DE60115978T2

DE60115978T2 - Reagens für Glutamat-Pyruvat-Transaminase-Assay

Info

Publication number: DE60115978T2
Application number: DE60115978T
Authority: DE
Inventors: Yoshiro Koriyama-shi Sato; Chie Koriyama-shi Satokawa; Ryo Koriyama-shi Kojima; Katsuhiro Koriyama-Shi Katayama
Original assignee: Nitto Boseki Co Ltd
Current assignee: Nitto Boseki Co Ltd
Priority date: 2000-03-21
Filing date: 2001-03-12
Publication date: 2006-08-17
Anticipated expiration: 2021-03-13
Also published as: EP1136564A3; EP1136564A2; JP2001258595A; US6645735B2; JP3674450B2; DE60115978D1; EP1136564B1; US20020009763A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Reagenzienkit zur Bestimmung von Glutamin-Pyruvat-Transaminase (im folgenden abgekürzt als GPT) und insbesondere einen verbesserten Reagenzienkit für einen GPT-Assay, welcher stabil über einen langen Zeitraum gelagert werden kann.
Beschreibung des verwandten Standes der Technik
In klinischen Routinetests ist GPT ein wichtiges Element zur Untersuchung als ein empfindliches Testverfahren zur Bestimmung von Zellschäden oder Zytotoxizität in verschiedenen Organen, insbesondere Herz- und Lebererkrankungen, und ist seit langem verwendet worden.
Mit der verbesserten Leistung von analytischen Instrumenten ist für den GPT-Assay ein Verfahren namens UV-Verfahren verbreitet eingesetzt worden. Das UV-Verfahren umfaßt Wirkenlassen von GPT auf L-Alanin und α-Ketoglutarat als Substrat von GPT, Umwandeln des resultierenden Pyruvats mit L-Lactatdehydrogenase (im folgenden abgekürzt als LDH) in Lactat in der Gegenwart von reduziertem Nicotinamidadenindinucleotid (im folgenden abgekürzt als NADH) und Messen der Abnahme von NADH bei einer Wellenlänge von etwa 340 nm.
Das UV-Verfahren wird durch die folgende Gleichung dargestellt. L-Alanin + α-Ketoglutarat → GPT Pyruvat + Glutamat Pyruvat + NADH → LDH Lactat + NAD
Ein Kit zur GPT-Bestimmung in Kombination mit Aspartataminotransferase wird in US 4,235,962 offenbart, welcher drei Reagenzien umfaßt, unter denen das 2-Oxoglutaratsubstrat in lyophilisierter Form zur Verfügung gestellt wird.
Da GPT weit verbreitet bestimmt wird, variieren die Meßwerte in Abhängigkeit vom Durchführenden und somit können Patientendaten wegen fehlender Austauschbarkeit zwischen Meßwerten nicht verglichen werden, ein Problem, das zum Hindernis für eine Diagnose werden kann, beginnt so zu entstehen. Daher sind Assayverfahren, die als empfohlene Assayverfahren bezeichnet werden, in welchen Reagenzienkonzentrationen etc. vorgeschrieben sind, in verschiedenen Ländern vorgeschlagen worden. International hat die Internationale Föderation für Klinische Chemie (IFCC) das IFCC-Verfahren als einen Standard vorgeschlagen, durch Reagierenlassen von GPT auf L-Alanin und α-Ketoglutarat in der Gegenwart von Pyrodixalphosphat (IFCC Wissenschaftliches Komitee: Expertenkommission zu Enzymen, IFCC-Verfahren für Alaninaminotransferase, Clinica Chemica Acta, 105, 147F-1^57F (1980)). Die Japanische Gesellschaft für Klinische Chemie (JSCC) hat darüber hinaus das JSCC-Verfahren zur Bestimmung von GPT ohne die Verwendung von Pyridoxalphosphat veröffentlicht (JSCC: Verfahren zur Bestimmung einer Enzymaktivität in menschlichem Serum – Alaninaminotransferase (1989-08-30), Rinsho Kagaku (Clinical Chemistry), 18(4), 250–262 (1989)).
Das IFCC-Verfahren wird mit dem JSCC-Verfahren verglichen und der Vergleich wird in der unten stehenden Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1
Das im IFCC-Verfahren verwendete Pyridoxalphosphat ist eines der Vitamin B6-Phosphate und gilt als unstabil gegenüber Hitze und Licht. Pyridoxalphosphat ist die wichtigste Verbindung, welche in vivo Schiff-Basen mit ε-Aminogruppen von Lysin in Enzymen (GPT etc.) bildet, welche am Aminosäuremetabolismus teilnimmt und an GPT gekoppelt ist, um als Co-Enzym zu wirken. GPT wirkt als ein Enzym in der an ein Co-Enzym gekoppelten Form, jedoch ist aus irgendeinem Grund das Co-Enzym entfernt. Solche GPT wird auch Apo-GPT genannt. Auf der anderen Seite wird GPT, das an ein Co-Enzym gekoppelt ist, Holo-GPT genannt. Da Apo-GPT durch Hinzufügen von Pyridoxalphosphat zu dem Reagenssystem aktiviert wird, kann Apo-GPT gemeinsam mit Holo-GPT bestimmt werden. Somit können Apo- und Holo-GPTs beide mit dem IFCC-Verfahren und dem JSCC-Verfahren bestimmt werden, jedoch wird in dem letzteren Verfahren hauptsächlich Holo-GPT gemessen, da zu dem Reagenssystem kein Pyridoxalphosphat hinzugefügt wurde.
In den vergangenen Jahren wurden Techniken zur Verwendung von Reagenzien für klinische Tests in einem flüssigen Zustand verbessert, was es möglich macht, über eine lange Zeitdauer stabile flüssige Reagenzien zur Verfügung zu stellen. Im Gegensatz dazu war das flüssige Reagenssystem zur GPT-Analyse in der Gegenwart von Pyridoxalphosphat nicht erfolgreich, da Pyridoxalphosphat unstabil ist. Zur Zeit wird zum Beispiel ein Reagenzienkit verwendet, in welchem Pyridoxalphosphat als eine Tablette zur Verfügung gestellt wird und in einem Reagens vor der Benutzung aufgelöst wird, oder ein lyophilisiertes Reagens. Gemäß der IFCC-Methode ist es vorgeschrieben, eine wäßrige Lösung von Pyridoxalphosphat alle 2 Wochen herzustellen. In gelöstem Zustand hat Pyridoxalphosphat eine der Substanz eigene gelbe Färbung, wird jedoch mit fortschreitender Abnahme der Stabilität farblos. Als solches ist es schwierig, in den bestehenden Verfahren Pyridoxalphosphat zur Verwendung in dem GPT-Analysesystem über eine längere Zeitdauer zu stabilisieren. Die Stabilität von Pyridoxalphosphat wird nur für wenige Tage nach dem Auflösen aufrechterhalten.
Die gegenwärtigen Erfindung haben intensive Studien betrieben, um die voranstehenden Probleme zu lösen und haben als Ergebnis eine Reagenszusammensetzung geeignet für einen GPT-Assay gefunden, welcher ausreichende Lagerstabilität als ein flüssiges Reagens aufweist. Die vorliegende Erfindung basiert auf diesem Ergebnis.
Zusammenfassung der Erfindung
Als Ergebnis intensiver Untersuchungen zu einer für die Verwendung in der GPT-Analyse geeigneten Reagenszusammensetzung haben die gegenwärtigen Erfinder gefunden, daß unter den zu verwendenden Enzymen und Substraten, wenn L-Alanin und Pyridoxalphosphat gemeinsam vorhanden sind, die dem Pyridoxalphosphat eigene gelbe Färbung während der Lagerung verloren wird und gleichzeitig die Meßergebnisse abnehmen. Insbesondere wenn ein Reagenskit im wesentlichen vom Zwei-Reagenstyp ist, kann ein stabiles GPT-Assay-Reagenssystem zur Verfügung gestellt werden in der Form eines Zwei-Reagenzien-Systemkits, in welchem die beiden Substanzen voneinander isoliert sind, d.h. eines der Reagenzien enthält Pyridoxalphosphat jedoch kein L-Alanin oder das andere Reagens enthaltend L-Alanin enthält kein Pyridoxalphosphat.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung einen Kit zur Analyse von Glutamin-Pyruvat-Transaminase (GPT) durch Wirkenlassen von GPT auf L-Alanin und α-Ketoglutarat in der Gegenwart von Pyridoxalphosphat, Umwandeln des resultierenden Pyruvats in Lactat mit L-Lactatdehydrogenase (LDH) in der Gegenwart von reduziertem Nicotinamidadeninnucleotid (NADH) und Messen von GPT basierend auf der Aufnahme von NADH, wobei der GPT-Assaykit

1) vom einem Zwei-Reagenstyp ist, umfassend ein erstes und ein zweites Reagens, worin
2) eines der ersten und zweiten Reagenzien Pyridoxalphosphat, L-Alanin, α-Ketoglutarat, LDH und NADH als wesentliche Bestandteile enthält, und
3) eines der Reagenzien, welches von L-Alanin frei ist, Pyridoxalphosphat enthält, und das andere Reagens, welches frei ist von Pyridoxalphosphat, L-Alanin enthält.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Nachfolgend wird die Erfindung im Detail beschrieben.
Der GPT-Assaykit der Erfindung betrifft einen Assaykit des Zwei-Reagenzientyps, umfassend ein erstes und ein zweites Reagens, in welchem eines der Reagenzien Pyridoxalphosphat aber kein L-Alanin enthält, und ein anderes Reagens L-Alanin aber kein Pyridoxalphosphat enthält.
Der GPT-Assaykit der Erfindung kann in lyophilisierter Form vorliegen, aber selbst in flüssiger Form kann seine Stabilität über eine lange Zeitdauer beibehalten werden, so daß die dem Pyridoxalphosphat innewohnende gelbe Farbe über eine lange Zeit ebenfalls beibehalten werden kann.
Im allgemeinen ist es bevorzugt, als ein erstes Reagens eine Zusammensetzung umfassend Pyridoxalphosphat, LDH und NADH als wesentliche Komponente zuzubereiten und als ein zweites Reagens eine Zusammensetzung enthaltend L-Alanin und α-Ketoglutarat als wesentliche Komponenten, und die beiden Zusammensetzungen in einen Kit zusammenzustellen. LDH und NADH als ein Co-Enzym von LDH, welche in dem ersten Reagens enthalten sind, sind vorteilhaft im Eliminieren von Pyruvat in einer Probe, da Pyruvat einen Meßfehler verursacht.
Das erste Reagens, welches von L-Alanin frei ist und Pyridoxalphosphat enthält, ist ausgelegt, einen pH-Wert im Bereich von vorzugsweise 7 bis 10 zu haben. Es ist ebenso vorteilhaft für das zweite Reagens, einen pH im Bereich zwischen 7 und 8 zu haben, vorzugsweise etwa 7,3, wenn GPT wirkt. Solch ein bevorzugter pH-Bereich für GPT wird zur Verfügung gestellt durch Einstellen des zweiten Reagens und eines Puffers auf einen geeigneten pH bzw. Konzentration, gefolgt von Mischen des so eingestellten zweiten Reagens und Puffer mit dem ersten Reagens. Durch Herstellen der ersten und zweiten Reagenzien mit einem wie oben eingestellten pH-Bereich können die in den ersten bzw. zweiten Zusammensetzungen enthaltenen Komponenten über eine lange Zeitdauer stabil gehalten werden.
Jegliche bekannte Pufferlösung kann als Puffer für das erste Reagens erwendet werden, so lange sein pH innerhalb des oben angegebenen Bereichs eingestellt werden kann. Insbesondere können Tris(hydroxymethyl)aminomethan, verwendet in der ISCC-Methode und der JSCC-Methode, sowie eine Pufferlösung mit einer Pufferfunktion in einem pH-Bereich von 7 bis 10 ohne Einschränkungen in der Erfindung verwendet werden. Der pH des ersten Reagens kann auf einen Bereich von 7 bis 10 durch die Kombination einer Mehrzahl von Pufferlösungen eingestellt werden. Wie oben beschrieben, hat das erste Reagens vorzugsweise einen pH im Bereich von 7 bis 10, noch bevorzugter 8,5 bis 9,0.
Bekannte Pufferlösungen können richtig ausgewählt werden und als Puffer für das zweite Reagens verwendet werden, um den pH für die GPT-Reaktion auf den oben angegebenen Bereich einzustellen. Insbesondere kann Tris(hydroxymethyl)aminomethan wie in dem ersten Reagens verwendet werden. Der pH-Bereich für die Pufferlösung ist nicht besonders limitiert. Vorzugsweise werden der pH und die Konzentration der Pufferlösung eingestellt, um bei Mischung mit dem ersten Reagens einen pH-Bereich zwischen 7 und 8 zu ergeben.
In dem ersten Reagens wird Pyridoxalphosphat im allgemeinen in einer Menge von 0,01 bis 1 mM, vorzugsweise 0,1 bis 0,3 mM, eingeschlossen. NADH wird im allgemeinen in einer Menge von 0,05 bis 5 mM, vorzugsweise 0,1 bis 1 mM verwendet. Die in der Erfindung verwendete Quelle von LDH ist nicht besonders limitiert. LDH wird geeigneterweise mit einer Konzentration von 1.000 U oder mehr eingesetzt.
L-Alanin, das in dem zweiten Reagens verwendet wird, wird im allgemeinen in einer Menge von 10 bis 2.000 mM, vorzugsweise 500 bis 1.500 mM, verwendet. α-Ketoglutarat wird im allgemeinen in einer Menge von 1 bis 200 mM, vorzugsweise 10 bis 50 mM, hinzugefügt.
Die Mengen dieser Reagenzien sind nicht genau und können außerhalb der oben angegebenen Bereiche sein, da sie sich in Abhängigkeit vom Mischungsverhältnis der ersten und zweiten Reagens ändern können.
Das erste und zweite Reagens kann geeigneterweise, falls nötig und erforderlich, andere konventionelle Zusatzstoffe enthalten, z.B. ein chelatierendes Mittel wie EDTA, ein Desinfektionsmittel wie Natriumazid, verschiedene Tenside etc..
Durch Messen von GPT in einer Probe unter Verwendung des so zusammengestellten GPT-Assaykits wird GPT in der Probe durch die Wirkung von Pyridoxalphosphat von Apo-GPT zu Holo-GPT aktiviert. L-Alanin und α-Ketoglutarat als Substrate von GPT werden von in der Probe vorliegendem Holo-GPT umgesetzt, um Glutamat und Pyruvat zu produzieren. Durch die Wirkung von LDH als Kopplungsenzym oxidiert Pyruvat NADH, um Lactat und NAD zu produzieren. Eine abnehmende Menge von NADH, welche durch die oben genannte Reaktion oxidiert wird, wird bezüglich der Absorption bei einer Wellenlänge von etwa 340 nm gemessen, um die GPT-Aktivität zu bestimmen.
Die vorliegende Erfindung wird nachstehend genauer durch Bezug auf die folgenden Beispiele beschrieben, wird jedoch nicht als darauf beschränkt angesehen.
Beispiel 1
Stabilität von Pyridoxalphosphat gegenüber L-Alanin
Die Stabilität von Pyridoxalphosphat gegenüber L-Alanin wurde untersucht.
Pyridoxalphosphat wurde in einer Menge von 0,125 mM zu 36,6 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Puffer (pH 8,70) hinzugefügt, zu welchem LDH, β-NADH und ein Tensid hinzugefügt wurden. L-Alanin wurde zu der Mischung in einer Menge von 200 mM oder 400 mM hinzugefügt, und der pH wurde auf 8,70 mit 4 N NaOH eingestellt, um ein erstes Reagens herzustellen. Als Kontrolle wurde ein L-Alanin freies erstes Reagens in einer ähnlichen Weise hergestellt.
Ein zweites Reagens wurde hergestellt durch Hinzufügen von L-Alanin, α-Ketoglutarat und einem Tensid zu 366 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Puffer (pH 4,00) und Einstellen des pHs der Mischung mit 2 N HCl. Zusammensetzungen der ersten und zweiten Reagenzien werden nachstehend gezeigt.
Zusammensetzung des ersten Reagens
Zusammensetzung des zweiten Reagens
Die GPT-Aktivität wurde bestimmt unter Verwendung eines automatisierten Analysers von Hitachi, Modell 7150 (Hitachi 717) durch Wirkenlassen von 300 μl des ersten Reagens und 75 μl des zweiten Reagens auf 10 μl Serum oder physiologische Kochsalzlösung als Probe, um auf die Hauptwellenlänge von 340 nm und eine sekundäre Wellenlänge von 405 nm einzustellen, und Nachverfolgen der Veränderung in Absorption zwischen 30–50 Datenpunkten (welche 1–5 Minuten nach Hinzufügen von R2 entsprechen). Die GPT-Aktivität in der Probe wurde gemäß der folgenden Gleichung berechnet: GPT-Aktivität (IU/l) = (ΔE/min)/ε × (V/v) × 106

ΔE/min:: Veränderung in Absorption pro Minute
ε:: molarer Extinktionskoeffizient (6,22 × 10³ l/mol·cm in NADH)
V:: Gesamtvolumen (Probe + erstes Reagens + zweites Reagens)
v:: Volumen der Probe

Die Stabilität von Pyridoxalphosphat wurde bestimmt durch Berechnen einer Veränderung der Meßergebnisse, wenn die Meßwerte des Kontrollserums als 100% an dem Tag gesetzt wurden, an dem es zubereitet wurde, und das erste Reagens bei 4°C und 37°C gelagert wurde. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt. Die Stabilität wurde auch in Bezug auf die Änderung der Farbe von Pyridoxalphosphat beurteilt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 2 Veränderung der Meßergebnisse von Kontrollserum während der Lagerung bei 37°C
Tabelle 2 zeigt die Meßwerte von Kontrollserum in Bezug auf die relative Aktivität im Vergleich zu der Aktivität, die am Tag, an dem die Serumprobe zubereitet wurde, gemessen wurde. Wie in Tabelle 2 gezeigt, nahmen die Meßwerte während der Lagerung bei 37°C mit jedem Meßtag ab, wenn L-Alanin zu dem ersten Reagens, in welchem L-Alanin gemeinsam mit Pyridoxalphosphat vorlag, hinzugefügt wurde, was darauf hinweist, daß die Stabilität des Reagens verlorenging. In dem Reagens ohne Hinzufügung von L-Alanin veränderten sich die Meßdaten kaum, selbst wenn das Reagens bei 37°C gelagert wurde, was darauf hinweist, daß das Reagens seine Stabilität beibehielt.
Tabelle 3 Veränderung der Farbe des ersten Reagens während der Lagerung bei 37°C
In der obigen Tabelle bezeichnen die Symbole "++", "+" und "–" gelb, hellgelb und farblos. Tabelle 3 zeigt auch, daß wenn L-Alanin in dem Reagens vorhanden war, die Farbe unabhängig von der Konzentration zu einem farblosen Zustand verloren wurde, was zu der Vermutung führt, daß sich Pyridoxalphosphat verändert. Im Gegensatz dazu wurde in dem Reagens, das frei war von L-Alanin, die ursprüngliche Farbe beibehalten. Das heißt, diese Ergebnisse zeigen klar, daß die Stabilität von Pyridoxalphosphat in der Gegenwart von L-Alanin verlorengeht und das L-Alanin freie Reagens, welches Pyridoxalphosphat enthält, in Bezug auf Stabilität hervorragend ist.
Beispiel 2
Stabilität von Pyridoxalphosphat gegenüber pH
Die Veränderung der Stabilität von Pyridoxalphosphat gegenüber pH wurde untersucht.
Nachdem 0,205 mM Pyridoxalphosphat zu 100 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Puffer hinzugefügt worden war, wurden LDH, β-NADH, Natriumchlorid und ein Tensid zu der Mischung weiter hinzugefügt, gefolgt vom Einstellen des pHs des Reagens mit 4 N NaOH und 2 N HCl in dem Bereich von 7 bis 10, wodurch das erste Reagens hergestellt wurde. Ein zweites Reagens wurde hergestellt durch Hinzufügen von L-Alanin und α-Ketoglutarat zu 105 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Puffer (pH 4,20) und Einstellen des pHs mit 2 N HCl. Das erste und zweite Reagens hatten die folgenden Zusammensetzungen:
Zusammensetzung des ersten Reagens
Zusammensetzung des zweiten Reagens
Die GPT-Aktivität wurde bestimmt unter Verwendung eines automatisierten Analysers von Hitachi, Modell 7150, durch Wirkenlassen von 200 μl des ersten Reagens und 200 μl des zweiten Reagens auf 10 μl Serum oder physiologischer Kochsalzlösung als Probe, in welchem die Hauptwellenlänge auf 340 nm eingestellt war und die sekundäre Wellenlänge auf 405 nm, und Nachverfolgen der Veränderung der Absorption zwischen 30–50 Datenpunkten (welche 1–5 Minuten nach Hinzufügen von R2 entsprechen). Die GPT-Aktivität wurde wie in Beispiel 1 berechnet.
Die Stabilität von Pyridoxalphosphat wurde wie in Beispiel 1 bei Lagerung des ersten Reagens bei 37°C bestimmt durch berechnen der Veränderung der Meßwerte, wenn die Meßwerte des Kontrollserums am Tag seiner Zubereitung auf 100% gesetzt wurden. Die Ergebnisse werden in Tabelle 4 gezeigt. Die Stabilität wurde auch untersucht in Bezug auf Veränderung der Färbung von Pyridoxalphosphat. Die Ergebnisse werden in Tabelle 5 gezeigt.
Tabelle 4 Veränderung der Meßwerte eines Kontrollserums während der Lagerung bei 37°C
Tabelle 4 zeigt die Meßergebnisse von Kontrollserum in Bezug auf relative Aktivität im Vergleich zu der Aktivität gemessen am Tag, an dem die Serumprobe hergestellt wurde. Wie in Tabelle 4 gezeigt, veränderte sich der Meßwert des Kontrollserums nicht wahrnehmbar in einem pH von 7 bis 10, insbesondere 7 bis 9, was zeigt, daß das Reagens stabil war.
Tabelle 5 Veränderung der Farbe des ersten Reagens während der Lagerung bei 37°C
In der obigen Tabelle zeigen die Symbole "++", "+" und "–" gelb, hellgelb und farblos. Es ist aus Tabelle 5 ersichtlich, daß das erste Reagens die Farbe in einem pH zwischen 7 und 10, insbesondere zwischen 7 und 9 beibehält, was zeigt, daß die Stabilität von Pyridoxalphosphat insbesondere in dem pH-Bereich von 7 bis 9 beibehalten wurde.
Wie in den obigen Beispielen gezeigt, kann die Reagenszusammensetzung der Erfindung in einem flüssigen Zustand zur Verfügung gestellt werden, wenn sie in einem automatisierten Analyser angewandt wird, begleitet von einer deutlich verbesserten Handhabbarkeit und Stabilität. Das heißt, gemäß der vorliegenden Erfindung kann nicht nur die Stabilität von Pyridoxalphosphat in einer flüssigen Form beibehalten werden, was im Stand der Technik nicht erreicht werden konnte, sondern es kann eine für eine lange Zeitdauer verwendbare Zusammensetzung zur Verfügung gestellt werden.

Claims

Kit zur Bestimmung von Glutamin-Pyruvat-Transaminase (GPT) durch Reagieren von GPT mit L-Alanin und α-Ketoglutarat in der Gegenwart von Pyridoxalphosphat, Umwandeln des resultierenden Pyruvats in Lactat mit L-Lactatdehydrogenase (LDH) in der Gegenwart von reduziertem Nicotinamidadenindinucleotid (NADH) und Messen von GPT basierend auf der Abnahme von NADH, wobei der Kit zur Bestimmung von GPT: 1) vom Zwei-Reagenstyp ist, umfassend ein erstes und ein zweites Reagens, worin: 2) eines der ersten und zweiten Reagenzien Pyridoxalphosphat, L-Alanin, α-Ketoglutarat, LDH und NADH als wesentliche Bestandteile enthält, und 3) eines der Reagenzien, welches kein L-Alanin enthält, Pyridoxalphosphat enthält, und das andere Reagens, welches kein Pyridoxalphosphat enthält, L-Alanin enthält, worin das erste und zweite Reagens beide in flüssiger Form sind.
Kit zur Bestimmung von GPT gemäß Anspruch 1, worin eines der Reagenzien Pyridoxalphosphat, LDH und NADH als die wesentlichen Komponenten enthält und das andere Reagens L-Alanin und α-Ketoglutarat als die wesentlichen Komponenten enthält.
Kit zur Bestimmung von GPT gemäß Anspruch 1 oder 2, worin das erste Reagens Pyridoxalphosphat, LDH und NADH als die wesentlichen Komponenten enthält und einen pH im Bereich von 7 bis 10 hat, und das zweite Reagens L-Alanin und α-Ketoglutarat als die wesentlichen Komponenten enthält.
Verwendung eines ersten Reagens, welches kein Pyridoxalphosphat enthält und L-Alanin enthält, und ein zweites Reagens, welches kein L-Alanin enthält und Pyridoxalphosphat enthält, zur Herstellung eines Kits zur Bestimmung von Glutamin-Pyruvat-Transaminase, worin besagter Kit besagtes erstes und zweites Reagens als Flüssigkeiten enthält.