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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Die
Anwendung der Technologie der rekombinanten DNA hat die technische
Erzeugung von Wirtszellen ermöglicht,
um gewünschte
Verbindungen, wie beispielsweise Polypeptide und Sekundärmetaboliten
zu erzeugen. Die in großem
Maßstab
erfolgende Herstellung von Polypeptiden in technisch erzeugten Zellen
ermöglicht
eine Herstellung von Proteinen zum pharmazeutischen Einsatz und
von Enzymen zum industriellen Einsatz. Sekundärmetaboliten sind von der Natur
abgeleitete Produkte, deren biologische und medizinische Bedeutung
seit langem bekannt ist. Aufgrund der derartigen Molekülen inhärenten strukturellen
Komplexität erfordert
eine herkömmliche
chemische Synthese häufig
einen umfangreichen Aufwand sowie eine Verwendung teurer Vorstufen
und Cofaktoren zur Herstellung der Verbindung. In den letzten Jahren
hat die Expression heterologer Proteine in Zellen die technische
Erzeugung heterologer Biosynthesewege in Mikroorganismen zur Erzeugung
von Metaboliten aus kostengünstigen
Ausgangsmaterialien erleichtert. Auf diese Weise wurden eine Vielzahl
von Verbindungen erzeugt, einschließlich Polyketiden, β-Lactam-Antibiotika,
Monoterpenen, Steroiden und Aromaten.
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Promotoren,
die durch Acetylphosphat reguliert werden, sind in Shin S. et al., "Modulation of flagellar expression
in Escherichia coli by acetyl phosphate and the osmoregulator OmpR", J. Bacteriology,
Bd. 177, Nr. 16, 1995, S. 4696–4702,
und Haldimann, A. et al., Transcriptional regulation of the Enterococcus
faecium BM4147 vancomycin restistance gene cluster by the VanS-VanR
two-component regulatory
system in Escherichia coli K-12",
J. Bacteriology, Bd. 179, Nr. 18, 1997, S. 5903–5913.
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INHALT DER ERFINDUNG
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Die
Erfindung basiert teilweise auf der Entdeckung, dass eine Herstellung
heterologer Polypeptide und Metaboliten durch die regulierte Expression
des Polypeptids (z. B. eines Biosyntheseenzyms) unter Verwendung
eines Promotors verbessert werden kann, der durch die Konzentrationen
eines Sekundärmetaboliten,
z. B. Acetylphosphat, reguliert wird. Der Begriff "heterolog" betrifft ein Polypeptid
oder einen Metaboliten, der künstlich
eingefügt
wird. Ein heterologes Polypeptid oder ein Metabolit kann identisch
zu einer natürlich
vorhandenen endogenen Entität
sein. Der Begriff "Metabolit" betrifft eine organische
Verbindung, die das Produkt einer oder mehrerer biochemischer Reaktionen
ist. Ein Metabolit kann selbst eine Vorstufe für weitere Reaktionen sein.
Ein Sekundärmetabolit
ist ein Metabolit, der von einem anderen abgeleitet wurde.
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Demgemäß stellt
die Erfindung eine E. coli-Wirtszelle bereit, die eine Nucleinsäuresequenz,
die einen Promotor beinhaltet, und eine Nucleinsäuresequenz enthält, die
ein heterologes Polypeptid codiert, wie in den Ansprüchen dargelegt.
Die Nucleinsäuresequenz
ist funktionsmäßig mit
dem Promotor verbunden, der durch ein Response-Regulatorprotein
gesteuert wird. Mit anderen Worten ist die Nucleinsäure mit
der Promotorsequenz in einer Weise verbunden, die eine Expression
der Nucleotidsequenz in vitro und in vivo gestattet. "Promotor" bezeichnet jegliches
DNA-Fragment, das eine Transkription von genetischem Material lenkt.
Der Promotor wird durch ein Response-Regulatorprotein gesteuert,
beispielsweise ntrC von E. coli oder dessen Homologe von anderen
Bakterienarten. Weiter kann das Response-Regulatorprotein ein weiteres
Element der orthologen Clustergruppe (COG – Cluster Orthologous Group)
COG0745 sein, wie definiert durch http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/
(Tatusov et al., Nucleic Acids Res. (2000); 28: 33–36). Bei
einer Implementierung ist der Promotor durch ntrC von E. coli gebunden.
Der Begriff "ntrC" bezieht sich sowohl
auf das ntrC-Protein von E. coli (SWISSPROT: P06713, http://www.expasy.ch/)
als auch dessen Homologe bei anderen Bakterien, je nach Eignung.
Wie hier verwendet, bezeichnet "gebunden" eine physische Verbindung
mit einer Gleichgewichtsbindungskonstante (KD)
von weniger als 100 nM, vorzugsweise weniger als 1 nM. Ein Beispiel
für den
Promotor ist der glnAp2-Promotor von E.
coli, z. B. ein Gebiet zwischen Positionen von ca. 93 und ca. 323
in der publizierten DNA-Sequenz, GenBank-Zugangs-Nr. M10421 (Reitzer&Magasanik (1985)
Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82: 1979–1983). Dieses Gebiet beinhaltet
nicht übersetzte
Sequenzen aus dem glnA-Gen. Weiter kann eine Translationsfusion
zwischen Codiersequenzen für
glnA und Codiersequenzen für
das heterologe Polypeptid konstruiert werden.
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Die
Wirtszelle ist genetisch modifiziert, derart, dass der Promotor
durch Acetylphosphat bei Abwesenheit von Stickstoffaushungerung
geregelt wird. Beispielsweise kann die Wirtszelle durch Deletion
oder Mutation eines Gens genetisch modifiziert sein, das eine Histidinproteinkinase
codiert, z. B. ein Element von COG0642, wie definiert durch http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/
Tatusov et al. supra), z. B. glnL, phoR, phoQ, creC oder envZ. Bei
einem weiteren Beispiel weist die Histidinproteinkinase eine Spezifität für das Response-Regulatorprotein
auf, welches den Promotor steuert. Die Histidinproteinkinase kann
durch glnL codiert sein, z. B. glnL von E. coli (SWISSPROT: P06712,
http://www.expasy.ch/).
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Zwar
ist die Wirtszelle genetisch derart modifiziert, dass der Promotor
durch Acetylphosphat bei Abwesenheit von Stickstoffaushungerung
reguliert wird, jedoch kann, für
eine Expression eines heterolo gen Polypeptids oder eines Metaboliten,
die Wirtszelle bei beliebiger gewünschter Bedingung vermehrt
werden, z. B. bei Stickstoffaushungerungszuständen, stickstoffarmen Zuständen oder
stickstoffreichen Zuständen.
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Das
heterologe Polypeptid, das durch die Nucleinsäuresequenz codiert wird, kann
ein Biosyntheseenzym sein, das zur Herstellung eines Metaboliten
benötigt
wird. Es kann ein Säugetier-Protein,
z. B. ein sezernierter Wachstumsfaktor, ein monoklonaler Antikörper oder
eine extrazellulare Matrixkomponente sein. Bei noch einem weiteren
Beispiel kann das heterologe Polypeptid ein gewünschtes Antigen zur Verwendung
in einem Vakzin sein, z. B. ein Oberflächenprotein von einem viralen,
bakteriellen, fungalen oder Protisten-Pathogen sein.
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Die
Wirtszelle enthält
eine erste Expressionskassette. Die erste Expressionskassette beinhaltet
einen Promotor, beispielsweise irgendeinen von den zuvor beschriebenen,
und eine Nucleinsäuresequenz,
die ein Enzym codiert, das zur Biosynthese eines heterologen Metaboliten
benötigt
wird. Wie hier verwendet, bezeichnet "Enzym" ein Polypeptid, das fähig ist,
eine chemische Reaktion oder mehrere Reaktionen zu katalysieren. Die
Nucleinsäuresequenz
ist funktionsmäßig mit
dem Promotor verbunden, der durch Acetylphosphat in Abwesenheit
von Stickstoffaushungerung reguliert wird. Die Wirtszelle enthält auch
zusätzliche
Nucleinsäuresequenzen
zum Exprimieren weiterer Enzyme, die zur Biosynthese des Metaboliten
benötigt
werden. Derartige zusätzliche
Sequenzen können
endogene Sequenzen sein, die endogene Enzyme exprimieren, oder eingefügte Sequenzen,
die heterologe Enzyme exprimieren.
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Bei
einem Beispiel ist der heterologe Metabolit ein Isoprenoid, ein
Polyhydroxyalkanoat, ein Polyketid, ein β-Lactam-Antibiotikum, ein Aromat
oder eine Vorstufe, z. B. ein Upstream-Metabolit, oder ein Derivat,
z. B. ein Downstream-Metabolit, von diesem sein. Beispielsweise
kann das Isoprenoid ein Carotinoid, ein Sterol, ein Taxol, ein Diterpen,
ein Gibberellin und ein Chinon sein. Spezielle Beispiele von Isoprenoiden
beinhalten Isopentyldiphosphat, Dimethylallyl-diphosphat, Geranyl-diphosphat,
Farnesyl-diphosphat, Geranylgeranyl-diphosphat und Phytoen. Spezielle
Beispiele von Carotinoiden beinhalten β-Carotin, ζ-Carotin, Astaxanthin, Zeaxanthin,
Zeaxanthin-β-Glucosid,
Phytofluen, Neuroporen, Lutein und Torulen. Wenn der gewünschte heterologe
Metabolit ein Isoprenoid ist, kann das heterologe Enzym Isopentyl-diphosphatisomerase,
Geranylgeranyl-diphosphatsynthase oder eine 1-Deoxyxylulose-5-phosphatsynthase
sein. Wenn der gewünschte
heterologe Metabolit ein Polyhydroxyalkanoat ist, kann das heterologe
Enzym 3-Ketoacyl-reductase,
oder Poly-3-hydroxyalkanoat-Polymerase sein.
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Die
Wirtszelle kann eine Bakterienzelle, z. B. eine Zelle von E. coli
sein. Die Wirtszelle ist optional durch Deletion oder Mutation eines
Gens modifiziert, z. B. eines Gens, das eine Histidinproteinkinase
codiert, wie zuvor beschrieben wurde. Bei einem spezifischen Beispiel
enthält
die Wirtszelle weiter eine zweite Expressionskassette, die eine
Nucleinsäuresequenz
enthält,
die eine Phosphoenolpyruvatsynthase codiert, die mit einem Promotor
funktionsmäßig verbunden
ist, der durch eine Acetylphosphat-Konzentration reguliert wird,
z. B. glnAp2.
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Ein
Verfahren zur Herstellung von heterologen Isoprenoiden in einer
Wirtszelle beinhaltet ein Überexprimieren
von Phosphoenolpyruvatsyntase und ein Exprimieren von Biosyntheseenzymen,
die für
eine Synthese des heterologen Isoprenoid benötigt werden. Bei einer Implementierung
wird ein Gen in der Wirtszelle, das eine Pyruvatkinase oder eine
Phosphoenolpyruvat-carboxylase codiert, genetisch deletiert oder
geschwächt.
Bei einer anderen Implementierung wird ein Gen, das eine Phosphoenolpyruvat-carboxykinase
codiert, in der Wirtszelle überexprimiert.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren zur
Erzeugung eines Lycopen in einer Wirtszelle bereit. Das Verfahren
beinhaltet ein Exprimieren der folgenden heterologen Enzyme: 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphatsynthase,
eine Geranylgeranyl-diphosphatsynthase, eine Photoensynthase und
eine Phytoensaturase. Bei einer Implementierung dieses Verfahrens
wird eine Isopentenyl-diphosphatisomerase überexprimiert, z. B. unter
Verwendung des glnAp2-Promotors. Bei einer
weiteren Implementierung dieses Verfahrens wird eine Phosphoenolpyruvatsynthase überexprimiert,
z. B. unter Verwendung des glnAp2-Promotors.
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Die
Nucleinsäuresequenz
enthält
einen Promotor und eine Sequenz, die ein Biosyntheseenzym codiert,
die für
die Erzeugung eines ersten Metaboliten benötigt wird. Der Promotor ist
mit der Sequenz funktionsmäßig verbunden
und wird durch einen zweiten Metaboliten reguliert, dessen Konzentration
die Verfügbarkeit
einer Vorstufe für
die Biosynthese des ersten Metaboliten angibt. Bei einem Beispiel
ist der zweite Metabolit ein Abfallprodukt, der aus einer Vorstufe
für die
Biosynthese des ersten Metaboliten erzeugt wird.
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Der
erste Metabolit kann ein Polyhydroxyalkanoat sein, z. B. Polyhydroxybutyrat,
und die Nucleinsäuresequenz
codiert ein Biosyntheseenzym, z. B. eine 3-Ketoacyl-Coenzym-A-(CoA)-Reduktase,
oder eine Poly-3-hydroxyoctanoyl-CoA-Polymerase. In einem anderen
Fall ist der erste Metabolit ein Polyketid, ein β-Lactam-Antibiotikum oder ein Aromat. Bei noch
einem weiteren Fall ist der erste Metabolit ein Isoprenoid, z. B.
ein hier erwähntes
Isoprenoid. Die Nucleinsäuresequenz
kann ein Biosyntheseenzym codieren, das für eine Isoprenoid-Produktion
benötigt
wird, z. B. Isopentyldiphosphatisomerase, Geranylgeranyl-diphosphatsynthase, 1-Deoxyxylulose-5-phosphatsynthase,
Phosphoenolpyruvatsynthase, Farnesyldiphosphatsynthase. Geranylgeranyl-diphosphatsynthase,
Phytoensynthase, Phytoendesaturase oder Lycopencyclase. Eine Vorstufe
von Isoprenoiden kann Pyruvat sein. Die Pyruvat-Konzentrationen stehen in Bezug zu Acetat-
und Acetylphosphat-Konzentrationen.
Demgemäß ist in
diesem Fall der zweite Metabolit Acetylphosphat. Der Promotor, der auf
Acetylphosphat anspricht, kann durch ein Response-Regulatorprotein
gesteuert werden, z. B. ein zuvor erwähntes Response-Regulatorprotein.
Ein derartiger Promotor spricht möglicherweise lediglich auf
Acetylphosphat in einer spezifischen Wirtszelle an. Bei einem speziellen
Beispiel ist der Promotor, der auf eine Acetylphosphat-Konzentration
anspricht, durch ntrC von E. coli gebunden, z. B. ein glnAp2-Promotor von E. coli.
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Der
Promotor kann durch cAMP reguliert werden. Der Promotor kann ein
bakterieller Promotor sein, der CAP (Catabolit Activator Protein)
bindet. Bei Säugetieren
kann der Promotor ein Promotor sein, der ein cAMP-Response-Element
(CRE) enthält,
das sich an die Proteine CREB, CREM oder ATF-1 bindet. In Hefezellen
kann der Promotor ein Promotor sein, der durch cAMP reguliert wird,
oder ein Promotor, der durch Proteine Gis1, Msn2 oder Msn4 gebunden
wird. Ein weiteres mögliches
Regulierungssignal für
den Promotor kann Fructose-1-phosphat, oder Fructose-6-phosphat
sein. Das FruR-Protein von E. coli reguliert derartige Promotoren.
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Die
Nucleinsäuresequenz
kann auf einem Plasmid enthalten sein. Sie kann auch einen bakteriellen Replikationsstartpunkt
und einen Selektionsmarker enthalten. Die Sequenz kann weiter einen
Hefen- oder einen
anderen eukaryotischen Replikationsstartpunkt und ge eignete Selektionsmarker
enthalten, und kann in das Genom integriert sein.
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Die
Optimierung der Biosynthese von heterologen Verbindungen in Wirtszellen
ist angewiesen auf eine Erfassung von Parametern der Zellphysiologie
und auf eine Verwendung dieser Parameter, um die Biosynthese zu
regulieren. Ein Standardverfahren der Technik besteht darin, Zellen
zu züchten,
und besteht für den
Benutzer darin, einen Wirkstoff, z. B. einen Induktor exogen zuzusetzen,
um Gene anzuschalten, die für eine
Biosynthese des gewünschten
Produktes benötigt
werden. Es wurde verbreitet beobachtet, dass ein auf einem hohen
Niveau erfolgendes Induzieren eines rekombinanten Proteins oder
eines Wegs zu Wachstumsverzögerung
und verringerter Stoffwechselaktivität führt. (Kurland and Dong (1996)
Mol. Microbiol. 21: 1–4). Die
Praxis eines exogenen Zuführens
eines Induktors ist empirisch, und es erfolgt keine Beobachtung
der Verfügbarkeit
von Biosyntheseressourcen in der Zelle. Im Gegensatz dazu beruhen
natürliche
Wege auf Rückkopplungsmechanismen
zur Steuerung derartiger Prozesse. Die Kombination gewisser Promotoren
mit spezifischen genetisch definierten Wirtszellen und heterologen
Polypeptiden bei dieser Erfindung führt unerwartetermaßen zu einem
stark verfeinerten und vielseitigen Steuerkreis, der den Fluss zu
einem heterologen Polypeptid oder einer Metabolitsynthese reagierend
auf den metabolischen Zustand der Zelle steuert. Tatsächlich sorgt
der dynamisch gesteuerte rekombinante Weg für eine vergrößerte Produktion,
minimierte Wachstumsverzögerung
und eine verringerte Erzeugung von toxischen Nebenprodukten. Die
Regulierung einer Genexpression, reagierend auf den physiologischen
Zustand ist auch für
weitere Anwendungen, wie beispielsweise zur Gentherapie, von Nutzen.
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Die
Details von einer oder mehreren Ausführungsformen der Erfindung
werden in der nachfolgenden Beschreibung dargelegt. Weitere Merkmale,
Ziele und Vorteile der Erfindung gehen aus der Beschreibung und aus
den Ansprüchen
klar hervor.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
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Die
Erfindung betrifft Verfahren zur technischen Gestaltung einer metabolischen
Steuerung, z. B. Verfahren zur Verwendung von Promotoren in spezifischen
Wirtszellen, um eine Proteinexpression entweder zur Proteinproduktion
oder zur Metabolitensynthese zu optimieren.
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Ein
zentraler Bestandteil der Erfindung ist eine Expressionskassette,
die einen Promotor und eine Nucleinsäuresequenz beinhaltet, die
ein heterologes Polypeptid codiert, dessen Expression angestrebt
wird. Die Expressionskassette ist unter Verwendung in der Technik üblicher
Verfahren aufgebaut, derart, dass die codierende Nucleinsäuresequenz
mit dem Promotor funktionsmäßig verbunden
ist, z. B. durch diesen reguliert wird. Der Promotor ist derart
gewählt,
dass der Promotor durch einen Parameter der Physiologie der Zelle
oder einen metabolischen Zustand der Zelle reguliert wird. Eine
Vielzahl von Promotoren können
verwendet werden. Bei einigen Anwendungen ist die Expressionskassette
in einem Plasmid enthalten, beispielsweise einem bakteriellen Plasmid
mit einem bakteriellen Replikationsstartpunkt und einem Selektionsmarker.
Die Expressionskassette kann in das Genom von Zellen unter Verwendung
von in der Technik üblichen
Verfahren integriert sein.
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Wenn
die Expressionskassette zur technischen Gestaltung einer regulierten
Produktion eines heterologen Polypeptids während einer spät-logarithmischen
Wachstumsphase oder während
einer statio nären
Phase verwendet werden soll, dann kann der Promotor entsprechend
gewählt
werden. Beispielsweise kann ein Promotor gewählt werden, der auf ein kleines
Molekülsignal,
z. B. einen zweiten Botenstoff, reagiert, dessen Pegel sich während einer
spät-logarithmischen Wachstumsphase
oder während
einer stationären
Phase anreichern. Der zweite Botenstoff kann ein Molekül sein,
dass als Vorstufe, Zwischenprodukt oder Abfallprodukt eines biochemischen
Weges anfällt.
Bei Bakterien kann das kleine Molekülsignal ein Glycolyse-Zwischenprodukt
sein, z. B. Fructose-1-phosphat
oder Fructose-6-phosphat, oder ein Glycolyse-Abfallprodukt, z. B. ein Acetat oder
ein Actetylphosphat. In eukaryotischen Zellen sind cAMP-Konzentrationen
ein allgemein bekanntes Signal eines Ernährungszustands.
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Der
Promotor in der Expressionskassette kann basierend auf den Ergebnissen
eines in großem
Maßstab
erfolgenden Gen-Chip-Experimentes
gewählt
werden. Gene, die durch Acetylphosphat induziert werden, können dadurch
identifiziert werden, dass markierte cDNA, die aus in Acetat gezüchteten
Zellen erzeugt ist, auf ein Mikroarray hybridisiert wird, und das
Signal mit einem Referenzsignal verglichen wird, z. B. mit dem Signal,
das mit cDNA erhalten wird, das aus Zellen bei früh-logarithmischem
Wachstum erzeugt wird. Dieses Experiment kann sowohl bei prokaryotischen
als auch eukaryotischen Zellen durchgeführt werden, z. B. Bakterienzellen,
Hefe-, Pflanzen- und Säugetierzellen.
Für ein
Beispiel eines derartigen Versuches in einem Prokaryoten sei verwiesen
auf Talaat et al. (2000) Nat. Biotechnol. 18: 679–82 und
Oh&Liao (2000)
Biotechnol. Prog. 16: 278–86.
Sobald ein Gen identifiziert ist, das bei dem gewünschten
Zustand exprimiert wird, kann dessen Promotor in der Expressionskassette
verwendet werden. Alternativ kann der Versuch durch das exogene Zusetzen
eines gewünschten
Moleküls
(z. B. einer Vorstufe in einem metabolischen Weg) oder durch Beeinflus sung
der Versuchsbedingungen durchgeführt
werden (z. B. Wachstum in einer spät-logarithmischen Phase oder
Wachstum bei Überproduktion
eines Biosyntheseenzyms). Promotoren können basierend auf den induzierten
Genen identifiziert werden.
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In
einem Fall wird eine Expressionskassette für eine technische Gestaltung
einer geregelten Erzeugung eines Metaboliten in einer Bakterienzelle
verwendet. Der Promotor kann gewählt
werden, der durch einen zweiten Metaboliten reguliert wird, dessen
Konzentration ein Indikator für
die Verfügbarkeit
einer Vorstufe für die
Biosynthese des ersten Metaboliten ist. Wenn beispielsweise der
erste Metabolit ein Isoprenoid ist, das aus den Vorstufen, Pyruvat
und Glyceraldehyd-3-phosphat, synthetisiert wird, dann kann der
zweite Metabolit Acetylphosphat sein. In einer reichen Umgebung
erzeugen Zellen eine Überschussmenge
an Acetyl-CoA, ein Produkt von Pyruvat. Das überschüssige Acetyl-CoA wird verwendet,
um ATP und Acetat zu erzeugen, das als Abfallprodukt sezerniert
wird. Die Acetat-Konzentration nimmt mit der Zelldichte zu. Die
Konzentrationen von Acetat, Acetyl-CoA und Acetylphosphat stehen
zueinander durch die folgenden biochemischen Reaktionen in Beziehung: Acetyl-CoA + Pi ↔ Acetylphosphat
+ CoA (1) Acetylphosphat + ADP ↔ Acetat + ATP (2)
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Somit
weist eine hohe Konzentration von Acetylphosphat auf überschüssiges Acetyl-Coa
und überschüssiges Pyruvat
hin. Eine Wirtszelle, die beispielsweise durch Deletion oder Mutation
von glnL genetisch modifiziert ist, bewirkt, das eine ntrC-Funktion
abhängig
von Acetylphosphat wird (Feng et al. (1992) J. Bacteriol. 174: 6061–6070).
Auf diese Weise kann ein durch ntrC regulierter Promotor, z. B.
der glnAp2-Promotor, verwendet werden, um eine Genexpression reagierend
auf Acetylphosphat zu steuern. Der glnAp2- Promotor kann unter Verwendung von in
der Technik üblichen
Verfahren erzielt werden. Beispielsweise können Primer entworfen und synthetisiert
werden, die sich an den glnAp2-Promotor anlagern. Die Polymerase-Kettenreaktion
(PCR) kann verwendet werden, um ein Nucleinsäurefragment zu amplifizieren
(vervielfältigen),
das den glnAp2-Promotor enthält.
Dieses Fragment kann nun für
weitere Konstruktionen verwendet werden. In ähnlicher Weise kann ein E.
coli-Stamm, der eine Deletion eines Histidinproteinkinase-Gens enthält, z. B.
glnL, ohne Weiteres erzeugt werden; siehe Link et al. (1997) J.
Bacteriol, 179(20): 6228–6237
für eine
detaillierte Beschreibung eines möglichen Verfahrens. Die Sequenzen,
die ein gewünschtes
heterologes Polypeptid codieren, können downstream vom glnAp2-Promotor
kloniert werden, so dass dieses funktionsmäßig mit dem Promotor verbunden
ist. Eine Wirtszelle mit einem inaktivierten glnL-Gen kann dann
mit den Sequenzen transformiert werden. Der transformierte Stamm
kann gezüchtet
werden, und die Polypeptidproduktion kann im Verlauf des Wachstums überwacht
werden. Eine kräftige
Proteinexpression kann bei hohen Zelldichten beobachtet werden,
siehe beispielsweise Farmer and Liao (2000) Nat. Biotechnol. 18:
533–537.
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Eine
Säugetier-Zelle
kann als Wirtszelle für
die Polypeptid- oder Metaboliten-Erzeugung verwendet werden. Ein
Promotor kann gewählt
werden, z. B. ein Promotor, der auf cAMP anspricht. Ein derartiger
Promotor kann ein cAMP-Response-Element (CRE) enthalten, das sich
an die Proteine CREB, CREM oder ATF-1 bindet. Unter Verwendung in
der Technik üblicher
Verfahren kann eine gewünschte
Codiersequenz unter Steuerung des Promotors gestellt werden und
in die Säugetierzelie
transformiert werden. In einigen Fällen kann das Konstrukt in
einen Virus eingefügt
werden, z. B. ein inaktiviertes Virus. Derartige Implementierungen
gestatten eine geregelte Erzeugung eines Proteins oder eines Metaboliten,
das/der durch ein heterologes Biosyntheseenzym in einem Gentherapieszenario
erzeugt wird. Pflanzenzellen können
ebenfalls als Wirtszellen verwendet werden. Wiederum kann ein geeigneter
Promotor gewählt
werden, z. B. ein Promotor, der auf ein Pflanzenhormon, einen Metaboliten
oder eine Vorstufe für
die Herstellung eines gewünschten
Metaboliten anspricht. Ein Promotor kann durch einen Mikroarray-Versuch
identifiziert werden. Nach Fusion eines gewünschten Promotors mit einer
gewünschten
Codiersequenz in einem geeigneten Vektor kann das Konstrukt einer Elektroporation
in einem Agrobacterium tumefaciens unterzogen werden, und dann verwendet
werden, um Pflanzenzellen unter Verwendung von in der Technik üblicher
Verfahren zu transformieren. Bei noch einem weiteren Beispiel können Hefezellen
so manipuliert werden, dass sie heterologe Polypeptide oder Metaboliten unter
metabolischer Steuerung exprimieren. Beispielsweise kann ein Saccharomyces
cerevisiae-Promotor
ein durch cAMP regulierter Promotor sein, z. B. ein Promotor, der
an Proteine Gis1, Msn2 oder Msn4 gebunden ist. Die Regulierung aller
Hefegene ansprechend auf eine Vielzahl von metabolischen Bedingungen
ist zunehmend gut untersucht. Beispielsweise beschreiben DeRisi
et al. (1997) Science 278: 680–686
Versuche, die das Transkriptionsprofil von fast dem gesamten Gensatz
von Saccharomyces cerevisiae unter verschiedenen metabolischen Bedingungen
verfolgen. Promotoren, die durch einen gewünschten Metaboliten reguliert
werden, können
basierend auf solchen Daten ausgewählt werden. Die Erzeugung von
Hefe-Plasmiden und die Transformation von Hefe ist in der Technik
allgemein bekannt.
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Eine
Vielzahl von metabolischen Wegen kann unter Verwendung der zuvor
beschriebenen Expressionsverfahren rekonstruiert werden. Beispielsweise
kann ein Weg zur Erzeugung von Lycopen in E. coli durch Konstruieren
von Expressionsvektoren für
die folgenden Gene eingefügt
werden: dxs (codiert für
1-Deoxy-D-xylulose-5- phosphatsynthase)
von E. coli, gps (codiert für
Geranylgeranyldiphosphat-(GGPP)-synthase) von Archaeoglobus fulgidus,
und crtBI (codiert für
Phytoen-synthase bzw. -desaturase) von Erwinia uredovora. Diese
Gene können
auf einem einzigen oder auf mehreren Plasmiden liegen, oder sie
können
in das E. coli-Chromosom integriert sein. Außerdem kann eine Phosphoenolpyruvat-synthase
unter Verwendung eines beliebigen Verfahrens überexprimiert werden, z. B.
durch Fusion mit dem glnAp2-Promotor. Isopentyldiphosphatisomerase
kann unter Verwendung eines beliebigen Verfahrens überexprimiert
werden, z. B. durch Fusion mit dem glnAp2-Promotor.
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Bei
einem weiteren Beispiel kann ein Weg zur Erzeugung von Polyhydroxyalkaloaten
(PHA), z. B. Polyhydroxybutyrat, in E. coli implementiert werden.
PHA ist eine Familie von linearen Polyestern von Hydroxysäuren mit
einer Vielzahl von thermoplastischen Eigenschaften und kommerziellen
Verwendungen. Pseudomonasaeruginosa-Gene, die 3-Ketoacyl-Coenzym-A-Reduktasen
und Poly-3-hydroxyalkanoat-Polymerase codieren,
können
der Regulierung eines gewünschten
Promotors unterstellt werden, z. B. glnAp2, da Acetyl-CoA-Pegel
Indikatoren für
eine Verfügbarkeit
einer Vorstufe für
eine PHA-Synthese sein können.
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Ohne
weitere Ausarbeitung wird angenommen, dass die vorhergehende Beschreibung
die Erfindung in angemessener Weise ausgeführt hat.
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VERFAHREN
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Wachstumsbedingungen.
Alle E. scoli-Stämme
wurden in Schüttelkolben,
die das gewünschte
Medium bei 37°C
enthielten, in Wasserbadschüttlern
(Modell G76; New Brunswick Scientific, Edison, NJ) gezüchtet. Die
Kulturen wurden in Minimalmedien gezüchtet, die entweder aus M9-definierten
Salzen 34, die 0,5% (Gew./Vol.) Glucose enthielten, oder YE-definierten
Salzen bestehen, die 1,5% (Gew./Vol.) Glucose enthielten. YE-definierte
Salze bestanden aus (je Liter): 14 g K2HPO4, 16 g KH2PO4, 5 g (NH4)2SO4, 1 g MgSO4 und 1 mg Thiamin. Die Zelltrübung wurde
spektralphotometrisch bei 550 nm überwacht.
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Metabolitenmessungen.
Acetat, Pyruvat und andere organische Säuren wurden unter Verwendung von
HPLC (Lösungsmittelzuführsystem
Constametric 3500 und variabler Wellenlängendetektor Spectromonitor
3100; LDC Analytical, Riviera Beach, FL) über eine Kolonne für organische
Säuren
(Aminex HPX-87H, Bio-Rad Laborstories, Hercules, CA) gemessen, die
auf 65°C
gehalten wurde. Die bewegliche Phase bestand aus 0,01 N H2SO4 und deren Durchsatz
wurde auf 0,6 ml min–1 gehalten. Von der
Kolonne kommende Spitzen wurden bei 210 nm erfasst. Glucose wurde
unter Verwendung von Sigma-Kit-Nr. 315-100 gemessen. Um Lycopen
zu quantifizieren, wurde 1 ml von Bakterienkultur mit Aceton extrahiert,
zentrifugiert, und das Absorptionsvermögen des Überstandes bei 474 nm gemessen.
Lycopen-Konzentrationen wurden unter Vergleichen der Absorptionswerte
mit einer Standardkurve berechnet.
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SDS-PAGE
und enzymatische Untersuchungen. Das Protokoll für SDS-PAGE wurde beispielsweise beschrieben
von Laemmli (1970) Nature 227: 680–685. Eine Messung einer β-Galactosidase-Aktivität wurde im
Wesentlichen so ausgeführt,
wie beispielsweise beschrieben von Miller (1992) A Short Course
in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, NY.
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ERGEBNISSE
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Verwendung des glnAp2-Promotors in E.
coli bei heterologer Fusion mit lacZ.
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Zunehmende
Pegel von Acetylphosphat können
ein Indikator eines überschüssigen Glucoseflusses sein.
Die Erfindung stellt Wirtszellen, Nucleinsäuresequenzen sowie Verfahren
zur Verwendung von Acetylphosphat als Signal zur Regelung der Expression
von raten-steuernden
Enzymen auf einem gewünschten Stoffwechselweg
bereit, sowohl um den überschüssigen Kohlenstofffluss
vollständig
auszunutzen als auch den Fluss weg vom toxischen Produkt, Acetat,
zu leiten.
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Um
das Potential von glnAp2 zur dynamischen Steuerung der Produktexpression
zu untersuchen, wurde eine Nucleinsäuresequenz aufgebaut, die ein
heterologes lacZ-Gen enthielt, das mit dem glnAp2-Promotor
funktionsmäßig verbunden
war. Der Bereich des glnAp2-Promotors, der den Promotor enthält, und
zwei ntrC-Bindungsorte,
können
durch in der Technik bekannte übliche
Verfahren ohne Weiteres erzielt werden. Der glnAp2-Promotor wurde
einer PCR-Amplifikation aus einer Genom-DNA von E. coli unter Verwendung
des Forward-Primer 5'-CAGCTGCAAAGGTCATTGCACCAAC
(der einen technisch erzeugten PvuII-Ort enthält) und des Reverse-Primer 5'-GGTACCAGTACGT-GTTCAGCGGACATAC
(der einen technisch erzeugten KpnI-Ort enthielt) unterzogen. Diese
zwei Primer amplifizierten ein Gebiet zwischen Positionen 93 und
343 in der veröffentlichten
DNA-Sequenz 16 (GenBank-Zugangs-Nr. M10421).
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Das
glnAp2-PCR-Fragment wurde auch in den EcoRI-Ort von pRS551 kloniert,
wodurch p2GFPuv erzeugt wurde, das glnAp2 vor einem promotorlosen
lacZ-Gen enthält.
Das lacZ-Gebiet von glnAp2 wurde mittels homologer Rekombination
auf λRS45
transferiert (Si mons et al. (1987) Gene 53: 85–96), wodurch ein λp2GFPuv-Phage
erzeugt wurde. JCL1595 und JCL1596 wurden durch Integrieren einer
lacZ-Fusion von glnAp2 mittels Infektion (Silhavy et al. (1984)
Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, NY) mit einem λp2GFPuv-Phagen in die Chromosomen
von BW13711 (lacX74) bzw. BW18302 (lacX glnL2001; Feng et al., supra)
konstruiert. Dieser Stamm enthält
das glnL2001-Allel, das aus einer internen Deletion zwischen den
Kodonen 23 und 182 der glnL-Codiersequenz besteht und vermutlich in
einer Null-Mutation resultiert (Feng et al., supra).
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Der
zeitliche Verlauf der Aktivität
der β-Galactosidase
(β-gal)
wurde beim Wild-Typ und beim glnL-Mutanten gemessen. Die Aktivität der glnAp2-β-gal nimmt
in zeitabhängiger
Weise zu, ähnlich
wie die ausgeschiedene Acetat-Konzentration vom glnL-Wirt (JCL1596),
hingegen wurde keine Induktion der Promotor-Aktivität bei der
Steuerung des isogenen Wild-Typs (JCL1595) beobachtet. Tabelle 1. β-Galactosidase-Aktivität von glnAp2-lacZ
| | β-Galactosidase-Aktivität (nmol/min-mg
Protein) |
| 6
Stunden | 11
Stunden |
| glnAp2-lacZ
in WT (JCL1595) | < 100 | ~100 |
| glAp2-lacZ
in glnL (JCL1596) | ~700 | ~1500 |
| Plac-lacZ in (VJS632) | ~500 | ~550 |
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Somit
ist, bei Abwesenheit von glnL, glnAp2 fähig, auf den überschüssigen Kohlenstofffluss
anzusprechen, der durch eine Ausscheidung von Acetat angezeigt wird.
Bei Annäherung
der Zellen an die spät-exponentielle
Phase nahm die Biosyntheseanforderung ab, und die Zellen begannen,
einen überschüssigen Kohlenstofffluss
aufzuweisen, der durch die verstärkte
Erzeugung von Acetat dargelegt wird. An dieser Stelle begann, bei
ungefähr
6 Stunden, die Aktivität
von glnAp2-β-gal
unerwartet anzusteigen (auf ~700 nmol/min-mg Protein, siehe Tabelle 1), hingegen
war die Aktivität
von glnAp2-β-gal beim
Stamm vom Wild-Typ (JCL1595) relativ gering und blieb die ganze
Zeit über
konstant (~100 nmol/min-mg Protein, Tabelle 1). Nach mehr als 10 Stunden
lag die Aktivität
von glnAp2-β-gal
bei Abwesenheit von glnL auf einem bemerkenswerten Wert von ~1500
nmol/min-mg Protein (Tabelle 1). Das Induktionsprofil von glnAp2
steht auch in starkem Kontrast zu demjenigen des lac-Promotors (Plac). Die chromosomale Plac-Aktivität im Stamm
VJS632 (lac+) nahm nach Induktion mit IPTG
(Isopropyl-β-D-thio-galactopyranosid)
rasch zu und erzielte einen konstanten Expressionspegel in der Zelle
(~550 nmol/min-mg Protein, siehe Tabelle 1), was unabhängig von
der Wachstumsphase ist.
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Verwendung des glnAp2-Promotors in E.
coli in heterologer Fusion mit pps und aroG
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Eine
Expression von zwei unterschiedlichen metabolischen Enzymen, Phosphoenolpyruvatsynthase (pps)
und 3-Deoxy-D-arabinoheptulosonat-7-phosphat-(DAHP)-synthase
(aroG) wurden unter Steuerung des glnAp2-Promotors gestellt. Als
Steuerungen wurden diese zwei Proteine auch vom tac-Promotor (Ptac) überexprimiert,
der eine statische Steuerung zeigt, und zwar bei gleichem genetischen
Hintergrund und Umgebungsbedingungen. Standardverfahren zum Exprimieren
von pps führen
zu einer Wachstumsverzögerung
(Patnaik et al. (1992) J. Bacteriol. 174: 7527–7532).
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Das
Plasmid pAROG wurde dadurch aufgebaut, dass ein PCR-Fragment, das aroG
pRW5tkt in die EcoRI-BamHI-Orte von pJF118EH kloniert wurde. Das
Plasmid pPS706 wurde zuvor in Patnaik et al., supra, beschrieben.
Beide Plasmide exprimieren die jeweiligen Gene unter dem Plac-Promotor. Das PCR-Fragment, das den glnAp2-Promotor
enthielt, wurde in die EcoRV-EcoRI-Orte der Plasmide pAROG, und
pPS706 kloniert, um die Plasmide p2AROG3 bzw. pPSG706, welche die
jeweiligen Gene enthalten, unter dem glnAp2-Promotor zu erzeugen.
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Der
Wirtstamm BW18302 (lacX glnL2001) wurde mit allen vier Plasmiden
transformiert. Die Stämme mit
den jeweiligen Plasmiden wurden in M9 Salz-Glucose-Medien gezüchtet. Das
Wachstum wurde nach 5 Stunden verglichen. Tabelle 2. Wachstum überexprimierender Stämme
| | OD550 nach 5 Stunden Wachstum |
| kein
Plasmid | ~0,5 |
| Ptac-aroG | ~0,5 |
| glnAp2-aroG | ~0,5 |
| Ptac-pps | ~0,12 |
| glnAp2-pps | ~0,4 |
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Wie
zuvor dargelegt, bewirkte eine Überexpression
von pps unter Verwendung von Ptac-pps eine
deutliche Wachstumsverlangsamung. Jedoch führte die Verwendung von glnAp2
unerwartetermaßen
zu annähernd
normalem Wachstum (Tabelle 2). Nach 15 Stunden wurden Proteine von
jedem Stamm isoliert und auf einem 10% SDS-PAGE-Gel analysiert. Mindestens 500%
mehr pps wurde exprimiert, wenn das pps-Gen durch den glnAp2-Promotor
gesteuert wurde, im Vergleich zu dem Ptac-Promotor.
Bei einer weiteren überraschenden Erkenntnis
war AroG-Protein, dessen herkömmliche Überexpression
nicht offensichtlich schädlich ist,
auch in Extrakten von Zellen um mindestens 300% reichlicher vorhanden,
die einen glnAp2-Promotor
zur Expression verwenden, im Vergleich zum Ptac-Promotor.
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Produktion von Lycopen in E. coli durch
idi-Überexpression
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Wir
konstruierten einen rekombinanten Lycopen-Weg in E. coli durch Exprimieren
der Gene dxs (codiert für
1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphatsynthase)
von E. coli, gps (codiert für
Geranylgeranyldiphosphat-(GGPP)-synthase) von Archaeoglobus fulgidus,
und crtBI (codiert für
Phytoensynthase bzw. -desaturase) von Erwinia uredovora. Diese Gene
wurden in pCL1920, ein Plasmid mit geringer Kopienzahl (low-copy-number-plasmid)
eingefügt,
um pCW9 zu erzeugen, und gleichzeitig überexprimiert.
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Wir
verwendeten den glnAp2-Promotor, um die Expression von idi (Isopentenyl-diphosphatisomerase) zu
steuern. Konstrukte, die das idi-Gen enthielten, wurden aus einem
promotorlosen Vektor, pJF118, abgeleitet. Der glnAp2-Promotor wurde
eingefügt,
um p2IDI zu bilden. Als Steuerung wurde der P
tac-Promotor
eingefügt,
um pTacIDI zu erzeugen. Diese Plasmide wurden separat in einen glnL-Stamm (BW18302) eingefügt, der pCW9
enthielt. Der p2IDI-enthaltende
Stamm (glnAp2-idi) erzeugte 100 mg L
–1 Lycopen
nach 26 h in einem definierten glucosehaltigen Medium. Andererseits
erzeugte der Stamm, der P
tac-idi enthielt,
lediglich eine geringe Menge an Lycopen (< 5 mg L
–1)
unter identischen Bedingungen. Außerdem erzeugte der p2IDI-Stamm fast
dreifach weniger Acetat als pTacIDI, was angibt, dass beim Kohlenstofffluss
zu Acetat eine Umleitung zu Lycopen erfolgte. Tabelle 3. Kohlenstoff-Ertrag von Lycopen-Erzeugung
in Batch-Kulturen
von E. coli
| | Lycopen-Kohlenstoff-Ertrag
bezogen auf Glucose (mol C/mol C) |
| nur
Wirt (BW18302) | 0,0000 |
| +pTacIDI
(Ptac-idi) | 0,0003 |
| +pTacIDI
(Ptac-idi)/pPS184 (Ptac-pps) | 0,0012 |
| +p2IDI
(glnAp2-idi) | 0,014 |
| +p2IDI
(glnAp2-idi)/pPSG184 (glnAp2-pps) | 0,022 |
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Verwendung von pps zur Verbesserung
von Lycopen-Ertrag
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pps
wurde aus glnAp2 überexprimiert,
von einem weiteren kompatiblen Plasmid, pPSG18, hingegen wurde der übrige Teil
des Lycopen-Weges (dxs, gps, crBI) unter Verwendung pCL1920 exprimiert.
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Eine
Coexpression von pps und idi mit dem Lycopen-Weg vergrößerte den
am Schluss vorhandenen Titer von Lycopen um 50% und bewirkte, dass
die Produktivität
um das Dreifache vergrößert wurde,
von 0,05 mg mL–1 h–1 auf
0,16 mg mL–1 h–1 (Tabelle
3). Dies steht im Gegensatz zum Begleit-Stamm, der sowohl pTacIDI als
auch pPS184 (Ptac-idi + Ptac-pps)
enthält,
bei dem keine signifikante Ertragsverbesserung beobachtet wurde und
eine beträchtliche
Wachstumshemmung auftrat.
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Zusätzliche Wirtszellen zur Produktion
von Lycopen
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Die
pykF::cat und pykA::kan-Allele wurden in einen Stamm vom Wild-Typ
eingefügt,
um zwei einzelne Mutanten (JCL1610 (pykF) und JCL1612 (pykA)) und
einen doppelten Mutantenstamm zu erzeugen (JCL1613 (pykF pykA))(Ponce
et al. (1995) J. Bacteriol. 177: 5719–5722). Der doppelte Mutantenstamm
war fähig,
zum Schluss einen Lycopen-Titer von ca. 14 mg Lycopen/g getrockneter Zellen
zu erzielen, hingegen wurden mit den einzelnen Mutantenstämmen jeweils
Lycopen-Titer von ca. 2,5 mg Lycopen/g getrockneter Zellen erzielt. Die
einzelnen pyk-Mutanten erzeugten Lycopen mit einem ähnlichen
Pegel wie der Stamm vom Wild-Typ, ~4 mg Lycopen/g getrockneter Zellen.
Weiter vergrößerte eine Überexpression
von Pck Phosphoenolpyruvat-carboxykinase, den zum Schluss vorhandenen
Lycopen-Titer um ca. das 3-fache. Eine Überexpression von Ppc, Phosphoenolpyruvat-carboxylase,
verringerte die Produktion von Lycopen um ca. 30%. SEQUENZLISTE
