DE60033383T2

DE60033383T2 - Verwendung von tetrahydrocurcuminoiden zur regulation von physiologischen und pathologischen fällen in der haut und mucosa

Info

Publication number: DE60033383T2
Application number: DE60033383T
Authority: DE
Inventors: Muhammed Piscataway MAJEED; Vladimir Piscataway BADMAEV
Original assignee: Sami Chemicals and Extracts Ltd; Sabinsa Corp
Current assignee: Sami Chemicals and Extracts Ltd; Sabinsa Corp
Priority date: 1999-04-09
Filing date: 2000-04-07
Publication date: 2007-05-31
Anticipated expiration: 2020-04-08
Also published as: ES2282101T3; PT1171144E; NZ514884A; CA2369381A1; DK1171144T3; ATE353662T1; WO2000061162A9; EP1171144A1; JP2002541205A; AU4187900A; DE60033383D1; EP1171144B1; WO2000061162A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Eine Körperzelle verdankt ihr Funktionieren zum Großteil ihrem Cytoskelett, dem strukturellen Gerüst der Zelle. Das Cytoskelett wird durch Komponenten im Cytoplasma gebildet, die die Form der Zelle erhalten, Zellbefestigungen an Nachbarzellen stabilisieren und Spezialfunktionen der Zelle, wie die Endocytose, die Exocytose und die Beweglichkeit der Zelle, erleichtern. Das Cytoskelett beinhaltet verschiedene faserartige Strukturen, wie Mikrotubuli, Mikrofilamente, Zwischenfilamente und mikrotrabekulare Gitter. Proteine, die an der Bildung eines Cytoskeletts beteiligt sind, besonders Mikrotubular-verbundene Proteine (MAPS) werden, nachdem diese von der Zelle hergestellt wurden, in einem Verfahren, das als posttranslationale Modifikation oder Quervernetzung bezeichnet wird, weiter an die Cytoskelettfunktion angepasst. Dieses Verfahren der Quervernetzung von Proteinen ist essenziell, um das Cytoskelett zu stabilisieren, der Ablauf ist erforderlich, um die Zellhomeostase, physiologische Prozesse und die Zellentwicklung und Reifung aufrechtzuerhalten.
Die posttranslationale Modifikation von Proteinen beinhaltet verschiedene chemische Reaktionen. Die Proteinphosphorylierung dient als Beispiel eines der häufigsten Mechanismen der posttranslationalen Modifikation von zellulären Proteinen. Andere Beispiele beinhalten die Methylveresterung von Proteinen, die ADP-Ribosylierung, die Proteinglycosylierung, die Histonacetylierung, die Bildung von Hypusin und Transglutaminase-katalysierte Reaktionen.
Das elektrische Potenzial einer Zelle ist ein Aspekt der zellulären Physiologie, der für das Verständnis des Mechanismus der Erfindung wichtig ist. Das elektrische Potenzial einer Zelle wird durch ein komplexes Gleichgewicht zwischen negativ und positiv geladenen Molekülen aufrechterhalten, das zu einem physiologischen Ruhepotenzial von ungefähr 70 mV im Innern der Zelle führt. Dieser Wert weist auf das Wohlbefinden der Zelle hin. Andererseits kommt die Unfähigkeit der Zelle, ein optimales Ruhepotenzial aufrecht zu erhalten, bei pathologischen Bedingungen vor, z.B. bei physikalischen oder chemischen Verletzungen, bei Krankheitsprozessen und bei Altersverschleiß. Ein optimales Ruhepotenzial fördert den physiologischen Prozess, die posttranslationale Proteinmodifikation und die Quervernetzung eingeschlossen. Es gilt auch, dass die intakte physiologische Quervernetzung von Proteinen auf die Fähigkeit einer Zelle hinweist, ein optimales elektrisches Ruhepotenzial aufrecht zu erhalten.
Positive Effekte der Quervernetzung
Die Quervernetzung von Proteinen ist, wie zuvor schon erwähnt, ein Ergebnis der posttranslationalen Modifikation von Proteinen. Einige der meist üblichen Quervernetzungen, die in Proteinen, die das Cytoskelett bilden, identifiziert wurden, sind Neee-(ggg-Glutamyl)lysin und N,N-bis(ggg-Glutarnyl)polyamin. Die Bildung dieser zwei Typen von Quervernetzungen wird durch die katalytische Aktivität einer Gruppe von Enzymen erleichtert, die als Transglutaminasen bekannt sind. Eine der am besten bekannten Transglutaminasen im Körper ist das Gerinnungsprotein Faktor XIII. Dieser Faktor verursacht die Quervernetzung des Fibrins, das als stabilisierendes Mittel bei der Blutgerinnselbildung wirkt. Dieser Typ der Modifikation ist ein Beispiel eines lebensrettenden Mechanismus, der auf der Quervernetzung von Proteinen basiert, der die Verblutung bei einem Schnitt oder einer Wunde verhindert.
Transglutaminasen sind verantwortlich dafür, dass ein physiologischer Prozess der Proteinquervernetzung erleichtert wird, der unter normalen Bedingungen zur Zellteilung führt, dadurch ist die Zelle in der Lage, ihren Zweck zu erfüllen, z.B. die schleimabsondernde Zelle, die phagozytische Zelle, Epithel- und Tegumenzelle, die die Gewebestruktur schützen. Die Transglutaminaseaktivität oder ihr Fehlen spielt eine kritische Rolle bei der Teilung von Krebszellen, besonders von Hautkrebsmelanomen. Das Melanom ist ein sich schnell ausbreitender Krebs, der aus undifferenzierten Hautzellen besteht, und der Grad der geringen Zelldifferenzierung korreliert gut mit der unterdrückten Aktivität der Transglutaminase. Andererseits führt die experimentelle Induktion der Transglutaminaseaktivität zu viel versprechenden Ergebnissen beim Abbremsen oder der Reversion der Progression von Melanomen. Beispiele für Transglutaminaseinduktoren sind Retinoinsäure und Methylxantine. Daraus wird ersichtlich, dass das therapeutische Potenzial von Retinoiden bei Melanomen auf ihre Fähigkeit zurückzuführen ist, intrazelluläre Transglutaminasen zu aktivieren.
Schädliche Quervernetzung
Die Quervernetzung von intrazellulären Proteinen ist jedoch nicht immer ein positives Ereignis. Wenn eine willkürliche und massive Quervernetzung durch einen abrupten, nicht physiologischen Reiz ausgelöst wird, erfolgt eine beschleunigte Alterung der Zelle. Aufgrund der Natur der Quervernetzung, die dem Zweck der Zellorganisation und Differenzierung entgegenläuft, kann dies nicht nur zu vorzeitiger Zellalterung und -tod, sondern auch zu einer Pathologie führen, bösartige Tumore eingeschlossen. Z.B. können freie Radikale, die durch UVA erzeugt werden, in Hautzellen vorzeitige Quervernetzung von Proteinen und die Freisetzung von proteolytischen Enzymen bewirken. Dieses letztere Ereignis führt zur Zerstörung des Cytoskeletts und der schnellen Zerstörung der Zellorganisation, die das Funktionieren der Zelle gefährdet.
Es ist von besonderem Interesse, hier den Begriff Lipofuscin zu erwähnen, der den Spitznamen "Alterspigment" oder "Leberflecken" trägt, der in der Epidermis und Schleimmembranen, wahrscheinlich als Ergebnis eines unterbrochenen zellulären und systemischen Metabolismus vorkommt. Es wurde gezeigt, dass Lipofuscin auf den oxidativen Abbau von Mitochondrien und/oder Lysosomen in der Zelle zurückzuführen ist. Es wird vorausgesetzt, dass Lipofuscin das Ergebnis eines metabolischen Fehlers ist, der zu Hypoanabolismus in Kombination mit Hyperkatabolismus führt. Es wird hier vorausgesetzt, dass die Bildung von Lipofuscin ein Teil des Sichtbarwerdens des gestörten Verfahrens der posttranslationalen Modifikation von Proteinen ist, und dass dieses Verfahren mit jeglichem systemischen Krankheitsprozess intensiviert wird, den Altersprozess eingeschlossen.
Verwandter Stand der Technik
Wie zuvor erwähnt wurde, sind Transglutaminasen verantwortlich dafür, dass die physiologischen Prozesse der Quervernetzung von Proteinen erleichtert werden, die unter normalen Bedingungen zur Zelldifferenzierung, Reifung und zeitgemäßen Alterung führen. Es gibt einen beachtlichen Beweis dafür, dass die intrazelluläre Transglutaminaseaktivität bei einer bestimmten Pathologie verhindert wird, z.B. bei bösartigen Tumoren, z.B. Melanomen. Es scheint, dass das therapeutische Potenzial von Transglutaminaseinduktoren, wie Retinoiden und Methylxantinen, bei Melanomen auf deren Fähigkeit, die intrazelluläre Transglutaminase zu aktivieren, zurückzuführen ist. Dies würde umgekehrt zur Differenzierung der Zelle führen, was in der klinischen Praxis zu einer Verlangsamung des Krankheitsprozesses aufgrund einer Abnahme der Zahl der undifferenzierten bösartigen Zellen führen würde.
Curcuminderivate, Tetrahydrocurcumin und Curcuminoide eingeschlossen sind in der Literatur als eine Gruppe phenolischer Antioxidantien wohlbekannt (Majeed et al. Curcuminoides Buch). Majeed et al., U.S. Patent Nr. 5,861,415, haben festgestellt, dass die Kombination von natürlich vorkommenden Curcuminoiden, die aus der Gelbwurzel isoliert wurden, d.h. Curcumin, Demethoxycurcumin und Bisdemethoxycurcumin, einen breiten Bereich eines Schutzes gegen Antioxidantien herstellen, der als bioprotektive Wirkung beschrieben wird. Die bioprotektive Wirkung, die dadurch charakterisiert ist, dass die Bildung von freien Radikalen und das Eingreifen in freie Radikalfänger verhindert wird, wird sowohl von Tetrahydrocurcumin(oiden) (THC) als auch von Curcumin(oiden) ausgeübt (Majeed et al., Die Gelbwurzel und heilende Curcuminoide, Keats Publications 1996 und Majeed et al., Curcuminoide antioxidantische Phytonährstoffe, NutriScience Publishers 1995). Tetrahydrocurcumin(oide) zeigen jedoch im Vergleich zu Curcumin oder Curcuminoiden bessere Radikalfängereigenschaften (Majeed et al. Curcuminoides Buch). Ein weiterer Vorteil von Tetrahydrocurcuminoiden ist, dass diese nicht so stark gefärbt sind wie Curcuminoide und daher ohne bedeutende Verfärbung topisch angewandt werden können.
Kürzlich wurde gefunden, dass Curcumin, aber nicht Tetrahydrocurcumin einen vorbeugenden Effekt auf die Quervernetzung von Collagen bei diabetischen Ratten hat. (Sajithlal GB, Chithra P, Chandrakasan G., Biochem Pharmacol, 15. Dezember 1998, 56(12): 1607–14). Der antiquervernetzende Effekt von Curcumin war jedoch mit einer sehr hohen oralen Dosis der Verbindung erreicht worden (200 mg/kg Körpergewicht). Es wurde auch beobachtet, dass der vorbeugende Effekt von Curcumin auf die fortgeschrittene Quervernetzung von Collagen ausgeprägter war als sein therapeutischer Effekt. Die Autoren dieser Studie erklärten dies damit, dass der antiquervernetzende Mechanismus von Curcumin durch das Quenching der freien Radikale bedingt ist, was umgekehrt die beschleunigte Quervernetzung von Collagen bei Diabetes verhindern würde. Diese Studie unterstützt die Verwendung von Curcumin zur Vorbeugung und in gewissem Maße zur Behandlung von exzessiver Quervernetzung von Proteinen bei Behandlung von Bedingungen, die durch beschleunigte Quervernetzung charakterisiert sind, wie Diabetes.
Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung ist geeignet für ein Verfahren zur Behandlung eines prämalignen Zustands oder von bösartigen Tumoren bei einem Patienten, umfassend die Verabreichung einer wirksamen Menge einer Mischung von Tetrahydrocurcuminoiden an einen Patienten, der unter einem prämalignen Zustand oder einem bösartigen Tumor leidet, insbesondere für ein Verfahren, bei dem der bösartige Tumor ein Melanom ist.
Daher ist ein Aspekt der Erfindung die Verwendung einer wirksamen Menge einer Mischung von Tetrahydrocurcuminoiden zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Melanomen.
Die Erfindung ist auch geeignet für ein Verfahren zur Reduzierung von "Altersflecken" aufgrund der Bildung von Lipofuscin bei einem Patienten, der eine derartige Behandlung benötigt, umfassend die Verabreichung einer wirksamen Menge einer Mischung enthaltend 75–85% Tetrahydrocurcumin, 10–20% Tetrahydrodimethoxycurcumin und 2,0 bis 4,5% Tetrahydrobisdimethoxycurcumin an den Patienten, insbesondere für ein Verfahren, bei dem die Zusammensetzung topisch verabreicht wird.
Daher ist ein weiterer Aspekt der Erfindung die Verwendung einer wirksamen Menge einer Mischung von Tetrahydrocurcuminoiden zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Altersflecken aufgrund der Bildung von Lipofuscin.
Der Mechanismus der Erfindung besteht darin, dass die Homeostase und das Funktionieren der Zellen basierend auf dem regulatorischen, sowohl inhibitorischen und anregenden Effekt der Quervernetzung von intrazellulären Proteinen erhalten werden. Dieser regulatorische Mechanismus, der zuvor für Curcumin und seine Derivate unbekannt war, steht auch nicht in Bezug zu den gut untersuchten und beschriebenen antioxidantischen Eigenschaften von Curcumin(oiden) und Tetrahydrocurcumin(oiden). Es ist ein neuer Weg der Erzielung eines weit reichenden regulatorischen Effekts bei biologischen Prozessen. Ein vergleichbarer regulatorischer Effekt auf die Quervernetzung von Proteinen im Organismus wurde zuvor weder mit einer einzelnen Verbindung noch mit Kombinationen von Verbindungen beschrieben. Im Wesentlichen unterscheidet sich die Erfindung von anderen Verbindungen, die den Quervernetzungsprozess beeinflussen dadurch, dass die zuvor beschriebenen Verbindungen die intrazelluläre Quervernetzung stimulieren oder inhibieren, wohingegen die Erfindung als Quervernetzungsmodifikator (CLM) oder "Crossregulin" wirkt. Diese Begriffe werden hier zum ersten Mal verwendet, um den Mechanismus der Erfindung zu beschreiben. CLM oder Crossregulin bedeutet, dass eine Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung einen positiven Einfluss auf die posttranslationale Proteinmodifikation und den Quervernetzungsprozess sowohl bei physiologischen als auch bei pathologischen Bedingungen ausübt. Der CLM-Effekt der Erfindung wird dadurch erreicht, dass eine spezifische Zusammensetzung des Produkts verwendet wird, das in dem Abschnitt "Verfahren zum Erhalten von THC" beschrieben wird. Der Mechanismus kommt mit Modifikationen des THC-Moleküls, z.B. Ether-THC, Trimethylether-THC, Dimethylether-TCH, Benzylether-THC und Kalium-, Magnesium- und Kupfersalzen von THC vor. Der Mechanismus der Erfindung wurde bei in vivo experimentellen Bedingungen wie bei dem Verhindern von UV-Sonnenbrand und Quervernetzung (Prozent der Thymindimerzellen) bei Hautzellen gezeigt, die UV-Strahlung ausgesetzt wurden. Die biologischen Eigenschaften der Erfindung wurden mit denen von Curcuminoiden verglichen und trotz der Tatsache, dass die vorliegende Zusammensetzung frei von gelber Farbe ist, zeigt sie immer noch vergleichbar schützende Wirkungen gegen UV-Strahlung wie die gelben Curcuminoide. Diese Aktivität scheint anders zu sein als die antioxidativen Effekte, die für THC und Curcuminoide charakteristisch sind.
Im Folgenden wird der Mechanismus der Erfindung ausführlich beschrieben:

1. Es wird vorgeschlagen, dass bei physiologischen Zuständen, die durch optimale posttranslationale Proteinmodifikation, Proteinquervernetzung, sowie durch das optimale elektrische Zellpotenzial charakterisiert sind, THC die oben veranschaulichten Zustände von zellulärem Wohlbefinden nicht stört.
2. Aber bei den Zuständen, die durch eine schwache morphologische und funktionelle Differenzierung von Zellen gekennzeichnet sind, z.B. prämaligne Zustände oder bösartige Tumore, würde THC zur posttranslationalen Proteinmodifikation und Quervernetzung beitragen und das elektrische Potenzial der Zelle optimieren. Dies würde sowohl durch die Wechselwirkung zwischen den phenolischen Ringen und der Olefinbildung von THC und NH₂ als auch durch die COO-Gruppen der Proteinaminosäuren erreicht werden. Die resultierenden Bindungen würden als "Anker" fungieren, der die Quervernetzung mit anderen Proteinen initiiert.
3. Bei den Zuständen der Zellalterung und bei den Zuständen, in denen eine willkürliche Quervernetzung beispielsweise durch eine thermische Verletzung aufgrund von UV-Strahlen auftritt, würde der unerwünschte Prozess durch die Erfindung verhindert werden. THC würde die unerwünschte Quervernetzung dadurch verhindern, dass es sich an Amino- und Carboxygruppen der Proteinaminosäuren anhängt. Dies würde zu einer Wechselwirkung mit der willkürlichen Quervernetzung führen, einem Mechanismus, der mit einer "Puffer"-Wirkung vergleichbar ist. Diese "Puffer"-Wirkung würde die Kettenreaktion effektiv stoppen, die andererseits zur Verschlechterung der Zellhomeostase, vorzeitiger Zellalterung und vorzeitigem Zelltod führen würde.
4. Die Erfindung hat auch einen unterstützenden Mechanismus bei der Verhinderung von willkürlicher Quervernetzung von intrazellulären Proteinen, die auf den antioxidantischen Eigenschaften von THC beruht, insbesondere auf der Fähigkeit der Erfindung, freie Radikale einzufangen. Es wird vorgeschlagen, dass THC aufgrund seiner antioxidativen Wirkung die Unterbrechung der elektrischen Ladung von "supergeladenen" Proteinmolekülen erleichtert, was einer der Gründe ist, warum die willkürliche Quervernetzung beschleunigt wird. Dieser kombinierte Mechanismus der Crossregulin- und antioxidantischen Wirkung ist besonders anwendbar bei der Verhinderung von "Altersflecken" aufgrund der Bildung von Lipofuscin und entzündlichen Bedingungen, wie Psoriasis.
5. Die Quelle von Sauerstoffresten in THC für die Bindung an NH₂- oder COO-Gruppen, wäre von der Parahydroxygruppe nicht länger in Verbindung mit der olefinischen Bindung und von den Hydroxygruppen der Phenolringe.
6. Im Gegensatz zu den Curcumin(oiden)-Verbindung(en) können THC-Molekül(e) freier rotieren und stellen daher einen besseren Zugang zu den reaktiven Gruppen für "Anker"- und/oder "Puffer"-Reaktionen dar.
7. Dahingegen ist die Erfindung, wie zuvor erwähnt, relativ inaktiv bei den Zuständen der Zellphysiologie, ihr Crossregulinmechanismus würde schrittweise proportional zu dem Grad des Stresses, der auf die Zelle einwirkt ausgedrückt werden. Daher würde der Crossregulinmechanismus von THC im biologischen System von der Art der verletzenden Wirkung abhängen, die das biologische System erfährt.

Verfahren zum Erhalten von THC:
Die Tetrahydrocurcuminoide der Erfindung sind Produkte der chemischen Reduktion von Curcuminoiden, die aus den Wurzelstöcken von Curcuma longa, üblicherweise bekannt als die Gelbwurz, erhalten werden, oder aus jeglicher anderer geeigneter Pflanze der botanischen Familie Zingiberaceae.
Der Stand der Technik lehrt, dass, wenn Curcuminoide, die aus Curcuma longa erhalten werden, katalytisch reduziert und dann in einem Kristallisationsverfahren isoliert werden, Tetrahydrocurcumin (THC) ohne Verlust erhalten wird, aber dass Tetrahydrobisdemethoxycurcumin (THBDC) und Tetrahydrodemethoxycurcurmin (THDC) mit beträchtlichem Verlust erhalten werden. Als Ergebnis ist das Verhältnis zwischen Tetrahydrocurcuminoiden im Vergleich zu dem ursprünglichen Verhältnis der Stammverbindungen, den Curcuminoiden beträchtlich verändert. Das Mengenverhältnis der Curcuminoide ist bevorzugt, weil es mit der optimalen biologischen Aktivität der Curcuminoide korreliert. Das U.S. Patent Nr. 5,861,415 beschreibt Curcuminoide in einem spezifischen und optimalen Verhältnis als Bioprotektantien, die einen maximal schützenden Effekt auf die lebende Zelle ausüben.
Die vorliegende Erfindung stellt ein neues effizienteres Verfahren zur Gewinnung von THCs bereit. Dieses Verfahren verhindert den Verlust von TBDMC und TDMC und stellt eine bioprotektive Zusammensetzung von THCs bereit.
Kurzer Abriss des Verfahrens des Standes der Technik zur Herstellung von THCs

Natürliche Curcuminoide (95%) – 100 g

Aceton – 1 Liter

Pd-C (Katalysator) 5% – 2,5 g
Die Lösung von natürlichen Curcuminoiden wurde in einen Hydrierapparat geladen. Der Katalysator wurde vorsichtig hinzugefügt und der Wasserstoffdruck bei ungefähr 2 kg/cm² gehalten. Diese Reaktion ist in 3 bis 4 Stunden abgeschlossen. Der Katalysator wird dann herausgefiltert und entfernt. Die Acetonlösung wird unter Vakuum konzentriert. Der Rückstand wird aus Toluolen kristallisiert. Die Tetrahydroverbindungen kristallisieren als cremefarbiges weißes Pulver aus, das einen Schmelzpunkt von 92–94°C hat.
Verfahren der vorliegenden Erfindung
Dieses Verfahren verwendet bei der katalytischen Wasserstofftransferreaktion, die als Hydridübertragungsreaktion bekannt ist, eine neue Methode der Sättigung von zwei olefinischen Bindungen in Curcuminoiden. Es folgt ein Beispiel eines Hydridübertragungsverfahrens.

1. Ein 3 Liter-Rundhalskolben mit einem Rührer und einem Rückflusskühler wird mit 1 Liter Essigester befüllt;
2. Die Lösung wird mit 200 g natürlichen Curcuminoiden in einer zuvor beschriebenen bioprotektiven Zusammensetzung, d.h. Curcumin (C) 70–80%, Demethoxycurcumin (DMC) 15–20% und Bisdemethoxycurcumin (BDMC 2,5–6,5%) versetzt und bis zur Gleichmäßigkeit bei Raumtemperatur gerührt;
3. Diese Mischung wird mit 1 Liter Triethylamin versetzt, gefolgt von 12 g Palladium auf Kohlenstoff und 80 ml Ameisensäure;
4. Die Mischung wurde gerührt und dann bei 80°C für 12 Stunden unter Rückfluss erhitzt;
5. Periodisch wurde Ameisensäure in 5 ml Aliquoten in 2 Stunden-Intervallen zugegeben, während die Mischung weiter unter Rückfluss erhitzt wurde;
6. Die DC wurde überprüft, um die Vervollständigung der Reaktion zu beobachten (System: mit Silika vorbeschichtete 0,25 mm dicke Platten/Chloroform : Methanol = 9 : 1);
7. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur abgekühlt. Sie wurde dann filtriert, um den Palladium-Katalysator zu entfernen, und mit 50 ml Essigester gewaschen;
8. Essigester und Triethylamin wurden abdestilliert (2 Liter Destillat wurden gesammelt);
9. Die Rohmasse wurde dann mit Toluol extrahiert (3 × 500 ml);
10. Der Toluolextrakt wurde mit 200 ml von 5% HCl und 3 × 500 ml Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet;
11. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt, um ungefähr 200 g einer blassgelben Paste zu erhalten.
12. Die Paste wurde mit 200 ml Ether verrieben, filtriert und unter Vakuum getrocknet, um ein blassgelbes Pulver von Tetrahydrocurcuminoiden zu erhalten, 175 g (70%) Ausbeute.

THC	75 bis 85%
THDHC	10 bis 20%
THBDMC	2 bis 4,5%

In einer anderen Variante der Hydridtransferreaktion wurden Curcuminoide mit Ammoniumformat oder Natriumdihydrogenphosphit (als katalytisches Wasserstoffübertragungsreagenz) in Gegenwart von Pd/C und Essigsäure behandelt. Die Reduktion ist in 20 bis 30 Minuten bei 100 bis 110 Grad Celsius abgeschlossen. Dieses Verfahren ergibt 50% Tetrahydrocurcuminoide.
THC kann in einem geeigneten Vehikel oder mit einer Anwendungsvorrichtung, z.B. einem transdermalen Pflaster, in einer Konzentration von 0,025% bis 5%; in der Form von subkutanen Injektionen oder einem transdermalen Pflaster von 0,025% bis 5% topisch verabreicht werden; oder in einer oral verabreichten Dosierungsform in einer Konzentration von 5 mg bis 500 mg pro Dosis oder 0,083–8,3 mg/kg des Körpergewichts. THC ist geeignet für die Verwendung am Menschen und am Tier.
Andere Verabreichungsvehikel schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf: Aerosol oder andere Vorrichtungen zur Abgabe an die Lungen, Nasensprays, intravenös, intramuskulär, intraperitoneal, intrathekal, vaginal und rektal. Arzneiträger, die als Vehikel zur Abgabe des Phagen geeignet sind, sind dem Fachmann offensichtlich.
Zusammensetzungen von Tetrahydrocurcuminoiden für die topische Anwendung sollten im Wesentlichen farblos sein. Der Begriff "im Wesentlichen farblos" soll bedeuten, dass die Zusammensetzung keine Farbe enthält oder solch eine geringe Menge an Farbe enthält, dass die Zusammensetzung bei topischer Verabreichung die Haut nicht verfärbt.
Der Begriff "farbentferntes Curcumin" bezieht sich auf die tetrahydrocurcuminoide Mischung gemäß der vorliegenden Erfindung.
THC-Molekül, das als "Anker" für Aminosäuren von Proteinen wirkt, um Proteinquervernetzungen zu initiieren. Dieser Mechanismus würde zu den physiologischen Quervernetzungen beitragen.
Legende:

:

Aminosäure/Protein

THC-Molekül, das als Puffer wirkt, zur Verhinderung von willkürlicher Quervernetzung aufgrund von UV bewirkten Quervernetzungen. Dieser Mechanismus würde zu der Vorbeugung von pathologischen Quervernetzungen beitragen.
Legende:

:

Aminosäure/Protein

EINFÜHRUNG
Die Studie wurde entwickelt, um die akute orale Toxizität von farbentferntem Curcumin auf Sprague Dawley Ratten zu bestimmen. Die Richtlinien, nach denen vorgegangen wurde, wurden durch das Gaitonde Committee Guidelines, CIB, New Delhi vorgeschrieben. PROJEKT NR. 4952 MATERIALIEN UND METHODEN TESTSUBSTANZ:

Sponsor : Sami Chemicals and Extracts Ltd., Bangalore.

Bezeichnung auf der Probe: Farbentferntes Curcumin Charge Nr. – CRC/65 A R Nr. – BL8C 0445

Beschreibung: cremeweißes kristallines Pulver

Identifizierung: IR Spektrum: erfüllt

Löslichkeit: löslich in Methanol

Reinheit gemäß HPLC: 99,0%
PROJEKT NR. 4952
ZUSAMMENFASSUNG
Die jetzt berichtete Studie wurde entwickelt, um die akute orale Toxizität von farbentferntem Curcumin bei Sprague Dawley Ratten zu bestimmen. Die in Maiskeimöl suspendierte Substanz wurde auf dem oralen Weg an die Ratten verabreicht. Die Ratten wurden 14 Tage lang nach der Behandlung auf Symptome hin beobachtet, die mit dem Produkt zusammenhängen könnten. Die Testsubstanz verursachte Speichelfluss bei allen Tieren und Polyharnstoff bei zwei Tieren mit einem Anfall nach zwei Stunden nach der Behandlung. Alle Tiere überlebten während der Studiendauer von 14 Tagen und waren 24 Stunden nach der Behandlung frei von Vergiftungserscheinungen.

Es wurde gefunden, dass der LD₅₀-Wert von farbentferntem Curcumin bei Ratten bei dem oralen Weg größer als 5000 mg/kg ist. TESTSYSTEM

Spezies:	Ratte
Stamm:	Sprague Dawley
Quelle:	I. I. T. Animal house
Geschlecht:	männlich und weiblich
Alter:	6 bis 8 Wochen
Gewichtsbereich:	120,5 bis 141,9 g
Zahl der Tiere pro Dosis:	5 pro Geschlecht
Randomisierung:	wahllos ausgewählt aus Gruppen von fünf des gleichen Geschlechts zu der Zeit, zu der die Studie begonnen wurde.

Akklimatisierung:	wurde nicht durchgeführt, da die Tiere in demselben Institut gezüchtet und aufgezogen wurden.
Identifizierung der Tiere:	durch Käfignummer und individuelle Markierung auf dem Fell.
Ernährung:	pelletiertes Futter, das durch Nav Maharashtra Chakan Oil Mills Ltd., Pune bereitgestellt wurde.
Wasser:	Aquagard reines Wasser in Glasflaschen nach Belieben.
Management:	Jeweils 5 Ratten desselben Geschlechts wurden in Polypropylenkäfigen, die mit einem Strohboden ausgestattet waren, untergebracht. Die Temperatur wurde zwischen 20 und 24°C gehalten und die relative Luftfeuchtigkeit zwischen 50 und 60%; es wurde jeweils ein Zyklus von 12 Stunden Dunkelheit und Helligkeit aufrechterhalten.
Weg:	mündliche Sondenernährung
Benutztes Vehikel:	Maiskeimöl
Dosierungsvolumen:	10 ml/kg

EXPERIMENTELLES VERFAHREN
Die in Maiskeimöl suspendierte Testsubstanz wurde jeweils einmal durch orale Sondenernährung an die Ratten beiderlei Geschlechts verabreicht. Die Ratten wurden 16 Stunden vor und 2 Stunden nach der Verabreichung der Testsubstanz ausgehungert. Die Tiere wurden 14 Tage lang nach der Dosierung hinsichtlich toxischer Symptome und Sterblichkeit betreffend das Produkt beobachtet. Bei Tieren, die während der Beobachtungsperiode starben, wurde eine Nekropsie durchgeführt. Am Ende der Beobachtungsperiode wurden die überlebenden Testtiere getötet, seziert und hinsichtlich großer pathologischer Abnormalitäten, wenn überhaupt, geprüft.
LD₅₀ bei Ratten
Zehn Ratten (5 männliche und 5 weibliche) wurden der Behandlung wie folgt unterzogen.
PROJEKT NR. 4952 ERGEBNISSE LD₅₀ bei Ratten

Symptome: Gruppe 1 – Bei allen Tieren wurde Speichelfluss und bei zwei Tieren wurde Polyharnstoff beobachtet, wobei der Ausbruch 2 Stunden nach der Behandlung erfolgte. Alle Tiere überlebten während der Studiendauer von 14 Tagen und waren 24 Stunden nach der Behandlung frei von Vergiftungserscheinungen.
Ergebnisse der Nekropsie: Mit dem bloßen Auge konnten keine bedeutenden Änderungen gesehen werden.
LD₅₀: Größer als 5000 mg/kg.

Sterblichkeitstabelle
PROJEKT NR. 4953
ZUSAMMENFASSUNG
Die Studie wurde entwickelt, um das primäre Hautreizungspotenzial von farbentferntem Curcumin zu bestimmen, das von Sami Chemicals and Extracts Ltd., Bangalore zur Verfügung gestellt wurde. Die Testsubstanz wurde in einer Menge von 500 mg auf geschorener Rückhaut, sowohl auf der intakten als auch auf der aufgescheuerten Seite, bei drei Kaninchen pro Geschlecht angewandt. Jeder Ort der Anwendung wurde sorgfältig beobachtet und die Reaktion nach der Methode von Draize bei 24 und 72 Stunden ausgewertet.

Farbentferntes Curcumin verursachte keine Hautreizung bei Kaninchen.
Primärer Hautreizungswert = 0,00. PROJEKT NR. 4953 MATERIALIEN UND METHODEN TESTSUBSTANZ:

Sponsor:	Sami Chemicals and Extracts Ltd., Bangalore
Bezeichnung auf der Probe:	Farbentferntes Curcumin Charge Nr. – CRC/65 A R Nr. – BL8C 0445
Beschreibung:	cremeweißes kristallines Pulver
Identifizierung:	IR Spektrum: entspricht den Anforderungen
Löslichkeit:	löslich in Methanol
Reinheit durch HPLC:	99,0%

TESTSYSTEM

Spezies:	Kaninchen
Stamm:	New Zealand Weiß
Quelle:	Serum Institute of India Ltd., Pune.

Geschlecht:	männlich und weiblich
Alter:	gesunde Erwachsene
Gewichtsbereich:	2,00 bis 2,40 kg
Nr. an Tieren pro Dosis:	3 pro Geschlecht
Randomisierung:	wahllos ausgewählt aus Gruppen von drei des gleichen Geschlechts zur Zeit des Beginns der Studie.
Akklimatisierung:	eine siebentägige Periode zur Behandlung.
Identifizierung der Tiere:	durch die Käfignummer und individuelle Markierung. am Ohr.
Ernährung:	pelletiertes Futter, das von Nav Maharashtra Chakan Oil Mills Ltd., Pune bereitgestellt wurde.
Wasser:	Aquaguard reines Wasser in Glasflaschen nach Belieben.
Management:	Die Kaninchen wurden jedes einzeln in rostfreien Stahlkäfigen mit Edelstahlgitterboden untergebracht. Die Temperatur wurde zwischen 20 und 23°C gehalten und die relative Luftfeuchtigkeit zwischen 50 und 60%; es wurde ein Zyklus von jeweils 12 Stunden Dunkelheit und Helligkeit aufrechterhalten.
Weg:	dermal
Dosisvolumen:	500 mg/Ort.

EXPERIMENTELLES VERFAHREN

Für diese Studie wurden drei Kaninchen pro Geschlecht verwendet. Auf beiden Seiten wurde das Haar durch eine elektrische Haarschneidemaschine einen Tag vor der Behandlung entfernt. Die Testsubstanz wurde mit einer Menge von 500 mg auf die intakten und abgeriebenen Hautstellen jedes Testtiers aufgetragen. Dabei wurde besonders darauf geachtet, dass die Abschürfungen durch das Stratum corneum, aber nicht durch die Haut dringen. Ein Gazeflicken wurde über jedem behandelten Gebiet durch Klebeband gesichert. Die Tiere wurden einzeln mit einer Plastikmanschette um ihren Nacken für 24 Stunden untergebracht, um die Nahrungsaufnahme der Testsubstanz zu vermeiden. Das Pflaster und die nicht absorbierte Testsubstanz wurden nach 24 Stunden entfernt. Jede Stelle der Anwendung wurde sorgfältig beobachtet und die Reaktion nach der Methode von Draize bei 24 und 72 Stunden ausgewertet. Draize Evaluierung von Hautreaktionen – Einstufung der Hautreaktion 1. Erythema und Eschar Bildung

Kein Erythema	0
Sehr leichtes Erythema (kaum wahrnehmbar)	1
Gut definiertes Erythema	2
Gemäßigtes bis schweres Erythema	3
Schweres (Beetröte) bis leichtes Erythema
Escharbildung (Verletzung in der Tiefe)	4

Maximal mögliche Erythemae Bewertung: 4 2. Bildung von Ödemen

Keine Ödeme	0
Sehr leichte Ödeme (kaum wahrnehmbar)	1
Leichte Ödeme (Umrandung des Gebietes, definiert durch deutliche Erhebung)	2
Gemäßigte Ödeme (mehr als 1 mm erhaben)	3
Schwere Ödeme (mehr als 1 mm erhaben und sich erstreckend über das Gebiet der Anwendung hinaus)	4

Maximal mögliche Ödem Bewertung: 4 ERGEBNISSE Zusammenfassung der individuellen dermalen Reizung nach der Anwendung von farbentferntem Curcumin bei Kaninchen.

Primärer Hautreizungswert 0,00/4 = 0,00

PROJEKT NR. 4953
SCHLUSSFOLGERUNG
Auf Basis der vorliegenden Studie wurde geschlossen, dass die Testsubstanz farbentferntes Curcumin, die durch Sami Chemicals and Extracts Ltd., Bangalore bereitgestellt wurde, bei Kaninchen keine Hautreizung auslöst.
Erste Hautreizungszahl: 0,00. Radikalfängereffekt von Curcumin und seiner Derivate auf den 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl-Rest

*NTC: natürlich; STC: synthetisch.

Effekt der topischen Anwendung von Curcumin und Tetrahydrocurcumin auf Ultraviolett-B lichtinduzierte Bildung von Thymindimeren in Mausepidermis
Weibliche SKH-1 Mäuse (8–9 Wochen alt) wurden topisch mit 100 μl Aceton behandelt oder einer Testverbindung in 100 μl Aceton behandelt. Fünf Minuten später wurden die Mäuse mit einer einzelnen Dosis von UVB (30 mJ/cm²) bestrahlt. Die Mäuse wurden eine Stunde später getötet und die Hautproben wurden in einer 10%igen Formalin-Phosphatpuffer-Lösung für den Thymindimertest aufbewahrt.
Effekt von UVB-induzierter Bildung von Hautsonnenbrandzellen in der Mausepidermis
Weibliche Sencar-Mäuse wurden mit UVB (60 mJ/cm²) bestrahlt. Die Mäuse wurden topisch mit 100 μl Aceton oder einem Inhibitor in 100 μl Aceton 5 Minuten vor der UVB-Einstrahlung behandelt. Acht Stunden später wurden die Mäuse getötet und die Hautproben wurden entfernt und in einer 10%igen Formalinphosphatpuffer-Lösung für den Sonnenbrandzellentest aufbewahrt.

Claims

Verwendung einer wirksamen Menge einer Mischung von Tetrahydrocurcuminoiden zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Melanomen.
Verwendung einer wirksamen Menge einer Mischung von Tetrahydrocurcuminoiden zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Altersflecken aufgrund der Bildung von Lipofuscin.