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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren für die Identifizierung und/oder
die Quantifizierung einer oder mehrerer in einer Probe vorhandener
Nukleotidzielsequenzen bereit, das deren Unterscheidung von homologen
Sequenzen ermöglicht,
vor allem die Identifizierung und Quantifizierung bestimmter Arten
von Mikroorganismen, die zur selben Familie gehören, oder für den Nachweis und/oder die
Quantifizierung verschiedener Isotypen einer allgemeinen Sequenz,
die zu einem bestimmten Organismus gehört (einschließlich Sequenzen
mit Einzelnukleotidpolymorphismen).
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG UND STAND DER TECHNIK
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Biochips,
die mit vielen spezifischen Bindungs- oder Capture-Nukleotidsequenzen hergestellt
sind, sind gut geeignete Hilfsmittel, um eine Unterscheidung zwischen
entsprechenden verschiedenen homologen Nukleotidsequenzen durchzuführen, die
in einer Probe nachzuweisen sind.
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Es
bestehen allerdings Unterschiede in einem Mikroorganismus oder zwischen
Mikroorganismen, die sich nur durch eine Base der DNA- oder RNA-Sequenz
unterscheiden. Da diese Sequenzen sehr ähnlich sind, kann zwischen
einer bestimmten Nukleotidzielsequenz und verschiedenen Capture-Nukleotidsequenzen,
an die sie binden kann, eine Kreuzreaktion auftreten.
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Die
Biochips-Technologie, welche die Hybridisierung und den Nachweis
einer oder mehrerer Nukleotidzielsequenzen durch Verkleinerung ermöglicht,
ist aufgrund der hohen Anzahl der auf dem Biochip gebundenen Capture-Nukleotidsequenzen
ein nützliches
Hilfsmittel für
den Nachweis (die Unterscheidung) zwischen einer oder mehreren Nukleotidzielsequenzen.
Sie erlaubt auch den Nachweis eines Genexpressionsmusters eines
Gewebes, das erhalten wird, indem mRNA in cDNA kopiert und diese
auf Biochips mit zu diesen Sequenzen komplementären Capture-Nukleotidsequenzen
hybridisiert wird. Da sich die cDNA-Sequenzen voneinander unterscheiden,
ist der Grad der Kreuzreaktionen gering, wobei die Capture-Nukleotidsequenzen
aus einer aus dem Gewebe klonierten cDNA-Bank konstruiert sind (und
ziemlich lange Sequenzen sind) und die Rate und der Ertrag der Hybridisierung
hoch sind.
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Wenn
kleine Capture-Nukleotidsequenzen verwendet werden, ist der Hybridisierungsgrad
eher gering, außer
wenn die Zielsequenzen in kleinere Stücke geschnitten werden. In
Lösung
ist die Geschwindigkeit der Hybridisierung proportional zur Quadratwurzel
der Stranglänge,
wobei die Kürze
limitierend ist (Wetmur, J. G., Biopolymers 10, 601 (1971); Anderson
et Young in „Nucleic
acid and hybridisation",
IRL Press, Hames, B. and Higgins, S. Hrsg., 73–111, Oxford-Washington DC (1985)).
Wenn die Reaktion auf einer festen Fläche durchgeführt wird,
ist der Einfluss der Länge
der Capture-Nukleotidsequenzen noch größer als in Lösung, so
dass der Unterschied zwischen der Fixierungsgeschwindigkeit einer
bestimmten DNA-Zielsequenz auf kleinen oder langen Capture-Nukleotidsequenzen
sehr groß ist.
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Der
Nachweis von DNA-Nukleotidzielsequenzen ist noch schwieriger, da
die DNA zunächst
amplifiziert werden muss (in der Regel durch PCR). Amplikons sind
doppelsträngige
DNA und neigen dazu, in Lösung zu
reassoziieren und nicht mit Capture-Nukleotidsequenzen zu hybridisieren,
die an die feste Fläche
gebunden sind (WO98/11253). Dieser Effekt ist außerdem direkt von der Länge der
Capture-Nukleotidsequenzen abhängig,
und kleine Capture-Nukleotidsequenzen führen zu einem Mangel an Empfindlichkeit.
Es ist möglich,
die DNA unspezifisch in Stücke
zu schneiden (in Anbetracht der großen Anzahl von Sequenzen, die
auf Chips analysiert werden). Es ist auch möglich, so viele Capture- Nukleotidsequenzen
wie möglich
auf einer Oberfläche
des festen Trägers
zu binden, um den Ertrag der Reaktion zu beeinflussen, aber die
Konzentration, die gebunden werden kann, ist beschränkt. Schließlich ist
die Auswahl der Sequenzen wichtig, da manche Sequenzen selbst bei
gleicher Länge
einen höheren
Hybridisierungsertrag liefern als Andere (Bildung einer Sekundärstruktur,
die den ersten Schritt, der zur Bildung eines Doppelstrangs führt, begünstigen
oder beschleunigen kann).
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Deshalb
sind Capture-Nukleotidsequenzen mittlerer Länge, die noch einen guten Hybridisierungsertrag
liefern, während
sie den Nachweis homologer Zielsequenzen ermöglichen, als Kompromiss vorgeschlagen
worden.
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Kleine
Capture-Nukleotidsequenzen erlauben jedoch die Unterscheidung zwischen
Sequenzen, die sich nur in einer Base unterscheiden. Eine Anwendung
dieser Anordnungen, die kleine Capture-Nukleotidsequenzen tragen,
ist die Identifizierung von Sequenzen mit Einzelnukleotidpolymorphismen
(Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs) (WO98/56954).
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Die
Patentanmeldung WO93/25563 beschreibt ein Verfahren zum Unterscheiden
zwischen Sequenzen, die sich voneinander lediglich in einem einzigen
Nukleotid unterscheiden, durch Verwendung eines PCR-Amplifizierungsverfahrens
mit speziellem Primerdesign. Die Sequenz des Primers ist aus zwei
Abschnitten zusammen gesetzt, der 3'-Abschnitt ist für die gewünschte Nukleotidzielsequenz
spezifisch und der 5'-Abschnitt ist zu
einer vorselektierten Nukleinsäuresequenz
komplementär,
die vorzugsweise an einen festen Träger als ein Bestandteil eines
Rasters mit einer Gruppe von Sequenzen gebunden ist. Einer Hybridisierung
des Primers an seine Zielsequenz folgt ein Verlängerungsschritt. Die Verlängerung
des 3'-Abschnitts
des Primers mit einem markierten Desoxynukleotidtriphosphat ergibt
ein markiertes Verlängerungsprodukt,
wenn die Vorlage die richtige Zielsequenz enthält, aber nur dann. Das markierte
Verlängerungsprodukt
wird durch Hybridisierung des 5'-Abschnitts
der vorselektierten Sequenz und nicht durch einen für das Ziel
spezifischen Sequenzabschnitt nachgewiesen.
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Von
Armour et al. (Nucl. Ac. Res. 28, 605–609, 2000) wurde ein Verfahren
auf der Basis der Hybridisierung mittellanger Sonden auf immobilisierter
langer DNA zum Nachweis des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins
eines Lokus in genomischer DNA vorgeschlagen. In diesem Verfahren
wird eine genomische DNA auf einem Nylonfilter immobilisiert und
dann mit spezifischen Sonden inkubiert. Die fixierten Sonden haben
dieselben Primerbindungsstellen und werden anschließend amplifiziert.
Die Sonden haben eine Länge von
140 bis 600 Basen und sind nicht geeignet, um kleine Unterschiede
im Genom wie bei dem Nachweis homologer Sequenzen nachzuweisen.
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ZIELE DER
ERFINDUNG
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Es
ist das Ziel der vorliegenden Erfindung, eine neue und verbesserte
Lösung
für die
Identifizierung und/oder Quantifizierung einer Nukleotidzielsequenz
unter anderen möglichen
homologen Zielsequenzen bereit zu stellen, indem Anordnungen verwendet
werden, die Capture-Nukleotidsequenzen tragen, welche für die unterschiedlichen
homologen Zielsequenzen spezifisch sind und welche nicht die Nachteile
aus dem Stand der Technik aufweisen.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung erlaubt die Unterscheidung zwischen homologen
Zielsequenzen, die gleichzeitig in einer Probe vorhanden sein könnten, durch
Umkehrung des Hybridisierungsvorgangs der zu hybridisierenden Sequenzen
auf der Anordnung.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
erlaubt eine Identifizierung (Nachweis und Charakterisierung) und/oder
eine Quantifizierung von Nukleotidzielsequenzen auf der Basis eines
zweistufigen Bindungsvorgangs, bei dem die Nukleotidsequenzen, die
im ersten Schritt an das Ziel binden, im zweiten Schritt als auf
der Anordnung nachzuweisende Ziele verwendet werden.
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In
dem erfindungsgemäßen Verfahren
reagiert die Ziel-DNA (oder -RNA) zuerst mit unterschiedlichen, gegebenenfalls
markierten Nukleotidsequenzen, anschließend, nach einem Wachschritt,
werden die gegebenenfalls markierten Nukleotidsequenzen von den
Nukleotidzielsequenzen gelöst
und schließlich
auf einer Anordnung, die Capture-Nukleotidsequenzen trägt, welche
zu den gegebenenfalls markierten Nukleotidsequenzen komplementär sind,
identifiziert. Erfindungsgemäß sind es
die gegebenenfalls markierten Nukleotidsequenzen, die auf der Anordnung
hybridisieren, und nicht die Nukleotidzielsequenzen.
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In
dem erfindungsgemäßen Verfahren
haben die Capture-Nukleotidsequenzen und die Nukleotidzielsequenzen
mindestens einen identischen Teil oder Abschnitt in ihrer Sequenz,
während
die gegebenenfalls markierten Nukleotidsequenzen zu diesen komplementär sind.
Ein solches umgekehrtes Verfahren, wie in den beigefügten Ansprüchen beschrieben,
löst das
Problem einer effizienten Unterscheidung zwischen homologen Zielsequenzen
vorteilhaft.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung
und/oder Quantifizierung einer oder mehrerer Nukleotidzielsequenzen,
die möglicherweise
in einer Probe vorhanden sind, und zur Unterscheidung von anderen
homologen Sequenzen, indem zwei Sätze von Nukleotidsequenzen
verwendet werden, wobei in einem ersten Schritt ein erster Satz
von (gegebenenfalls markierten) Nukleotidsequenzen, die zwischen
8 und 60 Basen umfassen, spezifisch an die Nukleotidzielsequenzen
bindet, wobei die (gegebenenfalls markierten) Sequenzen des ersten
Satzes von Nukleotidsequenzen, die nicht an die Nukleotidzielsequenz
gebunden sind, entfernt werden, wobei die (gegebenenfalls markierten)
Nukleotidsequenzen des ersten Satzes von Nukleotidsequenzen, die
an die Nukleotidzielsequenz gebunden sind, voneinander enthybridisiert
und in einem zweiten Schritt durch Hybridisierung mit einem zweiten
Satz von Capture-Nukleotidsequenzen nachgewiesen und/oder quantifiziert
werden, bei denen mindestens ein Teil ihrer Nukleotidsequenz zu
dem Teil der Nukleotidsequenz der (gegebenenfalls markierten) Sequenzen
des ersten Satzes von Nukleotidsequenzen, der spezifisch an die
Nukleotidzielsequenzen bindet, komplementär ist, wobei die Capture-Nukleotidsequenzen
auf der Oberfläche
eines festen Trägers
gemäß einer
Anordnung von mindestens 4 unterschiedlichen Bereichen/cm2 immobilisiert sind, wobei an jeden der
diskreten Bereiche eine Art von Capture-Nukleotidsequenzen gebunden
ist und wobei die Identifizierung und Quantifizierung der Bindung
zwischen der (gegebenenfalls markierten) Nukleotidsequenz und ihrer
entsprechenden Capture-Nukleotidsequenz mit der Identifizierung und
der Quantifizierung der in der Probe vorhandenen Nukleotidzielsequenzen
korreliert.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft außerdem einen diagnostischen
Apparat und/oder einen Quantifizierungsapparat einer oder mehrerer
möglicherweise
in einer Probe vorhandenen homologen Nukleotidzielsequenzen, welcher
zwei gesonderte Kammern umfasst, die sich auf einem festen Träger befinden,
und eine flüssige
Verbindung zwischen den beiden Kammern, und wobei die zweite Kammer
Capture-Nukleotidsequenzen
enthält,
die gemäß einer
Anordnung von mindestens 4 unterschiedlichen Bereichen/cm2 auf der Oberfläche des festen Trägers immobilisiert
sind, wobei an jeden der diskreten Bereiche eine Art von Capture-Nukleotidsequenzen
gebunden ist.
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Definitionen
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„Homologe
Nukleotidsequenzen" bedeutet
DNA- oder RNA-Sequenzen mit demselben Nukleotid an entsprechenden
Positionen. Der Grad der Homologie (oder Sequenzidentität) wird
als Prozentanteil identischer Nukleotide an bestimmten Stellen nach
optimaler gegenseitiger Ausrichtung der Sequenzen (ganze Sequenz)
berechnet, wobei Insertionen oder Deletionen wie Lücken in
einer der beiden zu vergleichenden Sequenzen berücksichtigt werden. Dies ist
der Fall für
Sequenzen eines bestimmten Gens, das in genetisch unterschiedlichen
Quellen wie beispielsweise unterschiedlichen Organismusarten oder
für Proteine
oder Enzyme mit ähnlichen
Funktionen (von derselben Familie oder mit gemeinsamer struktureller
Domäne)
vorhanden ist. Der Homologiegrad (oder die Sequenzidentität) kann
stark variieren, wobei Sequenzen an einer bestimmten Stelle oder
an mehreren bestimmten Stellen oder über die gesamte Sequenz hinweg
homolog sein können. Die
Teile (oder Abschnitte) der in beiden Sequenzen identischen Sequenzen
werden als „konserviert" bezeichnet. Die
Sequenzen, die einen hohen Grad an Invarianz in ihren Sequenzen
aufweisen, werden als hoch konserviert bezeichnet und geben einen
hohen Homologiegrad wieder. Sequenzen, die sich durch nur eine Base unterscheiden
können
als Sequenzen mit dem höchsten
Homologiegrad gelten. Dies ist der Fall bei Sequenzen, die für die Einzelnukleotidpolymorphismen
(Single Nucleotide Polymorphisms) oder SNP-Sequenzen verantwortlich
sind.
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Homologie
(oder Sequenzidentität)
wird berechnet, nachdem Sequenzen zueinander ausgerichtet worden
sind, und basiert auf lokalen Homologiealgorithmen, die im Rechner
berechnet worden sind worden sind (beispielsweise, jedoch nicht
ausschließlich,
Clustal, Intelligenetics, Mountain View, Kalifornien, USA, oder
GAP, BESTFIT, FASTA und TFASTA aus dem Wisconsin Genetics Software
Package, Genetics Computer Group Madison, Wisconsin, USA, oder Boxshade).
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 ist
eine Schemadarstellung von erfindungsgemäßen umgekehrten Biochips, die
aus zwei Kammern 5 und 6 bestehen, die auf demselben
festen Träger 4 vorhanden
und zum Zweck der Automatisierung verbunden sind.
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AUSFÜHRLICHE
BESCHREIBUNG DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG
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Die
Erfindung umfasst vorteilhafterweise die Verwendung von doppelten
Biochips, wobei eine erste Kammer 5, die eine zu identifizierende
und aus einer Probe isolierte Nukleotidzielsequenz 3 trägt, eingeführt wird,
und wobei eine zweite Kammer 6 vorhanden ist, welche verschiedene,
an den festen Träger 4 der
Biochips 7 gebundene Capture-Nukleotidsequenzen 2 umfasst,
wobei die Capture-Nukleotidsequenzen, wie in 1 dargestellt,
für die
markierten Nukleotidsequenzen 1 spezifisch sind. Zur Vereinfachung
der Durchführung
von Tests sind die Nukleotidzielsequenzen 3 auf dem festen
Träger 4 immobilisiert,
so dass sie mit verschiedenen markierten Nukleotidsequenzen 1 in
der ersten Kammer reagieren können.
Diese Immobilisierung ist für
die Erfindung jedoch nicht ausschlaggebend, da eine erste Hybridisierung
in Lösung
durchgeführt
werden kann und die markierten Nukleotidsequenzen 1 danach
von den Nukleotidzielsequenzen 3 getrennt werden können, bevor
sie selbst auf der Anordnung nachgewiesen werden (Hybridisierung
mit entsprechenden Capture-Nukleotidsequenzen 2).
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Der
erste Vorteil des Verfahrens ist, eine Spezifität mit der Nachweisgeschwindigkeit
zu verknüpfen. Die
Spezifität
wird durch die Tatsache erhalten, dass kleine markierte Nukleotidsequenzen
verwendet werden, so dass sie in dem Teil der Nukleotidzielsequenzen
gewählt
werden können,
in dem sie sich voneinander unterscheiden. Die Tatsache, dass es
kleine Sequenzen verwendet, erlaubt auch die Unterscheidung von
Sequenzen, die sich nur in einer Base unterscheiden (SNP-Sequenzen).
In einer bevorzugten Ausführungsform haben
die markierten Nukleotidsequenzen eine Sequenz zwischen 8 und 60
Basen, aber vorzugsweise zwischen 15 und 30 Basen, die spezifisch
für die
entsprechenden Nukleotidzielsequenzen sind.
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Der
zweite Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist, dass die Hybridisierung der markierten Nukleotidsequenz 1 auf
den immobilisierten Nukleotidzielsequenzen 3 im Vergleich
zu einer Situation, bei der Capture-Nukleotidsequenzen 2 klein
und Nukleotidzielsequenzen 3 in Lösung lange und in der Regel
doppelsträngige
Fragmente sind, ein eher schneller Prozess ist. Darüber hinaus
lässt sich
die Geschwindigkeit beschleunigen, indem eine Sequenz zur Hybridisierung
der markierten Nukleotidsequenzen 1 ausgewählt wird, die
sich entfernt von der Bindungsstelle der Nukleotidzielsequenzen 3 an
den festen Träger
befindet, und indem die markierten Nukleotidsequenzen 1 im Überschuss
zugegeben werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die markierten
Nukleotidsequenzen 1 in hohem Überschuss zugegeben, das heißt über 100 Mal
mehr als die Menge der Nukleotidzielsequenzen, um die Geschwindigkeit
und den Ertrag der Fixierung dieser markierten Nukleotidsequenzen 1 auf
Nukleotidzielsequenzen 3 zu erhöhen.
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Alle
markierten Nukleotidsequenzen 1 sind gemeinsam zur Hybridisierung
auf Nukleotidzielsequenzen 3 vorhanden, so dass die Reaktionen
untereinander kompetitiv sind. Da die Sequenzen in derselben oder ähnlichen
Konzentration vorhanden sind, richtet sich der Ertrag der Bindung
nach der Affinität
zu den Nukleotidzielsequenzen. Es wurde eine günstige Bindung der komplementären Sequenzen
im Vergleich zu nicht-komplementären
Sequenzen beobachtet, selbst wenn sie sich nur in einer Base unterscheiden,
und die Unterscheidung zwischen homologen Sequenzen ist sehr gut.
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In
der zweiten Kammer 6 (der Anordnung) ist der Hybridisierungsertrag
bei den verschiedenen markierten Nukleotidsequenzen 1 ähnlich,
da sie dieselbe (oder ähnliche)
Größe haben
und auf Capture-Nukleotidsequenzen 2 ähnlicher Größe hybridisieren. Die Intensität der Punkte
(Spots) gibt den Anteil an markierten Nukleotidsequenzen 1 an,
die sich von den ersten Nukleotidzielsequenzen (die in der Probe
vorhanden sind) abgelöst
haben und für
eine Hybridisierung in der zweiten Kammer 6 (der Anordnung)
zur Verfügung
stehen.
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Die
zweite Hybridisierung der Sequenz auf den Capture-Nukleotidsequenzen 2 in
der Anordnung ist ein schneller Prozess, da auf Capture-Nukleotidsequenzen 2,
die konzipiert sind, um schnelle Reaktionen zu erlauben, kleine
Sequenzen reagieren. Die Capture-Nukleotidsequenzen 2 können für eine solche
Reaktion optimiert werden, damit diese in einer schnellen Geschwindigkeit
abläuft,
wobei die Verlängerung
der spezifischen Sequenz vom Punkt der Bindung an den festen Träger 4 aus
die Hybridisierungsgeschwindigkeit erhöht. Da die komplementäre Sequenz
im Vergleich zu anderen nicht-komplementären Sequenzen immer im Überschuss
vorhanden ist, ergibt der entsprechende Punkt (Spot) von Beginn
der Reaktion an immer ein stärkeres Signal,
was eine Identifizierung der Nukleotidzielsequenz ermöglicht.
Wenn nur eine qualitative Bestimmung erforderlich ist, kann die
Reaktion vor Abschluss angehalten werden, da die Signalstärke auf
dem Punkt (Spot) ihren Anteil in der Lösung vom Start der Reaktion
wiedergibt.
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Eine
bevorzugte Ausführungsform
des Verfahrens ist der Nachweis doppelsträngiger Ziel-DNA. Beim klassischen
Nachweis von DNA-Zielsequenzen auf einer Anordnung ist die Hybridisierungsgeschwindigkeit
in Anbetracht der Tatsache, dass die DNA-Zielsequenzen in Lösung erneut
Duplizes bilden können,
gering. Eine Möglichkeit,
einer solchen Situation entgegen zu wirken, ist es, die Länge der Capture-Nukleotidsequenzen
zu erhöhen,
aber in diesem Fall werden homologe Sequenzen auf derselben Capture-Nukleotidsequenz
kreuzhybridisiert, was den Nachweis verfälscht. In dieser Erfindung
wird das Ziel entweder vor oder nach der Immobilisierung in eine
einzelsträngige
Form überführt, damit
die Konkurrenz zwischen den markierten Capture-Nukleotidsequenzen
und dem zweiten Zielstrang zur Hybridisierung verringert oder reduziert
wird. Die markierten Nukleotidsequenzen sind vorzugsweise einzelsträngige Nukleotide,
um ihre Rehybridisierung in Lösung
zu vermeiden.
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Die
Erfindung ist insbesondere für
die Identifizierung und/oder Quantifizierung homologer Sequenzen geeignet
(Identifizierung eines besonderen Stamms von Mikroorganismen in
einer Probe oder in der Forschung, wenn Gene spezifisch identifiziert
werden müssen,
die unter einer Population verwandter Gene für Proteine mit unterschiedlichen
Rollen in normalen oder pathologischen Situationen kodieren). Dies
gilt vor allem für
regulatorische Gene wie Rezeptoren, Kinasen, Phosphatasen, Cycline,
Transkriptionsfaktoren oder Onkogene. Homologe Nukleotidzielsequenzen,
bei denen ein Teil ihrer Sequenz identisch ist, können durch Verwendung
von Konsensusprimern amplifiziert oder kopiert werden. In vielen
Anwendungen hat der Nachweis die Funktion, zwischen Nukleotidzielsequenzen ähnlicher
Organismen zu unterscheiden (homologe DNA- oder RNA-Sequenzen).
In diesem Fall werden Teile oder Abschnitte der konservierten Sequenzen
zur Bindung von Primern verwendet, die alle diese homologen Nukleotidsequenzen
erkennen (falls in der Probe vorhanden). Die Verwendung von lediglich
einem Primerpaar für
eine Familie oder Gattung von Organismen ist gegenüber der
Verwendung von Primern, die für
jede Art oder Unterart spezifisch sind, ein Vorteil, da manche Familien
von Organismen mehr als dreißig
Arten umfassen. Es ist außerdem
schwierig (wenn nicht unmöglich),
Amplifizierungsbedingungen zu finden, welche die Amplifizierung
all dieser Arten in einer Multiplex-PCR erlauben (bereits eine Multiplex-PCR
für 5 unterschiedliche
Nukleotidsequenzen ist in reproduzierbarer Weise in Proben schwierig).
Erfindungsgemäß kann ein
Test konzipiert werden, um jede Familie von Organismen (wie die
Bakterienfamilien) mit nur einem Primerpaar pro Familie zu amplifizieren.
Wenn nur eine Kopie durchgeführt
wird, wie im Falle einer reversen Transkription von mRNA, kann eine
einzelne poly-dT-Sequenz der Transkriptase als Vorlage dienen, um
die cDNA-Kopie zu erstellen.
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Für die Hybridisierung
in ersten sowie im zweiten Hybridisierungsschritt werden vorzugsweise
kleine markierte Nukleotidsequenzen 1 verwendet. Die Verwendung
kleiner Nukleotidsequenzen 1 erlaubt die Unterscheidung
sehr homologer Sequenzen (mit einer Homologie zwischen 30 und 98%).
Wenn die markierten Nukleotidsequenzen geeignet gewählt sind,
können
sie zwischen zwei Sequenzen unterscheiden, die sich nur in einer
Base unterscheiden (SNP), was die Bestimmung eines Polymorphismus
erlaubt.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
enthalten die markierte Nukleotidsequenzen 1 einen Teil
in ihrer Sequenz, der spezifisch für ihre Nukleotidzielsequenzen 3 ist,
sowie einen zusätzlichen
Schwanz, der nicht spezifisch für
die Nukleotidzielsequenzen 3 und spezifisch für eine bestimmte
markierte Nukleotidsequenz ist. Dieser Schwanz ist komplementär zu den
Capture-Nukleotidsequenzen 2, die auf der Kammer 6 der
Anordnung vorhanden sind. Da sich der Schwanz für jede markierte Nukleotidsequenz 1 unterscheidet,
stabilisiert er eine perfekte Übereinstimmung
auf der Anordnung, was zur Folge hat, dass eng verwandte markierte
Nukleotidsequenzen, die sich beispielsweise in dem Teil der Sequenz,
der für
die Nukleotidzielsequenzen spezifisch ist, in einer Base unterscheiden,
auf der Anordnung besser unterschieden werden.
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Das
Verfahren kann zum Nachweis von SNP-Sequenzen angewandt werden,
indem Modifikationen der Nukleotidsequenzen 1 verwendet
werden, die auf der DNA-Zielsequenz hybridisiert und anschließend in einem
zweiten Schritt auf der Kammer 6 der Anordnung, welche
die verschiedenen Capture-Nukleotidsequenzen 2 trägt, nachgewiesen
werden.
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In
einer Ausführungsform
wird die Erfindung angewandt, um SNP-Sequenzen nachzuweisen, indem eine
Mischung von zwei oder mehreren markierten Nukleotidsequenzen verwendet
wird, die am Ende ein anderes Nukleotid aufweisen, welches an die
Nukleotidzielsequenz neben der möglichen
SNP-Sequenz bindet, wobei eines der Endnukleotide der Nukleotidsequenz
eine perfekte Übereinstimmung
zu der SNP-Sequenz aufweist.
Das Vorhandensein einer anderen angehängten Nukleotidsequenz, die
neben der markierten Nukleotidsequenz bindet, ermöglicht,
dass die perfekt übereinstimmende
Nukleotidsequenz mithilfe einer Ligase mit dieser Nukleotidsequenz
ligiert wird. Die ligierte Nukleotidsequenz wird dann auf der zweiten
Anordnung nachgewiesen, so dass die SNP-Sequenz identifiziert wird.
Die verschiedenen markierten Nukleotidsequenzen können unterschiedliche
Markierungen tragen wie beispielsweise Cy3, Cy5 oder Cy7, so dass
sie leicht identifiziert werden können. Falls nicht markiert,
muss die zweite angehängte
Nukleotidsequenz markiert werden, so dass das resultierende ligierte
Produkt markiert ist.
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In
einer anderen Ausführungsform
der Erfindung wird eine Mischung der markierten Nukleotidsequenzen
verwendet, von denen sich jede an mindestens einer Base unterscheidet,
die sich am Ort desselben SNP befindet. Nach der Hybridisierung
werden die nicht übereinstimmenden
Nukleotidsequenzen von einer für
einen Einzelstrang spezifischen Nuklease ohne Wirkung auf die doppelsträngige DNA
geschnitten und der Vorgang wiederholt. Die ungeschnittenen und
geschnittenen Nukleotidsequenzen werden dann zur Hybri disierung
auf Kammer 6 der Anordnung verarbeitet. Bei geeigneten
Hybridisierungsbedingungen und mit gut gewählten Capture-Nukleotidsequenzen
auf der Anordnungskammer können
sie entweder die langen ungeschnittenen oder die kleinen geschnittenen
Nukleotidsequenzen hybridisieren, was die Identifizierung der SNP-Sequenz
erlaubt.
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In
einer anderen Ausführungsform
der Erfindung wird eine Mischung mehrerer Nukleotidsequenzen verwendet,
die unterschiedliche Teile der Nukleotidzielsequenzen erkennt, wie
beispielsweise SNP-Sequenzen entlang der Nukleotidzielsequenz, und
im zweiten Schritt des Verfahrens auf der Anordnung nachgewiesen.
Zahlreiche Capture-Nukleotidsequenzen 2 können auf
der Anordnung fixiert werden und können zwischen zahlreichen markierten
Nukleotidsequenzen 1 unterscheiden. Auf diese Weise ist
es möglich,
in einem Test mehrere Variationen wie beispielsweise möglicherweise
in einer bestimmten Nukleotidzielsequenz vorhandene Mutationen zu
untersuchen. Dies ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn alle diese
Variationen möglicherweise
im Ziel vorhanden sind und wenn sie mit einer pathologischen Situation
korreliert sind. Dies ist der Fall für Mutationen, die in Onkogenen
(wie p53) auftreten, wobei viele davon mit einem Fortschreiten als Krebserkrankung
verbunden sind, während
bei HIV Virusenzyme zu einer Resistenz gegenüber der Arzneimittelbehandlung
führen.
SNP könnten
darüber
hinaus auch mit einer individuellen Variabilität verknüpft sein, was das Ansprechen
auf eine Arzneimittelbehandlung oder auf Pathologien beeinflusst.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
werden beim ersten Hybridisierungsschritt mehrere Nukleotidzielsequenzen
verwendet, um eine breitere Antwort auf das gegebene Problem zu
erhalten und aus den zahlreichen auf der Anordnung möglichen
Nachweisen einen Vorteil zu ziehen.
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Vorteilhafterweise
können
Nukleotidzielsequenzen nachgewiesen werden, ohne dass sie in einem
Kopier- oder Amplifizierungsschritt markiert werden, was den direkten
Nachweis von DNA- oder RNA-Sequenzen ermöglicht (bei den meisten vorherigen
Verfahren werden Nukleotidzielsequenzen während des Amplifizierungs-
oder Transkriptionsschrittes markiert). Dies erlaubt eine Vereinfachung
der endgültigen
Verwendung der Biochips, da der Anwender die Amplifizierung auf
jede Art und Weise durchführen
kann und keine Rücksicht
auf mögliche
Wechselwirkungen mit dem markierten Reagenz während dieses Schrittes nehmen
muss. Diese Eigenschaft erlaubt auch die Identifizierung von Sequenzen
unmittelbar nach der Extraktion aus Proben, wobei der Schritt des
Kopierens oder Amplifizierens entfällt, was die Durchführung erleichtert.
Dieser direkte Nachweis kann nur durchgeführt werden, wenn genug Material
verfügbar
ist. Die erfindungsgemäßen Anwendungen
gelten (jedoch nicht ausschließlich)
für die
RNAs wie beispielsweise die ribosomale RNA 16s, 23s, 18s oder 25s,
jedoch auch für
die mRNA. Da es sich bei dieser RNA um Einzelstrangnukleotide handelt,
ist es nicht erforderlich, nach deren Immobilisierung auf dem Träger eine
solch drastische Denaturierung wie im Falle von doppelsträngigen Amplikons
zu verwenden, so dass in diesem Schritt eine nicht kovalente Bindung
verwendet werden kann. Der Nachweis von RNA, ob ribosomale RNA oder
Boten-RNA (mRNA), entweder direkt oder nach Kopieren in ihre komplementäre DNA-Sequenz,
ist eine bevorzugte Ausführungsform
dieser Erfindung, da sie in der Regel in Zellen in vielen Kopien
vorliegt, so dass ihr Nachweis bei vielen Anwendungen ohne Amplifizierung
durchgeführt
werden kann. Dieser direkte Nachweis erleichtert auch die Quantifizierung,
da eine Vermeidung der Amplifizierung die Variation reduziert, die
sich durch diesen Schritt ergibt, was sehr häufig schwer in den Griff zu
bekommen ist. Ein direkter Nachweis kann auch auf lange DNA-Sequenzen
abgestimmt werden, nachdem diese extrahiert und denaturiert sind
oder nachdem sie in kleinere Stücke
geschnitten worden sind.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung wird die Nukleotidzielsequenz 3 unter Verwendung
von Konsensusprimern (Sequenzen, die von denselben Primern amplifiziert
werden), amplifiziert. Homologe Sequenzen sind beispielsweise Sequenzen
von Genen in derselben Familie oder Gattung von Mikroorganismen.
Für diese
Amplifizierung wird einer der Primer aminiert, so dass einer der
Amplikonstränge
nach der Amplifizierung diese Aminogruppe trägt. Die Amplikons werden dann
auf einer Oberfläche
inkubiert, die Aldehydgruppen trägt.
Die Reaktion zwischen dem Amin und dem Aldehyd ist unter normalen
Bedingungen spontan, es ist kein anderes Reagenz erforderlich. Nach
der Reaktion wird anschließend
ein Reduktionsmittel (NaBH4) zugegeben,
um die reaktiven Doppelbindungen zu beseitigen. Der zweite Strang
wird anschließend entfernt,
indem Denaturierungsbedingungen für die Nukleotidsequenzen verwendet
werden. Es ist möglich, die
Temperatur über
den Schmelzpunkt der Nukleotidsequenzen zu erhöhen, so dass sie sich vom Zielstrang lösen, aber
es können
andere Bedingungen wie die Verwendung einer alkalischen Lösung verwendet
werden (eine Konzentration von 0,1 oder sogar 0,05 N einer NaOH-Lösung ist
ausreichend, um die beiden Stränge
zu trennen).
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Die
Bindung der Amplikons an die aktivierte Oberfläche kann durch das Vorhandensein
der Primer, die nach der Amplifizierung noch in der Lösung vorhanden
sind, begrenzt werden. Diese Primer können auch auf der aktivierten
Oberfläche
reagieren, und damit die Fixierung der Zielamplikons verringern.
Gegebenenfalls werden die Amplikons vor der Durchführung ihrer
Fixierung auf der Oberfläche
getrennt (Trennung auf Zentrifugations-Säule, aber für eine solche Trennung eignet
sich auch eine auf Kieselgel basierende Adsorption wie der PCR-Reinigungs-Kit
Nucleo-Trap (Clonetech)
oder die Filtration auf einem Gelfilter (Nucleo Spin Clonetech)).
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Auch
elektrophoretische Verfahren liefern gute Trennungen von DNA-Fragmenten
nach ihrer Größe und durch
die Miniaturisierung solcher Techniken eignen sie sich nun für derzeitige
Anwendungen wie sie in solchen Routineanwendungen benötigt werden.
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Erfindungsgemäß ist der
Test ein Tandem-Chip, der auf demselben Träger 4 durchgeführt wird.
Auf der ersten Kammer 5 werden die Nukleotidzielsequenzen
durch kovalente Fixierung auf einem aktiven Träger 4 immobilisiert.
Kovalente Reaktionen sind in der Chemie gut bekannt und viele von
ihnen werden bereits für die
Bildung von Chips verwendet, beispielsweise durch die Reaktion einer
aminierten Nukleotidzielsequenz mit einer auf der Chip-Oberfläche vorhandenen
Aldehydgruppe. In einer anderen Ausführungsform werden die Zielsequenzen
entweder direkt oder während
des Kopier- oder Amplifizierungsschrittes vorzugsweise an einem
Strang biotinyliert und das Ziel auf einer Streptavidinbeschichteten
Oberfläche
immobilisiert. In einer anderen Ausführungsform wird ein beliebiges
Hapten oder ein beliebiger Ligand auf der Zielsequenz fixiert, so dass
sie durch den entsprechenden, auf einer Oberfläche immobilisierten Antikörper oder
Rezeptor immobilisiert wird.
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Viele
Träger
können
so angepasst werden, dass dieser Schritt stattfinden kann. Glas
wird aktiviert, um Aldehydgruppen zu tragen. Es gibt viele verschiedene
Möglichkeiten,
Aldehydgruppen auf eine Oberfläche
zu übertragen.
Glas reagiert mit Aminosilan und danach mit Glutaraldehyd. Man kann
Carboxylgruppen auf die Oberfläche
des festen Trägers
binden und sie dann zu einem Aldehyd reduzieren. Auch Alkoholfunktionen können zu
Aldehyden oxidiert werden. Allerdings ist auch die Verwendung bifunktioneller
Aktivatoren wie SMCC oder DSS nützlich,
da sie Aminogruppen aktivieren und sie entsprechend mit Thiol- oder
Amingruppen verknüpfen
können.
Eine solche chemische Kopplung ergibt eine kovalente Fixierung der
Nukleotidzielsequenzen an den Träger,
die vor allem dann nützlich
ist, wenn die Nukleotidzielsequenzen doppelsträngig sind und in einer Denaturierungslösung behandelt
werden müssen.
Auch eine einfache Adsorption auf einer Oberfläche wie Nylon, Zellulosederivat
oder einer positiv geladenen Oberfläche, die beispielsweise mit
Polylysin beschichtet ist, oder auf einem Copolymer wie Poly(Phe-Lys)
ist ein geeignetes Verfahren für
die Adsorption von Nukleotidsequenzen auf einer Oberfläche. In
diesem Fall werden Bedingungen für
die Adsorption langer DNA-Zielfragmente
anstatt kleiner Primer ausgearbeitet.
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Während Glas
viele Vorteile aufweist, wie beispielsweise inert zu sein und eine
geringe Eigenfluoreszenz aufzuweisen, können andere Träger, beispielsweise
Polymere, ebenfalls nützlich
sein, da auch sie mit verschiedenen chemisch gut charakterisierten
Gruppen auf ihrer Oberfläche
erhalten werden können,
was die Fixierung der Ziel-DNA ermöglicht. Polystyrol wurde aktiviert,
um Carboxyl- oder Aminogruppen an der Oberfläche zu erhalten, was eine kovalente
Fixierung von Amino-DNA ermöglicht
(Anal. Biochem. 236. 85 (1996)). Die meisten Polymere können aktiviert
werden, um Carboxyl-, Amino- oder Aldehydgruppen zu erhalten. Polystyrol
ist nur als flacher Träger
erhältlich,
sondern auch als Mikrokügelchen,
die vorteilhafterweise verwendet werden, um den ersten Bindungsschritt
der markierten Sonden auf den immobilisierten Zielen durchzuführen.
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Es
können
alle anderen Träger
verwendet werden, die DNA fixieren können, wie beispielsweise Filter, Silikonträger, Metallträger, Compact
Discs, Kunststoffvorrichtungen oder elektronische Vorrichtungen.
Vorteilhafterweise ist der feste Träger eine einzelne Glas- oder
Kunststoffplatte, die weitere Mittel (Strichcodes, Markierungen,
etc.) oder Medien (Beschichtung, etc.) umfassen kann, um das erfindungsgemäße Verfahren
zu verbessern. Eine Kombination von Trägern wie Glas, das in einen
Kunststoffträger eingesetzt
ist, eignet sich zur Handhabung der Chips zur Automatisierung.
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Nach
und/oder vor der Bindung werden die Nukleotidzielsequenzen denaturiert,
was zu der Bildung einer einzelsträngigen immobilisierten Nukleotidzielsequenz
führt.
Die Lösung,
welche die verschiedenen markierten Nukleotidsequenzen enthält, wird
dann zu diesen ersten Monochips gegeben und sie können reagieren,
wenn ihre komplementäre
Sequenz auf der Nukleotidzielsequenzen vorhanden ist. Nach dem Waschen wird
die Lösung
erhitzt und die gebundenen Nukleotidsequenzen von den Nukleotidzielsequenzen
abgelöst und
in Lösung
vorgefunden. Diese Lösung
wird dann durch spezifische Kanäle
oder andere Mittel auf die zweite Kammer 6 (Waschschritt
anhand von Mikropumpen oder Ventilen), welche die für die markierten
Nukleotidsequenzen spezifischen Capture-Nukleotidsequenzen enthält, übertragen.
Anschließend
wird die zweite Hybridisierung durchgeführt, welche es ermöglicht,
die markierten Nukleotidsequenzen und damit die Nukleotidzielsequenz
zu identifizieren. Wenn die verschiedenen Schritte gut durchgeführt werden,
kann der Test quantitativ durchgeführt werden, was nicht nur die
Identifizierung sondern auch die Quantifizierung der Nukleotidzielsequenzen
erlaubt. Da alle Schritte auf derselben Oberfläche 4 durchgeführt werden,
ist der Test anwenderfreundlich durchzuführen und kann automatisiert
werden.
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In
der bevorzugten Ausführungsform
dieser Erfindung werden Konsensusprimer bei der PCR-Amplifizierung
der möglicherweise
in der Probe vorhandenen homologen Sequenzen verwendet. Es sind
funktionelle Gruppen wie NH2 oder Biotin eingebaut, um sie auf einer
festen Oberfläche,
wie oben beschrieben, anzubringen. Es sind auch andere Amplifizierungsverfahren
wie LCR, CPR, NASBA, ICR, TMA oder Avalanche-DNA möglich. Auf
dieselbe Weise kann nach einer reversen Transkription auch eine
RNA-Amplifizierung durchgeführt werden.
Es können
auch kurze DNA-Sequenzen durch spezifische Spaltung mit Restriktionsenzymen und
kleine RNA-Sequenzen durch unspezifische Spaltung durch Hitze oder
in Gegenwart einer Base erhalten werden (WO97/10365).
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Es
kann eine indirekte Markierung mittels biotinylierter markierter
Nukleotidsequenzen, die danach ein Streptavidinkonjugat mit entweder
fluoreszierenden Molekülen
oder mit Enzymen oder mit kolloidalen Goldpartikeln binden, verwendet
werden. Diese Goldpartikel können
selbst nachgewiesen werden oder dienen als Katalysatoren für die Reduktion
von Silber. Das Präzipitat
wird anschließend
nachgewiesen und gegebenenfalls quantifiziert (EP-99870106.4).
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Eine
Markierung könnte
auch mit einer Hapten- oder
Antikörperreaktion
erhalten werden, wobei der Antikörper
die Markierung ist oder an ein Molekül gebunden ist, das ein Signal
geben kann.
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Alle
Verfahren des Nachweises von DNA, die auf Fluoreszenz, Kolorimetrie,
Magnetismus, Elektronik, Elektrolumineszenz, Biolumineszenz oder
Radioaktivität
beruhen, die auf DNA-Chips abgestimmt sind, können zum Nachweis der Anordnung
verwendet werden.
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Die
Auswahl der nachweismarkierten Nukleotidsequenzen und ihrer komplementären Capture-Nukleotidsequenzen
ist ein wichtiger Schritt im Gesamtverfahren, wenn homologe Sequenzen
voneinander spezifisch unterschieden werden müssen. Je höher die Homologie zwischen
den Sequenzen ist, desto wichtiger ist die Auswahl dieser Sequenzen.
Vorzugsweise wird ein kleiner Sequenzbereich (oder -abschnitt) ausgewählt, in
dem sich die homologen Sequenzen am meisten (oder sehr) unterscheiden,
und es werden die markierten Nukleotidsequenzen als zu diesem Bereich
(oder Abschnitt) komplementär
ausgewählt.
Auch die Länge
der Sequenzen variiert je nach Homologie; sie ist länger, wenn
die Sequenzen eher unterschiedlich sind, und sie ist kürzer, wenn
sie sehr homolog sind. Die Sequenzen haben eine Länge zwischen
15 und 30 Basen, können aber
auch nur 8 Basen kurz oder bis zu 60 Basen lang sein. Die punktweise
auf der Anordnung aufgetragenen Capture-Nukleotidsequenzen sind
komplementär
zu den markierten Nukleotidsequenzen. In einer bevorzugten Ausführungsform
befinden sich diese Sequenzen 2 in einem bestimmten Abstand
zu der Oberfläche 4,
entweder indem sie unspezifische Sequenzen haben, welche an die
Oberfläche 4 gebunden
sind, oder indem für die
Fixierung ein Linker verwendet wird.
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Die
Verwendung einer einzelnen Oberfläche zur Durchführung der
beiden Hybridisierungsschritte ermöglicht die Anpassung des Verfahrens
an eine Automatisierung und an Mikrofluidtechnologie. Die Oberfläche ist
in zwei Kammern aufgeteilt, wobei in der ersten Kammer die Ziel-DNA
oder – RNA
gebunden ist und die markierten Sequenzen auf den Zielsequenzen
hybridisieren und die zweite Kammer die Anordnung darstellt und
die verschiedenen Capture-Sequenzen enthält. Injektion und Entfernen
von Flüssigkeiten
aus jeder Kammer kann durch Kanäle
und Pumpen erfolgen, so dass Inkubationen und Waschschritte möglich sind.
Die Kammern können
auch auf die erforderliche Temperatur erwärmt werden.
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Die
zwei Kammern können
auch durch eine kleine Röhre
oder einen kleinen Kanal verbunden sein, so dass nach Ablösung der
markierten Nukleotidsequenzen von dem Ziel die Lösung in eine zweite Kammer überführt und
für die
Hybridisierung auf der Anordnung verarbeitet werden kann. Der gesamte
Vorgang, sogar einschließlich
des Nachweises, kann automatisiert werden, was den umgekehrten Chipnachweis
zu einem einfachen Verfahren macht. Diese Erfindung wiederholt die
Schritte des Bindens und Ablösens
markierter Nukleotidsequenzen auf den immobilisierten Zielen, so
dass die spezifischen Nukleotidsequenzen sich in der Anordnung ansammeln,
um auf Capture-Nukleotidsequenzen unterschieden zu werden. Automatisierung
des Verfahrens durch einen Automaten oder eine Maschine eignet sich
besonders gut zur Wiederholung des Vorgangs.
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Diese
Technologie lässt
sich leicht an bestehende Automaten anpassen. Einer davon ist der
VIDAS (Biomerieux, Lyon, Frankreich), entwickelt für ELISA-Assays.
Er hat die Eigenart, die Antigen/Antikörper-Reaktion in den Spitzen
durchzuführen,
welche dann schrittweise in die verschiedenen Lösungen zum Waschen und Inkubieren
weitergeleitet werden. Anschließend
wird das in einer solchen Spitze erhaltene Endsignal aufgezeichnet.
Die Anordnung kann wie eine Pipettierspitze in eine Vorrichtung
eingesetzt werden, so dass Lösungen
nach innen gepumpt werden und auf der Anordnung umgesetzt, gewaschen
und inkubiert werden können.
Die Durchführung
der Reaktion auf einer Spitze wurde für Antikörper-/Antigenreaktionen entwickelt
und ist gut an. die von der VIDAS-Maschine (Biomerieux, Lyon, Frankreich)
durchgeführte
Automatisierung angepasst. Nach Abschluss der Reaktion wird das
Signal wie hiernach beschrieben auf der Anordnung nachgewiesen.
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Ein
System mit einer doppelten Anordnung könnte auf die gleiche Weise
behandelt werden, wobei jede Anordnung in eine Mikropipettenvorrichtung
eingesetzt und mit der anderen verbunden ist, um die Lösung mit
Nukleotidsequenzen weiterzugeben, wenn dies vom Protokoll vorgesehen
ist.
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Mikrofluidtechniken
machen es außerdem
möglich,
dass der gesamte Prozess der Amplifizierung und/oder der Trennung
von Amplikons von den überschüssigen Primern
auf derselben Oberfläche
durchgeführt
werden, was zu einem „Labor-auf-einem-Chip"-Produkt führt. Die
endgültige
Oberfläche
enthält
mehrere oder alle der Kompartimente: eine Kammer, in welcher die
PCR durchgeführt
wird, eine Trennvorrichtung für die
Reinigung der Amplikons, falls erforderlich, eine Kammer für die Immobilisierung
der Amplikons und die erste Hybridisierung mit den verschiedenen
markierten Nukleotidsequenzen und schließlich eine Kammer mit der Anordnung
für die
endgültige
Identifikation der Nachweisnukleotidsequenz. Das Endprodukt würde die
erforderlichen Verbindungen aufweisen, damit die Flüssigkeiten
von einer Kammer in die andere geleitet werden kann sowie für die Inkubationen
und Waschschritte mit den externen Lösungen. Dem Automaten könnte auch ein
Detektor hinzugefügt
werden, um eine voll automatisierte Analyse des Assays zu erhalten.
Die Trennung der Amplikons von den Primern kann anhand von Filtration,
einem Adsorptions-Desorptions-Prozess oder Mikroelektrophorese erfolgen,
wie beispielsweise von ACLARA Biosciences (Mountain View, CA, USA)
vorgeschlagen.
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Analyse des Ergebnisses
der Hybridisierung
-
Das
Ergebnis der Hybridisierung auf der Anordnung muss von der Maschine
nachgewiesen und/oder quantifiziert werden, indem ein Nachweissystem
verwendet wird, das auf das Signal, was bei einer positiven Hybridisierung
ausgesandt wird, abgestimmt ist. Die häufigste Markierung von in Mikroanordnungen
verwendeter DNA beruht auf dem Gebrauch fluoreszierender Nukleotidsequenzen.
In diesem Fall dienen Fluoreszenz-Scanner als Detektoren (d.h. ein
konfokaler Fluoreszenz-Scanner (Genetic Microsystem, Woburn, MA, USA).
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Die
Bildung eines Präzipitats
auf den positiven Punkten (Spots), vor allem Silberpräzipitat
nach Markierung mit Nanogold, eignet sich besonders gut für einen
einfachen Nachweis, da kolorimetrische Scanner oder fotografische
Detektoren, die eine besonders kostengünstige Technologie darstellen,
den Grad der Reaktion nachweisen und/oder quantifizieren können (EP-99870106.4).
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Es
ist eine Software-Analyse zur Bilderkennung an die Punkte (Spots)
angepasst worden, gefolgt von einer Quantifizierung des auf jedem
Punkt (Spot) vorhandenen Signals, wobei die Stärke des Hintergrunds berücksichtigt
wird. Eine andere Art von Analyse beruht auf einer Korrelationsanalyse
der Punkte (Spots), wobei die Form und die Stärke jedes Pixels der Punkte
(Spots) berücksichtigt
werden. Eine Klassifizierung der Punkte (Spots) entsprechend dem
Grad der Korrelation erlaubt anschließend eine Klassifizierung in
positive oder negative Punkte (Spots), was dem Anwender eine einfache
Antwort darauf gibt, ob die Ziele in der ursprünglichen Probe vorhanden sind
oder nicht.
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Die
Quantifizierung der Hybridisierung erfolgt anhand von herkömmlichen
Ansätzen,
entweder durch einen internen oder einen externen Standard, der
Korrekturen der verschiedenen Erträge erlaubt, welche in den verschiedenen
Schritten des Prozesses erhalten werden, angefangen bei der Extraktion,
der Kopie oder Amplifizierung, der ersten Hybridisierung und der
zweiten Hybridisierung auf der Anordnung. In der bevorzugten Ausführungsform
wird der Probe ein externen Standard in einer bekannten Konzentration
zugegeben und während
aller Schritte mitverarbeitet, um die Effizienz des Gesamtverfahrens
zu korrigieren. Da das Verfahren in der Regel ein Kopier- oder Amplifizierungsverfahren
enthält,
ist ein kompetitiver Standard die bevorzugte Ausführungsform
der Erfindung. Einer davon ist in Dokument WO98/11253 vorgeschlagen
worden.
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Vorzugsweise
ist der Hybridisierungsertrag des Standards durch diese spezifische
Sequenz ideal oder unterscheidet sich um nicht mehr als 20% vom
Hybridisierungsertrag der Zielsequenz, und eine Quantifizierung
wird wie in WO98/11253 beschrieben erhalten.
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Vorteilhafterweise
ist auch die Standardnukleotidsequenz, ein externer und/oder interner
Standard in dem Kit (der Vorrichtung) oder dem Apparat gemäß der Erfindung
enthalten, gegebenenfalls mit allen Medien und Mitteln, die zum
Durchführen
der verschiedenen erfindungsgemäßen Schritte
erforderlich sind (Hybridisierungs- und Kulturmedien, Polymerase
und andere Enzyme, Standardsequenz(en), Markierungsmolekül(e), etc.).
-
Beispiel
-
Identifizierung von Staphylokokkus-Arten
durch Nachweis der spezifischen FemA-Gene
-
Die
FemA-Gene sind hoch konservierte Gene und haben zwischen den verschiedenen
Staphylokokkus-Arten eine Homologie von 50 bis 90%. Die Identifizierung
von Staphylococcus epidermidis in einer Probe anhand einer Voramplifizierung
mit Konsensusprimern durchgeführt,
welche die 5 häufigsten
Staphylokokken amplifizieren: S. aureus, S. epidermidis, S. haemolyticus,
S. hominis und S. saprophyticus. Einer der Primer war aminiert,
so dass ein Strang der Amplikons eine Aminogruppe an seinem 5'-Ende trug. Die Amplikons
wurden anschließend
kovalent an ein Glas fixiert, das Aldehydgruppen trug, und dann
durch Erhitzen auf 100°C denaturiert.
Die markierten, für
die 5 Staphylokokken-Arten spezifischen Nukleotidsequenzen wurden
dann mit diesen Einzelstrangamplikons inkubiert. Nach der Reaktion
und Waschen wurden sie in einer Lösung von NaOH wiedergewonnen.
Diese Lösung
wurde anschließend
auf die Anordnung gegeben, die von Punkten (Spots) von Capture-Nukleotidsequenzen,
die für
jede der markierten Nukleotidsequenzen spezifisch sind, gebildet
wurde. Nach der Reaktion und Waschen wurde ein Streptavidin-Cy5-Konjugat zugegeben,
gefolgt von der Messung mit einem konfokalen Fluoreszenzscanner
(Genetic Microsystem). Das Prinzip dieses Verfahrens ist in 1 und 2 gezeigt. Es sind nur die Punkte (Spots)
positiv, welche die für
S. epidermidis spezifischen Capture-Nukleotidsequenzen tragen.
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Amplifizierung des FemA-Gens
anhand von Konsensusprimern
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Die
für die
PCR-Amplifizierung verwendeten Primer haben folgende Sequenz:
FP
1: 5' CCA CTA GCG
TAC ATC AAT TTT GA 3'
FP
1HS: 5' CCC ACT
CGC TTA TAT AGA ATT TGA 3'
FP
3: 5' GGT TTA ATA
AAG TCA CCA ACA TAT T 3'
mit
einer NH2-Gruppe am 5'-Ende. Diese Primer amplifizieren eine
Sequenz von 487 bp im FemA-Gen.
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Fixierung der DNA der
Amplikons auf einer Oberfläche
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Amplikons
werden auf dem High Pure PCR Product Purification Kit (Boehringer
Mannheim, Deutschland) chromatografisch gereinigt, um aminierte
Primer und freie Nukleotide zu beseitigen. Für die Fixierung auf der Oberfläche wurden
100 μl der
Lösung
SSC3X pH 5, die 150 nM der gereinigten Amplikons enthielt, 30 Min. bei
23°C auf
silylierten Mikroskopie-Objektträgern
inkubiert (Cell Associates, Houston, USA), die von einer Hybridisierungskammer
eingerahmt wurden. Nach der Inkubation wurden die Objektträger einmal
mit 0,1% SDS, zweimal mit Wasser gewaschen und anschließend 5 Min.
mit NaBH4 (2,5 mg gelöst in 750 μl PBS und 250 μl 100 Ethanol)
inkubiert und 3 Min. in kochendem Wasser. Die Objektträger wurden
bis zur Verwendung bei 4°C aufbewahrt.
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Hybridisierung und Entfernen
der spezifischen Nukleotidsequenzen vom Ziel
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Die
spezifischen biotinylierten Nukleotidsequenzen für den Nachweis der 5 Staphylokokkenarten
sind wie folgt:
S. aureus
ASaur01: 5' CTA AAT GAA GAG CGT GAT ATT TTA AAT
3'
S. epidermidis
ASepi01:
5' CTA AAT AAT GAA
AGA AAT GTG CTT AAT 3'
S.
haemolyticus
AShae01: 5' TTA
CAA AAT GAA CGT GAA ACT TTA AAT 3'
S. hominis
AShom01: 5' CTT CAT GCA GAA
CGT CAG ACA TTA AAT 3'
S.
saprophyticus
ASsap01: 5' TTA
AAG GCT GAA CGC GAA GTA TTA AGT 3'
-
Die
Sequenz der biotinylierten Nukleotidsequenzkontrolle ist:
CMV23Biot
5' GGT TAT CAG AGG
CCG CTT GGC CA 3'
-
Jede
Sonde trägt
ein Biotin an ihrem 5'-Ende.
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Für die Hybridisierung
werden 100 μl
Hybridisierungslösung
auf einen Glasobjektträger
mit Ziel-DNA geladen. Diese Mischung enthält 0,5 M Phosphatpuffer pH
7,4, 7% SDS, 100 μg/ml
Lachsspermien-DNA, 30 nM biotinylierte Nukleotidsequenzen von S.
epidermis (1 Nukleotidsequenz) oder 30 nM jeder der Nukleotidsequenzen
(5 Nukleotidsequenzen). Die Hybridisierung wird in einer
Hybridisierungskammer bei 60°C
für 2 Std.
durchgeführt.
Die Proben werden 4 Mal mit 10 mM Maleinpuffer, pH 7,5, 15 mM NaCl,
0,03 Tween gewaschen.
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Hybridisierte
Sonden werden abgelöst,
indem innerhalb des mit einem wasserfesten Stift abgegrenzten Hybridisierungsbereichs
für 5 Min.
bei 25°C
mit 70 μl
0,05 N NaOH inkubiert wurde. 50 μl
der Lösung
werden dann in ein Mikroröhrchen überführt und
mit 56 μl
Lösung
mit 0,7 M Phosphatpuffer pH 7,4, 10% SDS, 200 μg/ml Lachsspermien-DNA, 10 nM biotinylierter
CMV-Nukleotidsequenz (Hybridisierungskontrolle) neutralisiert.
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Nachweis der markierten
Nukleotidsequenzen auf der Anordnung
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Sequenzen
der Capture-Nukleotidsequenzen:
-
Die
Capture-Nukleotidsequenzen für
die 5 Staphylokokkenarten sind wie folgt:
S. aureus
ATaur02:
5' ATT TAA AAT ATC
ACG CTC TTC ATT TAG 3'
S.
epidermidis
ATepi02: 5' ATT
AAG CAC ATT TCT TTC ATT ATT TAG 3'
S. haemolyticus
AThae02:
5' ATT TAA AGT TTC
ACG TTC ATT TTG TAA 3'
S.
hominis
AThom01: 5' ATT
TAA TGT CTG ACG TTC TGC ATG AAG 3'
S. saprophyticus
ATsap02:
5' ACT TAA TAC TTC
GCG TTC AGC CTT TAA 3'
-
Die
Sequenz der Capture-Nukleotidsequenzkontrolle ist.
CMVNH2:
5' TGG CCA AGC GGC
CTC TGA TAA CC 3'
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Jede
Capture-Nukleotidsequenz trägt
eine NH2-Gruppe
an ihrem 5'-Ende.
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Capture-Sonden-Immobilisierung
-
Es
wurde das von Schena et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 10614,
1996) für
das Aufbringen (Grafting) aminierter DNA auf ein Aldehyd beschriebene
Protokoll mit kleinen Änderungen
befolgt.
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Die
aminierten Capture-Nukleotidsequenzen wurden bei einer Konzentration
von 1,6 μM
punktförmig aufgetragen.
Die Capture-Nukleotidsequenzen wurden auf die silylierten Mikroskopie-Objektträger mit
einer selbst gemachten Vorrichtung zur Erstellung von Anordnungen
aufgedruckt. Die Capture-Nukleotidsequenzen waren zu den markierten
Nukleotidsequenzen komplementär
und hatten eine Aminogruppe an ihrem 5'-Ende. 250-μm-Stifte von Genetix (GB) und
silylierte (Aldehyd) Mikroskopie-Objektträger von Cell Associates (Houston,
USA) wurden verwendet. Die Punkte (Spots) haben einen Durchmesser
von 400 μm
und das ausgegebene Volumen war etwa 1 Nanoliter. Die Objektträger wurden
bei Raumtemperatur getrocknet und bis zur Verwendung bei 4°C aufgewahrt.
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Hybridisierung und Nachweis
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106 μl denaturiertes
Produkt werden in einer Hybridisierungskammer für 30 Min. bei 50°C inkubiert. Die
Objektträger
werden anschließend
4 Mal mit 10 mM Maleinpuffer, pH 7,5, 15 mM NaCl, 0,03% Tween (Waschpuffer)
gewaschen. Die Glasproben werden 45 Min. bei Raumtemperatur mit
800 μl Streptavidin-markiertem
Cyabin5 (Sigma St. Louis, Mi, USA), 500 × verdünnt in 100 mM Maleinpuffer
pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1% Gloria-Milchpulver, inkubiert. Die Objektträger werden
5 Mal mit Waschpuffer gewaschen, einmal mit Wasser gespült und getrocknet.
Die Objektträger
werden mit einem Konfokalscanner von Genetic Microsystem (Woburn,
MA, USA) gemessen.
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Tabelle
1 gibt ein Ergebnis an, das mit erfindungsgemäßen umgekehrten Biochips zum
Nachweis einer spezifischen Sequenz von Staphylococcus epidermidis
(A) erhalten wurde, wenn Zielamplikons von S. epidermidis immobilisiert
und in einer ersten Kammer 5 mit einer Mischung der markierten
Nukleotidsequenzen 1 inkubiert wurden, die spezifisch für die 5
Staphylokokken-Stämme
sind, oder (B), wenn Zielamplikons von S. aureus immobilisiert und
mit spezifischen markierten Nukleotidsequenzen von S. epidermidis
inkubiert wurden. Die Nukleotidsequenzen 1, die von der
Nukleotidzielsequenz nach der Hybridisierung abgelöst wurden,
wurden dann auf eine Anordnung (Kammer 6) überführt, die
Capture-Sonden 2 für
die 5 möglichen
markierten, für die
5 Staphylokokkus-Arten spezifischen Sequenzen tragen, und nachgewiesen.
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