DE102013217694A1

DE102013217694A1 - Vorrichtung und Verfahren zur Messung an Membranen und Zellen

Info

Publication number: DE102013217694A1
Application number: DE102013217694.5A
Authority: DE
Inventors: Thomas Knott; Michael Huber; Peter van Stiphout
Original assignee: CYTOCENTRICS BIOSCIENCE GmbH
Current assignee: CYTOCENTRICS BIOSCIENCE GmbH
Priority date: 2013-09-04
Filing date: 2013-09-04
Publication date: 2015-03-05
Also published as: WO2015032868A1

Abstract

Bei einer Vorrichtung (1) nach Art eines Patch-Clamp-Chips zur Bestimmung von biologisch relevanten Messgrößen an Membranen und Zellen (12) ist mindestens ein, vorzugsweise flaches Substrat (2) vorgesehen, das mikrofluidische Komponenten und/oder mikrofluidische Strukturen (3–7, 9–11) sowie mindestens eine Öffnung (8), an der die Membran oder Zelle (12) zumindest während einer Messung unter elektrischer Kontaktierung immobilisierbar ist, vorgesehen. Weiter umfasst die Vorrichtung (1) mindestens einen optischen Pfad (13) zur Übertragung elektromagnetischer Strahlung, der dem Substrat (2) zugeordnet ist und/oder Teil des Substrats (2) ist.

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung nach Art eines Patch-Clamp-Chips zur Bestimmung von vorzugsweise biologisch relevanten Messgrößen an Membranen und Zellen sowie Verfahren zur Bestimmung solcher Messgrößen.
Bei der sogenannten Patch-Clamp-Technik handelt es sich um eine Messmethode aus der Elektrophysiologie, die seit der zweiten Hälfte der 70er Jahre des vergangenen Jahrhunderts durch die Arbeiten von Neher und Sakmann bekannt ist. Durch diese Methode lassen sich Ströme durch einzelne Ionenkanäle in biologischen Membranen und Zellmembranen darstellen.
Das Funktionsprinzip der Patch-Clamp-Technik ist in vielen Übersichtsartikeln als Stand der Technik beschrieben.
Bei der sogenannten manuellen Patch-Clamp-Technik wird eine Glaskapillare, die in der Regel frisch bereitgestellt wird, mit einer leitfähigen Lösung, in die eine Metallelektrode taucht, befüllt und, meist unter optischer Kontrolle, mit einer intakten Zelle kontaktiert. Dann wird durch einen angelegten Unterdruck eine Versiegelung zwischen biologischer Membran und Pipette erzeugt, idealerweise unter Ausbildung eines sogenannten Gigaseals, d.h. unter Ausbildung eines elektrischen Widerstands in der Größenordnung von mindestens einem Gigaohm.
Eine solche manuelle Patch-Clamp-Technik ist jedoch für den wachsenden Bedarf an Patch-Clamp-Messungen in der Forschung, insbesondere in der Pharmaforschung, nicht geeignet, da die Durchführung einer einzelnen Messung viel Zeit in Anspruch nimmt. Es wurden deshalb Patch-Clamp-Techniken entwickelt, die an planaren, d.h. flachen, Substraten durchgeführt werden. Hier wird dann keine Pipette auf einer Zelle positioniert, sondern eine Zell-Suspension wird auf ein flaches Substrat, das auch als Chip bezeichnet wird, aufgebracht, und die Membranen/Zellen werden auf Öffnungen oder Vertiefungen positioniert, die in diesem Chip vorgesehen sind.
Mit diesen zuletzt beschriebenen Techniken lassen sich automatisierte Verfahren für Patch-Clamp-Messungen realisieren. Dabei sind mikrofluidische Strukturen, die für die entsprechende Messung notwendig oder von Vorteil sind, idealerweise bereits in den sogenannten Patch-Clamp-Chip integriert.
Bei den beschriebenen planaren Systemen gibt es solche, bei denen es nicht notwendig ist, dass an jeder der vorhandenen Öffnungen tatsächlich eine Membran oder Zelle immobilisiert ist. Ein solches System ist beispielsweise in der EP-B1-1 802 752 bzw. der parallelen US-A1-2006/0194255 beschrieben. Allerdings lassen sich mit solchen Systemen sogenannte Gigaseals nur schwer realisieren, so dass zur Bereitstellung von Gigaseals beispielsweise sogenannte seal enhancer (Pufferlösungen basierend auf reaktionsfreudigen Elementen wie beispielsweise Fluor) zur Hilfe genommen werden müssen.
Ein anderes planares Patch-Clamp-System ist in der EP-B1-1 311 655 dargestellt. Hier ist es durch einen separaten Ansaugkanal möglich, dass eine einzelne Membran oder Zelle über der eigentlichen Patch-Clamp-Öffnung positioniert wird, bevor das eigentliche Seal an der Öffnung ausgebildet wird. Hierbei sind auch ohne weiteres sogenannte Gigaseals realisierbar.
Die Erfindung stellt sich die Aufgabe, die bereits bekannten planaren Patch-Clamp-Systeme weiter zu verbessern. Insbesondere soll es ermöglicht werden, die Positionierung und Immobilisierung von Membranen oder Zellen an einer Öffnung, an der das entsprechende Seal ausgebildet wird, noch besser zu kontrollieren. Weiter wird zum einen angestrebt, die Faktoren, die die Messgrößen bei der Patch-Clamp-Messung beeinflussen, gezielt zu variieren, und zum anderen, die erhaltenen Messgrößen besser zu detektieren und auszuwerten. Schließlich soll es ermöglicht werden, die Membranen und Zellen gezielt zu stimulieren.
Diese Aufgaben werden gelöst durch die Vorrichtung mit den Merkmalen des Anspruchs 1 und durch die Verfahren mit den Merkmalen der Ansprüche 10 und 11. Bevorzugte Ausführungen der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind in den abhängigen Ansprüchen 2 bis 9 beschrieben. Der Wortlaut sämtlicher Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt dieser Beschreibung gemacht.
Wie eingangs erläutert, ist die erfindungsgemäße Vorrichtung nach Art eines Patch-Clamp-Chips zur Bestimmung von vorzugsweise biologisch relevanten Messgrößen an Membranen und Zellen vorgesehen. Insbesondere weisen diese Membranen und Zellen Membranproteine wie beispielsweise Ionenkanäle auf oder sind in der Lage, solche Membranproteine auszubilden.
Nach der Erfindung weist die beanspruchte Vorrichtung mindestens ein, vorzugsweise flaches Substrat auf, das mikrofluidische Komponenten und/oder mikrofluidische Strukturen sowie mindestens eine Öffnung besitzt, an der die Membran oder Zelle zumindest während einer Messung unter elektrischer Kontaktierung immobilisierbar ist. Dieses Immobilisieren erfolgt vorzugsweise an der Oberseite der Öffnung.
Weiter besitzt die erfindungsgemäße Vorrichtung mindestens einen optischen Pfad, der dem Substrat zugeordnet ist und/oder Teil des Substrats ist. Dieser optische Pfad dient zur Übertragung elektromagnetischer Strahlung.
Mit anderen Worten lässt sich die Erfindung auch so beschreiben, dass bei einem planaren Patch-Clamp-System, das mindestens ein, vorzugsweise flaches Substrat aufweist und mit dem sich automatisierte Verfahren für Patch-Clamp-Messungen realisieren lassen, insbesondere bei einem sogenannten Patch-Clamp-Chip, mindestens ein optischer Pfad vorhanden ist. Dieser optische Pfad ist entweder Teil des Substrats selbst, oder er ist dem Substrat zugeordnet.
Der Ausdruck „Substrat“ soll nach der Erfindung umfassend verstanden werden, d.h. es soll sich hier um ein Material nach Art eines Trägers, einer Grundplatte oder dergleichen handeln, an dem die zur Durchführung der Patch-Clamp-Messungen notwendigen Strukturen, Komponenten und dergleichen ausgebildet oder vorgesehen sind. Vorzugsweise handelt es sich hierbei um ein flaches Substrat nach Art einer Platte oder Folie. Dies soll bedeuten, dass derartige Substrate in der Regel eine größere Breite bzw. Länge, insbesondere eine wesentlich größere Breite bzw. Länge, gegenüber der Dicke (oder Höhe) eines solchen flachen Substrats aufweisen. Dabei wird in der Regel die Dicke eines folienartigen Substrats, das auch flexibel ausgestaltet sein kann, geringer sein als die Dicke eines plattenartigen Substrats.
„Mikrofluidische Komponenten“ oder „mikrofluidische Strukturen“ sind Komponenten, Strukturen, Bauteile und dergleichen, die eine Bevorratung, Bewegung, Mischung, Trennung oder sonstige Handhabung von flüssigen Medien auf kleinem und kleinstem Raum ermöglichen. Wie eingangs erläutert, werden bei den entsprechenden Patch-Clamp-Messungen die zu untersuchenden Membranen oder Zellen in der Regel in Form von Suspensionen in geeigneten Lösungsmitteln gehandhabt, und dabei u.a. an die entsprechende Patch-Clamp-Öffnung herangeführt oder von dieser abtransportiert. Derartige Suspensionen werden durch die genannten mikrofluidischen Komponenten und Strukturen hindurchgeführt. Das entsprechende Fachgebiet ist dem Fachmann unter dem Begriff der Mikrofluidik bekannt.
Unter „Membranen“ im Sinne der Erfindung sollen alle Trennschichten oder auch Schichten mit anderer Funktion verstanden werden, die mit Hilfe der Patch-Clamp-Technik untersucht werden können. Es kann sich hier ohne weiteres auch um künstliche Membranen handeln, die beispielsweise in Form von Lipid-Doppelschichten realisierbar sind. Bei den sogenannten Biomembranen, die erfindungsgemäß bevorzugt untersucht werden, handelt es sich in der Regel um Trennschichten zwischen verschiedenen Bereichen innerhalb einer lebenden Zelle (intrazellulär) oder auch zwischen dem Inneren einer Zelle und dem Zellaußenraum. Dementsprechend ist es erfindungsgemäß möglich, sowohl einzelne Membranfragmente, vollständige Membranen oder auch vollständige Zellen zu untersuchen. Auch Zellverbunde sollen von der Erfindung mit umfasst sein.
Bei einem „optischen Pfad“ handelt es sich erfindungsgemäß um Mittel, die zur Übertragung elektromagnetischer Strahlung vorgesehen oder geeignet sind. Derartige Mittel können auch gegebenenfalls weitere Mittel zur Erzeugung der elektromagnetischen Strahlung selbst enthalten.
Erfindungsgemäß ist der optische Pfad nicht auf die Übertragung bestimmter Wellenlängen der elektromagnetischen Strahlung beschränkt. Es können die unterschiedlichsten Wellenlängen, insbesondere von dem Gebiet der ultravioletten Strahlung bis zum Gebiet der Infrarotstrahlung übertragen werden. Insoweit ist der Begriff „optisch“ breit zu verstehen, und nicht nur auf den Bereich des sichtbaren Lichts beschränkt.
Der optische Pfad dient bei der Erfindung im weitesten Sinne dazu, die durch ihn übertragene elektromagnetische Strahlung für die Patch-Clamp-Messung, insbesondere die automatisierte Patch-Clamp-Messung nutzbar zu machen.
Solange dieser Zweck erfüllt ist, spielt es grundsätzlich keine Rolle, in welcher Weise der optische Pfad bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung vorgesehen ist.
Dementsprechend kann der optische Pfad dem Substrat in beliebiger Weise zugeordnet sein oder einen Teil des Substrates darstellen. Verschiedene bevorzugte Ausgestaltungen werden im Folgenden noch diskutiert.
Wie bereits erläutert, befindet sich erfindungsgemäß im Substrat mindestens eine Öffnung, an der die Membran oder Zelle unter Ausbildung des Seals immobilisiert wird. Diese Öffnung wird in der Regel an einem Kanal, einer Pore, einer Bohrung oder dergleichen gebildet sein, die im weitesten Sinne die Patch-Clamp-Pipette darstellt. Bezogen auf den Funktionszustand der Vorrichtung, d.h. auf den Zustand, in dem die Zelle an der Öffnung immobilisiert ist und eine Messung durchgeführt werden kann, erfolgt die Immobilisierung bevorzugt an der „Oberseite“ der Patch-Clamp-Pipette und damit auch an der „Oberseite“ der durch diese Pipette gebildeten Öffnung. Dies wird im Zusammenhang mit der Zeichnung noch näher erläutert.
Der erfindungsgemäß vorgesehene optische Pfad kann nun grundsätzlich an beliebigen Stellen am Substrat vorgesehen oder diesem zugeordnet sein. Bezieht man dies auf die soeben beschriebene Ausgestaltung, dass die Immobilisierung der Membran oder Zelle an der „Oberseite“ der Öffnung erfolgt, so kann der optische Pfad dementsprechend möglichen Seitenflächen des Substrats zugeordnet sein oder auch der Seite (Oberseite), an der die Immobilisierung der Membran/Zelle erfolgt. Es ist erfindungsgemäß jedoch bevorzugt, wenn der optische Pfad derjenigen Seite des Substrats zugeordnet ist oder sich an derjenigen Seite des Substrats befindet, die zu der Seite der Öffnung abgewandt ist, an der die Membran/Zelle immobilisiert wird. Wie im Zusammenhang mit der Zeichnung ebenfalls noch erläutert wird, erfolgt die Immobilisierung der Membran/Zelle dann vorzugsweise an der Oberseite der Öffnung (Funktionszustand), während der optische Pfad dann am Substrat an der Seite vorgesehen ist, die zu der der Membran/Zelle abgewandten Seite der Öffnung bzw. der Patch-Clamp-Pipette gehört. Wird der optische Pfad in diesem Zusammenhang beispielsweise zu einer direkten optischen Beobachtung der Membran/Zelle während des Messvorgangs eingesetzt oder beispielsweise zur optischen Anregung der Membran/Zelle oder zur optischen Anregung von Reaktionen, die an der Membran/Zelle ablaufen, so kann man dies auch so beschreiben, dass diese Beobachtung/Anregung „von unten her“ erfolgt.
Wie bereits dargestellt, kann der optische Pfad bei der Erfindung in verschiedener Weise realisiert werden. So ist es vorzugsweise möglich, dass der optische Pfad mindestens teilweise, vorzugsweise vollständig, als Ausnehmung im Substrat selbst ausgebildet ist. Besteht das Substrat bei der Erfindung mindestens teilweise aus Material , das für mindestens einen Teil des elektromagnetischen Spektrums transparent ist, so kann an den Stellen, an denen der optische Pfad ausgebildet sein soll, entweder dieses Material selbst oder ein anderes Material, das dieses Material umgibt, entfernt werden, um auf diese Weise den „Zugang“ der entsprechenden elektromagnetischen Strahlung hin zur immobilisierten Membran/Zelle und damit die entsprechende Beobachtung/Anregung und dergleichen zu ermöglichen.
In Weiterbildung ist es bei der Erfindung möglich, dass der optische Pfad ein transparentes Material umfasst, das zumindest für einen Teil des elektromagnetischen Spektrums (mindestens teilweise) transparent ist. Hierbei kann es sich beispielsweise auch um entsprechende Kunststoffmaterialien handeln. Vorzugsweise umfasst der optische Pfad jedoch in solchen Fällen (transparentes) Glas oder Quarzglas oder besteht vollständig aus solchen Materialien. Insbesondere können in diesen Fällen dann Sichtöffnungen oder sogenannte Fenster aus transparentem Glas oder Quarzglas vorgesehen sein.
Bei anderen bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung umfasst der optische Pfad mindestens eine Glasfaseroptik oder mindestens eine Mikroskopoptik. Derartige Optiken sind dann dem Substrat ebenfalls in geeigneter Weise zugeordnet, oder sie bilden ein Bauteil des Substrats. Insbesondere können solche Optiken in entsprechenden Ausnehmungen am Substrat vorgesehen sein. In gleicher Weise ist es möglich, eine Schnittstelle für eine Glasfaseroptik oder eine Mikroskopoptik vorzusehen, mit deren Hilfe dann die eigentliche Glasfaseroptik oder Mikroskopoptik an das Substrat bzw. die Vorrichtung angeschlossen werden kann. Auch hier soll der Begriff der Optik umfassend verstanden werden und bedeuten, dass grundsätzlich jede Art von elektromagnetischer Strahlung durch die entsprechenden Optiken hindurch übertragen werden kann.
Wie bereits ausgeführt, können die mikrofluidischen Komponenten oder mikrofluidischen Strukturen bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung in unterschiedlicher Weise ausgebildet sein, insbesondere im Hinblick darauf, dass automatisierte Patch-Clamp-Messungen durchführbar sind. In diesem Zusammenhang sind Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Vorrichtung bevorzugt, bei denen zusätzlich zu der Öffnung, an der die Membran/Zelle immobilisiert wird, und gegebenenfalls zusätzlich zu dem Kanal, an dem diese Öffnung ausgebildet ist, mindestens ein (weiterer) separater Kanal vorgesehen ist. Dieser separate Kanal steht mit der genannten Öffnung nicht in (direkter) Verbindung und ist dazu vorgesehen, die Membran oder Zelle durch Anlegen eines Unterdrucks an der genannten Öffnung zu positionieren bzw. festzulegen. Dieses Merkmal des separaten Kanals, der gegebenenfalls auch als Ansaugkanal bezeichnet werden kann, sowie dessen Funktion ist in der oben bereits genannten EP-B1-1 311 655 beschrieben. Auf den Inhalt dieser Patentschrift wird Bezug genommen und verwiesen. Die insoweit notwendige Offenbarung wird hiermit durch diese Bezugnahme zum Inhalt dieser Beschreibung gemacht.
Der (zusätzliche) separate Kanal kann eine beliebige Querschnittsform bzw. Querschnittsfläche besitzen. Bevorzugt handelt es sich um Querschnittsflächen, die kreisförmig, oval, rechteckförmig oder quadratisch sind. Es sind jedoch auch andere n-eckförmige (n > 3) Querschnittsflächen u.a. möglich. Der Durchmesser D all dieser Querschnittsflächen soll dabei als die größte Abmessung definiert sein, die zwischen zwei Punkten auf dem Außenumfang der Querschnittsfläche existiert.
Vorzugsweise mündet der genannte separate Kanal in einer separaten Öffnung, d.h. in einer Öffnung, die mit der Öffnung, an der die Membran/Zelle immobilisiert wird, nicht in Verbindung steht. Vorzugsweise umgibt die separate Öffnung die Öffnung, an der die Membran/Zelle immobilisiert wird, mindestens teilweise, vorzugsweise vollständig konzentrisch. Auch dies wird im Zusammenhang mit der Zeichnung noch näher erläutert.
Bei weiteren bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist der Durchmesser (D) des separaten Kanals über den Verlauf dieses Kanals nicht konstant. Insbesondere vergrößert sich der Durchmesser des separaten Kanals in Richtung auf seine separate Öffnung, vorzugsweise kontinuierlich. Auf diese Weise lässt sich die Funktion des separaten Kanals, nämlich die Membran/Zelle (vor Ausbildung des eigentlichen Seals/Gigaseals an der Öffnung) beispielsweise aus der Suspension, in der sich die Membran/Zelle befindet, zu selektieren, zu positionieren oder wieder zu entfernen in steuerbarer Weise noch besser zu erfüllen.
Wie aus den bisherigen Ausführungen bereits hervorgeht, kann das Merkmal des separaten Kanals, der zur Positionierung/Festlegung der Membran/Zelle an der eigentlichen Patch-Clamp-Öffnung vorgesehen ist, auf unterschiedliche Weise realisiert werden. So kann zu dem entsprechenden Zweck ein separater Kanal, der in der zugehörigen separaten Öffnung mündet, vorgesehen sein. Bei anderen Ausführungsformen kann auch ein separater Kanal vorhanden sein, der mit mindestens zwei, vorzugsweise mehreren separaten Öffnungen in Verbindung steht.
Schließlich sind Ausführungsformen möglich, bei denen mindestens zwei, vorzugsweise mehrere separate Kanäle vorgesehen sind, die wiederum jeweils in einer separaten Öffnung oder auch in mindestens zwei, vorzugsweise mehreren Öffnungen münden können.
Bei allen genannten Ausführungsformen mit mindestens einem separaten Kanal ist es bevorzugt, wenn die separaten Öffnungen, in denen die separaten Kanäle münden, die eigentliche (Patch-Clamp-)Öffnung, an der die Membran/Zelle unter Ausbildung eines Seals/Gigaseals immobilisiert wird, mindestens teilweise konzentrisch umgeben. Durch eine derartige (mindestens teilweise) konzentrische Anordnung kann die Zelle in besonders günstiger Weise entlang ihres Aussenumfangs an bzw. über der eigentlichen Patch-Clamp-Öffnung positioniert bzw. festgelegt werden.
Besonders bevorzugt ist die erfindungsgemäße Vorrichtung unter näherer Definition der vorgesehenen mikrofluidischen Komponenten oder Strukturen wie folgt ausgebildet. Sie weist auf:

– ein Substrat mit den folgenden mikrofluidischen Strukturen: o mindestens einen Flüssigkeitszulauf, vorzugsweise zwei Flüssigkeitszuläufe, o mindestens einen Flüssigkeitsablauf, o mindestens eine zwischen dem Flüssigkeitszulauf und dem Flüssigkeitsablauf angeordnete Perfusionskammer, o mindestens einen Kanal nach Art einer Patch-Clamp-Pipette mit einer Öffnung, die in der Perfusionskammer mündet, wobei der Kanal vorzugsweise mit mindestens einem weiteren Flüssigkeitskanal in direkter Verbindung steht, und o mindestens einen separaten Kanal, der mit der Öffnung nicht in direkter Verbindung steht und der in mindestens einer separaten Öffnung mündet, die insbesondere die Öffnung mindestens teilweise konzentrisch umgibt.

Weiterhin ist bei den zuletzt genannten Ausführungsformen ebenfalls ein optischer Pfad zur Übertragung von elektromagnetischer Strahlung vorhanden. Dieser optische Pfad befindet sich vorzugsweise auf der zur Oberseite der Öffnung abgewandten Seite des Substrats.
Bei den zuletzt beschriebenen Ausführungsformen besitzt also der Kanal nach Art einer Patch-Clamp-Pipette diejenige Öffnung, an der die Immobilisierung der Membran/Zelle unter Ausbildung des Seals/Gigaseals für die Patch-Clamp-Messung erfolgt. Diese Öffnung mündet in der Perfusionskammer, in der sich also die immobilisierte Membran/Zelle während der Patch-Clamp-Messung in immobilisiertem Zustand befindet. Der weitere Flüssigkeitskanal, der mit dem genannten Kanal in Verbindung stehen kann, dient dazu, an der Öffnung einen definierten, einstellbaren Flüssigkeitsdruck auf die Membran/Zelle zur Ausbildung des Seals/Gigaseals aufzubringen. Dies geht auch aus der Zeichnung hervor.
Der separate Kanal, der mit der genannten Öffnung, an der das Seal/Gigaseal ausgebildet wird, nicht in (direkter) Verbindung steht, mündet in einer oder mehreren separaten Öffnungen. Diese separaten Öffnungen dienen beispielsweise dazu, die Membran/Zelle durch Anlegen eines Unterdrucks an der Öffnung, an der später das Seal/Gigaseal ausgebildet wird, zu positionieren. Zu diesem Zweck ist es von Vorteil, wenn die separate Öffnung bzw. die separaten Öffnungen die Öffnung, an der (später) das Seal/Gigaseal ausgebildet wird, mindestens teilweise konzentrisch, vorzugsweise vollständig konzentrisch, umgibt oder umgeben.
Die eine oder mehrere separate Öffnungen können so ausgelegt sein, dass eine Strömung durch die separate Öffnung hindurch an der Zelle vorbei möglich ist, wodurch der Lösungswechsel oder Suspensionswechsel an der Zelle bei longitudinaler Strömung in der Perfusionskammer (d.h. in Längsrichtung der Kammer vom Zulauf zum Ablauf) zusätzlich beschleunigt werden kann, indem die Zelle zusätzlich zu einer laminaren longitudinalen Strömung einer transversalen Strömung (d.h. quer, insbesondere senkrecht zur Längsrichtung (quasi in Richtung Substrat)) ausgesetzt wird.
Sowohl der Kanal nach Art einer Patch-Clamp-Pipette als auch der separate Kanal sind vorzugsweise in der Weise steuer- und regelbar, dass diese Kanäle gezielt mit Flüssigkeit, insbesondere mit Flüssigkeitsdruck, beaufschlagbar sind, und dies bidirektional. Dies bedeutet, dass gezielt Überdrucke und Unterdrucke der entsprechenden Flüssigkeiten in diese Kanäle eingebracht werden können, damit diese die beschriebenen Funktionen erfüllen.
Insbesondere können die letztgenannten Funktionen erfindungsgemäß dadurch bereitgestellt werden, dass mindestens zwei, vorzugsweise zwei weitere Flüssigkeitskanäle vorgesehen sind, die mit dem Kanal nach Art einer Patch-Clamp-Pipette in Verbindung stehen. In gleicher Weise können vorzugsweise mindestens zwei separate Kanäle, vorzugsweise zwei (weitere) separate Kanäle, die mit der separaten Öffnung in Verbindung stehen, vorgesehen sein. Auf diese Weise ist es möglich, dass die jeweils zusätzlichen (zweiten) Kanäle eine Bypass-Funktion für die jeweils zugehörigen (ersten) Kanäle übernehmen können.
Bei den zuletzt beschriebenen Ausführungsformen ist es dann beispielsweise möglich, den Kanal nach Art einer Patch-Clamp-Pipette bzw. den separaten Kanal mit Hilfe des jeweiligen Bypass-Kanals zu befüllen. Dabei sind die beiden jeweils einander zugehörigen Kanäle als Zuführkanal (Einfließrichtung der Flüssigkeit) bzw. als Abführkanal (Rückflussrichtung der Flüssigkeit) genutzt. Der eigentliche Patch-Clamp-Kanal (Pipette) bzw. der der separaten Öffnung zugeordnete eigentliche separate Kanal wird auf diese Weise nach Art einer Abzweigung befüllt, da der eigentliche Füllstrom der Flüssigkeit an den jeweiligen Öffnungen vorbeigeführt wird. Dies ist insbesondere deshalb von praktischer Bedeutung, da auf diese Weise bspw. Luft oder allgemein Gase, die sich in diesen mikrofluidischen Strukturen befinden, besser kontrolliert oder geregelt strömen und ggf. durch die entsprechende Flüssigkeit ersetzt werden können.
Auch ein Flüssigkeitsaustausch in den mikrofluidischen Strukturen ist auf diese Weise besser möglich, da auch ein solcher Flüssigkeitsaustausch nicht über die eigentliche Patch-Clamp-Öffnung bzw. über die separate Öffnung erfolgen muss. Ein solcher Flüssigkeitsaustausch ist beispielsweise nach dem mechanischen Durchbrechen einer Zellmembran für einen intrazellulären Lösungswechsel nötig oder für das Einbringen perforierender Substanzen, wenn ein mechanisches Durchbrechen der Zellmembran nicht vorgesehen ist.
Schließlich ist es bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung bevorzugt, dass die von dem Kanal nach Art einer Patch-Clamp-Pipette gebildete Öffnung und/oder die von dem separaten Kanal gebildete separate Öffnung in die Perfusionskammer hineinragt, d.h. sich sozusagen im Inneren der Perfusionskammer befindet. Man kann dies auch so beschreiben, dass sich die entsprechenden Öffnungen in diesen Fällen nicht in der Begrenzungsfläche oder Wand der Perfusionskammer befinden, sondern über diese Begrenzungsfläche hinaus in das Innere der Perfusionskammer ragen. Dies hat Vorteile im Hinblick auf die Durchströmung der Perfusionskammer mit der Suspension, die die Membranen/Zellen enthält, und damit einen Einfluss auf die Positionierbarkeit bzw. auf die tatsächliche Immobilisierung der Membranen/Zellen mit Hilfe der und an den entsprechenden Öffnungen. Des Weiteren kann eine auf der Öffnung kontaktierte Zelle bei solchen Ausführungsformen so schneller mit einer weiteren Lösung oder Suspension umspült werden, z.B. um einen Liganden schneller an einen ligandengesteuerten Ionenkanal anzuspülen, als dieser Ionenkanal durch Desensitivierung inaktiviert.
Die zuletzt beschriebene Ausbildung der Öffnungen (Hineinragen) kann beispielsweise durch eine entsprechende mikromechanische Strukturierung im Substrat realisiert werden.
Bei allen Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann das Substrat mindestens teilweise aus Glas oder Quarzglas, vorzugsweise vollständig aus Glas oder Quarzglas, bestehen. Auch andere teilweise oder völlig transparente Materialien wie teilweise oder völlig transparente Kunststoffe können eingesetzt werden. Auch Materialien, die ein spezifisches Transmissionsspektrum aufweisen, sind verwendbar, um z.B. bestimmte Frequenzanteile elektromagnetischer Strahlung (beispielsweise mit unerwünschter biologischer Aktivität) auszublenden.
In diesem Zusammenhang ist es insbesondere auch möglich, bestimmte Stellen des Substrats bewusst nicht aus teilweise oder völlig transparentem Material zu fertigen, beispielsweise um einen Einfall von elektromagnetischer Strahlung an bestimmten Stellen zu verhindern. Dies kann beispielsweise dazu dienen, eine Einstreuung unerwünschter elektromagnetischer Strahlung (Streulicht) zu verhindern.
Außerdem sollen von der Erfindung auch Vorrichtungen umfasst sein, bei denen in einem Substrat, vorzugsweise flachen Substrat, nicht nur eine Öffnung, sondern mindestens zwei, vorzugsweise mehrere Öffnungen vorgesehen sind, an denen unter Immobilisierung einer Membran/Zelle ein Seal/Gigaseal ausgebildet ist. Zusätzlich zu diesen Öffnungen können dann gegebenenfalls für alle Öffnungen separate Öffnungen vorgesehen sein, an denen eine vorherige Positionierung der Membranen/Zellen vor Ausbildung des Seals/Gigaseals möglich ist. In der beschriebenen Weise können solche separaten Öffnungen diese Öffnungen mindestens teilweise, vorzugsweise vollständig, konzentrisch umgeben.
Weiter ist es erfindungsgemäß möglich, dass eine erfindungsgemäße Vorrichtung mehrere vorzugsweise flache Substrate (mit einer Öffnung oder mehreren Öffnungen) umfasst. Dabei können mindestens zwei, insbesondere mehrere solcher Substrate über einen geeigneten Träger, der beispielsweise gitter- oder rasterartig angeordnet sein kann, zu einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zusammengefasst werden.
Schließlich ist es auch möglich, mehrere der zuletzt beschriebenen Vorrichtungen zu einer (größeren) erfindungsgemäßen Vorrichtung zusammenzufassen.
Man kann dies auch so beschreiben, dass in den zuletzt genannten Fällen mehrere Patch-Clamp-Chips (mit einem oder mehreren Substraten, die wiederum eine oder mehrere Öffnungen für das Seal/Gigaseal aufweisen können) zu einer größeren Einheit mit mehreren Chips zusammengefasst werden.
Neben der beschriebenen erfindungsgemäßen Vorrichtung umfasst die Erfindung neue Verfahren, die im Folgenden beschrieben werden.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist zunächst ein Verfahren zur Bestimmung von vorzugsweise biologisch relevanten Messgrößen an Membranen und Zellen, die insbesondere Membranproteine wie beispielsweise Ionenkanäle aufweisen oder ausbilden, bei dem entweder eine optisch ausgelöste Immobilisierung der Membran oder der Zelle an einer in einem vorzugsweise flachen Substrat vorgesehenen Öffnung oder eine optisch ausgelöste Messung an einer Membran oder Zelle, die an einer in einem vorzugsweise flachen Substrat vorgesehenen Öffnung immobilisiert ist, erfolgt. Solche Verfahren können vorzugsweise mit der bereits beschriebenen erfindungsgemäßen Vorrichtung durchgeführt werden.
Weiter bevorzugt ist erfindungsgemäß ein Verfahren zur Bestimmung von vorzugsweise biologisch relevanten Messgrößen an Membranen und Zellen, die insbesondere Membranproteine wie beispielsweise Ionenkanäle aufweisen oder ausbilden, bei dem eine Stimulation, insbesondere eine optische Stimulation der Membran oder der Zelle erfolgt, während die Zelle an einer in einem vorzugsweise flachen Substrat vorgesehenen Öffnung immobilisiert ist. Auch bei den zuletzt genannten bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens kann dieses insbesondere mit der bereits beschriebenen erfindungsgemäßen Vorrichtung durchgeführt werden.
Erfolgt bei den zuletzt genannten Verfahren (alternativ zu oder zusätzlich zu einer optischen Stimulation) eine andere Stimulation der Membran oder Zelle, so handelt es sich hierbei vorzugsweise um eine mechanische, eine chemische, eine biochemische und/oder eine thermale Stimulation. In diesen Fällen wird die Membran/Zelle dementsprechend mechanisch, durch einen chemischen oder biochemischen Stoff oder durch die Einwirkung von Wärme/Hitze stimuliert, um eine mögliche Reaktion der Membran/Zelle auf den entsprechenden Reiz (Stimulation) zu untersuchen.
Im Rahmen der genannten erfindungsgemäßen Verfahren lässt sich eine optisch ausgelöste Immobilisierung der Membran/Zelle beispielsweise in der Weise realisieren, dass basierend auf einem optischen Signal Membranen/Zellen an der Patch-Clamp-Öffnung gefangen und immobilisiert werden. Auch eine Freigabe der Membran/Zelle von dieser Öffnung kann aufgrund optischer Signale bewirkt werden. Man kann hier auch von einer optisch getriggerten Selektion der Membranen/Zellen sprechen.
Eine optisch ausgelöste Messung an der Membran/Zelle kann bei anderen Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgen, indem Eigenschaften, Zusammensetzungen, Konzentrationen u.a. von nicht-organischen oder organischen/biologischen Substanzen an den immobilisierten Membranen oder Zellen bestimmt werden.
Auch hier ist eine optisch getriggerte Messung möglich, z.B. ein Start der Messung nach Überschreitung einer vorgegebenen Schwelle eines optischen oder elektrophysiologischen Messwerts.
Grundsätzlich können bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die unterschiedlichsten Messgrößen bestimmt werden wie Volumen, Größe, Masse, Dichte, elektrophysiologische Aktivität, Vitalität, Morphologie und dergleichen. In diesem Zusammenhang ist es auch möglich, emittierte elektromagnetische Strahlung beliebiger Frequenzen zu detektieren, um molekulare Veränderungen, insbesondere Konzentrationsänderungen ausgewählter Stoffe zu detektieren, entweder in der beschriebenen mikrofluidischen Struktur oder in der entsprechenden Membran/Zelle. Besonders hervorzuheben ist hier die Detektion fluoreszierender Stoffe, beispielsweise Moleküle, deren Wechselwirkung mit der Membran/Zelle erfindungsgemäß untersucht werden kann.
Erfindungsgemäß können hier über den erfindungsgemäß vorgesehenen optischen Pfad Patch-Clamp-Messungen kombiniert werden mit abbildender Mikroskopie, mit Fluoreszenzmessungen, mit Polarisationsfiltern, Frequenz- und anderen Filtern, mit konfokaler Mikroskopie, mit FRET (Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer), mit anderer (Bio-/Chemo-)Lumineszenzmessung, mit photometrischen oder kolorimetrischen Messungen, mit optischer Detektion von Gasblasen und makroskopischen Teilchen, mit dem Einsatz von Kontrastmitteln, auch in Verbindung mit den zuvor genannten Verfahren. Auch die zeitabhängige optische Messung der Proteinlokalisation und des sogenannten Proteintrafficking (gegebenenfalls im Zeitraum von Stunden oder Tagen) ist erfindungsgemäß möglich.
Wie bereits angesprochen, ist bei dem erfindungsgemäßen Verfahren, bei dem eine Stimulation der Membran oder Zelle erfolgt, die Applikation unterschiedlichster Stimuli möglich, und zwar am Äußeren der Zellen oder im Inneren der Zellen oder sogar im Zellverbund oder Gewebsverbund. Diese Stimuli werden in der Regel über die mikrofluidischen Strukturen im Substrat während der Messung aufgebracht.
Bei den mechanischen Stimuli kann es sich hier um eine Änderung des Durchflusses der Strömung, um einen Richtungswechsel der Strömung, um Druckveränderungen in den verschiedenen mikrofluidischen Strukturen (Patch-Clamp-Kanal, Ansaugkanal, Perfusionskammer und dergleichen) handeln.
Eine chemische/biochemische Stimulation kann erfolgen über, vorzugsweise schnelle Substanzwechsel an der Zelle während deren Immobilisierung im Gigaseal, z.B. an Liganden gesteuerten Ionenkanälen, über einen transversalen Strömungsfluss in der Perfusionskammer (sogenannter Cross Flow), und dergleichen. Dieser Cross Flow kann beispielsweise mit Hilfe der bereits beschriebenen Ansaugöffnung erfolgen.
Weiter können lichtaktivierbare Substanzen appliziert werden, die durch Belichtung in gleichbleibender oder veränderlicher Frequenz und/oder Lichtstärke und/oder über Lichtpulse freigesetzt werden, und so die jeweiligen Rezeptoren gegebenenfalls schneller ansprechen, als dies durch einen Lösungswechsel/Substanzwechsel möglich wäre.
Weitere Stimuli können direkt oder indirekt erzeugt werden durch

– Applikation von elektromagnetischer Strahlung jeglicher Frequenz zur Modifikation von Membranen, Zellen oder vorhandenen Substanzen während der Messung,
– Transfektion von positionierten Einzelzellen oder eines Zellverbunds oder eines Gewebsverbunds während der Messung,
– Zellwachstum von positionierten Einzelzellen oder eines Zellverbunds oder Gewebsverbunds während der Messung,
– Kultivierung von zellulären Netzwerken während der Messung,
– optische Stimulation lichtsensitiver Proteine (beispielsweise Ionenkanälen bzw. von an solchen Ionenkanälen gekoppelten Rezeptoren) und Vermessung der Lichtemission (im Dunkeln).

Insbesondere umfasst die Erfindung Verfahren, bei denen eine optische Messung und/oder optische Stimulation mit Patch-Clamp-Messungen und/oder einem Lösungswechsel an Zellen oder Membranen kombiniert wird. Dazu wird eine Zelle oder Membran mittels der separaten Öffnung auf der Patch-Clamp-Öffnung reversibel platziert und optisch vermessen. Weist die Zelle auf Basis der optischen Messungen nicht die gewünschten Eigenschaften auf, so kann die Zelle mit der separaten Öffnung und/oder der Strömung in der Perfusionskammer wieder abgespült werden und eine weitere Zelle angesaugt und, falls geeignet, an der Patch-Clamp-Öffnung irreversibel nach dem Patch-Clamp-Verfahren kontaktiert und dann optisch vermessen und stimuliert werden. Dabei kann intrazellulärer oder extrazellulärer Lösungswechsel erfolgen, um z.B. die Ionenkonzentration zu verändern oder biologisch aktive Substanzen an die Membran oder Zelle zu bringen. Parallel kann eine mechanische Stimulation über Drucke oder Strömungen an Öffnung, separater Öffnung oder Perfusionkammer erfolgen. Beispiele für das Verfahren sind automatisiertes Patch Clamp in Kombination mit intrazellulärer Perfusion, mit fluoreszenzbasierter Detektion und Zellselektion bei transienter Transfektion (z.B. GFP-Expression), mit fluoreszenzbasierter Detektion und Zellselektion von Antikörper-markierten Zellen, mit Fluoreszenz Detektion für intrazelluläre Calcium- oder pH-Messung (Fura-2 bzw.,BCECF-Farbstoffe u.ä), mit FRET, um in Kombination mit Patch Clamp Funktionsbeziehungen von Ionenkanälen zu untersuchen, mit der Möglichkeit der optisch induzierten Freisetzung von Zellstimulatoren und sog. Second Messenger (“caged compounds”, z.B. Ca2+, NO,) mit mechanosensitiven Zellen, mit Primärzellen, Stammzellen und Expressionssystemen, mit ligandengesteuerten Ionenkanälen, mit Lipidmembranpräparationen (wie Liposomen, Vesikel, Bilayer), mit der Erfassung von Teilchenströmung, z.B. Nanoteilchendichte oder Anzahl Zellen pro Volumen für Zellzählung, oder für die Erfassung von Verschmutzungen in Flüssigkeiten, wie z.B. Medikamentenrückständen im Trinkwasser u.a.
Zur weiteren Definition der erfindungsgemäßen Vorrichtung und der erfindungsgemäßen Verfahren werden noch die folgenden Angaben gemacht, die die Erfindung in keiner Weise einschränken sollen. Diese Angaben nennen lediglich Größen, die für die Erfindung bevorzugt, jedoch nicht zwingend sind.
So können die Abmessungen des Substrats, welches ein wesentliches Bauteil der erfindungsgemäßen Vorrichtung darstellt, in der Größenordnung von wenigen mm liegen. Fertigungstechnisch können die Abmessungen ca. 1 mm betragen, wobei Abmessungen von beispielsweise 2 mm × 3 mm üblich sind.
Der Durchmesser der Öffnung, an der die eigentliche Patch-Clamp-Messung stattfindet (Öffnung der Patch-Clamp-Pipette) beträgt zwischen 0,1 µm bis maximal einige 10 µm. Diese Obergrenze wird in der Regel ca. 1/10 des Durchmessers der zu untersuchenden Zellen betragen. Vorzugsweise beträgt der Durchmesser der genannten Öffnung ca. 1 bis ca. 5 µm, insbesondere ca. 2 bis 3 µm.
Der (Gesamt-)Durchmesser der separaten Öffnung (des Ansaugkanals) liegt vorzugsweise zwischen 0,5 µm bis ebenfalls einigen 10 µm. Als Obergrenze kann hier beispielsweise das Zweifache des Durchmessers der zu untersuchenden Zellen gewählt werden. Vorzugsweise liegt der Durchmesser der separaten Öffnung zwischen ca. 2 µm und ca. 20 µm, wobei innerhalb dieses Bereichs Durchmesser zwischen ca. 9 µm und ca. 12 µm weiter bevorzugt sind.
Die Dicke (Höhe) des Substrats liegt in der Größenordnung von einigen 10 µm. Dieses Substrat besteht üblicherweise aus einem Träger aus Silizium (Si) mit einer sich darauf befindenden Quarzschicht (SiO₂). In diese Quarzschicht sind üblicherweise die mikrofluidischen Strukturen (Kanäle, Öffnungen und dergleichen) eingebracht, in der Regel durch mikromechanische Bearbeitung, Ätzen oder dergleichen.
Die Drucke, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren in den mikrofluidischen Strukturen zur Anwendung kommen, liegen in der Regel zwischen 150 mbar bis 4 bar, wobei Druckänderungen über den genannten vollen Druckbereich innerhalb kurzer Zeiträume, beispielsweise innerhalb von 10 ms, vorgenommen werden können. Auch Stoßwellen können in entsprechender Weise erzeugt werden.
Die Strömungsgeschwindigkeiten innerhalb der mikrofluidischen Strukturen, insbesondere innerhalb der Perfusionskammer, liegen vorzugsweise zwischen einigen µm/s und einigen 100 mm/s, wobei hier Strömungsgeschwindigkeiten zwischen ca. 2 mm/s bis ca. 400 mm/s weiter bevorzugt sind.
Sofern nach den erfindungsgemäßen Verfahren Stimuli auf die immobilisierten Membranen/Zellen oder auf die sich innerhalb der mikrofluidischen Strukturen befindenden Flüssigkeiten aufgebracht werden, so können diese grundsätzlich so lange andauern wie die entsprechende Messkonfiguration besteht. In der Regel beträgt die Dauer der Stimuli zwischen 1 ms und 1h, wobei Stimuli über Zeiträume zwischen 10 ms bis 15 min, weiter bevorzugt sind.
In der Zeichnung zeigt
1 eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung nach Art eines Patch-Clamp-Chips.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung 1 nach 1 ist in der bereits beschriebenen Weise zur Bestimmung von vorzugsweise biologisch relevanten Messgrößen an Membranen und Zellen (12) vorgesehen, wobei diese Membranen/Zellen insbesondere Membranproteine wie beispielsweise Ionenkanäle aufweisen oder ausbilden. Aus Gründen der Übersichtlichkeit sind in 1 weitere Komponenten der Vorrichtung 1 wie Elektroden(n), Gegenelektrode(n), Pumpe(n), Ventil(e), Flüssigkeitsreservoir(s), Mess- und Steuergerät(e) u.a. nicht dargestellt.
Das gemäß 1 nicht in allen Einzelheiten dargestellte Substrat 2 umfasst in der Regel einen Träger aus Silizium (Si), der mit Quarz (SiO₂) beschichtet ist. Die in 1 dargestellten mikrofluidischen Strukturen (Kanäle, Öffnungen und dergleichen) sind in der Regel in der Quarzschicht vorgesehen. Insgesamt ist das Substrat 2 mehrere 10 µm dick.
Das Substrat 2 gemäß 1 weist zwei Zuläufe 3, 4 auf, durch die Lösungen/Suspensionen, insbesondere Suspensionen, die die zu untersuchenden Membranen/Zellen enthalten, einströmen können, und zwar in eine Perfusionskammer 6, an deren (Austritts-)Ende sich ein Ablauf 5 befindet.
In die Perfusionskammer 6 hinein ragt die Öffnung 8 eines Kanals 7 nach Art einer Patch-Clamp-Pipette. Gemäß 1 ist an der (Oberseite) der Öffnung 8 eine Zelle 12 immobilisiert, und zwar unter Ausbildung eines Seals/Gigaseals. Bei der Öffnung 8 handelt es sich also um die eigentliche Patch-Clamp-Öffnung, an der die Patch-Clamp-Messung stattfindet.
Der Kanal 7 mit Öffnung 8 ist mit einem weiteren Kanal 9 verbunden, mit dessen Hilfe Lösungen/Suspensionen in den Kanal 7 und damit an die Öffnung 8 (und gegebenenfalls an die immobilisierte Zelle 12) herangeführt werden können (oder wieder abgeführt). Gegebenenfalls können auch zwei Kanäle 9 vorgesehen sein, die beide mit dem Kanal 7 in Verbindung stehen. Der zweite Kanal dient bspw. nach Art eines Bypass zur Befüllung des Kanals 7 oder zum Flüssigkeitsaustausch im Kanal 7.
Weiter zeigt 1 einen separaten Kanal 10 mit einer separaten Öffnung 11, wobei die Öffnung 11 mit dem Kanal 7 und der Öffnung 8 nicht (direkt) verbunden ist. Auch hier kann ggf. ein zweiter Kanal 10 mit Bypass-Funktion vorgesehen sein, wie im Zusammenhang mit Kanal 9 bereits beschrieben.
Der Durchmesser des separaten Kanals 10 vergrößert sich in Richtung auf die Öffnung 11. Weiter umgibt die separate Öffnung 11 die Öffnung 8 konzentrisch, d.h. nach Art eines die Öffnung 8 umschließenden Rings, so dass mit Hilfe der separaten Öffnung 11 eine Zelle 12 über der Öffnung 8 eingefangen und positioniert werden kann (beispielsweise durch Anlegen eines Unterdrucks/Ansaugdrucks). Sobald die Zelle 12 selektiert und gegebenenfalls positioniert ist, kann das eigentliche Seal/Gigaseal an der Öffnung 8 ausgebildet werden.
Schließlich zeigt 1 einen als Ausnehmung bzw. Sichtfenster 13 ausgebildeten optischen Pfad, der im Substrat 2 vorgesehen ist. Wenn 1 den Funktionszustand der Vorrichtung 1 wiedergibt, so ist in dargestellten Fall die Zelle 12 an der Oberseite der Öffnung 8 bzw. des Kanals 7 immobilisiert, während die Ausnehmung 13 bzw. das Sichtfenster 13 an der Unterseite des Substrats vorgeseheen ist, die sich dementsprechend an der der Zelle abgewandten Seite der Öffnung 8 bzw. des Kanals 7 befindet. Eine Beobachtung oder Stimulation der Zelle 12 mit Hilfe der Ausnehmung 13 bzw. des Sichtfensters 13 als optischem Pfad erfolgt dementsprechend in der Ausführung gemäß 1 „von unten“.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

EP 1802752 B1 [0007]
US 2006/0194255 A1 [0007]
EP 1311655 B1 [0008, 0028]

Claims

Vorrichtung (1) nach Art eines Patch-Clamp-Chips zur Bestimmung von vorzugsweise biologisch relevanten Messgrößen an Membranen und Zellen (12), die insbesondere Membranproteine wie beispielsweise Ionenkanäle aufweisen oder ausbilden, mit – mindestens einem, vorzugsweise flachen Substrat (2), das mikrofluidische Komponenten und/oder mikrofluidische Strukturen (3–7, 9–11) sowie mindestens eine Öffnung (8), an der die Membran oder Zelle (12) zumindest während einer Messung unter elektrischer Kontaktierung immobilisierbar ist, vorzugsweise an der Oberseite der Öffnung (8), aufweist, und – mindestens einem optischen Pfad (13) zur Übertragung elektromagnetischer Strahlung, der dem Substrat (2) zugeordnet ist und/oder Teil des Substrats (2) ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der optische Pfad (13) auf der Seite des Substrats (2) vorgesehen ist, die zu der Seite der Öffnung (8), an der die Membran oder Zelle (12) immobilisiert ist, abgewandt ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der optische Pfad (13) mindestens teilweise, vorzugsweise vollständig als Ausnehmung im Substrat ausgebildet ist.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der optische Pfad (13) Glas oder Quarzglas, insbesondere mindestens ein Fenster aus Glas oder Quarzglas umfasst.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der optische Pfad mindestens eine Glasfaseroptik oder mindestens eine Mikroskopoptik oder mindestens eine Schnittstelle für eine Glasfaseroptik oder eine Mikroskopoptik umfasst.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein separater Kanal (10) vorgesehen ist, der mit der Öffnung (8) nicht in direkter Verbindung steht und mit dessen Hilfe die Membran oder Zelle (12) durch Anlegen eines Unterdrucks an der Öffnung (8) positionierbar und/oder festlegbar ist, wobei vorzugsweise dieser separate Kanal (10) in mindestens einer separaten Öffnung (11) mündet, welche insbesondere die Öffnung (8) mindestens teilweise konzentrisch umgibt.
Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass sich der Durchmesser des separaten Kanals (10) in Richtung seiner separaten Öffnung (11) vergrößert.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche mit – einem Substrat (2), das als mikrofluidische Strukturen aufweist: – mindestens einen Flüssigkeitszulauf, vorzugsweise zwei Flüssigkeitszuläufe (3, 4), – mindestens einen Flüssigkeitsablauf (5), – mindestens eine zwischen dem Flüssigkeitszulauf (3, 4) und dem Flüssigkeitsablauf (5) angeordnete Perfusionskammer (6), – mindestens einen Kanal (7) nach Art einer Patch-Clamp-Pipette mit einer Öffnung (8), die in der Perfusionskammer (6) mündet, und der mit mindestens einem weiteren Flüssigkeitskanal (9) in Verbindung steht, und – mindestens einen separaten Kanal (10), der mit der Öffnung (8) nicht in direkter Verbindung steht und der in mindes einer separaten Öffnung (11) mündet, die insbesondere die Öffnung (8) mindestens teilweise konzentrisch umgibt, – einem optischen Pfad (13) zur Übertragung von elektromagnetischer Strahlung, der vorzugsweise auf der zur Oberseite der Öffnung (8) abgewandten Seite des Substrats (2) vorgesehen ist.
Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die von dem Kanal (7) nach Art einer Patch-Clamp-Pipette gebildete Öffnung (8) und/oder die von dem separaten Kanal (10) gebildete separate Öffnung (11) in die Perfusionskammer (6) hineinragt.
Verfahren zur Bestimmung von vorzugsweise biologisch relevanten Messgrößen an Membranen und Zellen, die insbesondere Membranproteine wie beispielsweise Ionenkanäle aufweisen oder ausbilden, wobei das Verfahren vorzugsweise durchgeführt wird mit der Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine optisch ausgelöste Immobilisierung der Membran oder der Zelle an einer in einem vorzugsweise flachen Substrat vorgesehenen Öffnung erfolgt, oder dass eine optisch ausgelöste Messung an der Membran oder der Zelle, die an einer in einem vorzugsweise flachen Substrat vorgesehenen Öffnung immobilisiert ist, erfolgt.
Verfahren zur Bestimmung von vorzugsweise biologisch relevanten Messgrößen an Membranen und Zellen, die insbesondere Membranproteine wie beispielsweise Ionenkanäle aufweisen oder ausbilden, wobei das Verfahren vorzugsweise durchgeführt wird mit einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass eine Stimulation, insbesondere eine optische Stimulation der Membran oder der Zelle erfolgt, während die Zelle an einer in einem vorzugsweise flachen Substrat vorgesehenen Öffnung immobilisiert ist.