 als auch SC-4 dieselbe Aktivität gegen P. aeruginosa haben (siehe Tabelle 1). Dies kann etwas mit der Art zu tun haben, mit der diese Peptide mit der Bakterienzellwand/Membran interagieren. Gegen den S. aureus-Stamm MNHO hebt die Verschiebung des Dodecapeptid-Fensters um nur einen Rest von SC-3 nach SC-4, d.h. SC-401, die Aktivität im Wesentlichen auf. Eine andere Verschiebung von nur einem Rest (SC-402) bringt einige Aktivität zurück, und die Verlängerung beider Termini von SC-4 hat keine Wirkung.
Tabelle 4. SC-4-Peptid-Varianten SC-401 bis SC-409 – LD50-Werte für bakterizide Aktivität und IC50-Werte für die Neutralisierung von Bakterien-Lipopolysaccharid (LPS). Alle Werte sind als micromolare Mengen angegeben.

*LD50- und IC50-Werte sind in Einheiten von 10^–6 M
Standardabweichungen sind etwa ± 30% der angegebenen Werte.
XXX bedeutet bei Konzentrationen unterhalb von 1 × 10^–5 M nicht aktiv.

Mit den Lysin-Varianten reduziert die Substitution von K1 oder K4 durch Norleucin die bakterizide Aktivität gegen J5 nur leicht, wohingegen die Substitution von K8 und K10 durch Norleucin einen etwas stärker signifikanten Abfall der Aktivität zeigt. Dies ist besonders für SC-407 (K10X) der Fall. Nichtsdestoweniger bleiben die bakteriziden Aktivitäten respektabel, wobei sie anzeigen, dass die Entfernung einer einzigen positiven Ladung allein die Aktivität nicht aufhebt. Die Substitution von R5 mit Lysin zeigt jedoch keine Veränderung der Aktivität, wohingegen die Substitution von R5 durch Norleucin eine signifikante Aktivitätszunahme verursacht. Die NRM-Lösungsstruktur von SC-4 zeigt, dass K1, K4, R5 und K8 auf einer Fläche einer amphipathischen Helix liegen, wobei K10 mehr auf der Seite liegt (5). Diese Konformation der Peptide lagert K4 und R5 zwischen K1 und K8. Die Entfernung der geladenen Gruppe an Position 5 kann dabei helfen, die Ladungs-Ladungs-Abstoßung zu reduzieren und über hydrophobe Interaktionen, den Rest des Lysin-Kerns zu stabilisieren.
Wiederum reduzieren alle Veränderungen der SC-4-Aminosäuresequenz die bakteriziden Wirkungen gegen P. aeruginosa (Tabelle 4). In der Lysin/Argininreihe hat die Substitution von K1, K4 und R5 durch Norleucin die schädlichsten Auswirkungen. Gegen den Stamm S. aureus MNHO wird die Substitution von jedem dieser geladenen Reste mehr toleriert (Tabelle 4).
Diese Daten zeigen ebenfalls an, dass, während der Aktionsmechanismus dieser Peptide gegen verschiedene Bakterienstämme ähnlich sein kann, es diskrete und signifikante Unterschiede gibt, die mit der räumlichen Orientierung von geladenen und hydrophoben Gruppen der Peptide in Verbindung stehen. Darüber hinaus kann, obwohl CD- und NMR-Daten für diese Peptide eine helikale Konformation anzeigen, die Interaktion mit der Bakterienzellwand/Membran diese Konformation bestimmt modifizieren, was eine Ableitung genauer Struktur-Aktivitäts-Beziehungen unmöglich macht.
Die Fähigkeit dieser SC-4-Varianten, LPS zu neutralisieren, wurde ebenfalls untersucht. Dosis-Reaktionskurven sind in 3 gezeigt und IC50-Werte sind in Tabelle 4 aufgelistet. Wie vorstehend gezeigt, sind SC-401 und SC-402 Dodecapeptide, bei denen jeweils ein Rest von SC-3 beziehungsweise SC-4 verschoben ist. SC-4 hat einen IC50 von 2 × 10^–6 M, wohingegen SC-3 einen IC50 hat, der um mehr als das zehnfache größer ist (25 × 10^–6 M). Mit der Verschiebung eines einzigen Rests von SC-3 nach SC-4 ist die Aktivität von SC-401 (IC50-Wert von 126 × 10^–6 M) im Vergleich zu der von SC-3 um das 5-fache gesunken. Die Verschiebung eines weiteren Rests, um SC-402 zu erhalten, bringt die LPS-Neutralisierungs-Aktivität zurück auf den Wert, der für SC-3 beobachtet wurde (IC50 von 25 × 10^–6 M). Der Vergleich dieser Sequenzen zeigt an, dass es offensichtlich entscheidend ist, mindestens einen hydrophoben Rest an der C-terminalen Position zu haben. SC-3 hat Trp und SC-402 hat Ile. Das am wenigsten aktive SC-401 endet in einem Lys-Rest. Das am meisten aktive Peptid SC-4 hat das hydrophobe Dipeptid Ile-Ile an seinem C-Terminus. Die exakte funktionelle Bedeutung ist nicht klar, da das äquipotente SC-5 nur einen hydrophoben Rest, Leu, an seinem C-Terminus hat, wohingegen SC-1 Phe, SC-2 His, SC-6 Gly und das inaktive SC-7 ebenfalls ein Leu hat.
In den Varianten von Lysin nach Norleucin reduziert die Substitution der ersten beiden Lys-Reste (K1X und K4X) die Aktivität nur etwa um das 3-fache. Die Substitution der letzten beiden Lys-Reste (K8X und K10X) hat im Wesentlichen keine Auswirkung auf die Fähigkeit des Peptids, LPS zu neutralisieren. In dieser Hinsicht ist keines dieser Lysine für diese Aktivität entscheidend. Ein überraschendes Ergebnis wurde jedoch mit SC-408 und SC-409 beobachtet. SC-408 ist die R5K-Variante. Hier fällt die Aktivität dramatisch um etwa das 500-fache. Allein, dies würde darauf hinweisen, dass der Arg-Rest für die Aktivität entscheidend ist, und die Ladungskonservierung nicht ausreicht, um die Aktivität aufrechtzuerhalten. Dieser Schluss wird jedoch durch Ergebnisse mit SC-409 in Frage gestellt, wobei dieses Arg durch Norleucin ersetzt wurde, wodurch die positive Ladung vollständig entfernt, der hydrophobe Charakter jedoch durch die Seitenketten-Methylene aufrechterhalten wurde. In SC-409 wurde, verglichen mit SC-4, fast die volle Aktivität erhalten. Somit ist eine kleine positiv geladene Aminogruppe an dieser Position für die Aktivität schädlich, die Ladung selbst spielt bei der Aktivität jedoch keine offensichtliche Rolle.
Diskussion
Gegen Bakterien, die in dieser Studie untersucht wurden, ist SC-4, mit LD50-Werten, die in den nanomolaren Einer- bis Hunderterbereich fallen, insgesamt das wirksamste antibakterielle Mittel all dieser Peptide. Abgesehen von SC-7 und SC-8, die bei Konzentrationen unterhalb 10 micromolar inaktiv sind, sind die anderen SC-Peptide, insbesondere SC-3 und SC-5, ebenfalls recht gut bakterizid. In der Tat liegen die Aktivitäten für die Peptide SC-1 bis SC-6 gegen die S. aureus-Stämme MN8 und MNHO ungefähr innerhalb eines Faktors von zwei voneinander entfernt, aber gegen den E. coli-Stamm IA2 sticht SC-4 wieder hervor, wobei es etwa 4- bis 10-mal mehr aktiv ist als jedes andere SC-Peptid. Die Beobachtung, dass bakterizide Peptide wie SC-4 gegen Gram-negative Stämme im Gegensatz zu Gram-positiven wirksamer sind, wird allgemein bei anderen bekannten bakteriziden Peptiden beobachtet. Unterschiede der bakteriziden Aktivitäten gegen verschiedene Stämme sind am wahrscheinlichsten einer Variabilität in den Bestandteilen der Bakterienmembranen und wie diese Peptide mit diesen Membranen interagieren, zuzuschreiben. Zum Beispiel schließt die äußere Membranoberfläche Gram-negativer Bakterien Lipopolysaccharide ein, wohingegen es in Gram-positiven Bakterien keine äußere Membran gibt und die Zellwand die sauren Polysaccharide, Teichonsäuren, einschließt. SC-4 muss die geeigneten Zusammensetzungs- und strukturellen Merkmale einfangen, die für Interaktionen mit diesen zumeist negativ geladenen Zelloberflächen notwendig sind, um eine bakterizide Aktivität mit einem solchen Breitenspektrum auszuüben.
Im Vergleich zu Bakterien-Membranen haben normale Säuger-Zellmembranen, die vor allem aus zwitterionischem Phosphatidylcholin- und Sphingomyelin-Phospholipiden zusammengesetzt sind, einen eher positiv geladenen Charakter. Auf Grund des signifikanten Abfalls der negativen Nettoladung von eukaryontischen Zellmembran-Oberflächen interagieren bakterizide Peptide im Allgemeinen weniger mit Säugerzellen. Nichtsdestoweniger können bakterizide Peptide Säugerzellen in Konzentrationen nahe ihren bakteriziden LD50-Konzentrationen lysieren (Maloy et al., Biopolymers 37, 105-112 (1995)). In dieser Hinsicht ist zu überprüfen, dass diese Konzentrationsschwellen nicht nahe beieinander sind, um das wirksamste und am wenigsten cytotoxische therapeutische bakterizide Agens zu erhalten. Rote Blutzellen werden in der Regel als Modelle für eukaryontische Zellen gewählt und Hämolyse wird oft als Index der cytolytischen Aktivität eines Peptids gegen Säugerzellen verwendet. Für die meisten SC-Peptide findet eine signifikante Hämolyse nur bei Konzentrationen oberhalb von 1 × 10^–4 M statt, wohingegen die LD50-Werte alle in submikromolaren bis nanomolaren Bereichen liegen. Diese geringe Cytotoxizität gegen Säugerzellen ist ein zusätzlicher Vorteil der Verwendung von SC-Peptiden als Antibiotika.
Antibakterielle Peptide wurden auf verschiedene Arten klassifiziert. Eine Klassifizierung basiert auf chemischen Struktur-Kriterien und wird in zwei breite Gruppen geteilt: lineare Peptide und zyklische Peptide. Innerhalb der linearen Gruppe können zwei Untergruppen unterschieden werden: (1) lineare Peptide, die dazu tendieren, helikale Struktur anzunehmen und (2) lineare Peptide mit unüblicher Zusammensetzung, reich an Aminosäuren wie Pro, Arg oder sogar Trp. Nimmt man die Beobachtung, dass SC-Peptide helikal sind, so werden sie in die erste Untergruppe klassifiziert. Eine Liste anderer linearer antibakterieller Peptide mit helikaler Konformation wurde durch Andreu & Rivas (Andreu et al., Biopolymers (Pep. Sci.) 47, 415-433 (1998)) (vgl. Tabelle I in Andreu et al., Biopolymers (Pep. Sci.) 47, 415-433 (1998)) tabellarisiert und umfasst: Andropin, BLP-1, Bombinin, Bombolitin, die Cecropine, Ceratotoxin, Clavanin, CRAMP, Dermaseptin, Enbocin, FALL-39, Lycotoxin I, Magainin, Melittin, Misgurin, PGLa, Pleurocidin, Seminalplasmin und Styelin. Die Konformationen von Peptiden innerhalb dieser Gruppe werden meistens als α-helikal erörtert, was ein spezifischer Typ einer Helix ist, die 13 Atome oder 3,6 Reste pro helikale Windung hat. Es wurde jedoch beobachtet, dass viele kurze lineare Peptide in wässriger Lösung ein Gemisch aus α-Helix und 3₁₀-Helix bilden (Toniolo et al., J. Am. Chem. Soc. 118, 2744-2745 (1996); und Millhauser et al., Biochemistry 34, 3873-3877 (1995)). Durch die Rezension von Strukturdaten (vor allem CD-Messungen) über andere bekannte helixbildende antibakterielle Peptide, die vorstehend aufgelistet sind, ist es offensichtlich, dass einige dieser Peptide ebenfalls einen 3₁₀-Helix-Charakter haben. In dieser Hinsicht kann der Begriff „α-helikal", wie momentan in der Literatur verwendet, sich tatsächlich auf beide Helix-Typen beziehen, d.h. die 3₁₀-Helix sollte nicht ausgeschlossen werden.
Sowohl die CD- als auch die NMR-Konformationsanalysen der SC-Peptide, vor allem von SC-4, zeigen, dass sie in wässriger Lösung als Gemisch aus α-Helix, 3₁₀-Helix und Zufallsknäuel vorliegen. Der Grad der spezifischen Helixbildung hängt von der jeweiligen Sequenz und der Gegenwart oder Abwesenheit von TFE ab. Bei SC-Peptiden scheint TFE Konformationen, die in gewissem Ausmaß bereits in Wasser vorliegen, nicht zu induzieren. NOE-Muster sind zum Beispiel in Wasser und in TFE im Wesentlichen gleich. In TFE sind NOEs im Allgemeinen größer, was anzeigt, dass TFE bei der Stabilisierung vorhandener Konformationen wirkt. Darüber hinaus stellt TFE auch eine Umgebung geringerer Dielektrizität bereit, die irgendwie die geringe Dielektrizität innerhalb einer Membran nachahmen kann. Im Hinblick auf die Peptid-Faltung ist die Gegenwart jedes Helixtyps interessant, da SC-Peptide von βpep-25 abgeleitet wurden, das in wässriger Lösung eine β-Faltblattstruktur bildet (Mayo et al., Protein Sci. 5, 1301-1315 (1996)). Es scheint deshalb so, dass SC- Peptide, wenn sie aus dem Kontext des gesamten βpep-33-Mere entfernt werden, frei sind, eine helikale Struktur zu bilden. Es wurde ebenfalls beobachtet, dass bakterizide Aktivität in βpep-Peptiden mit β-Faltblatt-Stabilität negativ korreliert ist (Mayo et al., Biochim. Biophys. Acta 1425, 81-92 (1998)), d.h. mehr stabiles β-Faltblatt führt zu verringerter bakterizider Aktivität. Innerhalb der Bakterienmembran kann dies Konformationsänderungen einiger βpep-Peptide erleichtern und dadurch eine größere bakterizide Aktivität fördern.
Basierend auf NOE-Daten zeigt die Struktur-Modellierung, dass SC-4 die Konformation einer amphipathischen Helix besitzt ist. Für einige Zeit wurde über die amphipathische helikale Struktur bemerkt, sie sei für die bakterizide Aktivität wichtig. Obwohl der Aktionsmechanismus bakterizider Peptide zum größten Teil unklar ist, wurde gezeigt, dass Peptid-Lipid-, eher als Rezeptor-vermittelte Erkennungsprozesse die Hauptrolle in ihrer Funktion spielt (Oren et al., Biopolymers (Pep. Sci.) 47, 451-463 (1998)). Es wurde gezeigt, dass mindestens ein antibakterielles Peptid: KLKLLLLLKLK_-NH2 (SEQ ID NO:20), das nur in einer sehr viel höheren Konzentration (1 × 10^–4 M) als SC-4 wirksam ist, durch die Erzeugung von Kanälen in Bakterienmembranen funktioniert, wobei es die Membrandurchlässigkeit erhöht und ihre Funktion beeinträchtigt, was schließlich zum Zelltod führt (Alvarez-Bravo et al., J. Biochem. 117, 1312-1316 (1995)). SC-Peptide funktionieren wahrscheinlich ähnlich, da die Auslauf-Kinetik im selben Zeitmaßstab mit der halben Abtötungszeit von etwa 10 min auftritt. Zwei Wirkungsmechanismen wurden vorgeschlagen, um die Membranpermeation durch amphipathische, helikale Peptide zu erklären: (1) transmembrane Porenbildung über einen „Fassdauben"-Mechanismus (Ehrenstein et al., Quart. Rev. Biophys. 10, 1-34 (1977)) oder (2) Membranzerstörung/Solubilisierung über einen „Teppich-ähnlichen" Mechanismus (Gazit et al., Biochemistry 34, 11479-11488 (1995); und Pouny et al., Biochemistry 31, 12416-12423 (1992)). Bei dem allgemein favorisierten „Teppich-ähnlichen" Mechanismus interagieren amphipathische helikale Peptide mit der Oberfläche der Bakterienmembran so, dass ihre hydrophoben Oberflächen zur Membran hin liegen und ihre hydrophilen Oberflächen zum Lösungsmittel hin liegen. Wird eine Schwellen-Peptidkonzentration erreicht, wird die Membran aufgebrochen und eine Durchgangspore gebildet. Aus den vorliegenden Daten ist es unmöglich, definitiv darauf zu schließen, dass SC-Peptide, nur wenn sie in helikaler Konformation sind, mit Zellmembranen interagieren. Nichtsdestotrotz kann, wenn diese Peptide die Konformation von amphipathischen Helices aufweisen, ihr Wirkungsmechanismus genauer erklärt werden.
Die Membranoberfläche sowohl der Gram-positiven als auch -negativen Bakterien hat eine negative Nettoladung, die sie zur favorisierten Umgebung für die Interaktion mit polykationischen Peptiden wie SC-4 werden lässt. In der Tat zeigten Gray et al. (Gray et al. Biochim. Biophys. Acta 1244, 185-190 (1995), dass viel von der bakteriziden Aktivität des Proteins B/PI (bakterizides/Permeabilitäts-erhöhendes Protein) der positiv geladenen Tripeptidsequenz KWK zugeschrieben werden kann. SC-Peptide sowie das antibakterielle Peptid Cecropin (Hanzawa et al., FEBs Lett. 269, 413-420 (1990)) enthalten ebenfalls das KWK-Tripeptid-Motiv. Im Vergleich zu SC-4 sind ihre bakteriziden Aktivitäten gegen P. aeruginosa jedoch mit letalen Konzentrationen von zum Beispiel 6 micromolar für Cecropin P1 (Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 9159-9162 (1989)) verglichen mit 10 nanomolar für SC-4 viel geringer. Es ist wichtig zu betonen, dass eine hohe positive Nettoladung allein nicht eine optimale bakterizide Aktivität garantiert. Zum Beispiel haben SC-4 und SC-5 beide eine Nettoladung von +6, obwohl SC-4 von beiden das stärkere gegen Gram-negative Bakterien ist. Des Weiteren zeigt, während SC-6 und SC-1 Nettoladungen von nur +3 haben, SC-6 in etwa dieselbe allgemeine bakterizide Aktivität wie SC-5 und SC-1 ist gegen den E. coli-Stamm J96 mindestens so aktiv wie SC-4. Die Gegenwart hydrophober Reste moduliert ebenfalls die bakterizide Aktivität; dennoch kann Hydrophobie allein nicht für diese Aktivitätsunterschiede verantwortlich sein, da der Gehalt an hydrophoben Resten in jedem SC-Peptid etwa 50% bis 60% beträgt. Ein anderes, hauptsächlich positiv geladenes und hydrophobes bakterizides Peptid, abgeleitet von der C-terminalen amphipathischen α-Helix von Plättchen-Faktor-4 (Darveau et al., J. Clin. Invest. 90, 447-454 (1992)) hat zum Beispiel vier Lysinreste, die in Tandem auf einer Seite seiner Helix angeordnet sind; dennoch ist seine Aktivität um etwa das 100-fache geringer als jene von SC-4.
Klarerweise tragen sowohl die Zusammensetzung als auch die Sequenz zur Funktion bei. Die Aminosäuresequenz wiederum bestimmt die Konformation, die schließlich der Schlüssel zum Verständnis von bakteriziden Wirkungen von SC-Peptiden und von anderen bakteriziden Peptiden im Allgemeinen ist. Im Fall von SC- 4 sind K1, K4, R5 und K8 auf derselben Seite des helikalen Moleküls angeordnet (vgl. 6). Da die CD- und NMR-Daten anzeigen, dass die anderen SC-Peptide auch eine Neigung haben, in wässriger Lösung eine helikale Struktur zu bilden und ebenfalls ihre antibakterielle Aktivität fördern können, wenn sie in helikaler Konformation vorliegen, zeigt 7 helikale Rad-Projektionen für SC-1 bis SC-8. Es ist anzumerken, dass die aktivsten SC-Peptide, SC-3 und SC-4, vier positiv geladene Reste haben, die in Tandemanordung auf einer Seite der Helix angeordnet sind. Darüber hinaus liegt in beiden Fällen ein Lysinrest oben auf der Spitze einer diamantenförmigen Anordnung mit einem R-K-Paar in der Mitte und einem anderen K auf dem Grund dieser Anordnung. Für SC-4 ist die diamantenförmige Anordnung K1, R5-K4, K8 und für SC-3 ist die Anordnung K4, R8-K7, K11. In SC-4 beginnt diese Anordnung an der ersten Windung der Helix am N-Terminus, wohingegen sie in SC-3 an der zweiten Windung der Helix beginnt. Dies kann der Grund sein, warum SC-4 insgesamt aktiver ist als SC-3. Im nächstaktivsten Peptid, SC-5, bilden die Reste K1-R2 und K5 auf der Helixoberfläche eine Dreieckform, die Teil einer Diamantenform ist. In den weniger aktiven Peptiden SC-1, -2 und -6 sind positiv geladene Reste über die gesamte Helix positioniert, und in den am wenigsten aktiven oder inaktiven Peptiden SC-7 und -8 sind die Lysinreste wenig und negativ geladene Reste sind dazwischen gelagert. Im Hinblick auf die antibakterielle Potenz von SC-Peptiden sollte dieser diamantenförmigen Anordnung nicht zuviel Bedeutung beigemessen werden, da das Entfernen von einem dieser positiv geladenen Reste von SC-4 seine Aktivität nicht in einem größeren Ausmaß reduziert. Nichtsdestotrotz kann diese Ladungsverteilung zumindest teilweise für eine optimale Aktivität benötigt werden.
Die Auflösung der äußeren Zellmembran der Gram-negativen bakteriziden Zelle setzt das Endotoxin Lipopolysaccharid (LPS) frei, das in den weißen Blutzellen von Säugern die übermäßige Freisetzung verschiedener Cytokine wie TNFα und Interleukin-1 auslöst. Dies kann wiederum zu der pathologischen Störung der Sepsis und möglicherweise schließlich zum Tod führen. SC-4 ist ein solches bakterizides Peptid, das den zusätzlichen Vorteil hat, dass es in der Lage ist, LPS zu neutralisieren. Während die LPS-Bindungsaktivität (IC50) von SC-4 (2 × 10^–6 M) nicht so hoch ist wie die des 55 kD-Proteins B/PI (2 × 10^–8 M) (Marion et al., FEBS Lett. 227, 21-26 (1988)), ist SC-4 schließlich nur ein Dodecapeptid. Es wird angenommen, dass die Neutralisation von LPS mechanistisch vor allem durch Interaktionen zwischen dem Protein/Peptid und dem Lipid A-Abschnitt von einem gegebenen LPS vermittelt wird. Die Eigenschaften von LPS variieren von Bakterienstamm zu Stamm; alle LPS-Moleküle enthalten jedoch eine konservierte Kerneinheit Lipid A, die sich aus einem diphosphorylierten Diglycosaminoglycan mit einer Anzahl an angehefteten polyphosphorylierten Oligosacchariden und mehreren Acylketten zusammensetzt. Es wurde angenommen, dass die LPS-Neutralisation über Protein/Peptidbindung an Lipid A sowohl über kationische Aminosäure-Interaktionen mit den anionischen Phosphaten als auch über hydrophobe Interaktionen mit den Acylketten stattfindet. In der SC-Reihe spielt die positive Ladung bei der LPS-Neutralisation eine Rolle. SC-4 und SC-5, die die höchste positive Nettoladung von +6 haben, neutralisieren auch am besten LPS. Jedoch kann ebenso wie bei der bakteriziden Aktivität eine hohe positive Nettoladung allein nicht für die LPS-Neutralisation verantwortlich sein. Man betrachte zum Beispiel SC-2 und SC-3, die beide eine Nettoladung von +5 haben; dennoch ist SC-3 bedeutend aktiver als SC-2. Darüber hinaus verringert in der mit Arg/Lys substituierten Norleucin-Reihe (Tabelle 4) die Entfernung eines positiven Rests die LPS-Bindungsaktivität nur leicht, was wahrscheinlich anzeigt, dass das positive Ladungsfeld selbst eher als ein einzelner geladener Rest die Aktivität vermittelt. Auf der anderen Seite scheinen hydrophobe Reste am C-Terminus für die LPS-Bindung mehr von Bedeutung zu sein. Das Entfernen der zwei Isoleucine vom C-Terminus von SC-4 (Peptid SC-401) verringert die Aktivität um das 60-fache, wohingegen das Entfernen von nur einem dieser Isoleucine (Peptid SC-402) die Aktivität nur um das 12-fache verringert. Ein eigenartiges Ergebnis ist, dass, während das Entfernen von R5 (SC-408) die LPS-Bindung nicht beeinträchtigt, das Ersetzen von R5 durch Lysin die LPS-Bindung um mehr als das 500-fache reduziert.
Schlussfolgerung
Die Identifikation eines Dodecapeptids mit starker bakterizider Aktivität sowohl gegen Gram-positive als auch -negative Bakterien kann zur Entwicklung eines hochwirksamen therapeutischen Antibiotikums und bakteriellen Endotoxin-neutralisierenden Agens führen. Die Herstellung und Reinigung bakterizider Proteine oder Peptide mit längeren Sequenzen ergeben Probleme, die teilweise durch die Identifikation eines kleinen Peptids wie SC-4 vermieden werden können. Da ständig neue Stämme antbiotikaresistenter Bakterien auftauchen, werden solche neuen bakteriziden Agenzien besonders nützlich werden.
Tabelle 5.
Tabelle 6
Sequenzfreier Text
Folgende sind synthetische Polypeptide:
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus jenen, welche durch die SEQ ID NOs: 1 bis 6 dargestellt sind, und Analoge davon, die wirksam sind zur Behandlung von bakterieller Infektion, zur Behandlung von Endotoxämie, zum Verringern der Menge an TNF-α, zum Hemmen endothelialer Zellproliferation, zum Hemmen angiogenetischer Faktor-vermittelter Herabregulierung interzellulärer Adhäsionsmolekülexpression, zum Hemmen von Angiogenese und/oder zum Hemmen von Tumorgenese, wobei ein Analog davon durch das Enthalten einer Deletion einer Aminosäure, von Additionen einer oder zwei Aminosäuren, von Austauschen konservierter Aminosäuren oder von chemischen und/oder enzymatischen Modifikationen an einer oder mehreren bestehenden Aminosäuren, beinhaltend Seitenkettenmodifikationen, Rückgratmodifikationen und N- und C-terminale Modifikationen, definiert ist.
Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus jenen, welche durch die SEQ ID NOs: 9 bis 17, wobei X eine Aminosäure ist, dargestellt sind, und Analoge davon, die wirksam sind zur Behandlung von bakterieller Infektion, zur Behandlung von Endotoxämie, zum Verringern der Menge an TNF-α, zum Hemmen endothelialer Zellproliferation, zum Hemmen angiogenetischer Faktor-vermittelter Herabregulierung interzellulärer Adhäsionsmolekülexpression, zum Hemmen von Angiogenese und/oder zum Hemmen von Tumorgenese, wobei ein Analog davon durch das Enthalten einer Deletion einer Aminosäure, von Additionen einer oder zwei Aminosäuren, von Austauschen konservierter Aminosäuren oder von chemischen und/oder enzymatischen Modifikationen an einer oder mehreren bestehenden Aminosäuren, beinhaltend Seitenkettenmodifikationen, Rückgratmodifikationen und N- und C-terminale Modifikationen, definiert ist.
Polypeptid gemäß Anspruch 2, wobei X Norleucin ist.
Arzneimittel, umfassend das Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3.
Verwendung eines Polypeptids, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus jenen, dargestellt durch die SEQ ID NOs: 1 bis 6 und 9 bis 17, wobei X eine Aminosäure ist, wirksamen Analogen davon und Kombinationen davon, zur Herstellung eines Arzneimittels zum Behandeln bakterieller Infektion und/oder Endotoxämie, wobei ein Analog davon durch das Enthalten einer Deletion einer Aminosäure, von Additionen einer oder zwei Aminosäuren, von Austauschen konservierter Aminosäuren oder von chemischen und/oder enzymatischen Modifikationen an einer oder mehreren bestehenden Aminosäuren, beinhaltend Seitenkettenmodifikationen, Rückgratmodifikationen und N- und C-terminale Modifikationen, definiert ist.
Verwendung gemäß Anspruch 5, wobei das Polypeptid Endotoxin neutralisiert.
Verwendung gemäß Anspruch 5, wobei das Polypeptid bakterizid ist.
Verwendung gemäß Anspruch 5, wobei das Polypeptid sowohl bakterizid als auch fähig zum Neutralisieren von Endotoxin ist.
Verfahren zum Hemmen bakterieller Infektion und/oder Endotoxämie in vitro, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen von Zellen mit einer Menge einer Zusammensetzung, wirksam um die bakterielle Infektion zu hemmen und/oder Endotoxin zu neutralisieren, umfasst, wobei die Zusammensetzung ein Polypeptid enthält, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus jenen, dargestellt durch die SEQ ID NOs: 1 bis 6 und 9 bis 17, wobei X eine Aminosäure ist, wirksamen Analogen davon und Kombinationen davon, wobei ein Analog davon durch das Enthalten einer Deletion einer Aminosäure, von Additionen einer oder zwei Aminosäuren, von Austauschen konservierter Aminosäuren oder von chemischen und/oder enzymatischen Modifikationen an einer oder mehreren bestehenden Aminosäuren, beinhaltend Seitenkettenmodifikationen, Rückgratmodifikationen und N- und C-terminale Modifikationen, definiert ist.
Verwendung eines Polypeptids, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus jenen, dargestellt durch die SEQ ID NOs: 1 bis 6 und 9 bis 17, wobei X eine Aminosäure ist, wirksamen Analogen davon und Kombinationen davon, zur Herstellung eines Arzneimittels zum Verringern der Menge an TNF-α in einem Patienten, wobei ein Analog davon durch das Enthalten einer Deletion einer Aminosäure, von Additionen einer oder zwei Aminosäuren, von Austauschen konservierter Aminosäuren oder von chemischen und/oder enzymatischen Modifikationen an einer oder mehreren bestehenden Aminosäuren, beinhaltend Seitenkettenmodifikationen, Rückgratmodifikationen und N- und C-terminale Modifikationen, definiert ist.
Verfahren zum Verringern der Menge an TNF-α in vitro, wobei das Verfahren das Inkubieren von Zellen mit einer wirksamen Menge einer Zusammensetzung, enthaltend ein Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus jenen, dargestellt durch die SEQ ID NOs: 1 bis 6 und 9 bis 17, wobei X eine Aminosäure ist, wirksamen Analogen davon, und Kombinationen davon, umfasst, wobei ein Analog davon durch das Enthalten einer Deletion einer Aminosäure, von Additionen einer oder zwei Aminosäuren, von Austauschen konservierter Aminosäuren oder von chemischen und/oder enzymatischen Modifikationen an einer oder mehreren bestehenden Aminosäuren, beinhaltend Seitenkettenmodifikationen, Rückgratmodifikationen und N- und C-terminale Modifikationen, definiert ist.
Verwendung eines Polypeptids, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus jenen, dargestellt durch die SEQ ID NOs: 1 bis 6 und 9 bis 17, wobei X eine Aminosäure ist, wirksamen Analogen davon und Kombinationen davon, zur Herstellung eines Arzneimittels zum Hemmen endothelialer Zellproliferation in einem Patienten, wobei ein Analog davon durch das Enthalten einer Deletion einer Aminosäure, von Additionen einer oder zwei Aminosäuren, von Austauschen konservierter Aminosäuren oder von chemischen und/oder enzymatischen Modifikationen an einer oder mehreren bestehenden Aminosäuren, beinhaltend Seitenkettenmodifikationen, Rückgratmodifikationen und N- und C-terminale Modifikationen, definiert ist.
Verfahren zum Inhibieren endothelialer Zellproliferation in vitro, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen von Zellen mit einer wirksamen Menge einer Zusammensetzung, enthaltend ein Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus jenen, dargestellt durch die SEQ ID NOs: 1 bis 6 und 9 bis 17, wobei X eine Aminosäure ist, wirksamen Analogen davon und Kombinationen davon, umfasst, wobei ein Analog davon durch das Enthalten einer Deletion einer Aminosäure, von Additionen einer oder zwei Aminosäuren, von Austauschen konservierter Aminosäuren oder von chemischen und/oder enzymatischen Modifikationen an einer oder mehreren bestehenden Aminosäuren, beinhaltend Seitenkettenmodifikationen, Rückgratmodifikationen und N- und C-terminale Modifikationen, definiert ist, umfasst.
Verwendung eines Polypeptids, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus jenen, dargestellt durch die SEQ ID NOs: 1 bis 6 und 9 bis 17, wobei X eine Aminosäure ist, wirksamen Analogen davon und Kombinationen davon, zur Herstellung eines Arzneimittels zum Hemmen angiogenetischer Faktor-vermittelter Herabregulierung interzellulärer Adhäsionsmolekülexpression in einem Patienten, wobei ein Analog davon durch das Enthalten einer Deletion einer Aminosäure, von Additionen einer oder zwei Aminosäuren, von Austauschen konservierter Aminosäuren oder von chemischen und/oder enzymatischen Modifikationen an einer oder mehreren bestehenden Aminosäuren, beinhaltend Seitenkettenmodifikationen, Rückgratmodifikationen und N- und C-terminale Modifikationen, definiert ist.
Verfahren zum Hemmen angiogenetischer Faktor-vermittelter Herabregulierung interzellulärer Adhäsionsmolekülexpression in vitro, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen von Zellen mit einer wirksamen Menge einer Zusammensetzung, enthaltend ein Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus jenen, dargestellt durch die SEQ ID NOs: 1 bis 6 und 9 bis 17, wobei X eine Aminosäure ist, wirksamen Analogen davon und Kombinationen davon, umfasst, wobei ein Analog davon durch das Enthalten einer Deletion einer Aminosäure, von Additionen einer oder zwei Aminosäuren, von Austauschen konservierter Aminosäuren oder von chemischen und/oder enzymatischen Modifikationen an einer oder mehreren bestehenden Aminosäuren, beinhaltend Seitenkettenmodifikationen, Rückgratmodifikationen und N- und C-terminale Modifikationen, definiert ist.
Verwendung eines Polypeptids, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus jenen, dargestellt durch die SEQ ID NOs: 1 bis 6 und 9 bis 17, wobei X eine Aminosäure ist, wirksamen Analogen davon und Kombinationen davon, zur Herstellung eines Arzneimittels zum Hemmen von Angiogenese in einem Patienten, wobei ein Analog davon durch das Enthalten einer Deletion einer Aminosäure, von Additionen einer oder zwei Aminosäuren, von Austauschen konservierter Aminosäuren oder von chemischen und/oder enzymatischen Modifikationen an einer oder mehreren bestehenden Aminosäuren, beinhaltend Seitenkettenmodifikationen, Rückgratmodifikationen und N- und C-terminale Modifikationen, definiert ist.
Verfahren zum Inhibieren von Angiogenese in vitro, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen von Zellen mit einer wirksamen Menge einer Zusammensetzung, enthaltend ein Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus jenen, dargestellt durch die SEQ ID NOs: 1 bis 6 und 9 bis 17, wobei X eine Aminosäure ist, wirksamen Analogen davon und Kombinationen davon, umfasst, wobei ein Analog davon durch das Enthalten einer Deletion einer Aminosäure, von Additionen einer oder zwei Aminosäuren, von Austauschen konservierter Aminosäuren oder von chemischen und/oder enzymatischen Modifikationen an einer oder mehreren bestehenden Aminosäuren, beinhaltend Seitenkettenmodifikationen, Rückgratmodifikationen und N- und C-terminale Modifikationen, definiert ist.
Verwendung eines Polypeptids, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus jenen, dargestellt durch die SEQ ID NOs: 1 bis 6 und 9 bis 17, wobei X eine Aminosäure ist, wirksamen Analogen davon und Kombinationen davon, zur Herstellung eines Arzneimittels zum Inhibieren von Tumorgenese in einem Patienten, wobei ein Analog davon durch das Enthalten einer Deletion einer Aminosäure, von Additionen einer oder zwei Aminosäuren, von Austauschen konservierter Aminosäuren oder von chemischen und/oder enzymatischen Modifikationen an einer oder mehreren bestehenden Aminosäuren, beinhaltend Seitenkettenmodifikationen, Rückgratmodifikationen und N- und C-terminale Modifikationen, definiert ist.
Polypeptid wie definiert in einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei die Modifikationen Acetylierung, Hydroxylierung, Methylierung, Amidierung und die Anfügung von Kohlenhydrat- oder Lipidresten oder Co-Faktoren beinhaltet.
Polypeptid gemäß Anspruch 19, wobei das Polypeptid an der C-terminalen Carboxylatgruppe amidiert ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 5 bis 8, 10, 12, 14, 16 oder 18, wobei die Zusammensetzung KLFKRHLKWKII (SEQ ID NO:4) umfasst.
Polypeptid mit einer amphiphatischen α-helikalen oder 3₁₀-helikalen Struktur mit einer primär aus positiv geladenen Aminosäureresten zusammengesetzten Oberfläche und einer gegenüberliegenden, primär aus hydrophoben Aminosäureresten zusammengesetzten Oberfläche, wobei diese eine oberflächenaktive Domäne definieren, wobei die oberflächenaktive Domäne die Aminosäuren K1, K4, K8 und R5 wie dargestellt in 6 umfasst, wobei Aminosäure K1 N-terminal ist, wobei das Polypeptid 12 bis 14 Aminosäurereste hat.
Polypeptid gemäß Anspruch 22, wobei das Polypeptid 12 Aminosäurereste hat.
Polypeptid gemäß Anspruch 22, wobei die oberflächenaktive Domäne die Atome 1 bis 24, 64 bis 109 und 146 bis 167 wie aufgelistet in Tabelle 5 umfasst.
Polypeptid gemäß Anspruch 22 mit den folgenden Strukturkoordinaten:
Polypeptid mit einer amphiphatischen Struktur mit einer Oberfläche, die positiv geladene Aminosäurereste umfasst, und einer gegenüberliegenden Oberfläche, die hydrophobe Aminosäurereste umfasst, wobei diese eine oberflächenaktive Domäne mit der Sequenz KLFKRHLKWKII (SEQ ID NO:4) definieren, wobei das Polypeptid 12 bis 14 Aminosäurereste hat.
Verfahren zum Evaluieren einer Kandidatenverbindung auf strukturelle Ähnlichkeit zu der des Polypeptids KLFKRHLKWKII (SEQ ID NO:4), wobei das Verfahren umfasst: das Bereitstellen einer dreidimensionalen Struktur von KLFKRHLKWKII (SEQ ID NO:4); das Bereitstellen einer dreidimensionalen Struktur einer Kandidatenverbindung; und das Vergleichen der dreidimensionalen Struktur der Kandidatenverbindung mit der dreidimensionalen Struktur von KLFKRHLKWKII (SEQ ID NO:4).
Verfahren gemäß Anspruch 27, wobei das Bereitstellen einer dreidimensionalen Struktur von KLFKRHLKWKII (SEQ ID NO:4) das Bereitstellen der Koordinaten der Atome 1 bis 24, 64 bis 109 und 146 bis 167 wie aufgelistet in Anspruch 25 umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 27, wobei das Bereitstellen einer dreidimensionalen Struktur von KLFKRHLKWKII (SEQ ID NO:4) das Bereitstellen der Strukturkoordinaten wie aufgelistet in Anspruch 25 umfasst.