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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung
zur Durchführung
chemischer und biochemischer Assays. Die Möglichkeit, Prozesse auf einem
zellulären
oder subzellulären
Level zu charakterisieren, ist sowohl für die Wirkstoffentdeckung als
auch für
klinische Diagnosen wichtig. Eine Klasse kürzlich untersuchter Wechselwirkungen
ist die Bindung eines biologischen Moleküls an ein anderes Molekül, an eine
Zelle oder einen Teil einer Zelle. Dies kann bspw. die Bindung von
Antikörpern
an Antigene sein, von Hormonen an Rezeptoren, von Liganden an Zelloberflächenrezeptoren,
von Enzymen an Substraten, von Nucleinsäuren an anderen Nucleinsäuren, von
Nucleinsäuren
an Proteine und von Viren an Zelloberflächen.
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Eine
andere Klasse von Wechselwirkungen, die für die Biologie der Zelle wichtig
ist, ist die Diffusion oder der Transport von Molekülen oder
Zellen über
Membranen hinweg. Dies kann bspw. bei der Osmose auftreten, über spezielle
Transportproteine oder durch Phagozytose.
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Viele
Krankheiten werden durch Binde- oder Transportprozesse charakterisiert.
Bei der Heilmittelentdeckung ist es das Ziel, Mittel zur Verstärkung oder
zur Blockierung des Prozesses zu identifizieren. Bei der klinischen
Diagnostik ist es das Ziel, abnormale Funktionen dieser Prozesse
zu detektieren; ferner das Vorliegen von abnormalem Nucleinsäurematerial;
oder zur Identifizierung von Fremdkörpern (wie bspw. Viren oder
Bakterien), um eine Krankheit zu diagnostizieren, so dass eine geeignete
Behandlung verabreicht werden kann.
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Mit
der vorliegenden Erfindung soll ein schnelles und einfaches Assay
bereitgestellt werden, um Binde- und Transportprozesse zu detektieren
und quantifizieren, die bei der Heilmittelentdeckung und für klinische
Diagnosen wichtig sind.
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Für die Zwecke
der folgenden Beschreibung soll „Rezeptor" jedes biologische Molekül, Zelle
oder Struktur bedeuten, die ein anderes Molekül, Zelle oder Struktur bindet. Ähnlich soll „Ligand" jedes organische
oder anorganische Molekül
bedeuten, das an den „Rezeptor" bindet. In der Beschreibung
und den Beispielen liegt der Schwerpunkt auf einem Assay mit einem
markierten Liganden, der an einen Rezeptor bindet. Der beschriebene
Stand der Technik und die Erfindung kann derart erweitert werden,
dass die Wechselwirkung eines nicht-markierten Agonisten oder Antagonisten
in einem Kompetitionsassay eingeschlossen ist, wie es für die Heilmittelentdeckung gewöhnlich eingesetzt
wird.
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Das
grundliegende Prinzip einer reversiblen Bindereaktion wird durch
die folgende Gleichung beschrieben: Dissoziationskonstante
(Kd) = [L] × [R]/[L.R]in welcher
[L] = die Konzentration des ungebundenen Liganden im Gleichgewicht,
[R] = die Konzentration des ungebundenen Rezeptors im Gleichgewicht,
und [L.R] = die Konzentration des gebundenen Liganden-/Rezeptorkomplex
im Gleichgewicht ist.
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Die
Konzentration wird üblicherweise
in Mol berechnet, und Kd steht für den Liganden;
die Proteinwechselwirkung liegen typischerweise im Bereich 10-4 bis 10-5 M-1.
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Das
in der Heilmittelentdeckung und bei der Diagnostik klassischerweise
verwendete Assay ist das Separations-Assay. Bei diesem Assay wird
eine Komponente (bspw. der Ligand) gelöst oder in Lösung suspendiert.
Die andere Komponente (bspw. der Rezeptor) kann auf einer Oberfläche, wie
bspw. die Wände
einer Vertiefung (Well) in einer Mikrotiterplatte, immobilisiert
sein, oder kann auf der Oberfläche
einer Zelle vorliegen. Eine oder beide Komponenten können eine
Markierung tragen, wie bspw. einen fluoreszierenden oder radioaktiven
Marker, der an diese angebracht ist, um die Messung mit einem Instrument
zu unterstützen.
Das Assay wird durch Hinzufügen
der löslichen
Komponente zu einer Vertiefung, die die immobilisierte Komponente
enthält, und
durch Ermöglichen
der Bindung der Komponenten zur Erreichung eines Gleichgewichts
durchgeführt.
Mit herkömmlichen
Detektoren, wie bspw. collorimetrischen, fluoreszierenden oder Radioaktivität-Plattenlesern
ist es nicht möglich,
die Menge des gebundenen markierten Liganden in Gegenwart von freiem
markierten Liganden zu bestimmen. Das Problem wird dadurch gelöst, dass
der freie Ligand von gebundenen Liganden durch Abkippen der Lösung, die
den freien Liganden enthält,
gelöst.
Ein oder mehrere Waschschritte mit frischem Lösungsmittel können durchgeführt werden,
um jeden Überschuss
an freiem Liganden zu entfernen. Eine Messung der verbleibenden
Markierung soll die Konzentration des gebundenen Komplexes in der
ursprünglichen
Lösung darstellen.
Dieses Verfahren kann auch dann durchgeführt werden, wenn der Rezeptor
auf einer Zelle vorliegt. Wenn die Zellen nicht in die Vertiefung
anhaften, werden die Waschschritte über spezielle Filterplatten
durchgeführt,
die die Zellen zurückhalten, die
jedoch das Waschlösungsmittel
hindurchlaufen lassen.
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Dieses
Verfahren funktioniert dann gut, wenn die Dissoziationsrate des
gebundenen Komplexes langsam ist, und wird tatsächlichen bei vielen Assays erfolgreich
angewandt. Nichtsdestotrotz birgt dieses Assay-Verfahren bedeutende
Nachteile, wenn es in einem breiteren Bereich angewandt wird.
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Wenn
die Dissoziationsrate schnell ist, werden einigen der gebundenen
Markierungen zurück
in die Waschlösung
freigesetzt, was zu einem Fehler beim Auslesen führt. Die Effizienz des Waschens
selber kann von einer Probe zur nächsten variieren, wodurch die
Wiederholbarkeit des Assays reduziert wird. Es ist wünschenswert,
die Waschschritte in automatisierten Systemen zu reduzieren oder
zu eliminieren, um den Durchsatz zu erhöhen, die Komplexizität zu reduzieren
und das Risiko einer Kreuz-Verunreinigung zwischen Proben zu eliminieren.
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Einige
nicht-Separations-Assayverfahren sind in den vergangenen Jahren
entwickelt worden, um diese Probleme zu beseitigen, einschließlich des Scintillations-Proximitäts-Assays
(SPA), der Fluoreszenzpolarisation (FP), der Fluoreszenzkorrelations-Spektroskopie
(FCS) und der zeitaufgelösten Fluoreszenz
(TRF). Nichtsdestotrotz bergen diese Techniken Nachteile, die deren
Anwendbarkeit beschränken.
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SPA
beruht auf dem Energietransfer von einem radiomarkierten Liganden
auf einen scintillierenden Bead, auf welchem der Rezeptor angebracht
ist. Das Assay muss mit relativ hohen Konzentrationen durchgeführt werden,
um ein hinreichendes Signal zu produzieren. Die Gesetzgebung bezüglich der
Beseitigung des radioaktiven Materials und das Risiko der Aussetzung
für die
Durchführenden
veranlasste viele Firmen, nach Alternativen zu suchen. SPA ist bei
einigen Assays, bei denen ganze Zellen verwendet werden, nicht geeignet,
und kann auch nicht dazu eingesetzt werden, Rezeptoren oder Proteine
innerhalb von Zellen zu untersuchen. Dies bedeutet, dass ein funktioneller
Rezeptor aus der Zelle isoliert werden muss, um das Assay durchzuführen, was
kostenintensiv und schwierig ist, und in einigen Fällen überhaupt
nicht erreicht werden kann.
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Mit
der FP-Technik wird die Masse eines fluoreszierenden Objekts ausgehend
von seiner Rotationsgeschwindigkeit oder Translokationsgeschwindigkeit
durch Diffusion berechnet. Die Probe wird durch einen Impuls von
polarisiertem Licht beleuchtet, und die emittierte Fluoreszenz wird
in der gleichen oder einer anderen Polarisationsebene gemessen.
Wenn die Markierung an ein großes
Objekt gebunden ist, wird die Rotation oder Translokation langsamer
sein, und die Emission wird in der gleichen Polarisationsebene sein
wie die Anregung für
einige Zeit nach Beleuchtung. Wenn der freie Marker bedeutend kleiner
ist als der gebundene Komplex, kann das Molekül sich schneller aus der Ebene
des einfallenden polarisierten Lichts bewegen und in eine andere
Ebene emittieren. Unter der Voraussetzung, dass der Fluorophor eine
hinreichend lange Zerfallszeit besitzt, wird das Licht, das den
Detektor erreicht, nach Anregung langsamer zerfallen, wenn eine
hinreichend große
Anzahl von Fluorophor-markierten Liganden in der Lösung an
größere Moleküle gebunden
ist.
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Das
Verfahren ist eher eine Korrelation als eine direkte Messung des
gebundenen und freien Markers. Teilweise wird der freie Marke in
der gleichen Ebene wie die der Anregung emittieren. Auch ist notwendig,
dass der markierte Ligand viel kleiner ist als der Rezeptor, und
dass die Zerfallszeit für
den Fluorophor länger
ist als die Rotationsgeschwindigkeit der Zielmoleküle. Diese
Technik hat viele Nachteile: es ist schwierig, zwischen unspezifischer
Bindung sowie verunreinigender Hintergrund-Fluoreszenz und spezifisch gebundenem
markierten Ligand zu unterscheiden; sie kann nicht dazu eingesetzt werden,
intrazelluläre
Wechselwirkungen zu untersuchen; die Empfindlichkeit des Verfahrens
wird dadurch reduziert, dass sie eher auf dem Zerfall des Signals
basiert, als auf einer Peak-Fluoreszenz, und sie ist auf die Verwendung
von bestimmten Fluorophoren begrenzt.
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FCS
ist ähnlich
wie FP, mit der Ausnahme, dass mit FCS Beziehungen einzelner Moleküle untersucht
werden. Mit dieser Technik wird die Größe eines fluoreszierenden Partikels
oder Moleküls
ausgehend von dessen Translokationsgeschwindigkeit durch einen fixierten
Laserstrahl durch die Braun'sche
Bewegung vorhergesagt. Um diese Technik durchzuführen, ist es wünschenswert,
dass nur ein einzelnes Fluorophor-Molekül im Laserstrahl zu einem gegebenen
Zeitpunkt vorliegt. Daher besteht eine praktische Grenze bezüglich darauf,
wie eng der Laserstrahl sein kann (typischerweise im Bereich von wenigen
Mikrometern im Durchmesser). Ferner ist es unpraktisch, eine extrem
kurze Weglänge
durch das Fluid zu haben. Aus diesen Gründen wird FCS gewöhnlich mit
sehr niedrigen Konzentrationen des Markers durchgeführt. Diese
Technik ist für
verunreinigende Hintergrund-Fluoreszenz, die bei praktischen Assays
typisch ist, sehr anfällig.
Ferner ist sie vergleichsweise langsam, und es dauert bis zu einer halben
Stunde kontinuierlicher Messungen, um die Bindung an große Moleküle zu detektieren.
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Die
FCS-Technik ist seit mehr als zwanzig Jahren bekannt. Die Schwierigkeit
der Verwendung dieser Technik für
praktische Assays hat bis vor kurzem ihrem Einsatz entegegengestanden.
Einige der Nachteile dieser Technik sind: der fixierte FCS-Strahl untersucht
lediglich eine Wechselwirkung zu einem gegebenen Zeitpunkt, der
nicht für
die gesamte Probe repräsentativ
sein muss; es kann nicht direkt zwischen spezifischer und unspezifischer
Bindung unterschieden werden; bei der Technik ist es notwendig, die
Assays bei einer sehr niedrigen Konzentration durchzuführen, was
weitere Probleme mit sich führen kann,
wie bspw. der Verlust eines Signals durch eine unspezifische Bindung
des Markers oder Rezeptors an die Gefäßwände, sowie ein niedriges Signal-Geräuschpegelverhältnis als
Ergebnis einer niedrigen Signalstärke. Die Technik ist ferner
gegenüber
wärmeinduzierten
Wirbelströmen
empfindlich. Diese schwerwiegenden Einschränkungen könnten dadurch reduziert werden,
dass eine etablierte Technik, die für die Untersuchung des Flusses
in Flüssigkeiten eingesetzt
wird, angewandt wird. Durch ein Scannen des Laserstrahls wäre es möglich, ein
Schnappschuss der Lage einer Anzahl von fluoreszierenden Partikeln
zu erhalten. Mit aufeinanderfolgenden Schnappschüssen könnte die Geschwindigkeit und die
Richtung der Translokation dieser Partikel und daher deren Massen
bestimmt werden. Jedoch würden
immer noch viele der grundlegenden Beschränkungen der oben aufgeführten Techniken
im Raum stehen.
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TRF
ist ähnlich
wie SPA, wobei es auf dem Energietransfer von einem Molekül auf ein
anderes in enger Nachbarschaft zueinander basiert. In diesem Fall
wird die Energie von einem Fluorophor in enger Angrenzung zu einem
anderen Fluorophor übertragen.
Bei der Technik ist notwendig, dass sowohl der Rezeptor als auch
der Ligand löslich
sind, und dass ein Fluorophor sowohl auf dem Liganden als auch auf dem
Rezeptor vorliegt. Dies ist daher bei Assays nicht geeignet, bei
welchem kein löslicher
Rezeptor gewonnen werden kann, und ferner kann darüber hinaus
die chemische Modifizierung des Rezeptors durch die Hinzufügung eines
Markers schwierig sein und kann zu einer Reduktion oder Eliminierung
der Aktivität
führen.
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In
den vergangenen Jahren ist eine Vielzahl von Instrumenten und Techniken
für ein
Screening von Zellen mit niedrigem Durchsatz eingeführt worden,
die auf bildgebenden Techniken basieren, und zwar unter Verwendung
von Mikroskopobjektiven und/oder CCD-Kameras. Charakteristisch hierfür sind Fluoreszenzmikroskope
und CCD-Scansysteme. Bei diesen Systemen wird eine Lichtquelle eingesetzt,
um eine durchsichtige Platte von unten zu beleuchten. Die Zellen
wachsen auf dem Boden der Vertiefungen der Platten oder werden darauf
aufgebracht, und ein fluorszierender Marker oder fluoreszierendes
Reagens wird zu der Lösung über die
Zellen hinzugefügt.
Der Detektor fokussiert nur auf den Boden der Vertiefungen (auf
den Zellrasen), um zu vermeiden, dass Signale aus der überschüssigen Lösung, die
den freien Marker enthält,
erhalten werden. Die Probe wird auf einem CCD-Array sichtbar gemacht,
und der resultierende Rahmen bezüglich
Helligkeit mittels Software analysiert. Dieser Ansatz kann verwendet
werden, um Fluoreszenz innerhalb oder die Bindung an Zellen oder
Beads sichtbar zu machen, jedoch bestehen einige Nachteile, die
dessen Verwendung für
quantitative Assays begrenzen.
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Ein
CCD hat eine begrenzte Auflösung.
Die größten CCDs,
die heutzutage verfügbar
sind, haben ca. 1 Million Pixel, jedoch haben die kostenintensiven Vorrichtungen,
die bei wissenschaftlichen Instrumenten eingesetzt werden, bedeutend
weniger Pixel. Daher gibt es einen Kompromiss zwischen Sichtfeld
und Auflösung.
Dies bedeutet, dass das Sichtfeld im besten Fall typischerweise
lediglich 1 mm2 mit einer Auflösung von
4 μm ist.
Damit können
nur schlecht aufgelöste
Bilder von ca. 100 Zellen gleichzeitig erhalten werden, was zur
Gewinnung von statistisch signifikanten Ergebnissen bei einigen
Assaytypen nicht ausreichend ist. Die Auflösung reicht nicht aus, um eine
genaue Messung der Größe- und
Formcharakteristika von Zellen oder Beads zu ermöglichen. Die Empfindlichkeit
der CCDs ist wesentlich niedriger als die von PMTs, wodurch sie
nicht hinreichend empfindlich genug sind, um mit ihnen quantitative
Messungen bei niedrigen Lichtleveln durchzuführen (bspw. markierter Ligand
gebunden an Zelloberflächenrezeptoren
aus Zellen, mit niedriger Expression, vielleicht lediglich 5.000
Rezeptoren pro Zelle). Bei quantitativen Kompetitionsassays muss
man in der Lage sein, die gebundene Fluoreszenz weit unter der Sättigung
messen zu können,
und bei CCD-bildgebenden Systemen fehlt diese Möglichkeit. Jedes Pixel aus
dem CCD-Array hat eine unterschiedliche Empfindlichkeit, so dass
die Messungen über
den Scan nicht konsistent sind. Jeder Pixel kann lediglich eine
Farbe zu einem gegebenen Zeitpunkt detektieren. Vielfarbenbilder
können
durch Verwendung eines Filterrads vor einem CCD-Array gewonnen werden,
und es können
viele verschiedene Rahmen mit unterschiedlichen Filtern gewonnen
werden. Dies verlangsamt die Lesezeit, und wenn sich die Probe während der
Messung bewegt (wie es freie Zellen und Beads sehr wahrscheinlich
in Flüssigkeiten
tun werden), geht die Spektral-Information verloren. Viele verschiedene
CCD-Arrays können eingesetzt
werden, um Bilder in vielen verschiedenen Farben zu sammeln, jedoch
ist es nicht möglich,
eine perfekte Pixel-Ausrichtung zwischen den Detektoren zu erreichen,
oder eine echte simultane Multi-Wellenlängendetektion zu erreichen.
CCD-Arrays zeigen keine einheitliche Empfindlichkeit über den
sichtbaren Bereich hinweg. Bei einer Hintergrundzurückweisung
bei niedrigen Signalleveln ist es wichtig, dass echte simultane
Spektralmessungen durchgeführt
werden.
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Mit
CCD-Arrays ist es nicht möglich,
ein Gebiet wiederholt mit Geschwindigkeiten zu scannen, die schnell
genug sind, Messungen von schnellen Übergängen oder Zeit-aufgelösten Fluoreszenztechniken
durchzuführen
(Nanosekunden bis Mikrosekunden Erfassungs-Geschwindigkeiten).
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Einige
Systeme, wie bspw. das „FLIPR" von Molecular Devices
und FMATTM von Perkin Elmer scannen die
Probe mit einem Laser. Bei diesen Systemen werden konfokale Optiken
eingesetzt, um die Tiefe des Felds des Detektors bewusst zu begrenzen,
wodurch das Hintergrundsignal des freien Markers minimiert wird.
Dieses Signal wird nicht zur Messung von Konzentrationen des gebundenen
gegenüber
dem freien Marker eingesetzt. Darüber hinaus ist die Auflösung dieser
Systeme zu schlecht, um eine genaue Messung der Form oder Größe von kleinen Beads
oder Zellen zu ermöglichen.
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Sämtliche
bildgebende Systeme versuchen nicht, die Konzentration des freien
Markers zu messen. Bei Assays, die in ein dynamisches Gleichgewicht
resultieren, wie bspw. Rezeptor-/Liganden-Bindungsassays, ist es
notwendig, eine Messung von sowohl von freien als auch dem gebundenen
Liganden zu erhalten, um die Gleich gewichtskonstante oder verwandte
Messungen, wie bspw. IC50 zu erhalten. Dies ist insbesondere bei
praktischen Assays wichtig, bei welchen die Variabilität bei den
flüssigen Handhabungsvorrichtungen
und der Verdampfungseffekt bedeuten kann, dass die Konzentration
des Liganden im Assay nicht mit der erwünschten Konzentration korrespondiert.
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Zusätzlichen
zu den beschriebenen Beschränkungen
jede der Techniken bestehen allgemeine Nachteile bei all den Techniken
für Anwendungen über den
breiten Assaybereich hinweg. Mit der Entwicklung des Hochdurchsatz-Screenings
ist es wichtig, dass so viele Assaytypen wie möglich mit einem einzigen System
ausgeführt
werden können. Bei
jeder der zuvor genannten Techniken wird ein eigener Detektor benötigt. Hierfür werden
oftmals ganze Screening-Teams benötigt, die unterschiedliche Detektoren
in die automatisierten Systeme anschrauben müssen, wenn von einem Assaytyp
zu einem anderen gewechselt wird. Dadurch wird noch mehr Zeit benötigt und
dadurch müssen üblicherweise
auch die automatisierten Maschinen reprogrammiert werden.
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Die
Fluoreszenz-Dektektion wird zum Verfahren der Wahl für die Heilmittelentdeckung,
damit Empfindlichkeiten bereitgestellt werden, die nahe denjenigen
von Assays mit radioaktiven Markierungen sind, jedoch ohne Gesundheitsrisiken
und die Beseitigungsprobleme. Die vorliegende Erfindung bietet eine
praktische Lösung
für die
oben beschriebenen Probleme.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird ein Verfahren zur Durchführung eines nicht-Separations-Assays
bereitgestellt, zum Bestimmen des Ausmaßes der Bindung einer Komponente
an eine andere, wie im nachfolgenden Anspruch 1 beansprucht.
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Durch
die Anwendung mathematischer Berechnungen auf die Signale, die von
dem Detektor empfangen werden, können
bestimmte Parameter bestimmt werden.
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Das
beleuchtende Licht kann durch einen Laserstrahl erzeugt werden.
Das empfangene Licht kann ein Licht sein, das durch Fluoreszenz
erzeugt wird, und mehr als eine Wellenlänge des Lichtes kann empfangen
werden.
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Die
empfangene Intensität
kann dazu eingesetzt werden, die Größe und/oder das Volumen jeder Zelle,
Beads, Oberfläche
oder jeder Vertiefung und die Anzahl der darin gebundenen Moleküle zu bestimmen.
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Das
beleuchtende Licht kann derart angeordnet werden, dass die Probe
von oben oder von unten bestrahlt wird, wobei das emittierte Licht
von oberhalb oder unterhalb der Probe in irgendeiner Kombination
derart detektiert wird, dass das beleuchtende Licht sowohl die Stelle
als auch ein bedeutendes Volumen der Lösung oberhalb oder angrenzend zu
der Stelle beleuchtet wird.
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Mit
der vorliegenden Erfindung wird ferner eine Vorrichtung zur Durchführung eines
nicht-Separations-Assays bereitgestellt, zur Bestimmung des Ausmaßes der
Bindung einer ersten markierten Komponente in Lösung an eine zweite Komponente, wie
im nachstehenden Anspruch 11 beansprucht.
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Ein
Vorteil der vorliegenden Erfindung ist es, dass sie dazu eingesetzt
werden kann, einen Referenzwert für die Lösung, in welcher die Beads,
Zellen, Oberfläche
oder Vertiefungen liegen, bereitgestellt wird, so dass die Konzentration
jeder fluoreszierenden Komponente in der Lösung gemessen werden kann (freie
Komponente) und die Anzahl der Moleküle jeder fluoreszierenden Komponente,
die an den Bead, die Zelle, Oberfläche oder Vertiefungen (gebundene
Komponente) gebunden ist, gemessen werden kann, und ein Ausgleich
für jedes
Signal von der freien Komponente geschaffen werden kann, das mit dem
Signal von der gebundenen Komponente zusammenfällt, so dass ein genauer Wert
für die
Anzahl der an die Beads, Zelle, Oberfläche oder Vertiefung gebundenen
Moleküle
gemessen werden kann, und ferner, dass die Verhältnisse zwischen gebundenen und
freien Signalen geschätzt
werden kann, ohne dass es nötig
wäre, die
Komponenten zu trennen. Darüber
hinaus ist es mit dem Verfahren und der Vorrichtung gemäß der Erfindung
möglich,
nicht nur das Ausmaß der
Bindung, sondern auch die Fläche
des Beads, der Zelle, der Oberfläche
oder das Volumen jeder Vertiefung zu bestimmen, um genauere Ergebnisse
sicherzustellen.
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Die
Lichtquelle kann die Lösung
und die Stellen auf lineare Art und Weise scannen, wobei ein Scan
den nächsten
Scan überlappt,
so dass eine kontinuierliche Messung der empfangenen Lichtintensität bereitgestellt
werden kann. Die Daten, die sich auf die empfangene Lichtintensität beziehen, können durch
Anwendung eines festgesetzten oder variablen Grenzwertes gefiltert
werden, um die Datenmenge, die verarbeitet werden muss, zu reduzieren.
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Ein
weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass es durch Einsatz
des kontinuierlichen Scannens der Beads, Zellen, Oberflächen oder
Vertiefungen und Lösungen
möglich
ist, die Lage der Beads, Zellen, Oberfläche oder Vertiefung genau zu
bestimmen, und auch eine verlässliche
Anzeige falscher Ergebnisse zu ermöglichen, die durch Verunreinigungen
und Ähnlichem
verursacht werden.
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Noch
ein weiterer anderer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist es,
dass der Meniskus der Probe gleichzeitig mit der Messung des gebundenen/freien
Markers gemessen und in der mathematischen Analyse kompensiert werden
kann.
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Ein
Beispiel der vorliegenden Erfindung wird nun mit Bezug auf die beigefügten Zeichnungen
näher erläutert, in
welchem:
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1 eine
schematische Zeichnung einer Vorrichtung ist, die zur Ausführung der
vorliegenden Erfindung eingesetzt werden kann;
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2 eine
schematische Darstellung ist, die den Scan-Vorgang der Vorrichtung
aus 1 zeigt; und
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3 eine
schematische Seitenansicht des Verfahrens und der Vorrichtung der
Erfindung ist, die auf zwei Assay-Stellen angewandt werden;
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4 und 5 die
grundlegenden theoretischen Elemente der Erfindung darstellen;
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6 bis 14 Diagrammsets
sind, die den Output einer Vorrichtung gemäß der Erfindung an verschiedenen
Etappen während
eines Verfahrens zeigen, mit welchen ein Assay durchgeführt wird;
und
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15 bis 21 ein
Diagrammset zeigen, das sich auf ein drittes Beispielassay bezieht,
mit welchem theoretische Hypothesen bereitgestellt werden.
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Die
US-A-5663057 beschreibt
ein Verfahren zur schnellen Detektion von Mikroorganismen im Wasser.
Letzte Verfahrensschritte dieses Verfahrens schließen das
Scannen eines Lasers über
eine Filtermembran mit ein, auf welchem Fluoreszenzmarkierte Bakterien
zurückgehalten
werden. Bei dem System wird eine Kombination aus Diskriminanten
und Grenzwert-Algorithmen eingesetzt, um einzelne Zellen gegen den
kontinuierlichen Hintergrund des freien Markers und der Hintergrund-Fluoreszenz zu selektieren.
Die Linienamplitude, die für
jede Zelle gewonnen wird, ist eine genaue Messung der Fluoreszenzintensität der Zelle
und kann kalibriert werden, wodurch eine Messung der Menge des gebundenen Fluorophors
erzielt wird. Aufgrund der Markierung der Bakterien liegt immer
etwas freier Marker vor, jedoch ist dies für die bakterielle Detektion
unerwünscht,
und das Verfahren gemäß der
US-A-5663057 versucht dies dadurch
zu minimieren, dass der Marker soweit wie möglich innerhalb der Zellen
zurückgehalten
wird, und versucht die Flüssigkeit
auf der Probe durch die Verwendung einer porösen Membran zu minimieren.
Aus diesen Gründen gibt
es gegenwärtig
keine definierte und homogene Flüssigkeitsschicht,
die für
die Messung einer Konzentration eines Markers in Lösung geeignet
wäre. Das
System misst die durchschnittliche Hintergrund-Fluoreszenz. Diese
Daten werden für
Referenzzwecke gesammelt und nicht bei der Detektion von Mikroorganismen
eingesetzt.
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1 zeigt
ein schematisches Diagramm einer Vorrichtung, die in der
US-A-5663057 eingesetzt wird,
die jedoch zur Durchführung
des Verfahrens gemäß der Erfindung
angepasst ist, wobei diese Vorrichtung nachstehend detaillierter
beschrieben werden wird.
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Bezug
nehmend auf 1 strahlt ein Laser 1 einen
beleuchtenden Lichtstrahl 2 ab, der an einer Reihe von
Spiegeln vorbeigeführt
wird, sowie an einem Strahlerweiterer 3. Der beleuchtende
Strahl 2 wird dann über
die Scan-Spiegel 4 und eine Linse 5 weiter ausgerichtet.
Die Scan-Spiegel 4 können
gesteuert werden, um den Strahl 2 über die Oberfläche eines
Filters 6 und einer Assayprobe 7 derart hinwegzuscannen,
wie es nachstehend mit Bezug auf 2 beschrieben
wird.
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An
der Strahlerweiterungsposition 3 kann ein Teleskop eingeführt werden,
um den Spot mit unterschiedlichen Abständen zu der Scan-Linse 5 fokussieren
zu können,
oder aber um die Größe des Laserspots
auf dem Ziel zu steuern.
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Das
Licht von der Assayprobe 7 wird durch den Filter 6,
die Linse 7 und die Spiegel 4 zu einem oder mehrerer
Lichtempfangeinheiten 8 zurückgeführt, welche in diesem Beispiel
Fotovervielfacher sind. Die Signale, die durch den Fotovervielfacher 8 generiert
werden, werden einer Analyse 9 zugeführt, welche Amplitikations-
und Erfassungselektroniken 10 aufweist. Das amplifizierte
und erfasste Signal wird anschließend an Datenverarbeitungsmittel 11 weitergeleitet,
deren Arbeitsweise nachstehend beschrieben werden wird. Der Output
der Verarbeitungsmittel 11 wird an eine Display-Vorrichtung 12 weitergeleitet,
die ein einfacher Monitor oder ein Computer sein kann.
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Bezug
nehmend auf 2 ist ersichtlich, wie der Lichtstrahl 2 sequentiell über die
Assayprobe 7 gescannt wird, so dass die gesamte Probenoberfläche bedeckt
ist. Es ist bevorzugt, wenn der Scan-Vorgang derart durchgeführt wird,
dass jeder benachbarte Scan den vorherigen Scan überlappt, wodurch sichergestellt
ist, dass keine Merkmale ausgelassen werden. Die Verarbeitungsmittel 11 können derart ausgestaltet
sein, dass sie die Überlappung
kompensieren.
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Die
Prinzipien des Betriebs des Systems gemäß der Erfindung werden nun
Bezug nehmend auf die 3 und 4 erläutert. 3 zeigt,
wie Linienamplituden erhalten werden, wenn eine Probe gescannt wird. 4 zeigt
die Prinzipien des Assays.
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Beispiel 1
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Zur
erleichterten Darstellung eines einfachen Beispiels gemäß der Erfindung
werden zunächst eine
Anzahl von Hypothesen vorgenommen:
- 1. Der Laserstrahl
soll ein Volumen von nr2h beleuchten, wobei
r der Radius des Strahls (in unserem Beispiel 3 μm) ist, und h die Tiefe der
Flüssigkeit
ist. Dies wird als Laserbeleuchtungsvolumen (N) bezeichnet.
- 2. Die Fluorophor-Lösung
ist verdünnt,
es gibt ein minimales Quenching, und jedes Molekül des Fluorophor in dem Volumenelement
strahlt mit der gleichen Intensität.
- 3. Eine Zelle oder ein Bead besitzt ein sphärisches Volumen, und alle Fluorophor-Moleküle, die an
diese Zelle oder das Volumen gebunden sind, besitzen eine ähnliche
Fluoreszenz, wie sie in Lösung
haben würden.
Dies wird als Bead-Volumen (BV) bezeichnet.
- 4. Jedes Bead oder jede Zelle soll jeweils eine lokale Konzentration
eines Rezeptors repräsentieren,
welche die Rezeptoranzahl geteilt durch das Bead-Volumen ist.
- 5. Wo kein Bead oder keine Zelle im Volumenelement vorliegt
(„leeres
Volumenelement")
liest der Detektor die Fluoreszenzintensität nur aufgrund des freien Markers.
Dieser Intensitätswert
wird „leeres
Volumenelementsignal" oder
UVS bezeichnet. Wenn eine Zelle oder ein Bead in dem Laservolumenelement
liegt (ein „gefülltes Volumenelement") wird das Intensitätssignal
aus den additiven Intensitäten
des Markers berechnet, der auf der Zelle oder dem Bead konzentriert
ist, und dem Signal des freien Markers im Überschuss des Volumenelements über dem
Bead oder der Zelle. Dieses Signal wird als „gefülltes Volumenelementsignal" oder PVS bezeichnet.
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Während ein
Fachmann diese Hypothesen als ungenau betrachten mag, haben wir
in den Beispielen 3 sowie in den 15 bis 21 gezeigt, dass
diese Hypothesen hinreichend sind, um das Verfahren mit einer hohen
Korrelation zwischen beobachteten und erwarteten Werten durchzuführen.
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Es
ist klar, dass die Konzentration der fluoreszierenden Moleküle im Zellvolumen
signifikant höher
oder niedriger als das äquivalente
Volumen der Lösung
sein müsste,
damit das System einen Unterschied detektieren kann: Signalverhältnis PVS/UVS
= <1>
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In
den meisten Fällen,
wurde auf PVS/UVS >1
abgezielt, um die Bindung eines Fluorophors an eine Zelle oder ein
Bead zu zeigen. Die Helligkeit des Zellvolumens beruht vorrangig
auf drei Faktoren: die Anzahl der Bindestellen (oder Rezeptoren)
auf der Zelle oder dem Bead; der Kd der
Assoziierung sowie der Konzentration des markierten Liganden in
Lösung
beim Gleichgewicht.
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Es
ist auch klar, dass die vorliegende Erfindung dazu eingesetzt werden
kann, das Ausmaß der Bindung
oder die Nähe
eines Fluorophores an eine Oberfläche dort zu bestimmen, wo diese
Oberfläche den
Fluorophoren modifizieren kann, oder die Emission maskieren oder
derart quenchen kann, dass das Licht-Output von Fluo rophor reduziert
oder lokal eliminiert wird. Beispiele schließen die Umwandlung einer fluoreszierenden
Verbindung in eine nichtfluoreszierende Verbindung durch ein Enzym
mit ein, einer Reduktion der Fluoreszenz aufgrund des Vorliegens eines
quenchenden Stoffes auf einer Oberfläche, einem Bead oder Zelle;
die Translokation eines Markers in eine Zelle und der Wechsel in
den Spektrum-Charakteristika eines Fluorophores; die Beispiele sind
jedoch nicht hierauf beschränkt.
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Wenn
die Konzentration des freien Fluorophors zu groß ist und/oder die Flüssigkeit
zu tief ist, wird es nicht möglich
sein, die markierte Zelle zu detektieren. Daher müssen bei
praktischen Assays diese Parameter innerhalb der empfindlichen Grenzen erhalten
werden. 5 zeigt vorhergesagte Werte für die PVS/UVS-Signalverhältnisse,
die gegen Kd bezüglich der folgenden Konditionen
geplottet sind: Bead: 6 μm
Durchmesser, mit variierenden angezeigten Anzahlen von Bindestellen;
Laserstrahl: 6 μm Durchmesser;
Flüssigkeitstiefe:
100 μm;
und eine Konzentration des markierten Liganden im Gleichgewicht
von 1 nM.
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Mit
den oben gemachten Hypothesen ist es möglich, eine Berechnung für die Anzahl
der Moleküle
oder der Oberflächenkonzentration
eines Liganden, der an jedes Bead oder jede Zelle gebunden ist, sowie
für die
Konzentration des freien Liganden abzugeben. In diesem Fall gilt: [frei] ∝ UVS [gebunden] ∝ PVS – (UVS.(IV-BV/IV) in
welcher
Konzentration des freien Markers = [frei]
Konzentration
des gebundenen Markers = [gebunden]
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Dies
stellt einen sehr vereinfachten Fall für beispielhafte Zwecke dar.
In der Praxis ist es notwendig, eine Anzahl von Faktoren zu korrigieren,
wie bspw. die Feldtiefe, die Flüssigkeitstiefe,
der Meniskus der Flüssigkeit,
die Laserverzögerung,
das Quenchen etc. Korrektionsverfahren für dieses Modell, um die Genauigkeit
der Messung zu verbessern, werden in späteren Beispielen vorgestellt.
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Ein
praktisches Beispiel der Erfindung wird nun beschrieben.
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Beispiel 2
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Ein
einfaches Beispiel einer Ausführungsform
gemäß der Erfindung
ist in 6 gezeigt. Eine 5 μl Probe einer
Lösung
mit 48 nM Fluoresceinisothiocyanatmarkiertem Biotin (FITC-Biotin)
wird zu 5 μl einer
Pufferlösung
hinzugefügt,
die ein einzelnes Bead mit 2,8 μm
Durchmessern enthält,
welches mit Streptavidin beschichtet ist (erhalten von Dynal). Die Probe
wurde dem Instrument zum Scannen zugeführt, und zwar als ein 10 μl Tröpfchen auf
der Oberfläche
eines Glas-Objektträgers.
Die Beleuchtung und die Lichtsammlung wurde von oberhalb der Probe
angeordnet. Das Instrument wurde derart eingerichtet, dass es Fluoreszenz-Intensitätsmessungen mit
1 μm Intervallen über die
Probe in x-Richtung mit einem Linie-zu-Linie-Schritt von 2,2 μm in die
y-Richtung durchführte.
Als Laserspotgröße wurde
6 μmm gewählt, was
die Überlappung
zwischen jeder Scan-Linie ermöglichte.
Die Histogramme geben die relative Intensität (analog-in-digital-Umwandler
oder ADC-Zahler) gegen die Position (Probennummer) bezüglich mehrerer
benachbarter Scan-Linien wieder. Anfänglich hatte das FITC-Biotin
nicht genügend Zeit,
um zu den Streptavidin-Stellen,
die auf dem Bead konzentriert waren, zu diffundieren. Die Probe wurde über die
Dauer des Experiments mit Intervallen gescannt. Es ist leicht ersichtlich,
dass das von der Beleuchtung erhaltene Signal proportional zu der Anzahl
der Markermoleküle
(FITC-Biotin) im Weg des Lasers zu jedem gegebenen Punkt sein wird. Wenn,
wie in diesem Fall, der Marker durch das Tröpfchen hindurch homogen verteilt
ist, dann ist das Signal an jedem Punkt proportional zur Weglänge des
Lasers durch die Probe. Das obere Diagramm zeigt klar, dass jede
Scan-Linie einen Durchschnitt durch das Tröpfchen darstellt, und dass
der Meniskus des Tröpfchens
in diesem Fall, wie erwartet, halbkugelförmig ist.
-
Wenn
die Konzentration des Markers bekannt ist, ist es offensichtlich,
dass das Volumen und die Form einer Probe (in diesem Falle ein Tröpfchen) durch
Berechnungen geschätzt
werden kann. Daraus folgt, dass, wenn das Volumen oder die Höhe einer
Lösung
bekannt ist, dass es nach Kalibrierung der Vorrichtung mit bekannten
Lösungen
möglich
ist, die Berechnung des freien Markers aus den gewonnenen Intensitätssignalen
zu berechnen.
-
Über die
Zeit diffundiert das FITC-Biotin zu dem Bead und wird schrittweise
auf der Oberfläche des
Beads (untere Plots) konzentriert. Bei diesem Experiment war nach
30 Minuten ein Gleichgewicht erreicht. Es ist ersichtlich, dass
das Signal auf dem Bead signifikant höher ist als das eines äquivalenten Volumens
an Lösung,
und dass das Signal von diesem Bead zu dem Signal der Lösung hinzugefügt wird
(PVS/UVS = ungefähr
6,1 im Gleichgewicht).
-
Grenzwertsetzung und Datenreduktion
-
In
Beispiel 2 wurde eine Messung vorgenommen und die Daten zu jedem
Punkt in der Probe gespeichert. Der Chemscan®RDI,
der für
diese Anwendung modifiziert wurde, besitzt drei Detektorkanäle, und
mit ihm können
im Überschuss
600 Millionen Ablesungen in einem einzigen Scan mit 400 mm2 erreicht werden. Es ist wünschenswert,
die Menge an Daten, die an den Computer zur Endanalyse weitergegeben
wird, zu reduzieren, um die Analyse zu beschleunigen und um die
Menge der Daten, die für
die Archivierung gespeichert werden muss, zu vermindern. Dies kann
durch die Anwendung eines Grenzwert-Algorithmus auf die Rohdaten
erreicht werden. Die Erfindung setzt dabei zwei Typen an Grenzwert-Algorithmen
ein. Bei der „Frequenz-Tabelle"-Grenzwertsetzung
wird jede Messung in eine Tabelle von Intensitätswerten gesetzt. Wenn eine
einzelne Messung die durchschnittliche Intensität sämtlicher Messungen, die bis
zu diesem Punkt genommen wurden, mit einem vorbestimmten Prozentsatz überschreitet
(bspw. 20 %) dann wird die Messung an den Computer weitergeleitet.
Alle Messungen, die diesen Grenzwert nicht überschreiten, werden verworfen.
Bei der „dynamischen
Grenzwertsetzung" berechnet
das System einen sich bewegenden Durchschnitt des Signals und behält diejenigen
Messungen zurück,
die mit einem vorbestimmten Prozentsatz überhalb des sich bewegenden
Durchschnitts befinden. Es ist auch möglich, eine dynamische Grenzwertsetzung
durchzuführen,
indem der Verlauf der Signalantwort kontinuierlich gemessen und
der Start und das Ende eines Ereignisses angestoßen wird, wenn der Verlauf
oder die Rate des Wechsels des Verlaufs größer oder kleiner ist als ein vorbestimmter
Wert oder ein gesetzter Prozentsatz des Durchschnitts.
-
Frequenztabellen-Grenzsetzung
funktioniert dann gut, wenn es wenig helle Objekte in der Probe gibt,
und der Hintergrund niedrig ist. Die dynamische Grenzwertsetzung
besitzt den Vorteil, dass mit ihr Signale isoliert und aufgezeichnet
werden können,
die auf einzelne Stellen in Gegenwart von bedeutenden Konzentrationen
des freien Markers.
-
Die
Rohdaten für
ein oder mehrere der Linien wird über einen kurzen Zeitraum durch
das System während
des Scannens zurückbehalten.
Dies bedeutet, dass, wenn ein Objekt wie bspw. ein Bead oder eine
Zelle durch die Grenzwertsetzung detektiert wird, die Messproben
sofort vor und nach dem Objekt zurückgehalten werden können, zusammen
mit dem Rest der Messproben für
das Objekt vor Zurückweisung
des Rests der Hintergrunddaten. Diese werden als Prä- und Post-Proben
bezeichnet.
-
In
7 ist
eine typische Scan-Karte fluoreszierender Partikel gezeigt, die
in einer flüssigen
Probe mit einem Chemscan
®RDI-Instrument des Typs gemessen
wurden, der in der
US-A-5663059 gezeigt ist,
wobei gleichzeitig ein dynamischer Grenzwert verläuft. Die
Scan-Karte auf der linken Seite zeigt sämtliche gefundenen fluoreszierenden
Partikel; die Scan-Karte auf der rechten Seite zeigt diejenigen Partikel,
die auf die Charakteristika passen, die bezüglich der Beads fortgesetzt
wurden, die mit Fluoreszenz markiert sind, und zwar in einem Assay,
das gemäß dem Verfahren
der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurde.
-
Berechnung der Größe und des
Volumens des Beads oder der Zelle
-
8 zeigt
die Linienamplituden eines typischen markierten Beads. Beads und
Zellen, die in vielen Fällen
kugelförmig
sind, führen
zu Linienamplitude-Plots („Z"), die „Halbsinuskurven" in X und Y sind.
Diese Plots stellen keine exakten Repliken der Beads oder Zellen
dar. Dies ist lediglich eine Näherung.
So besitzt bspw. der Prototyp eine Strahlenergie, die gemäß der Gauß'schen Verteilung
verläuft. Ein
Beads ist kugelförmig.
Deshalb ist eine Korrigierung hinsichtlich der weiteren Breite der
Beads eine Kombination aus einer Gauß'schen Verteilung und einer Sinuskurvenfunktion.
Die Erfassungsrate ist höher
als die Scanrate, weshalb bspw. Proben jeweils in einem Intervall
von 1 μmm
gezogen werden (Scannen bei 2 ms-1 und Abfragen
bei 2 MHz), jedoch ist die Laserspotgröße größer (6 μmm Durchmesser). Dies bedeutet,
dass der wahre Durchmesser eines Beads oder einer Zelle ungefähr der Breite
des Plots minus zweimal des Durchmessers des Laserspots entsprechen
wird. Beads mit einer bekannten Größe werden dazu eingesetzt,
das Instrument zu kalibrieren.
-
Messung von freier und gebundener
Fluoreszenz
-
Wenn
ein Bead oder eine Zelle kleiner oder gleich groß ist wie der Durchmesser des
Laserspots, dann sollte die Peak-Intensität auf dem Plot der Linienamplitude
direkt proportional zur Menge des Fluorophor sein, der an dem Bead
oder die Zelle gebunden ist, und zu dem Volumen der Fluorophor-Lösung oberhalb
dessen. Dies kann als die PVS genommen werden. Bei Beads oder Zellen,
die größer als
der Laserspot sind, wird der Wert der Peak-Intensität durch einen
Wert unter-lesen, der proportional zum Durchmesser der Zelle oder
des Beads ist, wofür
jedoch kompensiert werden kann. Der Bereich unterhalb des 3-D-Plots
kann auch dazu eingesetzt werden, die PVS mit einer anderen Kalibrierung
darzustellen.
-
Die
UVS kann aus den Prä-
und Post-Proben gewonnen werden, die vor und nach einem durch einen
Grenzwert-Algorithmus detektiertem Bead oder Zelle gezogen wurden.
-
Auf
diese Weise ist es möglich,
Auslesungen sowohl für
den gebundenen als auch den freien Marker zu erhalten, ohne sämtliche
gesammelten Rohdaten zu speichern. Bezüglich des Signals von freien Marker,
der zu dem gebundenen Marker hinzugefügt wird, kann eine Korrektur
vorgenommen werden, indem ein korrespondierender Abschnitt des UVS
bis zu 100 % abgezogen wird. Alternativ wird mit dem dynamischen
Grenzwert automatisch eine Grundlinie für den Beitrag des freien Markers
zur PVS bereitgestellt, und der gebundene Marker kann als die Höhe oder
das Gebiet des Peaks oberhalb dieses Grenzwerts genommen werden.
Es ist ersichtlich, dass der Wert für die Peak-Intensität für das gefüllte Volumenelement
aus dem Maxima dieses Plots gewonnen werden kann, und dass die Intensität des freien
Volumenelements von den Prä-
und Post-Proben der Ränder
des Plots erhalten werden kann.
-
Das
freie Volumenelementsignal kann auch von dem durchschnittlichen
Hintergrundgrenzwert erhalten werden, der durch das System aufgezeichnet wird,
oder als das niedrigste Signal, das irgendwo im Scan gewonnen wird.
-
Statistische Abfrage und Analyse
-
Einzelne
Beads oder Zellen können
in Schlüsselparametern
wie bspw. Größe, Anzahl
der Bindestellen oder Rezeptor-Expression enorm variieren. Aus diesen
Gründen
ist es zu vermeiden, sich auf die Messung von Signalen aus lediglich
einer handvoll Beads oder Zellen zu verlassen, wenn quantitative
Daten gesammelt werden. Bei dem Verfahren gemäß der Erfindung kann eine signifikante Anzahl
an Beads oder Zellen verwendet werden (typischerweise 100-1000 in
einer Probe). Die Schlüsselparameter,
wie bspw. Peak- oder Durchschnitts-Intensitäten aller Beads oder Zellen,
werden individuell abgespeichert, diese Daten werden anschließend als
eine Population verarbeitet. Jeder Bead oder jede Zelle ist effektiv
ein separates Assay, und die Daten, die für die Population erhalten werden,
stellen typischerweise eine Gauß'sche Verteilung dar
(siehe 9).
-
Die
Erfindung setzt Populationsstatiken ein, um genaue Daten für eine darauffolgende
mathematische Analyse bereitzustellen. Die Werte für die Peak-Intensität oder Gebietsintensität der Zielstelle sowie
die Intensität
des benachbarten freien Markers wird hinsichtlich jeder Stelle in
der Probe aufgezeichnet. Diese Daten werden dann als Frequenzhistogramm
geplottet. Auf die Populationsdaten wird eine Gauß'sche Verteilung angewandt,
und der Mittelwert wird berechnet. Das gleiche Verfahren der Gauß'schen Anpassung wird
auf Frequenzhistogramme für
andere größere Diskriminanten,
wie bspw. die Größe, Form
und Spektral-Charakteristika angewandt. 10 zeigt
ein Frequenzhistogramm hinsichtlich der Peak-Intensität einer
Bead-Population mit einer Intensität, die nahe dem Hintergrundgeräusch-Grenzwert-Cutt-Off
ist. Hier ist ersichtlich, dass die Anpassung dieser Daten auf eine Gauß'sche Verteilung zu
einer genauen Darstellung der Population führt, wohingegen ein Durchschnitt diejenigen
Ergebnisse ignorieren würde,
die unterhalb des detektierbaren Grenzwertes liegen. 11 zeigt
die Korrelation zwischen Histogrammen bezüglich unterschiedlicher Messungen
der gleichen Population. 12 zeigt
ein typisches Histogramm der „Gauß'schen Form", die eine Population
kontaminierender Partikel unterscheidet. Man beachte, dass die Population
der kontaminierenden Partikel selber nicht über eine Gauß'sche Form verteilt
ist.
-
Korrektur der Meniskuseffekte
der Flüssigkeit
-
Der
Meniskus der Flüssigkeit
kann bei der Durchführung
der Assays ein Problem darstellen. Es ist wünschenswert, eine festgesetzte
Weglänge durch
die Flüssigkeit
zu haben (einheitliche Tiefe), um genaue und reproduzierbare Messungen
sowohl innerhalb einer Vertiefung als auch von einer Vertiefung
zum nächsten
zu erhalten, wenn die Probe von oben gescannt wird. Der Meniskus
fungiert auch als eine Linse, was möglicherweise dazu führt, dass
Abschnitte der Probe außerhalb
des Fokus liegen. Leider kann es extrem schwer sein, den Meniskus
in den kleinen Volumen, die für
das Arzneimittel-Screening gefordert werden (< 1 μl),
zu kontrollieren, da sowohl ein konvexer als auch ein konkaver Meniskus
in der gleichen Vertiefung vorliegen kann. 6 zeigt
die Möglichkeit
der Vorrichtung, den Meniskus einer flüssigen Probe zu plotten. Diese
Probe war in Tropfen auf einen flachen Objektträger. Das System wurde auch
dazu verwendet, die Meniski von Proben in Mikrovertiefungen zu plotten,
und zwar während
von oben oder von unten gescannt wurde. Die Konzentration des freien
Markers ist über
das Volumen der Probe im Wesentlichen konstant, und die UVS kann dazu
eingesetzt werden, den Meniskus zu plotten, wodurch eine mathematische
Anpassung auf die Daten übertragen
werden kann, um dessen Auswirkungen zu korrigieren. Die Daten können durch
Plotten der UVS von den Signalen, die von den durch die dynamische
Grenzwertsetzung detektierten Stellen erhalten wurden, weitestgehend
reduziert werden. Auf diese Weise würden eintausend Stellen (bspw.
Zellen) für
mehrere tausend UVS Auslegungen sorgen, was es ermöglicht,
dass der Meniskus in hinreichender Weise korrigiert wird, wenn auch
bei einer niedrigeren Auflösung.
Das PVS/UVS-Verhältnis
kann durch die Messung der Peak-Intensität (für PVS) und des Durchschnitts
der Prä-
und Post-Proben (für UVS)
für jede
Stelle bestimmt werden.
-
Kalibrierung
-
Das
von dem Detektor erhaltene Signal ist nicht immer direkt proportional
zum Laserdurchmesser- und zur Flüssigkeitstiefe.
So ist bspw. Folgendes denkbar:
- 1. Der Laserspot
fokussiert vorzugsweise auf den Boden der Vertiefung. Je nach optischem
Set-up kann die Tiefe des Fokusses sich mit dem Spotdurchmesser ändern. Mit
dem experimentellen System erreichte eine Laserspotgröße von 6 μm Durchmesser
eine ± 26 μm Fokustiefe.
Eine Erhöhung
dieses Wertes auf 10 μm
ergab eine ± 74 μm Fokustiefe.
Wenn die Flüssigkeitstiefe
größer ist als
die Fokustiefe, wird ein Abschnitt des Laservolumenelements außerhalb
des Fokusses liegen.
- 2. Der Winkel der Lichtsammlung wird beschränkt sein, wobei die Lichtsammlung
von Markermolekülen
in der Flüssigkeit,
die dem Detektor am nächsten
liegen, effizienter sein wird als diejenige, die weiter weg liegen.
- 3. Die Refraktion des abgestrahlten Lichts bei Zwischenflächen, insbesondere
Flüssigkeit/Luft, wird
die Effizienz der Lichtsammlung von Markermolekülen in der Flüssigkeit
reduzieren.
- 4. Moleküle
im Weg des Lasers können
die Erregung oder Ausstrahlung derart verzögern, dass das erhaltene Signal
eine nichtlineare Beziehung zu der Konzentration für eine vorgegebene
Weglänge
besitzt.
- 5. Der Detektor kann über
Abschnitte seines Bereiches nichtlinear sein.
-
Diese
Probleme können
durch die Kalibrierung des Systems mit Beads mit bekanntem Fluorophorgehalt
und Größenverteilung
in Lösungen
mit bekannten Tiefen und Fluorophor-Konzentration korrigiert werden.
Die erhaltenen Werte können
in einer Software-Nachschlagtabelle eingesetzt werden, oder können dazu
eingesetzt werden, Algorithmen abzuleiten, um das grundlegende mathematische
Modell, das in Beispiel 1 beschrieben ist, zu korrigieren. Unter
Verwendung dieser Algorithmen ist es dann möglich, Folgendes genau zu bestimmen:
Die
Tiefe eines Fluids mit bekannter Fluorophor-Konzentration; die Fluorophor-Konzentration
eines Fluids mit bekannter Tiefe; die Menge eines Fluorophores, das
mit einem Objekt innerhalb einer Fluorophor-Lösung gebunden oder mit diesem
assoziiert ist.
-
Der
Laserspot wird auf den Grund der Platte, wo die Beads oder die Zellen
platziert sind, fokussiert. Magnetische Beads können eingesetzt werden, so
dass ein Magnet die Beads in die Fokusebene des Lasers zieht. Der
Großteil
der Lösung
selber liegt nicht innerhalb der Fokustiefe, wird jedoch durch einen
Lichtkegel erleuchtet.
-
Jedoch
besitzt das Nadelloch des Detektors ein Gebiet, das bedeutend größer ist
als die Spotgröße, und
die Emission von diesem Kegel wird gesammelt. Daher wird ein Fluoreszenzsignal
erhalten, das ähnlich
zu demjenigen ist, das gewonnen werden würde, wenn der Strahl tatsächlich kollimiert
wäre. Dadurch
erreicht man eine nahezu lineare Beziehung zwischen der Flüssigkeitstiefe
und dem Signal, und zwar für
jede vorgegebene Fluorophor-Konzentration, sogar unterhalb der Fokustiefe
des Lasers. 13 zeigt die Kalibrierung der
Vorrichtung mit Fluorescein-Losungen fixierter Tiefe und bekannter
Konzentration. 14 zeigt eine Kalibrierung der
Vorrichtung mit Beads mit bekanntem Fluoresceingehalt (Sigma Chemical
Co.) und bekannter Größe innerhalb
einer Flüssigkeit
mit bekannter Tiefe.
-
Anwendung von Diskriminanten
-
In
Beispiel 2 ist die Kd der Liganden-/Rezeptorassoziierung
sehr niedrig und die Konzentration der Rezeptoren an der Stelle
ist relativ hoch. Bei diesem Modell-Experiment würden wir keine signifikante Beeinflussung
einer Hintergrund-Kontaminierung
erwarten. Bei praktischen Assays, insbesondere bei der Heilmittelentdeckung,
ist es üblich,
einen schwächeren
Kd-Wert zu haben, und niedrigere Konzentrationen
an Rezeptoren. Eine Kd von 10-9 ist
typisch, wobei vielleicht 50.000-100.000 Rezeptoren auf einer Zelle,
oder wenige 100.000 Rezeptoren auf den Beads vorliegen. Es ist auch
wünschenswert,
niedrige Konzentrationen des markierten Liganden zu verwenden, um
Kosten zu reduzieren, oder um eine Sättigung der Rezeptoren zu vermeiden.
Dies führt
zu niedrigeren Signalen aus den Assays. Eine als Hintergrund auftretende
natürlich
vorkommende Auto-Fluoreszenz von Komponenten des Assays, insbesondere
der Zellkulturkomponenten und Partikeln auf der Stammflüssigkeit
des markierten Liganden, kann eine Helligkeit besitzen, die gleich
ist oder größer als
die zu untersuchenden Stellen. Praktische Experimente haben gezeigt,
dass in einem echten Assay bis zu 60.000 kontaminierende Objekte
in 1 μl vorliegen
können,
mit einer Helligkeit die ähnlich
zu derjenigen der markierten Stelle ist.
-
Die
Reinigung der biologischen Proben zur Reduzierung der Hintergrundsverunreinigung
ist teuer und führt
oftmals zu einer reduzierten Aktivität. Es ist wünschenswert, Assays mit einem
Minimum an Komponentenreinigung durchführen zu können.
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Bei
der vorliegenden Erfindung wurden die Linie-zu-Linie-Korrelation,
die Größendiskrimination, das
Kriterium der Gauß'schen Form, der Farbunterscheidung
und andere Diskriminanten eingesetzt, die in der
US-A-5663057 beschrieben wurden, um
die Signale von verunreinigten Objekten auszuschließen. Diese
Diskriminanten wurden dazu entwickelt, um Bakterien positiv zu identifizieren
und aufzuzählen, die
viel heller markiert sind als der Hintergrund, und welche daher
nicht immer passend sind für
den Ausschluss einer Hintergrundverunreinigung in biochemischen
Assays, bei welchen der Zielanalyt manchmal heller ist als die Kontamination.
Daher wurden zu der Technik neue Diskriminanten hinzugefügt, um die vorliegende
Erfindung durchzuführen:
Das
Hintergrundrauschen, das nahe dem Empfindlichkeitslimit des Instrumentes
liegt, zeigt oftmals eine Gauß'sche Form, die ähnlich der
des Ziels im primären
Kanal ist. Bei Signalen mit niedriger Intensität setzt die Erfindung eine
Korrelation zwischen den Detektoren ein. Die Zielobjekte geben Signale,
die in mehr als einem der Detektionskanäle eine Gauß'sche Form aufweisen, wohingegen Hintergrundgeräusche, wie
bspw. elektrische Geräusche, dies
nicht tun.
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Eine
bakterielle Detektion zielt auf eine Detektion eines seltenen Ereignisses
ab. Die relative Intensität
jedes Ereignisses ist nicht wichtig, vorausgesetzt es liegt über einem
Grenzwert. Bei der vorliegenden Erfindung ist ein Intensitätswert sowohl
für den
gebundenen als auch für
den freien Marker notwendig.
-
Dieses
Beispiel wird zeigen, wie das Verfahren gemäß der Erfindung eingesetzt
werden kann, eine Dissoziationskonstante für ein Assay zu berechnen, das
auf Beads basiert und das Ausmaß der kompetitiven
Inhibierung dieser Assoziation durch eine aktive Verbindung zu messen. 4 zeigt
die Messprinzipien.
-
Magnetische
Beads, beschichtet mit den Rezeptoren, werden hergestellt. Die Anzahl
der Rezeptoren auf den Beads wird durch deren Inkubation in einer
Lösung
an markierten Liganden geschätzt.
Die Liganden-Konzentration wird so ausgewählt, dass sie überhalb
der erwarteten Kd für die Assoziierung liegt. Die
Menge des gebundenen Liganden wird dadurch gemessen, dass die Beads
mit einem Magneten in den Fokuspunkt des Instruments gezogen werden
und dass die Suspension gemessen wird. Ein dynamischer Grenzwert-Algorithmus
wird eingesetzt, um lediglich diejenigen Objekte zu detektieren,
die signifikant heller als der Hintergrund sind. Ein Set an Diskriminanten
für die
halbe Breite, die Größe, die Spektral-Verhältnisse,
die Gauß'sche Form etc. wird auf
die Rohdaten angewandt, und lediglich diejenigen Objekte, die auf
die Charakteristika der Beads passen, werden angezeigt.
-
Die
Histogramme aller Messungen auf den Beads werden geplottet und hinsichtlich
einer Gauß'schen Verteilung
in jedem Parameter überprüft, um zu
bestätigen,
dass das System tatsächlich die
Beads von den kontaminierenden Partikeln im Hintergrund unterschieden
hat. Das Signal, das auf den freien Liganden zurückzuführen ist, kann im Anschluss
an das Signal von den Beads gemessen werden. Alternativ kann der
Grenzwert-Algorithmus derart gesetzt werden, dass der Hintergrund
auf Null gesetzt wird, und dass lediglich Peaks überhalb dieses Hintergrunds
gemessen werden. Auf diese Weise kann das Signal, das auf den freien
Marker zurückzuführen ist,
von dem Gesamtsignal abgezogen werden, wodurch lediglich das Signal
der Beads erzielt wird.
-
Die
Peak- oder Durchschnittsintensität
aller Objekte, die als Beads bestätigt werden, wird in einem
Frequenzhistogramm geplottet. Auf dieses Histogramm wird eine Gauß'sche Anpassung gesetzt, und
der Intensitätswert
im Zentrum dieser Verteilung wird als typischer Wert der Population
genommen. Die Anzahl der Fluorophor-Moleküle (und daher der Rezeptoren),
die mit den Beads assoziiert sind, wird dann durch ein Vergleich
des Fluoreszenzwertes gemessen, welcher mit einer Kalibrie rungskurve
erhalten wurde, der von Beads mit einem bekannten Fluorophor-Gehalt
gewonnen wurde.
-
Die
Kd der Assoziation kann durch eine Wiederholung
des Assays mit einer Konzentration des markierten Liganden unterhalb
der erwarteten Kd geschätzt werden. Eine Messung des
gebundenen markierten Liganden wird beim Gleichgewicht für die Mitte
der Verteilung der Peak-Intensitätswerte
erhalten. Die Konzentration des freien Liganden im Gleichgewicht
wird erhalten vom Signal der Lösung
in unmittelbare Nachbarschaft zu den Beads. Das Volumen der Beads
kann geschätzt
werden, und eine mathematische Korrektur auf die Halbbreite angewandt werden,
welche für
die Beads ermittelt wurde.
-
Das
Volumen der Beads und die durchschnittliche Anzahl der Rezeptor-Moleküle pro Beads sind
nun bekannt. Dies kann als lokale Konzentration dargestellt werden.
-
Das
Volumen des freien Markers, der durch den Laser beleuchtet wird,
und die Konzentration dieses Volumens im Gleichgewicht ist nun ebenfalls
bekannt.
-
Eine
Messung der Dissoziationskonstanten für die Assoziation kann nun
durch Anwendung eines mathematischen Modells, wie nachstehend beschrieben,
berechnet werden:
-
Vereinfachtes mathematisches
Modell
-
Bezug
nehmend auf 4 ist die Kd eines
reversiblen Rezeptors: die Liganden-Wechselwirkung kann dadurch geschätzt werden,
dass angenommen wird, dass die Zelle oder der Bead eine lokale Rezeptor-Konzentration
darstellt, in welche die Rezeptor-Moleküle durch das Volumen der Zelle
oder des Beads hindurch als gleichmäßig verteilt, betrachtet werden.
Dies wird die Bead-Rezeptorkonzentration genannt (BR).
Diese Arbeitshypothese funktioniert gut in der Praxis hinsichtlich
der Bead- und Zellgrößen sowie
hinsichtlich der assoziierten Rezeptoranzahlen, die in den praktischen
Assays verwendet worden. Daher gilt:
- BV
- = Beadvolumen
- NRB
- = Durchschnittliche
Anzahl der Rezeptoren pro Bead
- BR
- = NRB/(BV × Avogadro'sche Zahl)
-
Die
Konzentration des freien Liganden wird als Liganden-Konzentration
der Flüssigkeitsmasse angenommen,
und als im Wesentlichen konstant (keine merkliche Depletion des
freien Liganden). Um eine Schätzung
der Kd gegenüber PVS/UVS zu erhalten, nehmen
wir an:
- NLB
- = vorhergesagte Anzahl
an markierten Liganden-Molekülen
auf jedem Bead
- (L)
- = Konzentration der
Menge des freien Liganden
- IV
- = Beleuchtungsvolumen
des Laserstrahls
NLB – [L] × NRB × BV × Avogadro'sche Zahl/(Kd + [L])
-
Die
Anzahl der Liganden-Moleküle
im UVS = [L] × IV × Avogadro'sche Zahl PVS = {(IV – BV) × [L] × Avogadro'sche Zahl} + NLB
-
Daher
kann mit diesem Modell die Kd gegenüber PVS/UVS
vorhergesagt werden, wie in 4 geplottet.
Ist dieser Plot einmal gewonnen, kann die Kd einer
Assoziierung ausgehend von einer einzelnen Messung des PVS/UVS-Signals
erhalten werden, welches über
einen breiten Bereich von Konzentrationen des freien Liganden gewonnen
wurde, und kann daher auf verschiedene Assays angewandt werden,
bei welchen der gebundene oder der freie Marker variiert. Dieses
mathematische Modell zeigte eine gute Korrelation mit experimentellen
Ergebnissen von PVS/UVS in Beispiel 3.
-
Die
Technik gestattet es der Kd durch eine einzelne
Messung zu messen, ohne Serienverdünnungen testen zu müssen, jedoch
können
auch Serienverdünnungen
eingesetzt werden, um die Genauigkeit der Messung zu verbessern.
Es versteht sich, dass die Kd für einen
Rezeptor auf einer Oberfläche von
derjenigen in Lösung
variieren kann, jedoch werden die meisten Rezeptoren auf oder in
Zellmembranen gefunden. Mit dieser Technik werden Mittel bereitgestellt,
mit welchen die Kd für Biomoleküle in deren natürlicher
Umgebung geschätzt
werden kann.
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Die
Berechnung kann auf ein mathematisches Modell reduziert werden,
das in die Software des Instruments eingebettet ist. Das Instrument
bestimmt automatisch die Signale der mittleren Peak-Intensität für die Beads
oder Zellen, für
die Anzahl der Beads oder Zellen, für deren echte Dimensionen und
das Signal aufgrund der freien Fluoreszenz. Diese Werte werden auf
das mathematische Modell angewandt, um eine Messung der Kd in Echtzeit direkt zu bestimmen. Das Instrument
kann ferner das statistische Konfidenzintervall in der Genauigkeit des
Ergebnisses bestimmen.
-
Die
kompetitive Inhibition durch eine aktive Verbindung (bspw. ein mögliches
Arzneimittel) kann ausgehend von der Änderung in den Verhältnissen der
gebundenen gegenüber
den freien Signalen gemessen werden, welches beobachtet wird, wenn
die Verbindung zu einem Modell-Assay hinzugefügt wird. Es ist möglich, IC50 auf diese Weise zu messen, und ferner
die Kd der Verbindung zu bestimmen.
-
Nachweismessungen
-
Ein
spezifisch gemessenes Beispiel, auf welches als Beispiel 3 Bezug
genommen wird, wurde durch geführt,
um die oben gemachten theoretischen Hypothesen zu bestätigen, was
im Folgenden nun Bezug nehmend auf die 15 bis 21 beschrieben
werden wird.
-
In
diesem Beispiel waren die Reagenzien Polystyrol-Mikrokügelchen,
beschichtet mit Ziegen-Antimaus-Antikörper, 5,5 μm im Durchmesser, Bindekapazität 1,48 μg Maus IgG/mg
Beads, 1,045 × 109 Beads/ml in Borpuffer (100 mM, pH 8,5,
mit 0,1 % Rinderserumalbumin, 0,05 % Tween, 10 mM EDTA und 0,1 %
Natriumazid), gelagert bei 4 °C,
bezogen von Bang's
Laboratories, Inc., 9025 Technology Drive, Fishers, IN 46038-2866,
USA.
-
Maus
IgG, K (MOP-21), Fluoresceinisothiocyanat(FITC)-Konjugat,
Immunglobulin-Konzentration 200 μg/ml,
Proteinkonzentration 200 μg/ml,
Fluorescein/Protein-Molverhältnis
5,8 in Phosphat-gepufferter Saline (0,01 M, pH 7,4, mit 1 % Rinderserumalbumin
und 15 mM Natriumazid). Spezifität
(Immunelektrophoresie): einzelner Bogen der Fällung gegenüber einem Antimaus-Gesamtserum,
Antimaus IgGI und Antimaus IgG K (vor der
Konjugation). Spezifität (Ouchterlony
Doppeldiffusion): einzelner Bogen der Fällung mit AntimausIgGi, keine
Reaktion mit Antimaus IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM oder IgA (vor der
Konjugation). Erhalten von Sigma, 3050 Spruce Street, Saint Louis,
Missouri 63103, USA.
-
Dulbecco's Phosphat-gepufferte
Saline (10 mM, pH 7,4, mit 120 mM Natriumchlorid, ohne Calcium oder
Magnesium).
-
Erhalten
von Life Technologies Ltd., P.O. Box 35, 3 Fountain Drive, Inchinnan
Business Park Paisly, PA4 9RF, UK.
-
Quantum-Fluoreszenz-Beads
mit 450.000 Molekülen
eines äquivalenten
löslichen
Fluorochroms (450.000 MESF), 7-10 μm Durchmesser, ungefähr 2 × 106 Beads/ml in Phosphatpuffer mit oberflächenaktiven
Stoffen und 0,1 % Natriumazid (Information aus der technischen Produktanleitung).
Erhalten von Sigma.
-
Fluoresceinisothiocyanat
(FITC) Isomer 1, ungefähr
98 % rein (HPLC-Analyse). Erhalten von Sigma.
-
Die
erste Notwendigkeit zum Nachweis der Assay-Hypothesen ist es, nachzuweisen,
dass das Verhältnis
zwischen Fluoreszenz und Fluorophor-Konzentration bei einer festgesetzten
Weglänge
und zwischen der Fluoreszenz und der Weglänge bei einer fixierten Fluorophor-Konzentration
linear ist.
-
Die
zwei biochemischen Parameter, die für den Nachweis benötigt werden,
sind die Kd der Binde-Wechselwirkung und
die maximale Anzahl der verfügbaren
Bindestellen auf dem Bead. Dies kann beides in einem einzelnen Bead-Titrations-Experiment gemessen
werden.
-
Die
Kd ist die Offensichtliche bei den zwei Messungen,
und ist zu der Konzentration eines fluoreszierenden Liganden äquivalent,
was in der Hälfte der
maximalen Bead-Fluoreszenz resultiert, nachdem die mittlere Bead-Intensität der Peakhöhe hinsichtlich
der Intensität
der darüber
liegenden Ligandenlösung
korrigiert wurde.
-
Die
maximale Anzahl der verfügbaren
Stellen auf einem Bead kann dadurch gefunden werden, dass die aggregierte
Fluoreszenz des freien Liganden (das Assay sollte unter Bedingungen
durchgeführt
werden, die keine Lösungsdepletion
verursachen) bei einer fixierten Weglänge und PMT-Gewinn gegen die
Liganden-Konzentration
geplottet wird. Nach Plotten der Fluoreszenz gegen die Liganden-Konzentration, kann
die Konzentration des Liganden, dessen Lösungs-Fluoreszenz gleich ist
mit derjenigen der korrigierten mittleren Peak-Bead-Intensität, genommen
werden. Dieser Wert und der Wert der Weglänge werden in eine geeignete
Rechensoftware eingespeist, und anschließend wird die effektive Anzahl
der fluoreszierenden Liganden-Moleküle im Laserweg berechnet. Die
effektive Anzahl der Stellen pro Bead ist gleich mit dieser Anzahl.
Es ist wichtig, dass die Antwort der Lösungsfluoreszenz gegenüber der
Weglänge
für diese
Berechnung linear ist.
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Es
sollte bemerkt werden, dass, obwohl der Weg des Laserlichts konisch
sein wird, unser Modell vorhergesagt hat, dass die effektive Anzahl
der Fluorophor-Moleküle innerhalb
dieses Kegels durch die Hypothese gemessen werden kann, dass das
beleuchtete Volumen das eines Zylinders ist, mit einem Durchmesser
gleich dem Laserspotdurchmeser.
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Es
ist wichtig, den Wert der Bead-Intensität für die Fluoreszenz der darüber liegenden
Fluorophor-Losung zu korrigieren, da die verwendeten Beads durchsichtig
sind, wodurch das Laserlicht jeden darüber liegenden Fluorophor anregen
kann. Das Kollektionsnadelloch für
das fluoreszierende Licht weist einen Durchmesser von 2 mm auf;
daher wird das meiste der Lösungsfluoreszenz
nicht durch den Bead hindurch geführt werden müssen, um
erfasst zu werden. Dies wurde experimentell nachgewiesen, indem
die Fluoreszenz von 450.000 MESF-Beads in unterchiedlichen Konzentrationen
der Fluorescein-Lösung
(in PBS, Nullprobe, 0,25 μM,
0,5 μM und 1,0 μM) mit einer
festgesetzten Tiefe (20 μm)
gemessen wurden. Ein Plot der unkorrigierten Bead-Fluoreszenz gegenüber der
Fluorescein-Konzentration ergab eine gerade Linie, wenn 100 % der
Lösungsfluoreszenz
abgezogen wurde, alle der Beads besaßen eine ähnliche Intensität (17).
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Das
Verhältnis
der mittleren korrigierten Bead-Fluoreszenz gegenüber der
Lösungsfluoreszenz kann
nun gegen die gebundenen bis freien Auslesungen geplottet werden,
welche durch Software unter Verwendung der Input-Werte von Kd, der verfügbaren Rezeptorstellen, der
Weglänge
und der Fluorophor-Konzentration vorhergesagt wurden. Wenn das Modell
genau ist und die Kd und die Werte für verfügbare Rezeptorstellen
genau sind, sollte die Kurve der gemessenen gebundenen bis freien
gegenüber
der vorhergesagten gebundenen bis freien Fluoreszenz eine gerade
Linie mit einer Neigung von 1 sein.
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Die
experimentelle Bestätigung
der linearen Beziehung zwischen Fluoreszenz- und Fluorophor-Konzentration wurde
dadurch erreicht, dass die Fluoreszenz mehrere Fluorescein-Lösungen in
Dulbecco's PBS mit
Konzentrationen zwischen 0,1 μM und
1 μM mit
einem festgesetzten Fotovervielfacher-Gewinn bei einer fixierten
Weglänge
(500 μm) gemessen
wurde. Die Weglänge
wurde dadurch festgesetzt, dass eine zweckgerichtete Durchziehvorrichtung
in die Fluorescein-Lösung
eingebracht wurde, welche mittels Noniusschub auf die erwünschte Tiefe
gesetzt wurde. Die Lösungen
wurde auf der oben beschriebenen Vorrichtung gescannt, welche auf
einen Fluoreszenz-Aggregat-Modus eingestellt war (Grenzwertsetzung
effektiv abgeschaltet, um Daten aus der freien Lösung sammeln zu können), wobei
die abgelesene Fluoreszenz die mittlere Fluoreszenz war, geschätzt aus
dem Scan-Profil. Ein Plot der Fluoreszenz gegen die Fluorescein-Konzentration erzielte
eine gerade Linie (15). Die Bestätigung der
linearen Beziehung zwischen Fluoreszenz und Weglänge bei der Konzentration,
die bei einem fixierten PMT-Zugewinn eingesetzt wurde, wurde auf ähnliche
Art und Weise erzielt, unter Verwendung einer 1 μM-Fluorescein-Lösung und
durch Variieren der Tiefe der Durchziehvorrichtung, welche durch
Noniusschub eingestellt wurde. Ein Plot der Fluoreszenz gegen die
Weglänge
erzielte eine gerade Linie (16).
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Lösungen von
MOPC-21-FITC-Konjugaten mit Konzentrationen von 1 nM, 5 nM, 10 nM,
50 nM, 100 nM, 500 nM, 1,0 μM
wurden in Dulbecco's
PBS vorbereitet. Ziege-Antimaus-Beads wurden durch Vortexen resuspendiert
und wurden auf Konzentrationen mit 2.500 Beads/μl mit Dulbecco's PBS verdünnt. Diese
verdünnte
Bead-Suspension wurde anschließend
zu jeder der MOPC-21-FITC-Lösungen hinzugefügt (2 μl Beads plus
100 μl Lösung ergaben eine
Endkonzentration von 50 Beads/μl),
wobei eine PBS-Blindprobe mit eingeschlossen war. Nach dem Mischen
wurden die Reaktionsgefäße 3 Stunden lang
im Dunkeln und bei Raumtemperatur inkubiert, sowie gelegentlich
gemischt.
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Die
Bead-Suspensionen (jeweils 50 μl)
wurden anschließend
von unten in einer Mikrotitterplatte mit durchsichtigen Grund in
dem wie oben beschriebenen Gerät
gescannt, wobei die Probentiefe bei 200 μm fixiert war.
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Die
Grenzwert-Algorithmen wurden derart eingestellt, dass jedes einzelne
Bead ausgewählt wurde,
und die Daten wurden hinsichtlich der Peak-Intensität und der
halben Breite gesammelt. Der Wert für die Lösungsfluoreszenz (UVS) wurde durch
Abschalten des Grenzwertes und durch Scannen eines gröberen Profils
erhalten. Der Wert für
die Lösungsfluoreszenz
wurde als die Mittellinie des gezeigten Profils genommen. Die unkorrigierte
mittlere Bead-Intensität
der Peak-Höhenfluoreszenz
(PVS) für
jede Lösungskonzentration
wurde aus dem Screen der Scan-Ergebnisse erhalten, zusammen mit
dem Regelabweichungswert und der Anzahl der betrachteten Ergebnisse.
Um das Signal isolieren zu können,
das nur auf den Bead zurückzuführen ist, wurde
die Lösungsfluoreszenz
von dem Fluoreszenzwert der mittleren Bead-Peak-Intensität für jeden Datenpunkt abgezogen.
Die korrigierte Bead-Fluoreszenz wurde anschließend gegen MOPC-21-FITC-Konzentration
geplottet (18). Aus diesem Plot war es
offensichtlich, dass eine Bindung eines zweiten Liganden aufzutreten
begann, und zwar überhalb
der Liganden-Konzentration von 100 nM (18), die
möglicherweise
auf eine Antikörper-Antikörper-Selbstbindung
zurückzuführen ist. Daher
wurde beschlossen, die Titrationskurve auf 100 nM zu plotten (19)
und die Kd der Interaktion zu berechnen,
sowie die Anzahl der verfügbaren
Rezeptoren pro Bead aus dieser Kurve, wie oben beschrieben, nach
Plotten der Lösungs-Fluoreszenz gegen
MOPC-21-FITC-Konzentration (20). Die experimentellen
Ergebnisse bezüglich
gebunden gegenüber
frei wurden gegen die vorhergesagten Werte geplottet (21).
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Die
Kd der Bindereaktion erwies sich als 1,2 nMol/l
und die maximale Anzahl der verfügbaren
Bindestellen-Bead betrug 245.000. Der Plot des experimentellen Verhältnisses
gebunden gegenüber
frei gegen das vorhergesagte PVS/UVS-Verhältnis war linear mit einer
Neigung von 1,86. Die Linearität
bei diesem Nachweis ist wichtiger als die Neigung, da angenommen
wurde, dass die Laserspotgröße 6 μm ist, und
jede Variation in diesem Wert wird die vorhergesagten B/F-Werte
auf lineare Art und Weise beeinflussen.
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Dieses
Beispiel beweist, dass die Vorrichtung gemäß der Erfindung dazu eingesetzt
werden kann, der Kd einer Assoziierung zu
messen und zu schätzen;
ferner die Größe und das
Volumen eines Beads oder einer Zelle; die Anzahl der Bindestellen auf
einem Bead oder einer Zelle; die Konzentration des freien Markers
und die Belegungsrate der Bindestellen während eines Assays. Darüber hinaus kann
das System, sobald es einmal kalibriert ist, sowie das Verfahren
gemäß der Erfindung
dazu eingesetzt werden, die Kd einer reversiblen
Binde-Wechselwirkung in einer einzelnen Vertiefung zu schätzen, ohne
die Notwendigkeit von Reihenverdünnungen oder
von Abtrennungen, und zwar durch Einsatz eines einfachen mathematischen
Modells auf die gewonnenen Messungen.
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Diese
fundamentale Prinzip kann auf die Messung von komplexeren Wechselwirkungen
angewandt werden, die mehrere Dissoziationskonstanten beinhalten,
und kann ferner dazu eingesetzt werden, den Kd-Wert
einer kompetitierenden Verbindung zu berechnen.