DE60115461T2

DE60115461T2 - Trägerlösung für verglasbare konzentrationen von gefrierschutzmitteln und gefrierschutzmittel-mischungen

Info

Publication number: DE60115461T2
Application number: DE60115461T
Authority: DE
Inventors: M. Gregory FAHY; Brian Wowk
Original assignee: 21st Century Medicine Inc
Current assignee: 21st Century Medicine Inc
Priority date: 2000-07-31
Filing date: 2001-07-30
Publication date: 2006-06-08
Anticipated expiration: 2021-07-31
Also published as: EP1311155A2; AU2001288229A1; US6869757B2; DE60115461D1; US20050153272A1; WO2002009516A3; CA2388544A1; US7741018B2; US20020076687A1; CA2388544C; WO2002009516A2; EP1311155B1; ATE311104T1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung bezieht sich allgemein auf das Gebiet der Kryokonservierung. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf äußerst stabile Verglasungslösungen von geringer Toxizität und Trägerlösungen, die Lactose und Mannitol umfassen. Derartige Konservierungslösungen sind in der WO 97/47 192 offenbart.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Damit Verglasungslösungen biologisch anwendbar sind, müssen die Gefrierschutzmittel, welche die Verglasungslösung umfassen, in einer "Träger"- oder "Vehikel"-Lösung enthalten sein, die dazu verwendet wird, osmotische und physiologische Unterstützung für lebende Systeme in An- und Abwesenheit der Gefrierschutzmittel bereitzustellen. Es ist jedoch auf diesem Fachgebiet hinlänglich bekannt, dass die Wirkungskraft von Trägerlösungen für Gefrierschutzmittel nicht vorhersehbar ist und dass die beste Trägerlösung für ein Gefrierschutzmittel oder eine Gefrierschutzmittel-Mischung eine andere sein kann als die beste Trägerlösung für ein anderes Gefrierschutzmittel oder eine andere Gefrierschutzmittel-Mischung.
Wie von Fahy et al. in der US-Patentanmeldung Nr. 09/400,793, eingereicht am 21. September 1999, offenbart, hemmt Glucose die Einwirkung des "Eisblocker"(Antinukleierungs-)Mitteis des Polyvinylalkoholtyps. Dies macht (190 mM Glucose enthaltende) Eurocolline-Lösung oder (180 mM Glucose enthaltendes) RPS-2 suboptimal zur Verwendung mit derartigen Antinukleierungsmitteln. Jedoch ist der Einschluss solcher Mittel, wofür das allertypischste Beispiel ein Produkt namens "X1000" ist, das im Handel von der Firma 21^st Century Medicine, Rancho Cucamonga, California 91730 erhältlich ist, hoch erwünscht. Mehrere alternative Trägerlösungen wurden von Fahy et al. in der US-Patentanmeldung Nr. 09/400,793, eingereicht am 21. September 1999 (durch Querverweis hierin aufgenommen), offenbart, wie z. B. MHP-2, GHP-2 und RPS-T. Keine davon war jedoch ganz zufriedenstellend. Diese anderen Träger stellten eine schlechtere Erholung von in Anwesenheit verglasbarer Gefrierschutzmittel-Konzentrationen darin bewahrten Geweben bereit als RPS-2 oder sind unerschwinglich teuer (RPS-T) und können dabei auch weniger biologisch akzeptabel sein als RPS-2.
Die Schwierigkeiten, keine vollendete Trägerlösung zu haben, werden vervielfacht, wenn die Aufgabe darin besteht, massive Strukturen, wie z. B. natürliche Organe oder technisch hergestellte Gewebeprodukte, wie z. B. künstliche Organe oder Gewebe, zu verglasen. Die einzige relevante Erfahrung, die auf diesem Fachgebiet bekannt ist, ist die Verwendung von entweder RPS-2 (Fahy und Ali, Cryobiology, 35:114–131, 1997) oder von Eurocolline-Lösung (Khirabadi und Fahy, Transplantation 70: 51–57, 2000; Khirabadi und Fahy, Cryobiology 31: 10–25, 1994; Arnaud, Fahy und Khirabadi, Cryobiology 35:358, 1997 und ein 2001 zur Veröffentlichung vorgelegtes Papier) für die Perfusion von Kaninchennieren mit einer Verglasungslösung namens VS4 (Formel in diesen Entgegenhaltungen definiert). Ohne die Fähigkeit, entweder Eurocolline oder RPS-2 als Trägerlösung zu verwenden, ist der Praktiker nicht imstande, sich bei der Wahl einer Trägerlösung zur Verwendung auf den Stand der Technik zu verlassen, insbesondere bei dem gegebenen extremen Wunsch nach Verwendung einer anderen Verglasungslösung als VS4 oder deren konzentrierteres Derivat VS41A (Formel beispielsweise veröffentlicht bei G.M. Fahy et al., Kapitel 20, in "Cell Biology of Trauma" (Hrsg. J.J. Lemasters und C. Oliver), CRC Press, Boca Raton, FL, 1995, S. 333–356). Dieses Fehlen einer geeigneten Trägerlösung ist ein Haupthindernis bei der Anwendung von Verglasung auf ganze Organe und technisch hergestellte Systeme. Dies bewahrheitet sich insbesondere, wenn man die Potentialdifferentialantwort des Organparenchyms und des Organgefäßsystems auf eine bestimmte ungeprüfte Kombination aus Gefrierschutzmitteln und Trägerlösung betrachtet.
WESEN DER ERFINDUNG
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine geeignete Trägerlösung zur Verwendung mit neueren Verglasungslösungen zu beschreiben und Verglasungslösungen zu zeigen, die in Anwesenheit dieser neuen Trägerlösung überraschend wirksam sind. Es ist eine weitere Aufgabe, eine Trägerlösung bereitzustellen, die sowohl bei Verwendung mit separierten Gewebescheiben als auch mit ganzen Organen und bei vielerlei Verglasungslösungen der neueren Generation vollendete Ergebnisse liefert.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Ergebnisse einer Nierenperfusion mit einer eine Kombination aus Mannitol und Lactose enthaltenden Lösung (LM5).
2 zeigt die Erholung von Kaninchen-Nierenrindenscheiben, nachdem sie bei ca. –22°C verschiedenartigen Verglasungslösungen in Anwesenheit einer Lactose und Mannitol enthaltenden Trägerlösung ausgesetzt waren.
3 zeigt ein Lebensfähigkeit/Stabilität-Diagramm für 16 beispielhafte Verglasungslösungen, darunter sowohl die zuvor beschriebenen Lösungen als auch neue Varianten von außergewöhnlicher Wirkungskraft, von denen die meisten in einer Lactose und Mannitol umfassenden Trägerlösung enthalten sind.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, überraschend wirksame Verglasungslösungen zu beschreiben. Diese Lösungen wurden alle durch praktische Umsetzung der Erfindung hergeleitet, die in der US-Anmeldung Nr. 09/400,793, "Improved Cryoprotectant Solutions", eingereicht am 21. September 1999 von G.M. Fahy und B. Wowk beschrieben sind oder durch Folgen dieser Lehren plus der Lehren in einer verwandten US-Patentanmeldung mit dem Titel "Hypertonic Reduction of Cooling Injury" von G.M. Fahy, eingereicht am 25. Juli 2001. Jedoch waren die hierin beschriebenen Lösungen so außergewöhnlich wirksam, dass ihre Effektivität basierend auf den Lehren dieser zitierten Patentanmeldungen allein nicht vorhersehbar war. In der Tat konnten diese Lösungen nicht hergeleitet und ihr Wert ohne die Entwicklung eines anderen Werkzeugs nicht richtig eingeschätzt werden, das zum Zeitpunkt seiner Erfindung für unmöglich gehalten wurde. Dieses Werkzeug ist das Lebensfähigkeit/Stabilität-Diagramm.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue Verglasungslösungsvariationen zu beschreiben, die aufgrund ihrer etwas überraschenden Kombination aus fehlender Toxizität und Stabilität gegen Eisbildung infolge scheinbar geringfügiger Änderungen in der Lösungszusammensetzung außergewöhnlich wirksam sind.
Das Lebensfähigkeit/Stabilität-Diagramm ist eine graphische Darstellung einer Lebensfähigkeitsmessung, die nach einer Gefrierschutzmittellösungsexposition gegenüber der erforderlichen Erwärmungsgeschwindigkeit zur Begrenzung der Entglasung dieser Gefrierschutzmittellösung auf ein erträgliches Maß vorgenommen wird. Das Lebensfähigkeit/Stabilität-Diagramm verbindet eine biologische Messung mit einer physikalischen Messung zur Bildung einer Universalskala zum Einordnen der Effektivität einer Verglasungslösung für ein bestimmtes System. Typischerweise muss die Wirkung der Lösung auf die Lebensfähigkeit nach Kontakt des lebenden Systems mit der Verglasungslösung für eine ausreichend lange Zeitspanne erfolgen, um das lebende System beim anschließenden Kühlen verglasbar zu machen. Des Weiteren muss der zur Messung gewählte Entglasungsgrad praktisch unschädlich für das zu untersuchende System sein, damit das Diagramm Signifikanz für die Vorhersage des Ergebnisses eines Verglasungs- und Wiedererwärmungsversuchs bekommt.
Die zur Unterdrückung der Entglasung erforderliche Erwärmungsgeschwindigkeit wird durch Abkühlen der Verglasungslösung mit einer standardmäßigen, realistischen Geschwindigkeit und dann Wiedererwärmen der verglasten Lösung mit einer Reihe von Erwärmungsgeschwindigkeiten bestimmt. Die während der Entglasung (Entglasung ist Eisbildung während des Erwärmens) freigesetzte Wärme wird unter Verwendung eines Differentialscanning-Kalorimeters quantifiziert und gegen die Erwärmungsgeschwindigkeit aufgetragen. Durch Kurvenanpassung einer solchen Aufzeichnung von Wärmeentwicklung gegen Erwärmungsgeschwindigkeit durch mehrere Punkte für eine gegebene Lösung kann der Schnittpunkt der Kurve mit einem Standardpegel der Wärmeentwicklung bestimmt werden und die Erwärmungsgeschwindigkeit, die diesen Grad der Wärmeentwicklung erzeugt, von der graphischen Darstellung abgelesen werden. Diese Erwärmungsgeschwindigkeit ist die kritische Erwärmungsgeschwindigkeit, die gegen die Lebensfähigkeitsmessung aufgetragen wird, um einen Punkt auf der Lebensfähigkeit/Stabilität-Auftragung zu bilden.
Das Konzept einer Lebensfähigkeit/Stabilität-Auftragung wurde in "Improved Cryoprotectant Solutions", US-Anmeldung Nr. 09/400,793, eingereicht am 21. September 1999, eingeführt, aber die bereitgestellte graphische Darstellung war nur eine Schätzung basierend auf visuellen Beobachtungen makroskopischer Proben. Wenn mehr präzise Stabilitätsdaten für viele der in der Hauptanmeldung aufgeführten Lösungen bestimmt wurden, wurden viel enthüllendere Informationen verfügbar. Diese neuen Informationen gestatteten eine "Feinabstimmung" der Lösung, um die Merkmale, die höherer Lebensfähigkeit zugeordnet wurden, mit den Merkmalen, die höherer Stabilität zugeordnet wurden, zu kombinieren. Als Folge wurden außergewöhnlich wirksame Lösungen hergeleitet, und diese werden hierin bereitgestellt.
Daneben führten jüngste Einblicke in die Rolle von impermeanter Spannung auf die Größe der "Kühlungsschädigung" in Verglasungssystemen, wie in einer US-Patentanmeldung mit dem Titel "Hypertonic Reduction of Chilling Injury", eingereicht am 26. Juli 2001, offenbart, zu den hierin vorgelegten Lösungen, die geringe Toxizität und hohe Stabilität mit außergewöhnlich starkem Schutz vor Kühlschaden verbinden. Die resultierenden Lösungen sind von beispielloser Nützlichkeit für die Kryokonservierung lebender Systeme.
Hierin wird von Lösungen berichtet, die Toxizität, Kühlungsschädigung und Entglasung minimieren. In voller Stärke verwendet sind diese Lösungen von besonderer Bedeutung für die Kryokonservierung größerer lebender Systeme, wie z. B. Organe und technisch hergestellte Gewebe und biokünstliche Organe, bei denen eine rasche Abkühlung und Erwärmung schwierig oder unmöglich ist. Viele lebende Systeme und einige technisch hergestellte Gewebe und biokünstliche Organe sind jedoch imstande, mit höheren Geschwindigkeiten abgekühlt und erwärmt zu werden als die hierin diskutierten oder sind imstande, nach stärkerer Eisbildung zu überleben als hierin erörtert ist. Für diese Systeme können auch geeignete Verdünnungen der aufgelisteten Formeln wirksam verwendet werden und vorteilhafter sein als die Vollstärkeversionen. Die Verwendung von Verdünnungen etablierter Verglasungslösungen wird beispielsweise in Rall, W.F. und Fahy, G.M., Nature, 313:573–575, 1985, gelehrt. Folglich werden moderate Verdünnungen der vorliegend offenbarten Formeln als äquivalent und unter den Schutzbereich der offenbarten Erfindung fallend angesehen.
Eine Ausführungsform entspricht mehreren Lösungszusammensetzungen, die gemeinsame physikalische und biologische Eigenschaften aufweisen, insbesondere hohe Stabilität und geringe Toxizität.
Die folgenden Beispiele stellen die Schritte bereit, die zur Formulierung der neuen Trägerlösung und anschließendes Testen dieser Lösungen führten.
BEISPIELE
In Beispiel 1 ist eine neue Trägerlösung offenbart. Beispiel 2 zeigt die Annehmbarkeit des Trägers für ganze Nieren ohne Gefrierschutzmittel, und Beispiel 3 zeigt die Annehmbarkeit des Trägers für ganze Nieren, die Gefrierschutzmittel enthalten. Beispiel 4 stellt Experimente unter Verwendung der Lösung für die Behandlung von Kaninchennieren dar. Beispiel 5 stellt die Ergebnisse zusätzlicher Experimente dar, bei denen Beobachtungen, die an Nierenscheiben und der physikalischen Stabilität der Lösungen gemacht wurden, kombiniert und diese Ergebnisse mit zuvor offenbarten Ergebnissen und der hohen Funktionswiedergewinnung in Nierenscheiben verglichen wurden, die in den neuen LM5-haltigen Lösungen verglast wurden.
BEISPIEL 1
Einige der Gestaltungsschritte, die zur Formulierung der neuen, LM5 genannten Trägerlösung führten, sind wie folgt:
Als Erstes bestand die Notwendigkeit, die Konzentration von Glucose auf ein unbekanntes Ausmaß zu reduzieren, um die Inaktivierung des oben beschriebenen Antinukleatorproduktes X1000 zu verhindern. Zum Zweiten musste die Glucose durch irgendeine andere impermeante Spezies ersetzt werden. Die Impermeantien der hinlänglich bekannten und hinlänglich offenbarten Lösung der Universität von Wisconsin (UW-Lösung, verkauft unter der Handelsmarke VIASPAN) wurden sowohl für biologisch schädlich als auch für unerschwinglich teuer gehalten. Des Weiteren mussten Impermeantien gewählt werden, welche die X1000 inaktivierende Wirkung von Glucose nicht teilten, ein früher unerforschtes Problem. Zudem wurde von Khirabadi et al. berichtet, dass Mannitol, ein nominell inertes Impermeans, sonderbare Gefäßschädigung an der Niere erzeugte, wenn es anstelle von Glucose in einer Trägerlösung für eine Verglasungslösung des Typs VS4 verwendet wurde (Arnaud, Fahy und Khirabadi, Cryobiology 35: 358, 1997). Andere auf diesem Fachgebiet bekannte Impermeantien neigen dazu, beladen zu werden, aber neben anderen Gründen könnten beladene Spezies aufgrund ihrer Fähigkeit, Ionen zu chelieren, schädlich sein, (siehe Fahy, da Mouta et al., 1995, oben angeführt). Sucrose, ein beliebtes Impermeans, wurde aufgrund seiner hohen Viskosität und berichteten Nephrotoxizität als unerwünscht angesehen. Zudem war es erwünscht, Impermeantien zu verwenden, die preiswert und biologisch benigne waren.
Eine andere Gestaltungsüberlegung rührte von der Tatsache her, dass in Verglasungslösungen verwendete Trägerlösungen am besten als Konzentrate hergestellt werden. Typischerweise wird beispielsweise eine fünffach konzentrierte Version einer Trägerlösung vorbereitet. Die Verglasungslösung wird beispielsweise hergestellt durch Zusetzen von einem Fünftel Volumen des Konzentrats in einen Mess- oder Maßbehälter, darauf folgend Zusetzen der Gefrierschutzmittel und beliebiger notwendiger Polymere, und schließlich Bringen des Volumens des Gesamtsystems auf ein Volumen (fünfmal das Konzentratvolumen), um so das Konzentrat in Wasser plus Gefrierschutzmittel zu lösen, um die richtige Konzentration der Trägerlösungskomponenten pro Volumeneinheit zu erzielen. Damit dies möglich ist, müssen die Bestandteile der Trägerlösung löslich sein, wenn sie in Anwesenheit der anderen Bestandteile etwa fünffach konzentriert sind.
Überraschenderweise gibt es kein früheres Beispiel für die Verwendung von Lactose in Organkonservierungslösung oder -perfusat. Das natürliche Vorkommen von Lactose in lebenden Systemen förderte deren Verwendung in RPS-2 anstelle von Glucose, aber es stellte sich heraus, dass sie eine ungenügende Löslichkeit zur Verwendung in Konzentraten aufwies, und ihre Löslichkeit in Anwesenheit von Verglasungslösungen voller Stärke war fraglich.
Wie zuvor angemerkt, wurde der Verwendung von Mannitol als Perfusatkomponente von Khirabadi et al. widersprochen (Cryobiology 35: 357, 1997), die herausfanden, dass es schädlich war. Die Verwendung von Mannitol ist auch wegen seiner typischen Verwendung als osmotischer Puffer in Organ-Gefrierschutzmittelperfusionen fraglich (siehe z. B. Kheirabadi und Fahy, 2000 und Fahy und Ali, 1997). Je mehr extrazelluläres Mannitol vorhanden ist, desto größer ist die Wahrscheinlichkeit, dass etwas davon in die Zelle eindringt, wo es dann zurückgehalten wird und anschließend eine schädigende Zellaufquellung bewirkt. Zudem ist Mannitol in Wasser nicht besonders löslich und in Anwesenheit von Gefrierschutzmitteln noch weniger löslich, was seine mögliche Konzentration als osmotischer Puffer beschränkt.
Neben diesen Beschränkungen besteht sowohl bei Mannitol als auch bei Lactose das Problem der Löslichkeit des Mittels bei tiefen Temperaturen unter Null während des Abkühlens auf die und Erwärmens von der Glasübergangstemperatur. Typischerweise können viele Moleküle von marginaler Löslichkeit im Kalten aus der Lösung präzipitieren.
Diese Schwierigkeiten wurden folgendermaßen gelöst: Zunächst wurde bestimmt, dass das Zurückhalten von 90 mM der normalen 180 mM Glucose in RPS-2 hinsichtlich der Kompatibilität mit der Antinukleierungsfähigkeit von X1000 akzeptabel war. Als Nächstes wurde bestimmt, dass die Löslichkeit von Mannitol und die Löslichkeit von Lactose ausgeglichen werden konnte, indem beide in gleichen Konzentrationen von 45 mM verwendet wurden, was eine Gesamtmenge von 90 mM Glucose in RPS-2 ersetzte. Die resultierende Lösung erhielt den Namen LM5. Der Name bezieht sich auf die Verwendung von Lactose und Mannitol als Ersatz für 50 % der Glucose in RPS-2. Eine andere Lösung, LT5, ist ebenfalls wirksam, aber weit teurer als LM5. LT5 besteht aus RPS-2, in dem 45 mM Glucose durch Lactose und 45 mM Glucose durch Trehalose ersetzt wurden. Wie noch gezeigt wird, bleiben bei den Konzentrationen in LM5 sowohl Mannitol als auch Lactose in Anwesenheit von Gefrierschutzmitteln und während des Abkühlens und Erwärmens auf Tieftemperaturen unter Null in Lösung.
Tabellen 2 und 3

*Vorhersage-Ergebnis

Alle Prozente sind in Gewicht/Volumen-Einheiten;
dG = Decaglycerol;
K/Na (40) = K/Na nach Exposition bei 0°C für 40 min;
K/Na (20) = K/Na nach Exposition bei 0°C für 20 min;
K/Na (30) = K/Na nach Exposition bei –22°C für 30–40 min;
SEM = Standardabweichung des Mittelwertes, gewöhnlich für 12 Proben;
Wrcrit = Erwärmungsgeschwindigkeit, welche die Eisbildung während der Erwärmung basierend auf dem Durchschnitt von Doppel- oder Dreifachproben auf nicht mehr als 0,2 % der Probenmasse begrenzt (°C/min).
X1000 ist ein im Handel erhältliches Produkt von 21^st Century Medicine und besteht aus 80 % hydrolisiertem Polyvinylalkohol mit einer relativen durchschnittlichen Molekularmasse von rund 2 Kilodalton oder weniger.
PVP 5.000 ist Polyvinylpyrrolidon mit einer durchschnittlichen relativen Molekularmasse von 5 Kilodalton.
Viele andere auf dem Obigen basierende Formeln sind analysiert und festgestellt worden, dass sie nach Exposition bei –20°C für 20 min 100 % Ertrag des K/Na-Verhältnisses lieferten, aber die kritischen Erwärmungsgeschwindigkeiten für diese Lösungen sind nicht bestimmt worden.

DMSO: Dimethylsulfoxid; Form. = Formamid; EG = Ethylenglycol; alle Prozente = % Gewicht/Volumen; die Spalten DMSO, Form., EG und Acetol beziehen sich auf Konzentrationen von % Gewicht/Volumen.

LM5-Bestandteile sind in dieser Tabelle nicht gezeigt.
BEISPIEL 2
Mehrere Kaninchennieren wurden fünf Stunden lang bei 3,5°C mit LM5 perfundiert. Zudem wurden während dieser Perfusion 1 % G/V X1000, 1 % G/V Decaglycerol und 7 % G/V Polyvinylpyrrolidon der mittleren Molekularmasse 5000 (PVP 5000) derart eingeführt und entfernt, dass die Konzentrationen dieser Substanzen in einer typischen Perfusion mit einer Verglasungslösung simuliert wurden. Die Ergebnisse sind in 1 gezeigt, in der die postoperativen Serumcreatiningehalte gegen den Tag nach der Operation aufgetragen sind, an dem die Probe genommen wurde. Wie ersichtlich, erlitten diese Nieren mit und ohne die Kälteschutzpolymere keine messbare Schädigung infolge Perfusion mit LM5. Deshalb ist LM5 sowohl mit den Gefäß- als auch den Parenchymbestandteilen ganzer Organe kompatibel.
BEISPIEL 3
Als Nächstes wurden mehrere Kaninchennieren in einer LM5-Trägerlösung mit Gefrierschutzmittelkonzentrationen perfundiert, die zur Verglasung bei Umgebungsdrücken ausreichen. Calcium und Magnesium wurden schrittweise entfernt und wieder zugesetzt, während Gefrierschutzmittelkonzentrationen erhöht und dann verringert wurden, um eine Präzipitation dieser Ionen zu vermeiden. Es gab keine Perfusionsprobleme, die irgendeiner Wirkung von LM5 zuzuschreiben waren, und trotz der fehlenden Verwendung von Iloprost wurde bei Transplantation das Überleben und die Lebenserhaltung seitens dieser perfundierten Nieren erreicht. Eine Organvorbehandlung mit Iloprost in vivo ist traditionell obligatorisch zum Erreichen des Überlebens, wenn Kaninchennieren mit Konzentrationen von Gefrierschutzmitteln perfundiert werden, die bei Umgebungsdruck verglasen können. Diese Ergebnisse zeigten auf, dass LM5 durch Gefäßperfusion mit der Lieferung verglasbarer Konzentrationen einer äußerst fortschrittlichen Gefrierschutzmittelformel kompatibel ist.
BEISPIEL 4
Als Nächstes wurden Nierenscheiben einer breiten Vielfalt von Gefrierschutzmittellösungen in LM5 ausgesetzt. LM5 erwies sich als geeignet zur Verwendung in Anwesenheit von verglasbaren Konzentrationen von Gefrierschutzmittel. Ein besonderes Beispiel ist in 2 gezeigt, worin in fünf Verglasungslösungsvariationen nach 20 min Behandlung bei 0°C etwa 100 % Erholung des Scheiben-K/Na-Verhältnisses erreicht wurden. Die Einzelheiten dieser Lösungen und die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben.
Tabelle 1: Zusammensetzungen von Lösungen

EG = Ethylenglycol; F = Formamid; D = Dimethylsulfoxid; alle Prozentangaben in der Tabelle sind in % Gewicht/Volumen.

Dies war das Experiment 00-035.
Die Motivation zur Herstellung von LM5 war es sicherzustellen, dass Eisblocker mit ganzer Effektivität verwendet werden konnten, um die Stabilität von Verglasungslösungen gegen Eisbildung aufrechtzuerhalten. Um den Erfolg von LM5 als Träger für hochstabile Lösungen zu untersuchen, die sich umfassend sowohl auf X1000 als auch auf Polyglycerin als Eisblocker verlassen, wurde die Stabilität mehrerer Lösungen unter Verwendung eines Differentialscanning-Kalorimeters gemessen, wie vor- und nachstehend beschrieben, und dieselben Lösungen wurden unter vielerlei Prüfbedingungen auf ihre Wirkung auf die Scheibenlebensfähigkeit analysiert. Diese Daten wurden dann in der in 3 gezeigten Lebensfähigkeit/Stabilität-Kurve zusammengetragen.
3 gibt Lebensfähigkeitsdaten an, die durch das K/Na-Verhältnis von Kaninchen-Nierenrindenscheiben dargestellt sind, die den 16 Verglasungslösungen ausgesetzt wurden, welche anschließend ausgewaschen wurden, gefolgt von Inkubation in Cross-Taggart-Lösung mit kontinuierlicher Sauerstoffanreicherung für 90 min. Das K/Na-Verhältnis wurde gemessen, wie in der wissenschaftlichen Literatur angegeben.
Die Kreise und Sechsecke in 3 stellen Lösungen dar, deren genaue Zusammensetzungen zuvor noch nicht offenbart wurden. Die Dreiecke stellen Lösungen dar, die praktisch äquivalent zu früher offenbarten Lösungen sind, aber eine LM5-Trägerlösung enthalten. Die Quadrate und Rauten stellen Lösungen dar, die zuvor in "Improved Cryoprotectant Solutions", US-Anmeldung Nr. 09/400,793, eingereicht am 21. September 1999, offenbart wurden (hierin durch Querverweis aufgenommen). Alle zuvor nicht offenbarten Zusammensetzungen enthalten eine LM5-Trägerlösung.
Leere Kreise stellen das K/Na-Verhältnis nach einer Gesamtexpositionszeit von 20 min bei 0°C dar. Graue und schwarze Kreise und andere Punkte stellen die K/Na-Verhältnisse nach 40 min Exposition bei dieser Temperatur dar. Im Falle der Sechsecke zeigen Sechsecke mit einer Mittelmarkierung die K/Na-Verhältnisse nach 30 min Exposition bei 0°C, und Sechsecke ohne eine Markierung in der Mitte zeigen die K/Na-Verhältnisse nach 30 min Exposition bei rund –22°C.
Die Horizontalachse, gekennzeichnet mit "Geschätzte kritische Erwärmungsgeschwindigkeit" stellt die Erwärmungsgeschwindigkeit dar, die benötigt wird, um mehr als 0,2 % der Masse der Lösung während der Erwärmung vor dem Kristallisieren zu bewahren. Dieser Kristallisationsgrad wird in den meisten biologischen Systemen für akzeptabel gehalten. Das Wählen der Erwärmungsgeschwindigkeit, die den Eisbildungsgrad auf diesen Stand bringt, liefert einen Standard zum Vergleichen der Stabilitäten aller Lösungen. Je niedriger die Erwärmungsgeschwindigkeit in 3 ist, desto stabiler ist die Lösung während der Wiedererwärmung (Entglasung) gegen Eisbildung. Die kritische Erwärmungsgeschwindigkeit wurde durch Abkühlen kleiner Proben (^~10–70 mg) mit 100°C/min auf unter –130°C und dann deren dreifaches Erwärmen mit mehreren festgelegten Erwärmungsgeschwindigkeiten bestimmt. Die während der Entglasung abgegebene Wärme wurde unter Verwendung eines Differentialscanning-Kalorimeters aufgezeichnet und über jede Dreierbestimmungsgruppe gemittelt, und diese Durchschnitte wurden gegen die Erwärmungsgeschwindigkeit aufgetragen. Die Daten wurden unter Verwendung von Interpolationsroutinen angepasst und die erforderliche Erwärmungsgeschwindigkeit zur Erzeugung einer kanonischen abgegebenen Wärme von 0,67 J/g Lösung gemäß der Interpolation als kritische Erwärmungsgeschwindigkeit gewählt (ein Gramm Wasser setzt beim Gefrieren 80 cal oder 335 J Wärme frei. Deshalb wurde die kritische Wärmeentwicklung als 335 J × 0,002 = 0,67 J festgelegt).
Die erwünschten Merkmale von Verglasungslösungen sind hohe Stabilität und fehlende Toxizität. Die Standardlösung VS41A wurde entweder in den Trägern Eurocolline (Raute ganz links) oder RPS-2 (übrige Rauten) untersucht, wobei die Ergebnisse in dem Kasten in der unteren rechten Ecke von 3 gezeigt sind. VS41A, das unter Verwendung der älteren Trägerlösungen exponiert wurde, weist eine relativ niedrige Stabilität (hohe kritische Erwärmungsgeschwindigkeit) und hohe Toxizität (relativ niedriges K/Na-Verhältnis) auf.
Mit Blick auf die grauen Quadrate in dem Diagramm und die in LM5 präparierten groben Äquivalente (graue Dreiecke) bestätigt sich der in der Patentanmeldung 09/400,793, eingereicht am 21. September 1999, festgestellte Verlauf, dass nämlich eine Tendenz besteht, dass K/Na niedriger ist, wenn die kritische Erwärmungsgeschwindigkeit niedriger wird. Es ist ersichtlich, dass die zwei Lösungen, die LM5 erhalten, bezogen auf ihre Unterstützung der Lebensfähigkeit bei ihren jeweiligen Stabilitäten eine absolut zufriedenstellende Leistung aufweisen, obwohl keine direkten Vergleiche an diesen in anderen Trägern vorbereiteten exakten Lösungen vorgenommen wurden.
Zuvor nicht beschriebene Lösungen von extremer Stabilität und Nichttoxizität sind in dem Kasten in der oberen linken Ecke der Figur enthalten. Sieben von neun solcher Lösungen wurden in LM5 vorbereitet und alle mit Expositionszeiten von 20 bis 40 min analysiert. Die schwarzen Kreise in dem Kasten zeigen einen Verlauf (Verlaufslinie 2) ähnlich dem für die zuvor offenbarten Lösungen gezeigten (Verlaufslinie 1), dass nämlich einem Verlauf zu einem niedrigeren K/Na-Verhältnis hin größere Stabilität zugeordnet ist, aber die Verlaufslinie 2 deutlich oberhalb und links von der zuvor erörterten Verlaufslinie 1 liegt, eine hocherwünschte Verbesserung.
Auf den Fall einer 20-minütigen Exposition bei 0°C oder einer 30-min-Exposition bei –22°C (leere Punkte) trifft kein solcher Verlauf zu: Eine Wiedergewinnung von 95 % der Aktivität unbehandelter Kontrollscheiben kann selbst bei Verglasungslösungen erhalten werden, die bei Wiedererwärmung mit Geschwindigkeiten von gerade einmal 2,9°C/min stabil sind, eine erstaunliche Verbesserung.
Tabelle 2 listet die Zusammensetzung, biologische Wirkung und Stabilität jeder der Versuchslösungen auf, die LM5 enthalten. RPS-2 enthält 180 mM Glucose als Hauptkomponente sowie 7,2 mM K₂HPO₄, 1 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂, 5 mM reduziertes Glutathion, 28,2 mM KCl, 10 mM NaHCO₃ und 1 mM Adenin-HCl. LM5 enthält 90 mM Glucose, 45 mM Lactose, 45 mM Mannitol, 7,2 mM K₂HPO₄, 1 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂, 5 mM reduziertes Glutathion, 28,2 mM KCl, 10 mM NaHCO₃ und 1 mM Adenin-HCl (die 180 mM Glucose in RPS-2 sind in LM5 durch 90 mM Glucose plus 45 mM Lactose plus 45 mM Mannitol ersetzt).
Tabelle 2 listet ferner einige Ergebnisse nach Abkühlen der Scheiben auf –110°C oder darunter bei einigen der vorteilhaftesten Lösungen auf und zeigt einen noch nicht dagewesenen Erfolg nach der Verglasung von Nierengewebe. Die Formeln, welche die besten Ergebnisse nach der Verglasung ergaben, wiesen nicht eindringende Lösungskomponenten-(LM5 plus Polymere)-Spannungen von insgesamt 1,5-mal isotonisch auf. Ein zweckmäßiger Spannungsbereich für Verglasungslösungen ist 1,1 bis 2,0-mal isotonisch oder günstiger 1,2 bis 2,0-mal isotonisch oder günstiger 1,2 bis 1,5-mal isotonisch. Obwohl in Tabelle 2 nicht eingeschlossen, wird erwartet, dass die durch die grauen und weißen Quadrate in 1 in dem Kasten in der oberen linken Ecke dargestellten Lösungen in Zusammensetzung mit einer LM5-Trägerlösung sogar stabiler und nicht mehr toxisch sind, weil diese Lösungen einen RPS-2-Träger enthielten, der die Wirkungskraft des Antinukleators in der Lösung begrenzt. Tabelle 3 stellt die expliziten Zusammensetzungen der Lösungen gemäß Tabelle 1 zur Verfügung.
Zum Analysieren von LM5 als Spül- und Aufbewahrungslösung für Kaninchennieren wurden ungefähr acht Kaninchennieren mit LM5 gespült und fünf Stunden auf Eis gelagert und dann transplantiert. Bis auf zwei Fälle, in denen das Creatinin aus nicht klar auf Probleme bei der Konservierung bezogenen Gründen plötzlich hochschnellte und dann plötzlich abfiel, funktionierten alle Nieren nach der Transplantation gut, was nahe legt, dass LM5 nicht nur mit Perfusion sondern auch mit kühler Lagerung ohne Perfusion, wie vor und nach Kryokonservierung, kompatibel ist.
Zusammengefasst wird von Lösungen berichtet, die Toxizität, Kühlungsschädigung und Entglasung minimieren. In voller Stärke verwendet sind diese Lösungen von besonderer Bedeutung für die Kryokonservierung größerer (ebender Systeme, wie z. B. Organe und technisch hergestellte Gewebe und biokünstliche Organe, bei denen rasches Abkühlen und Erwärmen schwierig oder unmöglich ist. Viele lebende Systeme und einige technisch hergestellte Gewebe und biokünstliche Organe sind jedoch imstande, mit höheren Geschwindigkeiten als den hierin erörterten abgekühlt und erwärmt zu werden oder sind imstande, nach stärkerer Eisbildung als hierin erörtert zu überleben. Bei diesen Systemen können auch geeignete Verdünnungen der aufgelisteten Formeln wirksam verwendet werden und vorteilhafter sein als die Vollstärkeversionen. Die Verwendung von Verdünnungen von etablierten Verglasungslösungen wird beispielsweise in Rall, W.F. und Fahy, G.M., Nature, 313:573–575, 1985, gelehrt. Folglich werden moderate Verdünnungen der vorliegend offenbarten Formeln als äquivalent zu den hierin beschriebenen Ausführungsformen und unter deren Schutzbereich fallend angesehen.

Claims

Lösung für die Konservierung lebender Systeme, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung Mannitol und Lactose in Kombination mit einer verglasbaren Konzentration von Gefrierschutzmittel umfasst.
Lösung nach Anspruch 1, worin das Gefrierschutzmittel Dimethylsulfoxid, Formamid und Ethylenglycol umfasst.
Lösung nach Anspruch 1, worin das Gefrierschutzmittel ferner Polyvinylalkohol oder ein Copolymer von Vinylalkohol und Vinylacetat umfasst.
Lösung nach Anspruch 3, worin der Polyvinylalkoholanteil 80 % des Copolymers beträgt.
Lösung nach Anspruch 1, worin das Gefrierschutzmittel ferner Polyglycerin umfasst.
Lösung nach Anspruch 1, worin das Gefrierschutzmittel nicht eindringende Bestandteile umfasst, die die Trägerlösung oder die Trägerlösung plus zusätzliche Impermeantien umfassen, und worin die nicht eindringenden Bestandteile 1,2 bis 1,5-mal isotonisch ausmachen.
Verwendung einer Mannitol und Lactose umfassenden Lösung für das Einbringen und Auswaschen verglasbarer Konzentrationen von Gefrierschutzmitteln, die zur Kryokonservierung lebender Systeme verwendet werden.