KR20020083634A - 수지상 세포를 포함하는 자가면역 질환의 치료용 약제학적조성물 및 이를 이용한 치료방법 - Google Patents
수지상 세포를 포함하는 자가면역 질환의 치료용 약제학적조성물 및 이를 이용한 치료방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 특정 수지상 세포를 포함하는 자가면역 질환의 치료용 약제학적 조성물 및 이를 이용한 치료방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 자가면역 T 세포에 의한 조직세포의 파괴를 억제하는 면역학적 효과를 갖으며 γ-인터페론으로 전처리된 수지상 세포의 치료학적 유효량; 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 자가면역 질환의 치료용 약제학적 조성물 그리고 이를 이용한 치료방법에 관한 것으로서, 본 발명의 약제학적 조성물 및 치료방법은 제 1 형 당뇨병 및 류마티스성 관절염과 같은 다양한 자가 면역 질환의 치료에 이용된다.
Description
본 발명은 자가면역 질환의 치료용 약제학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 특정 수지상 세포를 포함하는 자가면역 질환의 치료용 약제학적 조성물 및 이를 이용한 치료방법에 관한 것이다.
자가면역 질환 (autoimmune disease)은 자기의 항원에 대한 비정상적인 면역반응으로부터 야기된다. 자가면역 질환에 있어서, 자기 항원을 공격하는 T 세포가 관여하는 질환으로는 다발성 경화증 (multiple sclerosis), 제 1 형 당뇨병 또는 인슐인 의존형 당뇨병 및 류마티스성 관절염 (rheumatoid arthritis) 등이 있다 (KJ Johnson et al.,Immunopathology in Pathology, pp104-153(1999)).
인슐린 의존형 당뇨병 (insulin-dependent diabetes mellitus: IDDM), 즉 제 1 형 당뇨병은 인슐린을 생산하는 췌도 (pancreatic islet) 베타세포가 자가면역을 일으키는 T 세포에 의해 파괴되면서 나타나는 자가면역질환으로, 글루타메이트 디카복실라아제 (GAD65)와 같은 베타세포의 특정 항원 (Lohmann 등,Lancet343:1607(1994); Yoon 등,Science, 284:1183-1187(1999))이나 인슐린에 대한 항체 (Williams 등,J. Autoimmun. Nov.13(3):357-363(1999); Yu 등,P.N.A.S.USA, 97(4):1701-1706(2000)) 유무로 당뇨병의 발생 가능성을 규명하고 있지만 아직까지 치료방법은 물론이고 그 정확한 원인이나 면역학적 기전, 그리고 유전적인 요인도 제대로 밝혀지지 않고 있는 실정이다.
사람의 제 1 형 당뇨병과 유사한 동물모델인 NOD (non-obese diabetic) 마우스 (Makino 등,Exp. Anim., 29:1-13(1980))와 BB (BioBreeding) 래트 (Like 등,Science, 216:644-646(1982))가 개발되어 당뇨병에 대한 연구가 지속적으로 수행되어 왔으나 이렇다 할 병인학적 기전과 치료법에 대해서는 아직 성공을 거두지 못하고 있다.
한편, Green 등은 강력한 항원제시세포인 수지상 세포 (dendritic cell)가 제 1 형 당뇨병의 발병과 깊은 관련이 있을 것이라는 발표를 하였고 (Green 등,Immunity, 9:933-943(1998)), 보다 구체적으로는 TNF-α형질전환 NOD의 경우 췌도에서 국소적으로 TNF-α가 발현되면 췌도염이 시작되는데 이 때 염증 초기에 주위의 수지상 세포들이 몰려들어 췌도-특이항원에 대한 T 세포의 활성을 강력하게 유도하고 췌도염을 가속화시켜 최종적으로 당뇨병을 유발시킨다는 기전을 제시하였다.
그러나 정상의 NOD 마우스에서 당뇨 발증 기전을 상기 Green 등의 이론으로 설명하기에는 한계가 있던 중, 수지상 세포가 아폽토시스된 세포에서 매우 효과적으로 항원을 취하여 크로스-프라이밍 방법으로 세포독성 T 세포를 활성화한다는 결과 (Albert 등,Nature, 392:86-89(1998))가 발표되었고, 또한 Rovere 등은 (J. Immunol., 161:4467-4471(1998);J. Leuk. Biol., 66:345-349(1999)) 정상 마우스의 경우 췌도의 베타세포 재생과정에서 아폽토시스된 세포를 대식세포가 주로 제거하고 일부를 미성숙 상태의 수지상 세포가 도와주며 이 경우 수지상 세포가 췌도 항원-특이 T 세포를 만날 경우 클론제거 (clonal deletion) 방법이나 비활성상태 (anergy)를 유도하여 췌도 항원에 대한 자기관용 (tolerance)을 유도하지만, NOD의 경우 재생과정에서 아폽토시스 되는 베타세포가 많아 대식세포가 이를 다 감당하지 못한 상태에서 다량의 미성숙 수지상 세포가 몰려들어 이에 관여하게 되고 이들 일부가 아폽토시스된 세포를 제거하는 과정에서 성숙되어 췌도 항원-특이 T 세포를 활성화시킴으로써 강력한 자가면역성 T 세포가 만들어져 췌도가 파괴되고 당뇨로 진행된다고 발표하였다.
한편, B 세포 발생이 억제된 형질전환 마우스 실험을 통해 초기 췌도염 발생과정에 항원제시세포로 B 세포도 중요하게 작용하는 것으로 보고되었다 (Akashi edmInt. Immunol., 9:1159-1164(1997); Noorchashm 등,Daibetes, 46:941-946(1997); Serreze 등,J. Exp. Med., 184:2049-2053(1996)). 그러나 Green 등의 실험에 의하면 TNF-α-NOD 마우스 모델에서는 B 세포를 제거하여도 역시 당뇨가 유발되었으며 (Green과 Flavell,Curr. Opinion. Immunol., 11:663-669(1999)), 동량의 T 세포를 활성화시킬 경우 수지상 세포가 B 세포에 비해 10배 이상 효과적이라는 보고 (Delon 등,J. Exp. Med., 188:1473-1484(1998)), 그리고 당뇨 초기에NOD 마우스나 BB 랫드의 췌도에 다량의 수지상 세포의 침투가 관찰된다는 많은 보고들 (Voorbij 등,Diabetes, 38:1623-1629(1989); Jansen 등,Diabetes, 43:667-675( 1994); Dahlen 등,J. Immunol., 160:3585-3593(1998); Papaccio 등,J. Cell Biochem., 74:447-457(1999); Rosmalen 등,Lab Invest., 80:23-30(2000); Rosmalen 등,Lab Invest., 80:769-77(2000))은 B 세포보다는 수지상 세포가 당뇨 유발 초기에 중요하게 작용하고 있음을 시사해 준다. 그 외에도 당뇨나 뇌질환의 동물모델인 EAE (Experimental autoimmune encephalitis)의 경우 자가항원을 발현하도록 조작하거나 자가항원으로 표지시킨 수지상 세포를 정상 마우스에 옮겨줄 경우 동일 질병이 유도된다는 연구결과 (Ludwig 등,J. Exp. Med., 188:1493-1501(1998); Dittel 등,J. Immunol., 163:32-39(1999))도 수지상 세포가 이러한 자가면역질환에 핵심적으로 작용할 가능성을 뒷받침해준다.
그러나 무엇보다도 당뇨병과 관련된 수지상 세포의 연구 결과 중 최근 큰 관심을 모은 것은 정상 NOD 마우스의 비장에서 부착성 (adhesive)이 약한 수지상 세포를 분리하여 감마-인터페론을 처리한 후 1-4주령된 NOD 마우스의 복강에 주입할 경우 70% 정도 되던 NOD의 당뇨 발병율이 현저히 감소하여 26.3%까지 떨어졌다는 것이다 (Shinomiya 등,Clin. exp. Immunol., 117:38-43(1999)). 또한 이들은 ICR 마우스에서 동일한 방법으로 분리한 수지상 세포를 NOD 마우스에 투여하여도 비슷한 결과를 얻었다고 발표하였다. 또한 NOD 마우스에 생후 4주와 6주에 수지상 세포를 누 중 투여할 경우 30주 동안 6마리 중 한 마리도 당뇨 증상을 보이지않았다. 그러나 이러한 수지상 세포의 투여에 의한 예방효과는 6 주령 이상된 NOD 마우스에서는 나타나지 않았으며 오직 1-4 주령된 어린 NOD 마우스에서만 나타난다고 발표하였다. 이러한 연구결과는 1992년 Clare-Salzler 등 (J. Clin. Invest., 90:741-748(1992))이 발표한 수지상 세포의 당뇨 예방 가능성을 한 단계 발전시킨 것으로, Clare-Salzler 등은 췌장의 임파절에서 분리한 수지상 세포를 NOD 마우스에 투여할 경우 다른 세포보다 매우 효과적인 당뇨예방 효과를 보였다고 발표하였다. 또한, 최근 NOD 마우스의 비장에서 수지상 세포를 분리하여 인간 감마글로불린 (human γ-globulin: HGG)을 감작시키고 이를 5주령 된 NOD 마우스의 정맥에 투여할 경우 12마리 중 11마리에서 25주 동안 당뇨 증상이 나타나지 않았으며 당뇨가 예방된 NOD 마우스에서 아일릿 (islet)을 분리하여 배양하고 상층액을 분석한 결과 IL-4와 IL-10이 증가하였고, 감마 인터페론 (γ-interferon: γ-IFN)이나 TNF-α와 같은 사이토카인의 발현은 감소함을 보였다 (Papaccio 등,Endocrinology, 141:1500-1505(2000)). 그러나 HGG로 감작되지 않은 DC 투여군에서는 이러한 예방 효과를 보이지 않았다.
상술한 여러 연구 결과들은 NOD 마우스의 경우 수지상 세포를 인위적으로 활성화시킬 경우 체내의 비정상적인 면역반응을 정상적으로 조절할 수 있음을 보여주는 예가 되며, 사람의 제 1 형 당뇨 환자나 NOD 마우스의 수지상 세포가 비정상일 가능성이 있음을 시사해 준다. 실제 제 1 형 당뇨 환자의 경우나 (Jansen 등,Lancet, 345:491-492(1995); Takahashi 등,J. Immunol., 161:2629-2635(1999)) NOD 마우스에서 (Serreze 등,J. Immunol., 150:2534-2543(1993)) 항원제시세포에문제가 있을 가능성이 몇 차례 보고된 바 있으며, 특히 최근 BB 랫드에서 항원제시세포 중 수지상 세포의 미성숙이 T 세포의 활성을 효과적으로 조절하지 못하여 당뇨가 일어날 가능성이 보고되었다 (Delemarre 등,J. Immunol., 162:1795-1801(1999)). 또한 이러한 사실과 관련하여 Lee 등 (J. Korean Med. Sci., 15:217-223(1999))은 NOD 마우스의 척수 (bone marrow: BM) 유래 수지상 세포 (BM-DC)를 조사한 결과 NOD 마우스의 BM-DC가 골수성 수지상 세포로 잘 분화되지 않으며 표면의 Ⅱ형 MHC, 보조활성분자 (co-stimulatory moleculae)인 B7-1 및 B7-2, 그리고 CD40의 발현이나 IL-12의 분비가 C57BL/6 마우스에 비해 낮다고 보고하였다. Lee 등 (1999)의 결과는 Takahashi 등 (J. Immunol., 161:2629-2635(1999))의 결과를 뒷받침하는 것으로 제 1 형 당뇨 환자에게서 분리하여 분화시킨 단핵구 유래 수지상 세포 (Mo-DC)가 T 세포 활성을 효과적으로 유도하지 못하며, 그 이유 중 하나가 제 1 형 당뇨 환자의 경우 Mo-DC의 표면에 B7 분자의 발현이 낮다는 점을 들고 있다.
상술한 바와 같이 수지상 세포가 자가면역질환 중 하나인 제 1 형 당뇨 발병과 밀접한 관계가 있으며 수지상 세포를 이용한 제 1 형 당뇨의 예방 가능성은 몇 차례 보고된 적이 있지만 현재까지 수지상 세포를 이용한 당뇨병의 치료 가능성은 한 건도 보고된 적이 없다.
한편, 류마티스성 관절염의 치료제 또는 경감제로서 현재까지 개발된 것은 메토트렉세이드 (methotrexate), 아자티오프린 (azathioprine), 시클로포스파미드(cyclophosphamide) 및 코티코스테로이드 (corticosteroid) 등이 있다 (Johnson CJ, et al.,Ann. Pharmacother., 35(4):464-471(2001), Seymour HE, et al.,Br. J. Clin. Pharmacol., 51(3):201-208(2001)). 그러나, 현재까지 개발된 류마티스성 관절염의 대부분은 큰 부작용이 있으며, 관절 손상의 발전을 크게 억제하지는 못하고 있는 실정이다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문이 참조되고 그 인용은 괄호내에 표시하였다. 인용된 논문의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준이 보다 명확하게 설명된다.
따라서, 본 발명의 목적은 자가면역 질환의 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 자가면역 질환의 치료방법을 제공하는 데 있다.
도 1은 본 발명에서의 수지상 세포의 분리 단계를 나타내는 개략도;
도 2는 CD11b-/CD8α+수지상 세포의 당뇨 치료 효과를 나타내는 그래프;
도 3은 수지상 세포의 당뇨 치료 효과를 보여주는 췌도의 염색 사진;
도 4는 수지상 세포의 당뇨 치료 효과를 보여주는 췌도의 인슐린 염색 사진;
도 5는 수지상 세포의인 비보에서의 이동 위치를 나타내는 형광 사진;
도 6a는 초기 당뇨 발증된 NOD 마우스로부터 분리된 임파절 세포에 췌도 항원을 처리한 경우 IL-4 및 γ-IFN의 양적 변화를 나타내는 그래프;
도 6b는 본 발명에 따라 당뇨가 치료된 NOD 마우스에서의 면역전환을 보여주는 IL-4 및 γ-IFN의 양적 변화를 나타내는 그래프;
도 7은 CD11b-/CD8α+수지상 세포에 γ-IFN을 처리한 경우의 형태 변화를 나타내는 전자현미경 사진;
도 8은 분리된 CD11b-/CD8α+수지상 세포의 표면 단백질 발현 양상을 나타내는 FACS 결과 그래프; 및
도 9는 사람의 말초 혈액으로부터 분리한 CD11c-수지상 세포 및 CD11c+수지상 세포의 형태학적 특징으로 보여주는 전자현미경 사진
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 자가면역 T 세포에 의한 조직세포의 파괴를 억제하는 면역학적 효과를 갖으며 γ-인터페론으로 전처리된 수지상 세포의 치료학적 유효량; 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 자가면역 질환의 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 마우스의 비장으로부터 수지상 세포를 각각의 아군 (subset)에 따라 분리하고, 분리된 아군 중에서 경이롭게도 제 1 형 당뇨병 치료 효과를 나타내는 것을 발견하였다. 수지상 세포의 당뇨 예방 효과는 공지되어 있으나, 본 발명과 같은 수지상 세포 아군의 제 1 형 당뇨병 치료 용도는 종래에는 전혀 알려져 있지 않은 것이다.
한편, 수지상 세포의 특이 아군이 제 1 형 당뇨병을 치료할 수 있음은 특정의 수지상 세포가 류마티스 관절염과 같은 다른 자가면역 질환에 적용될 수 있는 가능성을 보여준다. 류마티스 관절염은 관절의 염증을 특징으로 하는 만성 전신성 자가면역 질환으로서, 관절의 염증은 계속적으로 관절 연골과 골 조직으로 침윤되어 이들 조직의 부식을 가져온다. 류마티스 관절염의 유발 가능한 원인 항원으로는 관절의 주요 구성성분인 제 2 형 콜라겐이 잘 알려져 있으며, 이를 특이 조직적합항원을 가지는 마우스에 주사할 경우 류마티스 관절염이 유발된다 (LK Myers et al.,Life Sci., 19:1861-1878(1997)). 류마티스 관절염의 경우 발병시 관절내 대식세포나 섬유아세포에서 사이토카인의 생산이 증가되며 T 세포에 의한 림포카인도 Th1 세포에 의한 IFN-γ와 IL-2 생산이 항진되어 있는 것으로 보고되었다. 이러한 Th1 세포에서 생산된 사이토카인은 관절염 증세를 악화시키는 반면 IL-4 및 IL-10 등과 같은 Th2 세포에 의해 생산된 사이토카인은 관절염을 예방하는 것으로 알려져 왔다. 또한 바이러스 벡터에 Th2 형 사이토카인인 IL-4 또는 IL-10을 발현시켜 관절염을 유도한 마우스의 관절내에 주사할 경우 주사한 다리 이외에 다른 다리에서도 치료 효과를 나타냈다는 보고도 있었다 (SH Kim, et al.,J. Immuonl.,166:3499-3505(2001)). 위와 같은 사실은 류마티스 관절염의 발병시 원인이 되는 조직 항원만이 제 1 형 당뇨병과 상이할 뿐 자가 면역의 형성 기전이나 치료 기전은 2가지 자가면역질환에서 공통적일 것이란 점을 강력히 시사한다. 따라서, 본 발명에서 제 1 형 당뇨병 치료에 사용되는 수지상 세포 아군과 처리 방법은 류마티스 관절염의 치료에도 적용된다.
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본 발명을 달성하기 위하여 요구되는 수지상 세포는 자가반응성 T 세포에 의한 조직 세포 (예: 베타세포) 파괴를 억제하는 능력을 갖는 세포이다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 수지상 세포는 임파성 수지상 세포이다.
본 발명의 구체적인 일 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 수지상 세포는 CD11b-/CD8α+수지상 세포 아군이다. 그러나, CD11b-/CD8α+수지상 세포 아군은 마우스에서만 나타나는 것이다. 본 발명자들은 상기한 마우스의 수지상 세포 아군과 동일한 기능을 할 것으로 예상되는 동종 세포를 인체에서 발견하였다. 따라서, 본 발명의 구체적인 일 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 수지상 세포는 CD11c-수지상 세포이다. 한편, 본 명세서에 개시된 내용을 변형하는 경우에는 상기한 CD11b-/CD8α+및 CD11c-이외에도 자가면역 질환의 치료제로서의 다른 수지상 세포를 확인할 수 있다는 것은 당업자의 측면에서 자명한 것이다. 결국, 본 발명의 요지는 제 1 형 당뇨병을 포함하는 자가면역 질환의 치료제로서의 수지상 세포의 신규한 용도를 발견한 것이고, 이에 본 발명은 자가면역 질환의 치료 효과를 나타내는 모든 수지상 세포를 포함한다.
본 발명에 있어서, 수지상 세포는 γ-인터페론으로 전처리 되는 경우에만 치료제로서의 활성을 나타낸다. 바람직하게는, 상기 γ-인터페론의 양은 50-200 U/㎖이고, 보다 바람직하게는 80-150 U/㎖이며, 가장 바람직하게는 100 U/㎖이다.
본 명세서에서의 용어 "치료"는 (ⅰ) 아직 자가면역 질환을 보유하고 있다고 진단되지 않았으나, 이러한 경향이 있는 포유동물에서 질병 또는 장애가 발생되는 것의 예방; (ⅱ) 자가면역 질환의 억제, 즉 발전의 억제; 및 (ⅲ) 자가면역 질환의 경감을 의미한다.
발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물은 치료학적 유효량의 수지상 세포 및 담체로서 생리 식염수의 현탁액으로 이루어질 수 있어, 용이하게 약제학적 조성물을 제조할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입 등으로 투여할 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물은 적용되는 질환의 종류에 따라, 예컨대 제 1 형 당뇨병인 경우에는 복강투여가 가장 바람직하고, 이는 투여된 수지상 세포가 희석되지 않고 효과적으로 췌장으로 이동할 수 있기 때문이다. 또한, 본 발명의 약제학적 조성물이 관절염 환자에 적용되는 경우에는 정맥내 주사로 투여될 수 있지만, 가장 바람직하게는 국부적으로 관절내 주입으로 투여된다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 당뇨 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 자가면역 T 세포에 의한 조직세포의 파괴를 억제하는 면역학적 효과를 갖는 수지상 세포에 γ-인터페론을 전처리하는 단계; 및 상기 전처리된 수지상 세포의 치료학적 유효량과 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 자가면역 질환의 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는 자가면역 질환의 치료방법를 제공한다.
본 발명의 치료방법에 대한 내용 중 상술한 본 발명의 약제학적 조성물과 중복되는 것은 편의상 기재를 생략한다.
한편, 자가면역 질환 중 제 1 형 당뇨병의 발전은 개념적으로 6 단계로 나눌 수 있다 (Eisenbarth,New Engl. J. Med.314:1360-1368(1986)). 단계 Ⅰ은 당뇨병의 발전에 필수적인 유전적 감수성 (genetic susceptibility)을 나타내지만 질병의 발전에는 충분한 조건이 갖추어지지 않은 단계이다. 단계 Ⅱ는 베타 세포에 대한 자가 면역의 활성화가 촉발되는 단계이고, 단계 Ⅲ은 베타 세포가 감소되고 인슐린에 대한 자가항체와 같은 면역학적 이상 및 췌도의 세포질성 항원이 확인되는 단계이다. 단계 Ⅳ는 베타 세포의 점진적으로 감소되어 인슐린 분비가 감소되지만 아직은 정상적인 혈당량을 나타내는 단계이고, 단계 Ⅴ는 명백한 당뇨 증상 (고혈당증)이 확인되고 베타 세포의 약 90%가 파괴되며 환자는 생존을 위해 외래의 인슐린을 요구하는 단계이다. 단계 Ⅵ은 잔여의 모든 베타 세포가 파괴되고, C 펩타이드가 혈액에서 더 이상 발견되지 않는 단계이다.
상술한 당뇨 증상의 단계에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물 및 치료방법은 상술한 모든 단계에 작용하여 치료적 효과를 나타내지만, 바람직하게는 단계 Ⅱ 내지 단계 Ⅴ 중 어느 한 단계에 있는 환자에게 적용된다.
본 발명의 바람직한 치료방법에 따르면, 본 발명의 투여단계는 복강 주입 (제 1 형 당뇨병) 또는 관절내 주입 (류마티스성 관절염)으로 실시된다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 마우스 비장에서 CD11b - /CD8α + 수지상 세포의 분리
우선, ICR 마우스 (분양처: 한림대 실험동물부)에서 비장을 분리하고 페트리 디쉬 상에서 PBS 용액으로 세척한 다음, PBS 용액을 상기 세척한 비장 조직에 주사기로 주입하고 주사기 바늘로 조직을 긁어 비장 세포들을 PBS 용액상으로 분리해 내었다. 이어, 남은 조직은 37℃에서 20분 동안 콜라겐나아제 (200 unit/㎖: Sigma Type Ⅳ)를 처리하여 비장세포들이 조직으로부터 PBS 용액상으로 분리되어 나오도록 하였다. 그런 다음, 용액상의 비장 세포들을 원심분리하여 수집하고, 10 ㎖의 적혈구 용해용액 (0.14 M NH4Cl, 0.02 M Tris-Cl, pH 7.2)에 10분 동안 실온에서 방치하여 적혈구만을 선택적으로 용해시켰다. 적혈구가 제거된 비장세포를 RPMI-5%FBS 배지 (GibcoBRL) 에 재부유한 다음, 세포수가 Φ100 세포배양 용기 당 1 x 108세포가 넘지 않도록 배지 부피를 맞추고, 37℃ 배양기에서 90분간 배양하였다. 이어, 세포배양 배지를 9-10회 피펫팅하여 플레이트 바닥에 느슨하게 붙어있는 세포를 세척하여 제거하였다. 37℃에서 미리 가열된 RPMI 배지를 디쉬 당10 ㎖씩 넣고 상기와 동일한 방법으로 느슨하게 붙은 세포를 제거하였다. 다시 미리 가열된 RPMI 배지를 디쉬 당 10 ㎖씩 넣고 60분간 배양하였다. 배양후 상기와 같은 방법으로 세척을 2회 반복하였다. 마지막 세척을 끝내고 RPMI-5%FBS 배지를 10 ㎖씩 넣고 18시간 내지 24시간 배양하였다. 배양후, 배지에 떠있는 부유세포들만을 수집하였다. 플레이트에 느슨하게 붙어있을 수지상 세포를 회수하기 위해 5 ㎖ RPMI-5%로 세척하였다. 이렇게 수집한 세포의 수를 세고, 107세포 당 10 ㎕의 CD90과 CD19가 부착된 자석입자 용액 (Microbeads: Miltenyi Biotech 제품 # 130-049-101 및 130-081-601)을 첨가하여 4℃에서 15분간 세포와 반응시킨 다음, 세포반응액을 LS 또는 MS 컬럼에 통과시켰다. 컬럼을 통과하여 나온 세포 중에서 CD11b-/CD8α+수지상 세포를 분리하기 위해서 상기와 동일한 비율로 CD8α자석 입자 용액 (Microbeads : Miltenyi Biotech 제품 #130-049-401)을 첨가하고 4℃에서 15분간 세포와 반응시키고 MS 컬럼을 통과시켰다. MS 컬럼에 선택되어 남아 있는 세포들을 1 ㎖의 MACS 용액 (2 mM EDTA, 2% FBS가 첨부된 냉장 PBS 용액)으로 분리하여 CD11b-/CD8α+수지상 세포를 수득하였다.
실시예 2: 분리된 CD11b - /CD8α + 수지상 세포에 γ-IFN 처리
상기 실시예 1에서 분리된 CD11b-/CD8α+수지상 세포를 10% FBS (Gibco/BRL 제품 # 26140-079)와 100 U/㎖의 γ-IFN (PharMingen 19301T)이 함유된 RPMI 1640(GibcoBRL 31800-022) 배지에 1x106세포/㎖ 정도 되게 부유시켜 24시간 동안 배양하였다.
실시예 3: NOD 마우스에서 당뇨 발증 유도
사이클로포스파미드 모노하이드레이트 (Sigma, C0768)를 생리 식염수에 최종농도 20 ㎎/㎖로 용해한 다음, 8 주령의 암컷 NOD 마우스 (분양처: 연세대학교 실험동물부)에 200 ㎎/㎏ 농도로 복강내로 1회 주사한 후 (1차), 2주 후에 동일한 방법으로 다시 주사하여 (2차) 당뇨 발증을 유도하였다 (Harada 및 Makino,Diabetologia, 27:604-606(1984); Yasunami 및 Bach,Eur. J. Immunol., 18:481-484(1988)).
실험 기간 중 체중 및 혈당량은 사이클로포스파미드 투여 전후 및 수지상 세포의 투여 전후 2-3일 간격으로 오전 10시에 측정하였다. 혈당은 헤파린을 처리한 모세관 (Chase, Rockwood, 미합중국, Cat#2501)을 이용하여 안와정맥총 (retinal vein)에서 채혈하여 혈당측정기 (Glucotrend, Boehringer Mannheim, Berlin, 독일국)를 사용하여 측정하였으며, 체중은 실험동물용 저울 (Mettler, 미합중국)을 사용하여 측정하였다.
실시예 4: 당뇨 발증된 NOD 마우스에 대한 수지상 세포의 치료 효과
실시예 4-1.수지상 세포 아군에 따른 치료 효과
상기 실시예 1에서 분리된 CD11b-/CD8α+수지상 세포 또는 다른 아군의 수지상 세포를 PBS로 2회 세척한 다음, PBS 400 ㎕ 당 2-3 x 105세포가 되도록 세포수를 조정하여 NOD 마우스의 복강 내에 주사하였다. 이어, 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 4주 동안 혈당의 변화를 측정하였고, 혈당치가 250 ㎎/㎗ 이하로 강하되어 2주 이상 지속적으로 유지될 때 당뇨 증상이 치료된 것으로 간주하였다 (참조: 도 2).
첨부 도 2에서 DM-NOD-cont는 당뇨 발증 후 수지상 세포를 주사하지 않은 NOD 마우스로서 네가티브 대조군이고, DM-NOD/DC-1, DM-NOD/DC-2 및 DM-NOD/DC-3은 상기 실시예 2와 같이 γ-IFN이 처리된 CD11b-/CD8α+수지상 세포로 각각 1회, 2회 및 3회 처리된 치료군이며, DR-NOD-con은 당뇨에 대해 내성을 갖는 NOD 마우스로서 포지티브 대조군이다. 수지상 세포의 누중 투여는 혈당량이 급격하게 증가되는 시점에서 이루어졌고, 별표 표시는 수지상 세포의 처리 시점을 나타낸다. 한편, d 표시는 마우스가 사망한 것을 나타낸다.
도 2를 참조하여 당뇨 치료 효과를 3 유형으로 설명하면 다음과 같다: 첫 번째 유형은 1회 투여만으로 혈당이 조절된 치료 군으로서 투여 직전 300 ㎎/㎗ 이상 되던 혈당이 투여 후 하루만에 조절되어 정상 대조군과 비슷한 200 ㎎/㎗ 이하로 떨어졌고, 이러한 혈당치는 4 주 이상 3 개월까지 한번도 혈당이 200 ㎎/㎗mg/dl 이상으로 상승하지 않고 지속적으로 정상 혈당을 유지하였으며, 이러한 치료유형이 치료군 중 가장 높은 빈도 (6/16, 38%)로 나타났다. 두 번째 유형은1차 투여 후 1-2 주정도 혈당이 조절되다가 다시 상승하는 군으로서, 추가적으로 2차 투여함으로써 혈당이 지속적으로 조절된 경우이며, 16 마리 중 4 마리 (25%)가 이러한 유형으로 혈당이 조절되었다. 세 번째 유형은 3차 누증 투여로 혈당이 조절된 군으로서, 1차 및 2차 투여 후 수일 동안 일시적으로 혈당이 조절되다가 다시 상승할 때 3차 투여하여 최종적으로 2주 이상 지속적으로 혈당이 조절되었고, 16 마리 중 2 마리가 이러한 형태의 치료효과를 보였다. 상기의 세 번째 유형과 같은 효과가 나타나는 것은 수지상 세포의 투여 시 이미 당뇨 상태가 많이 진행되어 췌도가 대부분 회복되지 못할 정도로 파괴되었기 때문으로 추측된다.
한편, 2차 투여 후 혈당이 조절되지 않은 개체 중 한 마리는 체중이 급격히 감소하면서 사망하였으며, 대부분의 대조군도 고혈당 상태가 지속될 경우 1-2주 내에 사망하였다. 그러나, γ-IFN이 처리된 CD11b-/CD8α+수지상 세포의 투여에 의해 혈당이 조절된 마우스의 경우에는 4주 이상 장기간 아무런 부작용이나 당뇨의 증상을 보이지 않았다.
상기한 실험 결과는 외부에서 주입한 CD11b-/CD8α+수지상 세포가 NOD의 췌장 베타세포를 파괴하는 자가반응성 T 세포를 장기적으로 조절하거나 효과적으로 제거할 수 있음을 나타낸다. 또한, 상기의 치료 효과가 일시적이 아니라 장기적으로 유지되기 때문에, 당뇨 발병 초기에 수지상 세포를 이용한 치료가 효과적으로 이루어 질 경우에는 더 이상의 췌도 베타세포의 파괴를 막아 75% 정도의 치료 효과를 기대할 수 있음을 나타낸다.
또한, 상기 실시예 1을 일부 변형하여 분리된 CD11b+/CD8α-수지상 세포 아군을 처리한 경우에는 6 마리 중 1 마리에서만 치료 효과가 관찰되었고, 치료된 1 마리의 경우는 수지상 세포의 분리 과정 중 CD11b-/CD8α+수지상 세포가 일부 섞여 들어가서 치료 효과를 보인 것으로 추측된다.
실시예 4-2.γ-IFN이 수지상 세포의 치료 효과에 미치는 영향
γ-IFN의 수지상 세포 치료 효과에 미치는 영향을 조사하기 위해, 상기 실시예 4-1에서 당뇨 치료 효과가 있는 것으로 확인된 CD11b-/CD8α+수지상 세포에 γ-IFN을 처리하지 않고 상기 실시예 3의 당뇨 발증 NOD 마우스에 상기 실시예 4-1과 동일한 방법으로 투여하였다. 실험 결과, 수지상 세포 투여군 중 한 마리에서도 치료 효과를 볼 수 없었으며 단지 6 마리 중 2 마리에서 수지상 세포 투여 후 1-2일 동안 일시적으로 혈당이 조절되는 것을 관찰되었으나, CD11b-/CD8α+수지상 세포를 누증 투여하여도 더 이상 혈당은 조절되지 않았고 치료 가능성도 볼 수 없었다.
본 실험 결과는 γ-IFN이 CD11b-/CD8α+수지상 세포의 당뇨 치료에 필수적임을 나타내는 것이다.
한편, γ-IFN의 중요성을 고려하여 상기 실시예 3의 NOD 마우스에 직접 γ-IFN을 마리 당 600 U로 투여하여 치료 가능성을 조사한 결과, 6 마리 중 한 마리에서만 일시적으로 치료 가능성을 보이다가 사망하였으며 나머지에서는 전혀 치료효과를 보이지 않았다. 이는 수지상 세포에 γ-IFN을 처리하여 나타나는 당뇨 치료 효과는 γ-IFN을 투여하여 얻을 수 있는 면역반응이 아니며, 상기 실시예 4-1에서 확인한 수지상 세포의 당뇨 치료 효과는 전신성이라기 보다는 국부적인 면역반응으로 나타나는 결과임을 나타낸다.
실시예 5: 수지상 세포에 의한 당뇨 치료의 조직병리학적 확인
실시예 5-1.췌도의 H&E 염색에 의한 확인
상기 실시예 3의 당뇨 초기 NOD 마우스에 상기 실시예 4-1과 동일한 방법으로 CD11b-/CD8α+수지상 세포를 마우스 당 2 x 105세포로 복강내에 주사하였고, 1 주 또는 4 주 후에 마우스를 척추 탈골하여 (decapitated) 안락사시키고 췌장을 적출하였다. 이어, 10% 중성 포르말린 용액에 24시간 동안 고정시키고, 알코올 탈수 및 파라핀 포매 과정을 거친 다음 조직 박절기 (Zeiss Super Cut 2050, Berlin, Germany)로 4 ㎛ 두께의 절편을 제작하였다. 그런 다음, 헤마톡실린 및 에오신 (H&E)으로 염색하고 (Shinomia 등,Clin. Exp. Immunol., 117:38-43(1999)) 광학현미경 (Nicon)으로 췌도염 (insulitis) 정도를 관찰하였다 (참조: 도 3).
첨부 도 3에서 a 패널 및 b 패널은 수지상 세포를 처리하지 않은 췌도이고, c 패널 내지 f 패널은 수지상 세포를 처리한 췌도이며, c 패널 및 d 패널, 그리고e 패널 및 f 패널은 수지상 세포를 처리한 마우스에서 4 주 후 분리한 췌도에 대한 것이다.
도 3에서 볼 수 있듯이, 수지상 세포를 처리하지 않은 대조군 NOD 마우스의 경우에는 당뇨 발증 후 초기 1 주일만에 췌도염 (insulitis)이 급격히 진전되어 베타세포 전부가 파괴되고 T 세포가 췌도 전체를 채우고 있는 모습 (diabetic score 4)을 나타내었다 (도 3의 a 및 b). 반면 수지상 세포로 치료된 군의 췌도 경우에는, 췌도 가장자리에 T 세포가 심하게 침윤 (infiltrated)된 형태가 발견되기는 하였으나 고혈당 상태의 대조군에 비해 췌도의 중심부가 정상적인 형태로 남아있는 모습 (diabetic score 2)이 상당 부분 관찰되었다 (도 3의 c 및 d). 또한, 도 3의 e와 f처럼 약간의 T 세포 침윤 흔적이 보일 뿐 더 이상 췌도염의 흔적을 볼 수 없었으며 (diabetic score 1 이하) T 세포 침윤으로 인한 췌도주위염 (periinsulitis)의 형태도 거의 관찰되지 않았다. 때때로 T 세포가 침윤되어 들어왔던 흔적이 보이기도 하나 대부분 그러한 흔적은 사라지고 정상적인 췌도의 모습을 나타내었다.
실시예 5-2.췌도의 인슐린 염색에 의한 확인
췌도의 인슐린 분비를 면역화학적으로 관찰하기 위해 적출한 췌장을 10% 중성 포르말린 용액에 24시간 고정한 다음, 알코올 탈수 및 파라핀 포매 과정을 거쳤다. 이어, 4 ㎛ 두께의 조직 절편을 제작하여 인슐린 분비세포 (췌도 베타 세포) 대하여 다음과 같이 아비딘-바이오틴 복합체 방법으로 췌도에 대한 면역조직화학적염색을 실시하였다: 조직 내의 내인성 과산화효소의 활성을 억제하기 위하여 메탄올에 과산화수소수를 1% 농도로 첨가한 용액으로 절편된 췌장 조직을 30분간 반응시키고, 인슐린에 대한 항체 (guinea pig anti-porcine insulin; Dako Co., Copenhagen, 덴마크국)를 1:400으로 희석하여 조직에 처리한 다음 4℃의 습윤 챔버에서 24시간 동안 반응시켰다. 2차 항체로 바이오틴이 결합된 항-기니아픽 항체 (biotinylated anti-guinea pig IgG; Vector, 미합중국)를 사용하였으며, 3차 반응은 효소가 결합된 아비딘 용액 (avidin-horseradish peroxidase; Vector, 미합중국)을 사용하였다. 각각의 염색 과정은 10% 정상 산양 혈청 (Sigma, S-2007)이 함유된 0.1 M의 PBS에서 진행하였다. 항원항체 반응 후 3,3'-디아미노벤지딘 (DAB, Sigma, D8001)을 증류수에 0.3 ㎎/㎖되게 용해시켜 첨가하고 발색 직전에 과산화수소수 0.003%를 처리하여 발색시킨 다음 광학현미경하에서 발색 과정을 관찰하면서 적절한 시기에 반응을 정지시켰으며, 면역조직화학적 염색 후에는 마이어스 헤마톡실린 용액으로 감별 염색한 뒤 탈수과정을 거쳐 현미경으로 관찰하고 사진촬영하였다 (참조: 도 4).
첨부 도 4에서 A 라인은 헤마톡실린-에오신 염색된 췌도이고, B 라인은 인슐린-면역조직화학적 염색된 췌도에 대한 것이다. 또한 a, b, e 및 f 패널은 수지상 세포로 처리되지 않은 췌도에 대한 것이고, c, d, g 및 h 패널은 ICR 마우스의 CD11b-/CD8α+수지상 세포로 처리된 췌도에 대한 것이다. 한편, b 및 f 패널은 초기 당뇨 시점에서 분리된 췌도에 대한 것이고, a, c, e 및 g 패널은 초기 당뇨증상 후 1 주일, d 및 h 패널은 4 주일 경과한 췌도에 대한 것이다.
도 4에서 볼 수 있듯이, 대조군 NOD 마우스 (수지상 세포가 투여되지 않음)의 경우에는 초기 당뇨 발증 후 1-2주 내에 소도는 췌도염으로 거의 모두 파괴되고 (참조: 도 4의 a), 인슐린 분비도 거의 관찰되지 않는 (참조: 도 4의 e) 당뇨 말기상태에 이른다. 그러나 수지상 세포로 치료된 NOD 마우스의 경우에는, 치료 1주일 경에 췌장의 동결박 편을 관찰하면 도 4의 c와 같이 소도의 일부가 파괴되지 않고 남아 있는 모습들이 많이 발견되며 이들 남은 소도들은 정상적으로 인슐린을 분비함을 관찰하였다 (참조: 도 4의 g). 한편 이들 치료군에서 치료 4주 후 췌장 소도를 관찰한 경우에는, 대부분 손상이 회복된 정상의 소도 모양을 관찰할 수 있었으며 (참조: 도 4의 d), 인슐린 분비도 정상적으로 회복되었음을 확인하였다 (참조: 도 4의 h).
실시예 6: CMTMR 염색 및
인 비보
에서 수지상 세포의 이동 위치 조사
CMTMR (Molecular Probe 제품#c-2926)을 10 mM로 용해한 후 사용직전 혈청 및 다른 보조물이 전혀 들어있지 않은 RPMI 1640 배지로 최종 농도가 2 μM되게 희석하여 ICR 마우스의 γ-IFN으로 처리된 CD11b-/CD8α+수지상 세포의 염색에 사용하였다. 염색시 106세포당 100 ㎕의 CMTMR 용액을 사용하여 37℃에서 15분간 반응시키고 세포를 2회 세척하였다. 이어, 세포를 다시 새로운 RPMI 배지에 부유시킨 후 37℃에서 30분간 방치하여 세포내로 침투한 CMTMR이 세포막을 다시 투과하여나갈 수 없는 물질로 전환시켰다. 그런 다음, CMTMR로 염색된 CD11b-/CD8α+수지상 세포 3 x 105개의 세포를 PBS 400 ㎕에 부유하여 NOD 마우스 복강내에 주사한 후 48시간에 마우스를 도살하여 췌장을 적출하고 조직동결배지 (Tissue freezing media: Jung, Nussloch, 독일국, Cat# 0201 08926)로 냉동하여 냉동절편기 (Cryostat, Leica CM1510-3, Lusslooh, 독일국)로 5 ㎛ 두께의 조직 절편을 제작하여 직접 콘포칼 현미경 (Bio-Rad MRC 1024ES, Hercules, 미합중국)으로 관찰하였다 (참조: 도 5).
첨부 도 5에서, DLN은 이격의 임파절, PI는 췌도의 주연부, SP는 비장, PLN은 췌장 임파절 그리고 Thy는 흉선 조직에 각각 해당하는 동결 박편의 단위 면적당 형광의 정도를 나타내는 사진이다. 도 5에서 볼 수 있듯이, NOD 마우스에 복강 투여된 CD11b-/CD8α+수지상 세포는 췌장 임파절에 가장 많이 위치하고 다음으로 비장, 흉선, 췌도 그리고 복강에서 멀리 떨어진 임파절의 순으로 이동하는 것을 확인하였다. 이러한 수지상 세포의 생체 내에서의 이동형태는 NOD 마우스에서 수지상 세포에 의한 당뇨 치료 효과는 수지상 세포의 이동과 밀접한 관계가 있음을 강하게 시사해준다.
실시예 7: 췌장 임파절에서 췌도항원-특이 세포의 배양 및 배양액에서 사이토카 인의 발현 측정
상기 실시예 4에서 ICR 마우스의 γ-IFN으로 처리된 CD11b-/CD8α+수지상 세포의 투여에 의해 당뇨가 치료된 NOD 마우스의 치료 후 췌도 베타세포에 대한 자가면역반응의 변화를 관찰하기 위해 다음과 같이 실험을 실시하였다:
7-1.췌도항원-특이 임파절 세포의 증식 및 췌도 분리
ICR 마우스의 γ-IFN으로 처리된 CD11b-/CD8α+수지상 세포 3 x 105개를 투여한 초기 당뇨의 NOD 마우스와 수지상 세포를 투여하지 않은 정상 마우스에서 각각 췌장을 적출하여 임파절을 분리하고 임파절 세포를 얻은 다음, 5%의 소태아 혈청이 첨가된 DMEM 배지에 부유한 후 플레이트에 웰당 5 x 105세포가 들어가도록 분주하였다. 한편, 별도로 NOD 마우스의 췌도를 적출하고 베타세포를 분리하여 초음파 분쇄기로 파쇄한 다음, 상기 임파절 세포가 든 각 웰에 2.5 x 104또는 5 x 104세포 분량의 파쇄물 (CEQ; cells of equivalent)을 췌도 항원 (islet antigen)으로 첨가하고 96시간 동안 배양하면서 상청액에 분비된 γ-IFN (Th1 면역반응의 지표로서의 사이토카인) 및 IL-4 (Th2 면역반응의 지표로서의 사이토카인)의 생성량을 샌드위치-ELISA 방법으로 하기 실시예 7-2와 같이 측정하였다.
상기 췌도는 다음과 같이 분리하였다: 우선, NOD 마우스에 체중 100 g 당 1 ㎖의 20% 우레한 (Urehane)을 복강 투여하여 마취시킨 다음, 복강을 절개하고 췌장에 콜라겐나아제 P를 주입한 후 일정시간이 경과한 다음에 췌장을 적출하였다.이어, 췌장을 37℃에서 상태에 따라 10여분 방치한 후 분해된 췌장에서 흘러나온 세포들을 수집하였다. 상기 세포들을 PBS로 2차례 원심분리로 세척한 다음 비중 1.086의 파이콜 (Ficoll)로 균일하게 부유시키고 용액 상층에 비중 1.076의 파이콜 4 ㎖ 및 비중 1.053의 파이콜 2 ㎖을 차례로 조심스럽게 채웠다. 이어, 4℃ 800 g에서 10분간 원심분리하여 비중 1.076 및 비중 1.053 사이에 모인 췌도 (islet)를 조심스럽게 수거하고 PBS로 2회 세척한 다음 37℃ CO2배양기에서 하루동안 배양하고 다음날 현미경하에서 췌도를 수획하였다.
7-2.ELISA에 의한 사이토카인의 정량
IL-4 및 γ-IFN의 생성은 Endogen (Woburn, MA. 미합중국)에서 제공하는 시약과 재료 (Matched Antibody Pairs)를 이용하여 샌드위치-ELISA 방법으로 다음과 같이 측정하였다: 우선, 96 웰 둥근 저부 플레이트를 100 ㎕ (2 ㎍/㎖)의 코팅 항체 (Endogen, 미합중국)로 10-14시간 실온에서 코팅한 다음, 웰을 세척하였다. 이어, 200 ㎕의 분석완충액 (PBS with 4% BSA, pH 7.2-7.4)을 첨가하고 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 그런 다음, 세 번 세척한 후 일정 비율로 희석한 시료와 표준 용액을 50 ㎕씩 이중으로 1시간 동안 반응시키고 50 ㎕ (250 ㎍/㎖)의 바이오틴-표지 2차 항체를 첨가하여 1-2시간 동안 반응시켰다. 그리고 나서, 웰을 세척한 다음, 1:12,000의 비율로 희석한 HRP-결합 스트렙타비딘 (Endogen, 미합중국) 100 ㎕를 첨가하고 어두운 곳에서 30분 동안 반응시켰다. 이어, 세척용 완충액으로 세척한 다음, TMB 기질 (Sigma, T-3405)을 이용하여 30분간 반응시키고 2 M의 황산을 첨가해 반응을 종료하였다. 그런 다음, 570 nm에서 OD를 측정하여 표준 용액을 기준으로 계산하여 발현된 양을 결정하였다 (참조: 도 6a 및 6b).
첨부 도 6a는 수지상 세포를 처리하지 않은 상기 실시예 3의 초기 당뇨 발증을 나타내는 마우스로부터 분리된 임파절 세포에 대한 실험이고, 도 6b는 수지상 세포에 의해 당뇨가 치료된 마우스로부터 분리된 임파절 세포에 대한 실험이다. 도 6a에서 확인할 수 있듯이, 수지상 세포를 처리하지 않은 대조군의 경우에는 췌도 항원 존재 하에서 임파절 세포의 배양 시 γ-IFN 발현만 관찰되고 IL-4는 거의 발현되지 않았다. 한편, 도 6b에서 확인할 수 있듯이, 수지상 세포의 투여에 의해 당뇨가 치료된 NOD 마우스의 경우 추출한 췌장 임파절 세포 배양에서 췌도 항원의 농도에 비례하여 γ-IFN 뿐만 아니라 IL-4의 발현도 크게 증가함을 나타내었다.
상기 실험 결과는 수지상 세포의 처리에 의해 당뇨 초기 Th1 형의 자가면역반응성 T 세포 중 상당수가 Th2 형으로 전환되었거나 또는 새로이 췌도 항원 특이적인 Th2 형이 발생하여 자가면역반응성 T 세포의 활성을 억제함으로써 췌도염의 진전을 막아 당뇨 증상이 치료되었을 가능성을 보여준다.
실시예 8: 전자현미경을 이용한 CD11b
-
/CD8α
+
수지상 세포의 형태 관찰
상기 실시예 1과 동일한 방법으로 ICR 마우스로부터 CD11b-/CD8α+수지상 세포를 분리하여 PBS로 세척한 다음, 2% 파라포름알데히드와 2.5% 글루타르알데히드혼합액 (4℃, pH 7.2)으로 2시간 동안 전고정 (pre-fixation) 하고 0.1 M PBS로 3회 세척하였다. 이어, 동일 완충용액과 1:1로 혼합한 1% OsO4(4℃, pH 7.2)로 1시간 후고정 (post-fixation) 하였다. 고정이 끝난 실험재료를 동일 완충용액을 사용하여 충분히 세척하고, 에탄올로 농도를 증가시키면서 (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 무수Ⅰ, 무수Ⅱ) 탈수하였다. 탈수가 끝난 시료는 프로필렌 옥시드로 치환하여 투명화 (clearing)시킨 후, 에폰-아랄다이트 (Epon-Araldite) 혼합액 (Poly/Bed 812 Embedding Media, Polysciences Inc.)으로 포매하여 60℃에서 28시간 동안 열중합시켰다.
포매된 조직은 울트라마이크로톰 (LKB-Ⅴ)을 이용하여 먼저 준초박절편 (semithin section)으로 제작한 다음, 1% 보락스에 용해된 1% 톨루이딘 블루로 핫 플레이트 (60℃) 상에서 염색하고, 광학현미경으로 관찰하였다. 이어, 초박절편 (thin section)을 제작하여 니켈 그리드에 부착시킨 다음, 우라닐 아세테이트와 리드 시트레이트로 이중 염색하여 JEM 100 CX-II형 (JEOL Co., 일본국) 투과전자현미경으로 80 kV에서 관찰 및 촬영하였다 (참조: 도 7).
첨부 도 7에서, A 패널은 γ-IFN이 처리되지 않은 CD11b-/CD8α+수지상 세포에 대한 것이고, B 패널은 γ-IFN이 처리된 CD11b-/CD8α+수지상 세포에 대한 것이다. 도 7에서 확인할 수 있듯이, γ-IFN이 처리되지 않은 세포의 경우에는 처음 분리되었을 때와 동일하게 소포체가 잘 발달되어 있으며 핵막과 염색체의 구조가 분명하게 관찰되었으나, γ-IFN을 처리한 세포의 경우에는 소포체의 구조가 사라지고 형질구 (plasmasytoid)의 형태도 현저히 바뀌며 핵막의 구분이 희미해지고 염색체도 풀리어 사라지는 모습을 나타내며 더욱이 세포막은 수지상의 돌기가 많이 나타나는 형태학적 소견을 보였다. 상기한 형태적 변화는 일반적으로 성숙된 수지상 세포에 나타나는 현상으로서, γ-IFN 처리로 미성숙 단계의 임파성 수지상 세포가 기원은 다르지만 활성화된 골수성 수지상 세포처럼 성숙된 수지상 세포의 형태로 분화됨을 보여주는 것이다.
실시예 9: CD11b
-
/CD8α
+
수지상 세포의 표면 단백질 발현 조사
ICR 마우스의 비장으로부터 분리 된 CD11b-/CD8α+수지상 세포 각각을 PE, FITC 등의 형광물질로 표지된 단일클론 항체 (Pharmingen)를 사용하여 다음과 같이 염색한 후 분석하였다: 우선, 세포를 각각 2 x 104세포씩 유세포 분석용 용기 (Falcon 2052: Becton Dickinson)에 분주하고, 유세포 분석 용액 (BSA가 최종농도 0.2%로 첨가된 냉장 PBS 용액) 3 ㎖을 첨가하여 원심분리하였다. 원심분리한 후 200 ㎕의 유세포 분석 용액으로 세포를 잘 부유하고 4 ㎕의 형광물질이 표지된 단일클론 항체들을 넣고 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. 그런 다음, 유세포 분석 용액 3 ㎖을 넣고 세포를 다시 원심분리하여 여분의 항체들을 제거하였다. 원심분리 후 200 ㎕의 유세포 분석 용액 에 세포를 잘 혼합하고 유세포 형광 분석기 (FACScalibur flow cytometer; Becton Dickinson)와 유세포 분석 프로그램 (CellQuest software)을 사용하여 세포의 형광 표지 정도를 분석하였다 (참조: 도8).
도 8 에서 확인할 수 있듯이, 분리 된 수지상 세포는 T 세포, B 세포 및 단핵세포의 대표적인 표지 단백질인 CD3, CD19, CD14 등으로는 거의 염색되지 않았다. 이러한 결과는 상기 실시예 1에서 분리한 세포가 임파구 또는 단핵구가 아닌 수지상 세포임을 보여주는 것이다. 활성화된 항원제시세포들의 표면에서 과량 발현되는 B7 분자 (CD86)도 거의 발현되지 않은 것으로 보아 아직 미성숙단계의 수지상 세포 아군임을 보여준다.
실시예 10: 정상인의 혈액에서 CD11c
-
수지상 세포의 분리
마우스의 CD11b-/CD8α+수지상 세포아군은 사람에서는 나타나지 않는 표현형이다. 이에, 본 발명자들은 CD11b-/CD8α+수지상 세포에 대응되는 사람의 수지상 세포를 다음과 같은 근거에 기초하여 CD11c-수지상 세포로 판단하였다: 도 9는 CD11c-수지상 세포의 전자현미경적 형태를 종래의 문헌 (J. Immunol.163:3250-3259(1999))에서 발췌한 것으로서, 소포체 (endoplasmic reticulum; ER)의 발달, 분명한 핵막 및 염색체의 형태 등의 전자현미경적 소견이 CD11b-/CD8α+수지상 세포 (참조: 도 7의 A)와 매우 유사하다. 또한, CD11c-수지상 세포가 임파성 수지상 세포로서 면역 조절 및 면역 관용에 관여할 가능성을 보인 연구 결과(O'Doherty 등,Immunology82:487-93(1994))도 본 발명자들의 결론을 뒷받침하는 것이다.
결국, 상술한 사실에 기초하여 본 발명자들은 사람의 혈액에서 CD11c-수지상 세포를 다음과 같이 분리하였다:
MACS사의 혈액 수지상 세포 분리 키트 (Miltenyi Biotec 제품# 468-01)에서 제시하는 방법을 변형하여 다음과 같이 사람의 혈액에서 CD11c-수지상 세포를 분리하였다: 우선, 정상인의 혈액을 류카페레시스 (leukapheresis)하여 얻은 백혈구 농축액을 PBS 용액으로 3배 희석한 다음, 30 ㎖ 당 10 ㎖의 파이콜-하이파크 (Hypaque)를 용기 바닥에 첨가하고 2000 g로 30분 동안 상온에서 원심분리하여 중간층에 모이는 세포층을 수획하였다. 이어, 수획한 세포들을 PBS 용액으로 3 번 연속적으로 세척하였고, 이 과정에서 원심분리 속도는 1600 g, 1200 g 및 900 g로 순차적으로 낮추어가며 5분간씩 진행하였다. 이렇게 분리된 PBMC (peripheral blood mononuclear cells)의 세포수를 측정한 뒤 각 2.5-3 x 108개의 PBMC로부터 다음과 같은 방법으로 CD11c-수지상 세포를 분리하였다.
우선, 상기 분리된 2.5-3 x 108개의 PBMC를 20 ㎖의 MACS 용액 (2 mM EDTA, 0.5% BSA가 첨부된 냉장 PBS용액)으로 세척하였다. 이어, 전체 부피가 1.2 ㎖가 되도록 MACS 용액으로 조정하고 세포들을 균일하게 잘 혼합한 다음, 혈액 수지상 세포 분리 키트 (Miltenyi Biotec 제품# 468-01)에서 제공하는 FcR 블록킹 용액0.4 ㎖과 햅텐-Ab 캇테일을 0.4 ㎖ 넣어 냉장 상태에서 20분 동안 반응시켰다. 그런 다음, 40 ㎖의 MACS 용액으로 두 번 세척하고 원심분리를 실시하였으며, 원심분리 시마다 세포 상등액을 음압을 사용하여 최대한으로 제거하였다. 그리고 나서, 전체 부피가 3.6 ㎖이 되도록 세포들에 MACS 용액을 첨가하고 세포를 균일하게 잘 혼합한 다음, MACS 항-햅텐 자석 구슬 용액 0.4 ㎖과 잘 혼합하여 냉장 상태에서 20분 동안 반응시켰다. 별도로, 냉장 상태의 CS 컬럼 (Miltenyi Biotec 제품#130-041-305)을 자성 분리대 (VarioMACS: Miltenyi Biotec 제품# 130-090-282)에 고정하고 60 ㎖의 MACS 용액으로 컬럼을 세척하였다.
상기 반응이 끝난 2 ㎖의 세포 용액을 상기 CS 컬럼에 통과시키고 30 ㎖의 MACS 용액으로 세척한 다음, 컬럼에 부착되지 않고 빠져나온 세포들을 수거하였다. 이어, 세포수를 측정하고 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 그런 다음, 107개 세포당 70 ㎕되게 MACS 용액으로 잘 혼합하고 15 ㎍의 CD11c 항체 (1㎍/㎕: BD제품# 30480D) 및 70 ㎕의 CD14 항체를 넣고 냉장 상태에서 20분 동안 반응시켰다. 그리고 나서, 3 ㎖의 MACS 용액으로 두 번 세척하고 원심분리를 실시하였으며, 원심분리 시마다 세포 상등액을 최대한 제거하였다. 이어, 전체 부피가 70 ㎕이 되도록 세포들을 MACS 용액으로 균일하게 혼합한 후 마우스 IgG 특이적 항체가 부착된 자석 구슬용액 (Goat Anti-Mouse IgG MicroBeads: Miltenyi Biotec 제품# 130-048-401) 30 ㎕와 혼합하여 15분 동안 4-6℃에서 반응시켰다. 그런 다음, 3 ㎖의 MACS 용액을 넣고 원심분리하여 세포에 붙지 않은 남은 자석 구슬을 가급적 완전히 제거하였다.
이어, 세포들을 0.5 ㎖의 MACS 용액에 잘 혼합한 후 MS 컬럼에 통과시켜 자성 표지된 세포들을 제거하였다. 컬럼을 0.5 ㎖의 MACS 용액으로 3번 세척한 후 자성 표지되지 않은 세포들을 원심분리하여 수거하였다. 전체 부피가 0.2 ㎖이 되도록 MACS 용액으로 조정하고 원심분리된 세포들을 잘 혼합한 다음, 혈액 수지상 세포 분리 키트 (Miltenyi Biotec 제품# 468-01)에서 제공하는 CD4 자석 구슬 용액 0.2 ㎖과 혼합하여 냉장 상태에서 30분 동안 반응시켰다. 이어, 8 ㎖의 MACS 용액을 넣고 원심분리하여 세포에 붙지 아니한 남은 자석 구슬을 가급적 완전히 제거한 다음, 세포들을 0.5 ㎖의 MACS 용액에 잘 혼합한 후 MS 컬럼에 통과시켜 자성 표지되지 않은 세포들을 제거하였다. 그런 다음, 컬럼을 0.5 ㎖의 MACS 용액으로 3번 세척하고, 컬럼에 부착된 세포들을 선택적으로 수거하기 위하여 컬럼을 자성 분리대 (VarioMACS:Miltenyi Biotec 제품# 130-090-282)로부터 분리하였다. 그리고 나서, 상기 컬럼을 15 ㎖ 원심분리 용기 위에 올려놓고 1 ㎖의 MACS 용액을 첨가한 다음, 주사기 밀대로 살짝 압력을 가하여 컬럼내에 남아있는 세포들을 원심분리 용기에 수거하였다. 이렇게 자성으로 선택된 세포들을 다시 MS 컬럼 (Miltenyi Biotec 제품# 130-042-201)에 통과시켜 자성 표지되지 않은 다른 세포들을 한 번 더 제거하였다. 이어, 0.5 ㎖의 MACS 용액으로 세 번 세척한 뒤 상술한 바와 동일한 방법으로 MS 컬럼에 선택되어 남아 있는 세포들을 1 ㎖의 MACS 용액으로 분리하였다. 최종적으로, 원심분리로 세포를 수집하고, 유세포 형광측정 방법에 의해 CD11c-수지상 세포의 분리 순도를 확인하였다.
실시예 11: 제 1 형 당뇨병 환자에 대한 수지상 세포의 치료 효과
상기 실시예 10에서 분리된 CD11c-수지상 세포를 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 γ-인터페론으로 처리한다. 이어, CD11c-수지상 세포의 배양물을 원심분리기로 침전시킨 다음, 상등액을 버리고 생리식염수를 첨가한다. 그런 다음, 제 1 형 당뇨병 환자의 복강내에 주사한다. 그리고 나서, 혈당량의 변화를 측정하여 당뇨 증상의 치료 효과를 확인한다.
실시예 12: 콜라겐으로 유발한 류마티스 관절염 모델 마우스에서 수지상 세포의 치료 효과
실시예 12-1.DBA/1 마우스에서 콜라겐으로 류마티스 관절염의 유발
5-6 주령의 수컷 DBA/1 마우스 (Jackson Laboratory, 미합중국)를 이용한다. 소 제 Ⅱ 형 콜라겐 (Sigma, 미합중국)을 0.05 M 아세트산 용액에 최종 농도 2 ㎎/㎖이 되도록 첨가한 다음, 교반기를 사용하여 4℃에서 하룻밤 동안 흔들어 용해한다. 용해한 콜라겐을 동일 용량의 완전 프룬드 아쥬번트 (complete Freund's adjuvant: CFA)에 혼합하고, 마우스 당 100 ㎍을 꼬리 시작 부위에 피내주사한다. 3주 후 100 ㎍의 콜라겐을 동일 용량의 불완전 프로이드 아쥬번트 (incomplete Freund's adjuvant: IFA)에 용해하여 동일 부위에 주사한다. 최초 투여 후 4주에40 ㎍의 LPS를 복강내로 투여하여 관절염 발증을 동기화시킨다 (참조: SH Kim, et al.,J. Immuonl., 166:3499-3505(2001)).
실시예 12-2.수지상 세포 아군의 관절염 치료 효과 확인
상기 실시예 1과 동일한 방법으로 정상의 DBA/1 마우스의 비장으로부터 CD11b-/CD8α+수지상 세포를 분리하고, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 γ-인터페론으로 처리한 다음, 상기 실시예 12-1의 마우스의 다리의 관절내에 투여하여 관절염 치료 효과를 확인한다.
관절염의 중등도 평가는 아래와 같은 방법으로 점수화하여 평가함으로써 수지상 세포의 치료 효과를 검증한다 (SH Kim, et al.,J. Immuonl., 166:3499-3505( 2001)): 중등도 0: 부종이나 종창이 없는 경우; 중등도 1: 족근골이나 발목 관절에 국한된 경한 부종과 발적; 중등도 2: 발목 관절에서 족근골에 걸친 경한 부종과 발적; 중등도 3: 발목 관절에서 중족골에 걸친 중등도의 부종과 발적; 및, 중등도 4: 발목에서 발가락 전체에 걸친 심한 부종과 발적, 특히 발목 및 발가락의 기형과 강직이 발생한 경우.
평균 관절염 지수 (Mean arthritis index) = 전체 마우스의 4 다리의 중등도의 합/전체 마우스의 수
관절염이 생긴 다리의 평균 다리수 (%) = 중등도 2 이상의 관절염을 가진 다리의 수/전체 다리의 수 x 100
부종도 = 전체 마우스의 4 다리의 두께의 합/전체 마우스의 수
실시예 12-3.치료 효과의 조직학적 검사
상기 실시예 12-2에서 CD11b-/CD8α+수지상 세포가 투여된 마우스의 발 관절을 신선하게 분리하여 10% 중성 포르말린 용액에 24시간 고정한 다음, 15% EDTA와 30% 글리세린이 포함된 용액으로 탈칼슘 (decalcification) 시키고, 일반적인 알코올 탈수 및 파라핀 포매 과정을 거친 후 5 ㎛ 두께로 박절하여 헤마톡실린과 에오신 (H&E) 으로 염색하여 골부식도와 단핵구 침윤정도를 관찰하여 치료 정도를 평가한다 (참조: SH Kim, et al.,J. Immuonl., 166:3499-3505, (2001)).
실시예 13: 류마티스 관절염 환자에 대한 수지상 세포의 치료 효과
상기 실시예 10에서 분리된 CD11c-수지상 세포를 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 γ-인터페론으로 처리한다. 이어, CD11c-수지상 세포의 배양물을 원심분리기로 침전시킨 다음, 상등액을 버리고 생리식염수를 첨가한다. 그런 다음, 류마티스 관절염 환자의 관절내에 주사한다. 그리고 나서, 관절염의 치료 효과를 확인한다.
본 발명은 자가면역 질환의 치료용 약제학적 조성물을 제공한다. 또한, 본발명은 자가면역 질환의 치료방법을 제공한다. 본 발명의 약제학적 조성물 및 치료방법은 제 1 형 당뇨병 및 류마티스성 관절염과 같은 다양한 자가면역 질환의 치료에 이용될 수 있다.
Claims (16)
- 자가면역 T 세포에 의한 조직세포의 파괴를 억제하는 면역학적 효과를 갖으며 γ-인터페론으로 전처리된 수지상 세포의 치료학적 유효량; 및약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 자가면역 질환의 치료용 약제학적 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 제 1 형 당뇨병인 것을 특징으로 하는 자가면역 질환의 치료용 약제학적 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 류마티스성 관절염인 것을 특징으로 하는 자가면역 질환의 치료용 약제학적 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 수지상 세포는 CD11b-/CD8α+수지상 세포인 것을 특징으로 하는 자가면역 질환의 치료용 약제학적 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 수지상 세포는 CD11c-수지상 세포인 것을 특징으로 하는 자가면역 질환의 치료용 약제학적 조성물.
- 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수지상 세포는 50-200 U/㎖의 γ-인터페론으로 전처리된 것임을 특징으로 하는 자가면역 질환의 치료용 약제학적 조성물.
- 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수지상 세포는 임파성 수지상 세포인 것을 특징으로 하는 자가면역 질환의 치료용 약제학적 조성물.
- 자가면역 T 세포에 의한 조직세포의 파괴를 억제하는 면역학적 효과를 갖는 수지상 세포에 γ-인터페론을 전처리하는 단계; 및상기 전처리된 수지상 세포의 치료학적 유효량과 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 자가면역 질환의 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는 자가면역 질환의 치료방법.
- 제 8 항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 제 1 형 당뇨병인 것을 특징으로 하는 자가면역 질환의 치료방법.
- 제 8 항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 류마티스성 관절염인 것을 특징으로 하는 자가면역 질환의 치료방법.
- 제 8 항에 있어서, 상기 수지상 세포는 CD11b-/CD8α+수지상 세포인 것을 특징으로 하는 자가면역 질환의 치료방법.
- 제 8 항에 있어서, 상기 수지상 세포는 CD11c-수지상 세포인 것을 특징으로 하는 자가면역 질환의 치료방법.
- 제 8 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수지상 세포는 50-200U/㎖의 γ-인터페론으로 전처리된 것임을 특징으로 하는 자가면역 질환의 치료방법.
- 제 8 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수지상 세포는 임파성 수지상 세포인 것을 특징으로 하는 자가면역 질환의 치료방법.
- 제 9 항에 있어서, 상기 제 1 형 당뇨병은 단계 Ⅱ 내지 단계 Ⅴ 중 어느 한 단계의 상태인 것을 특징으로 하는 자가면역 질환의 치료방법.
- 제 9 항에 있어서, 상기 투여하는 단계는 복강 주입으로 실시됨을 특징으로 하는 자가면역 질환의 치료방법.
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