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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Früherkennung von Krebs. Insbesondere
betrifft die Erfindung ein Verfahren und einen Kit zur Erkennung
von Virus-assoziiertem Gebärmutterkrebs
in einem Menschen.
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Hintergrund der Erfindung
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Infektion
durch bestimmte Unterarten von menschlichem Papillomavirus (HPV),
insbesondere HPV 16 und HPV 18, wurde seit langem als Hauptrisikofaktor
für Gebärmutterkrebs
erkannt, und ca. 95% von Krebsbiopsien enthalten HPV-DNA. Während die
Infektion mit HPV bei jungen Frauen im Alter von 16 bis 24 üblich ist,
entwickeln nur weniger als 1% Frauen mit onkogenen HPV-Abstrichen
Gebärmutterkrebs.
Deshalb haben bekannte Testmethoden auf das Vorhandensein von HPV
einen geringen Vorhersagewert.
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Innerhalb
des Standes der Technik gibt es zwei Hauptstrategien, um Gebärmutterkrebs
vorherzusagen oder zu diagnostizieren. Eine Strategie verwendet
Platten-Intraepithel-Läsion
in der Zytologie oder Gebärmutterdysplasie
als Anzeichen eines Gebärmutterkrebses.
Die andere Hauptstrategie ist die Bestimmung der HPV-Nucleinsäure in einer
Patientenprobe, entweder direkt oder nach Amplifikation der Nucleinsäure, wobei die
Gegenwart von HPV-Nucleinsäure
als Anzeichen einer möglichen
Gebärmutterkrebsausbildung
angesehen wird.
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Der
Stand der Technik hat sich auch auf die Bestimmung der exakten HPV-Typen
konzentriert;
US 5 580 970 beschreibt
z.B. die Amplifikation von gering-onkogenen HPV-Genen, wie z.B.
HPV 6 und 11, als Anzeichen für
ein geringeres Risiko einer Ausbildung eines ernsthaften Gebärmutterkrebses,
und hoch-onkogene HPV-Gene als Anzeichen eines höheren Risikos.
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US 5 795 722 beschreibt
die Amplifikation von (i) einer oder mehreren Kontroll-Nucleinsäuren zusammen
mit der Amplifikation von (ii) einer konservierten Region einer
Analyten-Nucleinsäure
aus einem verdächtigten
Pathogen in einer Patientenprobe sowie (iii) einer Region der zur
Sequenzierung verwendeten Analyten-Nucleinsäure. Nach der Amplifikation
wird die sequenzierende Region aus der Amplifikationsmischung eingefangen,
und die verbleibende Fragmentmischung wird elektrophoretisch getrennt,
um die relativen Mengen von konservierten Fragmenten und Kontrollfragmenten
zu bestimmen. Danach wird die Sequenz der sequenzierenden Region
sowie ihre pathogene Quelle bestimmt.
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Ylitalo
et al. beschreiben in J. Clin. Microbiol. 33: 1822-1828 die Bestimmung
von Genital-HPV-Arten durch Amplifikation der konservierten E1-Region
onkogener HPV-Arten.
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Die
Quantifikation einer viralen Belastung wird nicht diskutiert.
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Ho
et al., J. Natl. Cancer Inst. 87(18): 1365-1371, beschreiben eine
Analyse zur Identifizierung von Faktoren, die die Persistenz oder
Regression von Gebärmutterdysplasie
bestimmen. Es wurde gefunden, dass eine persistente genitale menschliche
Papilloma-Virusinfektion ein Risikofaktor für persistente Gebärmutterdysplasie
ist.
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Bis
jetzt gibt es jedoch noch keine bekannte Methode zur Vorhersage
von Gebärmutterkrebs
mehrere Jahre vor der Entwicklung von Krebs.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren bereit, das die Früherkennung
des klinischen Auftretens von Gebärmutterkrebs in situ (CCIS)
ermöglicht.
Nach der vorliegenden Erfindung, die in den anliegenden Ansprüchen definiert
wird, kann Gebärmutterkrebs
in HPV-positiven Frauen vorhergesagt werden, wenn die anfänglichen
HPV-positiven Abstriche mehrere Jahre vor der Entwicklung von Krebs
genommen werden.
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In
einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren
nach Anspruch 1 bereit zur Vorhersage des Risikos der Bildung von
Gebärmutterkrebs
in einem Menschen.
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Die
virale Nucleinsäure-Sequenz
ist vorzugsweise Nucleinsäure
aus mit genitalen menschlichen Papilloma-Virus(HPV)-Arten assoziiertem
Gebärmutterkrebs,
wie z.B. HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56 und 58. In einer
bevorzugten Ausführungsform
leitet sich die virale Nucleinsäure
vom E1-Gen, E6-Gen, E7-Gen,
L1-Gen oder Fragmenten) davon ab. Die menschliche Nucleinsäure-Sequenz
ist vorzugsweise genomische DNA aus einem Nucleargen.
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In
dem erfindungsgemäßen Verfahren
werden die Messungen in Stufen a) und b) nach bekannten Methoden
zur quantitativen DNA- oder RNA-Analyse durchgeführt, wie z.B. Polymerase-Kettenreaktion
(PCR), in-situ-Hybridisierung, NASBA, 3SR, Hybrid-Arretierung usw.
Alternativ wird die Menge der biologischen Probe durch Zellzählung, Zellfärbung, Zellfluoreszenz,
gesamte DNA-Menge, unter Verwendung einer technischen Vorrichtung
zum Erhalt identischer Mengen einer biologischen Probe, oder unter
Verwendung des Volumens, Gewichts oder anderer Mittel zur Normalisierung
der Probenmenge gemessen. Außerdem
wird ein Kit zur Vorhersage von HPV-assoziiertem Gebärmutterkrebs
durch Amplifikation von viraler Nucleinsäure beschrieben, der aufweist
a) Primer, spezifisch für
eine Region des konservierten E1-Gens von onkogenen HPV-Arten; und b)
Primer, spezifisch für
genomische Nucleinsäure
in einer Probe aus einem Menschen.
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Die
Primer in b) können
ausgewählt
sein aus irgendeinem Nuclear-Gen, vorzugsweise einem einzigen Kopie-Gen.
Der Kit kann auch DNA-interkalierende Verbindungen, wie z.B. Ethidiumbromid
und SYBR® Green, aufweisen.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
weist der Kit auch markierte HPV-spezifische Sonden auf; und markierte
spezifische Sonden für
menschliche genomische DNA. Die Marker können Fluorphore, radioaktive Isotopen,
Verbindungen für
die Chemoilluminiszenz-Bestimmung sein. Beispiele für Fluorphore
sind FAM (6-Carboxyfluorescein), HEX (Hexachloro-6-carboxyfluorescein),
TET (Tetrachloro-6-carboxyfluorescein), JOE
(2,7-Dimethoxy-4,5-dichlor-6-carboxyfluorescein), TAMRA (6-Carboxytetramethylrhodamin),
ROX (6-Carboxy-X-rhodamin), Cy5 (Cyanin).
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Bevorzugte
HPV-Sonden sind:
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung wird nun nachfolgend näher in Verbindung mit den anliegenden
Zeichnungen beschrieben, in denen bedeuten:
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1A zeigt die Verteilung von β-Actin-Schwellenzyklus(Ct)-Werten
für Fall(offene
Quadrate)- und Kontroll(offene Kreise)-Abstriche pro Kalenderjahr
der Herstellung der Abstriche (1969-1995).
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1B zeigt die Verteilung von HPV 16-Schwellenzyklus(Ct)-Werten
für Fall(offene
Quadrate)- und Kontroll(offene Kreise)-Abstriche, pro Kalenderjahr
der Herstellung der Abstriche (1969-1995).
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2 zeigt
die Verteilung von HPV 16-Schwellenzyklus(Ct)-Werten für Kontroll(oberes
Histogramm)- und Fall(unteres Histogramm)-Abstriche. Die HPV 16-Ct-Werte
(auf der X-Achse)
wurden in acht Gruppen unterteilt, und der mittlere Gruppenwert
jeder Gruppe ist angegeben. Absolute Häufigkeit der Abstriche auf
der Y-Achse.
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3 zeigt
positive Vorhersagewerte (PPV) für
Frauen bei verschiedenen Perzentilen (Prozentmengen) der Verteilung
der HPV 16-Schwellenzyklus(Ct)-Werte. Die verschiedenen Kategorien
der HPV 16-Ct-Werte sind aus Tabelle 2. Für Abstriche mit einer hohen
Menge an nuclearer DNA (β-Actin
Ct < 34,78 (4A)) und geringer Werte nuclearer DNA
(β-Actin
Ct > 34,87 (4B)) wurden getrennte Analysen durchgeführt, da
festgestellt wurde, dass β-Actin
ein wirksamer Modifikator ist.
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Die
Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben die relative virale Belastung
von HPV als Determinante zur Bildung von Gebärmutterkrebs in situ (CCIS)
untersucht. Die relative virale Belastung wurde in Archivabstrichen
durch eine quantitative DNA-Amplifikationsmethode analysiert. Von
jeder Frau wurden über
einen Zeitraum von 26 Jahren mehrere Proben erhalten. Eine Gesamtzahl
von 2081 Abstrichen wurde von 478 Fällen und 1754 Abstrichen von
608 Kontrollen erhalten.
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Die
DNA der Abstriche wurde isoliert und auf die Menge von HPV 16 unter
Verwendung einer Amplifikation eines Segments von 180 bp des E1-offenen
Leserasters und einer dual-markierten artspezifischen Sonde geprüft. Die
Erfindung wird mit einer HPV 16-spezifischen Sonde beispielhaft
erläutert.
Das Verfahren der Erfindung ist jedoch nicht darauf beschränkt, sondern
es wird angenommen, dass alle vorstehend erwähnten Sonden sowie ähnlich gestaltete
Sonden für
andere onkogene Arten zufriedenstellende Ergebnisse liefern.
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EXPERIMENTELLER ABSCHNITT
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DNA-Extraktion außer Archiv-Abstrichen
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Die
DNA-Extraktion von Archiv-Papanicolau-gefärbten Abstrichen wurde nach
dem folgenden Verfahren durchgeführt:
Xylen-Inkubation, Entfärbung
mittels 95% Ethanol, Proteinase-K-Behandlung (60°C, mindestens 1 Stunde) und
danach eine Protein-Ausfällung
mittels gesättigtem
Ammoniumacetat. Der DNA-Überstand
wurde mit Methanol gewonnen, das Pellet mit 70% Ethanol gewaschen,
getrocknet und in 200 μl
TE-low (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,1 mM EDTA) gelöst.
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PCR-Amplifikation
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Die
PCR-Amplifikation wurde in einem 50 μl-Volumen durchgeführt, das
aufwies: 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,4), 10 mM EDTA, 60 nM passiven
Referenzfarbstoff (Rox), 5 mM MgCl2, 0,25 μM HPV-E1-5'-Primer, 0,5 μM HPV-E1-3'-Primer, HPV-spezifische
dual-markierte Sonde bei einer Konzentration von 100 nM, dATP, dCTP
und dGTP, mit jeweils einer Konzentration von 200 μM, 400 μM dUTP, 0,5
E Uracil N'-Glykosylase (AmpErase
UNG; Perkin-Elmer), 1,25 E DNA-Polymerase (Amplitaq Gold; Perkin-Elmer)
und 2 bis 10 μl
DNA aus dem Abstrich. Die Menge an zur PCR-Mischung zugegebenen
DNA repräsentiert
1 bis 5% der aus dem Gebärmutterabstrich
erhaltenen DNA. Um die Komplexität
der Primer zu verringern, wurde eine 5'-Primermischung konstruiert, die aus
nur zwei Primern (HPVE116L 5'-TACAGGTTCTAAAACGAAAGT-3', spezifisch für HPV 16,
und 5'-HPVE118L
TGCATGTTTTAAAACGAAAGT-3',
spezifisch für
HPV 18) bestand, und eine 3'-Primermischung,
die aus drei Primern bestand (HPVE116R 5'-TTCCACTTCAGTATTGCCATA-3', spezifisch für HVP 16,
HPVE118R 5'-TTCCACTTCAGAACAGCCATA-3', spezifisch für HPV 18
und HPVE1RE 5'-TRYRKGMNYTAAAACGAAAGT-3', spezifisch für HPV 30-60,
worin R = A oder G, Y = C oder T, K = G oder T, M = A oder C, S
= G oder C, W = A oder T, N = A, T, C oder G, B = C, G oder T, D
= A, G oder T, H = A, C oder T, V = A, C oder G). Es ist auch möglich, die
HPV 16-spezifischen oder HPV 18-spezifischen
5'- und 3'-Primer allein oder
in Kombination mit einander zu verwenden.
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Die
Fluoreszenz-Sonden wiesen eine Länge
von 30 bis 33 bp auf, um eine höhere
Tm sicherzustellen als für
die Primer. Die folgende HPV 16-Sonde:
FAM-5'-ATAATCTCCTTTTTGCAGCTCTACTTTGTTTTT-3'-TAMRA wurde in einem
Amplifikations- und Bestimmungs-Assay verwendet, unter Verwendung
eines ABI-Prism 7700, Sequenz-Bestimmungssystem
(Perkin Elmer Inc.). Die Amplifikationsstrecke umfasste zwei Halteprogramme
(1) 2 min bei 50°C,
um das Dekontaminierungsenzym zu aktivieren, Uracil-N'-Glykosylase (UNG),
gefolgt von (2) 10 min bei 95°C,
um das UNG zu deaktivieren, und zur Freisetzung der Aktivität der DNA-Polymersase. Danach
folgte ein Zweistufen-Zyklus aus einer Schmelzstufe von 15 s bei
95°C und
einer Annelierung während
1 min bei 55°C
für insgesamt
50 Zyklen. Die Monitor-Kontaminierung, ca. 8 Röhrchen mit nur PCR-Komponenten
ohne DNA-Templat waren umfasst. Der Schwellenzyklus wurde unter
Verwendung der Sequence Detection System-Software berechnet und
die Basislinie wurde automatisch eingestellt (10 SD oberhalb des
Hintergrunds in den ersten 3 bis 15 Zyklen). Da alle Berechnungen
direkt an den Ct-Werten vorgenommen wurden, wurden keine Standardkurven verwendet.
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Normalisierung von HPV-DNA
und genomischer DNA
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Abstrichproben
variierten im wesentlichen in der Schwellenzykluszahl (Ct), die
die Amplifikationszykluszahl repräsentiert, bei der das Bestimmungssignal
deutlich die Basislinie übersteigt,
was potentiell eine Differenz in der HPV-DNA-Kopiezahl von mindestens
dem 100-fachen zwischen individuellen Abstrichen (Daten nicht angegeben)
reflektiert. Aufgrund der Natur des zur Probennahme von Gebärmutterepithelzellen
verwendeten Verfahrens können
HPV-Kopienzahl-Unterschiede die Zahl der Zellen der Probennahme
reflektieren. Um die HPV-Schätzungen
für die
Menge an in individuellen Proben vorhandener genomischer DNA zu
normalisieren, wurde in allen Abstrichen unter Verwendung der gleichen
Amplifikationsmethode ein Nuclear-Gen, β-Actin, quantifiziert. Die Nuclear-DNA
kann irgendeine Nuclear-DNA sein, vorzugsweise ein einziges Kopie-Gen.
Die Erfindung hängt
nicht vom Weg ab, mit dem HPV-DNA zu nuclearer DNA normalisiert
wird. Die Menge an viraler DNA sollte auf irgendeine geeignete Weise
in Beziehung zur genomischen nuclearen DNA stehen, um einen Wert
für die
relative virale Belastung zu ergeben. Die Relation kann z.B. die
Menge an viraler DNA, dividiert durch die Menge an genomischer nuclearer
DNA, sein.
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Wie
vorstehend erwähnt,
wurden die analysierten Abstriche während eines Zeitraums von fast
26 Jahren hergestellt, und das zur Herstellung der Abstriche verwendete
Verfahren und die Reagentien können
sich während
dieser Zeit geändert
haben, was möglicherweise
die Ergebnisse beeinflusst. Die mittlere Verteilung von β-Actin zwischen
Fällen
(Ct = 37,30) und für
die Kontrollen (Ct = 37,58) unterschied sich nicht, was anzeigt, dass
kein Unterschied in der DNA-Qualität zwischen den Gruppen (siehe
die nachstehende Tabelle 1) besteht. Die Verteilung der Schwellen(Ct)-Werte
für β-Actin zeigten
keinen signifikanten Trend während
der Zeit und waren zwischen Fall- und Kontrollabstrichen nicht signifikant
verschieden (1).
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Ergebnisse
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Insgesamt
871 Abstriche aus Fällen
und 117 Abstriche aus Kontrollen waren auf HPV 16 positiv (Tabelle
1). Die Verteilung der Ct-Werte unterscheidet sich zwischen den
Fällen
und den Kontrollen beträchtlich (2),
mit einem Mittelwert von Ct = 37,59 bei Fällen und Ct = 43,88 bei Kontrollen
(Tabelle 1).
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Tabelle
1. Charakteristika der Teilnehmer
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Da
ein inverses Verhältnis
zwischen Ct und der viralen Kopiezahl besteht,
ist der Unterschied zwischen Fällen
und Kontrollen mit einer höheren
durchschnittlichen viralen Belastung in den Fällen im Einklang. Die Ct-Werte für
HPV 16 zeigen keinen Trend während
des Kalenderzeitraums, und der Unterschied zwischen Patienten und
Kontrollen scheint während
des Kalenderzeitraums konstant zu sein (1B).
Die Unterschiede in den HPV 16 Ct-Werten
zwischen Patienten und Kontrollen können deshalb nicht durch Variation
in der DNA-Qualität
während
des Kalenderzeitraums erklärt
werden.
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Das
Verhältnis
zwischen viraler Belastung (HPV 16 Ct) und dem Risiko einer Erkrankung
wurde unter Verwendung einer konditionalen logistischen Regressionsanalyse
untersucht. Das Unterschiedsverhältnis (odds
ratio) (OR) auf der Basis aller Abstrichproben einer Frau ist für jedes
20 Perzentil signifikant und zeigt einen stark ansteigenden Trend
bei hoher HPV-Belastung (niedrigerer HPV 16 Ct)
(Tabelle 2). In diesen Analysen stellten wir auf die Wirkung von
Unterschieden in der Menge an genomischer DNA unter Verwendung der
mittleren β-Actin-Ct-Werte ab. Wie in Tabelle 2 gezeigt (unter
Ct-HPV-Mittel) zeigen die OR für das Perzentil,
das Abstriche mit der höchsten
viralen Belastung einschließt
(Ct < 36,66),
ein fast 70-fach höheres
Risiko in Bezug auf Frauen, die auf HPV negativ waren. Ähnlich zeigt
für Abstriche
im Perzentil mit Ct-Werten im Intervall 36,66 bis 38,99 das OR ein
19-fach höheres
Risiko, für
Ct-Werte im Intervall 38,99 bis 41,25 ein 8-fach höheres Risiko,
für Ct-Werte
im Intervall 41,25 bis 44,8 ein 4-fach höheres Risiko und für Ct-Werte
im Intervall 44,8 bis 50 ein 2-fach höheres Risiko.
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Statistisch
signifikant ansteigende ORs bei höherer HPV 16-Belastung werden
auch beobachtet, wenn nur der Abstrich mit dem minimalen oder maximalen
Ct-Wert für eine individuelle Frau verwendet
wird. Dies könnte
bedeuten, dass während
der Zeit individuelle Frauen die Tendenz zeigen, entweder niedrige
oder hohe HPV-Titer aufzuweisen.
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Schließlich ist
das OR, basierend auf nur dem ersten HPV 16-positiven Abstrich jeder
Frau, im Mittel 7,8 Jahre vor der Diagnose genommen, noch signifikant
für alle
Perzentile, außer
dem ersten, und zeigt auch einen stark ansteigenden Trend bei höherer viraler
Belastung (Tabelle 3). Wie in Tabelle 3 gezeigt, besitzen Frauen,
von denen ein einziger Abstrich gemacht wurde, zu einer Zeit bevor
irgendwelche zytologische Abnormalitäten festgestellt werden, und
mit einem Ct < 35,9
ein 60-fach vergrößertes Risiko
zur Entwicklung von Gebärmutterkrebs,
relativ zu Frauen, die HPV-negativ waren. Ähnlich haben Frauen mit einem
Ct zwischen 35,9 bis 38,7 ein 19-fach erhöhtes Risiko, Frauen mit einem
Ct zwischen 38,7 bis 42,08 ein 22-fach erhöhtes Risiko, Frauen mit einem
Ct zwischen 42,08 bis 45,26 ein 7-fach erhöhtes Risiko und schließlich Frauen
mit einem Ct zwischen 45,26 bis 50 ein 1,8-fach erhöhtes Risiko
zur Entwicklung von Gebärmutterkrebs
im Vergleich zu HPV-negativen Frauen. Da nur ein Abstrich pro Frau
umfasst wird, basiert das Verhältnis
zwischen einer hohen viralen Belastung (niedriger HPV 16 Ct) und dem Krebsrisiko nicht auf der Abhängigkeit
unter Abstrichen. Die Ergebnisse beim Vergleich von nur dem ersten
positiven Abstrich pro Frau kann auch nicht auf einer asymmetrischen
Probennahme von Fällen
und Kontrollen basieren, da es keinen Unterschied im Zeitmittel
zwischen Probennahme und Diagnose für die Fälle und Kontrollen gibt (Daten
sind nicht angegeben).
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Tabelle
3. Ergebnisse der konditionalen logistischen Regressionsanalyse
für den
ersten Abstrich von Fällen und
Kontrollen unter β-Actin-positiven
Frauen
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- * Die Kategorien sind je 20 Perzentil der Verteilung des
HPV 16 Ct-Wertes für den den ersten Abstrich für jede Frau
kalkuliert.
- Eingestellt
für β-Actin
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Diese
Ergebnisse zeigen, dass eine erhöhte
HPV-DNA-virale Belastung ein signifikanter Risikofaktor für Gebärmutterkrebs
ist. Die Fälle
und Kontrollen zeigen einen Unterschied in der viralen Belastung
bis zu 8 Jahre vor dem Zeitpunkt der Diagnose von Krebs in situ.
Ein solcher Langzeitunterschied in der viralen Belastung könnte entweder
auf Umgebungs- oder genetischen Risikofaktoren beruhen. Eine Zahl
von Umgebungsfaktoren, wie z.B. sexuelles Verhalten, Rauchen und
Variation im HPV-Subtyp, früher
als Beeinträchtigung
des Infektionsrisikos angesehen, könnte im Prinzip auch die virale
Belastung beeinflussen. Der hohe OR kann auch inhärente Unterschiede
zwischen Individuen bei der Reaktion gegenüber HPV 16-Infektion wiederspiegeln.
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Bei
gegebenem sehr hohen OR für
hohe HPV 16-virale Belastungen könnte
die Quantifizierung onkogener Subtypen von HPV klinische Brauchbarkeit
besitzen. Der positive Voraussagewert (PPV), ein Maß für das absolute
Risiko, assoziiert mit verschiedenen HPV 16-viralen Belastungen
wurde aus der Fall-Kontroll-Studie
nach den beschriebenen Methoden bewertet. Für diese Analyse wurde kein
Ausschluss von Abstrichen, die innerhalb des letzten Jahres vor
der Diagnose durchgeführt
wurden, gemacht. In der Analyse unter Verwendung von nur dem ersten
Abstrich für
jede Frau wurde gefunden, dass β-Actin
ein wirksamer Modifikator ist. Die Abstriche wurden deshalb in zwei
Gruppen mit niedrigen und hohen β-Actin-Ct-Werten
aufgeteilt. Der PPV erhöht
sich bei viraler Belastung in allen Altersgruppen, und für beide β-Actin-Kategorien
konsequent (3). Die Wahrscheinlichkeit der
Entwicklung von Gebärmutterkrebs
in situ für
Frauen mit einem HPV 16-negativen ersten Abstrich variiert zwischen
0,3 bis 0,8%, während
in der Gruppe mit einer höheren
nuclearen DNA-Menge (Ct > 34,78) der PPV für das Perzentil mit der höchsten HPV-viralen
Belastung in der jüngsten
Altersgruppe über
27% erreicht. Eine Frau dieser Populationen in ihren 20-igern und
mit einem HPV 16 Ct-Wert im höchsten Perzentil
hat somit ein absolutes Risiko von 27% einer Krebsentwicklung. Dies
sollte mit dem Risiko von im Test negativen Frauen in der gleichen
Altersgruppe von 0,8% verglichen werden, was ein Wahrscheinlichkeitsverhältnis von
34 ergibt.
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Um
die Beziehung zwischen der HPV 16-viralen Belastung und dem zytologischen
Screening-Status zu untersuchen, wie durch den PAP-Code bestimmt,
wurde der mittlere HPV 16 Ct-Wert für verschiedene PAP-Code-Klassen
für die
Fälle und
Kontrollen kalkuliert (Tabelle 4). PAP-Code 1 kennzeichnet zytologisch normale
Abstriche. Zwischen fallenden HPV 16 Ct-Werten (steigender HPV-Titer)
und einem höheren
PAP-Code unter den Fällen
und Kontrollen wurde eine klare Beziehung festgestellt. Interessant
ist es, dass der Mittelwert unter den zytologisch normalen Abstrichen
in den Fällen
(PAP-Code 1) (HPV 16 Ct = 38,7) wesentlich niedriger war als der
für die
Kontrollen (HPV 16 Ct = 44,3), was die Fähigkeit bestätigt, den
HPV-Titer-Assay zur Identifizierung von Frauen mit einem hohen Risiko
einer Krebsentwicklung in einem solchen frühen Zustand, bei dem Screening-Mittel
(wie z.B. PAP-Abstriche) nicht informativ sind, zu verwenden.
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Tabelle
4 HPV
Ct-Werte in Relation zu zytologischer Diagnose (PAP-Code)
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HPV-DNA-virale
Belastungseinschätzungen
können
somit die Fähigkeit,
zwischen Infektionen, die ein hohes oder niedriges Risiko der Bildung
von Gebärmutterkrebs
in situ aufweisen, zu unterscheiden, signifikant verbessern. Ferner
wurden, wie festgestellt, die absoluten Risikoeinschätzungen
unter Verwendung des ersten β-Actin-positiven
Abstrichs erhalten, der in den meisten Fällen kein Anzeichen einer Dysplasie
aufwies und fast 8 Jahre vor der Diagnose gemacht wurde. Bewertungen
der HPV-DNA-viralen
Belastung sind deshalb wahrscheinlich in einem solchen frühen Stadium
informativ zur Entwicklung von Gebärmutterkrebs in situ, wodurch eine
vorbeugende Behandlung sehr erfolgreich sein kann. Das Hinzunehmen
eines quantitativen Tests auf HPV-virale Belastung in Verbindung
mit gynäkologischen
Routine-Gesundheitskontrollen erscheint deshalb eine einfache und
kosteneffektive Maßnahme
zur Identifizierung von Frauen zu sein, die zur Entwicklung von Gebärmutterkrebs
neigen und verringert als Konsequenz auch das Auftreten von Gebärmutterkrebs.
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Bei
der Anwendung eines solchen Tests wird eine Probe als Teil der gynäkologischen
Routine-Gesundheitskontrolle
erhalten und auf die relative virale Belastung (die HPV-DNA-Menge,
normalisiert für
die Menge der Probe) untersucht. Die gemessene relative virale Belastung
wird dann auf der Basis der festgestellten Risikoverhältnisse
zwischen viraler Belastung und Krebs des vorstehend beschriebenen
Typs verwendet, um die Risiko-Kategorie für das Individuum zu bewerten.
Abhängig
vom Resultat des Assays (hohe oder niedrige Risiko-Kategorie) werden
verschiedene Schlussfolgerungen empfohlen (z.B. fortgesetzte Weiterbeobachtung,
Behandlung).
