DE60020348T2

DE60020348T2 - Werkstoffe und verfahren zur modulierung der p66 expression

Info

Publication number: DE60020348T2
Application number: DE60020348T
Authority: DE
Inventors: Pier Giuseppe Pelicci; Marco Giorgio; Enrica Migliaccio; Luisa Lanfrancone
Original assignee: Congenia SRL
Current assignee: Congenia SRL
Priority date: 1999-03-22
Filing date: 2000-03-22
Publication date: 2006-02-02
Anticipated expiration: 2020-03-23
Also published as: DK1163335T3; EP1163335B1; EP1163335A1; AU778301B2; ATE296352T1; GB9906515D0; AU3312400A; CA2367464A1; WO2000056886A1; JP2002539789A; ES2243237T3; DE60020348D1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Materialien und Verfahren in Zusammenhang mit den Auswirkungen einer p66-Expression. Insbesondere, nicht jedoch ausschließlich, stellt die vorliegende Erfindung Materialien und Verfahren in Zusammenhang mit den Beobachtungen bereit, dass p66, genauer gesagt die p66-Shc-Isoform, Teil eines Signaltransduktionswegs ist, der Stressantworten, Antworten auf onkogene Signale und die Lebensdauer von Säugetieren regelt.
Hintergrund der Erfindung
Die Gene, die für das Phänomen des Alterns bei Säugetieren verantwortlich sind, sind nicht bekannt. Derzeitige Theorien gehen davon aus, dass die Alterung eine Folge von Mutationen ist, welche die Fitness von Erwachsenen nicht beeinträchtigen, sich später im Leben aber nachteilig auswirken. Unter bestimmten Umständen erbrachte Beweise lassen vermuten, dass Gene, die an der Regelung der oxidativen Belastungsreaktion beteiligt sind, mögliche "Alterungsgene" sind. Tatsächlich hängt die Akkumulation von oxidativen Schäden mit der Alterung zusammen.
Der Säugetier-SHC-Locus kodiert für drei Isoformen: p52, p46 und p66. Diese unterscheiden sich durch die Gegenwart von N-terminalen Sequenzen variabler Längen und haben alle eine C-terminale SH2-Domäne, eine zentrale Collagenhomologiedomäne (CH1), die reich an Prolin-/Glycinresten ist, und eine N-terminale phosphotyrosinbindende Domäne (PTB). Die 110 Aminosäuren große N-terminale Region, die in p66 einzigartig ist, ist außerdem reich an Glycin- und Prolinresten (CH₂) (1A). Deshalb ist p66^shc eine Spleißvariante von p52^shc/p46^shc (E. Migliaccio et al., Embo. J. 16, 706–716 (1997)), ein zytoplasmatischer Signalumwandler, der an der Übertragung von mitogenen Signalen von Tyrosinkinasen zu Ras beteiligt ist (G. Pelicci et al., Cell 70, 93–104 (1992)). Die p52/46-Shc-Isoformen sind an der zytoplasmatischen Ausbreitung von mitogenen Signalen von aktivierten Rezeptoren zu Ras beteiligt (L. Bonfini et al., Tibs. 21, 257–261 (1996)). Sie werden nach einer Ligandensti mulation von Rezeptoren rasch auf Tyrosin phosphoryliert und bilden bei der Phosphorylierung stabile Komplexe mit aktivierten Rezeptoren und Grb2, einem Adaptorprotein für den Ras-Guanin-Nucleotid-Austauschfaktor SOS (E. Migliaccio et al., Embo. J. 16, 706–716 (1997); G. Pelicci et al., Cell 70, 93–104 (1992); M. Rozakis-Adcock et al., Nature 360, 689–692 (1992)). Diese Komplexe induzieren Ras-Aktivierung, wie durch verstärkte RasGTP-Bildung, mitogenaktivierte Proteinkinasenaktivität (MAPK-Aktivität) und FOS-Aktivierung in kultivierten Zellen, die p52^shc/p46^shc überexprimieren, gemessen werden kann (E. Migliaccio et al., Embo J. 16, 706–716 (1997); G. Pronk et al., Mol. Cell. Biol. 14, 1575–1581 (1994); L. Lanfrancone et al., Oncogene 10, 907–917 (1995)). Genauso wird p66^shc bei Rezeptoraktivierung tyrosinphosphoryliert und bildet stabile Komplexe mit aktivierten Rezeptoren und Grb2. Es hemmt jedoch c-fos-Promotoraktivierung und wirkt sich nicht auf die MAPK-Aktivität aus, was vermuten lässt, dass p66^shc auf einem anderen intrazellulären Signalweg wirkt (E. Migliaccio et al., Embo. J. 16, 706–716 (1997)).
c-fos wird als Reaktion auf verschiedene schädliche Stoffe (Umweltbelastung), wie beispielsweise DNA schädigende Stoffe (z.B. ultraviolette Strahlung, UV) oder Stoffe, die oxidative Schädigung induzieren (z.B. Wasserstoffperoxid, H₂O₂) transkriptionell aktiviert (M. Schreiber et al., Embo. J. 14, 5338–5349 (1995); C. Sen et al., FASEB J. 10, 709–720 (1996)).
Es wurde die These aufgestellt, dass die Hauptursache des Alterns die Akkumulation von oxidativer Schädigung während der Alterung eines Organismus ist (G. M. Martin et al., Nature Genetics 13, 25–34 (1996); F. B. Johnson et al., Cell 96, 291–302 (1999); G. J. Lithgow et al., Science 273, 80 (1996)). Tatsächlich leben transgene Fliegen, die antioxidative Enzyme überexprimieren, länger (W. C. Orr et al., Science 263, 1128–1130 (1994)); eine Einschränkung der Kalorienaufnahme verringert den stationären Zustand von oxidativer Belastung und Schädigung und verlängert die maximale Lebensdauer von Säugetieren (R. S. Sohal et al., Science 273, 59–63 (1996)). Die Gene, welche die Lebensdauer bei Säugetieren bestimmten, sind jedoch nicht bekannt. Im Rahmen der derzeit anerkannten Evolutionstheorien wird davon ausgegangen, dass die Alterung ein postreproduktiver Vorgang ist, welcher der natürlichen Auslese entkommen ist und sich durch die Selektion von Allelen mit Vorteilen während der frühen Lebensphasen kombiniert mit pleiotrop schädlichen Wirkungen später im Leben entwickelt hat. Es wird deshalb angenommen, dass diese Gene, da sie aktiv selektiert sind, die grundlegenden zellulären Vorgänge regeln, die verschiedenen Spezies gemein sind.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben entdeckt, dass p66 ein entscheidendes Gen bei der Regulierung der zellulären Antworten auf Umweltbelastung und onkogene Belastung ist und dass es am Alterungsprozess und an Tumorsuppression beteiligt ist. p66 stellt zum ersten Mal genetische Informationen zur Theorie des alterns bereit. Mechanistisch gesehen übt p66 seine Wirkung stromab der durch Belastung aktivierten Serinkinasen und stromauf von p53–p21 aus.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben herausgefunden, dass gerichtete Mutationen am p66^shc-Gen von Mäusen Stressresistenz induzieren und die Lebensdauer verlängern. Die Erfinder offenbaren hierin, i) dass p66^shc durch UV-Behandlung oder oxidative Schädigung serinphosphoryliert wird; ii) dass die Serinphosphorylierung von p66 durch oxidative Signale durch Erk1 und p38 vermittelt wird, wie sowohl in vivo als auch in vitro nachgewiesen wurde; iii) dass eine Ablation der p66^shc-Expression durch homologe Rekombination die Resistenz gegen oxidative Schädigung sowohl in vitro als auch in vivo erhöht; iv) dass eine p66^shc-Mutante mit einem Serinphosphorylierungsdefekt keine normale Stressantwort in p66^shc-gerichteten Zellen wiederherstellen kann; v) dass Mäuse, welche die p66^shc-gerichtete Mutation aufweisen, länger leben.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung offenbaren hierin, i) dass p16-, p53- und p21-Aktivierung in p66-(–/–)-Zellen bei H₂O₂ oder UV-Behandlung oder RASV12-Expression verloren geht; ii) dass das onkogene RASV12 unfähig ist, in p66-(–/–)-Mäuseembryofibroblasten (MEFs) Zellalterung zu induzieren, und p66-(–/–)-Zellen im Gegenteil transformiert; iii) dass p66-(–/–)-MEFs, die RASV12 überexprimieren, eine transformierte, spindelförmige Morphologie aufweisen und bei Konfluenz zur Bildung von Fokussen und zur Bildung von Kolonien in halbfesten Medien fähig ist; iv) dass p16 und p53 unfähig sind, Wachstumsproliferation von p66-(–/–)-Zellen zu induzieren.
Somit zeigen die Erfinder der vorliegenden Erfindung hierin, dass p66 selbst durch Serinphosphorylierung durch belastungsaktivierte Kinasen und Signale auf p16–p19-p53–p21 aktiviert wird und dass der p66-Signalweg Tumorsuppression und die Lebensdauer regelt.
Folglich stellt die vorliegende Erfindung in ihrer allgemeinsten Form Materialien und Verfahren bereit, die mit der Modulation der p66^shc-Genexpression und ihrer Beteiligung am Signaltransduktionsweg zusammenhängen, der durch Umweltbelastung und onkogene Mutationen aktiviert wird.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Unterbrechen des p66^shc-Signaltransduktionswegs in einer Zelle bereit, wobei das Verfahren den Schritt des Kontaktierens der Zelle mit einem Nucleinsäuremolekül umfasst, das in der Lage ist, an für p66^shc kodierende Nucleinsäure zu hybridisieren, wodurch die p66^shc-Expression verhindert wird.
In einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird außerdem ein Nucleinsäuremolekül bereitgestellt, das eine p66^shc-Kodiersequenz umfasst, wobei die Kodiersequenz aus der Kodiersequenz aus 5 besteht, die eine Mutation umfasst, sodass in dem durch die Kodiersequenz kodierten Protein der Rest S36 nicht vorhanden oder durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt ist.
Vorzugsweise ist der Serinrest durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt, sodass S36 beispielsweise durch Alanin ersetzt ist (p66^shcS36A).
Außerdem stellt die vorliegende Erfindung ein Polypeptid bereit, das für ein Nucleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung kodiert, wie es oben offenbart ist.
Im Allgemeinen wird eine Nucleinsäure gemäß vorliegender Erfindung als Isolat, in isolierter und/oder gereinigter Form oder frei oder im Wesentlichen frei von Material, mit dem es in der Natur vorkommt, wie z.B. frei oder im Wesentlichen frei von Nucleinsäure, die das Gen im menschlichen Genom flankiert, eventuell mit Ausnahme einer oder mehrerer Regulationssequenzen für die Expression, bereitgestellt. Die Nucleinsäure kann ganz oder teilweise synthetisch sein und kann genomische DNA, cDNA oder RNA umfassen. Wenn Nucleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung RNA umfasst, sind Verweise auf die dargestellte Sequenz als Verweis auf das RNA-Äquivalent zu verstehen, wobei T durch U ersetzt ist.
Nucleinsäuresequenzen, die für einen Teil vom oder das ganze p66^shc-Gen und/oder ihre Regulationselemente kodieren, können von Fachleuten leicht mithilfe der Informationen und Verweise hierin und der auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren hergestellt werden (siehe beispielsweise Sambrook, Fritsch und Maniatis, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), und Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons (1992)). Diese Verfahren umfassen (i) die Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) zur Amplifikation von Proben einer solchen Nucleinsäure, beispielsweise von genomischen Quellen, (ii) chemische Synthese oder (iii) die Herstellung von cDNA-Sequenzen. Modifikationen der p66^shc-Sequenzen können beispielsweise durch ortsgerichtete Mutagenese vorgenommen werden, um zur Expression eines modifizierten p66^shc-Polypeptids zu führen oder eine Codonpräferenz in den Wirtszellen Rechnung zu tragen, die zur Expression der Nucleinsäure verwendet werden.
Um eine Expression der p66^shc-Nucleinsäuresequenzen zu erreichen, können die Sequenzen in einen Vektor mit Kontrollsequenzen inkorporiert werden, die operabel an die p66^shc-Nucleinsäure gebunden sind, um die Expression zu kontrollieren. Die Vektoren können auch andere Sequenzen umfassen, wie beispielsweise Promotoren oder Enhancer, um die Expression der insertierten Nucleinsäure voranzutreiben, Nucleinsäuresequenzen, sodass das p66^shc-Polypeptid als Fusion produziert wird, und/oder Nucleinsäure, die für Sekrektionssignale kodiert, sodass das in der Wirtszelle produzierte Polypeptid von der Zelle sekretiert wird. Das p66^shc-Polypeptid kann dann erhalten werden, indem die Vektoren in Wirtszellen transformiert werden, in denen der Vektor funktionell ist, die Wirtszellen kultiviert werden, sodass das p66^shc-Polypeptid produziert wird, und das p66^shc-Polypeptid aus den Wirtszellen oder dem umliegenden Medium gewonnen wird. Auf dem Gebiet der Erfindung werden prokaryotische und eukaryotische Zellen für diesen Zweck verwendet, einschließlich Stämmen von E. coli, Hefe und eukaryotischen Zellen, wie z.B. COS- und CHO-Zellen. Die Wahl der Wirtszelle kann dazu genutzt werden, die Eigenschaften des in diesen Zellen exprimierten p66^shc-Polypeptids zu kontrollieren, also beispielsweise zu kontrollieren, wo das Polypeptid in den Wirtszellen positioniert wird, oder die Eigenschaften, wie beispielsweise seine Glykosylierung, zu beeinflussen.
PCR-Verfahren zur Amplifikation von Nucleinsäure sind im US-Patent Nr. 4.683.195 beschrieben. Im Allgemeinen erfordern solche Verfahren, dass die Sequenzinformationen über die Enden der Zielsequenz bekannt sind, damit geeignete Vorwärts- und Rückwärts-Oligonucleotidprimer gewählt werden können, die ident oder ähnlich sind wie die Polynucleotidsequenz, die das Ziel der Amplifikation ist. PCR umfasst die Schritte der Denaturierung von Matrizen-Nucleinsäure (wenn sie doppelsträngig ist), des Anellierens eines Primers an ein Ziel und der Polymerisation. Die Nucleinsäure, die sondiert oder als Matrize für die Amplifikationsreaktion verwendet wird, kann genomische DNA, cDNA oder RNA sein. PCR kann verwendet werden, um spezifische Sequenzen von genomischer DNA, spezifische RNA-Sequenzen und cDNA, die von mRNA transkribiert wurde, Bakteriophagen- oder Plasmidsequenzen zu amplifizieren. Mithilfe der p66^shc-Nucleinsäuresequenzen, die hierein bereitgestellt werden, können Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung leicht PCR-Primer entwerfen. Literaturverweise in Bezug auf die allgemeine Verwendung von PCR-Verfahren umfassen Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51, 263 (1987), Ehrlich, Hrsg., PCR Technology, Stockton Press, NY, USA (1989), Ehrlich et al., Science 252, 1643–1650 (1991), "PCR Protocols; A Guide to Methods and Applications", Innis et al. (Hrsg.), Academic Press, New York, USA (1990).
Ein Oligonucleotid zur Verwendung bei der Amplifikation von Nucleinsäure kann etwa 10 oder weniger (z.B. 6, 7 oder 8) Codons aufweisen, d.h. etwa 30 oder weniger (z.B. 18, 21 oder 24) Nucleotide lang sein. Im Allgemeinen sind spezifische Primer 14 Nucleotide lang oder länger, aber nicht länger als 18–20. Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung ist das Entwerfen von Primern zur Verwendung bei Verfahren wie PCR bekannt.
Ein einfacher Weg, ein Polypeptid gemäß vorliegende Erfindung herzustellen, besteht in der Expression von dafür kodierender Nucleinsäure durch den Einsatz der Nucleinsäure in einem Expressionssystem. Die Verwendung von Expressionssystemen ist heutzutage schon weit ausgereift.
Demgemäß umfasst die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptid (wie offenbart), wobei das Verfahren die Expression von Nucleinsäure kodiertem Polypeptid umfasst (im Allgemeinen Nucleinsäure gemäß vorliegender Erfindung). Das kann im Allgemeinen dadurch erreicht werden, indem eine Wirtszelle in einer Kultur gezüchtet wird, die solch einen Vektor enthält, und zwar unter geeigneten Bedingungen, die eine Expression des Polypeptids auslösen oder erlauben. Polypeptide können auch in In-vitro-Systemen exprimiert werden, wie beispielsweise in einem Retikulozytenlysat.
Systeme zum Klonieren und Exprimieren eines Polypeptids in verschiedenen Wirtszellen sind allgemein bekannt. Geeignete Wirtszellen umfassen Bakterien, eukaryotische Zellen, wie z.B. Säugetier- und Hefezellen, und Baculovirus-Systeme. Säugetierzelllinien, die auf dem Gebiet der Erfindung zur Expression eines heterologen Polypeptids verfügbar sind, umfassen Chinahamster-Eierstockzellen HeLa-Zellen, Nierenzellen von jungen Hamstern, COS-Zellen und viele andere. Ein häufiger, bevorzugter bakterieller Wirt ist E. coli.
Geeignete Vektoren, die geeignete Regulationssequenzen enthalten, einschließlich Promotorsequenzen, Terminatorfragmenten, Polyadenylierungssequenzen, Verstärkersequenzen, Marker-Genen und anderen geeigneten Sequenzen, können gewählt oder konstruiert werden. Die Vektoren können je nach Fall Plasmide, viralen Ursprungs, z.B. Phagen oder Phagemid sein. Für weitere Detalls siehe beispielsweise Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Viele bekannte Verfahren und Protokolle zur Manipulation von Nucleinsäure, beispielsweise bei der Herstellung von Nucleinsäurekonstrukten, Mutagenese, Sequenzierung, Einbringung von DNA in Zellen und Genexpression sowie zur Analyse von Proteinen, sind in Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Hrsg., John Wiley & Sons (1992), genauer beschrieben.
Somit stellt die vorliegende Erfindung außerdem eine Wirtszelle bereit, die einen hierin offenbarten Vektor umfasst. Die Nucleinsäure der Erfindung kann in das Genom (z.B. Chromosom) der Wirtszelle eingebunden werden. Gemäß herkömmlichen Verfahren kann die Einbindung kann durch die Aufnahme von Sequenzen unterstützt werden, die eine Rekombination mit dem Genom fördern. Die Nucleinsäure kann sich auf einem extrachromosomalen Vektor innerhalb der Zelle befinden.
Ein Antisense-Oligonucleotid, das in der Lage ist, spezifisch an die p66^shc-Nucleinsäure zu hybridisieren, kann bei der Herstellung eines Medikaments zur Steigerung der Resistenz von Zellen gegen oxidative Belastung verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem In-vitro-Verfahren zur Steigerung der Resistenz von Zellen gegen oxidative Belastung bereit. Solch eine oxidative Belastung kann das Ergebnis von externen Faktoren, z.B. Umweltfaktoren, sein, wie beispielsweise UV, Röntgenstrahlen, Hitzeschock, osmotischem Schock, oxidativer Belastung (Singulett-Sauerstoff, H₂O₂, Hydroxylresten, Entzündungszytokine), oder es kann das Ergebnis von internen Faktoren sein, die zur Nekrose von Zellen führen, wie dies bei manchen Erkrankungen der Fall ist.
Ein Verfahren zur Steigerung der Resistenz gegen oxidative Belastung umfasst das Unterbrechen eines p66^shc-Signalwegs. Der Weg kann in jedem Stadium während des Signalvorgangs unterbrochen werden, so kann das p66^shc-Polypeptid beispielsweise so mutiert werden, dass der Serinrest nicht vorhanden oder durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt ist, wie beispielsweise Alanin, sodass das resultierende Polypeptid nicht serinphosphoryliert werden kann; die Fähigkeit von Molekülen, wie z.B. p38 oder MAPK, p66^shc zu phosphorylieren, kann beispielsweise durch dominante negative Kinasen oder spezifische Inhibitoren gestört werden; insbesondere bevorzugt ist eine Störung der p66^shc-Expression durch Herabregulierung des p66^shc-Polypeptids in der Zelle. Da p53 und p16 in p66-(–/–)-Zellen nicht biologisch aktiv sind, kann jedes beliebige dominante negative p66-Molekül verwendet werden, um die p16- und p53-Funktion zu blockieren.
Die Störung der p66^shc-Genexpression kann auf verschiedene Arten erreicht werden. Auf der p66^shc-Sequenz basierende Antisense-Oligonucleotidsequenzen können so entworfen werden, dass sie an die komplementäre Sequenz einer Nucleinsäure, Prä-mRNA oder reifen mRNA hybridisiert werden, wodurch sie die Produktion des Polypeptid stören, für die eine vorgegebene DNA-Sequenz kodiert (z.B. entweder natives p66^shc-Polypeptid oder eine mutierte Form davon), sodass seine Expression verringert oder ganz verhindert wird. Außer für die p66^shc-Kodiersequenz können die Antisense-Verfahren auch verwendet werden, um die Kontrollsequenzen des p66^shc-Gens anzupeilen, z.B. in der 5'-Flankierungssequenz der p66^shc-Kodiersequenz, wodurch Antisense-Oligonucleotide die p66^shc-Kontrollsequenzen stören können. Die Konstruktion von Antisense-Sequenzen und ihre Verwendung ist in Peyman und Ulman, Chemical Reviews 90, 543–584 (1990), Crooke, Ann. Rev. Pharmacol. Toxical. 32, 329–376 (1992), und Zamecnik und Stephenson, P.N.A.S. 75, 280–284 (1974), beschrieben.
Ein Verfahren zum Screenen auf Verbindungen, die zur Modulierung eines p66^shc-Signalwegs fähig sind, kann das Kontaktieren einer Kandidatenverbindung mit einem p66^shc-Expressionssystem, wie es oben beschrieben ist; das Bestimmen der Menge einer Komponente des Signalwegs; und das Vergleichen der Menge der Komponente mit der Menge der Komponente in Abwesenheit der Kandidatenverbindung umfassen.
Vorzugsweise umfasst das Expressionssystem einen Nucleinsäurevektor mit einer p66^shc-Kodiersequenz oder einem Fragment davon, die/das darin eingebaut ist. Geeignete Vektoren, die geeignete Regulationssequenzen enthalten, einschließlich Promotorsequenzen, Terminationsfragmenten, Polyadenylierungssequenzen, Verstärkersequenzen, Marker-Genen und anderen geeigneten Sequenzen, können gewählt oder konstruiert werden. Für weitere Detalls siehe beispielsweise Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Welches Verfahren für die Einbringung der Nucleinsäure in Zellen verwendet wird, hängt von der verwendeten Wirtszelle ab, aber solche Verfahren sind allgemein bekannt.
Somit kann das Expressionssystem auch eine Wirtszelle umfassen, die eine p66^shc-Kodiersequenz oder einen Vektor, wie er oben offenbart ist, enthält. Insbesondere bevorzugt ist ein Expressionssystem, das eine Zelle von einer Zelllinie, wie beispielsweise Mäuseembryofibroblasten, umfasst, die bekannterweise p66^shc exprimiert.
Der p66^shc-Signalweg kann zu jedem Zeitpunkt während des Signalwegs moduliert, z.B. unterbrochen, werden, sodass die Produktion von aktiven p66^shc verhindert wird. Beispiele für solche Modulationen umfassen die direkte Verhinderung der Expression von p66^shc durch das Blockieren von Faktoren, die an der Transkription von Genen beteiligt sind. Beispielsweise könne Antisense-Primer verwendet werden, um das p66^shc-Gen zu binden, wodurch die Transkriptionsfaktoren daran gehindert werden, an Regulationsstoffe zu binden, die für die Förderung der Transkription erforderlich sind. Alternativ dazu kann auch die Kodiersequenz für p66^shc angepeilt werden, um Mutationen einzubringen, welche die Expression von p66^shc verhindern, ohne die Expression von verwandten Proteinen, wie z.B. p52^shc und p46^shc, zu stören. Vorzugsweise unterbricht die Mutation das Exon, das für die p66-CH2-Region kodiert. Antisense-Sonden können ebenfalls verwendet werden, um DNA oder mRNA, die für p66^shc kodiert, zu binden, sodass ihre Translation verhindert wird. Alternativ dazu können für p66^shc spezifische Antikörper (z.B. Anti-CH2-Antikörper) verwendet werden, um sie spezifisch an das exprimierte Protein zu binden, sodass eine darauf folgende Bindung von p66^shc an andere Proteine, z.B. Rezeptoren, verhindert wird.
Ferner kann die Hemmung der p66-Funktion erreicht werden, indem die Phosphorylierung der p66-CH2-Region gehemmt wird, die durch Erk1- oder p38-Stresskinasen ausgelöst wird. Zu diesem Zweck kann eine Bibliothek von Verbindungen gescreent werden, um jene zu identifizieren, die zur Hemmung der In-vitro-Phosphorylierung der GST-CH2-Region durch rekombinantes Erk1 fähig sind. Beispiele für solche Verbindungen umfassen MAPK (mitogenaktivierte Proteinkinase), beliebige Serin/Threoninkinasen und p38.
Antikörper können ebenfalls verwendet werden, um die Aktivität oder Funktion von p66^shc zu beeinflussen oder modulieren. Somit besteht eine weitere und wichtige Verwendungsmöglichkeit für das p66^shc-Polypeptid in der Erhöhung der Zahl an Antikörpern, die zur spezifischen Bindung an das p66^shc-Polypeptid, an Fragmente davon oder an aktive Abschnitte davon fähig sind.
Die Produktion von monoklonalen Antikörpern ist auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt. Monoklonale Antikörper können DNA-Rekombinationsverfahren unterzogen werden, um andere Antikörper oder chimäre Moleküle zu erzeugen, welche die Spezifität des ursprünglichen Antikörpers beibehalten. Solche Verfahren können die Einbringung von DNA, die für die variable Immunglobulinregion kodiert, oder der komplementaritätsbestimmenden Bereiche (CDRs) eines Antikörpers in die konstanten Regionen oder konstanten Regionen inklusive Gerüstregionen eines anderen Immunglobulins umfassen. Siehe beispielsweise EP-A-184087, GB-A-2188638 oder EP-A-239400. Ein Hybridom, das einen monoklonalen Antikörper produziert, kann einer genetischen Mutation oder anderen Veränderungen unterzogen werden, welche die Bindungsspezifität der produzierten Antikörper ändern kann oder auch nicht.
Ein Antikörper, der spezifisch an das p66^shc-Polypeptid binden kann, kann in dem Sinne spezifisch sein, dass er zwischen dem Polypeptid, das er binden kann, und anderen menschlichen Polypeptiden, für die er keine oder im Wesentlichen keine Bindungsaffinität aufweist (z.B. eine etwa 1000-mal schlechtere Bindungsaffinität), unterschieden kann. Spezifische Antikörper binden ein Epitop auf dem Molekül, das in anderen Molekülen entweder nicht vorhanden oder nicht zugänglich ist. Antikörper gemäß vorliegender Erfindung sind vorzugsweise für das p66^shc-Polypeptid der Wildform spezifisch, sodass sie seine Funktion stören.
Bevorzugte Antikörper sind in dem Sinne isoliert, dass sie frei von Verunreinigungen, wie beispielsweise Antikörpern, die andere Polypeptide binden können, und/oder frei von Serumkomponenten sind. Für manche Zwecke werden monoklonale Antikörper bevorzugt, obwohl auch polyklonale Antikörper innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung liegen.
Antikörper können mithilfe von Standardverfahren auf dem Gebiet der Erfindung erhalten werden. Verfahren zur Herstellung von Antikörpern umfassen die Immunisierung eines Säugetiers (z.B. Maus, Ratte, Kaninchen, Pferd, Ziege, Schaf oder Affe) mit dem Protein oder einem Fragment davon. Antikörper können mithilfe verschiedener auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren aus immunisierten Tieren gewonnen und gescreent werden, vorzugsweise durch Bindung eines Antikörpers an ein Antigen von Interesse. Western-Blotting-Verfahren oder Immunfällung können beispielsweise verwendet werden (Armitage et al., Nature 357, 80–82 (1992)). Zur Isolation von Antikörpern und/oder antikörperproduzierenden Zellen aus einem Tier muss das Tier eventuell getötet werden.
Als Alternative oder Ergänzung zur Immunisierung eines Säugetiers mit einem Peptid kann ein Antikörper, der für ein Protein spezifisch ist, aus einer rekombinant produzierten Bibliothek von exprimierten variablen Immunglobulindomänen erhalten werden, beispielsweise mithilfe eines Lambda-Bakteriophagen oder filamentösen Bakteriophagen, die funktionelle immunglobulinbindende Domänen auf ihren Oberflächen aufweisen; siehe beispielsweise WO92/01047. Die Bibliothek kann nalv sein, d.h. aus Sequenzen konstruiert sein, die aus einem Organismus erhalten wurden, der nicht mit einem der Proteine (oder einem Fragment davon) immunisiert wurde, oder sie kann unter Verwendung von Sequenzen konstruiert sein, die von einem Organismus erhalten wurden, der dem Antigen von Interesse ausgesetzt war.
Antikörper gemäß vorliegender Erfindung können auf verschiedene Arten modifiziert werden. Der Begriff "Antikörper" sollte tatsächlich so verstanden werden, dass er alle Bindesubstanzen mit einer Bindungsdomäne mit der gewünschten Spezifität umfasst. Somit umfasst die Erfindung Antikörperfragmente, Derivate, funktionelle Äquivalente und Homologe von Antikörpern, einschließlich synthetischen Molekülen und Molekülen, deren Gestalt die eines Antikörpers nachahmt, sodass sie ein Antigen oder Epitop binden können.
Beispiele für Antikörperfragmente, die zur Bindung eines Antigens oder eines anderen Bindepartners fähig sind, sind das Fab-Fragment, das aus der VL-, VH-, C1- und CH1-Domäne besteht; das Fd-Fragment, das aus der VH- und CH1-Domäne besteht; das Fv-Fragment, das aus der VL- und VH-Domäne eines einzelnen Arms eines Antikörpers besteht; das dAb-Fragment, das aus einer VH-Domäne besteht; isolierte CDR-Regionen und F(ab')2-Fragmente, ein zweiwertiges Fragment, das zwei Fab-Fragmente umfasst, die durch eine Disulfid-Brücke an der Gelenk-Region verbunden sind. Einkettige Fv-Fragmente sind ebenfalls umfasst.
Es ist allgemein bekannt, dass pharmazeutische Forschung zur Identifikation eines neuen Arzneimittels das Screenen einer sehr großen Anzahl von Kandidatensubstanzen umfassen kann, sowohl bevor als auch nachdem eine Leitverbindung gefunden wurde. Das ist ein Faktor, der die pharmazeutische Forschung sehr teuer und zeitaufwendig macht. Mittel zur Unterstützung des Screening-Verfahrens können bedeutende kommerzielle Bedeutung und Nützlichkeit aufweisen. Solche Mittel zum Screenen auf Substanzen, die möglicherweise zur Steigerung der Resistenz gegen oxidative Belastung nützlich sind und so die zelluläre Lebensdauer verlängern, werden durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt.
Ein Verfahren zum Screenen auf eine Substanz, welche die Aktivität des p66^shc-Polypeptids moduliert (stört), kann das Kontaktieren einer oder mehrerer Testsubstanzen mit dem Polypeptid in einem geeigneten Reaktionsmedium, das Testen der Aktivität des behandelten Polypeptids und das Vergleichen dieser Aktivität mit der Aktivität des Polypeptids in einem vergleichbaren Reaktionsmedium, das nicht mit der Testsubstanz oder den Testsubstanzen behandelt wurde, umfassen. Praktischerweise kann ein Enzymaktivitätstest verwendet werden, um beliebige Störungen der Aktivität von p66^shc zu bestimmen.
Verfahren mit kombinatorischen Bibliotheken stellen eine effiziente Möglichkeit dar, eine möglicherweise große Anzahl an unterschiedlichen Substanzen auf ihre Fähigkeit zu testen, die Aktivität von p66^shc zu stören oder auszulöschen. Solche Bibliotheken und ihre Verwendung sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Die Verwendung von Peptidbibliotheken ist bevorzugt.
Außerdem können Tests zur Bestimmung von p66-Inhibitoren die Verwendung von Zellen der Wildform umfassen (sowohl von etablierten Zelllinien als auch von primären Zellen, die zur Expression von p66^shc fähig sind, z.B. MEFs, p66-(–/–)-MEFs oder MEFs, die p66 überexprimieren (durch die Verwendung eines p66^shc-Expressionsvektors)).
Vergleichsantworten, die bestimmt werden sollen, können Antworten auf Stressfaktoren, z.B. UV oder H₂O₂; die Hemmung von durch RASV12 (oder einem beliebigen anderen Onkogen) induzierte Alterung in primären Fibroblasten; die Hemmung der p53-, p19-, p16- oder p21-Funktion (gemessen durch Transkriptionstest, Stabilitätstests oder Nucleus-Zytoplasmaexport-Tests); oder die Hemmung von p66-Phosphorylierung, die durch RASV12 oder durch oxidative Belastungssignale induziert wird, umfassen.
Nach der Identifizierung einer Substanz oder Verbindung, die p66^shc stört oder einen Schritt im p66^shc-Signalweg unterbricht, kann die Substanz oder Verbindung genauer untersucht werden. Außerdem kann sie hergestellt und/oder bei der Bereitstellung, d.h. Herstellung oder Formulierung, einer Zusammensetzung, wie beispielsweise eines Medikaments, einer pharmazeutischen Zusammensetzung oder eines Arzneimittels, verwendet werden. Diese können Personen verabreicht werden. Oxidative Belastung hängt mit der Entstehung vieler menschlicher Krankheiten zusammen. Somit können Medikamente, pharmazeutische Zusammensetzungen oder Arzneimittel, die einen Inhibitor der p66-Funktion umfassen, oder Substanzen oder Verbindungen, die p66^shc stören oder einen Schritt im p66^shc-Weg unterbrechen, bei der Behandlung von Krankheiten, wie beispielsweise Arteriosklerose; ischämischen Herzkrankheiten, Parkinson, Alzheimer, Gefäßkomplikationen in Zusammenhang mit Diabetes, Emphysemen und anderen Lungenkrankheiten, Myokardinfarkten, Schlaganfällen, frühzeitiger Alterung, Zellalterung, Hautkrankheiten und Krebs, verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein In-vitro-Verfahren zur Steigerung der zellulären Resistenz gegen oxidative Belastung bereit, welches das Auslöschen oder Stören des für p66^shc kodierenden Gens im zellulären Genom umfasst. Solch ein Verfahren kann Verfahren umfassen, bei denen ein Nucleinsäurevektor eine Nucleinsäuresequenz umfasst, die in das Genom der Zelle inkorporiert werden und die Expression von p66^shc stören kann.
Vektoren, wie beispielsweise virale Vektoren, wurden nach dem Stand der Technik verwendet, um Gene in verschiedenste Zielzellen einzubringen. Typischerweise werden die Vektoren den Zielzellen ausgesetzt, sodass eine Transfektion in einem ausreichenden Anteil der Zellen stattfinden kann, um eine nützliche therapeutische oder prophylaktische Wirkung aus der Expression des gewünschten Polypeptid zu erhalten. Die transfizierte Nucleinsäure kann permanent in das Genom der einzelnen angepeilten Tumorzellen inkorporiert werden, was eine langfristige Wirkung bereitstellt, oder alternativ dazu kann die Behandlung regelmäßig wiederholt werden.
Auf dem Gebiet der Erfindung der Erfindung ist eine Reihe von Vektoren bekannt, sowohl virale Vektoren als auch Plasmidvektoren; siehe US-Patent Nr. 5.252.479 und WO 93/07282. Genauer gesagt wurden verschiedene Vektoren als Gentransfervektoren verwendet, einschließlich Papovaviren, wie z.B. SV40, Vacciniaviren, Herpesviren, einschließlich HSV und EBV, und Retroviren. Viele Gentherapieprotokolle nach dem Stand der Technik nutzen inaktivierte Mäuseretroviren.
Als Alternative zur Verwendung von viralen Vektoren können auch andere bekannte Verfahren zur Einbringung von Nucleinsäure in Zellen verwendet werden, einschließ lich Elektroporation, Calciumphosphat-Cofällung, mechanischen Verfahren, wie z.B. Mikroinjektion, durch Liposomen und direkte DNA-Aufnahme vermittelten Transfers und rezeptorvermittelten DNA-Transfers.
Wie oben erwähnt haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung auch entdeckt, dass die p66-Expression für die Fähigkeit von p53, Apoptose (beispielsweise nach oxidativer Belastung) oder Alterung zu induzieren (beispielsweise nach einer Ras-Expression), unentbehrlich ist. Somit können Agonisten von p66 als mögliche Tumorsuppressoren betrachtet werden. Tatsächlich sind alle Moleküle, welche die Dephosphorylierung von p66 verhindern, oder Kinasen, die eine p66-Phosporylierung induzieren, mögliche Kandidaten für eine Tumorbehandlung.
Somit wird in einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung die Verwendung eines Vektors, der für p66^shc-Polypeptid kodierende Nucleinsäure umfasst, zur Herstellung eines Medikaments zur Steigerung der Resistenz gegen Tumorbildung in einem Gewebe durch Steigerung der Expression von p66^shc bereitgestellt. Die hierin offenbarten Ergebnisse weisen darauf hin, dass erhöhte Werte von p66^shc die Anfälligkeit für Carcinogenese verringern. Der Vektor ist in der Lage, die Nucleinsäure in das Genom der Zellen des Gewebes einzubinden.
Beispielsweise könnte Nucleinsäure, die für ein authentisches, biologisch aktives p66^shc-Polypeptid kodiert, in einem Gentherapieverfahren eingesetzt werden, um einen Patienten zu behandeln, der nicht in der Lage ist, das aktive Polypeptid zu synthetisieren, oder nicht in der Lage ist, es im normalen Ausmaß zu synthetisieren, wodurch die Wirkung des p66^shc der Wildform bereitgestellt und die Anfälligkeit für Tumorbildung unterdrückt wird.
Nachstehend werden Aspekte und Ausführungsformen der Erfindung unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen veranschaulicht. Weitere Aspekte der Erfindung sind für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offensichtlich.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
Im Einzelnen zeigen die Figuren Folgendes.
1 zeigt die Serinphosphorylierung von p66^shc durch UV- oder H₂O₂-Behandlung. 1A: Modulare Organisation von p66^shc; Y: Y239, Y340 und Y317, die wichtigsten Shc-Tyrosinphosphorylierungsstellen. Das alternative Initiationscodon (ATG) von p46^shc ist gekennzeichnet. 1B: Anti-Phosphotyrosin-Western-Blotting von Anti-p66-(αCH2-)Immunpräzipitaten von Lysaten von serumabgereicherten MEFs (SF) oder Mäuseembryofibroblasten (MEFs), die, wie angegeben, 5 min oder 4 h lang mit EGF, UV oder H₂O₂ behandelt wurden. Der gleiche Blot wurde mit Anti-p66^shc-Antikörpern (α-CH2) erneut sondiert. Die p66^shc-Polypeptide sind mit Pfeilen gekennzeichnet. Kreuzreaktive Immunglobulinpolypeptide sind ebenfalls angegeben (Ig). 1C: Western-Blot-Analyse der p66^shc-Expression von serumabgereicherten MEFs (SF) oder 5 min oder 4 h, je nach Angabe, mit EGF, UV oder H₂O₂ behandelten MEFs. Der gleiche Blot wurde mit Anti-Actin-Antikörpern erneut sondiert. 1D: Phosphoaminosäureanalyse von p66^shc. Serumabgereicherte MEFs (SF) wurden 4 Stunden lang mit 1 mCi/ml [³²P]-Orthophosphat markiert, und nicht stimulierte (SF) oder 5 min oder 5 h lang mit EGF, UV oder H₂O₂ stimulierte Zellen wurden lysiert und Immunpräzipitate wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und in Nitrocellulose transferiert und einer Autoradiographie unterzogen (nicht dargestellt). Phosphoaminosäureanalysen wurden am p66^shc-Polypeptid durchgeführt. Die Positionen der Phosphoserin- (S), Phosphothreonin- (T) und Phosphotyrosinmarker (Y) sind angegeben.
2 zeigt, dass p66^shc die Antwort auf oxidative Belastung in vitro und in vivo erhöht. 2A: Western-Blotting-Analyse der Shc-Expression in p66^shc-(+/+)- oder p66^shc-(–/–)-MEFs (linke Abbildung) und in p66^shc-(–/–)-MEFs, die mit einem Vektor alleine, p66^shc- oder p66^shcS36A-cDNAs transduziert sind (rechte Abbildung). 2B: Lebensfähigkeit von MEFs nach einer H₂O₂-Behandlung. Eine gleiche Anzahl (1,2 × 15⁵) der angegebenen MEF-Zellen, die in 100 mm großen Schalen dreifach gezüch tet worden waren, wurden mit dem PINCO-Retrovirus oder mit PINCO-Retroviren, die p66^shc oder p66^shcS36A exprimieren, wie angegeben infiziert, weitere 48 h gezüchtet, um eine Genexpression von exogener cDNA zu erlauben, und 24 h lang 400 mM H₂O₂ ausgesetzt. Die Zelllebensfähigkeit wurde durch Trypanblauausschluss bestimmt. Die Ergebnisse sind als Prozent an lebensfähigen Zellen in Bezug auf H₂O₂-unbehandelte Kontrollen angegeben und stellen das Mittel von drei unabhängigen Experimenten dar. Die Expression von p66^shc oder p66^shcS36A hatte, laut einer Messung 48 h nach der Virusinfektion, keine signifikante Auswirkung auf die Lebensfähigkeit oder Wachstumsgeschwindigkeit von MEFs (nicht dargestellt).
3 zeigt eine Kartierung von p66^shc-Serinphosphorylierungsstellen. 3A: Anti-CH2-Western-Blots von Lysaten von MEFs, die mit die isolierte CH2-Region exprimierenden Vektoren transfiziert wurden und dann abgereichert (SF) oder 5 min oder 4 h lang, je nach Angabe, mit EGF oder UV behandelt wurden. Der Stern zeigt das verschobene CH2-Polypeptid an. 3B: Die S36A- oder S54A-Mutation wurde mit der isolierten CH2-Region oder dem p66^shc voller Länge eingebracht. Die resultierenden cDNAs wurden HA-markiert, mit einem pcDNA3-Expressionsvektor kloniert und in MEFs transfiziert. Die Kulturen wurden wie angegeben behandelt und einer Western-Blotting-Analyse unter Verwendung von Anti-HA-Antikörpern unterzogen. 3C: Phosphoaminosäureanalyse von p66^shc und p66^shcS36A. Die MEFs wurden mit HA-p66^shc- oder HA-p66^shcS36A-Expressionsvektoren transfiziert, 48 h lang in Kultur gehalten, 4 h lang mit 1 mCi/ml [³²P]-Orthophosphat markiert, 5 min lang mit EGF oder H₂O₂ behandelt, wie angegeben, lysiert und mit Anti-HA-Antikörpern immungefällt. Auch eine Phosphoaminosäureanalyse wurde an den HA-p66^shc- oder HA-p66^shcS36A-Polypeptiden durchgeführt, wobei die gleiche Legende wie in 1 anzuwenden ist.
4 zeigt das kumulative Überleben (Kaplan und Meier) von p66^shc-(+/+)- (gestrichelte Linie), p66^shc-(+/–)- (gepunktete Linie) und p66^shc-(–/–)-Mäusen (durchgehende Linie). Die Überlebensrate der p66^shc-(–/–)- Mäuse betrug 71,4%.
5 zeigt (a) die p66-cDNA-Nucleotidsequenz (die ATG-Initiationsstelle ist unterstrichen) und (b) separat die p66-Aminosäuresequenz.
6 zeigt eine 13 kb große genomische Region, die alle für Shc kodierenden Exons enthält und durch Restriktionsenzymkartierung charakterisiert wurde, und die Nucleotidsequenz von allen Exon-Intron-Grenzen und 5'-Regulationsregionen.
7 zeigt den Aufbau des Targeting-Vektors pBSp66ShcKO.
8 zeigt den Vektor pBSp66ShcKO mit einer TK-Transkriptionseinheit, die an seinem 3'-Ende kloniert wurde.
9 zeigt mehrere Stoffwechselveränderungen in p66^shc-(–/–)-Zellen. Genauer gesagt zeigt sie den Mechanismus der p66-Wirkung und ihre Stoffwechselauswirkungen, vor allem die erhöhte Produktion von H₂O₂ und die damit zusammenhängende Steigerung der Konzentration von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS); und die erhöhte Produktion von ATP (auf Kosten von ROS). Außerdem wird bestätigt, dass p66 in der Mitochondrienmembran positioniert ist, eine Übergangsstelle regelt und am Elektronentransfer beteiligt ist.
10 zeigt die Regelung der mitochondrialen Aktivität durch p66^shc.
11 zeigt die Rolle von p66 in der p53-abhängigen Apoptose.
Detalllierte Beschreibung
1) Zelllinien, Reagenzien und Plasmidkonstruktion
Mäuseembryofibroblasten (MEFs) wurden aus 12 bis 14 Tage alten Embryos isoliert, die von p66^shc-(–/–)-Mäusen und p66^shc-(+/+)-Mäusen stammten, und in Earles Minimalmedium gehalten, das mit 10% fötalem Rinderserum ergänzt war. Die S36A- und S54A-Mutationen wurden durch herkömmliche PCR-Verfahren erzeugt. p66^shc, p66^shcS36A, HA-CH2, HA-CH2S35A, HA-CH2S54A, HA-p66^shc, HA-p66^shc-S35A und HA-p66^shcS54A wurden in die eukaryotischen pCDNA3- oder PINCO-Expressionsvektoren kloniert (P. P. Claudio et al., Cancer Res. 54, 5556–5560 (1994); F. Grignani et al., Cancer Res. 1, 14–19 (1998)). Als Antikörper wurden verwendet: der polyklonale Anti-Shc-Antikörper, der die SH2-Domäne aller drei Shc-Isoformen erkennt (G. Pelicci et al., Cell 70, 93–104 (1992)); der polyklonale Anti-p66-Antikörper, der die p66^shc-Isoform erkennt (E. Migliaccio et al., Embo J. 16, 706–716 (1997)); der polyklonale Anti-βActin-Antikörper (Sigma Immuno Chemicals); der monoklonale Anti-HA-Antikörper; und der monoklonale Antiphosphotyrosin-Antikörper (Santa Cruz Biotechnology).
2) Metabolische Markierung, Immunfällung, Western-Blotting und Phosphoaminosäureanalyse
Für ganze Lysate werden Zellen direkt in einem SDS-Probenpuffer (50 mM Tris-HCl pH 6,8, 2 Vol.-% SDS, 10% Glycerin und 5 Vol.-% β-Mercaptoethanol) lysiert und 5 min lang gekocht. 50 μg der gesamte Proteine wurden durch SDS-PAGE analysiert. Für die Immunfällung wurden die Zellen auf Eis in einem PY-Puffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,8, 50 mM NaCl, 30 mM Na₄P₂O₇, 5 mM Natriumorthovanadat, 1 Vol.-% Triton X-100 mit frisch zugesetzten Proteaseinhibitoren: 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 10 μgml^–1 Leupeptin und 5 mgml^–1 Aprotinin) lysiert, geeignete Antikörper wurden auf Protein-A-Sepharose (Pharmacia) adsorbiert und dann 2 h lang bei 4°C mit Zelllysaten inkubiert. Immunfällungen wurden gewonnen, durch 10% SDS-PAGE aufgetrennt und wie in der Literatur beschrieben auf Nitrocellulosefilter transferiert (E. Migliaccio et al., Embo J. 16, 706–716 (1997)). Die Blots wurden blockiert und mit spezifischen Antikörpern sondiert, und Immunkomplexe wurden durch Meerrettichperoxidase, die mit spezifischem sekundärem Antiserum (Biorad) konjugiert war, gefolgt von verstärkter Chemilumineszenz identifiziert. Für Phosphoaminosäureanalysen wurden Zellen bis zur Konfluenz auf 10 cm großen Platten gezüchtet, in einem serumfreien Medium abgereichert und 4 h lang in 5 ml phosphatfreiem DMEM, das 5% dialysiertes FBS und 1 mCiml^–1 ³²P-Orthophosphat enthielt, markiert. Die Zellen wurden mit 30 ngml^–1 EGF oder 400 μM H₂O₂ stimuliert oder mit 50 J/m² UV bestrahlt, zweimal mit eiskaltem PBS gespült und in einem PY-Puffer lysiert. p66^shc-Proteine wurden durch Immunfällung mit Anti-SHC- oder Anti-HA-Antikörpern isoliert und durch SDS-PAGE aufgetrennt. p66^shc-Polypeptide wurden auf PVDF-Membranen transferiert und 60 min lang bei 110°C in 6 M HCl hydrolysiert. Die Hydrolyseprodukte wurden durch SDS-PAGE bei pH 1,9 und pH 3,5 in Gegenwart von Phosphoserin-, Phosphothreonin- und Phosphotyrosinmarkern in zwei Dimensionen auf DC-Platten aufgetrennt.
3) Transfektionen, Infektionen und zelluläre Lebensfähigkeitstests
MEFs wurden mit dem LipofectaMINE-PLUS-Reagens GibcoBRL (mittlere Transfektionseffizienz 50%) transfiziert. Für retrovirale Infektionen wurden der leere PINCO-Vektor und rekombinante PINCO-Vektoren, die p66^shc- oder p66^shcS36A-cDNAs exprimierten, in die amphotrope Phoenix-Verpackungszelllinie transfiziert, und nach 48 Stunden wurden die Überstände verwendet, um MEF-Zellen zu infizieren (1,2 × 10⁵ Zellen/100-mm-Schale). Die Effizienz der Infektion (GFP-positive Zellen) wurde durch eine FACS-Analyse 48 Stunden nach der Infektion bestimmt. Die Lebensfähigkeit wurde durch den Tryptanblau-Färbungs-Ausschlusstest bestimmt.
4) Statistische Analysen
Die Überlebensfunktionen wurden durch das "Product-Limit"-Verfahren von Kaplan und Meier bestimmt. Die Überlebensverteilungen wurde unter Verwendung des "Logrank"-Tests verglichen (E. Marubini et al., John Wiley & Sons, New York (1995)). Alle statistischen Berechnungen wurden unter Verwendung der Software SAS/STAT Rel. 6.12 (SAS Institute 1995) durchgeführt.
5) Konstruktion eines p66^shc-Targeting-Vektors und Elektroporation und Selektion von ES-Zellen
Der Targeting-Vektor wurde unter Verwendung von herkömmlichen Klonierverfahren hergestellt. Das Plasmid wurde mit Kpn 1 linearisiert, bevor es in ES-Zellen elektroporiert wurde. CJ7-ES-Zellen wurden auf einer Monolayer aus durch Mitomycin C inaktivierten, gegen Neomycin resistenten, primären embryonalen Fibroblasten gehalten. Eine Suspension von 15 Millionen trypsinisierten ES-Zellen in PBS wurde mit 25 μg DNA des linearisierten Targeting-Vektors elektroporiert, indem der Gene Pulser II von Bio-Rad mit 240 V und 500 μF verwendet wurde. Die Zellen wurde direkt nach der Transfektion ausplattiert und 24 h lang erholen gelassen, bevor sie in einem Medium aus 350 μg/ml Geneticin und 2 μM Ganciclovir selektiert wurden. Den Zellen wurde täglich Nahrung gegeben, und nach 9 Tagen wurden die resultierenden Kolonien entnommen und einzeln kultiviert, bevor sie extrahiert und eingefroren wurden.
6) Southern-Blot-Analyse von ES-Zellen und Mäusen
Um das mutierte Shc-Allel zu identifizieren, wurde genomische DNA von ES-Zellen und von den Mäuseschwänzen gewonnen, und zwar durch Proteinase-K-Lyse und Phenol-Chloroform-Extraktion, und mit Eco R1 verdaut und einer Southern-Blot-Analyse unterzogen. Ein 1,1 kb großes Eco-R1-Xba-1-Fragment wurde als externe Sonde verwendet, um zwischen den WT-8-kb- und den rekombinanten 3,5-kb-Allelbanden zu unterscheiden (2).
7) Generierung von Mäusen, die das unterbrochene p66-Shc-Allel tragen
Zwei unterschiedliche Klone von ES-Targets wurden verwendet, um chimäre Mäuse zu generieren. C57BL/6J-Blastozysten, denen 10–15 ES-Zellen injiziert worden waren, wurden in scheinschwangere weibliche Mäuse transfiziert. Chimäre Mäuse, die durch die Agouti-Fellfarbe identifiziert werden können, wurden mit C57BL/6J-Mäusen gepaart. Nachkommen mit der Agouti-Fellfarbe wurden durch eine Southern-Blot- Analyse auf die Gegenwart des rekombinanten Allels getestet. Heterozygoten, die aus den Kreuzungen der Chimären mit weiblichen 129Sv-Mäusen erhalten wurden, wurden untereinander gekreuzt, um die Kolonie von p66-(–/–)-Mäusen im genetischen Hintergrund 129 zu errichten. Die Mäuse wurden bei einer konstanten Raumtemperatur (22°C) und Feuchtigkeit (60%) mit einem 12-h-Licht/Dunkelheitszyklus gehalten, wobei sei freien Zugang zu herkömmlichem Mäusefutter und Leitungswasser hatten.
Ergebnisse
1) Konstruktion des p66^shc-Targeting-Vektors
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben den Mäuse-Shc-Locus mithilfe von herkömmlicher embryonaler Stammzelltechnologie mutiert. Der genomische Shc-Locus wurde aus einer genomischen 129-Mäusebibliothek isoliert. Ein 13 kb große genomische Region, die alle für Shc kodierenden Exons enthielt, wurde durch Restriktionsenzymkartierung und die Nucleotidsequenz aller Exon-Intron-Grenzen und regulatorischen 5'-Regionen (6) charakterisiert. Eine positive/negative (G418/Ganciclovir) Selektionsstrategie wurde angewandt, um eine Mutation in die Region des ersten kodierenden Exons einzubringen, welches das p66-ATG enthielt. Um den Targeting-Vektor (pBSp66ShcKO; 7) zu konstruieren, verwendeten die Erfinder ein EcoR1-Fragment mit 8 kb, das die Exons 1–8 enthielt (7). Das Bal-1-Fragment, das den p66-spezifischen Startort enthielt (7), wurde mit der Neo-Transkriptionseinheit substituiert, die vom pY-Promotor angetrieben wird. Die resultierenden Vektoren enthalten 2,2 und 4,6 kb große flankierende Sequenzen am 5'- bzw. 3'-Ende (7). Eine TK-Transkriptionseinheit wurden am 3'-Ende kloniert (3).
2) ES-Transfektion und Selektion
CJ7-ES-Zellen, die von Dr. Vera Soares (Memorial Sloan Kettering Cancer Center, NY, USA) bereitgestellt wurden, wurden durch Elektroporation transfiziert, und resistente Kolonien wurden selektiert und durch Southern-Blotting auf die Deletion der ersten für p66 kodierenden Sequenz gescreent. Die Screening-Strategie basierte auf der EcoR1-Stelle, die durch Insertion der Neo-Transkriptionseinheit in das angepeilte Allel eingebracht war (7). 24 von 150 analysierten ES-Klonen wiesen ein gewünschtes Shc-Allel auf. Zytogenetische Analysen von 9 ES-Klonen ergaben eine normale typische Anzahl an Chromosomen.
3) Generierung von gewünschten Mäusen
Zwei ES-Klone wurden gemäß herkömmlicher Verfahren in C57BL/6J-Blastozysten injiziert. Die Züchtung von Heterozygoten (p66^shc+/–) ergab die erwartete Häufigkeit von homozygoten Tieren. Eine Analyse des Genotyps der Tiere erfolgte durch Southern-Blotting von DNA, die aus den Schwänzen extrahiert worden waren, und wurde durch Western-Blotting der p66^shc-Expression in verschiedenen Geweben bestätigt.
4) p66 wird nach H₂O₂- oder UV-Stimulierung auf Ser36 phosphoryliert
Da Fos durch verschiedene Umweltbelastungen (Wasserstoffperoxid: H₂O₂; ultraviolette Strahlung: UV) transkriptionell aktiviert wird, haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung die Modifikationen von p66 bei H₂O₂- oder UV-Stimulierung von Fibroblasten von Mäusen und Menschen analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass p66 bei H₂O₂/UV-Stimulierung deutlich auf Serin phosphoryliert wird. Außerdem haben die Erfinder Ser 36 als wichtigste Serinphosphorylierungsstelle identifiziert. Eine Ser-Ala-p66-Mutante wird durch UV/H₂O₂ in vivo nicht phosphoryliert.
5) Erk1 und p38 vermitteln eine UV/H₂O₂-Phosphorylierung von p66
Unter Verwendung von gereinigten Enzymen in In-vitro-Kinasetests und entweder dominanten negativen Kinasen oder spezifischen Inhibitoren in vivo haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung gezeigt, dass p66 bei UV- oder H₂O₂-Stimulierung durch p38 und Erk1 phosphoryliert wird.
Erk1 (auch als MAPK bekannt), JNK und p38 sind stressinduzierte Kinasen. Um die für die durch oxidative Belastung in vivo induzierte Phosphorylierung von p66 verantwortliche(n) Kinase(n) zu identifizieren, analysierten die Erfinder das Ausmaß der p66-Phosphorylierung nach dem Auftreten von Stresssignalen in MEFs, die eine dominante negative JNK-Kinase exprimieren, oder in Zellen, die mit verschiedenen MAPK- und p38-spezifischen Inhibitoren behandelt worden waren [PD98059, das die Aktivierung von Erk1 durch Raf verhindert; SB203580, das die p38-Map-Kinasen spezifisch hemmt]. Die Ergebnisse zeigten, dass SB203580 und PD98059, nicht jedoch die dominante negative JNK-Kinase, p66-Phosphorylierung durch oxidative Belastungssignale (H₂O₂) verhindern, was darauf hinweist, dass p66 in vivo durch Erk1 und p38 phosphoryliert wird, nicht jedoch durch JNK.
Die Erfinder rekonstruierten dann die p66-Phosphorylierung in vitro, wobei sie rekombinantes Erk1 oder JNK und die bakteriell exprimierte p66-CH2-Region verwendeten (CH2 wurde als GST-Fusionsprotein in Bakterien exprimiert). Erk1, nicht jedoch JNK, war in vitro nicht in der Lage, die p66-CH2-Region zu phosphorylieren. Die Phosphorylierung war spezifisch, wie durch die Tatsache belegt wurde, dass Erk1 im gleichen Test die p66-CH2-Region nicht phosphorylieren konnte, als die S36A-Mutation eingebracht wurde.
6) p66 moduliert die Antwort auf oxidative Belastung in vitro
Eine H₂O₂-Behandlung führt zu Fibroblasten-Zelltod. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben gezeigt, dass i) eine Überexpression von p66 in MEFs der Wildform durch H₂O₂ induzierten Zelltod steigert; ii) p66-(–/–)-MEFs in vivo resistenter gegenüber H₂O₂-induziertem Zelltod sind als Wildtyp-Kontrollen. Paraquat ist ein Pestizid, dass Mäuse durch die Induktion von oxidativen Schäden tötet. Die Erfinder haben außerdem gezeigt, dass p66-(–/–)-Mäuse resistenter gegenüber eine Paraquat-Behandlung sind als andere Mäuse vom gleichen Wurf.
7) p66 reguliert die p16-, p53- und p21-Reaktion
Da Umweltbelastung die p16-p53-p21-Signalwege aktiviert, haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung außerdem untersucht, ob p66 die p15-p53-p21-Aktivierung durch H₂O₂ stört. Die Ergebnisse zeigten, dass p16-, p53- und P21-Aktivierung in p66-(–/–)-Zellen durch eine H₂O₂-Behandlung verloren geht.
8) p66 ist ein Tumorsuppressor
In vitro lässt die stimulatorische Wirkung von p66 auf den p53-p21-Weg vermuten, dass es auch bei der zellulären Reaktion auf onkogene Stimuli eine Rolle spielt. Daher haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung die Wirkungen von p66 auf die Reaktion von primären Fibroblasten auf die onkogene RASV12-Mutante beurteilt. RASV12 führt als Konsequenz der p53-p21-Aktivierung zur Alterung von MEFs der Wildform. Die Expression von RASV12 in p66-(–/–)-MEFs löste eine zelluläre Transformation aus. Außerdem zeigten die Erfinder, dass p53 und p16 unfähig sind, eine Alterung von p66-(–/–)-Fibroblasten von Mäusen auszulösen.
9) p66 führt zu Alterung
Die hierin dargelegten Ergebnisse zeigen, dass p66 an der zellulären Reaktion auf Belastungen (umweltbezogene und onkogene) beteiligt ist. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung überlegten deshalb, ob p66 auch an der Vermittlung von Alterung beteiligt ist. Dazu beurteilten sie die Überlebensrate von p66-(–/–)-Mäusen. Von den zahlreichen Mäusen, die im August 1996 geboren wurden, wurden 14+/+, 8+/– und 15-/- nicht getötet, sondern für Überlebensanalysen verwendet. Eine Beurteilung nach 28 Monaten (Dezember 1998) ergab:
+/+ 0/14 überlebten 0%
+/– 3/8 überlebten 37%
–/– 11/15 überlebten 73%.
10) p66-(–/–)-MEFs sind resistent gegenüber p53-induzierter Apoptose
Um die molekularen Mechanismen zu analysieren, die der erhöhten Resistenz von p66-(–/–)-MEFs gegen durch oxidative Belastung induzierte Apoptose zugrunde liegen, analysierten die Erfinder der vorliegenden Erfindung die Funktion von p53 in p66-(–/–)-MEFs (im Vergleich zu Wildtyp-MEFs) nach einer H₂O₂-Behandlung.
p53 ist ein Tumorsuppressorgen, das als Transkriptionsfaktor fungiert. p53 ist auch eine entscheidende Komponente von zellulären Mechanismen, die auf eine Reihe von unterschiedlichen Umweltbelastungen, einschließlich DNA-Schädigung, Hypoxie oder oxidative Belastung, reagieren und zu Zellzyklusstillstand oder Apoptose führen. Stressinduzierte p53-Aktivierung umfasst erhöhte Proteinstabilität und posttranslationale Modifikationen, einschließlich Phosphorylierung und Acetylierung.
Eine H₂O₂-Behandlung führte zu einer Hochregulierung von p53 in Wildtyp- sowie p66-(–/–)-MEFs, wobei die der bei oxidativer Belastung erhöhten p53-Stabilität zugrunde liegenden Mechanismen nicht durch die p66-Expression beeinträchtigt wurden. Eine Überexpression von p53 (unter Verwendung von Retroviren oder Adenoviren) in p66-(–/–)-MEFs konnte jedoch keine Apoptose auslösen, was darauf hinweist, dass der stromab führende p53-Weg in Abwesenheit von p66 verändert wird.
Um die Mechanismen zu verstehen, die dem Verlust der p53-Aktivität in p66-(–/–)-Zellen zugrunde liegt, maßen die Erfinder das Potenzial von p53, in p66-(–/–)-Zellen als Transkriptionsfaktor zu agieren. Zu diesem Zweck führten sie Transaktivierungsversuche unter Verwendung von p53 und einem p53-Target-Promotor in p66-(–/–)- und Wildtyp-MEFs durch. Die Ergebnisse zeigten, dass die Transkriptionsaktivität von p53 in p66-(–/–)-MEFs beibehalten wird. Diese Entdeckung lässt vermuten, dass die Unfähigkeit von p53, den apoptotischen Prozess in p66-(–/–)-MEFs durchzuführen, auf Veränderungen der Aktivität von (manchen) p53-Target-Genen zurückzuführen sein könnte.
Über die p53-Target-Gene, die an der Durchführung vieler der biologischen p53-Aktivitäten beteiligt sind (Apoptose, Alterung, Zellzyklusstillstand), ist wenig bekannt. Im Falle der Apoptose wurde vor kurzem gezeigt, dass p53 eine Reihe von Genen aktiviert (so genannte PIGs; p53-induzierbare Gene), die an der Regelung des ROS-Stoffwechsels beteiligt sind. Tatsächlich führt eine p53-Aktivierung zu einer transkriptionellen Aktivierung dieser Gene, zu erhöhten intrazellulären Konzentrationen von ROS, zu Caspase-Aktivierung und zu Apoptose.
Um zu testen, ob dieser intrazelluläre Weg in p66-(–/–)-MEFs geändert wird, haben die Erfinder die intrazelluläre Konzentration von ROS in p66-(–/–)- und Wildtyp-MEFs nach einer p53-Überexpression (mithilfe von fluoreszierenden Farbstoffen, wie z.B. DCFDA) gemessen. Die Ergebnisse zeigten, dass der p53-induzierte Peak von intrazellulärem ROS nach einer p53-Expression in p66-(–/–)-MEFs verloren geht.
Zusammengenommen weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass p66 den ROS-Stoffwechsel reguliert und ein wesentlicher Effektor von p53-vermittelter Apoptose ist.
11) p66-(–/–)-MEFs sind resistent gegen Ras-induzierte replikative Alterung
p53 reguliert eine Checkpoint-Reaktion auf onkogene Signale: die Expression von onkogenen Mutanten von Ras in primären Zellen aktiviert p53, was zu frühzeitiger alterung führt, während die Abwesenheit von funktionalem p53 für eine onkogene Transformation von Mäusefibroblasten ausreicht. p53 mutiert tatsächlich in vielen Tumorarten mit großer Häufigkeit, was vermuten lässt, dass seine Wirkung für die Tumorentwicklung entscheidend ist. Über die Mechanismen, durch welche die Zellen Hyperproliferation erkennen und die zu p53-Aktivierung und Zellalterung führen, ist jedoch wenig bekannt. Vor kurzem wurde gezeigt, dass Ras-induzierte Alterung die Bildung von ROS umfasst, was darauf hinweist, dass ROS ebenfalls an der Ausführung des Alterungsprogramms durch p53 involviert sind.
Deshalb haben die Erfinder analysiert, ob Ras fähig ist, Zellalterung in p66-(–/–)-MEFs zu induzieren. Die Ergebnisse zeigten, dass p66-(–/–)-MEFs resistent gegenüber Ras-induzierter Alterung sind, was darauf hinweist, dass die intrazellulären Mechanismen, welche die Reaktion auf onkogene Signale regeln, in p66-(–/–)-Zellen geändert werden.
Um zu untersuchen, ob p66-(–/–)-MEFs anfälliger für Tumorbildung sind, analysierten die Erfinder der vorliegenden Erfindung die Fähigkeit von Ras-exprimierenden p66-(–/–)-MEFs, Kolonien in Methylcellulose zu bilden (eine Eigenschaft von transformierten Zellen), und vergleichen sie mit p53-(–/–)-MEFs. Während eine Ras-Expression eine Transformation von p53-(–/–)-MEFs auslöste, war es unfähig, dasselbe in p66-(–/–)-MEFs zu tun. Auch p66-(–/–)-Mäuse wiesen keine größere Häufigkeit von spontanen oder UV-(oder TPA-)induzierten Tumoren auf.
Die Erfinder kamen deshalb zu dem Schluss, dass die p66-Expression unerlässlich für die Fähigkeit von p53 ist, Apoptose (nach oxidativer Belastung) oder Alterung (nach Ras-Expression) auszulösen. Der Verlust von p66 ahmt in Bezug auf den zu Tumoren neigenden Phänotyp jedoch nicht den Verlust von p53 nach, was darauf hinweist, dass nach onkogenen Signalen andere Wege durch p53 aktiviert werden.
Mögliche Anwendungen
p66 ist ein stromab gelegenes Target von p53 bei der Ausführung von p53-vermittelter Apoptose und Zellalterung. Manipulationen von p66 können deshalb dazu genutzt werden, die p53-Funktion in p53-Nullzellen wiederherzustellen. Eine mög liche Anwendung dieser Erkenntnis ist die Möglichkeit, die Apoptose- oder Alterungswege in Tumoren mit nichtfunktionalem p53 zu aktivieren (die p19-p53-Wege sind in den meisten Tumoren nichtfunktional). Agonisten von p66 könnten als mögliche Tumorsuppressoren dienen. Alle Moleküle, die eine p66-Dephosphorylierung verhindern, oder Kinasen, die p66-Phosphorylierung auslösen, sind mögliche Tumorbehandlungsmittel.
12) Die intrazelluläre Konzentration von ROS (reaktive Sauerstoffspezies) in p66-(–/–)-MEFs wird verringert
Die oben genannten Ergebnisse lassen vermuten, dass p66 an der Regulierung des ROS-Stoffwechsels beteiligt ist. Deshalb haben die Erfinder die intrazellulären Konzentrationen von ROS in Kulturen von Wildtyp- und p66-(–/–)-MEFs gemessen (mithilfe von fluoreszierenden Farbstoffen, wie z.B. DCFDA). Die Ergebnisse zeigten, dass die intrazelluläre Konzentration von ROS in p66-(–/–)-MEFs deutlich geringer ist (um etwa ein Drittel).
Mögliche Folgerungen
Wie nachgewiesen wurde ist oxidative Belastung an der Entstehung zahlreicher menschlicher Krankheiten beteiligt. ROS führen zu einer Schädigung verschiedener Makromoleküle, wie z.B. von Proteinen (Bildung von Disulfidbindungen); Lipiden (Peroxidation); DNA (Mutationen). Diese Veränderungen vermitteln wahrscheinlich die phänotypischen Merkmale der Alterung und führen wahrscheinlich zur Pathogenese verschiedener Krankheiten (Arteriosklerose; ischämische Herzkrankheiten; Parkinson, Alzheimer, Gefäßkomplikationen in Zusammenhang mit Diabetes). Inhibitoren der p66-Funktion könnten bei der Behandlung dieser Krankheiten eingesetzt werden.
13) p66 ist ein Mitochondrienprotein
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben die Mechanismen untersucht, die der Regulierung der ROS-Produktion durch p66 zugrunde liegen. ROS werden hauptsächlich von Mitochondrien gebildet, und zwar als Folge der minimalen, und doch physiologischen, Entkopplung des Elektronentransfers während der oxidativen Phosphorylierung. Deshalb beurteilten die Erfinder zuerst, ob p66 ein Mitochondrienprotein ist. Elektor-Mikroskop-, Immunfluoreszenz- und Zellfraktionierungsstudien (unter Verwendung von anti-p66-spezifischen polyklonalen und monoklonalen Antikörpern) zeigten, dass p66 ein Mitochondrienprotein ist, das sich in der inneren Membran der Mitochondrien befindet.
14) Die Abnahme des mitochondrialen Δψ(mΔψ) nach einer N₂O₂-Behandlung ist in p66-(–/–)-MEFs verlangsamt
Um zu bewerten, ob die unterschiedliche Überlebensreaktion von p66-(–/–)-MEFs auf eine N₂O₂-Behandlung auch eine unterschiedliche mitochondriale Reaktion widerspiegelt, testeten die Erfinder die Funktionalität der Mitochondrien in den p66-(–/–)- und Wildtyp-MEFs nach einer Behandlung mit H₂O₂.
Das mitochondriale elektrische Potenzial (mΔψ) ist ein direktes Maß für den elektrochemischen Gradienten, der durch die Aktivität der Elektronentransferkettenkomplexe und dem resultierenden Protonenpumpen entwickelt wird. mΔψ wurde deshalb mithilfe von Tetramethylrhodaminmethylester (TMRM) als Indikator für die Mitochondrienaktivität nach einer H₂O₂-Behandlung gemessen. TMRM ist eine lipophile kationische fluoreszierende Sonde, die gemäß der Nerst-Gleichung in den Mitochondrien akkumuliert wird. Je höher der Wert für mΔψ, desto intensiver ist das aus der Fluoreszenz von TMRM resultierende Signal, wodurch die Bestimmung von mΔψ-Variationen in Zellkultursystemen möglich ist.
Die Erfinder fanden heraus, dass die Reduktion von mΔψ 10 Minuten nach dem Zusatz von 400 μM H₂O₂ etwa 50% der Wildtyp-MEFs und nur 20% der p66-(–/–)-MEFs betraf. Dieses Ergebnis zeigt, dass Mitochondrien in p66–/– durch H₂O₂ weniger geschädigt werden als Wildtyp-Zellen.
15) Aus p66-(–/–)-Mäuseleber isolierte Mitochondrien werden nach einer Stimulierung mit verschiedenen Substraten gekuppelt
Um zu bestimmen, ob mitochondriale Atmungsleistungen durch die Abwesenheit des p66-Proteins verändert werden, wurden gereinigte Mitochondrien von Wildtyp- und p66-(–/–)-Mäuselebern auf ihre Atmungsaktivität analysiert. Eine In-vitro-Quantifizierung des Sauerstoffverbrauchs durch die mitochondrialen Suspensionen wurde mithilfe einer sauerstoffempfindlichen Elektrode durchgeführt. Die Erfinder maßen sowohl die basale als auch die stimulierte Atmung nach der Verabreichung von ADP, Succinat, Aspartat, Malat, Dinitrophenol und berechneten das Zustand-3/Zustand-4-Verhältnis von Wildtyp- und p66-(–/–)-Mitochondrien. Die Erfinder erhielten für die p66-(–/–)-Mitochondrien durchwegs höhere Werte für dieses Verhältnis als für die Wildtyp-Mitochondrien. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass Mitochondrien, die aus p66-(–/–)-Lebern extrahiert wurden, sich in einem besser "gekuppelten Zustand" befinden.
16) Schwellung als Maß für den durch H₂O₂ induzierten Permeabilitätsübergang ist in isolierten p66-(–/–)-Mäuselebermitochondrien geringer als in Wildtyp-Mäuselebermitochondrien
Säugetiermitochondrien besitzen einen inneren Membrankanal, die Permeabilitätsübergangspore (MTP). Eine Öffnung der MTP ist verantwortlich für den Permeabilitätsübergang (PT), eine plötzliche Zunahme der Permeabilität für gelöste Stoffe mit Molekülmassen von etwa 1.500 Da (experimentell nach einer Ca²⁺-Akkumulation in Gegenwart verschiedener so genannter "Induktionsmittel" erhalten). Der PT ist der wichtigste Vorgang bei der Apoptose, und zusammen mit der mitochondrialen Depo larisierung stellt er den "obersten Exekutor" der apoptotischen Kaskade dar. PT führt zu einer Modifikation des Mitochondrienvolumens und folglich zu einer Schwellung der Organelle.
Es ist möglich, die relative MTP-Öffnungswahrscheinlichkeit und den resultierenden PT durch Messung der Absorptionsvariation der Schwellung mithilfe eines Spektralphotometers bei einer Wellenlänge von 540 mm zu bestimmen. Die Erfinder analysierten die "Schwellreaktion" von isolierten Lebermitochondrien von Wildtyp- und p66-(–/–)-Mäusen nach unterschiedlichen PT-Stimuli. Eine Beeinträchtigung/Verzögerung der Schwellung wurde in den p66-(–/–)-Mitochondrien nach einer Behandlung mit 100 μM H₂O₂ beobachtet. Diese Erkenntnis weist darauf hin, dass die MTP in den p66-(–/–)-Mitochondrien und ihre durch H₂O₂ induzierte Öffnung weniger empfindlich gegenüber einer Oxidation sind, was vermuten lässt, dass die Regulierung der Öffnung der MTP einer der Vorgänge ist, die in den Mitochondrien durch p66 kontrolliert werden. p66 würde somit die Öffnung der Pore unterstützen, wodurch fragilere und ungekuppelte Mitochondrien bestimmt werden können. Das würde zu einer weniger effizienten Atmungsleistung, aktiverer ROS-Produktion und besserer apoptotischer Reaktion auf oxidative Belastung führen.
Mögliche Folgerungen
Da p66 die Funktion der Permeabilitätspore in Mitochondrien und indirekt die Effizienz des Elektronentransfers und der ROS-Produktion kontrolliert, ermöglichen Veränderungen der p66-Funktion wahrscheinlich eine Manipulation des Stoffwechsels und der Apoptose.
17) Die Dichte an alten Lungenzellen ist in den p66–/– höher
Alle Ebenen der Organisation eines Organismus, vom Molekül bis zu gesamten Organsystemen, durchlaufen eine Alterung, und zahlreiche Beweise belegen, dass Radikale die Hauptursache für dieses Phänomen sind. Die resultierende, durch oxidati ve Belastung induzierte Alterung ist ein Prozess, der eng mit einer Abnahme von funktionellen Kapazitäten in allen Teilen des Körpers zusammenhängt, und auch wenn dadurch die Ursachen des Todes, der nach Ende der Lebensdauer eines Organismus eintritt, nicht eindeutig erklärt sind, so werden diese doch im Allgemeinen auf dieses degenerative Alterungssyndrom zurückgeführt.
Einige Untersuchungen haben gezeigt, dass bei Menschen mehr als bei anderen Säugetieren Nieren- und Herzversagen die häufigsten Todesursachen in sehr hohem Alter sind, aber auch auf die Alterung zurückzuführende Fehlfunktionen anderer Organe tragen deutlich zum Tod bei.
Vor allem in der Lunge nimmt das Verhältnis zwischen Volumen und Gewicht von aufgeblähten trockenen Lungenparenchymen mit dem Alter deutlich zu, was zu so genannten "Altersemphysemen" in der Lunge oder "senilen Lungenemphysemen" führt. Die oxidative Belastung, die während der Alterung akkumuliert wird, führt zu programmiertem Zelltod, was zu einer bei der Alterung beobachtbaren Verdünnung des Septum alveolare beiträgt. Die Untersuchung von älteren (älter als 1 Jahr) p66-(–/–)- und Wildtyp-Mäuselungen zeigte, dass das Gewicht und die Größe von p66-(–/–)-Lungen größer sind als die vom Wildtyp. Histologische Analysen dieser Lungen zeigen ein allgemeines Muster höherer Zelldichte, und vor allem sind in der p66-(–/–)-Lunge dickere Alveolarwände vorhanden.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung kamen deshalb zu dem Schluss, dass eine verzögerte Verdünnung der Alveolarwände und ein daraus folgendes frühes Auftreten von Anzeichen für senile Emphyseme in Wildtyp-Mäusen eine mögliche mechanistische Erklärung für die längere Lebensdauer bei Abwesenheit von p66 sein könnten, die auch auf andere Organe angewandt werden kann.
Mögliche Folgerungen
Ungeachtet der Auswirkungen der Verzögerung von senilen Emphysemen auf die längere Lebensdauer von p66-(–/–)-Mäusen weisen diese Erkenntnisse darauf hin, dass die Lunge ein Zielorgan für p66-Funktionen ist. Die Hemmung der p66-Funktion in der Lunge kann deshalb zu erhöhter Funktionalität der Lunge führen und neue Behandlungen für Emphyseme bereitstellen.
Diskussion
Um ihre Rolle in der Reaktion auf zelluläre Belastung zu untersuchen, analysierten die Erfinder der vorliegenden Erfindung das Ausmaß der p66^shc-Tyorsinphosphorylierung in mit UV oder H₂O₂ behandelten Mäuseembryofibroblasten (MEFs) und vergleichen sie mit der Wirkung der Behandlung mit Wachstumsfaktoren, wie z.B. dem Epidermis-Wachstumsfaktor (EGF). Anti-p66-Immunpräzipitate von Lysaten aus unbehandelten sowie EGF-, UV- oder H₂O₂-stimulierten Fibroblasten wurden mit Anti-Phosphotyrosin-Antikörpern immungeblottet. Die EGF-Stimulierung führte zu einer deutlichen Zunahme des Phoyphotyrosingehalts von p66^shc, der nach 5 min maximal war. Weder die UV- noch die H₂O₂-Behandlung führten zu einer nennenswerten Tyrosinphosphorylierung von p66^shc (1B). Western-Blotting der gleichen Lysate mit Anti-Shc-Antikörpern zeigte jedoch eine deutliche Gelretardation der p66^shc-Polypeptide nach 5 min und 4 h Behandlung mit UV oder H₂O₂, was mit anderen posttranslationalen Modifikationen von p66^shc übereinstimmt, die durch diese Stoffe ausgelöst werden (1C). Deshalb wurde die p66^shc-Phosphorylierung einer Phosphoaminosäureanalyse unterzogen (2C). p66^shc-Polypeptide aus serumabgereicherten Zellen wurden primär auf Serin phosporyliert. UV (2C) und H₂O₂ (nicht dargestellt) führten zu einer deutlichen Zunahme des Phosphoseringehalts und wirkten sich nicht auf das Phosphotyrosin aus. Im Gegensatz dazu führte EGF zu einer deutlichen Abnahme des Phosphotyrosingehalts und zu einer leichten Zunahme an Phosphoserin (2C). Es schein, dass p66^shc an den intrazellulären Transduktionswegen von sowohl Umweltbelastungen als auch Wachstumsfaktoren beteiligt ist, obwohl es hier unterschiedliche Funktionen hat, da UV und H₂O₂ eine rasche und andauernde Serinphosphorylierung auslösten, während EGF eine rasche und vorübergehende Tyrosinphosphorylierung auslöste.
Um die funktionale Rolle von p66^shc bei der Reaktion auf oxidative Belastung zu untersuchen, analysierten die Erfinder als Nächstes die Wirkungen einer p66^shc-Überexpression oder p66^shc-Ablation auf die zelluläre Reaktion von MEFs auf H₂O₂. MEFs wurden aus Mäusen entnommen, die eine gewünschte Mutation des Shc-Locus aufweisen, welche das für die p66-CH2-Region kodierende Exon unterbricht, ohne sich auf die p52^shc/p46^shc-Kodiersequenzen auszuwirken (G. Giogio et al., zur Veröffentlichung eingereicht). p66^shc-(+/+)-MEFs von Wildtyp-Mäusen mit sonst identischem genetischem Hintergrund wurden zum Vergleich verwendet. Wie erwartet war die Expression von p66^shc in p66^shc-(+/+)-MEFs normal, während sie in p66^shc-(–/–)-MEFs nicht detektierbar war; die Expression von p52^shc/p46^shc war in p66^shc-(+/+)- und p66^shc-(–/–)-MEFs ident. p66^shc-(+/+)-MEFs waren empfindlich gegenüber einer H₂O₂-Behandlung, wobei mehr als 70% der Zellen nach 24 Stunden Behandlung mit 400 μM H₂O₂ tot waren. Eine Überexpression von p66^shc machte p66^shc+/+ noch anfälliger gegenüber einer H₂O₂-Behandlung (etwa 85–90% Zelltod nach 24 Stunden). Im Gegensatz dazu waren p66^shc-(–/–)-MEF-Zellen resistenter gegenüber einer Tötung durch die gleiche Dosis H₂O₂, wobei mehr als 70% dieser Zellen nach 24 Stunden H₂O₂-Behandlung noch lebten (2B). Die Expression von p66^shc-cDNA in p66^shc-(–/–)-Zellen stellt wieder eine normale Reaktion auf H₂O₂ her (2B).
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung untersuchten dann die Fähigkeit von p66^shc-(–/–)-Mäusen, oxidativer Belastung in vivo standzuhalten. Zu diesem Zweck wurden Mäuse mit Paraquat behandelt, das nach Aufnahme durch die Zellen ein Superoxidanion bildet. Bei einer Dosis von 70 mg/kg starben 5 von 5 p66^shc-(+/+)-Mäusen innerhalb von 48 Stunden nach der Paraquat-Verabreichung. Im Gegensatz dazu starben von 5 behandelten p66^shc-(–/–)-Mäusen zwei innerhalb der ersten 48 Stunden, weitere zwei nach etwa 72 Stunden, und eine überlebte mehrere Wochen (2C). Zusammengenommen weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass p66^shc eine Funktion in der zellulären Antwort auf oxidative Belastung innehat.
Um zu untersuchen, ob p66^shc an der zellulären Reaktion auf Belastung als zytoplasmatischer Umwandler von Stresssignalen beteiligt ist, analysierten die Erfinder das Potenzial einer serinphosphorylierungsdefekten Mutante von p66^shc, die gehinderte Reaktion von p66^shc-(–/–)-MEFs auf oxidative Belastung zu retten. Die p66^shc-CH2-Region enthält wahrscheinlich die wichtigste Serinphosphorylierungsstelle(n), was sich durch die durch H₂O₂ und EGF induzierte Gelmobilitätsverschiebung zeigte, als das CH2 in kultivierten Zellen als isolierte Domäne exprimiert wurde (3A). Die CH2-Region enthält drei Serinreste mit einer Consensus-Sequenz zur Serin/Threonin-Kinasephosphorylierung (S28, S36 und S54) (J. J. Davis, Biol. Chem. 268, 14553–14556 (1993)). Eine Alaninsubstitution von S36 hob die durch H₂O₂ induzierte Gelmobilitätsverschiebung von sowohl dem isolierten CH2 als auch von p66^shc voller Länge auf (3B). Eine Phosphoaminosäureanalyse der p66^shc- und p66^shcS36A-Polypeptide zeigte einen deutlichen Anstieg des Phosphoseringehalts, der durch H₂O₂ induziert wurde, im p66^shc auf, nicht jedoch in der p66^shcS36A-Mutante (3C), was bestätigt, dass S36 die wichtigste p66^shc-Serinphosphorylierungsstelle ist.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung exprimierten dann die p66^shcS36A-Mutanten in p66^shc-(–/–)-MEFs und beurteilten ihre Wirkung auf die Antwort auf oxidative Belastung. Wie in 2B zu sehen ist, war p66^shcS36A nicht fähig, eine normale Reaktion auf H₂O₂ wiederherzustellen. Stattdessen löste es weitere Resistenz gegen H₂O₂-induzierten Zelltod aus, wahrscheinlich durch eine dominante negative Wirkung auf den Stressreaktionssignalweg. Zusammengenommen weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass p66^shc als Signalumwandler in der zellulären Reaktion auf oxidative Belastung agiert.
Eine erhöhte Resistenz gegen Umweltbelastungen hängt in Wirbellosen mit einer längeren Lebensdauer zusammen. In S. cerevisiae erhöhen Deletionen von RAS1 (J. Sun et al., J. Biol. Chem. 269, 18638–18645 (1994); S. P. Kale et al., Dev. Genet. 18, 154–160 (1996)) oder Mutationen im SIR4-Locus (B. K. Kennedy et al., Cell 80, 485–496 (1995)) die Lebensdauer und die Resistenz gegen Hunger, Ethanol und Hitzeschock bzw. UV. In C. elegans führen Mutationen von Genen des Dauer-Signalwegs, wie z.B. age-1 und daf-2, zu längerer Lebensdauer und zu höherer Re sistenz gegen Sauerstoffradikale, Hitze und UV (S. Murakami et al., Genetics 143, 1207–1218 (1995); P. L. Larsen et al., Genetics 139, 1576–1583 (1995)). In D. melanogaster hängt gute Fitness in höherem Alter mit höherer Resistenz gegen Umweltbelastungen zusammen (P. M. Service et al., Physiol. Zool. 58, 380–389 (1985); P. M. Service, Physiol. Zool. 60, 321–326 (1987); R. Arking et al., Dev. Genet. 12, 362–370 (1991)), und hypomorphe Mutanten des mth-Locus leben 35% länger und sind resistenter gegen diätetisches Paraquat und Hunger (Y. J. Lin et al., Science 282 (1998)). Die Erfinder der vorliegenden Erfindung analysierten deshalb retrospektiv die Wirkungen der p66^shc-Mutation auf die Lebensdauer. 37 Mäuse, die im August 1996 geboren wurden und p66^shc-(+/–)-heterozygote Eltern hatten, wurden nicht getötet und unter identischen stabilen Bedingungen gehalten. Dazu gehörten 14 p66^shc-(+/+)-, 8 p66^shc-(+/–)- und 15 p66^shc-(–/–)-Mäuse. Nach 28 Monaten Beobachtung waren alle Wildtyp-Tiere gestorben (mittlere Lebensdauer von 25,37 ± 0,63 Monaten), während 3 der 8 heterozygoten (37%) und 11 der 15 homozygoten (73%) Tiere noch lebten. Die restlichen 3 p66^shc-(+/–)-Tiere starben nach weiteren zwei Monaten (mittlere Lebensdauer von 27,40 ± 2,819). 3 p66^shc-(–/–)-Mäuse starben ebenfalls nach weiteren zwei Monaten; die restlichen 9 leben noch (Lebensdauer über 31 Monate). Ein Vergleich der Überlebenskurven, die nach dem Verfahren gemäß Kaplan und Meier (E. Marubinii et al., M. G. Valsecchi, John Wiley & Sons, New York (1995)) erhalten wurden (4), zeigte signifikante Unterschiede zwischen den drei Gruppen (Log-Rank-Test, p = 0,0002). Das kumulative Überleben wies keinen nennenswerten Unterschied zwischen Wildtyp-Tieren und heterozygoten Tieren auf (p = ns [0,057]. Das kumulative Überleben in der p66^shc-(+/+)-Gruppe betrug 71,4% (p < 0,01 in Vergleich zu p66^shc+/– und p66^shc+/+). Deshalb scheint es, dass homozygote Mutationen von p66^shc mit längerer Lebensdauer in Mäusen zusammenhängen.
Die hierin dargelegten Ergebnisse stimmen mit einem Modell überein, in dem die Lebensdauer als Ergebnis der erhöhten Fähigkeit bestimmt ist, Umweltschäden zu widerstehen oder diese zu reparieren. p66^shc ist Tel eines Signaltransduktionswegs, der durch Umweltbelastungen (H₂O₂ oder UV) aktiviert wird und dessen Mutation Stressresistenz und die Lebensdauer erhöht. Biochemische und genetische Unter suchungen des p66^shc-Signalwegs sollten zu einem besseren Verständnis der Mechanismen führen, die für die Alterung von Säugetieren relevant sind.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Nucleinsäuremolekül, umfassend eine p66^shc-Kodiersequenz, wobei die Kodiersequenz aus der Kodiersequenz aus 5 besteht, die eine Mutation umfasst, sodass in dem durch die Kodiersequenz kodierten Protein der Rest S36 nicht vorhanden oder durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt ist.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, worin S36 durch Alanin ersetzt ist (p66^shcS36A).
Polypeptid, für das ein Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 kodiert.
Replizierbarer Vektor, der Nucleinsäure nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, operabel an Kontrollsequenzen zur Steuerung seiner Expression gebunden, umfasst.
Wirtszelle, die mit einem Vektor nach Anspruch 4 transformiert ist.
Verfahren zur Herstellung eines modifizierten p66^shc-Polypeptids, umfassend das Kultivieren einer Wirtszelle nach Anspruch 5, sodass die p66^shc-Kodiersequenz produziert wird.
Verfahren zur Herstellung eines modifizierten Nucleinsäuremoleküls, das eine p66^shc-Kodiersequenz umfasst, wobei das Verfahren das Modifizieren der Kodiersequenz aus 5 umfasst, sodass in dem durch die Kodiersequenz kodierten Protein der Rest S36 des durch die Sequenz aus 5 kodierten Proteins nicht vorhanden oder durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt ist.
Verfahren zur Herstellung eines modifizierten p66^shc-Polypeptids, umfassend das Modifizieren einer Nucleinsäuresequenz wie in Anspruch 7 beschrieben und das Exprimieren der modifizierten Nucleinsäure in einer Wirtszelle.
In-vitro-Verfahren zum Unterbrechen des p66^shc-Signaltransduktionsweges in einer Zelle, umfassend das Kontaktieren der Zelle mit einem Nucleinsäuremolekül, das in der Lage ist, an für p66^shc kodierende Nucleinsäure zu hybridisieren, wodurch die p66^shc-Expression verhindert wird.
In-vitro-Verfahren zur Steigerung der Resistenz in Zellen gegen oxidative Belastung, umfassend den Schritt des Unterbrechens des p66^shc-Signalisierungsweges.
In-vitro-Verfahren nach Anspruch 10, worin der Schritt des Unterbrechens des p66^shc die Empfindlichkeit von p66^shc gegenüber Phosphorylierung beeinflusst.
In-vitro-Verfahren nach Anspruch 10 oder Anspruch 11, worin der Schritt des Unterbrechens des p66^shc-Weges die Expression eines derartig mutierten p66^shc-Polypeptids verursacht, dass der Serinrest S36 des durch die Sequenz aus 5 kodierten Proteins nicht vorhanden oder durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt ist.
In-vitro-Verfahren nach Anspruch 12, worin der S36 entsprechende Rest durch Alanin ersetzt ist.
In-vitro-Verfahren zur Steigerung der Resistenz von Zellen gegen oxidative Belastung, umfassend den Schritt des Unterbrechens des p66^shc-Signalisierungsweges durch Kontaktieren der Zelle mit einem Antikörper, der in der Lage ist, sich spezifisch an das p66^shc-Polypeptid zu binden, sodass eine spätere Bindung von p66^shc an andere Proteine verhindert wird.
In-vitro-Verfahren zur Steigerung der Resistenz von Zellen gegen oxidative Belastung, umfassend den Schritt des Unterbrechens des p66^shc-Signalisierungsweges durch Kontaktieren der Zelle mit einem Antisense-Oligonucleotid, das in der Lage ist, an die für das p66^shc-Polypeptid kodierende Nucleinsäure zu hybridisieren.
Verwendung eines Antisense-Oligonucleotids, das in der Lage ist, spezifisch an p66^shc-Nucleinsäure zu hybridisieren, zur Herstellung eines Medikaments zur Steigerung der Resistenz von Zellen gegen oxidative Belastung.
Verwendung nach Anspruch 16, worin die p66^shc-Nucleinsäuresequenz in 5 dargestellt ist.
Verwendung eines Antikörpers, der in der Lage ist, sich spezifisch an ein p66^shc-Polypeptid zu binden, oder eines Fragments davon zur Herstellung eines Medikaments zur Steigerung der Resistenz von Zellen gegen oxidative Belastung.
Verwendung eines Vektors, der für p66^shc-Polypeptid kodierende Nucleinsäure umfasst, zur Herstellung eines Medikaments zur Steigerung der Resistenz gegen Tumorbildung in einem Gewebe, wobei der Vektor in der Lage ist, die obige Nucleinsäure in das Genom der Zellen des Gewebes einzubinden.