DE60026337T2

DE60026337T2 - Verfahren zur diagnose von leberkrankheit unter verwendung von biochemischen merkmalen

Info

Publication number: DE60026337T2
Application number: DE60026337T
Authority: DE
Inventors: Thierry c/o Grp. Hosp. Pitie-Salpêtr POYNARD
Original assignee: Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP
Current assignee: Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP
Priority date: 2000-08-21
Filing date: 2000-10-24
Publication date: 2007-01-11
Anticipated expiration: 2020-10-25
Also published as: CA2420089C; EP1311857A1; EP1311857B1; JP2004507740A; CN100416273C; IL154566A0; US20040039553A1; ATE319093T1; CN1468375A; ES2259291T3; DE60026337D1; WO2002016949A1; US7225080B2; CA2420089A1; AU7812800A; AU2000278128B2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung bezieht sich auf ein neues Diagnoseverfahren zum Nachweisen des Ausmaßes einer entzündlichen, fibrotischen oder krebsartigen Erkrankung bei einem Patienten, insbesondere Leberfibrose, insbesondere bei einem Patienten, welcher mit dem Hepatitis C-Virus infiziert ist, durch Verwendung der Serumkonzentration von leicht nachweisbaren biologischen Markern. Die Erfindung bezieht sich auch auf Diagnosekits für die Durchführung des Verfahrens.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Für die Behandlung von Patienten, die durch das Hepatitis C-Virus (HCV) infiziert sind, wird die Leberbiopsie insbesondere für die Bestimmung des Stadiums („Staging") der Fibrose (1–4) als obligatorisch angesehen. Für Patienten und allgemeine praktizierende Ärzte kann dies als eine aggressive Maßnahme angesehen werden (5–6). Zahlreiche Studien haben signifikante, der Vorhersage dienende Werte („predictive values") von mehreren Markern für die Diagnose von Zirrhose (6–15, 41–43), aber keinen für die Diagnose von früheren Stadien, wie wenige Septen (Beginn einer verbrückenden Fibrose („bridging fibrosis")), prospektiv in einer großen Population, die nur durch das HCV-Virus infiziert ist, gezeigt.
Es ist nichtsdestoweniger wichtig, in der Lage zu sein, diese frühen Stadien bei der Entwicklung einer Leberpathologie nachzuweisen, um die Patientenbehandlung und die Nachbetreuung der Erkrankung zu verbessern. Da die Leberbiopsie nach wie vor eine invasive Prozedur ist, könnte es vorteilhaft sein, über einen schnellen und leicht auszuführenden Test zu verfügen, der einen guten, der Vorhersage dienenden Wert („predictive value") des Ausmaßes der Fibrose bei dem Patienten liefern könnte.
Nach einer Infektion durch das Hepatitis C-Virus kann die Entwicklung der Erkrankung zu einer Fibrose und später zu einer Zirrhose führen. Die Leberbiopsie erlaubt die Bestimmung des Stadiums der Fibrose, aber auch des Vorliegens von nekro-inflammatorischen Leberläsionen. Die Intensität und Aktivität von solchen Läsionen werden ergänzend zu dem Ausmaß der Fibrose durch Ärzte als ein wichtiger Faktor für die Diagnose und Prognose der Entwicklung der Erkrankung, und um die Art der zu verabreichenden Behandlung zu bestimmen, anerkannt.
Es gibt dementsprechend einen Bedarf, ein Diagnoseverfahren zu entwickeln, das einen guten der Vorhersage dienenden Wert („predictive value") bezüglich des Vorliegens (oder des Feh lens) einer Fibrose und/oder von Läsionen bei einem Patienten liefern würde und das verlässlich genug wäre, um die Notwendigkeit von Leberbiopsien zu verringern.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung stellt ein Diagnoseverfahren bereit, welches prospektiv den der Vorhersage dienenden Wert („predictive value") einer Kombination von einfachen biochemischen Serummarkern für die Diagnose einer signifikanten Fibrose (von wenige Septen bis Zirrhose) und/oder von nekro-inflammatorischen Leberläsionen bestimmt. Lägen hohe positive der Vorhersage dienende Werte (Vorhersage einer signifikanten Fibrose) oder negative der Vorhersage dienende Werte in Reichweite, könnte die Anzahl von Biopsie-Indikationen verringert werden. Dies könnte für Patienten und die Gesellschaft nützlich sein, um die Kosten und das Risiko von Biopsien, speziell Leberbiopsien, zu verringern (6).
BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1: ROC-Kurven der Fibrosemarker-Funktion bei Kombination von sechs (α2-Makroglobulin, α2-Mikroglobulin, gesamtes Bilirubin, γ-Globulin, apoA1 und GGT) oder zehn biochemischen Faktoren (gleiche plus Albumin, α1-Mikroglobulin, β-Globulin und ALT) und des Alters und Geschlechts. Die Flächen unter der Kurve waren nicht unterschiedlich: 0,853 ± 0,02 bzw. 0,851 ± 0,02.
2: Streuungsdiagramm des sechs Marker-Fibrose-Scores (reichend von 0,00 bis 1,00) gemäß dem Fibrose-Stadium.
3: ROC-Kurven der Fibrosemarker-Funktion bei Kombination von fünf (α2-Makroglobulin, Haptoglobin, gesamtes Bilirubin, ApoA1 und GGT), sechs (α2-Makroglobulin, α2-Mikroglobulin, gesamtes Bilirubin, γ-Globulin, apoA1 und GGT) oder zehn biochemischen Faktoren (gleiche plus Albumin, α1-Mikroglobulin, β-Globulin und ALT) und des Alters und Geschlechts. Die Flächen unter der Kurve waren nicht signifikant unterschiedlich: 0,837 ± 0,02, 0,847 ± 0,02 bzw. 0,851 ± 0,02.
4: Fibrose-Score gemäß dem Fibrose-Stadium.
4a: 6 Marker-Funktion F0 n = 56, Median = 0,10; F1 n = 145, Median = 0,22; F2 n = 68, Median = 0,41; F3 n = 28, Median = 0,66; F4 n = 42, Median = 0,89.
4b: 5 Marker-Funktion F0 n = 55, Median = 0,14; F1 n = 139, Median = 0,21; F2 n = 64, Median = 0,43; F3 n = 26, Median = 0,73; F4 n = 41, Median = 0,85.
Die Ober- und Unterkante des Kastens sind die 25. und 75. Perzentile. Die Länge des Kastens ist dementsprechend der Interquartilbereich. D.h., der Kasten repräsentiert die mittleren 50% der Daten. Durch die Mitte des Kastens ist bei dem Medianwert (dem 50. Perzentil) eine Gerade eingezeichnet. Der obere angrenzende Wert ist die größte Beobachtung, die geringer als oder gleich dem 75. Perzentil plus dem 1,5-fachen Interquartilbereich ist. Der untere angrenzende Wert ist die kleinste Beobachtung, die höher als oder gleich dem 25. Perzentil minus dem 1,5-fachen Interquartilbereich ist. Eine Varianzanalyse zeigt signifikante Unterschiede zwischen allen Stadien („Bonferroni all-pairwise Multiple Comparison"-Test; p < 0,001).
5: α2-Globuline, α2-Makroglobulin und Haptoglobin gemäß dem Fibrose-Stadium.
5a: Für α2-Globulin-Werte lagen die einzigen signifikanten Unterschiede zwischen Stadium 4 gegenüber Stadium 1 und Stadium 3 („Bonferroni all-pairwise Multiple Comparison"-Test; p = 0,01).
5b: Für α2-Makroglobulin gab es einen signifikanten Unterschied zwischen Stadium 0 und 1-Werten, die niedriger waren als bei den Stadien 2, 3 und 4 („Bonferroni all-pairwise Multiple Comparison"-Test; p < 0,001). Die Werte des Stadiums 2 waren niedriger als die Werte der Stadien 3 und 4 („Bonferroni all-pairwise Multiple Comparison"-Test; p < 0,001). Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen Stadium 0 und 1 und zwischen Stadium 3 und 4.
5c: Für Haptoglobin gab es einen signifikanten Unterschied zwischen Stadium 1-Werten, die höher waren als bei den Stadien 2, 3 und 4 („Bonferroni all-pairwise Multiple Comparison"-Test; p < 0,001). Werte für Stadium 4 waren niedriger als Werte des Stadiums 0, 1 und 2 („Bonferroni all-pairwise Multiple Comparison"-Test; p < 0,001). Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen Stadium 0 und 1 und zwischen Stadium 3 und 4.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die Erfindung bezieht sich dementsprechend auf ein in vitro-Verfahren zur Diagnose einer entzündlichen, einer fibrotischen oder einer krebsartigen Erkrankung bei einem Patienten, welches die Schritte umfasst:

a) Messen der Werte von biochemischen Markern im Serum des Patienten,
b) Kombinieren der Werte durch eine logistische Funktion, welche diese Marker umfasst, und
c) Analysieren des Endwerts der logistischen Funktion, um das Vorliegen einer Leberfibrose und/oder von nekro-inflammatorischen Leberläsionen bei dem Patienten zu bestimmen.

Die biochemischen Marker können auch im Plasma der Patienten bestimmt werden und das Verfahren kann als in vitro angesehen werden, wenn ein optionaler erster Schritt (Gewinnen von Serum oder Plasma von Patienten) nicht verwendet wird.
Das Verfahren der Erfindung ist insbesondere perfekt geeignet für die Diagnose von Leberfibrose und/oder des Vorliegens von nekro-inflammatorischen Leberläsionen bei dem Patienten. Es kann auch für die Diagnose einer entzündlichen und/oder fibrotischen Erkrankung in den Lungen oder Nieren von Patienten ausgeführt werden.
Die logistische Funktion wird erhalten durch das folgende Verfahren:

i) Einteilung der Patienten in unterschiedliche Gruppen je nach dem Ausmaß ihrer Erkrankung;
ii) Identifizierung von Faktoren, die sich zwischen diesen Gruppen signifikant unterscheiden, durch eindimensionale Analyse;
iii) logistische Regressionsanalyse, um den unabhängigen Unterscheidungswert von Markern für die Diagnose einer Fibrose und/oder von nekro-inflammatorischen Leberläsionen zu bestimmen;
iv) Konstruktion der logistischen Funktion durch Kombination dieser identifizierten unabhängigen Faktoren (Konstruktion eines Index).

Per definitionem war der beste Index („Fibrose-Score") in Hinblick auf eine Unterscheidung die logistische Regressionsfunktion, welche die unabhängigen Faktoren kombiniert.
Die logistische Funktion wird erhalten durch Kombinieren der relativen Gewichtung von jedem Parameter, wie individuell bei der logistischen Regression bestimmt, mit einem negativen Vorzeichen, wenn die Marker eine negative Korrelation mit dem Fibrose-Stadium aufweisen. Logarithmen werden für Marker verwendet, deren Werte einen sehr breiten Bereich aufweisen.
Die Qualität der logistischen Funktion wird mit Hilfe einer ROC-Kurve, die abhängig von dem für die Diagnose gewünschten Schwellenwert erhalten wird, analysiert. Die Art und Weise der Erstellung der ROC-Kurve wird in den Beispielen beschrieben. Im Rahmen der Erfindung war die Einteilung der Patienten das Vorliegen einer Fibrose, beginnend mit wenigen Septen, sie könnte aber geändert werden, wenn die Diagnostizierung von Patienten nur mit einer großen Anzahl von Septen oder mit einer Zirrhose beabsichtigt würde. Dies führt zu einer anderen ROC-Kurve, wie in den Beispielen diskutiert.
Die Diagnose des Vorliegens einer Leberfibrose und/oder von nekro-inflammatorischen Leberläsionen bei dem Patienten kann durch die Daten, die die (zu dem) erwartete Verbreitung von Leberfibrose in der Population betreffen, weiter verfeinert werden.
Die biochemischen Marker, die in Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens quantitativ bestimmt werden, sind vorzugsweise „einfache" biochemische Marker, was bedeutet, dass sie mittels Verfahren, die in diesem Fachgebiet bereits bekannt sind (Chromatographie, Elektrophorese, ELISA-Bestimmung ...), leicht quantitativ bestimmt werden.
Dementsprechend umfassen Marker, die für das Verfahren der Erfindung perfekt geeignet sind, α2-Makroglobulin, Alaninaminotransferase (ALT), Aspartataminotransferase (AST), gamma-Glutamyltranspeptidase (GGT), γ-Globulin, gesamtes Bilirubin, Albumin, α1-Globulin, α2-Globulin, Haptoglobin, β-Globulin, Apolipoprotein A1 (apoA1), IL10, TGF-β1, apoA2, apoB. Abhängig von der untersuchten Erkrankung könnte man auch andere Zytokine oder spezielle Marker, die den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind, verwenden. Für die Analyse einer Nieren- oder Blasenerkrankung könnte es sinnvoll sein, einige Bestimmungen an Urinproben des Patienten auszuführen.
In einer besonderen Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung werden 5 oder 6, 7 oder 10 biochemische Marker untersucht und in Schritt a) des Verfahrens quantitativ bestimmt.
Diese Marker sind vorzugsweise α2-Makroglobulin, GGT, γ-Globulin, gesamtes Bilirubin, (α2-Globulin oder Haptoglobin) und apoA1, wenn eine Diagnose von Leberfibrose beabsichtigt ist. Haptoglobin kann anstelle von α2-Globulin verwendet werden, da α2-Globulin die Summe von α2-Makroglobulin und α2-Mikroglobulinen, die hauptsächlich aus Haptoglobin bestehen, sind. Die relative Gewichtung von α2-Mikroglobulin und Haptoglobin würde dementsprechend in der logistischen Funktion angepasst werden.
Wenn eine Diagnose des Vorliegens von nekro-inflammatorischen Leberläsionen beabsichtigt ist, ist es am besten, wenn die Marker, die quantitativ bestimmt werden, α2-Makroglobulin, GGT, γ-Globulin, (ALT oder AST) und apoA1 umfassen. AST oder ALT können unterschiedslos verwendet werden, da die Daten, die in der vorliegenden Anmeldung angegeben werden, zeigen, dass diese Marker korreliert sind. Dementsprechend führt das Ersetzen eines Markers durch den anderen nur zu dem Ausbalancieren des Koeffizienten in der logistischen Funktion unter Berücksichtigung des Korrelationsfaktors.
Die logistische Funktion kann auch andere Marker, wie das Alter und das Geschlecht des Patienten, verwenden. Die verschiedenen Koeffizienten, die für die für die verschiedenen Marker erhaltenen Werte in der logistischen Funktion verwendet werden, können durch eine statistische Analyse berechnet werden, wie in den Beispielen beschrieben.
Insbesondere sind geeignete logistische Funktionen, die für die Durchführung des Verfahrens der Erfindung verwendet werden können, wie folgt:
Bei Verwendung von sechs Markern: f1 = a1 × Log[α2-Makroglobulin (g/l)] – a2 × [α2-Globulin (g/l)] + a3 × Log[GGT (IE/l)] + a4 × [γ-Globulin (g/l)] + a5 × [Alter (Jahre)] + a6 × Log[Bilirubin (μmol/l)] – a7 × [ApoA1 (g/l)] + a8 × [Geschlecht (weiblich = 0, männlich = 1)] – a9 mit

– a₁ zwischen 6,5 und 6,9 eingeschlossen,
– a₂ zwischen 0,450 und 0,485 eingeschlossen,
– a₃ zwischen 1,100 und 1,300 eingeschlossen,
– a₄ zwischen 0,0700 und 0,0750 eingeschlossen,
– a₅ zwischen 0,0265 und 0,0300 eingeschlossen,
– a₆ zwischen 1,400 und 1,700 eingeschlossen,
– a₇ zwischen 0,900 und 1 eingeschlossen,
– a₈ zwischen 0,300 und 0,450 eingeschlossen und
– a₉ zwischen 4,200 und 4,700 eingeschlossen.

Spezielle verwendbare Funktionen sind insbesondere: f1-a = 6,826 × Log[α2-Makroglobulin (g/l)] – 0,479 × [α2-Globulin (g/l)] + 1,252 × Log [GGT (IE/l)] + 0,0707 × [γ-Globulin (g/l)] + 0,0273 × [Alter (Jahre)] + 1,628 × Log[Bilirubin (μmol/l)] – 0,925 × [ApoA1 (g/l)] + 0,344 × [Geschlecht (weiblich = 0, männlich = 1)] – 4,544;oder f1-b = 6,552 × Log[α2-Makroglobulin (g/l)] – 0,458 × [α2-Globulin (g/l)] + 1,113 × Log[GGT (IE/l)] + 0,0740 × [γ-Globulin (g/l)] + 0,0295 × [Alter (Jahre)] + 1,473 × Log[Bilirubin (μmol/l)] – 0,979 × [ApoA1 (g/l)] + 0,414 × [Geschlecht (weiblich = 0, männlich = 1)] – 4,305;
Bei Verwendung von 10 Markern: f2 = b1 × Log[α2-Makroglobulin (g/l)] – b2 × [α2-Globulin (g/l)] + b3 × Log[GGT (IE/l)] + b4 × [γ-Globulin (g/l)] + b5 × [Alter (Jahre)] + b6 × Log[Bilirubin (μmol/l)] – b7 × [ApoA1 (g/l)] + b8 × [Geschlecht (weiblich = 0, männlich = 1)] + b9[Albumin (g/l)] + b10[α1-Globulin (g/l)] – b11[β2-Globulin (g/l)]2,189 – b12 × Log[ALT (IE/l)] – b13 mit

– b₁ zwischen 9,9 und 10,2 eingeschlossen,
– b₂ zwischen 0,7 und 0,77 eingeschlossen,
– b₃ zwischen 2 und 2,4 eingeschlossen,
– b₄ zwischen 0,1 und 0,2 eingeschlossen,
– b₅ zwischen 0,04 und 0,07 eingeschlossen,
– b₆ zwischen 4 und 4,6 eingeschlossen,
– b₇ zwischen 2 und 2,5 eingeschlossen,
– b₈ zwischen 0,28 und 0,32 eingeschlossen,
– b₉ zwischen 0,025 und 0,04 eingeschlossen,
– b₁₀ zwischen 2 und 2,2 eingeschlossen,
– b₁₁ zwischen 0,1 und 0,16 eingeschlossen,
– b₁₂ zwischen 0,7 und 0,9 eingeschlossen und
– b₁₃ zwischen 12 und 14 eingeschlossen.

Eine spezielle verwendbare Funktion ist insbesondere: f2 = 10,088 × Log[α2-Makroglobulin (g/l)] – 0,735 × [α2-Globulin (g/l)] + 2,189 × Log[GGT (IE/l)] + 0,137 × [γ-Globulin (g/l)] + 0,0546 × [Alter (Jahre)] + 4,301 × Log[Bilirubin (μmol/l)] – 2,284 × [ApoA1 (g/l)] + 0,294 × [Geschlecht (weiblich = 0, männlich = 1)] + 0,0312 [Albumin (g/l)] + 2,109[α1-Globulin (g/l)] – 0,136[β2-Globulin (g/l)] – 0,813 × Log[ALT (IE/l)] – 13,165.
Bei Verwendung von sechs Markern, um signifikante Aktivität zu bestimmen: f3 = c1 × Log[α2-Makroglobulin (g/l)] – c2 × [β2-Globulin (g/l)] + c3 × Log[GGT (IE/l)] + c4 × [γ-Globulin (g/l)] – c5 × [Alter (Jahre)] + c6 × Log[ALT (IE/l)] – c7 × [ApoA1 (g/l)] – c8 × [Geschlecht (weiblich = 0, männlich = 1)] – c9 mit

– c₁ zwischen 3,45 und 3,65 eingeschlossen,
– c₂ zwischen 0,3 und 0,4 eingeschlossen,
– c₃ zwischen 0,8 und 1 eingeschlossen,
– c₄ zwischen 0,075 und 0,09 eingeschlossen,
– c₅ zwischen 0,0015 und 0,003 eingeschlossen,
– c₆ zwischen 2,1 und 2,5 eingeschlossen,
– c₇ zwischen 1,55 und 1,75 eingeschlossen,
– c₈ zwischen 0,35 und 0,45 eingeschlossen und
– c₉ zwischen 4 und 4,6 eingeschlossen

Eine spezielle verwendbare Funktion ist insbesondere: f3 = 3,513 × Log[α2-Makroglobulin (g/l)] – 0,354 × [β2-Globulin (g/l)] + 0,889 × Log[GGT (IE/l)] + 0,0827 × [γ-Globulin (g/l)] – 0,0022 × [Alter (Jahre)] + 2,295 × Log[ALT (IE/l)] – 1,670 × [ApoA1 (g/l)] – 0,415 × [Geschlecht (weiblich = 0, männlich = 1)] – 4,311.
Bei Verwendung von sieben Markern für die Diagnose einer signifikanten Fibrose oder signifikanten Aktivität: f4 = d1 × Log[α2-Makroglobulin (g/l)] – d2 × [α2-Globulin (g/l)] + d3 × Log[GGT (IE/l)] + d4 × [γ-Globulin (g/l)] + d5 × [Alter (Jahre)] + d6 × Log[Bilirubin (μmol/l)] – d7 × [ApoA1 (g/l)] + d8 × [Geschlecht (weiblich = 0, männlich = 1)] + d9Log[ALT (IE/l)] – d10 mit

– d₁ zwischen 5,3 und 6,7 eingeschlossen,
– d₂ zwischen 0,45 und 0,5 eingeschlossen,
– d₃ zwischen 0,8 und 1,2 eingeschlossen,
– d₄ zwischen 0,06 und 0,08 eingeschlossen,
– d₅ zwischen 0,0015 und 0,0025 eingeschlossen,
– d₆ zwischen 1 und 1,2 eingeschlossen,
– d₇ zwischen 1 und 1,2 eingeschlossen,
– d₈ zwischen 0,09 und 1,1 eingeschlossen,
– d₉ zwischen 1,2 und 1,5 eingeschlossen und
– d₁₀ zwischen 4 und 5 eingeschlossen.

Eine spezielle verwendbare Funktion ist: f4 = 5,981 × Log[α2-Makroglobulin (g/l)] – 0,481 × [α2-Globulin (g/l)] + 0,965 × Log[GGT (IE/l)] + 0,0679 × [γ-Globulin (g/l)] + 0,0190 × [Alter (Jahre)] + 1,143 × Log[Bilirubin (μmol/l)] – 1,097 × [ApoA1 (g/l)] + 0,092 × [Geschlecht (weiblich = 0, männlich = 1)] + 1,355Log[ALT (IE/l)] – 4,498
Bei Verwendung von fünf Markern für die Diagnose einer signifikanten Fibrose: f5 = z1 × Log[α2-Makroglobulin (g/l)] – z2 × Log[Haptoglobin (g/l)] + z3 × Log[GGT (IE/l)] + z4 × [Alter (in Jahren)] + z5 × Log[Bilirubin (μmol/l)] – z6 × [ApoA1 (g/l)] + z7 × Geschlecht (weiblich = 0, männlich = 1) – z8 mit

– z₁ zwischen 4 und 5 eingeschlossen,
– z₂ zwischen 1,2 und 1,5 eingeschlossen,
– z₃ zwischen 0,9 und 1,1 eingeschlossen,
– z₄ zwischen 0,0026 und 0,03 eingeschlossen,
– z₅ zwischen 1,6 und 1,9 eingeschlossen,
– z₆ zwischen 1 und 1,3 eingeschlossen,
– z₇ zwischen 0,25 und 0,35 eingeschlossen und
– z₈ zwischen 5 und 6 eingeschlossen.

Eine spezielle verwendbare Funktion ist: f5 = 4,467 × Log[α2-Makroglobulin (g/l)] – 1,357 × Log[Haptoglobin (g/l)] + 1,017 × Log[GGT (IE/l)] + 0,0281 × [Alter (in Jahren)] + 1,737 × Log[Bilirubin (μmol/l)] – 1,184 × [ApoA1 (g/l)] + 0,301 × Geschlecht (weiblich = 0, männlich = 1) – 5,540.
Tatsächlich können die numerischen Definitionen für die Koeffizienten in den verschiedenen Funktionen geringfügig variieren (ungefähr 10–15%) abhängig von der Anzahl und den Charakteristiken der untersuchten Patienten. Dementsprechend müssen die Werte, welche für die Koeffizienten der verschiedenen Marker angegeben werden, so interpretiert werden, dass sie geringfügig unterschiedlich sein können, ohne den Umfang der Erfindung zu reduzieren.
Abhängig von dem Endwert, der durch die Analyse mit der logistischen Funktion des Werts, welcher für die biologischen Marker gemessen wird, erhalten wird, ist es möglich, Schlussfolgerungen über das Vorliegen einer Leberfibrose für den Patienten zu ziehen. Es ist auch möglich, eine Schlussfolgerung über das Vorliegen einer Zirrhose zu ziehen, indem Zirrhose als Schwellenwert beim Zeichen der ROC-Kurve herangezogen wird.
Das Verfahren der Erfindung ist auch als ein Vorhersagemittel für die Entwicklung der Erkrankung verwendbar. Insbesondere wenn der Patient mit dem Hepatitis C-Virus infiziert ist, ist es oftmals möglich, den Zeitpunkt der Infektion (üblicherweise durch Transfusion) zu bestimmen. Dementsprechend kann die Verwendung des Verfahrens der Erfindung, um das Ausmaß der Entwicklung der Erkrankung anhand des Datums der Diagnose zu bestimmen, auch die Prognose der zukünftigen Entwicklung der Erkrankung ermöglichen.
Die durch das erfindungsgemäße Diagnoseverfahren erhaltenen Daten können für auch für den Arzt sehr wertvoll sein, um je nach dem Stadium der Erkrankung eine geeignete Behandlung für den Patienten zu wählen.
Abhängig von der Verbreitung von Leberfibrose in der Population von Patienten, die sich im Rahmen einer Konsultation vorstellen, können die mittels des Verfahrens der Erfindung erhaltenen Daten verwendet werden, um die Notwendigkeit, eine Leberbiopsie bei dem Patienten auszuführen, zu bestimmen. Es wird erwartet, dass das Verfahren der Erfindung die Notwendigkeit einer Leberbiopsie um ungefähr 50% verringern wird.
Das Verfahren der Erfindung soll für Patienten verwendet werden, die unter einer jeglichen Erkrankung leiden, an welcher eine Leberfibrose, die sich zu einer Zirrhose entwickeln könnte, beteiligt ist. Insbesondere wird das Verfahren der Erfindung vorteilhafterweise ausgeführt für das Nachweisen einer Leberfibrose bei einem Patienten, welcher unter einer Krankheit leidet, welche in der Gruppe bestehend aus Hepatitis B und C, Alkoholismus, Hämochromatose, Stoffwechselerkrankungen, Diabetes, Obesität, Autoimmun-Hepatitis, primärer biliärer Zirrhose, α1-Antitrypsin-Mangel, Wilson-Krankheit enthalten ist.
Das Verfahren der Erfindung wird am besten an Patienten, die mit einem Hepatitis-Virus, insbesondere dem Hepatitis C-Virus infiziert sind, ausgeführt.
Die Erfindung bezieht sich auch auf einen Kit zur Diagnose einer Leberfibrose und/oder von nekro-inflammatorischen Leberläsionen bei einem Patienten, umfassend: Anweisungen, welche erlauben, das Vorliegen einer Leberfibrose und/oder von nekro-inflammatorischen Leberläsionen bei dem Patienten nach einer quantitativen Bestimmung von biochemischen Markern zu bestimmen.
Die Anweisungen können die logistische Funktion umfassen, die nach der Bestimmung der quantitativen Bestimmung der biochemischen Marker verwendet werden muss. Sie können als ein gedrucktes Unterstützungsmaterial wie auch als ein durch einen Computer verwendbares Unterstützungsmaterial, wie eine Software, auftreten. Die Anweisungen können auch die ROC-Kurve abhängig von dem Schwellenwert, nach welchem gesucht wird, enthalten, um die Analyse der Enddaten, die aus der logistischen Funktion erhalten werden, zu ermöglichen. Sie können auch verschiedene Tabellen umfassen, die ermöglichen, die der Vorhersage dienenden Werte („predictive values") abhängig von der erwarteten Verbreitung von Fibrose in der Patientenpopulation zu erhalten.
Der erfindungsgemäße Diagnosekit kann auch Bestandteile enthalten, die die quantitative Bestimmung der biologischen Marker von Interesse ermöglichen.
Das Verfahren der Erfindung kann leicht automatisiert werden, indem die quantitative Bestimmung der Marker automatisch ausgeführt wird, die Daten zu einem Computer oder einem Rechner geschickt werden, welcher den Wert der logistischen Funktion berechnen und diesen mit der Hilfe der ROC-Kurve und gegebenenfalls der Verbreitung von Leberfibrose in der Patientenpopulation analysieren wird. Die durch den Arzt erhaltenen Daten sind dementsprechend leichter interpretierbar und werden eine Verbesserung bei dem Entscheidungsprozess bezüglich der Notwendigkeit einer Biopsie oder der zu verschreibenden adäquaten Behandlung ermöglichen.
Die folgenden Beispiele sollen einen Aspekt der Erfindung beschreiben und die Methodik angeben, um das Verfahren der Erfindung zu wiederholen, sollen die Erfindung aber nicht einschränken.
BEISPIELE
Beispiel 1: Patienten und Verfahren
1.1. Patienten
Die in die Untersuchung aufgenommenen Patienten gehörten zu einer Gruppe aus einem einzelnen Zentrum (DOSVIRC). Diese Gruppe umfasste alle Patienten mit Hepatitis C (definiert als positive Serologie durch wenigstens einen ELISA-Test der zweiten Generation), die in der Leber- und Gastrointestinal-Abteilung des Pitié-Salpêtrière Hospital, Paris, Frankreich, retrospektiv vor 1993 und danach prospektiv betreut wurden (16). Für jeden Patienten wurde ein spezieller Fragebogen ausgefüllt, der 129 Punkte, einschließlich sozial-demographisch-administrativer Daten, Risikofaktoren und bei jedem Besuch klinische, biologische, virologische und Behandlungspunkte und histologische Daten, wenn eine Leberbiopsie ausgeführt wurde, enthielt. Die Dauer der HCV-Infektion wurde aus dem Transfusionsdatum oder der anfänglichen Exposition gegenüber anderen parenteralen Quellen abgeschätzt und sie konnte für Patienten mit einer sporadischen Infektion oder jene, bei denen die Infektionsquelle unbekannt war, nicht berechnet werden. Ausschlusskriterien waren das Vorhandensein von HBsAg oder HIV-positiv-Antikörpern. Von August 1997 bis März 2000 wurden alle informierten Patienten mit durch PCR detektierbarem HCV, welche sich einer Leberbiopsie unterzogen, vorab aufgenommen und am Biopsietag wurde eine Blutprobe genommen. Ausschlusskriterien waren eine Coinfektion mit HIV, HBV, andere Lebererkrankungen und eine nicht-interpretierbare Leberbiopsie.
Die Analyse wurde an einem ersten Zeitraum (erstes Jahr-Übungszeitraum 206 Patienten) und an dem zweiten Zeitraum (Validierungszeitraum 156 Patienten) validiert (Tabelle 1).
Eine andere Analyse wurde nach dem Ausschluss eines Patienten in dem Übungszeitraum und von 22 Patienten in dem Validierungszeitraum ausgeführt (Tabelle 4).
1.2. Serummarker
Für die beiden Zeiträume wurden die folgenden 11 Tests ausgeführt:
α2-Makroglobulin, AST, ALT, GGT, gesamtes Bilirubin, Albumin, α1-, α2-, β- und γ-Globuline, apoA1. Um den unabhängigen diagnostischen Wert von α2-Globulinen (welche hauptsächlich aus α2-Makroglobulin und Haptoglobin bestehen) zu erklären, wurde eine retrospektive Bestimmung von Haptoglobin an den 2 Zeiträumen ausgeführt.
IL10, TGF-β1, apoA2 und apoB wurden nur für den zweiten Zeitraum bestimmt.
AST, ALT, GGT, gesamtes Bilirubin wurden durch den Hitachi 917-Automaten unter Verwendung von Roche Diagnostics-Reagenzien (Mannheim, Deutschland) bestimmt.
Albumin wurde durch die Bromkresolgrün-Methode (17) unabhängig von einer Elektrophorese von Serumproteinen (α1-, α2-, β- und γ-Globulin-Fraktionen), die in einem automatischen Hydrasys- und Hyrys-System (Sebia, Issy-Les-Moulineaux, Frankreich) ausgeführt wurde, bestimmt.
Die Apolipoproteine A1, A2 und B und α2-Makroglobulin wurden in Serumproben (bis zum Assay bei –80°C aufbewahrt) durch Verwendung eines automatischen Nephelometers BNII (Dade Behring Marburg, Deutschland) bestimmt.
Die Plasma-TGF-β1-Konzentration wurde unter Verwendung des humanes TGF-β1-Immunoassays Quantikine (R and D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA) gemessen. Um latentes TGF-β1 zu der immunreaktiven Form zu aktivieren, wurden die Proben durch Säure aktiviert und danach neutralisiert.
Plasma-Interleukin 10 wurde unter Verwendung eines Immunoassay-Kits (Beckman Coulter Company Immunotech, Marseille, Frankreich) gemessen.
Plasmaproben wurden bis zum Assay bei –80°C aufbewahrt (weniger als ein Jahr).
1.3. Histologisches Staging und Grading
Histologische Merkmale von Leberproben wurden gemäß dem METAVIR-Scoring-System (18, 19) analysiert. Leberbiopsien von mehr als 10 mm Länge wurden fixiert, in Paraffin eingebettet und mit wenigstens Hämatoxylin-Eosin-Safran und Masson's-Trichrome oder Picrosirius Red auf Kollagen angefärbt.
Für jede Leberbiopsie wurden ein Fibrose-Stadium und ein Aktivitätsgrad gemäß den folgenden Kriterien ermittelt. Das Staging der Leberbiopsien erfolgte mittels einer Skala von 0 bis 4: 0 = keine Fibrose, 1 = portale (mikronoduläre) Fibrose ohne Septen, 2 = wenige Septen, 3 = zahlreiche Septen ohne Zirrhose und 4 = Zirrhose. Es ist gezeigt worden, dass dieses Merkmal zwischen Pathologen hochgradig reproduzierbar ist.
Die Aktivitätsgrad-Einstufung (Aktivitäts-Grading), das die Intensität von nekro-inflammatorischen Läsionen auswertet, wurde, wie folgt, angegeben: A0 = keine histologische Aktivität, A1 = milde Aktivität, A2 = moderate Aktivität, und A3 = schwere Aktivität. Das METAVIR-Scoring-System wurde durch einen einzelnen Pathologen (FC), der keine Kenntnisse von den Patientencharakteristiken hatte, bestimmt.
Beispiel 2: Statistische Analyse
Die statistische Analyse verwendete logistische Regression und ROC-Kurven (20). Die Analyse wurde an einem ersten Zeitraum (erstes Jahr-Übungszeitraum) ausgeführt und an dem zweiten Zeitraum (Validierungszeitraum) validiert, Gruppe von Patienten wie in den Tabellen 1 und 4.
Dann wurde eine abschließende Analyse an der Gesamtpopulation unter Kombination der beiden Zeiträume ausgeführt (siehe Tabellen 2 und 5).
Gemäß dem METAVIR-Scoring-System wurden Patienten in mehrere Gruppen eingeteilt.
Der Hauptendpunkt war die Identifizierung von Patienten mit signifikanter Fibrose (F2, F3 oder F4) gegenüber Patienten ohne signifikante Fibrose (F0 oder F1).
Bei sekundären Analysen wurden Patienten auch gemäß Aktivitätsgraden unterteilt: Patienten ohne signifikante Aktivität (A0 oder A1) und Patienten mit histologischer Aktivität (A2 oder A3).
Es wurden eine Gruppe mit nicht-signifikanten histologischen Merkmalen (A < 2 und F < 2) und eine Gruppe von signifikanten Läsionen (A ≥ 2 und/oder F ≥ 2) definiert.
Schließlich wurde auch eine Gruppe mit starker Fibrose oder Zirrhose (F3 oder F4) definiert.
Die erst Stufe bestand in der Identifizierung von Faktoren, welche sich zwischen diesen Gruppen signifikant unterschieden, durch eindimensionale Analyse unter Verwendung des chi-Quadrat-Tests, Student t-Tests oder Mann-Whitney-Tests.
Die zweite Stufe bestand in einer logistischen Regressionsanalyse, um den unabhängigen Unterscheidungswert von Markern für die Diagnose einer Fibrose zu bestimmen.
Der dritte Schritt bestand darin, einen Index zu konstruieren, welcher diese identifizierten unabhängigen Faktoren kombinierte. Per definitionem war der beste Index („Fibrose-Score") in Hinblick auf die Unterscheidung die logistische Regressionsfunktion, welche die unabhängigen Faktoren kombinierte.
Die diagnostischen Werte dieser Indices und der isolierten Faktoren wurden durch Empfindlichkeit, Spezifität, positive und negative der Vorhersage dienende Werte („predictive values") und „Receiver Operating Characteristics" bestimmt. Die der Vorhersage dienenden Werte wurden für die beobachtete Verbreitung von signifikanter Fibrose (40% in dieser Untersuchung), aber auch für eine niedrigere (10%) oder höhere (90%) Verbreitung bestimmt.
Die jeweiligen diagnostischen Gesamtwerte wurden anhand der Flächen unter den „Receiver Operating Characteristics"-Kurven verglichen. Die ROC-Kurve wird gezeichnet, indem die Empfindlichkeit gegen (1-Spezifität) aufgetragen wird, nach der Einteilung der Patienten gemäß dem für die logistische Funktion erhaltenen Wert für verschiedene Schwellenwerte (von 0 bis 1). Es ist üblicherweise anerkannt, dass eine RCO-Kurve, bei welcher die Fläche unter dieser einen Wert über 0,7 aufweist, eine gute der Vorhersage dienende Kurve für eine Diagnose ist. Die ROC-Kurve muss als eine Kurve anerkannt werden, welche erlaubt, die Qualität eines Diagnoseverfahrens vorherzusagen.
Diese statistischen Analysen wurden für die verschiedenen Gruppen, wie zuvor definiert, separat ausgeführt.
Um die Anzahl von Faktoren zu verringern, wurde eine Analyse, welche nur die 6 signifikantesten Marker kombinierte, ausgeführt (f1-a oder f1-b).
Da während der Analysen beobachtet worden war, dass α2-Globuline einen unabhängigen diagnostischen Wert aufwiesen, wenn α2-Makroglobulin berücksichtigt wurde, wurde retrospektiv der diagnostische Wert von Haptoglobin, der zweiten Hauptkomponente von α2-Globulinen, bestimmt.
Schließlich wurde ein Index mit fünf Markern, ausschließlich Protein-Elektrophorese-Komponenten, konstruiert, welcher Haptoglobin und die vier anderen identifizierten Marker kombinierte (logistische Funktion f5).
Beispiel 3: Bestimmung der logistischen Funktion
Vorab wurde eine Gesamtzahl von 422 Patienten mit chronischer Hepatitis C aufgenommen.
Abhängig von der Anzahl, die aus den folgenden Gründen (HIV-Coinfektion, HBV-Coinfektion und Transplantation) ausgeschlossen wurde, der Unmöglichkeit eines Fibrose-Stagings, welches bei anderen nicht möglich war, oder der Unmöglichkeit der quantitativen Bestimmung von wenigstens einem der 11 Marker wurden insgesamt 362 (1. Untersuchung) oder 339 (2. Untersuchung) Patienten mit chronischer Hepatitis C in die Studie aufgenommen, wie in den Tabellen 1 bzw. 4 angegeben.
Es gab keinen Unterschied zwischen den Patientencharakteristiken und den biochemischen Markern zwischen der ersten und zweiten Probe (Tabellen 1 und 4). Die Gesamtverbreitung von signifikanter Fibrose betrug 40% (F0 17–18%, F1 42–43%, F2 19–20%, F3 8%, F4 12–13%), wie durch Histologie bestimmt.
3.1. Diagnose einer signifikanten Fibrose
Die diagnostischen Werte (Fläche unter den ROC-Kurven) von jedem der elf biochemischen Marker sind in den Tabellen 2 und 5 wie auch deren unabhängige Assoziierung mit Fibrose (logistische Regression) angegeben.
Der Fibrose-Score, welcher die zehn oder die sechs informativsten Marker (α2-Makroglobulin, α2-Mikroglobulin, gesamtes Bilirubin, γ-Globulin, apoA1 und GGT) oder fünf Marker (nach Ausschluss von α2-Mikroglobulin, γ-Globulin und einschließlich Haptoglobin) und das Alter und Geschlecht kombinierte, hatte hohe diagnostische Werte bei der Übungsprobe wie auch bei der Validierungsprobe und bei der Gesamtpopulation (Tabelle 2 und 5).
Da ALT- und AST-Transaminasen hochgradig korreliert waren (Korrelationskoeffizient = 0,88), wurde nur ALT verwendet, wenn dieser Marker benötigt wurde.
Es wurde bestimmt, dass die logistische Funktion von 6 Markern und des Alters und Geschlechts, wie folgt, ist: f1-a = 6,826 × Log[α2-Makroglobulin (g/l)] – 0,479 × [α2-Globulin (g/l)] + 1,252 × Log[GGT (IE/l)] + 0,0707 × [γ-Globulin (g/l)] + 0,0273 × [Alter (Jahre)] + 1,628 × Log[Bilirubin (μmol/l)] – 0,925 × [ApoA1 (g/l)] + 0,344 × [Geschlecht (weiblich = 0, männlich = 1)] – 4,544;oder f1-b = 6,552 × Log[α2-Makroglobulin (g/l)] – 0,458 × [α2-Globulin (g/l)] + 1,113 × Log[GGT (IE/l)] + 0,0740 × [γ-Globulin (g/l)] + 0,0295 × [Alter (Jahre)] + 1,473 × Log[Bilirubin (μmol/l)] – 0,979 × [ApoA1 (g/l)] + 0,414 × [Geschlecht (weiblich = 0, männlich = 1)] – 4,305.
Es wurde bestimmt, dass die logistische Funktion von 6 Markern und des Alters und Geschlechts, wie folgt, ist: f5 = 4,467 × Log[α2-Makroglobulin (g/l)] – 1,357 × Log[Haptoglobin (g/l)] + 1,017 × Log[GGT (IE/l)] + 0,0281 × [Alter (in Jahren)] + 1,737 × Log[Bilirubin (μmol/l)] – 1,184 × [ApoA1 (g/l)] + 0,301 × Geschlecht (weiblich = 0, männlich = 1) – 5,540.
Diese Funktionen wurden erhalten, indem die relative Gewichtung von jedem Parameter, wie im Rahmen der logistischen Regression individuell bestimmt, mit einem negativen Vorzeichen, wenn der Marker eine negative Korrelation mit dem Fibrose-Stadium aufweist, kombiniert wurde. Für Marker, deren Werte einen sehr breiten Bereich aufwiesen, wurden Logarithmen verwendet.
Wenn für die Berechnung der logistischen Funktion zur Bestimmung von Fibrose 10 Marker verwendet wurden, war die Funktion, wie folgt: f2 = 10,088 × Log[α2-Makroglobulin (g/l)] – 0,735 × [α2-Globulin (g/l)] + 2,189 × Log[GGT (IE/l)] + 0,137 × [γ-Globulin (g/l)] + 0,0546 × [Alter (Jahre)] + 4,301 × Log[Bilirubin (μmol/l)] – 2,284 × [ApoA1 (g/l)] + 0,294 × [Geschlecht (weiblich = 0, männlich = 1)] + 0,0312[Albumin (g/l)] + 2,109[α1-Globulin (g/l)] – 0,136[β2-Globulin (g/l)] – 0,813 × Log[ALT (IE/l)] – 13,165.
Die ROC-Kurven für den Fibrose-Score unter Verwendung der zehn oder der sechs informativsten Marker (1) oder der zehn, sechs oder fünf informativsten Marker (3) waren identisch. Die Flächen unter der Kurve unterschieden sich nicht.
Das Streuungsdiagramm des sechs Marker-Fibrose-Scores (welcher von 0,00 bis 1,00 reicht) ist gemäß dem Fibrose-Stadium in 2 angegeben.
Die Kasten-Plots (Kasten („box")-Diagramme) des fünf oder sechs Marker-Fibrose-Scores (welcher von 0,00 bis 1,00) reicht sind gemäß dem Fibrose-Stadium in 4 angegeben.
Unter Verwendung des sechs Marker-Fibrose-Scores wurde ein hoher negativer der Vorhersage dienender Wert („predictive value") (> 90% Fehlen von F2, F3, F4) erhalten für einen Score, welcher von 0 bis 0,20 reichte (125 Patienten (1. Untersuchung) oder 119 Patienten (2. Untersuchung)), das entspricht ungefähr 35% der Patienten mit 13 falschen Negativen mit einem Alter von 34 bis 59 Jahre: 4 F2A0, 6 F2A1, 3 F2A2). Ein hoher positiver der Vorhersage dienender Wert („predictive value") (> 90% Vorliegen von F2, F3, F4) wurde erhalten für einen Score von 0,80 bis 1 (53 Patienten (1. Untersuchung) bzw. 50 Patienten (2. Untersuchung), dies entspricht 15% der Patienten mit 4 bzw. 5 falschen Positiven im Alter von 47 bis 68 Jahren; 1 bzw. 2 F1A1, 3 F1A2) (Tabellen 3 und 6).
Diese Werte wurden berechnet für eine Verbreitung von Fibrose (F > 1) von 40% in der Testpopulation. Die Werte für eine Vorhersage, die berücksichtigt werden müssen, wenn die Verbreitung von Fibrose in der Testpopulation 90% oder 10% beträgt, sind in den Tabellen 3 und 6 ebenfalls angegeben.
Neuronales Netz-Methoden lieferten ähnliche Ergebnisse: der Prozentsatz von korrekt eingeteilten Patienten betrug 77%, 74% und 79% für die Übungs-, Validierungs- bzw. Testproben (nicht gezeigt).
In der zweiten Probe erlaubte die Hinzufügung von IL10, TGF-β1, apoA2 und apoB, die Fläche unter der Kurve geringfügig auf 0,889 ± 0,030 zu erhöhen, was sich von dem 6 Marker-Fibrose-Score nicht unterschied.
3.2. Diagnose einer signifikanten Fibrose unter Patienten mit niedriger ALT (2. Untersuchung)
Insgesamt wiesen 43 Patienten ALT unter 35 IE/l mit 10 Patienten, die signifikante Fibrose aufwiesen, auf. Der diagnostische Wert der 6 Marker-Fibrose-Funktion war noch hoch mit einer Fläche unter der ROC-Kurve von 0,758 ± 0,090. Die beiden Patienten mit einem Score über 0,80 hatten eine Zirrhose. Unter 29 Patienten mit Scores unter 0,20 hatten 25 keine signifikante Fibrose.
3.3. Diagnose von Zirrhose oder schwerer Fibrose (1. Untersuchung)
Für die Diagnose einer Zirrhose oder von schwerer Fibrose erreichte ein Fibrose-Score unter Verwendung derselben 6 Marker (R² = 0,345, P < 0,001) eine sehr hohe Fläche unter der ROC-Kurve: 0,929 ± 0,020.
Unter Verwendung dieser Funktion wurde ein hoher negativer der Vorhersage dienender Wert („predictive value") (> 90% Fehlen von F3, F4) für einen Score, welcher von 0 bis 0,80 reichte, erhalten (309 Patienten, d.h. 85% der Patienten, mit 32 falschen Negativen im Alter von 27 bis 74 Jahren: 13 Zirrhose und 19 F3). Für einen Score > 0,80 gab es einen hohen positiven der Vorhersage dienenden Wert („predictive value") (> 85% Vorliegen von F3, F4) 53 Patienten, d.h. 15% der Patienten mit 8 falschen Positiven im Alter von 47 bis 68 Jahren: 4 F2 und 2 F1.
3.4 Diagnose von Zirrhose oder schwerer Fibrose (2. Untersuchung)
Für die Diagnose einer Zirrhose oder von schwerer Fibrose erreichte der gleiche Fibrose-Score unter Verwendung von 6 Markern (R² = 0,347, p < 0,001) eine sehr hohe Fläche unter der ROC-Kurve: 0,923 ± 0,020.
Unter Verwendung dieser Funktion wurde ein hoher negativer der Vorhersage dienender Wert („predictive value") (> 90% Fehlen von F3, F4) für Scores, welche von 0 bis 0,80 reichten, erhalten. Unter diesen 289 Patienten, welche 85% der Gesamtzahl entsprachen, gab es 30 falsche Negative: 11 Zirrhose und 19 F3). Für Scores > 0,80 gab es einen hohen positiven der Vorher sage dienenden Wert („predictive value") (> 85% Vorliegen von F3, F4). Unter diesen 50 Patienten, dies entspricht 15% der Gesamtanzahl, gab es 10 falsche Positive: 5 F2 und 5 F1.
3.5. Diagnose von signifikanter Aktivität oder entweder Fibrose oder Aktivität (1. und 2. Untersuchung)
Für die Diagnose von signifikanter Aktivität (A2, A3) kombinierte die beste logistische Regression ALT, α2-Makroglobulin, β-Globulin, γ-Globulin, apoA1 und GGT (R² = 0,243 P < 0,001).
Die logistische Funktion, die verwendet wurde, war: f3 = 3,513 × Log[α2-Makroglobulin (g/l)] – 0,354 × [β2-Globulin (g/l)] + 0,889 × Log[GGT (IE/l)] + 0,0827 × [γ-Globulin (g/l)] – 0,0022 × [Alter (Jahre)] + 2,295 × Log[ALT (IE/l)] – 1,670 × [ApoA1 (g/l)] – 0,415 × [Geschlecht (weiblich = 0, männlich = 1)] – 4,311.
Für die Diagnose von signifikanter Fibrose (F2, F3, F4) oder signifikanter Aktivität (A2, A3) kombinierte die beste logistische Regression die gleichen sechs Marker wie für signifikante Fibrose allein plus ALT (R² = 0,290 P < 0,001).
Die logistische Funktion, die man für diese Diagnostik verwenden sollte, lautet: f4 = 5,981 × Log[α2-Makroglobulin (g/l)] – 0,481 × [α2-Globulin (g/l)] + 0,965 × Log[GGT (IE/l)] + 0,0679 × [γ-Globulin (g/l)] + 0,0190 × [Alter (Jahre)] + 1,143 × Log[Bilirubin (μmol/l)] – 1,097 × [ApoA1 (g/l)] + 0,092 × [Geschlecht (weiblich = 0, männlich = 1)] + 1,355Log[ALT (IE/l)] – 4,498.
3.6. Assoziierungen zwischen Zytokinen und biochemischen Markern (2. Untersuchung)
TGF-β1 war positiv mit Haptoglobin (R = 0,39; p < 0,001) und negativ mit α2-Makroglobulin (R = –0,20; p = 0,02), Bilirubin (R = –0,32; p < 0,001) und GGT (R = –0,20; p = 0,01) assoziiert. HGF war mit α2-Makroglobulin (R = 0,45; p = 0,006) und GGT (R = 0,54; p < 0,001) assoziiert. IL10 war nur mit γ-Globulinen assoziiert (R = 0,20; p = 0,01).
Beispiel 4: Analyse der Daten
Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass eine Kombination von fünf oder sechs einfachen biochemischen Markern, die in keiner direkten Beziehung zu Fibrogenese stehen, hohe positive oder negative der Vorhersage dienende Werte („predictive values") für die Diagnose von signifikanter Fibrose sogar in dem frühen Stadium von wenigen Septen erreichen kann.
Schlussfolgerungen für ein Diagnoseverfahren sind üblicherweise schwach, wenn die untersuchte Probe vorbelastet und für die meisten üblichen Patienten nicht repräsentativ ist. Die kli nischen, histologischen und biochemischen Charakteristiken der prospektiven Population waren in dieser Studie während der 33 Monate der Untersuchung stabil und ähnlich zu Populationen, die in unlängst untersuchten großen randomisierten Versuchsreihen enthalten waren (22). Patienten mit offensichtlicher dekompensierter Zirrhose waren nicht enthalten. Die Aufnahme von Patienten mit schweren Lebererkrankungen würde die der Vorhersage dienenden Werte („predictive values") der logistischen Funktion künstlich erhöht haben. Andererseits gab es auch eine signifikante Anzahl von Patienten mit minimalen histologischen Merkmalen (13–18% ohne Fibrose) und 9% Patienten mit ALT unter 30 IE/ml und 13% mit ALT unter 35 IE/ml, die in randomisierte Versuchsreihen üblicherweise nicht aufgenommen werden.
Der diagnostische Wert des Fibrose-Scores war zwischen den beiden Zeiträumen reproduzierbar (Tabellen 2 und 5). Eine Analyse dieser Ergebnisse ermöglicht die Schlussfolgerung, dass bei der Behandlung von chronischer Hepatitis C die Biopsieanzahl um 50% verringert werden könnte.
In der Praxis werden Patienten gemäß dem Fibrose-Stadium und -Grad (1–4) behandelt. Wenn eine Entscheidung zugunsten von keiner Behandlung ohne Biopsie aufgrund eines Fibrose-Scores < 0,20 getroffen worden wäre, wären nur 13 von 125 oder 119 Patienten falsch negativ gewesen. Unter diesen hatte keiner eine Zirrhose oder schwere Fibrose (F3–F4) und nur zwei wiesen moderate Aktivität auf. Wenn eine Entscheidung zugunsten einer Behandlung ohne Biopsie aufgrund eines Fibrose-Scores > 0,80 getroffen worden wäre, wären nur 4 Patienten von 53 oder 5 von 50 falsch positiv gewesen. Von diesen wiesen 3 Patienten moderate Aktivität auf, welche eine Behandlung trotz nur portaler (mikronodulärer) Fibrose gemäß dem „Consensus Statement" (2) rechtfertigte.
Zwei von diesen 3 Patienten unterzogen sich einer transvenösen Leberbiopsie, welche einen erhöhten portokavalen Gradienten, 19 bzw. 13 mm Hg, zeigte. Es ist dementsprechend hochgradig möglich, dass diese Patienten tatsächlich eine signifikante Fibrose hatten.
In diesem Falle wären nur einer oder zwei Patienten (4%) überflüssigerweise behandelt worden. Dementsprechend kann dieser Score die meisten Patienten mit moderater und schwerer histologischer Aktivität, aber ohne signifikante Fibrose detektieren. Schließlich könnte der Fibrose-Score auch für eine Zirrhose-Behandlung ohne Biopsie verwendet werden.
Es ist sehr wichtig, anzumerken, dass das Verfahren der Erfindung nicht zu einer großen Anzahl von ungerechtfertigten Behandlungen von Patienten oder zu dem Ausschluss von Patien ten, welche eine Behandlung benötigen, führt. Die in dieser Anmeldung präsentierten Daten stärken vielmehr die Verlässlichkeit des erfindungsgemäßen Diagnoseverfahrens.
Der Fibrose-Score könnte auch für eine Zirrhose-Behandlung ohne Biopsie verwendet werden. Dementsprechend könnte ein Screening auf Varizen und auf ein Leberzellkarzinom bei Patienten mit einem Fibrose-Score > 0,80 empfohlen werden.
Die informativsten Marker waren in abnehmender Reihenfolge: α2-Makroglobulin, α2-Globulin, GGT, γ-Globulin, gesamtes Bilirubin und apoA1.
α2-Globulin (Normalbereich 4–6 g/l) besteht aus α2-Makroglobulin (1,4–4,0 g/l) und α2-Mikroglobulinen: Haptoglobin (0,4–2 g/l), Coeruloplasmin (0,2–0,4), Antithrombin III (0,2–0,3) und Retinol-bindendem Protein (0,03–0,07) (23). Der diagnostische Wert von α2-Globulin wurde bei einer univarianten Analyse nicht beobachtet, da eine Fibrose mit einer Zunahme von α2-Makroglobulin und einer Abnahme von α2-Mikroglobulinen assoziiert war (5).
Die berichteten Daten legen nahe, dass Haptoglobin, der Hauptbestandteil der α2-Mikroglobuline, abnahm, wenn die Fibrose zunahm, und der Prädiktionsfaktor ist. Tatsächlich war der Unterschied zwischen α2-Globulin und α2-Makroglobulin, welches hauptsächlich aus Haptoglobin besteht, stark und negativ mit Fibrose assoziiert (R = –0,33, p < 0,001). Die anderen Bestandteile von α2-Mikroglobulin (Coeruloplasmin, Antithrombin III und Retinol-bindendes Protein) sind in viel geringeren Serumkonzentrationen vorhanden und ihr individueller diagnostischer Wert ist nicht bestimmt worden.
Eine entgegengesetzte Korrelation konnte zwischen Fibrose und α2-Makroglobulin beobachtet werden (positiv korreliert, R = 0,46, p < 0,001) gegenüber α2-Mikroglobulinen (reich an Haptoglobin, negativ korreliert, R = –0,40).
Die logistische Funktion mit 5 Markern stärkt diese Hypothese.
Ein signifikanter diagnostischer Wert von erhöhtem α2-Makroglobulin für das Fibrose-Staging ist bereits bei Patienten mit alkoholbedingter Lebererkrankung beobachtet worden. α2-Makroglobulin gehört zu den akute Phase-Proteinen und wird örtlich durch Hepatozyten, Sternzellen und Granulomzellen an Orten von Entzündungen und Leberfibrose produziert. Darüber hinaus steht α2-Makroglobulin in spezifischer Beziehung zu Fibrose als ein Kennzeichen von Sternzellen-Aktivierung. α2-Makroglobulin ist auch ein Proteinaseinhibitor und eine erhöhte Synthese von diesem kann den Katabolismus von Matrixproteinen hemmen und fibrotische Prozesse in der Leber verstärken.
Haptoglobin nimmt ab, wenn die Fibrose zunimmt, und erklärt folglich den der Vorhersage dienenden Wert („predictive value") von α2-Globulinen bei Kombination mit α2-Makroglobulinen. Haptoglobin war stark und negativ mit Fibrose assoziiert, wie bereits beobachtet wurde. Diese Assoziierung stand in keiner Beziehung zu Hämolyse, Milzüberfunktion oder Leberinsuffizienz. In ähnlicher Weise wurde in dieser Untersuchung keine signifikante Assoziierung mit nicht-konjugiertem Bilirubin gefunden (Daten nicht gezeigt).
Die entgegengesetzten Korrelationen mit Fibrose zwischen α2-Makroglobulin (positiv) und Haptoglobin (negativ) könnten durch die unterschiedlichen Rollen von HGF und TGF-β1 während der Fibrogenese und der akute Phase-Reaktion erklärt werden. Für α2-Makroglobulin wurden eine starke positive Assoziierung mit HGF und eine negative Korrelation mit TGF-β1-Serumkonzentrationen beobachtet.
Im Gegensatz dazu wurde für Haptoglobin eine starke und positive Korrelation mit TGF-β1 beobachtet. Bei experimenteller Fibrose ist beobachtet worden, dass eine Transduktion mit dem HGF-Gen die Zunahme von TGF-β1 supprimierte und dass HGF die Synthese von α2-Makroglobulin stimuliert und die Synthese von Haptoglobin verringert. Dementsprechend scheint es, dass diese beiden Proteine sehr informativ sind, da sie repräsentativ für die zwei hauptsächlichen Fibrogenese-Zytokine sind: α2-Makroglobulin ist repräsentativ für HGF und Haptoglobin ist repräsentativ für TGF-β1.
Es ist mehrmals beobachtet worden, dass GGT mit Fibrose assoziiert ist, und dieses wird in Verbindung mit Prothrombin und Apolipoprotein A1 PGA Index (7–8, 13–14, 34) verwendet. In dieser Untersuchung war der diagnostische Wert von GGT unabhängig von anderen Faktoren, insbesondere Transaminasen und Bilirubin. Gegenwärtig kann keine Erklärung gegeben werden für den unabhängigen diagnostischen Wert von gesamtem Serum-Bilirubin bei nicht-zirrhotischen Patienten. Sowohl GGT als auch Bilirubin waren mit HGF assoziiert worden. Neben früher Cholestase könnte eine Zunahme des epidermalen Wachstumsfaktors eine Erklärung für die GGT-Zunahme sein.
Die Serumkonzentration von γ-Globulin ist seit Jahren mit Zirrhose und porto-systemischen Shunts in Verbindung gebracht worden (36). In dieser Untersuchung ist gezeigt worden, dass, obwohl geringer als bei Patienten mit Zirrhose, die γ-Globulin-Konzentration bereits bei Patienten mit nicht-zirrhotischer Fibrose verglichen mit Patienten mit F1 oder F0 erhöht war.
Es ist mehrmals beobachtet worden, dass die ApoA1-Serumkonzentration mit Fibrose assoziiert ist, und dieses wird in Verbindung mit Prothrombin und GGT:PGA Index verwendet (siehe a.a.O.). In dieser Untersuchung wurde kein signifikanter zusätzlicher diagnostischer Wert von apo-AII oder apoB im Vergleich zu apoA1 allein gefunden.
Im Rahmen dieser Untersuchung ist eine unerwartete Abnahme beim Serum-TGF-β1 gemäß dem Fibrose-Stadium beobachtet worden, obwohl dies keinen signifikanten diagnostischen Wert zu der Kombination der 6 Marker hinzufügte. Die stärkste Korrelation wurde zwischen TGF-β1 und α2-Mikroglobulin beobachtet (R = 0,42, p < 0,001), was nahe legt, dass Haptoglobin ein einfacher Marker der TGF-β1-Aktivierung bei chronischer Hepatitis C sein könnte.
Schließlich lieferten Bestimmungen von Serum-Zytokinen keine zusätzlichen signifikanten diagnostischen Werte zu den biochemischen Markern, die leichter und preiswerter zu messen sind. Messungen von Elektrophorese-Verbindungen (α2-Globuline und γ-Globuline) können als altmodische halbquantitative Bestimmungen angesehen werden. Ihr Ersetzen durch Haptoglobin in einer fünf Marker-Funktion lieferte ähnliche der Vorhersage dienende Werte („predictive values").
Als Schlussfolgerung präsentiert die Erfindung eine Kombination von fünf, sechs oder mehr biochemischen Markern für eine Verwendung für den Nachweis von Leberfibrose und/oder dem Vorliegen von inflammatorischen Läsionen. Die im Rahmen der Erfindung verwendeten Marker sind niemals auf eine solche Weise mit dem Alter und dem Geschlecht der Patienten kombiniert worden, um einen derart guten der Vorhersage dienenden Wert („predictive value"), wie durch die Fläche unter der ROC-Kurve veranschaulicht, zu liefern.
Das Diagnoseverfahren der Erfindung kann nach einer automatischen Messung der Werte der Marker automatisch analysiert werden und kann vorteilhafterweise für Patienten mit chronischer Hepatitis C angewendet werden, um die Indikation einer Leberbiopsie zu verringern.
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Claims

In vitro-Verfahren zur Diagnose von Leberfibrose und/oder des Vorliegens von nekro-inflammatorischen Leberläsionen bei einem Patienten, welches die Schritte umfasst: a) Messen der Werte der Konzentration von biochemischen Markern im Serum des Patienten, b) Kombinieren der Werte durch eine logistische Funktion, um einen Endwert zu erhalten, wobei die logistische Funktion erhalten wird durch die folgenden Verfahren: i) Einteilung der Patienten in unterschiedliche Gruppen je nach dem Ausmaß ihrer Erkrankung; ii) Identifizierung von Faktoren, die sich zwischen diesen Gruppen signifikant unterscheiden, durch eindimensionale Analyse; iii) logistische Regressionsanalyse, um den unabhängigen Unterscheidungswert von Markern für die Diagnose einer Fibrose und/oder von nekro-inflammatorischen Leberläsionen zu bestimmen; iv) Konstruktion der logistischen Funktion durch Kombination dieser identifizierten unabhängigen Faktoren, und c) Analysieren des Endwerts der logistischen Funktion, um das Vorliegen einer Leberfibrose und/oder von nekro-inflammatorischen Leberläsionen zu bestimmen, wobei eine Kombination von fünf, sechs oder mehr biochemischen Markern in Schritt a) untersucht wird und die Marker ausgewählt werden in der Gruppe bestehend aus α2-Makroglobulin, AST (Aspartataminotransferase), ALT (Alaninaminotransferase), GGT (gamma-Glutamyltranspeptidase), γ-Globulin, gesamtem Bilirubin, Albumin, α1-Globulin, α2-Globulin, Haptoglobin, β-Globulin, apoA1, IL10, TGF-β1, apoA2, apoB.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die logistische Funktion des Weiteren das Alter und das Geschlecht des Patienten berücksichtigt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die gemessenen biochemischen Marker, die für die Diagnose einer Fibrose verwendet werden, α2-Makroglobulin, GGT, γ-Globulin, gesamtes Bilirubin, (α2-Globulin oder Haptoglobin) und apoA1 umfassen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die gemessenen biochemischen Marker, die für die Diagnose des Vorliegens von nekro-inflammatorischen Läsionen verwendet werden, α2-Makroglobulin, GGT, γ-Globulin, (ALT oder AST) und apoA1 umfassen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die logistische Funktion ausgewählt wird in der Gruppe bestehend aus: – f1 = a1 × Log[α2-Makroglobulin (g/l)] – a2 × [α2-Globulin (g/l)] + a3 × Log[GGT (IE/l)] + a4 × [γ-Globulin (g/l)] + a5 × [Alter (Jahre)] + a6 × Log[Bilirubin (μmol/l)] – a7 × [ApoA1 (g/l)] + a8 × [Geschlecht (weiblich = 0, männlich = 1)] – a9 mit – a₁ zwischen 6,5 und 6,9 eingeschlossen, – a₂ zwischen 0,450 und 0,485 eingeschlossen, – a₃ zwischen 1,100 und 1,300 eingeschlossen, – a₄ zwischen 0,0700 und 0,0750 eingeschlossen, – a₅ zwischen 0,0265 und 0,0300 eingeschlossen, – a₆ zwischen 1,400 und 1,700 eingeschlossen, – a₇ zwischen 0,900 und 1 eingeschlossen, – a₈ zwischen 0,300 und 0,450 eingeschlossen und – a₉ zwischen 4,200 und 4,700 eingeschlossen. – f2 = b1 × Log[α2-Makroglobulin (g/l)] – b2 × [α2-Globulin (g/l)] + b3 × Log[GGT (IE/l)] + b4 × [γ-Globulin (g/l)] + b5 × [Alter (Jahre)] + b6 × Log[Bilirubin (μmol/l)] – b7 × [ApoA1 (g/l)] + b8 × [Geschlecht (weiblich = 0, männlich = 1)] + b9[Albumin (g/l)] + b10[α1-Globulin (g/l)] – b11[β2-Globulin (g/l)]2,189 – b12 × Log[ALT (IE/l)] – b13 mit – b₁ zwischen 9,9 und 10,2 eingeschlossen, – b₂ zwischen 0,7 und 0,77 eingeschlossen, – b₃ zwischen 2 und 2,4 eingeschlossen, – b₄ zwischen 0,1 und 0,2 eingeschlossen, – b₅ zwischen 0,04 und 0,07 eingeschlossen, – b₆ zwischen 4 und 4,6 eingeschlossen, – b₇ zwischen 2 und 2,5 eingeschlossen, – b₈ zwischen 0,28 und 0,32 eingeschlossen, – b₉ zwischen 0,025 und 0,04 eingeschlossen, – b₁₀ zwischen 2 und 2,2 eingeschlossen, – b₁₁ zwischen 0,1 und 0,16 eingeschlossen, – b₁₂ zwischen 0,7 und 0,9 eingeschlossen und – b₁₃ zwischen 12 und 14 eingeschlossen. – f3 = c1 × Log[α2-Makroglobulin (g/l)] – c2 × [β2-Globulin (g/l)] + c3 × Log[GGT (IE/l)] + c4 × [γ-Globulin (g/l)] – c5 × [Alter (Jahre)] + c6 × Log[ALT (IE/l)] – c7 × [ApoA1 (g/l)] – c8 × [Geschlecht (weiblich = 0, männlich = 1)] – c9 mit – c₁ zwischen 3,45 und 3,65 eingeschlossen, – c₂ zwischen 0,3 und 0,4 eingeschlossen, – c₃ zwischen 0,8 und 1 eingeschlossen, – c₄ zwischen 0,075 und 0,09 eingeschlossen, – c₅ zwischen 0,0015 und 0,003 eingeschlossen, – c₆ zwischen 2,1 und 2,5 eingeschlossen, – c₇ zwischen 1,55 und 1,75 eingeschlossen, – c₈ zwischen 0,35 und 0,45 eingeschlossen und – c₉ zwischen 4 und 4,6 eingeschlossen. – f4 = d1 × Log[α2-Makroglobulin (g/l)] – d2 × [α2-Globulin (g/l)] + d3 × Log[GGT (IE/l)] + d4 × [γ-Globulin (g/l)] + d5 × [Alter (Jahre)] + d6 × Log[Bilirubin (μmol/l)] – d7 × [ApoA1 (g/l)] + d8 × [Geschlecht (weiblich = 0, männlich = 1)] + d9Log[ALT (IE/l)] – d10 mit – d₁ zwischen 5,3 und 6,7 eingeschlossen, – d₂ zwischen 0,45 und 0,5 eingeschlossen, – d₃ zwischen 0,8 und 1,2 eingeschlossen, – d₄ zwischen 0,06 und 0,08 eingeschlossen, – d₅ zwischen 0,0015 und 0,0025 eingeschlossen, – d₆ zwischen 1 und 1,2 eingeschlossen, – d₇ zwischen 1 und 1,2 eingeschlossen, – d₈ zwischen 0,09 und 1,1 eingeschlossen, – d₉ zwischen 1,2 und 1,5 eingeschlossen und – d₁₀ zwischen 4 und 5 eingeschlossen. – f5 = z1 × Log[α2-Makroglobulin (g/l)] – z2 × Log[Haptoglobin (g/l)] + z3 × Log[GGT (IE/l)] + z4 × [Alter (in Jahren)] + z5 × Log[Bilirubin (μmol/l)] – z6 × [ApoA1 (g/l)] + z7 × Geschlecht (weiblich = 0, männlich = 1) – z8 mit – z₁ zwischen 4 und 5 eingeschlossen, – z₂ zwischen 1,2 und 1,5 eingeschlossen, – z₃ zwischen 0,9 und 1,1 eingeschlossen, – z₄ zwischen 0,0026 und 0,03 eingeschlossen, – z₅ zwischen 1,6 und 1,9 eingeschlossen, – z₆ zwischen 1 und 1,3 eingeschlossen, – z₇ zwischen 0,25 und 0,35 eingeschlossen und – z₈ zwischen 5 und 6 eingeschlossen.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die logistische Funktion ausgewählt wird in der Gruppe bestehend aus: – f1-a = 6,826 × Log[α2-Makroglobulin (g/l)] – 0,479 × [α2-Globulin (g/l)] + 1,252 × Log[GGT (IE/l)] + 0,0707 × [γ-Globulin (g/l)] + 0,0273 × [Alter (Jahre)] + 1,628 × Log[Bilirubin (μmol/l)] – 0,925 × [ApoA1 (g/l)] + 0,344 × [Geschlecht (weiblich = 0, männlich = 1)] – 4,544; – f1-b = 6,552 × Log[α2-Makroglobulin (g/l)] – 0,458 × [α2-Globulin (g/l)] + 1,113 × Log[GGT (IE/l)] + 0,0740 × [γ-Globulin (g/l)] + 0,0295 × [Alter (Jahre)] + 1,473 × Log[Bilirubin (μmol/l)] – 0,979 × [ApoA1 (g/l)] + 0,414 × [Geschlecht (weiblich = 0, männlich = 1)] – 4,305;– f2 = 10,088 × Log[α2-Makroglobulin (g/l)] – 0,735 × [α2-Globulin (g/l)] + 2,189 × Log[GGT (IE/l)] + 0,137 × [γ-Globulin (g/l)] + 0,0546 × [Alter (Jahre)] + 4,301 × Log[Bilirubin (μmol/l)] – 2,284 × [ApoA1 (g/l)] + 0,294 × [Geschlecht (weiblich = 0, männlich = 1)] + 0,0312 [Albumin (g/l)] + 2,109[α1-Globulin (g/l)] – 0,136[β2-Globulin (g/l)] – 0,813 × Log[ALT (IE/l)] – 13,165;– f3 = 3,513 × Log[α2-Makroglobulin (g/l)] – 0,354 × [β2-Globulin (g/l)] + 0,889 × Log[GGT (IE/l)] + 0,0827 × [γ-Globulin (g/l)] – 0,0022 × [Alter (Jahre)] + 2,295 × Log[ALT (IE/l)] – 1,670 × [ApoA1 (g/l)] – 0,415 × [Geschlecht (weiblich = 0, männlich = 1)] – 4,311;– f4 = 5,981 × Log[α2-Makroglobulin (g/l)] – 0,481 × [α2-Globulin (g/l)] + 0,965 × Log[GGT (IE/l)] + 0,0679 × [γ-Globulin (g/l)] + 0,0190 × [Alter (Jahre)] + 1,143 × Log[Bilirubin (μmol/l)] – 1,097 × [ApoA1 (g/l)] + 0,092 × [Geschlecht (weiblich = 0, männlich = 1)] + 1,355 Log[ALT (IE/l)] – 4,498;– f5 = 4,467 × Log[α2-Makroglobulin (g/l)] – 1,357 × Log[Haptoglobin (g/l)] + 1,017 × Log[GGT (IE/l)] + 0,0281 × [Alter (in Jahren)] + 1,737 × Log[Bilirubin (μmol/l)] – 1,184 × [ApoA1 (g/l)] + 0,301 × Geschlecht (weiblich = 0, männlich = 1) – 5,540.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Endwert der logistischen Funktion für die Diagnose einer Zirrhose verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der Endwert der logistischen Funktion verwendet wird, um die Entwicklung der Krankheit vorherzusagen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der Endwert der logistischen Funktion für die Wahl einer geeigneten Behandlung für den Patienten verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der Endwert der logistischen Funktion bei der Entscheidung über die Ausführung einer Leberbiopsie bei dem Patienten verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Patient unter einer Erkrankung leidet, welche eine Leberfibrose, welche sich gegebenenfalls zu einer Zirrhose entwickelt, mit umfasst.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Erkrankung in der Gruppe bestehend aus Hepatitis B und C, Alkoholismus, Hämochromatose, Stoffwechselerkrankungen, Diabetes, Obesität, Autoimmunerkrankungen der Leber, primärer biliärer Zirrhose, α1-Antitrypsin-Mangel, Wilson-Krankheit enthalten ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Erkrankung eine Hepatitis C-Virus-Infektion ist.
Kit zur Diagnose einer Leberfibrose und/oder von nekro-inflammatorischen Leberläsionen bei einem Patienten, umfassend: a) Anweisungen, welche erlauben, das Vorliegen einer Leberfibrose und/oder von nekro-inflammatorischen Leberläsionen bei dem Patienten nach der quantitativen Bestimmung von biochemischen Markern zu bestimmen; b) Reagenzien zum Messen der Serumwerte der Konzentrationen von wenigstens fünf, sechs oder mehr biochemischen Markern, wobei die Marker ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus α2-Makroglobulin, AST (Aspartataminotransferase), ALT (Alaninaminotransferase), GGT (gamma-Glutamyltranspeptidase), γ-Globulin, gesamtem Bilirubin, Albumin, α1-Globulin, α2-Globulin, Haptoglobin, β-Globulin, apoA1, IL-10, TGF-β1, apoA2 und apoB; und c) Anweisungen zur Verwendung einer logistischen Funktion, wobei die Funktion durch das Verfahren nach Anspruch 1 erhalten wird, welche verwendet wird, um die Werte zu kombinieren, um einen Endwert zu erhalten, wobei eine Analyse des Endwerts das Vorliegen einer Leberfibrose und/oder von nekro-inflammatorischen Leberläsionen bei dem Patienten bestimmt.