DE60027364T2

DE60027364T2 - Adenovirus-mutanten mit deletiertem proteasegen, komplementierende zelllinien und entsprechende vektoren für den gentransfer

Info

Publication number: DE60027364T2
Application number: DE60027364T
Authority: DE
Inventors: Bernard Laval MASSIE; Wahiba Montreal QUALIKENE
Original assignee: National Research Council of Canada
Current assignee: National Research Council of Canada
Priority date: 1999-02-25
Filing date: 2000-02-24
Publication date: 2007-05-10
Anticipated expiration: 2020-02-25
Also published as: ATE323775T1; EP1291434A3; DE60027364D1; US6291226B1; CA2322222A1; WO2000050619A1; EP1073760A1; EP1291434A2; US6620618B2; CA2322222C; US20010026938A1; EP1073760B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Gentherapie, insbesondere rekombinante Adenovirus-Vektoren, die sich zum Gentransfer und zur Proteinerzeugung eignen, für Anwendungen auf dem Gebiet der Gentherapie, der funktionellen Genomik und der Impfung, sowie die Komplementierung von Zelllinien zur Erzeugung und Vermehrung von derartigen Vektoren. Insbesondere betrifft die Erfindung Adenovirus-Mutanten, bei denen zumindest das Gen für die Adenovirus-protease deletiert ist, die Komplementierung von die Protease exprimierenden Zellinien und die entsprechenden Gentransfer-Vektoren.
Hintergrund der Erfindung
Unter dem Ausdruck "Gentherapie" ist üblicherweise das Verfahren zu verstehen, bei dem ein Gen in die somatischen Zellen eines Individuums mit dem Ziel zu dessen Expression in den Zellen eingeführt wird, um eine gewisse therapeutische Wirkung hervorzurufen. Ursprünglich wurde dieses Prinzip auf Fälle angewandt, bei denen eine zusätzliche normale Kopie eines defekten Gens bereitgestellt wurde, um die Synthese eines fehlenden Proteins, z.B. eines Enzyms, wieder herzustellen. Das Konzept der Gentherapie wurde seitdem auf verschiedene andere Möglichkeiten ausgedehnt. Insbesondere kann das übertragene Gen (Transgen) für ein Protein kodieren, das nicht notwendigerweise fehlt, sondern das von therapeutischem Nutzen sein kann und exogen schwierig zu verabreichen sein kann, z.B. IL-2 oder Antitumor-Cytokine. Ziel dieser Form von Gentherapie ist es, die in vivo-Erzeugung von potentiell therapeutischen Proteinen zu verstärken. Dieser Weg ist ähnlich einer Genvakzination, bei der das übertragene Gen in Zellen eingeführt wird, um ein Protein zu exprimieren, das als Antigen wirkt, das eine schützende Immunreaktion des Immunsystems des Wirts induziert. Eine weitere Form der Gentherapie beinhaltet die Übertragung von nicht-physiologischen Sequenzen, die eine antivirale Aktivität besitzen, z.B. von Antisense-Oligonucleotiden oder -Sequenzen, in Zellen. Schließlich können so genannte Suizidgene in unerwünschte Zellen (Krebszellen oder infizierte Zellen) übertragen werden, um sie gegenüber speziellen Substanzen zu sensibilisieren. Wenn diese Substanzen anschließend verabreicht werden, lösen sie eine selektive Zerstörung der Zielzellen aus.
Genabgabesysteme, die das erwünschte Gen in die Zielzellen übertragen, basieren auf physikochemischen oder auf biologischen Methoden. In jedem Fall kann das erwünschte Gen in die Zellen übertragen werden, entweder in vitro, indem man Zellen aus einem Organ extrahiert und die transfizierten Zellen in vitro wieder in das gleiche Organ oder den gleichen Organismus einführt, oder in vivo, d.h. direkt in ein geeignetes Gewebe. Bekannte physikochemische Methoden der Transfektion umfassen beispielsweise eine Genpistole (Biolistik), in situ-Injektionen von nackter DNA, Komplexe von DNA mit DEAE-Dextran oder mit Kernproteinen, liposomale DNA-Präparationen und dergl. Biologische Methoden, die im Vergleich zu physikochemischen Methoden als eine zuverlässigere Alternative gelten, stützen sich auf infektiöse Mittel als Gentransfer-Vektoren. Bei dieser Gruppe von Methoden stellen Viren infektiöse Mittel der Wahl dar, und zwar aufgrund ihrer naturgegebenen Fähigkeit zur Infektion verschiedener Zellen. Die Übertragung eines fremden Gens durch einen viralen Vektor ist als Transduktion des Gens bekannt.
Verschiedene Virusklassen wurden in Bezug auf ihre Verwendung als Gentransfer-Vektoren getestet, einschließlich Retroviren (RSV, HMS, MMS und dergl.), Herpesviren (z.B. HSV), Pockenviren (Vakzinia-Virus), Adenoviren (Ad, hauptsächlich abgeleitet von Typ 5 und 2 Ad) und adenoverbundene Viren (AAV). Von diesen reiht man Vektoren auf der Basis von Adenoviren derzeit unter die vielversprechendsten viralen Vektoren ein, und zwar aufgrund der folgenden Eigenschaften, von denen einige nur bei dieser Gruppe von Vektoren auftreten: (i) Adenovirus-Vektoren benötigen keine Zellproliferation für die Expression von Adenovirus-Proteinen (d.h. sie wirken auch in Zellen in der Ruhephase); (ii) Adenovirus-Vektoren integrieren ihre DNA nicht in die Chromosomen der Zelle, so dass ihre Wirkung nicht dauerhaft ist und es unwahrscheinlich ist, dass sie die normalen Funktionen der Zelle stören; (iii) Adenovirus-Vektoren können Zellen, die sich nicht teilen, oder endgültig differenzierte Zellen infizieren, so dass sie auf einen breiten Bereich von Wirtszellen anwendbar sind; (iv) Adenovirus-Vektoren zeigen einen Transduktionswirkungsgrad von nahezu 100% bei einer Vielzahl von gezüchteten tierischen Zellen und in vivo bei mehreren Organen verschiedener Spezies; (v) Adenovirus-Vektoren besitzen üblicherweise die Fähigkeit zur Replikation unter Erzielung eines hohen Titers, ein Merkmal, das für die Zubereitung von Vektor-Vorratsprodukten, die sich zur Erzielung einer wirksamen in vivo-Transduktion eignen, wichtig ist; (vi) Adenovirus-Vektoren können große Inserts von exogener DNA aufnehmen (sie besitzen eine hohe Klonierungskapazität); (vii) Rekombinationsereignisse sind bei Adenovirus-Vektoren selten; (viii) es gibt keine bekannten Verbindungen zwischen humanen malignen Erkrankungen oder anderen ernsthaften Gesundheitsproblemen mit Adenovirus-Infektionen; (Adenovirus-Typ 5 ist ursprünglich als Verursacher von Erkältungszuständen bei Menschen bekannt; lebendes Adenovirus dieses Typs, das die Fähigkeit zur Replikation besitzt, wurde in sicherer Weise als humaner Impfstoff verwendet (Top et al., J. I. D., Bd. 124 (1971), S. 148–154; J. I. D., Bd. 124 (1971), S. 155–160).
Strukturell handelt es sich bei Adenoviren um Viren ohne Hülle, die aus einem äußeren Capsid und einem inneren Kern bestehen. Mehr als 40 Adenovirus-Subtypen wurden beim Menschen isoliert und mehr als 50 zusätzliche Subtypen wurden von anderen Säugetieren und Vögeln isoliert. Sämtliche Adenoviren sind morphologisch und strukturell ähnlich, wenngleich sie sich auch in Bezug auf einige Eigenschaften unterscheiden. Subtypen von humanen Adenoviren werden entsprechend ihrer serologischen Reaktion auf eine Infektion bezeichnet. Darunter wurden die Serotypen Ad2 und Ad5 am eingehendsten untersucht und seit den 80er Jahren für Gentransfer-Zwecke verwendet. Genetisch handelt es sich bei Adenovirus um ein doppelsträngiges DNA-Virus mit einem linearen Genom von etwa 36 kb. Das Genom wird in frühe (E1–E4) und späte (L1–L5) transkriptionelle Regionen (Einheiten) eingeteilt. Diese Klassifikation beruht auf zwei temporären Klassen von viralen Proteinen, die während der frühen (E) und späten (L) Phasen der Virusreplikation exprimiert werden, wobei die virale DNA-Replikation die beiden Phasen trennt.
Ein viraler Gentransfer-Vektor ist ein rekombinantes Virus, üblicherweise ein Virus, bei dem ein Teil seines Genoms deletiert und durch eine Expressionskassette, die in die Wirtszelle zu übertragen ist, ersetzt ist. Zusätzlich zu einem fremden (exogenen) Gen umfasst die Expressionskassette Komponenten, die für eine einwandfreie Expression des fremden Gens notwendig sind. Es enthält mindestens eine Promotorsequenz und ein Polyadenylierungssignal vor und nach dem zu exprimierenden Gen. Weitere Sequenzen, die zur Regulation oder Verstärkung der Genexpression erforderlich sind, können für spezielle Anwendungszwecke in der Kassette enthalten sein.
Die Deletion von einigen Teilen des viralen Genoms kann das Virus replikationsinkompetent machen, d.h. es ist nicht mehr fähig, sich in den infizierten Wirtszellen zu vermehren. Dieses hochgradig erstrebenswerte Sicherheitsmerkmal von viralen Vektoren verhindert die Ausbreitung des Vektors, der das rekombinante Material enthält, auf die Umgebung und schützt den Patienten vor einer unbeabsichtigten viralen Infektion und vor deren pathologischen Konsequenzen. Das Virus mit dem Replikationsmangel benötigt für seine Vermehrung entweder eine komplementierende Zelllinie (Packungszelllinie) oder die Anwesenheit eines Helfervirus, die beide dazu dienen, die Funktionen des deletierten Teils oder der deletierten Teile des viralen Genoms zu ersetzen (in trans wieder herzustellen). Da gezeigt wurde, dass die Erzeugung von rekombinanten viralen Vektoren, die frei von replikationskompetentem Helfervirus sind, schwer zu erreichen ist, wird die Verwendung von Packungszelllinien für die Vermehrung von replikationsinkompetenten viralen Vektoren als die beste Wahl für gentherapeutische Zwecke angesehen.
Frühe Adenovirus-Vektoren (gelegentlich als erste Generation von Adenovirus-Vektoren oder Vektoren mit einem Einzelmangel bezeichnet) stützten sich auf Deletionen (und Insertionen) in den Kodierungsbereichen E1 und/oder E3 des viralen Genoms (vergl. beispielsweise US-5 670 488, US-5 698 202 und US-5 731 172). Eine E3-Deletion wurde üblicherweise durchgeführt, um den erforderlichen Raum für die Insertion von fremden Genen einer begrenzten Größe zu schaffen. Die E3-Region ist für das Viruswachstum in Gewebekultur nicht wesentlich, so dass Vektoren mit einer Deletion nur in der E3-Region in nicht-komplementierenden Zellen vermehrt werden konnten. Da die E1-Region für das Viruswachstum wesentlich ist, konnten E1-deletierte Vektoren nur in komplementierenden Zellen vermehrt werden, z.B. in humanen 293-Zellen (ATCC CRL 1573), einer humanen, embryonalen Nierenzelllinie mit einem Gehalt an der E1-Region von humaner Ad5-DNA.
US-5 846 945 betrifft Zusammensetzungen von rekombinanten zytopathischen Viren, die zur Replikation und/oder Expression von Genen der späten Region in neoplastischen Säugetierzellen befähigt sind, aber im wesentlichen in nicht-neoplastischen Zellen nicht replizierbar sind.
Eines der kritischen Probleme bei der Entwicklung von sicheren viralen Vektoren besteht darin, die Erzeugung von replikationskompetentem Virus während der Vektorerzeugung in einer Packungszelllinie oder während der gentherapeutischen Behandlung zu verhindern. Dies kann als Folge eines Rekombinationsereignisses zwischen dem Genom des Vektors und dem der Packungszellen oder zwischen dem Genom des Vektors und dem Wildtyp-Virus, die in Empfängerzellen des Patienten vorhanden sind oder als Verunreinigung beim Verfahren zur Erzeugung des rekombinanten Virus eingeführt worden sind, erfolgen. Gelegentlich kann ein Rekombinationsereignis ein replikationskompetentes Virus erzeugen, das das Transgen trägt, wobei sich dieses Virus auf die Umgebung ausbreiten kann. Obgleich Rekombinationsereignisse bei E1-deletierten Adenovirus-Vektoren selten sind, konnten ihre in vivo-Replikation und die sich daraus ergebenden Gefahren nicht vollständig verhindert werden, und die Erzeugung von replikationskompetentem Adenovirus wurde während der Präparation von viralen Vorratsmaterialien nachgewiesen. Eine weitere Gefahr besteht im Verlust des Replikationsmangels (und in der Rückkehr zu einem phänotypischen Multiplikationszustand) durch in trans-Komplementierung in einigen Zellen, die Proteine erzeugen, die zum Ersetzen von Proteinen befähigt sind, die durch die deletierten Regionen des viralen Genoms kodiert werden. Dies wurde für E1-deletierte Adenoviren nachgewiesen.
Versuche zur Verbesserung der Sicherheit und des Klonierungsvermögens von Adenovirus-Vektoren führten zur Entwicklung einer neuen Generation von Adenovirus-Vektoren mit Mehrfachdefekten (auch als Vektoren der zweiten Generation oder mehrfach deletierte Vektoren bezeichnet). Zusätzlich zu Deletionen in den E1- und/oder E3-Kodierungsregionen weisen diese Vektoren auch eine Deletion in anderen Regionen des viralen Genoms, das für die Virusreplikation wesentlich ist, auf, z.B. in den frühen Regionen E2 und/oder E4 (vergl. z.B. WO-95/34671, US-5 700 470, WO-94/28152) oder in den späten Regionen L1–L5 (vergl, z.B. WO-95/02697). Weitere bekannte Wege zur Verbesserung der Sicherheit von Adenovirus-Vektoren umfassen beispielsweise eine Relokation von Protein IX-Gen in E1-deletiertem Adenovirus (US-5 707 618) und eine Inaktivierung des Gens IVa2 in einem mehrfach deletierten Adenovirus (WO-96/10088). Sämtliche Adenovirus-Vektoren der zweiten Generation weisen einen Replikationsmangel auf und benötigen für ihre Vermehrung komplementierende Zelllinien, die in trans die deletierten oder inaktivierten Funktionen des viralen Genoms wieder herstellen. Noch wichtiger ist, dass derartige Vektoren eine verbesserte Resistenz gegen eine Rekombination zeigen, wenn sie in komplementierenden Zelllinien vermehrt oder in Empfängerzellen eines Patienten übertragen werden, wodurch Rekombinationsereignisse praktisch inexistent werden und die Sicherheit von gentherapeutischen Behandlungen verbessert wird.
Obgleich aus dem Stand der Technik Adenovirus-Vektoren mit verbesserter Beständigkeit gegen eine Rekombination bekannt sind, wie vorstehend durch Beispiele belegt wurde, sind sie nicht gleichwertig in Bezug auf ihren Gentransfer-Wirkungsgrad, die Klonierungskapazität, die Toxizität gegenüber Wirtszellen, die Schwere der im Organismus des Patienten induzierten Immunreaktion, die Einfachheit der Vermehrung (die durch die Toxizität von einem oder mehreren viralen Genen gegenüber Packungszelllinien begrenzt sein kann), die Einfachheit der Erzeugung (die durch eine Expressionskassette mit einem Gehalt an toxischen Genen begrenzt sein kann) und die in vivo-Regulierbarkeit der exogenen (fremden) Genexpression. Infolgedessen besteht ein anhaltendes Bedürfnis nach adenoviralen Vektoren, bei denen mindestens einige dieser Eigenschaften verbessert sind. Die vorliegende Erfindung stellt neue adenovirale Vektoren und komplementierende Zelllinien für ihre Erzeugung und Vermehrung bereit, die frei von zahlreichen, im Stand der Technik gegebenen Einschränkungen sind.
Adenovirale Vektoren können sich auch als Werkzeuge zur Herstellung von Proteinen eignen, z.B. mit dem Ziel von funktionellen Genomikstudien in Säugetierzellen. Eine Klonierung und Expression von zahlreichen Genen erlaubt die Erzeugung von Minibibliotheken, die sich für verschiedene Anwendungsmöglichkeiten eignen, z.B. für Signaltransduktionsstudien oder das Screening von Antisense-DNA-Konstrukten. Diese Anwendung von adenoviralen Vektoren erfordert ein Klonierungssystem, bei dem die Erzeugung und Auswahl von rekombinanten Mutanten leicht vorgenommen werden können. Die vorliegende Erfindung stellt ein neuartiges System von klonierenden DNA-Sequenzen unter Verwendung von adenoviralen Vektoren bereit.
Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Adenovirus-Vektor/Packungszelllinien-System bereit, bei dem die Vektorreplikation durch Deletion eines einzigen Gens und nicht einer viralen Region blockiert ist, wobei die Deletion nicht irgendwelche anderen viralen Funktionen beeinträchtigt. Beim deletierten Gen handelt es sich um das Gen der Adenovirus-Protease. Die durch das deletierte Gen kodierte Protease wird in einer komplementierenden (packenden) Zelllinie durch eine regulierbare Expressionskassette exprimiert, die keine toxischen Wirkungen in den Zellen induziert, was somit die Erzeugung und Herstellung des Vektors einfacher und wirkungsvoller macht. Da das deletierte Gen für Adenovirus hochspezifisch ist, ist keine Komplementierung des Gens in transduzierten Zellen zu erwarten, was die Sicherheit und die Eignung der in Bezug auf das Protease-Gen deletierten Vektoren für Gentransfer-Zwecke erhöht.
Wenn zusätzlich eine Deletion bezüglich der E1-Region des adenoviralen Genoms vorliegt, werden die erfindungsgemäßen Vektoren in Bezug auf die Replikation blockiert, sind aber zu einer einzigen Replikationsrunde befähigt, wenn sie nur eine Deletion in Bezug auf das Protease-Gen aufweisen. Das letztgenannte Merkmal ermöglicht eine verstärkte Expression des Transgens in transduzierten Zellen, was bei einigen Anwendungen von Bedeutung sein kann, beispielsweise um lokalisierte verstärkte Expressionen von Transgenen (bei der in situ-Tumortherapie) oder wirksame Impfungen ohne Boosting zu erreichen.
Infolgedessen besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung von neuartigen Zelllinien, die zum Beherbergen einer Adenovirus-Mutante mit einer Deletion des Protease-Gens befähigt sind, wobei die Zelllinien DNA enthalten, die die Adenovirus-Protease exprimiert.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung neuartiger Zelllinien, die zum Beherbergen einer Adenovirus-Mutante mit einer Deletion des Protease-Gens befähigt sind, wobei die Zelllinien DNA enthalten, die die Adenovirus-Protease exprimiert.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Verwendung von Zelllinien, die zum Beherbergen einer Adenovirus-Mutante mit einer Deletion in Bezug auf das Protease-Gen befähigt sind und die DNA enthalten, die die Adenovirus-Protease exprimiert, um Adenovirus-Mutanten, denen das Adenovirus-Protease-Gen fehlt, zu erzeugen und zu vermehren.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung von neuartigen Adenovirus-Mutanten, die eine Deletion des Adenovirus-Protease-Gens aufweisen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung von neuartigen Adenovirus-Mutanten, die in Bezug auf das Protease-Gen und in Bezug auf mindestens ein weiteres Adenovirus-Gen oder genomische Region deletiert sind.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung von neuartigen Adenovirus-Vektoren für den Gentransfer, die Proteinerzeugung, die Gentherapie und -vakzination, wobei die Vektoren einen Mangel zumindest in Bezug auf das Adenovirus-Protease-Gen aufweisen und mindestens ein exogenes Gen zur Übertragung auf eine Wirtszelle und zur Expression darin enthalten.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wurden neuartige Zelllinien erzeugt, die zur Expression des Ad2-Protease-Gens aus einer dicistronischen Expressionskassette unter Kontrolle eines durch Tetracyclin induzierbaren Promotors befähigt sind. Die Protease wird in diesen Zellen zusammen mit dem grünen fluoreszierenden Protein (GFP) exprimiert, wobei das letztgenannte Protein verwendet wird, um die Überwachung der Zellklonierung und Expression zu erleichtern. Die neuartigen Zelllinien wurden durch Transfektion von Derivaten von 293-Zellen mit DNA-Stücken, die für Ad2-Protease und GFP kodieren, durch Auswählen von Zellen, die diese Stücke beherbergen (Zellen, die GFP exprimieren), und durch Amplifikation der Zellen hergestellt. Die neuartigen Zelllinien, die in stabiler Weise die Ad2-Protease exprimieren, erzeugen Proteasemengen, die gleich groß oder größer sind als die Mengen, die nach vergleichbaren Infektionen durch Adenovirus erreicht worden sind. Die biologische Aktivität der neuartigen Zelllinien wurde durch ihre Fähigkeit zur vollständigen Stützung der Reproduktion der Ad2ts1-Mutante, einer temperaturempfindlichen Mutante, die eine Protease mit einem Funktionsmangel exprimiert, und zur Wiederherstellung normaler Replikationsausbeuten von zwei neuartigen Adenovirus-Mutanten, bei denen das Protease-Gen deletiert worden ist, nachgewiesen.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wurden neuartige Mutanten von Ad5, bei denen zumindest das Adenovirus-Protease-Gen deletiert ist, erzeugt. Diese neuartigen Mutanten wurden in erfolgreicher Weise in den erfindungsgemäßen Zelllinien vermehrt.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1A ist eine Photographie, die die Expression der Protease durch einige Klone von 293-tTA-PS- und 293-rtTA-PS-Zellen zeigt. Gesamtproteinextrakte (30 μg) aus verschiedenen Zelllinien vor (–) und nach (+) Induktion wurden mit 14% SDS-PAGE behandelt und auf eine Nitrocellulose-Folie übertragen. E. coli-exprimierte Ad2-Protease (Bahn 1: E. coli), endogene Adenovirus-Protease (Bahn 3: AdV) und nicht-transformierte Zellen (Bahn 2: Scheinprobe) wurden als Kontrollen mitgeführt.
1B ist eine Photographie von Immunoblots von Proteinextrakten von 1A. Die Proteine wurden mit einem Antiactin-Antikörper aufgedeckt, um festzustellen, dass die gesamte Menge des Proteins pro Vertiefung aufgesetzt wurde.
2 ist eine schematische Darstellung sämtlicher molekularer Klonierungen, die durchgeführt wurden, um bakterielle Plasmide zu erzeugen, die in Bezug auf Protease deletierte Adenovirus-Regionen beherbergen. Eine unter Anwendung von PCR gentechnisch erzeugte Protease-Deletion wurde (nach Sequenzierung der entsprechenden Region) in das pDE3-Plasmid eingeführt, in das vorher eine strangaufwärtige Erweiterung mit 2378 bp durch Klonierung des RsrII/XhoI-6145 bp-Fragments aus dem Ad5-Genom inseriert worden war.
3 ist eine schematische Darstellung von bakteriellen Plasmiden, die in Bezug auf Protease deletierte Adenovirus-Regionen beherbergen sowie von in E. coli durchgeführten Rekombinationen, um bakterielle Plasmide zu erzeugen, die in Bezug auf Protease deletierte Adenovirus-Genome beherbergen. Das NdeI/XhoI-Fragment aus pDE3-ext-ΔPS-Plasmid wurde durch homologe Rekombination in E. coli zusammen mit pAdEasy1-βgal-GFP-Plasmid (das ein E1/E3-deletiertes Ad5-Genom mit den Reportergenen βgal von E. coli und GFP beherbergt) oder mit dem pTG3026-Plasmid (das ein intaktes Ad5-Genom beherbergt) nach Verdau mit SgfI eingeführt.
4 ist ein Diagramm zur Darstellung der Einflüsse der Induktion der Protease-Expression auf die Lebensfähigkeit von Zellen der 293-PS-Zelllinien. Sechs Petri-Schalen mit einem Durchmesser von 6 cm wurden mit 2 × 10⁵ Zellen von 293- und 293-PS-tTA beimpft. Aliquotmengen wurden durch Färbung mit Trypanblau vom Tag 0 (D0) bis zum Tag 5 (D5) auf lebende/tote Zellen geprüft. Die Ergebnisse des Gesamtzellwachstums eines typischen Experiments sind als Anzahl der gesamten lebenden Zellen in Abhängigkeit von der Zeit (in Tagen) für 293-tTA-PS-Zellen aufgetragen, und zwar entweder nach Induktion (I) oder ohne Induktion (NI), wobei 293-tTA-Zellen als Kontrollen dienten.
5 ist eine schematische Darstellung der molekularen Klonierung, die zur Erzeugung von rekombinanten, adenoviralen Vektoren durch positive Selektion mit Ad-Protease durchgeführt wurde. Die hier dargestellte Rekombinante wies eine E1-Deletion auf. Ein Shuttle-Vektor mit einem Gehalt an dem Adenovirus 5-9.4- bis 15.5-mu-Teil des Genoms zur Ermöglichung der Rekombination beherbergte auch eine 3-fache Expressionskassette, die unter anderem das Protease-Gen und ein fremdes Gen von Interesse (X) anstelle der E1-Region enthielt. Nach Linearisation wurde der Shuttle-Vektor in eine von 293 abgeleitete Zelllinie mit einem Protease-deletierten Adenovirus-Genom, das in E1 gespalten war, kotransfiziert. Aufgrund der Protease-Deletion erzeugten nur Genome, bei denen eine Rekombination und somit die Wiederherstellung des Protease-Gens erfolgt war, virale Plaques. Die erhaltenen rekombinanten Viren beherbergten kein Protease-Gen in der L3-Region, jedoch wurden das E1-klonierte Gen und die Protease ektopisch aus der E1-Region exprimiert.
6 ist eine photographische Aufnahme zur Darstellung eines mit Coomassie-Blau gefärbten Gels zum Nachweis der Fähigkeit der Ad5-ΔPS-Mutante zur Durchführung einer einzigen Replikationsrunde in nicht-komplementierenden Zellen. A549-Zellen wurden mit einem MOI-Wert von 5 pfu mit den angegebenen Mutanten inokuliert. 3 Tage später wurden die Zellen in Laemmli-Puffer lysiert. Man setzte 20 μg Proteinextrakte pro Vertiefung auf und ließ sie in einem 12% Acrylamid:Bisacrylamid-Gel laufen. Bei Vergleich des viralen Proteins, das durch die verschiedenen Mutanten (d.h. Hexon, 100K) synthetisiert worden ist, zeigt, dass nur die Ad5-ΔPS-Mutante ähnliche Mengen wie das Wildtyp-Virus erzeugt. Dies bestätigt die Fähigkeit dieser Mutante zur Durchführung einer einzigen Runde der Replikation in nicht-komplementierenden Zellen.
7 ist ein Diagramm zur Darstellung der viralen Ausbeuten verschiedener adenoviraler Mutanten in A549-Zellen. Die Fähigkeit der Ad5-ΔPS-Mutante zur Durchführung einer einzigen Replikationsrunde in nicht-komplementierenden Zellen wurde ferner durch Titration der gleichen Extrakte, wie sie in 6 dargestellt sind, bestimmt. A549-Zellen wurden mit einem MOI-Wert von 5 pfu mit den angegebenen Mutanten inokuliert. 3 Tage später wurden die Zellen geerntet und Extrakte wurden in 293rtTA.PS.7 titriert. Die Titer sind in logarithmischen Werten (0–9) angegeben.
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Der hier verwendete Ausdruck "Adenovirus" (Ad) bedeutet ein beliebiges Adenovirus, das vom Menschen, von Säugetieren oder von Vögeln stammt (Mastadenovirus, Aviadenovirus-Familien). Darunter werden die humanen Adenoviren Ad2 und Ad5 bevorzugt. Ad5 wird besonders bevorzugt.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Ausdruck "Adenovirus-Protease" die Protease von einem beliebigen Adenovirus, das vom Menschen, von Säugetieren oder von Vögeln stammt, unter Einschluss von Analogen, Homologen, Mutanten und Isomeren einer derartigen Protease. Der Ausdruck "Adenovirus-Protease-Gen" bedeutet das Protease-Gen von einem beliebigen Adenovirus, das von Menschen, Säugetieren oder Vögeln stammt, unter Einschluss von Analogen, Homologen, Mutanten und Isomeren eines derartigen Gens. Obgleich untergeordnete Unterschiede zwischen Proteasen unterschiedlicher Adenoviren bestehen, sind diese Proteasen untereinander austauschbar. Proteasen der humanen Adenoviren Ad2 und Ad5 werden bevorzugt, wobei Ad2-Protease besonders bevorzugt wird.
Die Adenovirus-Protease, die erstmals durch Studien an der temperaturempfindlichen Ad2ts1-Mutante identifiziert wurde (Weber, J. Virol., Bd. 17 (1976), S. 462–471; Yeh-Kai et al., J. Mol. Biol., Bd. 167 (1983), S. 217–222) stellt ein Schlüsselenzym im Adenovirus-Lebenszyklus dar, das zur Reifung mehrerer Proteine dient. Durch dieses Enzym gespaltene Proteine sind das Präterminale Protein (pTP), pVI, pVII, pVIII, pIIIa und die 11K-DNA-Bindungsproteine (Anderson et al., J. Virol., Bd. 12 (1973), S. 241–252; Boudin et al., Virology, Bd. 101 (1980), S. 144–156; Tremblay et al., Biochim. et Biophys. Act., Bd. 743 (1983), S. 239–245). Zusätzlich zu diesen Substraten spielen die Spaltung von viralem 52K-Protein (Hasson et al., J. Virol., Bd. 66 (1992), S. 6133–6142) und von zellulärem Cytokeratin 18 (Chen et al., J. Virol., Bd. 67 (1993), S. 3507–3514) eine wichtige Rolle im viralen Zyklus. Die Adenovirus-Protease stellt daher ein wesentliches Element für die Reifung von Virusproteinen, für den Eintritt des Virus in Wirtszellen (Cotten et al., Virology, Bd. 213 (1995), S. 494–502; Greber et al., EMBO J., Bd. 15 (1996), S. 1766–1777) und für die Freisetzung von Virionen aus infizierten Zellen dar (Chen et al., a.a.O.).
Mutanten mit einer Adenovirus-Protease-Deletion bieten zahlreiche Vorteile für die Gentherapie und -vakzination. Derartige Mutanten weisen unabhängig davon, ob zusätzliche Gene (z.B. in der E1-Kodierungsregion) deletiert sind oder nicht, einen vollständigen Replikationsmangel auf. Obgleich sie zur Spaltung einiger zellulärer Proteine befähigt ist, ist die Adenovirus-Protease hochspezifisch, was es äußerst unwahrscheinlich macht, dass der Proteasedefekt in der Mutante in einer Säugetierzelle überwunden werden kann, ein Effekt, der für Adenovirus-Mutanten mit einer E1-Deletion in einigen Säugetierzellen nachgewiesen wurde (HeLa- und Teratokarzinom-F9-Stammzellen: Imperiale et al., Mol. Cell. Biol., Bd. 4 (1984), S. 867–874; Nevins et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol., Bd. 113 (1984), S. 15–19; embryonales Karzinom (EC): Keaveney et al., Nature, Bd. 365 (1993), S. 562–566). Dies bietet ein erhöhtes Sicherheitsniveau für therapeutische Anwendungen. Für gentherapeutische Anwendungen kann eine vollständige Blockade der Replikation von Adenovirus erreicht werden, indem man das Protease-Gen zusammen mit einem oder mehreren anderen Genen, die für das Viruswachstum essentiell sind, wie die E1-Kodierungsregion, deletiert. Rekombinante Vektoren, bei denen nur die Protease deletiert ist und die somit zu einer einzigen Replikationsrunde befähigt sind, stellen interessante Vektoren für die Vakzination dar.
Adenoviren, bei denen das Protease-Gen deletiert ist, benötigen für ihre Vermehrung eine Zelllinie, die dazu befähigt ist, das Produkt des Protease-Gens in trans bereitzustellen, z.B. die erfindungsgemäßen Zelllinien. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wurden 293S-Zelllinien, die in stabiler Weise die Ad2-Protease exprimieren, erzeugt (293-PS-Zellen). 293S-Zellen wurden aus zwei Gründen ausgewählt. Erstens ermöglichen 293-Zellen die Vermehrung von Adenoviren, die gleichzeitig eine Deletion in der E1- und/oder der E3-Kodierungsregion aufweisen, wie rekombinante Adenovirus-Vektoren für gentherapeutische Anwendungen. Zweitens ist der nicht haftende Phänotyp von 293S-Zellen vorteilhaft für eine Maßstabvergrößerung der Herstellung von deletiertem Adenovirus (Garnier et al., Cytotechnology, Bd. 15 (1994), S. 145–155), z.B. für die Herstellung von Vektor-Vorratsprodukten. Für den Fachmann ist es ersichtlich, dass andere Zelllinien, die zur Beherbergung von Adenoviren befähigt sind, wie A549, 911 oder BMAdE1, ebenfalls zur Erzeugung von Zelllinien, die das Adenovirus-Protease-Gen exprimieren, geeignet sind.
Gemäß der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wurden induzierbare Promotoren gewählt, um eine regulierbare Expression des Protease-Gens in den erfindungsgemäßen Zelllinien zu erreichen, nämlich die tTA- und rtTA-Systeme (Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 89 (1992), S. 5547– 5551; Gossen et al., Science, Bd. 268 (1995), S. 1766–1769). Diese Systeme ermöglichen eine induzierbare Expression des Gens, indem man entweder die Zellen mit Tetracyclin versetzt oder ihnen Tetracyclin entzieht. Regulierbare Expressionskassetten wurden aufgrund der Fähigkeit der Adenovirus-Protease zum Aufbrechen einiger Komponenten des zellulären Cytokeratin-Netzwerks gewählt (Chen et al., a.a.O.). Diese Funktion scheint eine Schlüsselrolle bei den phänotypischen Eigenschaften des zytopathischen Adenovirus-Effekts zu spielen und kann somit für die Wirtszellen zumindest nachteilig sein. Eine regulierbare Expressionskassette ermöglicht es, die Expression der Protease (zumindest auf einem hohen Niveau) nur auf Zeiträume zu beschränken, bei denen die Induktionssubstanz entweder zugesetzt oder entzogen wird, so dass die toxische Wirkung der Protease, die die Erzeugung oder Vermehrung von Protease-deletiertem Adenovirus behindern könnte, beseitigt wird. (Zellen mit einer Transfektion durch fremde Plasmid-DNA sind durch die Transfektion einem Stress ausgesetzt und gegen etwaige toxische Wirkungen wesentlich empfindlicher.)
Bei rekombinanten Adenovirus-Vektoren für die Gentherapie und -vakzination bietet es eine Reihe von Vorteilen, das Transgen in eine ähnliche regulierbare Expressionskassette zu bringen. Indem man beispielsweise das tTA- oder rtTA-Regulationssystem wählt, wird die Steuerung der Expression des Transgens dadurch ermöglicht, dass man entweder Tetracyclin verabreicht oder die Verabreichung einstellt. Dies kann beispielsweise bei der Vakzination von Tieren, bei denen Tetracyclin auf regulärer Basis dem Futter zugesetzt wird, wertvoll sein. Die Expression des Gens von Interesse kann in diesem Fall durch Weglassen der Verabreichung des Tetracyclins während einer angemessenen Zeitspanne induziert werden. Für den Fachmann ist es ersichtlich, dass andere regulierbare Promotoren, wie Ecdyson- und Corticosteroid-reaktive Systeme in der erfindungsgemäßen Praxis verwendet werden können.
Die erfindungsgemäßen Zelllinien lassen sich nach dem Fachmann bekannten Verfahren herstellen, insbesondere durch Kotransfektion von Zellen, die zur Beherbergung von Adenovirus befähigt sind, mit DNA-Stücken, die für die Adenovirus-Protease kodieren, und DNA-Stücken, die für einen Selektionsfaktor kodieren, durch Inkubation der Zellen, durch Selektieren von Zellen, die den Selektionsfaktor exprimieren und durch Amplifizieren dieser Zellen, die die Adenovirus-Protease exprimieren. Beim Selektionsfaktor kann es sich um einen beliebigen Faktor handeln, der die Selektion einer Zelle ermöglicht, z.B. um ein Antibiotikum-Resistenzprotein.
Gemäß der bevorzugten Ausführungsform wurden die neuartigen erfindungsgemäßen komplementierenden Zelllinien durch Kotransfektion von 293- tTA- oder 293-rtTA-Zellen mit dem Plasmid pTR5/PS-DC/GFP (das einen Tetracyclin-regulierbaren (TR) Promotor in einer dicistronischen Kassette (DC) mit dem GFP und dem Protease (PS)-Gen enthält) und mit dem Plasmid pTKNeo (das das Resistenzgen für Geneticin (Antibiotikum G418) enthält) oder mit dem Plasmid p3'SS (das das Resistenzgen für Hygromycin enthält) und durch Selektion von transfizierten Zellen mit diesen Antibiotika hergestellt. Antibiotikum-resistente Kolonien, die das GFP-Protein exprimieren, wurden amplifiziert und mehrere Kolonien davon für eine weitere Analyse ausgewählt.
Um das Screening von rekombinanten Klonen zu erleichtern, wurde das Adenovirus-Protease-Gen aus einer dicistronischen Kassette (Mosser et al., Biotechniques, Bd. 22 (1997), S. 150–161) zusammen mit einem Reportergen von grün fluoreszierendem Aquorea victoria-Protein (GFP) (Prasher et al., Gene, Bd. 111 (1992), S. 229–233; Heim et al., Nature, Bd. 373 (1995), S. 663–664), exprimiert. Nach der ersten Selektion mit einem Antibiotikum (G418 oder Hygromycin) wurden Zellen, die GFP exprimierten, für weitere Studien durch eine automatisierte Sortierung von fluoreszierenden Zellen selektiert. Dieses System ermöglichte eine wirksame Erzeugung von 293-Zelllinien, die in stabiler Weise die aktive Ad2-Protease exprimieren.
Für den Fachmann ist es ersichtlich, dass die DNA-Stücke, die für die Adenovirus-Protease kodieren, in die Zellen unter Verwendung eines beliebigen intrazellulären DNA-Abgabesystems, z.B. rekombinante Plasmide, und durch eine beliebige Transfektionstechnik, z.B. Calciumphosphat-Fällung oder Liposomen-Technologie, eingeführt werden können. Ferner können Zellen, die Stücke von für Adenovirus-Protease kodierender DNA beherbergen, unter Verwendung eines beliebigen geeigneten Selektionsfaktors selektierbar gemacht werden, z.B. durch Verwendung des Resistenzgens für ein Antibiotikum, wobei dieses Gen durch ein geeignetes rekombinantes Plasmid in die Zellen transfiziert werden kann.
Zur Untersuchung der biologischen Aktivität des rekombinanten Proteins wurde eine Komplementierung der Ad2ts1-Mutante (Weber, J. Virol., Bd. 17 (1976), S. 462–471) geprüft. Diese Mutante kodiert für eine modifizierte P137L-Protease, die bei der permissiven Temperatur (33°C) aktiv und bei 39°C funktionell defektiv ist. Eine Replikation von Ad2ts1 an 293tTA-PS- und 293-rtTA-PS-Zelllinien ermöglichte die Wiederherstellung von Ausbeuten, die ähnlich wie beim Wildtyp-Virus waren. Ferner wurde gezeigt, dass die Expression der Protease für die Zellen nicht toxisch war, sondern eher das normale Zeltwachstum leicht beeinträchtigte. Von den neuartigen Zelllinien wurde auch gezeigt, dass sie die Replikation von zwei neuartigen Adenovirus-Mutanten, bei denen das Protease-Gen deletiert worden ist, wieder herstellen.
Die in Bezug auf das Protease-Gen deletierten neuartigen Adenovirus-Mutanten lassen sich nach dem Fachmann bekannten Verfahren herstellen. Im allgemeinen stützt sich die Herstellung einer Virus-Mutante darauf, dass zunächst das vollständige Genom der Mutante hergestellt wird, indem man geeignete DNA-Stücke entweder durch in vitro-Ligation oder durch Rekombination in einer Zelle verknüpft. Im letztgenannten Fall werden mehrere (üblicherweise zwei oder drei) Fragmente von adenoviraler DNA, die Ähnlichkeitsregionen (oder Überlappungsregionen) enthält, in Wirtszellen transfiziert, wobei sie zu einem viralen Genom von voller Länge rekombiniert werden. Die zu ligierenden oder zu rekombinierenden Fragmente können Deletionen und Modifikationen in Bezug auf das virale Wildtyp-Genom enthalten, müssen aber ansonsten dessen gesamte Länge aufweisen. Die DNA des auf diese Weise hergestellten rekombinanten Virus wird sodann in geeignete komplementierende Zellen transfiziert, die dazu befähigt sind, virale in trans-Funktionen, die dem transfizierten, rekombinanten, viralen Genom als Folge der in das Wildtyp-Genom eingeführten Deletionen und Modifikationen fehlen, bereitzustellen. Das rekombinante Virus vervielfältigt sich in diesen Zellen, aus denen es anschließend freigesetzt werden kann, indem man beispielsweise die Zellen mehreren Einfrier-Auftau-Zyklen unterwirft. Zahlreiche Abänderungen dieses allgemeinen Verfahrens sind möglich, wie es für den Fachmann ersichtlich ist.
Gemäß der bevorzugten Ausführungsform wurden zwei neuartige Ad5-Mutanten (mit der Bezeichnung Ad5CMVLacZ-CMVGFP-ΔPS bzw. Ad5-ΔPS) gemäß dem vorstehend skizzierten allgemeinen Verfahren erzeugt. Dies wurde durch eine Reihe von Klonierungen in bakterielle Plasmide erreicht, wonach sich eine Rekombination geeigneter Fragmente des viralen Genoms in E. coli anschloss, um bakterielle Plasmide, die die deletierten Adenovirus-Genome beherbergen, zu erzeugen. Dieses Verfahren ist in 2 und in 3 zusammenfassend dargestellt und in den nachstehenden Beispielen ausführlicher erläutert.
Die Ad5-ΔPS-Mutante weist eine Deletion nur des Protease-Gens auf. Ad5CMVLacZ-CMVGFP-ΔPS ist in Bezug auf das Protease-Gen deletiert, jedoch auch in Bezug auf die E1- und E3-Kodierungsregionen des Ad5-Genoms. Beide Mutanten wurden mit Erfolg in den erfindungsgemäßen neuartigen komplementierenden Zelllinien, die die Ad2-Protease exprimieren, vermehrt. Die Ad5CMVLacZ-CMVGFP-ΔPS-Mutante enthält in ihrem Genom zwei exogene Gene (Transgene), nämlich das Gen von E. coli-β-Galactosidase (βgal) und das Gen des grünen fluoreszierenden Aquorea victoria-Proteins (GFP). Diese Reportergene können leicht durch dem Fachmann geläufige Verfahren durch Gene von therapeutischem Interesse ersetzt werden. In beiden Mutanten können Gene von therapeutischem Interesse leicht durch Rekombination eingeführt werden, da beide in bakterielle Plasmide kloniert wurden.
Die Erfindung ermöglicht ferner die sichere Erzeugung von Adenovirus-assoziierten Vektoren aufgrund der vollständigen Blockade der Replikation der in Bezug auf die Protease deletierten Mutanten, die anmeldungsgemäß als Hilfsinstrumente verwendet werden können.
Experimenteller Teil
Die erfindungsgemäßen Zelllinien und Vektoren wurden unter Anwendung von dem Fachmann geläufigen Verfahren hergestellt. Die folgenden Beispiele werden zu einer besseren Erläuterung der Erfindung vorgelegt.
Materialien und Methoden
Zellen und Viren
293-Zellen sind humane embryonale Nierenzellen, die hohe Konzentrationen der Adenovirus-5-E1A- und -E1B-Produkte exprimieren (Graham et al., J. Gen. Virol., Bd. 36 (1977), S. 59–72). 293S-Zellen, ein nicht-haftender 293-Zellklon, wurden in der Literatur beschrieben (Garnier et al., Cytotechnology, Bd. 15 (1994), S. 145–155; Massie et al., Bio/Technology, Bd. 13 (1995), S. 602–608). Die 293–tTA-Zelllinie wurde von Massie et al., J. Virol., Bd. 72 (1998), S. 2289–2296, beschrieben. Die 293-rtTA-Zelllinie wurde auf ähnliche Weise erhalten. Die Adenovirus-Mutante Ad2ts1 wurde in der Literatur beschrieben (Weber, J. Virol., Bd. 17 (1976), S. 462–471). Adenovirus dI309 ist eine vollständig replikative Mutante und wurde in der Literatur beschrieben (Jones et. al., Cell, Bd. 13 (1978), S. 181–188). AdCMV5-GFP ist ein rekombinantes Adenovirus, bei dem die E1-Region durch ein CMV, gesteuert durch die GFP-Expressionskassette ersetzt wurde (Massie et al., Cytotechnology, im Druck (1999)).
Plasmide
Das Plasmid pTKNeo wurde durch Autoligation des BstEII-Fragments von pREP 9 (Invitrogen) erzeugt. Das Plasmid pTR-DC/GFP ist in der Literatur beschrieben (Mosser et al., 1997). Dieses Plasmid wurde als pUHD10.3 (Resnitsky et al., Mol. Cell. Biol., Bd. 14 (1994), S. 1669–1679), das den tTA-reaktiven Promotor mit einer dicistronischen Expressionskassette enthält, modifiziert. Die dicistronische Expression wird durch das Encephalomyocarditis-Virus IRES (Ghattas et al., Mol. Cell. Biol., Bd. 11 (1991), S. 5848–5859) ermöglicht. Das ursprüngliche pTR-DC/GFP wurde durch Insertion einer BglII-Stelle modifiziert. Das Protease-Gen wurde aus pAdBM5-PS- durch BamHI-Verdau ausgeschnitten, sequenziert und in die BglII-Stelle von pTR-DC/GFP subkloniert. Das schließlich erhaltene Plasmid pTRS/PS-DC/GFP koexprimiert somit in induzierbarer Weise die mutanten GFP-S65T- und Ad2-Protease-Gene. Die Expression von GFP und Protease wurde durch Transfektion in 293-Zellen getestet. Die vorübergehende Expression der Protease wurde durch Western-Blot mit einem polyklonalen anti-Protease-Antiserum, das in Kaninchen mit einem rekombinanten Protein (von Dr. J. Weber, Universität Sherbrooke) erzeugt worden war, bestätigt. Das exprimierte Protein wies das gleiche Molekulargewicht wie das native Protein aus Wildtyp-Adenovirus auf und wurde nur bei Induktion exprimiert. Das Plasmid pDE3 wurde von Dr. Lochmüller (Montreal Neurological Institute) zur Verfügung gestellt. Dieses Plasmid enthält das rechte Ende des Ad5-Genoms aus der BamHI-Stelle (21562) bis zum Ende des Genoms mit einer E3-Deletion. Diese Deletion entspricht der von Bett et al. (1994) beschriebenen Deletion und stammt aus dem Plasmid pBHG11 (Umfang der Deletion: 27865–30995). Das Plasmid pAdEasy-1-βGal-GFP wurde von Dr. He (John Hopkins University, Baltimore, MD.) zur Verfügung gestellt und ist in der Literatur beschrieben (He et al, 1998). Das Plasmid pTG3602 (Chartier et al., 1996) wurde von Dr. Mehtali (Transgene SA, Strasbourg, Frankreich) zur Verfügung gestellt. Die rekombinante Adenovirus-Konstruktion in E. coli wurde gemäß den Literaturangaben von He et al. (1998) und Chartier et al. (1996) durchgeführt.
Erzeugung von Protease exprimierenden Zelllinien
293-tTA-Zelllinien wurden durch Kotransfektion von pTR5/PS-DC/GFP und pTKNeo erzeugt. 293-rtTA-PS-Klone wurde auf ähnliche Weise durch Kontransfektion des gleichen Plasmids mit p3'SS (Stratagene) in 293S-rtTA erzeugt. Transfektionen wurden durch das optimierte Calciumphosphat-Fällungsverfahren (Jordan et al., Nucleic Acids Res., Bd. 15, 24 (4) (1996), S. 596–601) erreicht. Für tTA und rtTA handelte es sich bei den Selektionsarzneistoffen um G418 bzw. um Hygromycin (Sigma Chemical).
Selektion von rekombinanten Zellklonen
Nach Kotransfektion und Selektion wurden Klone von 293S-Zellen, die das GFP aus der dicistronischen Kassette exprimieren, durch Screening auf Expression des GFP durch Fließzytometrieanalyse und Zellsortierung selektiert. Die Fließzytometrie wurde unter Anwendung eines EPICS-Profile II-Geräts (Coulter, Hialeah, FL, USA) mit einem 15 mW Argon-Ionenlaser durchgeführt. Die Zellsortierung wurde an einem EPICS V (Modell 752, Coulter)-Multiparameter-Laser-Fließzytometer und Zellsortiergerät unter Verwendung des Auto-clone-Systems (automatisierte Zellabscheidungen in Mehrfachvertiefungen) durchgeführt. Vor der Selektion und Sortierung wurde die Expression sowohl von GFP als auch von Protease durch Zugabe (rtTA) oder Suppression (tTA) von Doxycyclin induziert. Für die Analyse der GFP-Expression wurden Zellen steril gewonnen und in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) durch Zentrifugation eingeengt (1 × 10⁶ Zellen/ml). Die am stärksten fluoreszierenden Zellen wurden gewonnen und klonal auf Platten mit 96 Vertiefungen verteilt.
Analyse der rekombinanten Proteinexpression
Die Expression des GFP wurde periodisch durch fließzytometrische Analyse geprüft, während die Expression der Protease durch Western-Blotting getestet wurde. Die Zellen wurden in PBS gewaschen, zentrifugiert und eingefroren. Eine Lysis wurde in 100 mM Tris-HCl (pH-Wert 6,9), 10% Glycerin und 2% SDS durchgeführt und hochmolekulare DNA wurde durch Ultraschallbehandlung aufgebrochen. Vor dem Test wurde der Gesamtproteingehalt der Extrakte unter Verwendung des DC Protein-Testkits (Biorad) titriert. Für die Elektrophorese wurden die Proben in Laemmli-Puffer (Laemmli et al., J. Mol. Biol., Bd. 88 (1974), S. 749–165 verdünnt und 5 Minuten bis zum Sieden erwärmt. Eine geschätzte Gesamtproteinmenge von 20 μg wurde pro Vertiefung in 14% Acrylamid:Bisacrylamid (30:1)-Gelen aufgesetzt. Nach der Elektrophorese wurden die Proteine auf Nitrocellulosemembranen übertragen, die anschließend über Nacht bei 4°C mit PBS mit einem Gehalt an 5% fettfreier Trockenmilch und 0,1% Tween 20 blockiert wurden. Der Kaninchen-anti-Protease-Antikörper wurde im gleichen Puffer, der aber 0,2% Tween 20 enthielt, 1:20 000 verdünnt. Als interne Kontrolle wurde ein monoklonaler anti-Actin-Antikörper in einer Verdünnung von 1:10 000 verwendet. Eine Inkubation wurde über Nacht bei 4°C durchgeführt. Konjugate wurden in einer Verdünnung von 1:10 000 im gleichen Puffer 1 Stunde bei Raumtemperatur verwendet. Der Nachweis wurde unter Verwendung des ECL-Chemilumineszenz-Kits (Amersham) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.
Beispiele
Erzeugung und Isolierung von mit dem Ad2-Protease-Gen transformierten 293-Zelllinien
Zelllinien wurden durch Kotransfektion und Selektion unter Verwendung geeigneter Mittel gemäß der zusammenfassenden Darstellung in Tabelle 1 erzeugt.
Tabelle 1 Analyse der durch Transformation von 293-Zellen mit Protease erhaltenen Klone
293-tTA-Zellen wurden mit pTR5/PS-DC/GFP und pTKNeo kotransfiziert, während 293-rtTA mit dem gleichen Plasmid und mit p3'SS kotransfiziert wurde. Nach einer 48-stündigen Behandlung wurden transfizierte Zellen einer 3-wöchigen Selektion entweder durch G418 (500 μg/ml) für 293-tTA oder durch Hygromycin (150 μg/ml) für 293-rtTA unterworfen. Während dieser Zeitspanne wurden 2-mal wöchentlich frisches Medium und Arzneistoff zu den Zellen gegeben. Während des gesamten Selektionsvorgangs wurde die GFP-Expression an Aliquotmengen durch fließzytometrische Analyse überwacht. Die Zellen wurden sodann unter Verwendung des automatischen Mehrfachvertiefungs-Zellabscheidungssystems sortiert und die klonale Verteilung wurde visuell geprüft. Anschließend wurde die Expression bestimmt und nur homogene Klone (Prüfung aufgrund des Auftretens eines einzigen Peaks der fluoreszierenden Zellen) wurden selektiert. Die Ergebnisse der GFP-Expression von stabilen Klonen sind in Tabelle 2 zusammengestellt.
Tabelle 2 GFP-Expression und Induktionswirkungsgrad in 293-tTA-PS und 293-rtTA-PS
Selektierte Zelllinienklone wurden auf die Expression des GFP (basal und induziert) durch fließzytometrische Analyse getestet. FI: Fluoreszenzindex, berechnet als prozentualer Anteil von Zellen, die GFP exprimieren, aufgrund des durchschnittlichen Fluoreszenzwerts; AUS: GFP-Expression ohne Induktion (50 ng Doxyclin pro ml für tTA); AN: GFP-Expression nach Induktion (1 μg pro ml für rtTA). Der Induktionsfaktor wurde als Verhältnis zwischen dem FI-Wert im AN-Zustand und dem FI-Wert im AUS-Zustand berechnet.
Von sämtlichen getesteten Klonen wurden drei 293S-tTA-PS- und drei 293S-rtTA-PS-Klone selektiert. Der Induktionswirkungsgrad wurde durch Vergleich der Produkte aus der durchschnittlichen Fluoreszenz von einer Zelle und dem prozentualen Anteil von fluoreszierenden Zellen (Fluoreszenzindices: FI) gemessen. Die Induktionsfaktoren lagen im Bereich von 7 bis 106, wobei es sich um den Bereich handelt, der üblicherweise mit Tetracyclin-regulierten Expressionskassetten beobachtet wird.
Proteaseexpression in 293-tTA-PS und 293-rtTA-PS
Von den auf die Proteaseexpression getesteten Klonen werden drei Klone von 293-tTA-PS und 293-rtTA-PS vorgestellt (1A). Die Expression wurde mit einem polyklonalen Kaninchen-Antiserum gegen E. coli-exprimiertes Protein nachgewiesen. Die Ergebnisse zeigen, dass das exprimierte Protein das gleiche elektrophoretische Muster wie das endogene Adenovirus-Protein aufweist und dass die Expression bei sämtlichen getesteten Klonen von der Induktion abhängt. Die letztgenannte Feststellung wurde durch die interne Kontrolle (zelluläres Actin) geprüft, was zeigt, dass die gleiche Menge an Proteinextrakt pro Vertiefung aufgesetzt worden ist. Ein Test sämtlicher erhaltener Klone von rtTA ergab keine Beobachtung von höheren Expressionsgraden, als sie mit tTA-Klonen erreicht wurden. Der Expressionsgrad von Protease in sämtlichen selektierten Klonen war gleich groß oder höher als bei der nativen Adenovirus-Protease (1A, Bahn 3). Um dies zu prüfen, wurden 293-Zellen mit einem MOI-Wert von 10 pfu mit AdCMV5-GFP (Massie et al., Cytotechnology, im Druck (1999)) infiziert und Proteinextrakte wurden nach 48 Stunden p.i. hergestellt. Ein ähnlicher Expressionsgrad wurde mit den von 293-tTA- und 293-rtTA-Zellen abgeleiteten Klonen erreicht.
Biologische Aktivität der durch die Zelllinien exprimierten Protease
Zur Untersuchung der biologischen Aktivität von Ad2-Protease in transformierten Zelllinien wurde die Komplementierung der temperaturempfindlichen Ad2ts1 und von zwei neuartigen, in Bezug auf Protease deletierten Mutanten durch die Zelllinien geprüft. Virale Ad2ts1-Teilchen, die bei 39°C hergestellt worden sind, enthalten eine funktionell mangelhafte Protease. Sie wurden zur Ermittlung der Komplementierung verwendet. Die Ergebnisse von Einstufen-Wachstumskurven im 293- und 293-PS-Zelllinien (tTA und rtTA) für Ad2ts1 sind in Tabelle 3 und die für die beiden neuartigen, in Bezug auf Protease deletierten Mutanten in Tabelle 4 zusammengestellt.
Tabelle 3 Ausbeute an dI309 und Ad2ts1 aus Einstufen-Wachstumskurven in verschiedenen, von 293 abgeleiteten Zelllinien
Zellen wurden mit einer Muitiplizität von zwei plaquebildenden Einheiten (pfu) pro Zelle infiziert. 2–3 Tage später bei 39°C oder 5 Tage später bei 32°C wurden die Zellen geerntet und 3-mal eingefroren und aufgetaut. Die anschließend hergestellten Extrakte wurden titriert. Die Ergebnisse eines typischen Experiments werden hier vorgelegt. Die Titer wurden als pfu-Wert an 293-Zellen bei 33°C bestimmt. NI: nicht-induzierte Expression; I: induzierte Expression. Bei 33°C durchgeführte Experimente wurden als Kontrollen mitgeführt.
Während Ad2ts1 5 × 10³ pfu bzw. 2 × 10³ pfu bei 39°C in 293-tTA- bzw. 293-rtTA-Zelllinien ergab, wurde die Komplementierung durch Erreichen von Titern, die ähnlich groß wie die der dI309-Mutante in Protease exprimierenden Zelllinien waren, nachgewiesen. Die Induktion hatte den Effekt von geringfügig sinkenden Titern, wobei aber überraschenderweise die basale Expression des Gens aus 293-tTA-PS-15 und 293-rtTA-PS-7 ausreichend war, um die Ad2ts1-Mutante zu komplementieren. Es gab keinen Unterschied zwischen tTA- und rtTA-komplementierenden Zelllinien.
Um ferner die biologische Aktivität von Zelllinien nachzuweisen und die neuartigen Ad5-Mutanten zu charakterisieren, wurden Einstufen-Wachstumskurven in 293-tTA/rtTA- und 293-tTA/rtTA-PS-Zelllinien ermittelt (Tabelle 4).
Tabelle 4 Ausbeute an Ad5CMVLacZ-CMVGFP-ΔPS und an Ad5-ΔPS mit entsprechenden Kontrollen aus Einstufen-Wachstumskurven in verschiedenen, von 293 abgeleiteten Zelllinien
Die Zellen wurden mit einer Multiplizität von zwei plaquebildenden Einheiten (pfu) pro Zelle infiziert. 2–3 Tage später wurden die Zellen geerntet, 3-mal in PBS gewaschen und 3-mal eingefroren/aufgetaut. Die anschließend erhaltenen Extrakte wurden titriert. Die Ergebnisse eines typischen Experiments werden hier vorgestellt. Die Titer wurden als pfu-Werte an 293-Zellen bestimmt. NI: nicht-induzierte Expression; I: induzierte Expression.
Die biologische Aktivität wurde auch durch die Fähigkeit des 293-rtTA-PS-7-Klons zur Erzeugung der in Bezug auf Protease deletierten Mutanten Ad5CMVLacZ-CMVGFP-ΔPS und Ad5-ΔPS nach Transfektion von rekombinanter DNA nachgewiesen. Erwartungsgemäß waren zwar die in Bezug auf Protease deletierten Mutanten nicht zum Wachstum in 293-rtTA befähigt, jedoch ermöglichte eine Komplementierung durch Zelllinien die Wiederherstellung von Virustitern, die nahe bei den Kontrollwerten lagen (bei den Kontrollen handelte es sich genau um die gleichen Viren wie bei den Mutanten, mit Ausnahme der Anwesenheit des Protease-Gens). Bemerkenswert ist, dass für Ad2ts1 die basale Proteaseexpression aus beiden tTA- und rtTA-komplementierenden Zelllinien ausreicht, um die in Bezug auf die Protease deletierten Mutanten zu komplementieren. Ferner ist es bemerkenswert, dass im induzierten Zustand der Expression der Protease die Virusausbeuten geringfügig vermindert waren.
Wachstumsgeschwindigkeit von 293-PS-Zelllinien
Eine visuelle Prüfung von 293-PS-Zelllinien zeigte, dass nach Induktion der Expression die Zellen keinen signifikant unterschiedlichen Phänotyp aufwiesen. Um den Einfluss der Induktion auf Zelllinien weiter zu untersuchen, wurde die Lebensfähigkeit von Zellen durch Zählung von lebenden Zellen (entweder induziert oder nicht) nach Färbung mit Trypanblau täglich von D0 bis D5 gemessen. Für 293-rtTA-PS-Zellen ergab sich kein Unterschied zwischen induzierten oder nicht-induzierten Zellen. Für einen Klon von 293-tTA-PS (Klon 2) sind die Ergebnisse in 4 dargestellt. Es ist ersichtlich, dass die Expression der Protease keinen signifikanten nachteiligen Einfluss auf das Zellwachstum ausübte. Ferner ist es aufgrund der Tatsache, dass kein Einfluss während einer Zeitspanne (24–48 Stunden), die mit der Erzeugung einer rekombinanten Adenovirus-Mutante kompatibel ist, nachgewiesen werden konnte, erwiesen, dass diese Zelllinien sich für die Erzeugung und Expansion von Mutanten ohne Protease eignen. Die Expression des Gens zeigte keine toxische Wirkung, jedoch eine recht geringe Beeinträchtigung des Zellwachstums: wenn die Zellen im induzierten Zustand der Proteaseexpression gehalten wurden, wuchsen die Zellen langsamer. Aufgrund der Tatsache, dass eine Überexpression der Protease in geringem Maße das Zellwachstum beeinträchtigen konnte und die Virusausbeuten verringerte, ist die Kontrolle von deren Expression mit einem regulierbaren Promotor von entscheidender Bedeutung sowohl für die Gewinnung der besten Protease- komplementierenden Zelllinien sowie zur Gewährleistung einer maximalen Erzeugung von in Bezug auf Protease deletiertem AdV.
Stabilität von 293-PS-Zelllinien
Um die Stabilität von selektierten Klonen zu prüfen, wurden Zelllinien, die 2 Monate ohne Selektionsarzneistoff gehalten worden waren, auf die Expression des GFP und der Protease getestet. Beide Proteine wurden in ähnlichen Konzentrationen wie bei Zellen einer frühen Passage exprimiert, wie durch fließzytometrische Analyse bzw. durch Immunoblot-Analyse (Daten nicht aufgeführt) festgestellt wurde. Keine Veränderung der Arzneistoffempfindlichkeit wurde nach 2-monatigen Passagen festgestellt, noch waren die Protease-Expressionsgrade modifiziert.
Transfizierbarkeit von 293-PS-Zelllinien
Die Klone 293-tTA-PS-15 und 293-rtTA-PS-7 wurden auf ihre Fähigkeit zur Unterstützung der Bildung von viralen Plaques nach Transfektion mit AdCMV-LacZ-DNA analysiert. Beide Klone ergaben ebenso viele virale Plaques wie parentale 293-tTA- und 293-rtTA-Zellen. 293-PS-Zelllinien wurden somit in sehr wirksamer Weise transfiziert und anschließend für die Erzeugung von in Bezug auf Protease deletierten Mutanten verwendet.
Einfluss einer Adenovirus-Infektion auf die Proteinexpression
Um den Einfluss der Expression von IVa2-Produkten (Lutz et al., J. Virol., Bd. 70 (1996), S. 1396–1405) auf den MLP-Enhancer, der in unserer Konstruktion enthalten ist, zu untersuchen, wurden Zelllinien in einem Dreifachversuch mit einem MOI-Wert von 1 pfu infiziert. Die GFP-Expression wurde in induzierten und nicht-induzierten Zellen verfolgt. Zwischen beiden Ansätzen konnte kein signifikanter Unterschied nachgewiesen werden.
Erzeugung von in Bezug auf Protease deletierten Mutanten
Die Plasmidklonierungen sind in 2 zusammengestellt. Für die Konstruktion von in Bezug auf Protease deletierten Mutanten von Ad5 wurde zunächst eine für eine homologe Rekombination ausreichende Extension in das pDE3-Plasmid eingeführt, indem das 6145 bp-Fragment, das sich aus dem RsrII/XhoI-Verdau des Ad5-Genoms ergab, in die einzigen SalI- und XhoI-Stellen ligiert wurde. Zur Klonierung dieses Inserts und zur Erzeugung des pDE3-ext-Plasmids wurden zunächst RsrII (aus dem Insert) und SalI (aus pDE3) einer T4-DNA-Polymerase-Reparatur unterworfen. Die Protease-Deletion wurde gentechnisch durch PCR durchgeführt, um ein strangaufwärtiges 171 bp-Fragment (Vorwärtsprimer: gtcgacCATGGACGAGCCCACCCTTCT, Rückwärtsprimer: ggatccGGCGGCAGCTGTTGTTGATGT) und ein strangabwärtiges 2448 bp-Fragment (Vorwärtsprimer: agatctAAATAATGTACTAGAGACACT, Rückwärtsprimer: ctcgagTTCCACCAACACTCCAGAGTG) zu synthetisieren (für Klonierungszwecke hinzugefügte Restriktionsstellen sind in Kleinbuchstaben dargestellt). Diese Fragmente wurden im pDE3-Plasmid an den SalI- und XhoI-Stellen des Plasmids kloniert, wobei die BamHI/BglII-Ligationsverträglichkeit ausgenützt wurde. Das SfiI/BamHI-Fragment aus diesem Plasmid wurde in das pSL1190-Plasmid (Pharmacia) subkloniert und sequenziert. Anschließend wurde es in das pDE3-ext-Plasmid an den gleichen Stellen kloniert, wodurch das pDE3-ext-ΔPS-Plasmid erzeugt wurde. Um in Bezug auf Protease deletierte Ad-Mutanten zu erzeugen, wurde eine Rekombination in E. coli gewählt (3). Eine E1/E3-deletierte Mutante, nämlich Ad5CMVLacZ-CMVGFP-ΔPS, wurde im Plasmid durch Kotransfektion in E. coli des NdeI/XhoI-Fragments aus pDE3-ext-ΔPS mit SgfI-verdautem pAdEasy1-βgal-GFP konstruiert. Eine Mutante, die nur in Bezug auf die Protease deletiert war (Ad5-ΔPS), wurde auf die gleiche Weise aus dem pTG3602-Plasmid erzeugt. 7 μg der PacI-verdauten Plasmid-DNA sowohl aus pAdEasy1-βgal-GFP als auch aus pTG3602-ΔPS wurden in den 293-PS-rtTA-7-Zelllinienklon transfiziert, um rekombinante, Protease-deletierte Mutanten zu erzeugen. Die gleiche Menge an rekombinanten, linearisierten Plasmid-DNAs wurde ferner in 293- und 293-rtTA-Zellen als Kontrollen transfiziert. Erwartungsgemäß ergab dieses Experiment keine viralen Plaques. Nach 10 bis 14 Tagen wurden virale Plaques in 293-PS-rtTA beobachtet. Da rekombinante Adenoviren in E. coli erzeugt worden waren, war keine weitere Klonierung von Plaques erforderlich (He et al., 1998; Chartier et al., 1996). Die gesamte Monolayer wurde abgeschabt und Virus wurde durch Einfrier-Auftau-Zyklen aus den Zellen freigesetzt. Sämtliche viralen Plaques von rekombinantem Virus zeigten keine phänotypischen Unterschiede im Vergleich zum Wildtyp-Virus.
Fähigkeit der Ad5-ΔPS-Mutante, die nicht in Bezug auf E1 deletiert ist, zur Durchführung einer einzigen Replikationsrunde in nicht-komplementierenden Zelllinien
Um die Fähigkeit der in Bezug auf die Protease und nicht in Bezug auf E1 deletierten Mutante (Ad5-ΔPS) zur Durchführung einer einzigen Replikationsrunde in nicht-komplementierenden Zelllinien nachzuweisen, wurden A549 Zellen mit Wildtyp-, Ad5-ΔPS, AdΔE1.E3 und Ad5CMVLacZ-CMVGFP-ΔPS-Viren inokuliert. Ein Vergleich der viralen Proteinerzeugung (6) und der viralen Ausbeuten (7) der verschiedenen Viren zeigt, dass nur die in Bezug auf Protease deletierte Mutante und nicht die in Bezug auf E1 deletierte Mutante dazu befähigt ist, eine einzige Replikationsrunde in nicht-komplementierenden Zellen durchzuführen.
Die nachstehend angegebene Zelllinie wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, am 3. Dezember 1998 hinterlegt. Sie erhielt die folgende Hinterlegungsnummer:
293-rtTA.PS.7-Zelllinie: ATCC CRL-12595.

Claims

Zelllinie, die befähigt ist zum Beherbergen und Komplementieren in trans eines Adenovirus-Vektors, dessen Replikation durch Deletion eines einzelnen Gens blockiert ist, wobei das einzelne Gen Adenovirus-Protease ist, wobei die Zelllinie DNA enthält, welche die Adenovirus-Protease exprimiert, wobei die adenovirale Protease exprimierende DNA aus einer Expressionskassette exprimiert wird, welche einen regulierbaren Promotor umfasst.
Zelllinie nach Anspruch 1, worin der regulierbare Promotor ein auf Tetracyclin-Derivate ansprechender Promotor ist.
Zelllinie nach Anspruch 2, worin der auf Tetracyclin-Derivate ansprechende Promotor ein induzierbarer Promotor ist.
Zelllinie nach Anspruch 3, worin der durch Tetracyclin-Derivate induzierbare Promotor der rtTA-abhängige Minimal-Promotor ist.
Zelllinie nach Anspruch 2, worin der auf Tetracyclin-Derivate ansprechende Promotor ein reprimierbarer Promotor ist.
Zelllinie nach Anspruch 5, worin der durch Tetracyclin-Derivate reprimierbare Promotor der tTA-abhängige Minimal-Promotor ist.
Zelllinie nach Anspruch 1, worin die Expressionskassette ferner DNA umfasst, welche für ein fluoreszierendes Protein kodiert.
Zelllinie nach Anspruch 7, worin die Expressionskassette eine dicistronische Expressionskassette ist.
Zelllinie nach Anspruch 7, worin das fluoreszierende Protein das grün fluoreszierende Protein (GFP) von Aquorea victoria ist.
Zelllinie nach Anspruch 1, worin die Zellen Säugerzellen sind.
Zelllinie nach Anspruch 10, worin die Säugerzellen Humanzellen sind.
Zelllinie nach Anspruch 11, worin die Humanzellen 293-Zelllinien-Derivate sind.
Zelllinie nach Anspruch 12, hinterlegt bei ATCC unter der Hinterlegungsnummer ATCC CRL-12595.
Verfahren zur Herstellung einer Zelllinie, die befähigt ist zum Beherbergen und Komplementieren in trans eines Adenovirus-Vektors, dessen Replikation durch Deletion eines einzelnen Gens blockiert ist, wobei das Gen Adenovirus-Protease ist, wobei das Verfahren umfasst: – Transfizieren von Zellen, die befähigt sind zum Beherbergen eines Adenovirus mit Stücken von DNA, welche für die Adenovirus-Protease kodiert, – Inkubieren der Zellen und – Selektieren der Zellen, welche die Adenovirus-Protease exprimieren, wobei die DNA, welche die Adenovirus-Protease exprimiert, aus einer Expressionskassette exprimiert wird, welche einen regulierbaren Promotor umfasst.
Verfahren nach Anspruch 14, ferner umfassend die Cotransfektion der Stücke von DNA, welche für die adenovirale Protease kodiert, mit Stücken von DNA, welche für einen Selektionsfaktor kodiert, und die Selektion von Zellen, welche den Selektionsfaktor exprimieren.
Verfahren nach Anspruch 14, worin die Zellen, die zum Beherbergen eines Adenovirus befähigt sind, dessen Gen für Adenovirus-Protease deletiert ist, Derivate von 293-Zellen sind.
Verfahren nach Anspruch 14, worin die Stücke von DNA, welche für adenovirale Protease kodiert, innerhalb eines Plasmids enthalten sind.
Verfahren nach Anspruch 17, worin das Plasmid pTR5/PS-DC/GFP-Plasmid ist, welches einen Tetracyclin-regulierbaren (TR)-Promotor in einer dicistronischen Kassette (DC) mit dem grün fluoreszierenden Protein (GFP) und dem Protease (P5)-Gen enthält.
Verfahren nach Anspruch 15, worin die Stücke von DNA, welche für einen Selektionsfaktor kodiert, innerhalb eines Plasmids enthalten sind.
Verfahren nach Anspruch 19, worin die für einen Selektionsfaktor kodierende DNA das Gen für Resistenz gegenüber Geneticin (G418-Antibiotikum) ist.
Verfahren nach Anspruch 19, worin das Plasmid das pTKNeo-Plasmid ist.
Verfahren nach Anspruch 19, worin die für einen Selektionsfaktor kodierende DNA das Gen für Hygromycin-Resistenz ist.
Verfahren nach Anspruch 19, worin das Plasmid das p3'SS-Plasmid (Stratagene) ist.
Verfahren nach Anspruch 15, worin die Stücke von DNA, welche für die Adenovirus-Protease kodiert, und die Stücke von DNA, welche für einen Selektionsfaktor kodiert, mittels der Calciumphosphat-Präzipitations-Methode cotransfiziert werden.
Verfahren nach Anspruch 14, worin die Stücke von DNA, welche für die Adenovirus-Protease kodiert, ferner ein Reporter-Gen umfassen.
Verfahren nach Anspruch 25, worin das Reporter-Gen das Gen eines fluoreszierenden Proteins ist.
Verfahren nach Anspruch 26, worin das fluoreszierende Protein das grün fluoreszierende Protein (GFP) von Aquorea victoria ist.
Verfahren nach Anspruch 27, worin Zellen, welche das GFP-Reporter-Gen exprimieren, durch automatisiertes Sortieren von fluoreszierenden Zellen selektiert werden.
Adenovirus-Vektor, dessen Replikation durch Deletion eines einzelnen Gens blockiert ist, worin das Gen Adenovirus-Protease ist.
Adenovirus-Vektor nach Anspruch 29, ferner umfassend mindestens ein exogenes Gen.
Adenovirus-Vektor nach Anspruch 30, worin das exogene Gen von einer Expressionskassette exprimiert wird, welche eine regulierbaren Promotor umfasst.
Adenovirus-Vektor nach Anspruch 31, worin der regulierbare Promotor ein auf Tetracyclin-Derivate ansprechender Promotor ist.
Adenovirus-Vektor nach Anspruch 32, worin der auf Tetracyclin-Derivate ansprechende Promotor ein induzierbarer Promotor ist.
Adenovirus-Vektor nach Anspruch 33, worin der durch Tetracyclin-Derivate induzierbare Promotor der rtTA-abhängige Minimal-Promotor ist.
Adenovirus-Vektor nach Anspruch 32, worin der auf Tetracyclin-Derivate ansprechende Promotor ein reprimierbarer Promotor ist.
Adenovirus-Vektor nach Anspruch 35, worin der durch Tetracyclin-Derivate reprimierbare Promotor der tTA-abhängige Minimal-Promotor ist.
Gentransfer-Vektor, der befähigt ist zum Transfer eines exogenen Gens in eine Target-Zelle, umfassend einen Adenovirus-Vektor, dessen Replikation durch Deletion eines einzelnen Gens blockiert ist, wobei das Gen Adenovirus-Protease ist, wobei der Adenovirus-Vektor ferner mindestens ein exogenes Gen umfasst, zur therapeutischen Verwendung, wobei die Therapie in dem Transfer eines exogenen Gens in eine Target-Zelle besteht.
Gentransfer-Vektor nach Anspruch 37, worin der Gentransfer-Vektor ferner irgendeinen der in den Ansprüchen 31 bis 36 definierten Promotoren umfasst.