DE60115900T2

DE60115900T2 - Nukleotidsequenzen kodierend für das mdha gen aus corynebakterium glutamicum

Info

Publication number: DE60115900T2
Application number: DE60115900T
Authority: DE
Inventors: Douwe Molenaar; Eduard Michel VAN DER REST; Andre Drysch
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2000-07-04
Filing date: 2001-06-20
Publication date: 2006-08-03
Anticipated expiration: 2021-06-21
Also published as: KR20030013521A; DE10032350A1; WO2002002778A8; DE60115900D1; KR100904744B1; EP1297148B1; AU2001279674A1; US20020037568A1; EP1297148A1; ATE312929T1; US20040142454A1; CN1440458A; ES2254459T3; US7067288B2; WO2002002778A1; US6995002B2

Description

Die Erfindung stellt Nucleotidsequenzen aus coryneformen Bakterien, die das mdhA-Gen codieren, und ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, durch Abschwächung des mdhA-Gens bereit.
Stand der Technik
L-Aminosäuren, insbesondere Lysin, werden in der Humanmedizin und in der Pharmazeutika-Industrie, in der Nahrungsmittelindustrie und ganz besonders bei der Tierernährung verwendet.
Bekanntlich werden Aminosäuren durch Fermentierung aus Stämmen von coryneformen Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum, hergestellt. Aufgrund ihrer großen Bedeutung werden ständig Arbeiten unternommen, um die Herstellungsverfahren zu verbessern. Verbesserungen des Verfahrens können Fermentationsmaßnahmen, wie zum Beispiel Rühren und Sauerstoffversorgung, oder die Zusammensetzung der Nährmedien, wie beispielsweise die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung in die Produktform, beispielsweise durch Ionenaustauschchromatographie, oder die intrinsischen Abgabeeigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.
Mutagenese-, Selektions- und Mutantenselektionsverfahren werden dazu verwendet, die Abgabeeigenschaften dieser Mikroorganismen zu verbessern. Auf diese Weise werden Stämme erhalten, die gegenüber Antimetaboliten resistent oder für Metaboliten von regulatorischer Bedeutung auxotroph sind und die Aminosäuren produzieren.
Verfahren der DNA-Rekombinationstechnik werden ebenfalls seit einigen Jahren zur Verbesserung des Stammes der Corynebacterium-Stämme, die L-Aminosäuren produzieren, eingesetzt.
Eikmans et al., "Molecular Aspects of Lysine, Theronine and Isoleucine Biosynthesis in Corynebacterium glutamicum", beschreibt coryneforme Bakterien, die rekombinante Plasmide enthalten, die ein Enzym von coryneformen Bakterien exprimieren, zur verstärkten Produktion von Aminosäuren, wie Lysin.
Aufgabe der Erfindung
Somit war die Aufgabe der Erfinder, neue Maßnahmen für die verbesserte fermentative Herstellung von Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, bereitzustellen.
Beschreibung der Erfindung
L-Aminosäuren, insbesondere Lysin, werden in der Humanmedizin und in der Pharmazeutika-Industrie, in der Nahrungsmittelindustrie und ganz besonders bei der Tierernährung verwendet. Es ist deshalb von allgemeinem Interesse, neue verbesserte Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, bereitzustellen.
Die vorliegende Erfindung stellt ein isoliertes coryneformes Bakterium bereit, bei dem die Expression des mdhA-Gens, das aus einem Polynucleotid besteht, das ein Polypeptid mit Malatdehydrogenase-Aktivität und mit einer Aminosäuresequenz, die zu mindestens 90% identisch zu der in SEQ. ID. NR. 3 dargestellten Aminosäuresequenz ist, codiert, eliminiert worden ist.
Die Erfindung beschreibt ferner ein isoliertes Polypeptid mit Malatdehydrogenase-Aktivität, das die Aminosäuresequenz gemäß SEQ. ID. NR. 1 umfasst.
Die Erfindung beschreibt ferner:
eine DNA, die zur Replikation befähigt ist und die Nucleotidsequenz, wie in SEQ. ID. NR. 2 gezeigt, umfasst,
einen Vektor, der das Polynucleotid, wie in Anspruch 1, Punkt d, beansprucht, und insbesondere pEMmdhAint, hinterlegt in E. coli DSM 13494 am 18.05.2000 bei der DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen), Braunschweig (Deutschland), umfasst,
und coryneforme Bakterien, die eine Deletion oder Insertion in das mdhA-Gen, insbesondere unter Verwendung des Vektors pEMmdhAint, enthalten.
Die Erfindung beschreibt auch Polynucleotide, die im Wesentlichen eine Polynucleotidsequenz umfassen, die durch Screening einer entsprechenden Genbibliothek, die das vollständige mdhA-Gen mit der Polynucleotidsequenz entsprechend SEQ. ID. NR. 2 umfasst, mithilfe von Hybridisierung mit einer Sonde, welche die Sequenz des erwähnten Polynucleotids gemäß SEQ. ID. NR. 2 oder ein Fragment davon umfasst, und Isolierung der erwähnten DNA-Sequenz erhältlich sind.
Polynucleotide, die von der Erfindung beschriebene Sequenzen enthalten, eignen sich als Hybridisierungssonden für RNA, cDNA und DNA, um Nucleinsäuren oder Polynucleotide oder Gene, die Malatdehydrogenase codieren, in voller Länge zu isolieren oder solche Nucleinsäuren oder Polynucleotide oder Gene zu isolieren, die eine große Sequenzähnlichkeit mit dem Malatdehydrogenase-Gen besitzen.
Polynucleotide, die von der Erfindung beschriebene Sequenzen enthalten, eignen sich ferner als Primer, mit deren Hilfe DNA von Genen, die Malatdehydrogenase codieren, mit der Polymerasekettenreaktion (PCR) hergestellt werden kann.
Solche Oligonucleotide, die als Sonden oder Primer dienen, umfassen mindestens 30, vorzugsweise mindestens 20, ganz besonders bevorzugt mindestens 15 aufeinander folgende Nucleotide. Oligonucleotide mit einer Länge von mindestens 40 oder 50 Nucleotiden sind ebenfalls geeignet.
"Isoliert" bedeutet aus seiner natürlichen Umgebung abgetrennt.
"Polynucleotid" betrifft im allgemeinen Polyribonucleotide und Polydesoxyribonucleotide, wobei diese nichtmodifizierte RNA oder DNA oder modifizierte RNA oder DNA sein können.
Unter "Polypeptiden" werden Peptide oder Proteine verstanden, die zwei oder mehrere Aminosäuren umfassen, die über Peptidbindungen gebunden sind.
Die von der Erfindung beschriebenen Polypeptide umfassen die Polypeptide gemäß SEQ ID Nr. 3, insbesondere solche mit der biologischen Aktivität der Malatdehydrogenase, und ferner solche, die zu mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 80% und insbesondere zu mindestens 90% bis 95% identisch zu dem Polypeptid gemäß SEQ ID Nr. 3 sind und die erwähnte Aktivität aufweisen.
Die Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Lysin unter Verwendung coryneformer Bakterien bereit, die insbesondere bereits die Aminosäuren produzieren und in denen die Nucleotidsequenzen, die das mdhA-Gen codieren, eliminiert worden sind.
Der Begriff "Eliminierung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Eliminierung der intrazellulären Aktivität von einem oder mehreren Enzymen (Proteinen) in einem Mikroorganismus, die von der entsprechenden DNA codiert werden, beispielsweise unter Verwendung eines schwachen Promoters oder unter Verwendung eines Gens oder Allels, das ein entsprechendes Enzym mit niedriger Aktivität codiert oder das entsprechende Gen oder Enzym (Protein) inaktiviert und gegebenenfalls die Kombination dieser Maßnahmen.
Die Mikroorganismen, welche die vorliegende Erfindung bereitstellt, können Aminosäuren, insbesondere Lysin, aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melassen, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Sie können Mitglieder der coryneformen Bakterien, insbesondere der Gattung Corynebacterium, sein. Aus der Gattung Corynebacterium kann insbesondere die Art Corynebacterium glutamicum genannt werden, die unter Fachleuten für ihre Fähigkeit, L-Aminosäuren zu produzieren, bekannt ist.
Geeignete Stämme der Gattung Corynebacterium, insbesondere der Art Corynebacterium glutamicum, sind insbesondere die bekannten Wildtyp-Stämme
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870
Corynebacterium melassecola ATCC 17965
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC 14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC 14020
sowie L-Aminosäuren produzierende Mutanten oder Stämme, die daraus hergestellt wurden, wie beispielsweise die L-Lysin produzierenden Stämme
Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709
Brevibacterium flavum FERM-P 1708
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464
Corynebacterium glutamicum DM58-1
Corynebacterium glutamicum DG52-5
Corynebacterium glutamicum DSM5714 und
Corynebacterium glutamicum DSM12866.
Das neue mdhA-Gen von C. glutamicum, das das Enzym Malatdehydrogenase (EC 1.1.1.37) codiert, wurde gefunden.
Dazu wird das Malatdehydrogenase-Enzymprotein zunächst durch chromatographische Verfahren bis zur Homogenität gereinigt. Verfahren und Anweisungen für die Proteinreinigung und -präparation sind z.B. in dem Lehrbuch von Schleifer und Wensink: Practical Methods in Molecular Biology (Springer Verlag, Berlin, Deutschland, 1981); in dem Handbuch von Harris und Angal: Protein Purification Methods: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1989); in dem Lehrbuch von Scopes: Protein Purification: Principles and Practice, 3. Ausgabe (Springer Verlag, New York, USA, 1993) und in allgemein bekannten Lehrbüchern und Handbüchern beschrieben. Das reine Enzymprotein kann dann durch Behandlung mit geeigneten Enzymen, wie beispielsweise Trypsin oder Chymotrypsin, in Peptide zerlegt werden. Die Aminosäuresequenz dieser Peptide kann durch das von Edman (Archives of Biochemistry 22, 475 (1949)) beschriebene Verfahren der N-terminalen Sequenzierung bestimmt werden. Es ist ebenfalls möglich, die N-terminalen Aminosäuren des gereinigten Enzymproteins direkt zu bestimmen. Verfahren und Anweisungen für die Proteinsequenzierung sind zum Beispiel in Smith: Protein Sequencing Protocols: Methods in Molecular Biology, Bd. 64 und Bd. 112 (Humana Press, Totowa, NJ, USA, 1996) und in Kamp et al.: Protein Structure Analysis: Preparation, Characterization, and Microsequencing (Springer Verlag, New York, NY, USA, 1997) beschrieben. Auf diese Weise kann die Aminosäuresequenz des Malatdehydrogenase-Enzymproteins teilweise oder vollständig, jede nach der Ausrichtung, bestimmt werden. Die 20 N-terminalen Aminosäuren des isolierten Malatdehydrogenase-Enzymproteins sind in SEQ ID Nr. 1 dargestellt.
Unter Verwendung der bekannten Codon-Verwendung für coryneforme Bakterien (Malumbres et al. (Gene 134, 15–24 (1993)) können synthetische Oligonucleotide synthetisiert und als Primer für die Amplifizierung der entsprechenden chromosomalen DNA-Abschnitte mithilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR) eingesetzt werden. Anleitungen dafür können vom Fachmann u.a. in dem Handbuch von Gait: Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) und in Newton und Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994) gefunden werden. Das auf diese Weise erhaltene DNA-Fragment des sod-Gens wird dann durch bekannte Verfahren kloniert, wie z.B. in Sambrook et al.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2. Aufl. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, 1989) beschrieben, und kann als Sonde für die Suche nach dem vollständigen Gen, einschließlich seiner 5'- und 3'-Flanken, in Genbibliotheken eingesetzt werden.
Es ist ebenfalls möglich, das vollständige Gen, einschließlich seiner 5'- und 3'-Flanken, durch das Verfahren der "Plasmid-Rettung" zu isolieren. Bei diesem Verfahren wird ein Fragment des Gens von Interesse, das beispielsweise auf die vorstehend beschriebene Weise erhalten wurde, in einen Plasmidvektor kloniert, der für coryneforme Bakterien nicht replikationsfähig ist. Der Plasmidvektor, der das Genfragment enthält, wird in das Zielgen des Wirts durch Transformation und anschließende homologe Rekombination eingebracht oder integriert. Das Zielgen wird dabei markiert. Die chromosomale DNA des auf diese Weise markierten Stammes wird dann isoliert und mit einem geeigneten Restriktionsenzym gespalten. Geeignete Restriktionsenzyme sind insbesondere solche, die nicht innerhalb der eingesetzten Vektor-DNA spalten. Die erhaltenen DNA-Fragmente werden durch Behandlung mit Ligase zirkularisiert, und ein für die Replikation des Plasmidvektors geeigneter Wirt, üblicherweise Escherichia coli, wird mit dem Ligationsgemisch transformiert. Plasmid-DNA wird aus den Transformanten isoliert, und die klonierten DNA-Abschnitte werden sequenziert. Das Verfahren der "Plasmid-Rettung" wird zum Beispiel von Niaudet et al. (Gene 19, 277–284 (1982)) beschrieben. Verfahren zur DNA-Sequenzierung sind u.a. von Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74: 5463–5467, 1977) oder in dem Protokoll von Zimmerman et al. (BioTechniques 17: 302 (1994)) beschrieben.
Die erhaltenen DNA-Sequenzen können dann mit bekannten Algorithmen oder Sequenzanalyseprogrammen untersucht werden, wie z.B. dem von Staden (Nucleic Acids Research 14, 217–232 (1986)), dem von Marck (Nucleic Acids Research 16, 1829–1836 (1988)) oder dem GCG-Programm von Butler (Methods of Biochemical Analysis 39, 74–97 (1998)).
Die neue DNA-Sequenz aus C. glutamicum, die das mdhA-Gen codiert und, wie SEQ ID Nr. 2, ein Bestandteil der vorliegenden Erfindung ist, wurde auf diese Weise gefunden. Die Aminosäuresequenz des entsprechenden Translationsproduktes oder Genproduktes wurde zudem von der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz durch die vorstehend beschriebenen Verfahren abgeleitet. Die erhaltene Aminosäuresequenz des mdhA-Genproduktes ist in SEQ ID Nr. 3 gezeigt. Es ist bekannt (O'Regan et al., Gene 77, 237–251 (1989)), dass die Aminosäure Methionin oder Formyl-Methionin, die vom Start-Codon ATG codiert wird, aus verschiedenen Proteinen durch Enzyme des Wirtes entfernt wird.
Codierende DNA-Sequenzen, die sich aus SEQ ID Nr. 2 durch die Degeneration des genetischen Codes ergeben, sind ebenfalls Bestandteil der Erfindung. Auf die gleiche Weise sind DNA-Sequenzen, die mit SEQ ID Nr. 2 hybridisieren, oder Teile von SEQ ID Nr. 2 ein Bestandteil der Erfindung. Schließlich sind DNA-Sequenzen, die durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung von Primern, die sich aus SEQ ID Nr. 2 ergeben, Bestandteil der Erfindung.
Anleitungen für die Identifikation von DNA-Sequenzen mithilfe von Hybridisierung können vom Fachmann u.a. in dem Handbuch "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" von Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993) und in Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology (1991) 41: 255–260) gefunden werden. Anleitungen für die Amplifikation von DNA-Sequenzen mithilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR) können vom Fachmann u.a. in dem Handbuch von Gait: Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) und in Newton und Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994) gefunden werden.
Es wurde gefunden, dass coryneforme Bakterien Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, nach Eliminierung des mdhA-Gens auf verbesserte Weise produzieren.
Zur Erzielung einer Eliminierung können entweder die Expression des mdhA-Gens oder die katalytischen Eigenschaften der Enzymproteine verringert oder beseitigt werden. Die beiden Maßnahmen können gegebenenfalls kombiniert werden.
Die Verringerung der Genexpression kann durch geeignete Züchtung oder durch genetische Modifikation (Mutation) der Signalstrukturen der Genexpression erfolgen. Signalstrukturen der Genexpression sind zum Beispiel Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren, Attenuatoren, Ribosomenbindungsstellen, das Start-Codon und Terminatoren. Der Fachmann kann Informationen darüber z.B. in der Patentanmeldung WO 96/15246, in Boyd und Murphy (Journal of Bacteriology 170: 5949 (1988)), in Voskuil und Chambliss (Nucleic Acids Research 26: 3548 (1998), in Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191 (1998)), in Patek et al. (Microbiology 142: 1297 (1996)), Vasicova et al. (Journal of Bacteriology 181: 6188 (1999)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie, wie z.B. dem Lehrbuch von Knippers ("Molekulare Genetik [Molecular Genetics]", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995) oder dem von Winnacker ("Gene und Klone [Genes and Clones]", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) finden.
Mutationen, die zu einer Veränderung oder Verringerung der katalytischen Eigenschaften von Enzymproteinen führen, sind aus dem Stand der Technik bekannt; Beispiele, die erwähnt werden können, sind die Arbeiten von Qiu und Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611–8617 (1997)), Sugimoto et al. (Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61: 1760–1762 (1997)) und Möckel ("Die Threonindehydratase aus Corynebacterium glutamicum: Aufhebung der allosterischen Regulation und Struktur des Enzyms [Threonine dehydratase from Corynebacterium glutamicum: Cancelling the allosteric regulation and structure of the enzyme]", Berichte aus dem Forschungszentrum Jülich, Jü1-2906, ISSN09442952, Jülich, Deutschland, 1994). Umfassende Beschreibungen lassen sich bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie entnehmen, wie z.B. dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik [General Genetics]", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986).
Mögliche Mutationen sind Transitionen, Transversionen, Insertionen und Deletionen. Je nach der Wirkung des Aminosäureaustausches auf die Enzymaktivität spricht man von Missense-Mutationen oder Nonsense-Mutationen. Insertionen oder Deletionen von mindestens einem Basenpaar in einem Gen für zu Rasterverschiebungsmutationen, als deren Konsequenz falsche Aminosäuren eingebaut werden oder die Translation vorzeitig unterbrochen wird. Deletionen mehrerer Codons führen in der Regel zu einem völligen Verlust der Enzymaktivität. Anleitungen für die Herstellung solcher Mutationen sind Stand der Technik und können in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie gefunden werden, wie z.B. dem Lehrbuch von Knippers ("Molekulare Genetik [Molecular Genetics]", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995), dem von Winnacker ("Gene und Klone [Genes and Clones]", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) oder dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik [General Genetics]", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986).
Ein übliches Verfahren zur Mutation von Genen von C. glutamicum ist das von Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84–87 (1991)) beschriebene Gendisruptions- und Genaustauschverfahren.
Beim Gendisruptionsverfahren wird ein zentraler Abschnitt der codierenden Region des Gens von Interesse in einen Plasmidvektor kloniert, der sich in einem Wirt (üblicherweise E. coli), aber nicht in C. glutamicum replizieren kann. Mögliche Vektoren sind zum Beispiel pSUP301 (Simon et al., Bio/Technology 1, 784–791 (1983)), pK18mob oder pK19mob (Schäfer et al., Gene 145, 69–73 (1994)), pK18mobsacB oder pK19mobsacB (Jäger et al., Journal of Bacteriology 174: 5462–65 (1992)), pGEM-T (Promega Corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994), Journal of Biological Chemistry 269: 32678–84; U.S.-Patent 5,487,993), pCR^®Blunt (Invitrogen, Groningen, Holland; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534–541 (1993)) oder pEM1 (Schrumpf et al., 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510–4516). Der Plasmidvektor, der den zentralen Abschnitt der codierenden Region des Gens enthält, wird dann durch Konjugation oder Transformation in den gewünschten Stamm von C. glutamicum übertragen. Das Verfahren der Konjugation ist beispielsweise von Schäfer et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 756–759 (1994)) beschrieben. Verfahren zur Transformation sind beispielsweise von Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356–362 (1988)), Dunican und Shivnan (Bio/Technology 7, 1067–1070 (1989)) und Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343–347 (1994)) beschrieben. Nach homologer Rekombination mithilfe eines so genannten "Cross-over"-Ereignisses ist die codierende Region des fraglichen Gens durch die Vektorsequenz unterbrochen, und zwei unvollständige Allele werden erhalten, wobei bei einem das 3'-Ende und bei einem das 5'-Ende fehlt. Dieses Verfahren wurde zum Beispiel von Fitzpatrick et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 42, 575–580 (1994)) zur Eliminierung des recA-Gens von C. glutamicum verwendet.
1 zeigt als Beispiel den Plasmidvektor pEMmdhAint, mit dessen Hilfe das mdhA-Gen unterbrochen oder eliminiert werden kann.
Beim Genaustauschverfahren wird eine Mutation, wie z.B. eine Deletion, eine Insertion oder ein Basenaustausch, in dem Gen von Interesse in vitro hergestellt. Das hergestellte Allel wird seinerseits in einen Vektor kloniert, der für C. glutamicum nicht replikationsfähig ist, und dies wird dann durch Transformation oder Konjugation in den gewünschten Wirt von C. glutamicum übertragen. Nach homologer Rekombination mithilfe eines ersten "Cross-over"-Ereignisses, welches die Integration bewirkt, und eines geeigneten zweiten "Cross-over"-Ereignisses, welches das Ausschneiden in dem Zielgen oder in der Zielsequenz bewirkt, wird der Einbau der Mutation oder des Allels erreicht. Dieses Verfahren wurde zum Beispiel von Peters-Wendisch (Microbiology 144, 915–927 (1998)) zur Eliminierung des pyc-Gens von C. glutamicum durch eine Deletion verwendet.
Eine Deletion, eine Insertion oder ein Basenaustausch können auf diese Weise in das mdhA-Gen eingebracht werden.
Für die Produktion von L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, kann es weiterhin vorteilhaft sein, ein oder mehrere Enzyme des bestimmten Biosyntheseweges, der Glycolyse, der Anaplerose, des Pentosephosphat-Zyklus oder des Aminosäure-Exports, zusätzlich zur Eliminierung des mdhA-Gens zu verstärken, insbesondere überzuexprimieren.
So können beispielsweise zur Herstellung von L-Lysin gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus

• dem dapA-Gen, das Dihydrodipicolinatsynthase codiert (EP-B 0 197 335),
• dem eno-Gen, das Enolase codiert (EP-A-1090998),
• dem zwf-Gen, welches das zwf-Genprodukt codiert (JP-A-09224661),
• dem pyc-Gen, das Pyruvatcarboxylase codiert (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076–6086),
• dem lysE-Gen, das den Lysin-Export codiert (DE-A-195 48 222)

Für die Produktion von Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, kann es ferner vorteilhaft sein, zusätzlich zur Eliminierung des mdhA-Gens gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus

• dem pck-Gen, das Phosphoenolpyruvatcarboxykinase codiert (EP-A-1094111, DSM 13047),
• dem pgi-Gen, das Glucose-6-phosphatisomerase codiert (US-B-6,586,214, DSM 12969),
• dem poxB-Gen, das Pyruvatoxidase codiert ( EP 1096013 , DSM 13114) zu eliminieren.

Neben der Abschwächung des mdhA-Gens kann es zudem für die Produktion von Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, vorteilhaft sein, ungewünschte Nebenreaktionen zu eliminieren (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Micro-Organisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (Hrsg.), Academic Press, London, UK, 1982).
Die Erfindung stellt auch die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen bereit, und diese können kontinuierlich oder diskontinuierlich in dem Batch-Verfahren (Batch-Kultur) oder im Fed-Batch (Zufuhr-Verfahren) oder wiederholten Fed-Batch-Verfahren (wiederholtes Zufuhr-Verfahren) zum Zwecke der Produktion von L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, verwendet werden. Eine Zusammenfassung bekannter Kulturverfahren ist in dem Fachbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik [Bioprocess Technology 1. Introduction to Bioprocess Technology (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder in dem Fachbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen [Bioreactors and Peripheral Equipment](Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
Das zu verwendende Kulturmedium muss die Anforderungen der jeweiligen Stämme auf geeignete Weise erfüllen. Die Kulturmedien für verschiedene Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) beschrieben. Zucker und Kohlenhydrate, wie beispielsweise Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melassen, Stärke und Cellulose, Öle und Fette, wie beispielsweise Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren, wie beispielsweise Palmitinsäure, Stearinsäure und Linoleinsäure, Alkohole, wie beispielsweise Glycerin und Ethanol, und organische Säuren, wie beispielsweise Essigsäure, können als Quelle für Kohlenstoff verwendet werden. Diese Substanz kann einzeln oder als Gemisch verwendet werden. Organische stickstoffhaltige Verbindungen, wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Mais-Einweichwasser, Sojamehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat können als Quelle für Stickstoff verwendet werden. Die Quellen für Stickstoff können einzeln oder als Gemisch verwenden werden. Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden natriumhaltigen Salze können als Quellen für Phosphor verwendet werden. Das Kulturmedium muss zudem Salze von Metallen umfassen, wie beispielsweise Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wachstumssubstanzen, wie Aminosäuren und Vitamine neben den vorstehend genannten Substanzen eingesetzt werden. Geeignete Vorstufen können darüber hinaus zu dem Kulturmedium gegeben werden. Die erwähnten Ausgangssubstanzen können zu der Kultur in der Form eines einzelnen Ansatzes gegeben werden, oder können während der Anzucht auf geeignete Weise eingespeist werden.
Basische Verbindungen, wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak oder wässriges Ammoniak, oder saure Verbindungen, wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure, können auf geeignete Weise zur Steuerung des pH-Wertes verwendet werden. Antischaummittel, wie beispielsweise Fettsäurepolyglycolester, können zur Steuerung der Entwicklung von Schaum verwendet werden. Geeignete Substanzen mit einer selektiven Wirkung, wie beispielsweise Antibiotika, können zu dem Medium hinzugegeben werden, damit die Stabilität der Plasmide aufrechterhalten wird. Zur Aufrechterhaltung aerober Bedingungen werden Sauerstoff, oder sauerstoffhaltige Gasgemische, wie beispielsweise Luft, in die Kultur eingeleitet. Die Temperatur der Kultur wird gewöhnlich bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C gehalten. Die Anzucht erfolgt so lange, bis sich eine Höchstmenge an gewünschtem Produkt gebildet hat. Dieses Ziel wird gewöhnlich innerhalb von 10 bis 160 Std. erreicht.
Verfahren zur Bestimmung von L-Aminosäuren sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die Analyse kann somit, wie beispielsweise von Spackman et al. (Analytical Chemistry 30, (1958), 1190) beschrieben, durch Anionenaustauschchromatographie mit anschließender Ninhydrin-Derivatisierung durchgeführt werden oder sie kann, wie von Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167–1174) beschrieben, durch Umkehrphasen-HPLC durchgeführt werden.
Der folgende Mikroorganismus wurde an der Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ = Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Deutschland) gemäß dem Budapester Vertrag am 18.05. 2000 hinterlegt:

• Escherichia coli DH5αmcr/pEMmdhAint als DSM13494

Das erfindungsgemäße Verfahren wird zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, verwendet.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Ausführungsbeispiele eingehender erläutert.
Die Isolation von Plasmid-DNA aus Escherichia coli und sämtliche Techniken der Restriktions-, Klenow- und alkalische Phosphatase-Behandlung wurden durch das Verfahren von Sambrook et al. (Molecular cloning. A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA) durchgeführt. Verfahren zur Transformation von Escherichia coli werden ebenfalls in diesem Handbuch beschrieben.
Die Zusammensetzung der gewöhnlichen Nährmedien, wie LB- oder TY-Medium, findet sich ebenfalls im Handbuch von Sambrook et al.
Die Malatdehydrogenase-Aktivität wurde wie von Sanwal (Journal of Biological Chemistry 244 (7): 1831–1837 (1969)) und Smith (Methods of Enzymatical Analysis 1985, 3. Aufl., Bd. 3 (Bergmeyer et al. (Hrsg.)), VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland) beschrieben, bestimmt. Die Proteinkonzentrationen wurden durch das Verfahren von Smith et al. (Analytical Biochemistry 150: 76–85 (1985)) bestimmt.
Beispiel 1
Isolation und Reinigung von Malatdehydrogenase aus Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
Viermal 100 ml 2 × TY wurden in jedem Fall mit einer Kolonie des Stammes Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 beimpft und in jedem Fall in konischen 250-ml-Kolben für 16 Std. bei 30°C und 200 U/min gezüchtet. Die Zellen wurden zweimal in Puffer A (50 mM K-Phosphat, pH-Wert 7,5, 1 mM Dithiothreitol, 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure) bei 4°C gewaschen und in 20 ml des gleichen Puffers resuspendiert. Die Zellen wurden dreimal in einer vorgekühlten French-Pressure-Zelle von Spectronic Unicam (Rochester, NY, USA) unter 165 MPa aufgebrochen. Die Zelltrümmer wurden dann in einer Zentrifuge für 10 min bei 4°C und 75600 × g sedimentiert. Das Malatdehydrogenase-Protein wurde in drei Schritten gereinigt.
Schritt 1
Streptomycinsulfat-Fällung:
Der Überstand wurde entfernt und weiter mit einer Streptomycinsulfat-Fällung behandelt. Zu diesem Zweck wurde eine 10%ige (Gew./Vol.) Streptomycinsulfatlösung unter Rühren bei 0°C langsam hinzu gegeben, bis eine Endkonzentration von 0,75 erreicht wurde. Der Ansatz wurde für 15 min auf Eis inkubiert und dann für 10 min bei 4°C und 15000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde dann in einen Dialyseschlauch gefüllt, der gemäß den Herstellerangaben (Medicell, London, UK) vorbehandelt worden war, und in jedem Fall zweimal in 1 l Puffer B (10 mM K-Phosphat, pH-Wert 7,5, 1 mM Dithothreitol, 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure) für 1,5 Std. bei 4°C dialysiert. Das Dialysat wurde dann für 15 min bei 4°C und 75600 × g zentrifugiert.
Schritt 2
Anionenaustauschchromatographie:
Der Überstand aus Schritt 1 wurde entfernt und auf eine Anionenaustauschsäule des Typs "Resource Q" (1 ml Säulenvolumen, Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland) aufgetragen, welche mit 4 Säulenvolumina Puffer B äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit 4 Säulenvolumina Puffer B gespült und dann mit einem linearen Gradient von Puffer B zu Puffer C (10 mM K-Phosphat, pH-Wert 7,5, 1 mM Dithiothreitol, 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure, 1 M NaCl) in 15 Säulenvolumina eluiert. Die Anionenaustauschchromatographie wurde bei 20°C durchgeführt und die Fraktionen wurden bei 4°C gesammelt. Die Malatdehydrogenase wurde bei etwa 0,5 M NaCl eluiert. Die Fraktionen mit der Malatdehydrogenaseaktivität wurden vereinigt und mittels Gelfiltration über PD-10-Säulen (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland) mit eiskaltem Puffer D (10 mM K-Phosphat, pH-Wert 7,5) gemäß den Herstellerangaben entsalzt.
Schritt 3
Farbstoff-Affinitätschromatographie:
Weniger als 10 mg Gesamtprotein aus Schritt 2 wurden auf eine Säule aufgetragen, die mit 2,5 ml des Säulenmaterials "Reactive Brown 10" (Sigma, Deisenhofen, Deutschland) gefüllt und mit 12,5 ml Puffer D äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit 15 ml eiskaltem Puffer D gespült, und die Malatdehydrogenase wurde mit 2,5 ml Puffer E (10 mM K- Phosphat, pH-Wert 7,5, 1 mM NADH) eluiert. Das Eluat wurde mittels Gelfiltration über PD-10-Säulen wie vorstehend beschrieben entsalzt.
Schritt 4
Farbstoffaffinitätschromatographie:
Schritt 3 wurde wiederholt. Das derart gereinigte Protein wurde bei –20°C aufbewahrt. Zur Stabilisierung der Aktivität wurde die Probe mit 1 mg/ml Rinderserumalbumin angereichert. Die Anreicherung mit Rinderserumalbumin wurde im Fall der Proben zur Bestimmung der N-terminalen Sequenz des Malatdehydrogenaseproteins weggelassen. Ein Lambda-10-Spektralphotometer von Perkin Elmer (Foster City, CA, USA) wurde zum Messen der Aktivität des gereinigten Enzyms verwendet. Die gereinigte Malatdehydrogenase hatte eine maximale spezifische oxalacetatreduzierende Aktivität von 1200 bis 1300 μmol/min und mg Protein bei einer Konzentration von 0,1 mM Oxalacetat und 0,3 mM NADH.
Die Reinheit der isolierten Malatdehydrogenase wurde mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese bestimmt. Die Analyse zeigte, dass die gereinigte Malatdehydrogenase als homogenes Protein mit einem apparenten Molekulargewicht von 33 kDA zugegen war.
Beispiel 2
Bestimmung der Aminosäuresequenz an der N-Position
Die Aminosäuresequenz an der N-Position wurde über den Edman-Abbau (Edman, Molecular Biology Biochemistry Biophysics 8: 211–55 (1970)) mittels automatischem Sequenziergerät Modell 476A von PE Biosystems (Folter City, CA, USA) bestimmt. Die resultierende Aminosäuresequenz (siehe ebenfalls SEQ. ID. NR. 1) war:
Beispiel 3
Herstellung eines Vektors mit einer Kopie eines internen Fragmentes des mdhA-Gens
Ein Segment des mdhA-Gens wurde mittels Polymerasekettenreaktion (PCR), ausgehend von der chromosomalen [sic] DNA des Stamms ATCC13032 amplifiziert und dann kloniert.
Mit der in Beispiel 2 bestimmten Aminosäuresequenz an der N-Position wurde der degenerierte Primer P1 verworfen. Der Primer hatte die Sequenz:
Der Primer P2 mit der folgenden Sequenz wurde als zweiter degenerierter Primer verwendet:
Die Abkürzung R steht für die Nucleobasen A oder G, die Abkürzung Y steht für C oder T, und die Abkürzung V steht für A, G oder C.
Die gezeigten Primer wurden von MWG Biotech (Ebersberg, Deutschland) synthetisiert. Die PCR-Reaktion wurde durch das Standard-PCR-Verfahren von Innis et al., (PCR Protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press, New York, USA) durchgeführt. Genomische DNA aus Corynebacterium glutamicum ATCC13032, welche durch das von Pospiech und Neumann (Trends in Genetics 11: 217–218 (1995)) beschriebene Verfahren isoliert wurde, wurde als Matrize verwendet.
In der Polymerasekettenreaktion wurde ein Zyklus aus Denaturieren (30 sec, 94°C), Annealing (60 sec, 63°C) und Synthese (90 sec, 72°C) 30 mal durchgeführt. Eine letzte Synthese von 10 min bei 72°C wurde anschließend durchgeführt. Es wurde Taq-Polymerase von Promega (Madison, WI, USA) und ein Thermocyler von Techne (Cambridge, UK) verwendet.
Das auf diese Weise hergestellte DNA-Fragment des mdhA-Gens mit etwa 470 bp Länge wurde mit Hilfe des QIAQuick PCR-Reinigungs-Kit von Qiagen (Hilden, Deutschland) gereinigt und in die EcoRV-Spaltstelle des Vektors pBlueskript II SK(+) (Stratagene, La Jolla, CA, USA) kloniert. Das Fragment wurde dann mit den Restriktionsenzymen BamHI und HindIII isoliert und in den Vektor pEM1, der mit den Restriktionsenzymen BamHI und HindII behandelt worden war (Schrumpf et al. Journal of Bacteriology 173, 4510–4516 (1991), in E. coli DHα kloniert, wobei die Selektion auf LB Medium erfolgte, das mit 50 μg/ml Knamycin angereichert worden war. Das auf diese Weise hergestellte Plasmid wurde mit pEMmdhAint bezeichnet.
Beispiel 4
Bestimmung der Sequenz des mdhA-Gens
Im Stamm Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 wurde das mdhA-Gen mit dem Plasmid pEMmdhAint inaktiviert.
Der Stamm Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 wurde mit dem Plasmid pEMmdhAint wie beschrieben von Van der Rest et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 52, 541–545 (1999)) transformiert. Die Transformanten wurden mit LBHIS-Agar selektiert, der mit 25 mg/l Kanamycin angereichert worden war. LBHIS-Agar umfasst LB-Medium, das mit 18,5 g/l Hirn-Herz-Brühe (Becton-Dickinson, Sparks MD, USA), 91 g/l Sorbit und 15 g/l Agar-Agar angereichert worden war. Der Stamm ATCC13032mdhA::pEMmdhAint, in dem das Plasmid pEMmdhAint in dem mdhA-Gen integriert ist, wurde auf diese Weise gebildet.
Die Chromosomen-DNA wurde aus dem Stamm ATCC13032mdhA::pEMmdhAint, wie von Pospiech und Neumann (Trends in Genetics 11: 217–218 (1995)) beschrieben, isoliert und vollständig in zwei verschiedenen Ansätzen gespalten, und zwar einmal mit dem Restriktionsenzym StuI und einmal mit dem Restriktionsenzym XbaI. Die chromosomalen Restriktionsfragmente wurden, wie von Niaudet et al. (Gene 19, 277–284 (1982)) beschrieben, ligiert, und Escherichia coli DH5α-MCR (Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 87, 4645–4649 (1990)) wurde mit dem Ligationsansatz transformiert. Die Transformanten wurden auf LB-Agar mit 50 mg/l Kanamycin selektiert. Die Plasmid-DNA wurde von den Transformanten isoliert und einer Restriktionsanalyse unterworfen. Die Plasmide pEMmdhAint-StuI und pEMmdhAint-XbaI, die neben dem bereits in das Plasmid pEMmdhAint klonierten internen Fragment des mdhA-Gens mit 470 bp Länge Bereiche des 5'- und des 3'-Endes des Gens trugen, wurden auf diese Weise identifiziert. Das aus der StuI-Spaltung erhaltene Plasmid pEMmdhAint hatte zusätzlich 0,56 kb am 5'-Ende und 0,40 kb am 3'-Ende des 470 bp Bereichs. Das aus der XbaI-Spaltung erhaltene Plasmid pEMmdhAint-XbaI hatte zusätzlich 1,2 kb am 3'-Ende des 470 bp-Bereichs.
Die erhaltenen Plasmide wurden von Seglab (Göttingen, Deutschland) mittels Cycle-Sequenzier-Protokoll von Zimmerman et al. (BioTechniques 17: 302 (1994)) sequenziert. Sie Sequenzen wurden mit PC/Gene-Version 6.60 von Intelligenetics Inc. (Genf, Schweiz) bestimmt. Die Sequenz des mdhA-Gen-Clusters ist inSEQ. ID. NR. 2 gezeigt.
Beispiel 5
Herstellung von L-Lysin-Produzenten mit einem inaktivierten mdhA-Gens
Die Experimente wurden mit verschiedenen bekannten Lysin-Produzenten von C. glutamicum durchgeführt, um die Wirkung der Eliminierung des mdhA-Gens auf die Produktion von Lysin zu untersuchen.
5.1. Herstellung der Stämme
Der Stamm MH20-22B ist beschrieben in EP-B-0435132 beschrieben und ist gemäß dem Budapester Vertrag als DSM5715 hinterlegt. Der Stamm DM58-1 ist in EP-B-0358940 beschrieben. Die dort beschriebene Transformante DM58-1/pDM6 ist gemäß dem Budapester Vertrag als DSM4697 hinterlegt. Der Stamm DM58-1 kann aus DSM4697 durch Ausschaltungsverfahren hergestellt werden, wie beispielsweise durch das von Schäfer et al., (Journal of Bacteriology, 176, 7309–7319 (1994)) beschriebene Verfahren der "Plasmid-Ausschaltung". Der Stamm DG 52-5 ist in DE-C-3823451 beschrieben. Die dort beschriebene Transformante DG 52-5/pZ1-asd ist gemäß dem Budapester Vertrag als DSM4421 hinterlegt. Der Stamm DG52-5 kann ebenfalls aus DSM4421 durch das Verfahren "Plasmid-Ausschaltung" hergestellt werden.
Der Stamm Corynebacterium Glutamicum MH20-22B wurde mit dem Plasmid pEMmdhAint, wie von Van der Rest et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 52, 541–545 (1999)) beschrieben, transformiert. Die Selektion der Transformanten erfolgte auf LBHIS-Agar, der mit 25 mg/l Kanamycin angereichert worden war. Der Stamm MH20-22BmdhA::pEMmdhAint wurde auf diese Weise hergestellt. Ausgehend von den Stämmen DG52-5 und DM58-1, wurden in jedem Fall die Stämme DG52-5mdhA::pEMmdhAint und DM58-1mdhA::pEMmdhAint auf die gleiche Weise hergestellt.
5.2. Bestimmung der Malatdehydrogenaseaktivität
Zur Bestätigung des Erfolgs der Insertionsmutagenese wurde die Malatdehydrogenaseaktivität in den Stämmen MH20-22B, DM58-1 und DG52-5 und in den Insertionsmutanten MH20-22BmdhA::pEMmdhAint, Dg52-5mdhA::pEMmdhAint und DM58-1mdhA::pEMmdhAint gemessen. Zu diesem Zweck wurde in jedem Fall eine Kolonie der Stämme auf 50 ml 2 × TY Medium überimpft und 16 Std. in einem konischen 250-ml-Kolben bei 30°C und 200 U/min inkubiert. Die Medien für die Stämme MH20-22BmdhA::pEMmdhAint, DG52-5mdhA::pEMmdhAint und DM58-1mdhA::pEMmdhAint erhielten hier zusätzlich 25 μg/ml Kanamycin. Die Kulturen wurden für 10 min bei 10000 × g abzentrifugiert, zweimal mit 50 mM Kaliumphosphat, pH-Wert 7,5 gewaschen, und dann in 5 ml des gleichen Puffers suspendiert. Die Zellsuspensionen wurden mit zwei Durchgängen durch eine eiskalte French-Press-Zelle unter 165 MPa aufgebrochen. Die Proben wurden dann 10 min bei 75000 × g und 4°C zentrifugiert. Der klare Überstand wurde als Rohextrakt für die Malatdehydrogenaseaktivitäts-Messungen verwendet. Die Malatdehydrogenase wurde bestimmt, wobei als Puffer 100 mM 3-Amino-1-propanol (pH-Wert 9,2) mit zusätzlich 4,5 mM MgCl₂ [sic] und 2,9 mM NAD⁺ verwendet wurde. Der Testansatz enthielt 1 ml von diesem Puffer und 50 μl Rohextrakt. Der Ansatz wurde zuerst für 30 min bei 30°C inkubiert. Danach wurde die Malatdehydrogenasereaktion durch Zugabe von 25 mM neutralisiertem L-Malat gestartet. Die Absorption wurde bei einer Wellenlänge von 340 nm in einem Lambda-10 Spektralphotometer von PE-Biosystems (Foster City, CA, USA) gemessen. Die Messung mit dem vollständigen Reaktionsansatz ohne L-Malat diente als Kontrolle für die spezifische NAD⁺-Reduktionsrate.
Die Ausgangsstämme MH20-22B, DM58-1 und DG52-5 hatte eine spezifische Malatdehydrogenaseaktivität von 301, 380 bzw. 354 nmol/min × mg Protein, wohingegen die mdhA-Insertionsmutanten keine nachweisbare Malatdehydrogenaseaktivität aufwiesen. Die untere Nachweisgrenze für die Aktivität war hier 2 nmol/min × mg Protein.
Beispiel 6
Herstellung von L-Lysin
Die in Beispiel 5 beschriebenen Stämme wurden in 2 × TY-Medium, das im Fall von Insertionsmutanten mit Kanamycin (25 μg/ml) angereichert worden war, 24 Std. bei 30°C inkubiert. Zum Züchten in einem flüssigen Medium wurde das Medium CgIII (Keilhauer et al. 1993, Journal of Bacteriology 175: 5595–5603), das für die Insertionsmutanten zusätzlich mit Kanamycin (25 mg/l) angereichert worden war, verwendet. Zu diesem Zweck wurden 10 ml Medium, das in einem konischen 100 ml-Kolben enthalten war, mit einer Kolonie des Stammes angeimpft, und die Kultur wurde dann weiter als Vorkultur verwendet.
CGXII-Glucose-Minimalmedium (Keilhauer et al. Journal of Bacteriology 175, 5595–5603 (1993)) wurde als Produktions- und Testmedium verwendet. Das Medium enthielt kein Kanamycin. Die Anzucht erfolgte in konischen 500-ml-Kolben mit einer Metallspirale mit 2 cm Durchmesser, die am Rand auf dem Boden auflag. Diese Kolben waren mit 60 ml CGXII-Glucose-Minimalmedium gefüllt. Die Kulturen wurden mit der Vorkultur derart beimpft, dass die optische Dichte zu Beginn einen wert zwischen 0,5 und 0,6 hatte. Die Anzucht wurde für 72 Std. bei 30°C durchgeführt. Die Kolben wurden mit einer Frequenz von 140 U/min geschüttelt.
Nach der Inkubation für 72 wurde die optische Dichte der Kultur und die Lysinkonzentration im Produktionsmedium bestimmt.
Die optische Dichte (OD) wurde mit einem Lambda B Spektralphotometer von Perkin-Elmer bei einer Wellenlänge von 600 nm bestimmt.
L-Lysin wurde mittels "Hochleistungsflüssigkeitschromatographie" bestimmt, wobei eine "Hypersil ODS 5 μ"-Säule (Abmessungen: 125 × 4 mm) von Chromatographie-Service, Langerwehe, Deutschland, verwendet wurde. Die Trennung erfolgte mit einem linearen Gradienten der mobilen Phasen A: 0,1 mM Natriumacetat, pH-Wert 7,5 und B: Methanol (Verhältnis A:B von 85:15 bis 0:100). 5 min vor dem Auftragen wurden die Aminosäuren mit Orthophthalodialdehyd (OPA-Reagenz, Pierce, Rockford, IL, USA) derivatisiert. Die Erfassung erfolgte durch Messen der Fluoreszenz mit einer Anregungswellenlänge von 243 nm und einer Emissionswellenlänge von 436 nm. Das Ergebnis des Experimentes ist in der Tabelle 1 gezeigt.
TABELLE 1
Kurze Beschreibung der Figur:
1: Karte des Plasmids pEMmdhAint.

Die verwendeten Abkürzungen und Bezeichnungen haben die folgende Bedeutung. Die angegebenen Basenpaarnummern sind Näherungswerte, die im Zusammenhang der Reproduzierbarkeit der Messungen erhalten wurden.

mdhAint	Internes Fragment des mdhA-Gens, Basen 566 bis 1035 derSEQ. ID. NR. 1
Km-Gen	Km-Resistenz-Gen (Tn5)
oriV	E. coli-Replikationsursprung
oriT	Transferursprung (Mobilisierung) aus Plasmid RP4
BamHI:	Spaltstelle des Restriktionsenzyms BamHI
HindIII:	Spaltstelle des Restriktionsenzyms HindIII

Claims

Isoliertes coryneformes Bakterium, in dem die Expression des mdhA-Gens, das aus einem Polynucleotid besteht, das ein Polypeptid mit Malatdehydrogenase-Aktivität und mit einer Aminosäuresequenz, die zu mindestens 90% identisch zu der in SEQ. ID. NR. 3 dargestellten Aminosäuresequenz ist, codiert, eliminiert worden ist.
Coryneformes Bakterium nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid die N-terminale Aminosäuresequenz von SEQ. ID. NR. 1 besitzt.
Coryneformes Bakterium nach den Ansprüchen 1 oder 2, wobei das Polypeptid die Aminosäuresequenz von SEQ. ID. NR. 3 besitzt.
Coryneformes Bakterium nach den Ansprüchen 1 bis 3, wobei das Polypeptid von den Nucleotiden 536 bis 1519 des in SEQ. ID. NR. 2 dargestellten Polynucleotids codiert wird.
Coryneformes Bakterium nach den Ansprüchen 1 bis 4, wobei das Polypeptid von dem in SEQ. ID. NR. 2 dargestellten Polynucleotid codiert wird.
Verfahren zur Herstellung von L-Lysin, das die Durchführung der folgenden Schritte umfasst: a) Fermentation der Bakterien nach den Ansprüchen 1 bis 5, wobei die Bakterien L-Lysin produzieren, b) Konzentrieren von L-Lysin im Medium oder in den Zellen der Bakterien und c) Isolation von L-Lysin.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei Bakterien, in denen ferner Gene des Biosyntheseweges der gewünschten L-Aminosäure zusätzlich amplifiziert worden sind, eingesetzt werden,
Verfahren nach Anspruch 6, wobei Bakterien, in denen die Stoffwechselwege, welche die Bildung der gewünschten L-Aminosäure verringern, eliminiert worden sind, eingesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Expression de(s/r) Polynucleotid(s/e), das (die) das mdhA-Gen codiert (codieren), eliminiert worden ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die katalytischen Eigenschaften des Polypeptids (Enzymproteins), welches von dem Polynucleotid mdhA codiert wird, verringert worden sind.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei zur Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, Bakterien, in denen gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus a) dem dapA-Gen, das Dihydrodipicolinatsynthase codiert, b) dem pyc-Gen, das Pyruvatcarboxylase codiert, c) dem eno-Gen, das Enolase codiert, d) dem zwf-Gen, welches das zwf-Genprodukt codiert, und e) dem lysE-Gen, das den Lysin-Export codiert, verstärkt, vorzugsweise überexprimiert, ist oder sind, fermentiert werden.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus a) dem pck-Gen, das Phosphoenolpyruvatcarboxykinase codiert, b) dem pgi-Gen, das Glucose-6-phosphatisomerase codiert, c) dem poxB-Gen, das Pyruvatoxidase codiert, eliminiert worden ist oder sind.
Verfahren nach einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, wobei Mikroorganismen der Gattung Corynebacterium glutamicum eingesetzt werden.
Verfahren zur Herstellung von L-Lysin durch Fermentation coryneformer Bakterien, wobei diese Bakterien eine eliminierte intrazelluläre Aktivität des Malatdehydrogenase-Enzyms aufweisen und wobei die Aminosäuresequenz zu mindestens 90% identisch zu dem Polypeptid gemäß SEQ. ID. NR. 3 ist.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Polypeptid die N-terminale Aminosäuresequenz von SEQ. ID. NR. 1 besitzt.
Verfahren nach den Ansprüchen 14 oder 15, wobei das Polypeptid die Aminosäuresequenz von SEQ. ID. NR. 3 besitzt.
Verfahren nach den Ansprüchen 14 bis 16, wobei das Polypeptid von den Nucleotiden 536 bis 1519 des in SEQ. ID. NR. 2 dargestellten Polynucleotids codiert wird.
Verfahren nach den Ansprüchen 14 bis 17, wobei das Polypeptid von dem in SEQ. ID. NR. 2 dargestellten Polynucleotid codiert wird.