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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
Erfindung bezieht sich allgemein auf das Gebiet der Kryokonservierung.
Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf äußerst stabile
Verglasungslösungen
von geringer Toxizität
und Trägerlösungen,
die Lactose und Mannitol umfassen. Derartige Konservierungslösungen sind
in der WO 97/47 192 offenbart.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Damit
Verglasungslösungen
biologisch anwendbar sind, müssen
die Gefrierschutzmittel, welche die Verglasungslösung umfassen, in einer "Träger"- oder "Vehikel"-Lösung enthalten
sein, die dazu verwendet wird, osmotische und physiologische Unterstützung für lebende
Systeme in An- und Abwesenheit der Gefrierschutzmittel bereitzustellen.
Es ist jedoch auf diesem Fachgebiet hinlänglich bekannt, dass die Wirkungskraft von
Trägerlösungen für Gefrierschutzmittel
nicht vorhersehbar ist und dass die beste Trägerlösung für ein Gefrierschutzmittel oder
eine Gefrierschutzmittel-Mischung eine andere sein kann als die
beste Trägerlösung für ein anderes
Gefrierschutzmittel oder eine andere Gefrierschutzmittel-Mischung.
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Wie
von Fahy et al. in der US-Patentanmeldung Nr. 09/400,793, eingereicht
am 21. September 1999, offenbart, hemmt Glucose die Einwirkung des "Eisblocker"(Antinukleierungs-)Mitteis
des Polyvinylalkoholtyps. Dies macht (190 mM Glucose enthaltende)
Eurocolline-Lösung
oder (180 mM Glucose enthaltendes) RPS-2 suboptimal zur Verwendung
mit derartigen Antinukleierungsmitteln. Jedoch ist der Einschluss
solcher Mittel, wofür
das allertypischste Beispiel ein Produkt namens "X1000" ist, das im Handel von der Firma 21st Century Medicine, Rancho Cucamonga, California
91730 erhältlich
ist, hoch erwünscht.
Mehrere alternative Trägerlösungen wurden
von Fahy et al. in der US-Patentanmeldung
Nr. 09/400,793, eingereicht am 21. September 1999 (durch Querverweis
hierin aufgenommen), offenbart, wie z. B. MHP-2, GHP-2 und RPS-T.
Keine davon war jedoch ganz zufriedenstellend. Diese anderen Träger stellten
eine schlechtere Erholung von in Anwesenheit verglasbarer Gefrierschutzmittel-Konzentrationen
darin bewahrten Geweben bereit als RPS-2 oder sind unerschwinglich
teuer (RPS-T) und können
dabei auch weniger biologisch akzeptabel sein als RPS-2.
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Die
Schwierigkeiten, keine vollendete Trägerlösung zu haben, werden vervielfacht,
wenn die Aufgabe darin besteht, massive Strukturen, wie z. B. natürliche Organe
oder technisch hergestellte Gewebeprodukte, wie z. B. künstliche
Organe oder Gewebe, zu verglasen. Die einzige relevante Erfahrung,
die auf diesem Fachgebiet bekannt ist, ist die Verwendung von entweder
RPS-2 (Fahy und Ali, Cryobiology, 35:114–131, 1997) oder von Eurocolline-Lösung (Khirabadi
und Fahy, Transplantation 70: 51–57, 2000; Khirabadi und Fahy,
Cryobiology 31: 10–25,
1994; Arnaud, Fahy und Khirabadi, Cryobiology 35:358, 1997 und ein
2001 zur Veröffentlichung
vorgelegtes Papier) für
die Perfusion von Kaninchennieren mit einer Verglasungslösung namens
VS4 (Formel in diesen Entgegenhaltungen definiert). Ohne die Fähigkeit,
entweder Eurocolline oder RPS-2 als Trägerlösung zu verwenden, ist der
Praktiker nicht imstande, sich bei der Wahl einer Trägerlösung zur
Verwendung auf den Stand der Technik zu verlassen, insbesondere
bei dem gegebenen extremen Wunsch nach Verwendung einer anderen
Verglasungslösung
als VS4 oder deren konzentrierteres Derivat VS41A (Formel beispielsweise
veröffentlicht
bei G.M. Fahy et al., Kapitel 20, in "Cell Biology of Trauma" (Hrsg. J.J. Lemasters
und C. Oliver), CRC Press, Boca Raton, FL, 1995, S. 333–356). Dieses
Fehlen einer geeigneten Trägerlösung ist ein
Haupthindernis bei der Anwendung von Verglasung auf ganze Organe
und technisch hergestellte Systeme. Dies bewahrheitet sich insbesondere,
wenn man die Potentialdifferentialantwort des Organparenchyms und des
Organgefäßsystems
auf eine bestimmte ungeprüfte
Kombination aus Gefrierschutzmitteln und Trägerlösung betrachtet.
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WESEN DER
ERFINDUNG
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Es
ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine geeignete Trägerlösung zur
Verwendung mit neueren Verglasungslösungen zu beschreiben und Verglasungslösungen zu
zeigen, die in Anwesenheit dieser neuen Trägerlösung überraschend wirksam sind. Es
ist eine weitere Aufgabe, eine Trägerlösung bereitzustellen, die sowohl
bei Verwendung mit separierten Gewebescheiben als auch mit ganzen
Organen und bei vielerlei Verglasungslösungen der neueren Generation
vollendete Ergebnisse liefert.
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KURZBESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 zeigt
die Ergebnisse einer Nierenperfusion mit einer eine Kombination
aus Mannitol und Lactose enthaltenden Lösung (LM5).
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2 zeigt
die Erholung von Kaninchen-Nierenrindenscheiben, nachdem sie bei
ca. –22°C verschiedenartigen
Verglasungslösungen
in Anwesenheit einer Lactose und Mannitol enthaltenden Trägerlösung ausgesetzt
waren.
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3 zeigt
ein Lebensfähigkeit/Stabilität-Diagramm
für 16
beispielhafte Verglasungslösungen,
darunter sowohl die zuvor beschriebenen Lösungen als auch neue Varianten
von außergewöhnlicher
Wirkungskraft, von denen die meisten in einer Lactose und Mannitol
umfassenden Trägerlösung enthalten
sind.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM
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Es
ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, überraschend wirksame Verglasungslösungen zu
beschreiben. Diese Lösungen
wurden alle durch praktische Umsetzung der Erfindung hergeleitet,
die in der US-Anmeldung Nr. 09/400,793, "Improved Cryoprotectant Solutions", eingereicht am
21. September 1999 von G.M. Fahy und B. Wowk beschrieben sind oder
durch Folgen dieser Lehren plus der Lehren in einer verwandten US-Patentanmeldung mit
dem Titel "Hypertonic
Reduction of Cooling Injury" von
G.M. Fahy, eingereicht am 25. Juli 2001. Jedoch waren die hierin
beschriebenen Lösungen
so außergewöhnlich wirksam,
dass ihre Effektivität
basierend auf den Lehren dieser zitierten Patentanmeldungen allein
nicht vorhersehbar war. In der Tat konnten diese Lösungen nicht
hergeleitet und ihr Wert ohne die Entwicklung eines anderen Werkzeugs nicht
richtig eingeschätzt
werden, das zum Zeitpunkt seiner Erfindung für unmöglich gehalten wurde. Dieses Werkzeug
ist das Lebensfähigkeit/Stabilität-Diagramm.
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Es
ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue Verglasungslösungsvariationen
zu beschreiben, die aufgrund ihrer etwas überraschenden Kombination aus
fehlender Toxizität
und Stabilität
gegen Eisbildung infolge scheinbar geringfügiger Änderungen in der Lösungszusammensetzung
außergewöhnlich wirksam
sind.
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Das
Lebensfähigkeit/Stabilität-Diagramm
ist eine graphische Darstellung einer Lebensfähigkeitsmessung, die nach einer
Gefrierschutzmittellösungsexposition
gegenüber
der erforderlichen Erwärmungsgeschwindigkeit
zur Begrenzung der Entglasung dieser Gefrierschutzmittellösung auf
ein erträgliches
Maß vorgenommen
wird. Das Lebensfähigkeit/Stabilität-Diagramm
verbindet eine biologische Messung mit einer physikalischen Messung
zur Bildung einer Universalskala zum Einordnen der Effektivität einer
Verglasungslösung für ein bestimmtes
System. Typischerweise muss die Wirkung der Lösung auf die Lebensfähigkeit
nach Kontakt des lebenden Systems mit der Verglasungslösung für eine ausreichend
lange Zeitspanne erfolgen, um das lebende System beim anschließenden Kühlen verglasbar
zu machen. Des Weiteren muss der zur Messung gewählte Entglasungsgrad praktisch
unschädlich
für das
zu untersuchende System sein, damit das Diagramm Signifikanz für die Vorhersage
des Ergebnisses eines Verglasungs- und Wiedererwärmungsversuchs bekommt.
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Die
zur Unterdrückung
der Entglasung erforderliche Erwärmungsgeschwindigkeit
wird durch Abkühlen der
Verglasungslösung
mit einer standardmäßigen, realistischen
Geschwindigkeit und dann Wiedererwärmen der verglasten Lösung mit
einer Reihe von Erwärmungsgeschwindigkeiten
bestimmt. Die während
der Entglasung (Entglasung ist Eisbildung während des Erwärmens) freigesetzte
Wärme wird
unter Verwendung eines Differentialscanning-Kalorimeters quantifiziert
und gegen die Erwärmungsgeschwindigkeit
aufgetragen. Durch Kurvenanpassung einer solchen Aufzeichnung von
Wärmeentwicklung
gegen Erwärmungsgeschwindigkeit durch
mehrere Punkte für
eine gegebene Lösung
kann der Schnittpunkt der Kurve mit einem Standardpegel der Wärmeentwicklung
bestimmt werden und die Erwärmungsgeschwindigkeit,
die diesen Grad der Wärmeentwicklung
erzeugt, von der graphischen Darstellung abgelesen werden. Diese
Erwärmungsgeschwindigkeit ist
die kritische Erwärmungsgeschwindigkeit,
die gegen die Lebensfähigkeitsmessung
aufgetragen wird, um einen Punkt auf der Lebensfähigkeit/Stabilität-Auftragung zu bilden.
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Das
Konzept einer Lebensfähigkeit/Stabilität-Auftragung
wurde in "Improved
Cryoprotectant Solutions",
US-Anmeldung Nr. 09/400,793, eingereicht am 21. September 1999,
eingeführt,
aber die bereitgestellte graphische Darstellung war nur eine Schätzung basierend
auf visuellen Beobachtungen makroskopischer Proben. Wenn mehr präzise Stabilitätsdaten
für viele
der in der Hauptanmeldung aufgeführten
Lösungen
bestimmt wurden, wurden viel enthüllendere Informationen verfügbar. Diese
neuen Informationen gestatteten eine "Feinabstimmung" der Lösung, um die Merkmale, die
höherer
Lebensfähigkeit
zugeordnet wurden, mit den Merkmalen, die höherer Stabilität zugeordnet
wurden, zu kombinieren. Als Folge wurden außergewöhnlich wirksame Lösungen hergeleitet,
und diese werden hierin bereitgestellt.
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Daneben
führten
jüngste
Einblicke in die Rolle von impermeanter Spannung auf die Größe der "Kühlungsschädigung" in Verglasungssystemen, wie in einer
US-Patentanmeldung mit dem Titel "Hypertonic Reduction of Chilling Injury", eingereicht am
26. Juli 2001, offenbart, zu den hierin vorgelegten Lösungen,
die geringe Toxizität
und hohe Stabilität
mit außergewöhnlich starkem
Schutz vor Kühlschaden
verbinden. Die resultierenden Lösungen
sind von beispielloser Nützlichkeit
für die
Kryokonservierung lebender Systeme.
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Hierin
wird von Lösungen
berichtet, die Toxizität,
Kühlungsschädigung und
Entglasung minimieren. In voller Stärke verwendet sind diese Lösungen von
besonderer Bedeutung für
die Kryokonservierung größerer lebender
Systeme, wie z. B. Organe und technisch hergestellte Gewebe und
biokünstliche
Organe, bei denen eine rasche Abkühlung und Erwärmung schwierig
oder unmöglich
ist. Viele lebende Systeme und einige technisch hergestellte Gewebe
und biokünstliche
Organe sind jedoch imstande, mit höheren Geschwindigkeiten abgekühlt und
erwärmt
zu werden als die hierin diskutierten oder sind imstande, nach stärkerer Eisbildung
zu überleben
als hierin erörtert
ist. Für
diese Systeme können
auch geeignete Verdünnungen
der aufgelisteten Formeln wirksam verwendet werden und vorteilhafter
sein als die Vollstärkeversionen.
Die Verwendung von Verdünnungen
etablierter Verglasungslösungen
wird beispielsweise in Rall, W.F. und Fahy, G.M., Nature, 313:573–575, 1985,
gelehrt. Folglich werden moderate Verdünnungen der vorliegend offenbarten
Formeln als äquivalent
und unter den Schutzbereich der offenbarten Erfindung fallend angesehen.
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Eine
Ausführungsform
entspricht mehreren Lösungszusammensetzungen,
die gemeinsame physikalische und biologische Eigenschaften aufweisen,
insbesondere hohe Stabilität
und geringe Toxizität.
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Die
folgenden Beispiele stellen die Schritte bereit, die zur Formulierung
der neuen Trägerlösung und anschließendes Testen
dieser Lösungen
führten.
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BEISPIELE
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In
Beispiel 1 ist eine neue Trägerlösung offenbart.
Beispiel 2 zeigt die Annehmbarkeit des Trägers für ganze Nieren ohne Gefrierschutzmittel,
und Beispiel 3 zeigt die Annehmbarkeit des Trägers für ganze Nieren, die Gefrierschutzmittel
enthalten. Beispiel 4 stellt Experimente unter Verwendung der Lösung für die Behandlung
von Kaninchennieren dar. Beispiel 5 stellt die Ergebnisse zusätzlicher
Experimente dar, bei denen Beobachtungen, die an Nierenscheiben
und der physikalischen Stabilität
der Lösungen
gemacht wurden, kombiniert und diese Ergebnisse mit zuvor offenbarten
Ergebnissen und der hohen Funktionswiedergewinnung in Nierenscheiben
verglichen wurden, die in den neuen LM5-haltigen Lösungen verglast wurden.
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BEISPIEL 1
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Einige
der Gestaltungsschritte, die zur Formulierung der neuen, LM5 genannten
Trägerlösung führten, sind
wie folgt:
Als Erstes bestand die Notwendigkeit, die Konzentration
von Glucose auf ein unbekanntes Ausmaß zu reduzieren, um die Inaktivierung
des oben beschriebenen Antinukleatorproduktes X1000 zu verhindern.
Zum Zweiten musste die Glucose durch irgendeine andere impermeante
Spezies ersetzt werden. Die Impermeantien der hinlänglich bekannten
und hinlänglich
offenbarten Lösung
der Universität
von Wisconsin (UW-Lösung,
verkauft unter der Handelsmarke VIASPAN) wurden sowohl für biologisch
schädlich
als auch für
unerschwinglich teuer gehalten. Des Weiteren mussten Impermeantien
gewählt
werden, welche die X1000 inaktivierende Wirkung von Glucose nicht
teilten, ein früher
unerforschtes Problem. Zudem wurde von Khirabadi et al. berichtet,
dass Mannitol, ein nominell inertes Impermeans, sonderbare Gefäßschädigung an
der Niere erzeugte, wenn es anstelle von Glucose in einer Trägerlösung für eine Verglasungslösung des
Typs VS4 verwendet wurde (Arnaud, Fahy und Khirabadi, Cryobiology
35: 358, 1997). Andere auf diesem Fachgebiet bekannte Impermeantien
neigen dazu, beladen zu werden, aber neben anderen Gründen könnten beladene
Spezies aufgrund ihrer Fähigkeit,
Ionen zu chelieren, schädlich
sein, (siehe Fahy, da Mouta et al., 1995, oben angeführt). Sucrose,
ein beliebtes Impermeans, wurde aufgrund seiner hohen Viskosität und berichteten
Nephrotoxizität
als unerwünscht angesehen.
Zudem war es erwünscht,
Impermeantien zu verwenden, die preiswert und biologisch benigne
waren.
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Eine
andere Gestaltungsüberlegung
rührte
von der Tatsache her, dass in Verglasungslösungen verwendete Trägerlösungen am
besten als Konzentrate hergestellt werden. Typischerweise wird beispielsweise eine
fünffach
konzentrierte Version einer Trägerlösung vorbereitet.
Die Verglasungslösung
wird beispielsweise hergestellt durch Zusetzen von einem Fünftel Volumen
des Konzentrats in einen Mess- oder Maßbehälter, darauf folgend Zusetzen
der Gefrierschutzmittel und beliebiger notwendiger Polymere, und
schließlich
Bringen des Volumens des Gesamtsystems auf ein Volumen (fünfmal das
Konzentratvolumen), um so das Konzentrat in Wasser plus Gefrierschutzmittel
zu lösen,
um die richtige Konzentration der Trägerlösungskomponenten pro Volumeneinheit
zu erzielen. Damit dies möglich
ist, müssen
die Bestandteile der Trägerlösung löslich sein, wenn
sie in Anwesenheit der anderen Bestandteile etwa fünffach konzentriert
sind.
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Überraschenderweise
gibt es kein früheres
Beispiel für
die Verwendung von Lactose in Organkonservierungslösung oder
-perfusat. Das natürliche
Vorkommen von Lactose in lebenden Systemen förderte deren Verwendung in
RPS-2 anstelle von Glucose, aber es stellte sich heraus, dass sie
eine ungenügende
Löslichkeit
zur Verwendung in Konzentraten aufwies, und ihre Löslichkeit
in Anwesenheit von Verglasungslösungen voller
Stärke
war fraglich.
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Wie
zuvor angemerkt, wurde der Verwendung von Mannitol als Perfusatkomponente
von Khirabadi et al. widersprochen (Cryobiology 35: 357, 1997),
die herausfanden, dass es schädlich
war. Die Verwendung von Mannitol ist auch wegen seiner typischen
Verwendung als osmotischer Puffer in Organ-Gefrierschutzmittelperfusionen
fraglich (siehe z. B. Kheirabadi und Fahy, 2000 und Fahy und Ali,
1997). Je mehr extrazelluläres
Mannitol vorhanden ist, desto größer ist
die Wahrscheinlichkeit, dass etwas davon in die Zelle eindringt,
wo es dann zurückgehalten
wird und anschließend
eine schädigende
Zellaufquellung bewirkt. Zudem ist Mannitol in Wasser nicht besonders
löslich
und in Anwesenheit von Gefrierschutzmitteln noch weniger löslich, was
seine mögliche
Konzentration als osmotischer Puffer beschränkt.
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Neben
diesen Beschränkungen
besteht sowohl bei Mannitol als auch bei Lactose das Problem der Löslichkeit
des Mittels bei tiefen Temperaturen unter Null während des Abkühlens auf
die und Erwärmens
von der Glasübergangstemperatur.
Typischerweise können
viele Moleküle
von marginaler Löslichkeit
im Kalten aus der Lösung
präzipitieren.
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Diese
Schwierigkeiten wurden folgendermaßen gelöst: Zunächst wurde bestimmt, dass das
Zurückhalten
von 90 mM der normalen 180 mM Glucose in RPS-2 hinsichtlich der
Kompatibilität
mit der Antinukleierungsfähigkeit
von X1000 akzeptabel war. Als Nächstes
wurde bestimmt, dass die Löslichkeit
von Mannitol und die Löslichkeit
von Lactose ausgeglichen werden konnte, indem beide in gleichen
Konzentrationen von 45 mM verwendet wurden, was eine Gesamtmenge
von 90 mM Glucose in RPS-2 ersetzte. Die resultierende Lösung erhielt
den Namen LM5. Der Name bezieht sich auf die Verwendung von Lactose
und Mannitol als Ersatz für 50
% der Glucose in RPS-2. Eine andere Lösung, LT5, ist ebenfalls wirksam,
aber weit teurer als LM5. LT5 besteht aus RPS-2, in dem 45 mM Glucose
durch Lactose und 45 mM Glucose durch Trehalose ersetzt wurden.
Wie noch gezeigt wird, bleiben bei den Konzentrationen in LM5 sowohl
Mannitol als auch Lactose in Anwesenheit von Gefrierschutzmitteln
und während
des Abkühlens
und Erwärmens
auf Tieftemperaturen unter Null in Lösung.
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Alle
Prozente sind in Gewicht/Volumen-Einheiten;
dG = Decaglycerol;
K/Na
(40) = K/Na nach Exposition bei 0°C
für 40
min;
K/Na (20) = K/Na nach Exposition bei 0°C für 20 min;
K/Na (30) =
K/Na nach Exposition bei –22°C für 30–40 min;
SEM
= Standardabweichung des Mittelwertes, gewöhnlich für 12 Proben;
Wrcrit =
Erwärmungsgeschwindigkeit,
welche die Eisbildung während
der Erwärmung
basierend auf dem Durchschnitt von Doppel- oder Dreifachproben auf
nicht mehr als 0,2 % der Probenmasse begrenzt (°C/min).
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X1000
ist ein im Handel erhältliches
Produkt von 21st Century Medicine und besteht
aus 80 % hydrolisiertem Polyvinylalkohol mit einer relativen durchschnittlichen
Molekularmasse von rund 2 Kilodalton oder weniger.
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PVP
5.000 ist Polyvinylpyrrolidon mit einer durchschnittlichen relativen
Molekularmasse von 5 Kilodalton.
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Viele
andere auf dem Obigen basierende Formeln sind analysiert und festgestellt
worden, dass sie nach Exposition bei –20°C für 20 min 100 % Ertrag des K/Na-Verhältnisses
lieferten, aber die kritischen Erwärmungsgeschwindigkeiten für diese
Lösungen
sind nicht bestimmt worden.
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- DMSO: Dimethylsulfoxid; Form. = Formamid; EG = Ethylenglycol;
alle
Prozente = % Gewicht/Volumen;
die Spalten DMSO, Form., EG und
Acetol beziehen sich auf Konzentrationen von % Gewicht/Volumen.
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LM5-Bestandteile
sind in dieser Tabelle nicht gezeigt.
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BEISPIEL 2
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Mehrere
Kaninchennieren wurden fünf
Stunden lang bei 3,5°C
mit LM5 perfundiert. Zudem wurden während dieser Perfusion 1 %
G/V X1000, 1 % G/V Decaglycerol und 7 % G/V Polyvinylpyrrolidon
der mittleren Molekularmasse 5000 (PVP 5000) derart eingeführt und
entfernt, dass die Konzentrationen dieser Substanzen in einer typischen
Perfusion mit einer Verglasungslösung
simuliert wurden. Die Ergebnisse sind in 1 gezeigt,
in der die postoperativen Serumcreatiningehalte gegen den Tag nach
der Operation aufgetragen sind, an dem die Probe genommen wurde.
Wie ersichtlich, erlitten diese Nieren mit und ohne die Kälteschutzpolymere
keine messbare Schädigung
infolge Perfusion mit LM5. Deshalb ist LM5 sowohl mit den Gefäß- als auch den
Parenchymbestandteilen ganzer Organe kompatibel.
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BEISPIEL 3
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Als
Nächstes
wurden mehrere Kaninchennieren in einer LM5-Trägerlösung mit Gefrierschutzmittelkonzentrationen
perfundiert, die zur Verglasung bei Umgebungsdrücken ausreichen. Calcium und
Magnesium wurden schrittweise entfernt und wieder zugesetzt, während Gefrierschutzmittelkonzentrationen
erhöht
und dann verringert wurden, um eine Präzipitation dieser Ionen zu
vermeiden. Es gab keine Perfusionsprobleme, die irgendeiner Wirkung
von LM5 zuzuschreiben waren, und trotz der fehlenden Verwendung
von Iloprost wurde bei Transplantation das Überleben und die Lebenserhaltung
seitens dieser perfundierten Nieren erreicht. Eine Organvorbehandlung
mit Iloprost in vivo ist traditionell obligatorisch zum Erreichen
des Überlebens,
wenn Kaninchennieren mit Konzentrationen von Gefrierschutzmitteln
perfundiert werden, die bei Umgebungsdruck verglasen können. Diese
Ergebnisse zeigten auf, dass LM5 durch Gefäßperfusion mit der Lieferung
verglasbarer Konzentrationen einer äußerst fortschrittlichen Gefrierschutzmittelformel
kompatibel ist.
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BEISPIEL 4
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Als
Nächstes
wurden Nierenscheiben einer breiten Vielfalt von Gefrierschutzmittellösungen in
LM5 ausgesetzt. LM5 erwies sich als geeignet zur Verwendung in Anwesenheit
von verglasbaren Konzentrationen von Gefrierschutzmittel. Ein besonderes
Beispiel ist in 2 gezeigt, worin in fünf Verglasungslösungsvariationen
nach 20 min Behandlung bei 0°C
etwa 100 % Erholung des Scheiben-K/Na-Verhältnisses erreicht wurden. Die
Einzelheiten dieser Lösungen
und die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben.
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Tabelle
1: Zusammensetzungen von Lösungen
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- EG = Ethylenglycol; F = Formamid; D = Dimethylsulfoxid;
alle
Prozentangaben in der Tabelle sind in % Gewicht/Volumen.
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Dies
war das Experiment 00-035.
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Die
Motivation zur Herstellung von LM5 war es sicherzustellen, dass
Eisblocker mit ganzer Effektivität verwendet
werden konnten, um die Stabilität
von Verglasungslösungen
gegen Eisbildung aufrechtzuerhalten. Um den Erfolg von LM5 als Träger für hochstabile
Lösungen
zu untersuchen, die sich umfassend sowohl auf X1000 als auch auf
Polyglycerin als Eisblocker verlassen, wurde die Stabilität mehrerer
Lösungen
unter Verwendung eines Differentialscanning-Kalorimeters gemessen,
wie vor- und nachstehend beschrieben, und dieselben Lösungen wurden
unter vielerlei Prüfbedingungen
auf ihre Wirkung auf die Scheibenlebensfähigkeit analysiert. Diese Daten
wurden dann in der in 3 gezeigten Lebensfähigkeit/Stabilität-Kurve
zusammengetragen.
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3 gibt
Lebensfähigkeitsdaten
an, die durch das K/Na-Verhältnis
von Kaninchen-Nierenrindenscheiben
dargestellt sind, die den 16 Verglasungslösungen ausgesetzt wurden, welche
anschließend
ausgewaschen wurden, gefolgt von Inkubation in Cross-Taggart-Lösung mit kontinuierlicher Sauerstoffanreicherung für 90 min.
Das K/Na-Verhältnis
wurde gemessen, wie in der wissenschaftlichen Literatur angegeben.
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Die
Kreise und Sechsecke in 3 stellen Lösungen dar, deren genaue Zusammensetzungen
zuvor noch nicht offenbart wurden. Die Dreiecke stellen Lösungen dar,
die praktisch äquivalent
zu früher
offenbarten Lösungen
sind, aber eine LM5-Trägerlösung enthalten.
Die Quadrate und Rauten stellen Lösungen dar, die zuvor in "Improved Cryoprotectant
Solutions", US-Anmeldung
Nr. 09/400,793, eingereicht am 21. September 1999, offenbart wurden
(hierin durch Querverweis aufgenommen). Alle zuvor nicht offenbarten
Zusammensetzungen enthalten eine LM5-Trägerlösung.
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Leere
Kreise stellen das K/Na-Verhältnis
nach einer Gesamtexpositionszeit von 20 min bei 0°C dar. Graue
und schwarze Kreise und andere Punkte stellen die K/Na-Verhältnisse
nach 40 min Exposition bei dieser Temperatur dar. Im Falle der Sechsecke
zeigen Sechsecke mit einer Mittelmarkierung die K/Na-Verhältnisse
nach 30 min Exposition bei 0°C,
und Sechsecke ohne eine Markierung in der Mitte zeigen die K/Na-Verhältnisse
nach 30 min Exposition bei rund –22°C.
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Die
Horizontalachse, gekennzeichnet mit "Geschätzte kritische Erwärmungsgeschwindigkeit" stellt die Erwärmungsgeschwindigkeit
dar, die benötigt
wird, um mehr als 0,2 % der Masse der Lösung während der Erwärmung vor
dem Kristallisieren zu bewahren. Dieser Kristallisationsgrad wird
in den meisten biologischen Systemen für akzeptabel gehalten. Das
Wählen
der Erwärmungsgeschwindigkeit,
die den Eisbildungsgrad auf diesen Stand bringt, liefert einen Standard
zum Vergleichen der Stabilitäten
aller Lösungen.
Je niedriger die Erwärmungsgeschwindigkeit
in 3 ist, desto stabiler ist die Lösung während der
Wiedererwärmung
(Entglasung) gegen Eisbildung. Die kritische Erwärmungsgeschwindigkeit wurde
durch Abkühlen
kleiner Proben (~10–70 mg) mit 100°C/min auf
unter –130°C und dann
deren dreifaches Erwärmen
mit mehreren festgelegten Erwärmungsgeschwindigkeiten
bestimmt. Die während
der Entglasung abgegebene Wärme
wurde unter Verwendung eines Differentialscanning-Kalorimeters aufgezeichnet
und über
jede Dreierbestimmungsgruppe gemittelt, und diese Durchschnitte
wurden gegen die Erwärmungsgeschwindigkeit
aufgetragen. Die Daten wurden unter Verwendung von Interpolationsroutinen
angepasst und die erforderliche Erwärmungsgeschwindigkeit zur Erzeugung
einer kanonischen abgegebenen Wärme
von 0,67 J/g Lösung
gemäß der Interpolation
als kritische Erwärmungsgeschwindigkeit
gewählt
(ein Gramm Wasser setzt beim Gefrieren 80 cal oder 335 J Wärme frei.
Deshalb wurde die kritische Wärmeentwicklung
als 335 J × 0,002
= 0,67 J festgelegt).
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Die
erwünschten
Merkmale von Verglasungslösungen
sind hohe Stabilität
und fehlende Toxizität.
Die Standardlösung
VS41A wurde entweder in den Trägern
Eurocolline (Raute ganz links) oder RPS-2 (übrige Rauten) untersucht, wobei
die Ergebnisse in dem Kasten in der unteren rechten Ecke von 3 gezeigt
sind. VS41A, das unter Verwendung der älteren Trägerlösungen exponiert wurde, weist
eine relativ niedrige Stabilität
(hohe kritische Erwärmungsgeschwindigkeit)
und hohe Toxizität
(relativ niedriges K/Na-Verhältnis)
auf.
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Mit
Blick auf die grauen Quadrate in dem Diagramm und die in LM5 präparierten
groben Äquivalente (graue
Dreiecke) bestätigt
sich der in der Patentanmeldung 09/400,793, eingereicht am 21. September
1999, festgestellte Verlauf, dass nämlich eine Tendenz besteht,
dass K/Na niedriger ist, wenn die kritische Erwärmungsgeschwindigkeit niedriger
wird. Es ist ersichtlich, dass die zwei Lösungen, die LM5 erhalten, bezogen auf
ihre Unterstützung
der Lebensfähigkeit
bei ihren jeweiligen Stabilitäten
eine absolut zufriedenstellende Leistung aufweisen, obwohl keine
direkten Vergleiche an diesen in anderen Trägern vorbereiteten exakten
Lösungen
vorgenommen wurden.
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Zuvor
nicht beschriebene Lösungen
von extremer Stabilität
und Nichttoxizität
sind in dem Kasten in der oberen linken Ecke der Figur enthalten.
Sieben von neun solcher Lösungen
wurden in LM5 vorbereitet und alle mit Expositionszeiten von 20
bis 40 min analysiert. Die schwarzen Kreise in dem Kasten zeigen
einen Verlauf (Verlaufslinie 2) ähnlich
dem für
die zuvor offenbarten Lösungen
gezeigten (Verlaufslinie 1), dass nämlich einem Verlauf zu einem
niedrigeren K/Na-Verhältnis
hin größere Stabilität zugeordnet
ist, aber die Verlaufslinie 2 deutlich oberhalb und links von der
zuvor erörterten
Verlaufslinie 1 liegt, eine hocherwünschte Verbesserung.
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Auf
den Fall einer 20-minütigen
Exposition bei 0°C
oder einer 30-min-Exposition bei –22°C (leere Punkte) trifft kein
solcher Verlauf zu: Eine Wiedergewinnung von 95 % der Aktivität unbehandelter
Kontrollscheiben kann selbst bei Verglasungslösungen erhalten werden, die
bei Wiedererwärmung
mit Geschwindigkeiten von gerade einmal 2,9°C/min stabil sind, eine erstaunliche
Verbesserung.
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Tabelle
2 listet die Zusammensetzung, biologische Wirkung und Stabilität jeder
der Versuchslösungen auf,
die LM5 enthalten. RPS-2 enthält
180 mM Glucose als Hauptkomponente sowie 7,2 mM K2HPO4, 1 mM CaCl2, 2
mM MgCl2, 5 mM reduziertes Glutathion, 28,2
mM KCl, 10 mM NaHCO3 und 1 mM Adenin-HCl.
LM5 enthält
90 mM Glucose, 45 mM Lactose, 45 mM Mannitol, 7,2 mM K2HPO4, 1 mM CaCl2, 2
mM MgCl2, 5 mM reduziertes Glutathion, 28,2
mM KCl, 10 mM NaHCO3 und 1 mM Adenin-HCl
(die 180 mM Glucose in RPS-2 sind in LM5 durch 90 mM Glucose plus
45 mM Lactose plus 45 mM Mannitol ersetzt).
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Tabelle
2 listet ferner einige Ergebnisse nach Abkühlen der Scheiben auf –110°C oder darunter
bei einigen der vorteilhaftesten Lösungen auf und zeigt einen
noch nicht dagewesenen Erfolg nach der Verglasung von Nierengewebe.
Die Formeln, welche die besten Ergebnisse nach der Verglasung ergaben,
wiesen nicht eindringende Lösungskomponenten-(LM5
plus Polymere)-Spannungen von insgesamt 1,5-mal isotonisch auf. Ein
zweckmäßiger Spannungsbereich
für Verglasungslösungen ist
1,1 bis 2,0-mal isotonisch oder günstiger 1,2 bis 2,0-mal isotonisch
oder günstiger
1,2 bis 1,5-mal isotonisch. Obwohl in Tabelle 2 nicht eingeschlossen, wird
erwartet, dass die durch die grauen und weißen Quadrate in 1 in
dem Kasten in der oberen linken Ecke dargestellten Lösungen in
Zusammensetzung mit einer LM5-Trägerlösung sogar
stabiler und nicht mehr toxisch sind, weil diese Lösungen einen
RPS-2-Träger
enthielten, der die Wirkungskraft des Antinukleators in der Lösung begrenzt.
Tabelle 3 stellt die expliziten Zusammensetzungen der Lösungen gemäß Tabelle
1 zur Verfügung.
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Zum
Analysieren von LM5 als Spül-
und Aufbewahrungslösung
für Kaninchennieren
wurden ungefähr acht
Kaninchennieren mit LM5 gespült
und fünf
Stunden auf Eis gelagert und dann transplantiert. Bis auf zwei Fälle, in
denen das Creatinin aus nicht klar auf Probleme bei der Konservierung
bezogenen Gründen
plötzlich hochschnellte
und dann plötzlich
abfiel, funktionierten alle Nieren nach der Transplantation gut,
was nahe legt, dass LM5 nicht nur mit Perfusion sondern auch mit
kühler
Lagerung ohne Perfusion, wie vor und nach Kryokonservierung, kompatibel
ist.
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Zusammengefasst
wird von Lösungen
berichtet, die Toxizität,
Kühlungsschädigung und
Entglasung minimieren. In voller Stärke verwendet sind diese Lösungen von
besonderer Bedeutung für
die Kryokonservierung größerer (ebender
Systeme, wie z. B. Organe und technisch hergestellte Gewebe und
biokünstliche
Organe, bei denen rasches Abkühlen
und Erwärmen
schwierig oder unmöglich
ist. Viele lebende Systeme und einige technisch hergestellte Gewebe
und biokünstliche
Organe sind jedoch imstande, mit höheren Geschwindigkeiten als
den hierin erörterten
abgekühlt
und erwärmt
zu werden oder sind imstande, nach stärkerer Eisbildung als hierin
erörtert
zu überleben.
Bei diesen Systemen können
auch geeignete Verdünnungen
der aufgelisteten Formeln wirksam verwendet werden und vorteilhafter
sein als die Vollstärkeversionen.
Die Verwendung von Verdünnungen
von etablierten Verglasungslösungen
wird beispielsweise in Rall, W.F. und Fahy, G.M., Nature, 313:573–575, 1985,
gelehrt. Folglich werden moderate Verdünnungen der vorliegend offenbarten
Formeln als äquivalent
zu den hierin beschriebenen Ausführungsformen
und unter deren Schutzbereich fallend angesehen.