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TECHNISCHES GEBIET:
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Die
vorliegende Erfindung betrifft pharmazeutisch nützliche Indolin-2-on-Derivate
oder deren Salze, sowie Knorpelbildungsförderer, Knorpelreparaturmittel
und Knorpeldiagnostika, die die Indolin-2-on-Derivate oder deren
pharmazeutisch annehmbare Salze enthalten.
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STAND DER TECHNIK:
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Körperknorpel
besteht im allgemeinen aus Chondrozyten und Fibrozyten, die spezialisierte
Bindegewebezellen darstellen, in einer amorphen gelartigen Matrix,
in die sie eingebettet sind, und stellt einen Teil des Trägergewebes
des Körpers
dar.
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In
Warmblütern,
einschliesslich Menschen, bildet Knorpel das Skelett, Gelenke, die
Luftröhre,
die Ohren, die Nase und dergleichen. Das heisst, er spielt eine
zentrale Rolle in Funktionen, die für das Überleben von Warmblütern unerlässlich sind,
einschliesslich der Wirkung als Knochenmatrize während des Wachstums (Wachstumsknorpel)
und seines Beitrags zur glatten Gelenkbewegung (Gelenkknorpel),
Atmung (Luftröhrenknorpel,
Nasenknorpel) und des Hörvorgangs
(Ohrknorpel). Daher bewirkt ein Abbau oder eine Zerstörung dieser
Knorpeltypen in Abhängigkeit vom
Ort und der Schwere des Abbaus oder der Zerstörung verschiedene Grade körperlicher
Beeinträchtigung.
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Beispielsweise
wird unter den vorgenannten Funktionen, in denen Knorpel eine Rolle
spielt (Wachstum, Gelenke, Atmung, Hörvorgang usw.), die glatte
Bewegung von Gelenken durch einen Abbau oder eine Zerstörung von
Gelenkknorpel unter Bedingungen, wie beispielsweise chronischer
rheumatoider Arthritis oder Osteoarthritis, besonders beeinträchtigt.
Der Abbau oder die Zerstörung
von Gelenkknorpel wird als Hauptgrund für die Schwierigkeiten beim
Gehen angesehen, die durch diese Erkrankungen hervorgerufen werden.
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Die
Möglichkeit
der Unterdrückung
des Abbaus oder der Zerstörung
von Knorpel oder der Förderung der
Knorpelbildung wurde als mögliches
Verfahren zur Behandlung von Zuständen wie beispielsweise chronischer
rheumatoider Arthritis und Osteoarthritis angesehen (J. Rheum. 22(1),
Suppl. 43:136–139,
1995, Lab. Invest. 78 (2):133–142).
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Von
mehreren, unterschiedlichen, aus Organismen abgeleiteten Substanzen
und niedermolekularen Substanzen ist es bekannt, dass sie Wirkungen
auf die Knorpelbildungsförderung
oder die Induzierung der Chondrozytenproliferation besitzen. Substanzen,
von denen berichtet wurde, dass sie knorpelbildungsfördernde
Wirkungen aufweisen, schliessen Wachstumsfaktoren, wie beispielsweise
TGF-β (Umwandlungswachstumsfaktor β), BMP-2
(J. Bone Joint Surg. 79-A(10):1452–1463, 1997), Concanavalin
A, das einen Lectintyp darstellt (J. Biol. Chem., 265:10125–10131,
1990) und Osteogenin (BMP-7), sowie niedermolekulare Substanzen,
wie beispielsweise Vitamin D-Derivate (1α, 25-D3)
(Cancer Res., 49:5435–5442, 1989),
Vitamin A-Derivate (Retinolsäure)
(Dev. Biol., 130:767–773,
1988), Vanadate (J. Cell Biol., 104:311–319, 1987), Benzamide (J. Embryol.
Exp. Morphol., 85:163–175,
1985), Benzyl β-D-xylosid
(Biochem. J., 224:977–988,
1984), Triiodthyronine (T3) (Endocrinology,
111:462–468,
1982), Prostaglandinderivate (PGE2, U44069)
(Prostaglandin, 19:391–406,
1980), dbcAMP (J. Cell. Physiol., 100:63–76, 1979) und 8-Br-cAMP (J.
Cell. Physiol., 100:63–76, 1979),
ein.
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Unter
diesen aus Organismen abgeleiteten Substanzen und niedermolekularen
Substanzen ist TGF-β als
geeignetes Behandlungsmittel meistversprechend, und von TGF-β1,
einer Isoform von TGF-β,
wurde berichtet, dass es die Knorpelbildung fördert, wenn es intraartikulär verabreicht
wird (Lab. Invest. 71(2):279–290, 1994).
Da TGF-β1 den arthritisinduzierten Verlust von Proteoglycanen
im Gelenkknorpel unterdrückt
oder, anders ausgedrückt,
die Zerstörung
von Gelenkknorpel durch seine anabolische Wirkung auf den Gelenkknorpel bei
intraartikulärer
Verabreichung in experimentellen Tiermodellen mit induzierter Arthritis
inhibiert, wurde es ferner als ein mögliches geeignetes Behandlungsmittel
für artikuläre Erkrankungen,
wie beispielsweise Rheumatismus, vorgeschlagen (Lab. Invest. 78(2):133–142, 1998).
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Selbst
von TGF-β,
das als Behandlungsmittel meistversprechend ist, wurde jedoch berichtet,
dass es trotz seiner Knorpelbildungsförderung Synovitis hervorruft
und daher ein ernsthaftes Problem bei seiner Anwendung als Behandlungsmittel
für artikuläre Erkrankungen
besteht (Lab. Invest. 71(2):279–290,
1994), weshalb es als Behandlungsmittel für derartige Zustände nicht
klinisch angewendet wurde. Zusammenfassend gibt es daher kein praktikables
Behandlungsmittel, das auf einer Knorpelbildungsförderung
beruht.
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OFFENBARUNG DER ERFINDUNG:
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Ein
erfindungsgemässes
Ziel ist die Überwindung
der vorgenannten Nachteile des Standes der Technik durch Bereitstellung
eines Knorpelbildungsfördermittels
und Knorpelreparaturmittels, die zur Förderung der Knorpelbildung
oder Induzierung der Chondrozytenproliferation in der Lage sind.
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Ein
weiteres erfindungsgemässes
Ziel ist die Bereitstellung eines Reagenzes mit knorpelbildungsfördernder
Wirkung, das für
die biologische, physikalische oder chemische Forschung an Knorpel
nützlich
ist.
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Ein
weiteres erfindungsgemässes
Ziel ist die Bereitstellung von Indolin-2-on-Derivaten, die als
Knorpelbildungsförderer
nützlich
sind.
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Noch
ein weiters erfindungsgemässes
Ziel ist die Bereitstellung von Indolin-2-on-Derivaten, die als Knochenbruchreparaturförderer nützlich sind.
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Als
Ergebnis sorgfältiger
Forschung, die auf das Erreichen dieser Ziele gerichtet war, haben
die hiesigen Erfinder die vorliegende Erfindung durch die Entdeckung,
dass Indolin-2-on-Derivate mit einer spezifischen Struktur eine
knorpelbildungsfördernde
Wirkung zeigen, erhalten.
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Folglich
wird gemäss
einem erfindungsgemässen
Aspekt die Verwendung einer Verbindung, ausgewählt aus
- (A)
Verbindungen der Formel (I): worin
R1 Halogen,
C1-6-Alkyl, C1-6-Alkoxy,
Hydroxyl, Nitro, Trifluormethyl, C1-6-Alkylthio,
Acyl, Carboxyl, Mercapto oder Amino ist;
R2 ist
Wasserstoff oder eine gegebenenfalls substituierte C1-6-Alkyl-,
C2-6-Alkenyl-, C2-6-Alkinyl-,
C1-6-Alkoxy-, Acyl-, Aryl- oder heterocyclische
Gruppe;
R3 ist eine gegebenenfalls
substituierte C1-6-Alkyl-, C3-8-Cycloalkyl-,
Aryl- oder heterocyclische Gruppe;
R4 ist
Wasserstoff, eine gegebenenfalls substituierte C1-6-Alkyl-,
Aryl- oder heterocyclische Gruppe, -OR5, -SR5 oder -NR6R7, worin R5, R6 und R7 identisch
oder voneinander verschieden sein können und jeweils Wasserstoff,
eine gegebenenfalls substituierte C1-6-Alkyl-, C3-8-Cycloalkyl-, Aryl-, C1-6-Alkoxy-
oder heterocyclische Gruppe oder Amino darstellen, und R6 und
R7 können zusammen
eine Gruppe -(CH2)m-
oder -(CH2)1NR8(CH2)k-
bilden, worin k, l und m jeweils eine ganze Zahl von 1–8 darstellen,
und R8 ist Wasserstoff oder C1-6-Alkyl,
oder R4 ist eine (4-(N,N-Dimethylamino)phenyl)amino-Gruppe;
die
heterocyclische Gruppe für
jeden von R2 bis R7 ist
ausgewählt
aus Pyridyl, Furyl, Thienyl, Imidazolyl, Pyrazinyl und Pyrimidyl,
der
gegebenenfalls vorhandene Substituent ist ausgewählt aus Halogen, C1-6-Alkyl,
C3-8-Cycloalkyl, Aryl, Hydroxyl, C1-6-Alkoxy, gegebenenfalls substituiert mit
einem Halogenatom, Aryloxy, C1-6-Alkylthio,
einer heterocyclischen Gruppe, wie oben definiert, Formyl, das gegebenenfalls
als Acetal geschützt
sein kann, C1-6-Alkylcarbonyl, Arylcarbonyl, Carboxyl,
C1-6-Alkoxycarbonyl,
Amino, C1-6-Alkylamino, Amino, Thioacetal, Nitro,
Nitrilo und Trifluormethyl,
X und Y können identisch oder voneinander
verschieden sein und repräsentieren
jeweils -CH2-, -NH- oder -O-, und
n
ist eine ganze Zahl von 0–4;
und
- (B) Verbindungen der Formel (I), worin X -NH- ist und n ist
0, und die verbleibenden Substituenten sind wie folgt definiert: oder eines
Salzes davon zur Herstellung eines Medikaments, das als Förderer der
Knorpelbildung, als Knorpelreparaturmittel oder als Knochenbruchreparaturförderer wirksam
ist, bereitgestellt.
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Gemäss einem
weiteren erfindungsgemässen
Aspekt wird eine Verbindung der Formel (IV):
bereitgestellt, worin R
12 C
1-6-Alkyl ist,
das am gleichen Kohlenstoffatom mit zwei C
1-6-Alkoxygruppen,
die jeweils mit 1–5
Halogenatomen substituiert sind, substituiert ist, oder ein Salz
davon.
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Darüber hinaus
wird erfindungsgemäss
eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, die als aktiven
Bestandteil eine Verbindung der obigen allgemeinen Formel (IV) oder
ein Salz davon umfasst, sowie die Verwendung einer Verbindung der
Formel (IV) oder eines Salzes davon zur Herstellung eines Medikaments,
das als Knorpelbildungsförderer,
als Knorpelreparaturmittel oder als Knochenbruchreparaturförderer wirksam
ist.
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Noch
weiter wird erfindungsgemäss
ein Verfahren zur ex-vivo-Herstellung einer chondrozytenhaltigen Zusammensetzung
bereitgestellt, das die Kultivierung von Chondrozyten oder undifferenzierten
Mesenchymalzellen in Gegenwart einer Verbindung der Formel (I) oder
(IV) oder eines Salzes davon umfasst.
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Ferner
wird erfindungsgemäss
eine chondrozytenhaltige Zusammensetzung bereitgestellt, die nach diesem
Verfahren erhältlich
ist.
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KURZE BESCHREIBUNG DER
ZEICHNUNGEN:
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1A ist
ein Photomikrograph, der eine Hämatoxylin/Eosin-doppeltgefärbte Ohrgewebeprobe
aus einer Ratte nach wiederholter oraler Verabreichung eines Kontrollträgers (3
% Gummi arabicum) für
4 Wochen zeigt, und 1B ist ein Photomikrograph,
der eine Hämatoxylin/Eosin-doppeltgefärbte Ohrgewebeprobe
aus einer Ratte nach wiederholter oraler Verabreichung einer Verbindung
(A) (2 g/kg) für
4 Wochen zeigt.
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2A ist
ein Photomikrograph, der eine Hämatoxylin/Eosin-doppeltgefärbte Luftröhrengewebeprobe aus
einer Ratte nach wiederholter oraler Verabreichung eines Kontrollträgers (3
% Gummi arabicum) für
4 Wochen zeigt, und 2B ist ein Photomikrograph,
der eine Hämatoxylin/Eosin-doppeltgefärbte Luftröhrengewebeprobe
aus einer Ratte nach wiederholter oraler Verabreichung einer Verbindung
(A) (2 g/kg) für
4 Wochen zeigt.
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3A ist
ein Photomikrograph, der eine Hämatoxylin/Eosin-doppeltgefärbte Brustbeinschwertfortsatz-Gewebeprobe
aus einer Ratte nach wiederholter oraler Verabreichung eines Kontrollträgers (3
% Gummi arabicum) für
4 Wochen zeigt, und 3B ist ein Photomikrograph,
der eine Hämatoxylin/Eosindoppeltgefärbte Brustbeinschwertfortsatz-Gewebeprobe
aus einer Ratte nach wiederholter oraler Verabreichung einer Verbindung
(A) (2 g/kg) für
4 Wochen zeigt.
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4A ist
ein Photomikrograph, der eine Hämatoxylin/Eosin-doppeltgefärbte Kniegelenkgewebeprobe
aus einer Ratte nach wiederholter oraler Verabreichung eines Kontrollträgers (3
% Gummi arabicum) für
4 Wochen zeigt, und 4B ist ein Photomikrograph,
der eine Hämatoxylin/Eosin-doppeltgefärbte Kniegelenkgewebeprobe
aus einer Ratte nach wiederholter oraler Verabreichung einer Verbindung
(A) (2 g/kg) für
4 Wochen zeigt.
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5A ist
ein Photomikrograph, der eine Hämatoxylin/Eosin-doppeltgefärbte Lendenwirbelsäulen (Scheiben)-Gewebeprobe
aus einer Ratte nach wiederholter oraler Verabreichung eines Kontrollträgers (3
% Gummi arabicum) für
4 Wochen zeigt, und 5B ist ein Photomikrograph,
der eine Hämatoxylin/Eosindoppeltgefärbte Lendenwirbelsäulen (Scheiben)-Gewebeprobe
aus einer Ratte nach wiederholter oraler Verabreichung einer Verbindung
(A) (2 g/kg) für
4 Wochen zeigt.
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6 ist
ein Graph, der die Breite der Oberschenkelkniegelenks einer Ratte
nach wiederholter Verabreichung der Verbindung (A) (1,0 mmol/l)
oder eines Kontrollträgers
(50 % DMSO in physiologischer Kochsalzlösung) in einer Menge von 50 μl/Tag in
das Kniegelenk für
3 Wochen zeigt.
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7A ist
ein Photomikrograph, der eine 0,3 % Safranin O-gefärbte Oberschenkelkniegelenk-Gewebeprobe
aus einer Ratte nach wiederholter Verabreichung eines Kontrollträgers (50
% DMSO in physiologischer Kochsalzlösung) in einer Menge von 50 μl/Tag in
das Kniegelenk für
3 Wochen zeigt, und 7B ist ein Photomikrograph,
der eine 0,3 % Safranin O-gefärbte
Oberschenkelkniegelenk-Gewebeprobe aus einer Ratte nach wiederholter
Verabreichung der Verbindung (A) (1,0 mmol/l) in einer Menge von
50 μl/Tag
in das Kniegelenk für
3 Wochen zeigt.
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8 ist
ein Graph, der die Aufnahme von 35S-markierter
Schwefelsäure
in Glycosaminoglycanen in Rattenprimärkultur-Gelenkchondrozyten
zeigt, denen Verbindung (A) oder ein Kontrollträger (Ethanol in einer Endkonzentration
im Medium von 1 %) zugegeben wurde.
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9 ist
ein Graph, der die Aufnahme von 3H-markiertem
Thymidin in Rattenprimärkultur-Gelenkchondrozyten
zeigt, denen Verbindung (A) oder ein Kontrollträger (Ethanol in einer Endkonzentration
von 1 % im Medium) zugegeben wurde.
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10A ist ein Photomikrograph, der Alcianblau/Ölrot O-doppeltgefärbte zusammenfliessende CL-1-Zellen
nach Zugabe eines Kontrollträgers
(Ethanol in einer Endkonzentration von 1 % im Medium) und 7-tägiger Kultivierung
zeigt, und 10B ist ein Photomikrograph,
der Alcianblau/Ölrot
O-doppeltgefärbte zusammenfliessende
CL-1-Zellen nach Zugabe der Verbindung (A) (10 μmol/l Endkonzentration im Medium)
und 7-tägiger
Kultivierung zeigt.
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11 ist
ein Graph, der die Aufnahme von 35S-markierter
Schwefelsäure
in zusammenfliessende CL-1-Zellen während der letzten 24 Stunden
der Kultivierung der CL-1-Zellen für 48 Stunden in einem Medium zeigt,
das die Verbindungen (A) und (F) in Endkonzentrationen von 1, 5
und 10 μmol/l,
Verbindungen (B) und (E) in einer Endkonzentration von 10 μmol/l oder
einem Kontrollträger
in einer Endkonzentration von 1 % Ethanol enthält.
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12 ist
ein Graph, der die Aufnahme von 35S-markierter
Schwefelsäure
in zusammenfliessende CL-1-Zellen während der letzten 24 Stunden
der Kultivierung der CL-1-Zellen für 48 Stunden in einem Medium zeigt,
das die Verbindungen (A), (C), (D) und (G) in Endkonzentrationen
von 10 μmol/l
oder einen Kontrollträger in
einer Endkonzentration von 1 % Ethanol enthält.
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13A und 13B sind
Graphen, die die Ergebnisse der histologischen Untersuchung der
Knorpelreparatur in Mangelbereichen der femoralen Patellaroberfläche von
Ratten, bei denen Mangelbereiche erzeugt wurden, die bis zum Knochenmark
reichten, zeigen, wobei eine wiederholte Verabreichung der Verbindung
(A) (1,0 mmol/l) oder eines Kontrollträgers (50 % DMSO in physiologischer
Kochsalzlösung)
in einer Menge von 50 μl/Tag
für 3 Wochen,
beginnend am 7. Tag nach der Operation, folgte. 13A zeigt die Ergebnisse für Zellmorphologie, Matrixeinfärbung und
Knorpeldicke und 13B zeigt die Gesamtergebnisse.
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14A ist ein Photomikrograph, der eine 0,3 Safranin
O-gefärbte
Gewebeprobe aus einem Mangelbereich zeigt, der in der bis zum Knochenmark
reichenden femoralen Patellaroberfläche einer Ratte erzeugt wurde,
der wiederholt intraartikulär
ein Kontrollträger
(50 % DMSO in physiologischer Kochsalzlösung) in einer Menge von 50 μl/Tag für 3 Wochen,
beginnend am 7. Tag nach der Operation, verabreicht wurde, und 14B ist ein Photomikrograph, der eine 0,3 % Safranin
O-gefärbte
Gewebeprobe aus einem Mangelbereich zeigt, der in der bis zum Knochenmark
reichenden femoralen Patellaroberfläche einer Ratte erzeugt wurde,
der wiederholt intraartikulär
Verbindung (A) (1,0 mmol/l) in einer Menge von 50 μl/Tag für 3 Wochen,
beginnend am 7. Tag nach der Operation, verabreicht wurde.
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15A ist ein Satz von Rasterelektronenmikrographen,
die teilweise menisektomisierte Kaninchen zeigen, denen wiederholt
intraartikulär
ein Kontrollträger
(50 % DMSO in physiologischer Kochsalzlösung) in einer Menge von 500 μl/Tag für 3 Wochen,
beginnend am 7. Tag nach der Operation, verabreicht wurde, und 15B ist ein Satz von Rasterelektronenmikrographen,
die teilweise menisektomisierte Kaninchen zeigen, denen wiederholt
intraartikulär
Verbindung (A) (3,0 mmol/l) in einer Menge von 500 μl/Tag für 3 Wochen,
beginnend am 7. Tag nach der Operation, verabreicht wurde. Die 15A und 15B enthalten
beide Photomikrographen von 6 Individuen.
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16A, 16B und 16C sind Graphen, die die verletzte Gelenkknorpeloberfläche aus
Rasterelektronenphotomikrographen teilweise menisetkomisierter Kaninchen
zeigen, denen wiederholt intraartikulär Verbindung (A) (3,0 mmol/l)
und ein Kontrollträger
(50 % DMSO in physiologischer Kochsalzlösung) in einer Menge von 500 μl/Tag für 3 Wochen,
beginnend am 7. Tag nach der Operation, verabreicht wurde. 16A zeigt die durchschnittliche Fläche geringfügiger Wunden, 16B zeigt die Durchschnittsfläche mittlerer Wunden und 16C zeigt den Durchschnitt der Gesamtwundenfläche als
Summe der geringfügigen
und mittleren Wundenflächen.
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17A und 17B sind
Graphen, die die Ergebnisse der histologischen Untersuchung von
0,3 % Safranin O-gefärbten
Proben von Wunden in Teilausschnitten aus den Gelenkhalbmonden von
Kaninchen zeigen, denen wiederholt intraartikulär die Verbindung (A) (3,0 mmol/l)
und ein Kontrollträger
(50 % DMSO in physiologischer Kochsalzlösung) in einer Menge von 500 μl/Tag für 3 Wochen,
beginnend am 7. Tag nach der Operation, verabreicht wurde. 17A zeigt die Ergebnisse für den Verlust an Oberflächenschicht,
die Geschwürbildung
oder Erosion, die Fibrillierung und Clusterbildung, und
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17B zeigt die globalen Testergebnisse.
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BESTE ERFINDUNGSGEMÄSSE AUSFÜHRUNGSFORM:
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Die
vorliegende Erfindung wird nachfolgend detaillierter unter geeigneter
Bezugnahme auf die beigefügten
Zeichnungen erläutert.
Die als "Teile" und "%" angegebenen Mengen in den nachfolgenden
Erläuterungen
basieren auf dem Gewicht, sofern nicht anders angegeben.
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Ein
erfindungsgemässes
Knorpelbildungsfördermittel
oder Knorpelreparaturmittel umfasst als aktiven Bestandteil eine
Verbindung der vorgenannten allgemeinen Formel (I) oder ein Salz
davon.
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Verbindungen
der allgemeinen Formel (I) sind in WO 94/19322 beschrieben, und
die gleiche Patentveröffentlichung
lehrt, dass die Verbindungen CCK-B/Gastrinrezeptor-Antagonisten
sind. Die hiesigen Erfinder haben gefunden, dass die durch die allgemeine
Formel (I) repräsentierten
Verbindungen eine unerwartete knorpelbildungsfördernde Wirkung besitzen, und
die vorliegende Erfindung wurde auf Basis dieser Entdeckung vollendet.
Die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) können nach dem in der vorgenannten
internationalen Patentveröffentlichung
beschriebenen Verfahren oder nach dem später in den Beispielen dargestellten
Verfahren erhalten werden.
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Ein "Halogenatom" bedeutet erfindungsgemäss ein Fluoratom,
ein Chloratom, eine Bromatom oder ein Iodatom.
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Eine "C1-6-Alkylgruppe" bedeutet erfindungsgemäss eine
lineare oder verzweigte Alkylgruppe mit 1–6 Kohlenstoffatomen, wie beispielsweise
eine Methylgruppe, eine Ettylgruppe, eine n-Propylgruppe, eine i-Propylgruppe,
eine n-Butylgruppe, eine s-Butylgruppe, eine t-Butylgruppe, eine
Pentylgruppe oder eine Hexylgruppe.
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Eine "C2-6-Alkenylgruppe" ist eine lineare
oder verzweigte Alkenylgruppe mit 2–6 Kohlenstoffatomen, wie beispielsweise
eine Vinylgruppe, eine Allylgruppe, eine Butenylgruppe, eine Pentenylgruppe
oder eine Hexenylgruppe.
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Eine "C2-6-Alkinylgruppe" ist eine lineare
oder verzweigte Alkinylgruppe mit 2–6 Kohlenstoffatomen, wie beispielsweise
eine Ethinylgruppe, eine Propinylgruppe oder eine Butinylgruppe.
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Eine "C1-6-Alkoxygruppe" ist eine lineare
oder verzweigte Alkoxygruppe mit 1–6 Kohlenstoffatomen, wie beispielsweise
eine Methoxygruppe, eine Ethoxygruppe, eine n-Propoxygruppe, eine
i-Propoxygruppe, eine n-Butoxygruppe, eine s-Butoxygruppe, eine
t-Butoxygruppe, eine Pentoxygruppe oder eine Hexoxygruppe.
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Eine "Acylgruppe" ist eine Carbonylgruppe,
die mit einem Wasserstoffatom oder mit einer Alkylgruppe mit einem
optionalen Substituenten, einer Arylgruppe mit einem optionalen
Substituenten, einer Alkoxygruppe mit einem optionalen Substituenten
oder einer Aminogruppe mit einem optionalen Substituenten substituiert ist,
beispielsweise eine Alkylcarbonylgruppe, wie eine Acetylgruppe,
eine Propionylgruppe, eine Pivaloylgruppe, eine Cyclohexancarbonylgruppe,
oder eine Arylcarbonylgruppe, wie eine Benzoylgruppe, eine Naphthoylgruppe
oder eine Toluoylgruppe.
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Eine "Arylgruppe" ist eine monovalente
Gruppe, die eine aromatische Kohlenwasserstoffgruppe abzüglich eines
Wasserstoffatoms darstellt, wie beispielsweise eine Phenylgruppe,
eine Tolylgruppe, eine Xylylgruppe, eine Biphenylgruppe, eine Naphthylgruppe,
eine Anthrylgruppe oder eine Phenanthrylgruppe.
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Eine "C1-6-Alkylengruppe" ist eine lineare
oder verzweigte Alkylengruppe mit 1–6 Kohlenstoffatomen, wie beispielsweise
eine Methylengruppe, eine Ethylengruppe, eine Propylengruppe, eine
Butylengruppe, eine Pentylengruppe oder eine Hexylengruppe.
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Eine "C3-8-Cycloalkylgruppe" ist eine cyclische
gesättigte
Kohlenwasserstoffgruppe mit 3–8
Kohlenstoffatomen, wie beispielsweise eine Cyclopropylgruppe, eine
Cyclobutylgruppe, eine Cyclopentylgruppe, eine Cyclohexylgruppe
oder eine Cycloheptylgruppe. Substituierte Cycloalkylgruppen schliessen
eine Methylgruppe und eine Adamantylgruppe ein.
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Eine "heterocyclische Gruppe" ist eine aromatische
heterocyclische Gruppe mit mindestens einem Heteroatom, wie beispielsweise
eine Pyridylgruppe, eine Furylgruppe, eine Thienylgruppe, eine Imidazolylgruppe,
eine Pyrazinylgruppe oder eine Pyrimidylgruppe.
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Die
zuvor genannte C1-6-Alkylgruppe, C2-6-Alkenylgruppe, Alkinylgruppe, C1-6-Alkoxygruppe, Acylgruppe, Arylgruppe,
C3-8-Cycloalkylgruppe und heterocyclische
Gruppe kann bei Bedarf mit einem oder mehreren Substituenten substituiert
sein. Beispiele für
die Substituenten sind ein Halogenatom, eine C1-6-Alkylgruppe, eine
C3-8-Cycloalkylgruppe,
eine Arylgruppe, eine Hydroxylgruppe, eine gegebenenfalls mit einem
Halogenatom substituierte C1-6-Alkoxygruppe,
eine Aryloxygruppe, eine C1-6-Alkylthiogruppe,
eine heterocyclische Gruppe, eine gegebenenfalls als Acetal geschützte Formylgruppe,
eine C1-6-Alkylcarbonylgruppe, eine Arylcarbonylgruppe,
eine Carboxylgruppe, eine C1-6-Alkoxycarbonylgruppe,
eine gegebenenfalls eine C1-6-Alkylgruppe aufweisende
Aminogruppe, eine Aminogruppe, eine Thioacetalgruppe, eine Nitrogruppe,
eine Nitrilgruppe oder eine Trifluormethylgruppe.
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Die
Verbindungen, die als aktive Bestandteile in den erfindungsgemässen Knorpelbildungsfördermitteln
und Knorpelreparaturmitteln dienen (Indolin-2-on-Derivate der obigen
allgemeinen Formel (I)), werden nachfolgend detaillierter erläutert.
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R1 ist ein Halogenatom, eine C1-6-Alkylgruppe,
eine C1-6-Alkoxygruppe, eine Hydroxylgruppe, eine
Nitrogruppe, eine Trifluormethylgruppe, eine C1-6-Alkylthiogruppe,
eine Acylgruppe, eine Carboxylgruppe, eine Mercaptogruppe oder eine
Aminogruppe, und unter diesen ist R1 vorzugsweise
ein Halogenatom, eine C1-6-Alkylgruppe,
eine C1-6-Alkoxygruppe oder eine Nitrogruppe.
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Der
Index "n" ist eine ganze Zahl
von 0–4.
Vorzugsweise ist er 0 oder 1, und am meisten bevorzugt 0.
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R2 ist ein Wasserstoffatom, eine C1-6-Alkylgruppe mit einem optionalen Substituenten,
eine C2-6-Alkenylgruppe mit einem optionalen
Substituenten, eine C2-6-Alkinylgruppe mit einem optionalen Substituenten, eine
C1-6-Alkoxygruppe mit einem optionalen Substituenten,
eine Acylgruppe mit einem optionalen Substituenten, eine Arylgruppe
mit einem optionalen Substituenten oder eine heterocyclische Gruppe
mit einem optionalen Substituenten.
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R2 ist vorzugsweise ein Wasserstoffatom, eine
C1-6-Alkylgruppe
mit einem optionalen Substituenten, eine C2-6-Alkenylgruppe mit
einem optionalen Substituenten oder eine Arylgruppe mit einem optionalen
Substituenten, und im Hinblick auf die Aktivität als Knorpelbildungsfördermittel
oder Knorpelreparaturmittel ist R2 weiter
bevorzugt eine C1-6-Alkylgruppe mit einem
optionalen Substituenten, der gegebenenfalls mit einem Halogenatom
substituiert ist.
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Unter
diesen ist R
2 noch weiter bevorzugt eine
C
1-6-Alkylgruppe,
die am gleichen Kohlenstoffatom mit zwei Niederalkoxygruppen substituiert
ist, die gegebenenfalls mit 1–5
Halogenatom oder der Gruppe -O-Z-O-, worin Z eine Niederalkylengruppe
ist, die gegebenenfalls mit 1–10
Halogenatom substituiert ist, substituiert sind, und noch weiter
bevorzugt eine Gruppe der allgemeinen Formel (II):
worin R
10 und
R
11 identisch oder voneinander verschieden
sein können
und jeweils eine gegebenenfalls mit 1–5 Halogenatomen substituierte
C
1-6-Alkylgruppe darstellen, vorzugsweise
ist ein beliebiges von ihnen oder beide eine C
1-6-Alkylgruppe
mit 1–5
Halogenatomen, oder der allgemeinen Formel (III):
worin Z eine gegebenenfalls
mit 1–10
Halogenatomen substituierte C
1-6-Alkylengruppe
ist.
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R2 ist weiter bevorzugt eine 2,2-Diethoxyethylgruppe,
eine 2,2-Dimethoxyethylgruppe, eine 2,2-Diisopropoxyethylgruppe,
eine 2,2-Bis(2-fluorethoxy)ethyl-Gruppe oder eine 2,2-Bis(2-chlorethoxy)ethyl-Gruppe, unter
denen eine 2,2-Diethoxyethylgruppe und eine 2,2-Bis(2-fluorethoxy)ethyl-Gruppe
am meisten bevorzugt sind, und besonders bevorzugt ist eine 2,2-Diethoxyethylgruppe.
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R3 ist eine C1-6-Alkylgruppe
mit einem optionalen Substituenten, eine C3-8-Cycloalkylgruppe
mit einem optionalen Substituenten, eine Arylgruppe mit einem optionalen
Substituenten oder eine heterocyclische Gruppe mit einem optionalen
Substituenten. R3 ist vorzugsweise eine
C1-6-Alkylgruppe mit einem optionalen Substituenten,
eine C3-8-Cycloalkylgruppe mit einem optionalen
Substituenten oder eine Arylgruppe mit einem optionalen Substituenten,
unter denen eine Arylgruppe mit einem optionalen Substituenten besonders
bevorzugt ist. Als Substituent bevorzugt ist eine C1-6-Alkylgruppe
(vorzugsweise eine Methylgruppe und eine Ethylgruppe, und besonders
eine Methylgruppe) und eine gegebenenfalls eine C1-6-Alkylgruppe
aufweisende Aminogruppe, und als R3 besonders
bevorzugt ist eine 4-Methylphenylgruppe.
-
R4 ist ein Wasserstoffatom, eine C1-6-Alkylgruppe mit einem optionalen Substituenten,
eine Arylgruppe mit einem optionalen Substituenten, eine heterocyclische
Gruppe mit einem optionalen Substituenten, -OR5, -SR5, oder -NR6R7.
-
Hier
können
R5, R6 und R7 identisch oder voneinander verschieden
sein und repräsentieren
jeweils ein Wasserstoffatom, eine C1-6-Alkylgruppe
mit einem optionalen Substituenten, eine C3-8-Cycloalkylgruppe
mit einem optionalen Substituenten, eine Arylgruppe mit einem optionalen
Substituenten, eine heterocyclische Gruppe mit einem optionalen
Substituenten, eine C1-6-Alkoxygruppe oder
eine Aminogruppe, und R6 und R7 können zusammen
eine Gruppe bilden, die durch -(CH2)m- oder -(CH2)lNR8(CH2)k-repräsentiert
werden, worin k, l und m jeweils eine ganze Zahl von 1–8 darstellen,
und R8 ist ein Wasserstoffatom oder eine
C1-6-Alkylgruppe.
-
R4 ist vorzugsweise eine C1-6-Alkylgruppe
mit einem optionalen Substituenten, eine Arylgruppe mit einem optionalen
Substituenten, eine heterocyclische Gruppe mit einem optionalen
Substituenten oder eine Gruppe, die durch -OR5 oder -NR6R7 repräsentiert
wird, worin R5, R6 und
R7 wie zuvor definiert sind, und weiter bevorzugt
eine Gruppe -NR6R7,
worin R6 und R7 identisch
oder voneinander verschieden sein können und jeweils ein Wasserstoffatom
oder eine Arylgruppe mit einem optionalen Substituenten darstellen.
-
Unter
diesen ist R4 vorzugsweise eine Gruppe -NR6R7, worin R6 und R7 identisch
oder voneinander verschieden sein können und jeweils ein Wasserstoffatom
oder eine Arylgruppe darstellen, wobei die Arylgruppe eine C1-6-Alkylgruppe
oder eine Aminogruppe aufweist, worin die Aminogruppe gegebenenfalls
eine C1-6-Alkylgruppe aufweist, und am meisten
bevorzugt ist eine Gruppe -NHR7, worin R7 eine 4-Methylphenylgruppe, eine 4-Ethylphenylgruppe
oder eine 4-(N,N-Dimethylamino)phenyl-Gruppe darstellt.
-
X
und Y können
identisch oder voneinander verschieden sein und stellen -CH2-, -NH- oder -O- dar, unter denen X vorzugsweise
-CH2-, -NH- oder -O- ist, und Y ist vorzugsweise
-CH2- oder -NH-. Im Hinblick auf die Aktivität als Knorpelbildungsfördermittel
oder Knorpelreparaturmittel können
X und Y identisch oder voneinander verschieden sein und sind vorzugsweise
-CH2- oder
-NH-, und am meisten bevorzugt ist X -NH- und Y -CH2-.
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Die
erfindungsgemässen
Indolin-2-on-Derivate können
in Form pharmazeutisch annehmbarer Salze verwendet werden. Als Beispiele
für solche
Salze sind anorganische Salze zu nennen, wie beispielsweise Salzsäuresalze,
Bromwasserstoffsäuresalze,
Iodwasserstoffsäuresalze
Schwefelsäuresalze
und Phosphorsäuresalze;
organische Säuresalze,
wie beispielsweise Bernsteinsäuresalze,
Malonsäuresalze,
Essigsäuresalze,
Maleinsäuresalze,
Fumarsäuresalze,
Zitronensäuresalze,
Benzoesäuresalze
und Salicylsäuresalze; und
Metallsalze, wie beispielsweise Natriumsalze, Kaliumsalze und Magnesiumsalze.
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Die
erfindungsgemässen
Indolin-2-on-Derivate können
auch in optisch aktiven Formen vorliegen. Wenn optisch aktive Formen
vorliegen, ist die absolute Konfiguration in der 3-Position vorzugsweise
die R-Konfiguration.
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Als
Beispiele für
spezifische Verbindungen der erfindungsgemässen Indolin-2-on-Derivate
sind die Verbindungen zu nennen, die in den Beispielen von WO 94/19322
genannt sind, sowie die Verbindungen, die in den Beispielen der
JP-A-7-48349 genannt sind, nämlich
die Verbindungen 1–201,
die in den folgenden Tabellen (Tabellen 1 bis 9) aufgeführt sind.
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In
den Tabellen 1 bis 9 sind R1 bis R4, X, Y und n wie oben für die allgemeine Formel (I)
definiert.
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Als
Beispiele für
spezifische Verbindungen, die als erfindungsgemässe Knorpelbildungsfördermittel und
Knorpelreparaturmittel besser geeignet sind, sind die folgenden
Verbindungen zu nennen.
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-
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Als
Beispiele für
Biometabolite der Verbindung (A) sind die folgenden Verbindungen
(H) und (I) zu nennen.
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Die
in den Tabellen 1 bis 9 aufgeführten
Verbindungen können
nach dem Verfahren synthetisiert werden, das in JP-A-7-48349 offenbart
ist. Unter den oben erwähnten
Verbindungen (A) bis (G) können
die Verbindungen (A) bis (D) nach dem in JP-A-7-48349 beschriebenen
Verfahren synthetisiert werden.
-
Die
Verbindungen (E), (F) und (G) können
beispielsweise nach dem unten gezeigten Reaktionsweg A hergestellt
werden (entspricht dem "Reaktionsweg
6" aus JP-A-7-48349),
wobei als Ausgangsmaterial das in den Beispielen der vorliegenden
Anmeldung genannte Aldehyd-Zwischenprodukt verwendet wird, das nach dem
Verfahren von JP-A-7-48349 synthetisiert wird.
-
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Die
oben genannte Verbindung (H) kann nach dem "Reaktionsweg 7" gemäss
JP-A-7-48349 synthetisiert werden. Verbindung (I) kann nach dem
folgenden Verfahren entweder in racemischer Form oder in optisch
aktiver Form erhalten werden.
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Genauer
kann eine racemische Form der Verbindung (I) beispielsweise nach
dem folgenden Reaktionsweg B synthetisiert werden (entspricht dem "Reaktionsweg 5" gemäss JP-A-7-48349),
wobei ein Isocyanat mit einer Hydroxylgruppe, die durch eine geeignete
Schutzgruppe geschützt
ist (beispielsweise eine substituierte Silylgruppe, wie eine Triethylsilylgruppe
oder eine t-Butyldimethylsilylgruppe), verwendet wird.
-
Eine
optisch aktive Form der Verbindung (I) kann beispielsweise nach
dem folgenden Reaktionsweg B synthetisiert werden (entspricht dem "Reaktionsweg 7" gemäss JP-A-7-48349),
wobei ein Isocyanat mit einer Hydroxylgruppe, die durch eine geeignete
Schutzgruppe geschützt
ist (beispielsweise eine substituierte Silylgruppe, wie eine Triethylsilylgruppe
oder eine t-Butyldimethylsilylgruppe), verwendet wird, oder durch
optische Auftrennung einer Stereoisomerenmischung der Verbindung
(I) nach einem dem Fachmann allgemein bekannten Verfahren (beispielsweise
ein Verfahren unter Verwendung einer optisch aktiven Säule).
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Die
Identifizierung, Strukturbestimmung und Reinheitsbestimmung der
erhaltenen Verbindung können nach
herkömmlichen
Verfahren erzielt werden (spektroskopische Verfahren, wie beispielsweise
NMR, IR usw., und HPLC oder dergleichen).
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Das
erfindungsgemässe
Knorpelbildungsfördermittel
kann ohne sonderliche Beschränkungen
für eine Vielzahl
von Anwendungen eingesetzt werden, solange der knorpelbildungsfördernde
Effekt des Mittels wirksam ausgenutzt werden kann; besonders geeignet
ist es zur Behandlung von Knorpelleiden, die eine Knorpeldysfunktion
aufgrund des Abbaus oder der Zerstörung von Knorpel begleiten,
zur Behandlung der Schädigung oder
Ablation von Knorpel durch Verletzungen oder Operationen, oder zur
Behandlung erblicher Knorpelhypoplasie oder -missbildung. Beispiel
für solche
Knorpelschädigungszustände schliessen
Osteoarthritis, chronische rheumatoide Arthritis, ausschneidende
Osteochondrose, verletzungsinduzierte Gelenkknorpelschädigung und
Bandscheibenvorfall ein. Beispiele für angeborene Knorpelhypoplasie
oder -missbildung schliessen Anotie und Mikrotie ein.
-
Ein
Mittel, das eine erfindungsgemässe
Verbindung enthält,
kann entweder oral oder parenteral verabreicht werden, jedoch ist
die parenterale Verabreichung im Hinblick auf die Vermeidung unnötiger Förderung der
Knorpelbildung ausserhalb des Verabreichungsortes und im Hinblick
auf die Wirkung bevorzugt. Das Mittel kann in einer Weise formuliert
werden, die für
das Verabreichungsverfahren geeignet ist.
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Eine
pharmazeutische Zusammensetzung, die eine erfindungsgemässe Verbindung
als aktiven Bestandteil umfasst, kann unter Verwendung einer herkömmlichen
Formulierungstechnik formuliert werden. Die pharmazeutische Zusammensetzung
kann in Abhängigkeit
vom Anwendungszweck in verschiedenen Formen verwendet werden, wie
beispielsweise in Form von Kapsel, Granulaten, einer Creme, eines
Pulvers, eines Sirups, Tabletten, einer Injektion oder Salbe, und
entweder in fester oder flüssiger
Form. Der/das für
die Formulierung verwendet Träger
oder Verdünnungsmittel
kann eine feste oder flüssige
Substanz sein. Als Beispiele sind Lactose, Magnesiumstearat, Stärke, Talk,
Gelatine, Agar, Pectin, Gummi arabicum, Olivenöl, Sesamöl und Ethylenglykol sowie eine
beliebige andere, üblicherweise
verwendete Substanz zu nennen.
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Der
Gehalt der erfindungsgemässen
Verbindung in der Formulierung variiert in Abhängigkeit von der Zubereitungsform,
jedoch ist üblicherweise
eine Konzentration von 0,00001–80
Gew.% bevorzugt. Eine pharmazeutische Zusammensetzung aus der erfindungsgemässen Verbindung
kann in Abhängigkeit
von der Art des Warmblüters,
wie beispielsweise einem Menschen, der Schwere der Symptome und
der klinischen Diagnose in verschiedenen Dosierungen verabreicht
werden; in den meisten Fällen
beträgt
die tägliche
orale Dosis jedoch 0,01–2
g/kg und die tägliche
parenterale Dosis 0,0000001–0,01
g/kg. Diese Dosis kann auf einmal oder über mehrere Zeitpunkte verteilt
alle 1 bis 7 Tage verabreicht werden, wobei in Abhängigkeit
von der Schwere der Symptome und der klinischen Diagnose eine geeignete
Einjustierung durchgeführt
wird. Wie in den nachfolgend angegebenen Beispielen gezeigt, wurde
von den erfindungsgemässen
Mitteln gezeigt, dass sie bei oraler oder parenteraler Verabreichung
bei Ratten knorpelbildungsfördernde
Wirkungen besitzen. Das zeigt die Nützlichkeit dieser Mittel als
therapeutische Mittel für
Knorpelerkrankungen an.
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Ferner
zeigen die knorpelbildungsfördernden
Wirkungen, die die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) auf den
Luftröhrenknorpel,
die Bandscheiben (interspinal disks), den Ohrknorpel und den Brustbeinknorpel
ausüben,
dass die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) geeignete Therapien
als Reparaturmittel für
Erkrankungen darstellen können,
die durch Knorpeldefekte und Abbau oder Zerstörung von Knorpel gekennzeichnet
sind.
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Darüber hinaus
können
durch die Behandlung undifferenzierter Mesenchymalzellen (CL-1)
oder Chondrozyten mit Knorpelbildungsförderern der allgemeinen Formel
(I) Chondrozyten (oder eine stärkere
Verbreitung von Chondrozyten, wenn Chondrozyten behandelt werden),
sowie eine extrazelluläre
Matrix oder knorpelartiges Gewebe erhalten werden. Die in der vorliegenden
Anmeldung beschriebenen Knorpelbildungsförderer können zur Analyse des extrazellulären Matrixmetabolismus' von Chondrozyten
und des Differenzierungsmechanismus zu Chondrozyten (biologische
Eigenschaften), zur Analyse der Komponenten, die die extrazelluläre Matrix
bilden (chemische Eigenschaften) und zur Analyse von Eigenschaften,
wie beispielsweise Viskoelastizität (physikalische Eigenschaften)
verwendet werden.
-
Ferner
können
die durch die allgemeine Formel (I) dargestellten Indolin-2-on-Derivate,
die knorpelbildungsfördernde
Wirkungen zeigen, in einigen Fällen
durch den gleichen knorpelbildungsfördernden Effekt die calcifizierte
Knorpelbildung fördern,
wodurch sie in einigen Fällen
eine heilungsfördernde
Wirkung auf Knochenbrüche über eine
schlussendliche endochondrale Verknöcherung durch die Verbindungen
hervorrufen können.
Das heisst, von diesen Verbindungen wird auch angenommen, dass sie
als Knochenbruchreparaturförderer
geeignet sind.
-
Die
vorliegende Erfindung wird nachfolgend anhand der nachfolgenden
Beispiele detaillierter erläutert.
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BEISPIELE
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SYNTHESEBEISPIEL 1
-
Die
Verbindungen (A), (C) und (D) wurden nach dem folgenden Verfahren
hergestellt.
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Verbindung (A):
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Die
Synthese wurde nach dem Verfahren durchgeführt, das in Beispiel 174(2)
von JP-A-7-48349 beschrieben ist. Eine racemische Form der Verbindung
wurde nach dem Verfahren synthetisiert, das in Beispiel 71 der Veröffentlichung
beschrieben ist.
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Verbindung (C):
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Die
Synthese wurde nach dem Verfahren durchgeführt, das in Beispiel 180 von
JP-A-7-48349 beschrieben ist.
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Verbindung (D):
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Die
Synthese wurde nach dem Verfahren durchgeführt, das in Beispiel 100 von
JP-A-7-48349 beschrieben ist.
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SYNTHESEBEISPIEL 2
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Die
Verbindungen (B), (E), (F) und (G) wurden nach dem folgenden Verfahren
synthetisiert.
-
Verbindung (B)
-
(3R)-1-(2,2-Diethoxyethyl)-3-(4-ethylphenyl)aminocarbonylmethyl-3-(N'-(4-methylphenyl)ureido)indolin-2-on:
-
(+)-1-(2,2-Diethoxyethyl)-3-hydroxycarbonylmethyl-3-(N'-(4-methylphenyl)ureido)indolin-2-on
(die in Beispiel 174-1 von JP-A-7-48349 beschriebene Verbindung,
182 mg) wurde in Dichlormethan (10 ml) aufgelöst und dann wurden 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-hydrochlorid
(96 mg) und p-Ethylanilin (61 mg) zugegeben. Die resultierende Mischung
wurde bei 15–30°C für 15 Stunden
gerührt.
-
Die
Reaktionsmischung wurde mit 1 N verdünnter Salzsäure und dann mit gesättigtem
Bicarbonatwasser gewaschen und nach Trocknen auf wasserfreiem Natriumsulfat
(15–30°C) wurde
das Lösungsmittel
zur Einengung unter reduziertem Druck entfernt. Der Rückstand
wurde mittels Silicagel-Säulenchromatografie (Hexan/Ethylacetat
= 3/1) gereinigt, wodurch 145 mg der Titelverbindung als weisses
Pulver erhalten wurden (Ausbeute: 65 %).
NMR (CDCl3,
270 MHz) δ:
8,48
(brs, 1H), 7,37–6,82
(m, 14H), 4,77 (t, J = 5,0 Hz, 1H), 3,94 (dd, J = 5,8, 13,7 Hz,
1H), 3,80–3,42
(m, 5H), 3,00 (d, J = 14,7 Hz, 1H), 2,66 (d, J = 14,7 Hz, 1H), 2,53
(q, J = 7, 6 Hz, 2H), 2, 17 (s, 3H), 1,20–1,05 (m, 9H)
-
Aldehyd-Zwischenprodukt:
-
(3R)-1-(Formylmethyl)-3-((4-methylphenyl)aminocarbonylmethyl)-3-(N'-(4-methylphenyl)ureido)indolin-2-on:
-
Wasser
(10 ml) und konzentrierte Salzsäure
(3 ml) wurden zu einer Acetonlösung
(30 ml) von (+)-1-(2,2-Diethoxyethyl)-3-((4-methylphenyl)aminocarbonylmethyl)-3-(N'-(4-methylphenyl)ureido)indolin-2-on
(in Beispiel 174(2) von JP-A-7-48349 beschriebene Verbindung, 610
mg) zugegeben und die Mischung wurde unter Rückfluss für 2 Stunden erhitzt. Nach dem
Abkühlen
der Reaktionslösung
wurde das Lösungsmittel
zur Einengung unter reduziertem Druck entfernt. Zu dem Rückstand
wurde Dichlormethan zugegeben und dann wurde zweimal mit Kochsalzlösung gewaschen.
Nach Trocknen der organischen Schicht über wasserfreiem Magnesiumsulfat
(15–30°C) wurde
sie unter reduziertem Druck eingeengt, wodurch 529 mg der Titelverbindung
als rohes Produkt erhalten wurden.
NMR (CDCl3,
270 MHz) δ:
9,71
(s, 1H), 7, 75 (m, 1H), 7, 40 (s, 1H), 7,38–6,90 (m, 11H), 6,65 (d, J
= 7,9 Hz, 1H), 4,76 (d, J = 18,7 Hz, 1H), 4,40 (d, J = 18,7 Hz,
1H), 2,98 (d, J = 14,5 Hz, 1H), 2,55 (d, J = 14,5 Hz), 2,30 (s,
3H), 2,23 (s, 3H)
-
Verbindung (E):
-
(3R)-1-(2,2-Diisopropoxyethyl)-3-((4-methylphenyl)aminocarbonylmethyl)-3-(N'-(4-methylphenyl)ureido)indolin-2-on:
-
Das
oben erhaltene Aldehyd-Zwischenprodukt (60 mg) wurde in Isopropanol
(10 ml) aufgelöst,
dann wurde p-Toluolsulfonsäure
(10 mg) zugegeben und die Mischung wurde unter Rückfluss für 4 Stunden erhitzt. Nach Abkühlen der
Lösung
wurde das Lösungsmittel
zur Einengung unter reduziertem Druck entfernt. Der Rückstand
wurde mit Dichlormethan verdünnt
und mit gesättigtem
Bicarbonatwasser gewaschen. Nach dem Trocknen der organischen Schicht
auf wasserfreiem Magnesiumsulfat (15–30°C) wurde sie unter reduziertem Druck
eingeengt. Der Rückstand
wurde mittels Silicagel-Säulenchromatografie
(Hexan/Ethylacetat = 1/1) gereinigt, wodurch 46 mg der Titelverbindung
erhalten wurden (Ausbeute: 62 %).
NMR (CDCl3,
270 MHz) δ:
8,
37 (s, 1H), 7,39–6,90
(m, 13H), 6,79 (s, 1H), 4,84 (dd, J = 4,9, 4,7 Hz, 1H), 3,94–3,73 (m,
4H), 3,00 (d, J = 14,9 Hz, 1H), 2,58 (d, J = 14,9 Hz, 1H), 2,29
(s, 3H), 2,22 (s, 3H), 1,18 (d, J = 6,3 Hz, 6H), 1,11–1,04 (m,
6H)
-
Verbindung (F)
-
(3R)-1-(2,2-Bis(2-Fluorethoxy)ethyl)-3-((4-methylphenyl)aminocarbonylmethyl)-3-(N'-(4-methylphenyl)ureido)indolin-2-on:
-
Das
vorgenannte Aldehyd-Zwischenprodukt (50 mg) wurde in 2-Fluorethanol
(1 ml) aufgelöst,
mit Kampfersulfonsäure
(5 mg) versetzt und die Mischung wurde unter Rückfluss für 5 Stunden erwärmt. Nach
Abkühlen
der Reaktionslösung
wurde Toluol zugegeben und die Mischung wurde unter reduziertem
Druck eingeengt, wobei überschüssiges 2-Fluorethanol
azeotrop abdestilliert wurde. Der Rückstand wurde mit Dichlormethan
verdünnt
und mit gesättigtem
Bicarbonatwasser gewaschen. Nach Trocknen der organischen Schicht über wasserfreiem
Magnesiumsulfat (15–30°C) wurde
sie unter reduziertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde mittels Silicagel-Säulenchromatografie
(Hexan/Ethylacetat = 2/1) gereinigt, wodurch 25 mg der Titelverbindung
erhalten wurden (Ausbeute: 41 %).
NMR (CDCl3,
270 MHz) δ:
7,79
(s, 1H), 7,32–6,93
(m, 13H), 6,76 (s, 1H), 5,01–4,96
(m, 1H), 4,62–4,53
(m, 2H), 4,45–4,35
(m, 2H), 4,11 (dd, J = 6,6, 14,3 Hz, 1H), 4,00–3,72 (m, 5H), 2,88 (d, J =
14,5 Hz, 1H), 2,49 (d, J = 14,5 Hz, 1H), 2,30 (s, 3H), 2,23 (s,
3H)
-
Verbindung (G)
-
(3R)-1-(2,2-Bis(2-chlorethoxy)ethyl)-3-((4-methylphenyl)-aminocarbonylmethyl)-3-(N'-(4-methylphenyl)ureido)indolin-2-on:
-
Das
vorgenannte Aldehyd-Zwischenprodukt (50 mg) wurde in 2-Chlorethanol
(1 ml) aufgelöst,
mit Kampfersulfonsäure
(5 mg) versetzt und die Mischung wurde bei 90°C für 5 Stunden gerührt. Nach
Abkühlen der
Lösung
wurde Toluol zugegeben und die Mischung unter reduziertem Druck
eingeengt, wobei überschüssiges 2-Chlorethanol
azeotrop abdestilliert wurde. Der Rückstand wurde mit Dichlormethan
verdünnt
und mit gesättigtem
Bicarbonatwasser gewaschen. Nach dem Trocknen der organischen Schicht über wasserfreiem Magnesiumsulfat
(15–30°C) wurde
sie unter reduziertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde mittels Silicagel-Säulenchromatografie
(Hexan/Ethylacetat = 2/1) gereinigt, wodurch 15 mg der Titelverbindung
erhalten wurden (Ausbeute: 23 %).
NMR (CDCl3,
270 MHz) δ:
7,88
(s, 1H), 7,32–6,93
(m, 13H), 6,79 (s, 1H), 4,96–4,91
(m, 1H), 3,97–3,46
(m, 10H), 2,98 (d, J = 14,5 Hz, 1H), 2,49 (d, J = 14,5 Hz, 1H),
2,30 (s, 3H), 2,23 (s, 3H)
-
SYNTHESEBEISPIEL 3
-
Racemische
Formen der Verbindungen (H) und (I) und eine optisch aktive Form
der Verbindung (I) wurden nach dem folgenden Verfahren synthetisiert.
-
Verbindung (H)
-
(3R)-1-(2,2-Diethoxyethyl)-3-(4-hydroxymethylphenyl)aminocarbonylmethyl-3-(N'-(4-methylphenyl)ureido)indolin-2-on:
-
(+)-1-(2,2-Diethoxyethyl)-3-hydroxycarbonylmethyl-3-(N'-(4-methylphenyl)ureido)indolin-2-on
(in Beispiel 174(1) von JP-A-7-48349 beschriebene Verbindung, 300
mg) wurde in Acetonitril (10 ml) aufgelöst, und nach Zugabe von p-Aminobenzylalkohol
(100 mg) und 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-hydrochlorid
(151 mg) in dieser Reihenfolge wurde die Mischung bei 15–30°C für 18 Stunden
gerührt.
Zu der Reaktionslösung
wurde Wasser zugegeben, die Extraktion mit Ethylacetat durchgeführt, die
organische Schicht mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und
das Lösungsmittel
abdestilliert. Die resultierende Reaktionsmischung wurde mittels
Säulenchromatografie
gereinigt, wodurch 324 mg der Titelverbindung erhalten wurden (Ausbeute:
88 %).
1H-NMR (CDCl3,
200 MHz) δ:
8,83
(s, 1H), 7,40–6,84
(m, 14H), 4,78 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 4,51 (s, 2H), 3,99 (dd, J =
5,9, 14,2 Hz, 1H), 3,83-3,34 (m,
5H), 2,90 (d, J = 15,2 Hz, 1H), 2,67 (breites s, 1H), 2,60 (d, J
= 15,2 Hz, 1H), 1,15 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1,10 (t, J = 6,9 Hz, 3H)
IR
(KBr, cm–1)
3330,
2980, 1708, 1671, 1610, 1533, 1478, 1464, 1412, 1375, 1310, 1248,
1209, 1125, 1059, 818, 751, 475
MS (EI, 70 eV)
m/e = 560
(M+), 514, 486, 453
-
Harnstoff-Zwischenprodukt:
-
3-(N'-(4-t-Butyldimethylsilyloxymethylphenyl)ureido)-1-(2,2-diethoxyethyl)indolin-2-on:
-
Eine
Dichlormethanlösung,
die p-Aminobenzyl-t-butyldimethylsilylether
(1,63 g) enthielt, wurde langsam tropfenweise zu einer Dichlormethanlösung von
Triphosgen (681 mg) bei 15–30°C zugegeben
und dann wurde eine Triethylamin (1,92 ml) enthaltende Dichlormethanlösung zugegeben
und die Mischung wurde für
1 Stunde gerührt,
wodurch eine Dichlormethanlösung
hergestellt wurde, die eine Isocyanatverbindung enthielt.
-
1-(2,2-Diethoxyethyl)-3-(hydroxyimino)indolin-2-on
(Verbindung, die als Zwischenprodukt in Beispiel 28 von JP-A-7-48349
genannt ist, 2,014 g) wurde in Methanol aufgelöst, dann wurden 10 % Pd-Kohlenstoff zugegeben
und die Mischung wurde für
4 Stunden in einer Wasserstoffatmosphäre bei 15–30°C gerührt. Nach Filtration der Reaktionsmischung
zur Entfernung des Pd-Kohlenstoffs wurde das Filtrat eingeengt.
Der Rückstand
wurde in Dichlormethan aufgelöst
und dann auf Eis zu der bereits hergestellten Diisocyanatverbindung enthaltenden
Dichlormethanlösung
zugegeben. Nach Rühren
bei der gleichen Temperatur für
1 Stunde wurde Wasser zu der Reaktionslösung zugegeben, mit Dichlormethan
extrahiert, die organische Schicht wurde mit wasserfreiem Natriumhydrogensulfat
getrocknet und das Lösungsmittel
abdestilliert. Die Reaktionsmischung wurde mittels Säulenchromatografie
gereinigt, wodurch 2,454 g der Titelverbindung erhalten wurden (Ausbeute:
68 %).
NMR (CDCl3, 200 MHz) δ:
7,58
(breites s, 1H), 7,44–6,95
(m, 9H), 6,03 (breites d, J = 5,7 Hz, 1H), 5,21 (d, J = 6,6 Hz,
1H), 4,70 (t, J = 5,1 Hz, 1H), 4,63 (s, 2H), 3,96 (dd, J = 5,1 Hz,
13,7 Hz, 1H), 3,83–3,42
(m, 5H), 1,15 (t, J = 6,9 Hz, 6H), 0,94 (s, 9H), 0,09 (s, 6H)
-
Amid-Zwischenprodukt:
-
3-(N'-(4-t-Butyldimethylsilyloxymethylphenyl)ureido-1-(2,2-diethoxyethyl)-3-((4-methylphenyl)aminocarbonylmethyl-2-on:
-
3-(N'-(4-t-Butyldimethylsilyloxymethylphenyl)ureido-1-(2,2-diethoxyethyl)indolin-2-on
(1 g) wurde in Dimethylformamid (15 ml) aufgelöst, bei 15–30°C mit Kalium-t-butoxid (237
mg) versetzt und nach 1-minütigem
Rühren
wurde N-p-Tolyl-2-bromacetamid (460 mg) zugegeben. Nach 15-minütigem Rühren wurde
Wasser zugegeben, mit Ethylacetat extrahiert, die organische Schicht
mit wasserfreiem Natriumhydrogensulfat getrocknet und das Lösungsmittel
abdestilliert. Die Reaktionsmischung wurde durch Silicagel-Säulenchromatografie
gereinigt, wodurch 939 mg der Titelverbindung erhalten wurden (Ausbeute:
73 %).
1H-NMR (CDCl3,
200 MHz) δ:
8,52
(s, 1H), 7,40–6,92
(m, 14H), 4,78 (t, J = 5,7 Hz, 1H), 4,60 (s, 2H), 4,02 (dd, J =
5,7 Hz, 14,9 Hz, 1H), 3,87–3,46
(m, 5H), 3,00 (d, J = 14,9 Hz, 1H), 2,67 (d, J = 14,9 Hz, 1H), 2,30
(s, 3H), 1,17 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 1,13 (t, J = 7, 4 Hz, 3H), 0,92
(s, 9H), 0,06 (s, 6H)
-
Verbindung (I) (racemische
Form):
-
1-(2,2-Diethoxyethyl)-3-(N'-(4-hydroxymethylphenyl)ureido)-3-((4-methylphenyl)aminocarbonylmethyl)indolin-2-on:
-
3-(N'-(4-t-Butyldimethylsilyloxymethylphenyl)ureido)-1-(2,2-diethoxyethyl)-3-((4-methylphenyl)aminocarbonylmethyl)indolin-2-on
(308 mg) wurde in Ethanol (15 ml) aufgelöst, mit konzentrierter Schwefelsäure (10 mg)
versetzt und dann wurde die Mischung für 1 Stunde bei 15–30°C gerührt. Zu
der Reaktionslösung
wurde Wasser zugegeben und dann wurde mit Ethylacetat extrahiert,
die organische Schicht mit wasserfreiem Natriumhydrogensulfat getrocknet
und das Lösungsmittel
abdestilliert. Die Reaktionsmischung wurde mittels Silicagel-Säulenchromatografie gereinigt,
wodurch 225 mg der Titelverbindung erhalten wurden (Ausbeute: 88
%).
1H-NMR (CDCl3,
270 MHz) δ:
8,13
(s, 1H), 7,37–6,90
(m, 14H), 4,79 (breites s, 1H), 4,50 (s, 2H), 4,01 (dd, J = 5,9
Hz, 14,5 Hz, 1H), 3,86-3,46 (m,
6H), 2,96 (d, J = 14,8 Hz, 1H), 2,53 (d, J = 14,8 Hz, 1H), 2,29
(s, 3H), 1,16 (t, J = 7,3 Hz, 3H), 1,11 (t, J = 6, 9 Hz, 3H)
IR
(KBr, cm–1):
3365,
3000, 1717, 1702, 1621, 1545, 1521, 1498, 1480, 1420, 1388, 1321,
1263, 1137, 1069, 831, 763, 515, 484
MS (EI, 70 eV)
m/e
= 560 (M+), 515, 392, 365, 306, 292
-
Ester-Zwischenprodukt:
-
1-(2,2-Diethoxyethyl)-3-(N'-(4-t-butyldimethylsilyloxymethylphenyl)ureido)-3-((L-menthoxy)carbonylmethyl)indolin-2-on:
-
Eine
Hexanlösung,
die ein Äquivalent
n-Butyllithium enthielt (1,68 M, 1,0 ml) wurde langsam zu einer trockenen
Tetrahydrofuranlösung
(20 ml), die 3-(N'-(4-t-Butyldimethylsilyloxymethylphenyl)ureido)-1-(2,2-diethoxyethyl)indolin-2-on
(936 mg) enthielt, unter Eiskühlung
in einem Stickstoffstrom zugegeben und nach 10-minütigem Rühren der
Mischung bei der gleichen Temperatur wurde tropfenweise eine trockene
Tetrahydrofuranlösung
(10 ml), die L-Menthylbromacetat (542 mg) enthielt, zugegeben. Nach
Rühren
der Mischung bei 0°C
für 8 Stunden
wurde sie in Salzwasser gegossen und dann wurde mit Ethylacetat
extrahiert. Die organische Schicht wurde über wasserfreiem Natriumsulfat
getrocknet und dann eingeengt und der Rückstand wurde mittels Silicagel-Säulenchromatografie
(Elution mit Hexan/Ethylacetat = 3/1) gereinigt und aus Methanol/Wasser
umkristallisiert, wodurch 357 mg der Titelverbindung erhalten wurden
(Ausbeute: 28 %).
1H-NMR (CDCl3, 270 MHz) δ:
7,30–6,97 (m, 8H), 6,81 (brs, 1H),
6,76 (brs, 1H), 4,74 (dd, J = 5,7 Hz, 4,9 Hz, 1H), 4,69–4,61 (m,
3H),3,94 (dd, J = 6,9 Hz, 14,2 Hz, 1H), 3,86–3,49 (m, 5H), 2,99 (d, J =
15,2 Hz, 1H), 2,59 (d, J = 15,2 Hz, 1H), 1,92–1,90 (brs, 1H), 1,21–1,10 (m,
6H), 0,92 (s, 9H), 1,36–0,65
(m, 18H), 0,065 (s, 6H)
-
Verbindung (2) (optisch
aktive Form):
-
1-(2,2-Diethoxyethyl)-3-(N'-(4-hydroxymethylphenyl)ureido)-3-((4-methylphenyl)aminocarbonylmethyl)indolin-2-on:
-
Eine
wässrige
Kaliumhydroxidlösung
(1 N, 1,36 ml) wurde zu einer Ethanollösung (8 ml), die 1-(2,2-Diethoxyethyl)-3-(N'-(4-t-butyldimethylsilyloxymethylphenyl)ureido)-3-((L-menthoxy)carbonylmethyl)indolin-2-on
(293 mg) enthielt, bei 15–30°C zugegeben
und nach 4-stündigem
Rühren
der Mischung bei 70°C wurde
diese eingeengt. Nach Zugabe von Wasser zu dem Rückstand und Waschen mit Chloroform
wurde zur Ansäuerung
2 N Salzsäure
zugegeben. Der resultierende unlösliche
Anteil wurde mit Ethylacetat extrahiert und nach Waschen der organischen
Schicht mit Kochsalzlösung
wurde sie über
wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingeengt, wodurch 234
mg 1-(2,2-Diethoxyethyl)-3-hydroxycarbonylmethyl-3-(N'-(4-hydroxymethylphenyl)ureido)indolin-2-on
(Carbonsäure-Zwischenprodukt)
als Rohprodukt erhalten wurden.
-
Das
Carbonsäure-Zwischenprodukt
(234 mg) wurde in Dichlormethan (10 ml) aufgelöst und in dieser Reihenfolge
mit 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimidhydrochlorid (131
mg) und p-Toluidin (73 mg) versetzt. Die Mischung wurde bei 15–30°C für 18 Stunden
gerührt
und dann eingeengt. Nach Verdünnen
des Rückstands
mit Ethylacetat und Waschen mit verdünnter Salzsäure und gesättigtem Bicarbonatwasser wurde er über wasserfreiem
Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Das Rohprodukt wurde mittels
Silicagel-Säulenchromatografie
(Elution mit Hexan/Ethylacetat = 2/1) gereinigt, wodurch 204 mg
eines weissen Pulvers erhalten wurden (90 % ee, 80 % Ausbeute, bezogen
auf das Ester-Zwischenprodukt).
-
Ein
140 mg-Anteil dieses Pulvers wurde mittels präparativer HPLC unter Verwendung
einer optisch aktiven Säule
gereinigt, wodurch die R-Form (117 mg, [α]D 26 = 94°,
C = 1,014/MeOH) und die S-Form (7 mg) erhalten wurden.
-
Trennbedingungen:
-
- Säule:
SUMICHIRAL OA-4800
- 20 mm Durchmesser × 25
cm Länge
- Nachweiswellenlänge:
UV 254 nm
- Flussgeschwindigkeit: 20 ml/min
- Lösungsmittel:
Hexan/1,2-Dichlorethan/Methanol = 75/22/3
- Retentionszeit: S-Form 24 Minuten, R-Form 40 Minuten
-
BEISPIEL 1
-
Knorpelbildungsfördernde
Wirkung bei oraler Verabreichung bei gesunden Ratten:
-
Die
im obigen Synthesebeispiel 1 erhaltene Verbindung (A) wurde in einer
3 %-igen Gummi arabicum-Lösung
suspendiert und 6 Wochen alten männlichen
SD-Ratten (Nihon SLC Corp./ Nihon Charles River Corp.) in einer
Dosierung von 2 g/kg/Tag über
4 Wochen verabreicht.
-
Dann
wurde jede Ratte autopsiert, die Ohrmuschel, die Luftröhre, das
Brustbein, die Oberschenkel/Unterschenkel-Knieverbindung und Lendenwirbel (Scheibe)
für 1 Woche
in 20 % Neutralpuffer-Formalin (Wako Pure Chemical Industries Co.,
Ltd.) eingelegt und fixiert, das Brustbein, die Oberschenkel/Unterschenkel-Knieverbindung
und Lendenwirbel (Scheibe) wurde dann für 2 Wochen mit einer 20 %-igen
EDTA-4Na-Lösung
(pH 7,4, Wako Pure Chemical Industries) demineralisiert und die
Beobachtungsstellen wurden mit einer Schneidklinge (Feather Co.,
Ltd.) geschnitten. Aus der Ohrmuschel und der Luftröhre wurden
ohne Demineralisierung Beobachtungsstellen mittels einer Schneidklinge
ausgeschnitten.
-
Jede
der ausgeschnittenen Gewebeproben wurde unter Verwendung einer automatischen
Einbettungsvorrichtung (Sakura Corp.) und Paraffin (äquivalente
Mischung von Produkten von Kokusan Kagaku Corp. und Fisher Scientific
Corp.) zu einem in Paraffin eingebetteten Block verarbeitet. Hierbei
wurde ein automatisches Paraffinabgabe-Einbettungszentrum (Miles
Scientific Corp.) zur Fixierung jedes Paraffinblocks in einer Gewebeprobekassette
(TISSUE-TEK Corp.) verwendet.
-
Der
Paraffinblock wurde zu 2 μm
dicken Abschnitten unter Verwendung eines Mikrotoms (Daiwa Optical
Instruments Corp.) und Mikrotommessers (Feather Co., Ltd.) geschnitten
und dann auf Objektträgern (Matsunami
Glass Corp.) befestigt und getrocknet. Nach dem Trocknen wurden
die Abschnitte zur Entfernung des Paraffins in Xylol und dann in
eine schrittweise Verdünnungsreihe
von Ethanol zu Wasser eingetaucht und dann in Wasser gelagert. Die
Abschnitte wurden mit 0,2 % Hämatoxylin
und 0,1 % Eosin (beide von Merck Co., Ltd.) eingefärbt und
dann mit einem Montagemittel (Takefuji Chemical Co., Ltd.) und einem
Abdeckglas (Matsunami Glass Corp.) montiert und unter einem Mikroskop
beobachtet (Vergrösserung:
10-fach-Objektlinse, hergestellt
von Nihon Kogaku Corp.). Der Oberschenkelstreifen wurde mit 0,3
% Safranin O (Merck Co., Ltd.) für
die histochemische Analyse der geförderten Bildung von Hyalinknorpel
eingefärbt
und in der gleichen Weise unter einem Mikroskop beobachtet (Vergrösserung:
10-fach-Objektlinse). Die Ergebnisse sind in den Photomikrographen
der 1A bis 5A und 1B bis 5B gezeigt.
-
Wie
aus diesen Photomikrographen, die nach dem Färben gemacht wurden, klar ersichtlich
ist, wurde in den Trägerkontrollgruppen
(Ratten, denen nur 3 % Gummi arabicum oral verabreicht worden war)
keine knorpelbildungsfördernde
Wirkung gefunden (1A, 2A, 3A, 4A und 5A),
wohingegen alle Ratten in der Gruppe, der die "Verbindung (A)" verabreicht worden war, in allen Organen
eine beschleunigte Hyalinknorpelbildung zeigte (1B, 2B, 3B, 4B und 5B).
-
Die
Ergebnisse des Experiments bestätigten,
das die Verbindung (A) eine in-vivo-knorpelbildungsfördernde
Wirkung zeigt.
-
BEISPIEL 2
-
Knorpelbildungsfördernde
Wirkung bei Verabreichung in Rattenkniegelenke:
-
Eine
27G-Injektionsnadel und eine 1 ml-Spritze (beide von Terumo Corp.)
wurden zur Verabreichung von 1 mmol/l der "Verbindung (A)" [gelöst in 50 % DMSO (Dimethylsulfoxid)physiologischer
Kochsalzlösung; DMSO
von Junsei Chemical Corp.; physiologische Kochsalzlösung von
Otsuka Pharmaceutical Corp.) in das rechte Kniegelenk von 10 Wochen
alten männlichen
SD-Ratten (Nihon Charles River Corp.) in einer Dosis von 50 μl pro Tag über 3 Wochen
verwendet.
-
Einer
anderen Testgruppe wurde 50 % DMSO-physiologische Kochsalzlösung (von
Junsei Chemical Corp. bzw. Otsuka Pharmaceutical Corp.) in der gleichen
Weise als Trägerkontrolle
verabreicht.
-
Nach
3-wöchiger
täglicher
Verabreichung wurden die Ratten autopsiert und der Abstand zwischen
den lateralen und medialen Befestigungsorten des kollateralen Ligaments
des rechten Oberschenkels wurden mit Schieblehren (Mitsutoyo Corp.)
zur Bestimmung der Breite der Oberschenkel-Knieverbindung gemessen. Dann wurden
in der gleichen weise wie in Beispiel 1 Gewebeproben hergestellt
und mit 0,3 Safranin O (Merck Co., Ltd.) eingefärbt und unter einem Mikroskop
beobachtet (Vergrösserung:
10-fach-Objektlinse, hergestellt von Nihon Kogaku Corp.). Die Ergebnisse
sind in den 6, 7A und 7B gezeigt.
-
Wie 6 zeigt,
waren die Oberschenkelkniegelenksbreiten in der Gruppe, der die
Verbindung (A) verabreicht worden war, signifikant grösser als
in der Trägerkontrollgruppe.
Wie in den 7A und 7B gezeigt,
ergab die histologische Beobachtung eine Safranin O-positiv beschleunigte
Bildung von Knorpelgewebe.
-
Die
Ergebnisse des Experiments bestätigten,
das die Verbindung (A) auch bei lokaler Verabreichung, wie beispielsweise
intraartikulärer
Injektion, eine knorpelbildungsfördernde
Wirkung zeigt.
-
BEISPIEL 3
-
Wirkung der Verbindung
(A) auf Rattenprimärkultur-Gelenkchondrozyten:
-
Unter
Verwendung eines Skalpells wurden aus der Oberschenkel-Knieverbindung
von 6 Wochen alten männlichen SD-Ratten
(Nikon SLC Corp.) Gelenkchondrozyten ausgeschnitten und dann in
0,3 % Kollagenase (Worthington Corp.) digeriert und kultiviert (Calcif.
Tissue Int. 19:179–187,
1975).
-
Die
isolierten Gelenkchondrozyten wurden zur Messung der Glycosaminglycansynthese
in der Knorpelmatrix durch Messung der Aufnahme von 35S-markierter
Schwefelsäure
(Amersham Co., Ltd.) in Glycosaminoglycan verwendet. Genauer wurden
die Gelenkchondrozyten in einer 96-Quellen-Zellkulturplatte (Falcon Corp.) auf
eine Zelldichte von 10.000 pro Quellen kultiviert. Das verwendete
Medium war einen äquivalente Mischung
aus Dulbecco MEM, das Rinderfötusserum
(Endkonzentration: 10 %), 100 U/ml Penicillin (Meiji Seika Corp.,
Ltd.) und 100 μg/ml
Streptomycin (Banyu Pharmaceutical Corp.) enthielt, und Ham G-12-Medium (beide
von Gibco Corp.).
-
Als
die Chondrozyten Konfluenz erreichten, wurde das Medium durch ein
solches ausgetauscht, das eine Serumkonzentration von 0,3 % aufwies,
und die Kultivierung wurde über
Nacht fortgeführt,
wonach das Medium durch den gleichen Typ ausgetauscht wurde, der
ferner 10 μmol/l
der Verbindung (A) enthielt, und dann wurde nach 3 Stunden 35S-markierte Schwefelsäure (Amersham Co., Ltd.) in
einer Menge von 0,5 μCi pro
Quelle zugegeben und die Kultivierung wurde für 24 Stunden fortgeführt. Dann
wurde das Medium in eine 24-Quellen-Platte aufgenommen und bei 4°C gelagert.
Die Zellschicht wurde bei 37°C über Nacht
(16 Stunden) durch Zugabe von 0,1 ml 2 mg/ml Actinase E (Kaken Pharmaceutical
Co., Ltd.) pro Quelle digeriert. Am folgenden Tag wurde die digerierte
Zellschicht mit dem gelagerten Medium vereinigt, und nach Zugabe
von 0,1 ml 0,1 mg/ml Chondroitinsulfat C (Sigma Corp.), 0,5 ml 2
mmol/l MgSO4 (Wako Pure Chemical Industries),
0,5 ml 0,2 mol/l Tris/HCl (Sigma Corp.) und 0,5 ml 1 % Cetylpyridiniumchlorid
(aufgelöst
in 20 mmol/l Natriumchloridlösung
(Wako Pure Chemical Industries) wurde die Mischung bei 37C für 2 Stunden
stehengelassen. Die Probe wurde dann mit Glasfaser-Filterpapier
(Toyo Filter Paper Corp.) filtriert, das Filterpapier dreimal mit
2 ml % Cetylpyridiniumchlorid (20 mmol/l) gewaschen, jeweils eines
wurde in ein Flüssigszintillations-Zählfläschchen
(Packard Corp.) plaziert, 10 ml Szintillator (Nacalai Tesque Corp.)
wurde eingegossen und die Radioaktivität wurde mittels eines Flüssigszintillationszählers (Packard
Corp.) gemessen.
-
Die
Aufnahme von 3H-markiertem Thymidin (Amersham
Corp.) wurde zur Bestimmung des Zellwachstums gemessen. Zur Messung
wurden die isolierten Gelenkchondrozyten in einer 96-Quellen-Zellkulturplatte (Falcon
Corp.) auf eine Zelldichte von 10.000 pro Vertiefung kultiviert.
Das verwendete Medium war eine äquivalente
Mischung aus Dulbecco MEM, das Rinderfötusserum (Endkonzentration:
10 %), 100 U/ml Penicillin (Meiji Seika Co., ltd.) und 100 μg/ml Streptomycin
(Banyu Pharmaceutical Corp.) enthielt, und Ham F-12-Medium (beide
von Gibco Corp.) enthielt. Nachdem 60–70 % der Zellen Konfluenz
erreicht hatten, wurde das Medium durch ein solches ausgetauscht,
das eine Rinderfötusserumkonzentration
von 0,3 % aufwies, und die Kultivierung wurde über Nacht fortgeführt. Am
folgenden Tag wurde das Medium durch den gleichen Typ ausgetauscht,
der ferner die Verbindung (A) in eine Endkonzentration von 0,1,
1,0 oder 10 μmol/l
und 0,3 % Rinderfötusserum
enthielt. Nach 24 Stunden wurde 3H-markiertes
Thymidin (Amersham Co., Ltd.) in einer Menge von 1 μCi pro Quelle
zugegeben und die Kultivierung wurde für 4 Stunden fortgeführt und
dann wurde das Medium verworfen und es wurde eine Zellaufnahmevorrichtung (Skatron
Corp.) zur Aufnahme der Zellschicht auf Szintillationszähler-Glasfaserfilterpapier
(Wallac Corp.) verwendet. Das Filterpapier wurde mit Plasticszintillator
(Wallac Corp.) getränkt
und die Radioaktivität
wurde mit einem Szintillationszähler
(Wallac Corp.) gemessen. Die Ergebnisse sind in den Graphen der 8 und 9 gezeigt.
-
Die
Aufnahme von 35S-markierter Schwefelsäure wurde
durch die Zugabe von 0,1 μmol/l
der Verbindung (A), bezogen auf das Ethanol in 1 % Endkonzentration
in dem Medium als Kontrollösungsmittel,
signifikant erhöht.
Die Aufnahme von 3H-markiertem Thymidin
wurde ebenfalls durch die Zugabe von 10 μmol der Verbindung (A) in bezug
auf das Kontrollösungsmittel
signifikant erhöht.
Diese Ergebnisse bestätigten,
dass die Verbindung (A) eine Wirkung der Verstärkung der Knorpelmatrixsynthese
und des Chondrozytenwachstums zeigt. Die Knorpelbildungsförderer der
allgemeinen Formel (I) können
auch als Mittel zur Förderung
der extrazellulären
Matrixsynthese und Wachstumseigenschaften von Chondrozyten vor oder
nach der Chondrozytentransplantation, wie beispielsweise autogener
Chondrozytentransplantation, verwendet werden.
-
BEISPIEL 4
-
Wirkung der Verbindung
(A) auf die Differenzierung der gemeinsam Mauschondrozyten und Adipozyten-Vorläuferzellinie
(CL-1) zu Chondrozyten:
-
Chondrozyten
aus normalen erwachsenen Mäusen
und die Adipozyten-Zellinie CL-1 (WO 98/39414) wurden in einem 4-Quellen-Kammerobjektträger (Nunc
Corp.) auf eine Zelldichte von 5.000/cm2 kultiviert.
Das verwendete Medium war α-MEM
(Gibco Corp.), das 100 U/ml Penicillin (Meiji Seika Co., Ltd.),
100 μg/ml
Streptomycin (Banyu Pharmaceutical Corp.) und 10 % Rinderfötusserum
(Intergen Corp.) enthielt. Als die CL-1-Zellen Konfluenz erreichten,
wurde die Verbindung (A) in einer Endkonzentration von 10 μmol/l zugegeben,
mit weiterer Zugabe, wenn das Medium dreimal wöchentlich während der Kultivierung für 7 Tage
ausgetauscht wurde.
-
Ferner
wurde ein Objektträger
mit Ethanol (Junsei Chemical Corp.) in einer Endkonzentration von
1 % im Medium als Trägerkontrolle
hergestellt. Am 7. Tag nach Konfluenz wurden die Platten aufgenommen,
die CL-1-Zellschicht wurde mit Alcianblau und Ölrot O doppeltgefärbt und
die Differenzierung in Chondrozyten oder Adipozyten wurde beobachtet.
Nach Beendigung der Kultivierung wurde die Zellschicht für 1 Stunde
bei Raumtemperatur mit einer 4 % p-Formaldehydlösung (Wako Pure Chemical Industries)
fixiert und dann mit 0,1 N Salz gewaschen und über Nacht mit einer wässrigen
Lösung
(pH 1,0) von 1 % Alcianblau (EM Science Corp.) gefärbt. Dann
wurde mit 0,1 N Salzsäure
und destilliertem Wasser gewaschen und dann für 1 Minute mit einer wässrigen
Lösung
von 35 % Propylenglykol (Nacalai Tesque Corp.) behandelt und für 30 Minuten
in einer wässrigen
Propylenglykollösung,
die 0,5 % Ölrot
O (Merck Co., Ltd.) enthielt, gefärbt. Dem anschliessenden Waschen
mit einer 85 %-igen wässrigen
Propylenglykollösung
folgte Waschen mit destilliertem Wasser. Die Kerne wurden dann für 5 Minuten
mit einer wässrigen
0,3 %-igen Kernechtrotlösung
(Merck Co., Ltd.) gefärbt.
Die Ergebnisse sind in den Photomikrographen der 10A und 10B gezeigt.
Die Differenzierung von CL-1 in Chondrozyten und Adipozyten beginnt
nach dem Erreichen der Konfluenz der Zellen, und unter herkömmlichen
Kultivierungsbedingungen differenzieren etwa 70 % der Zellen zu Ölrot O-positiven
Adipozyten, während
etwa 30 % der Zellen zu Alcianblau-positiven Chondrozyten differenzieren.
In den 10A und 10B stellen
die dunklen Punkte Fetttröpfchen
in dem Ölrot
O-positiven Fett und die dunkelgrauen Bereiche die Alcianblau-positive
Knorpelmatrix dar.
-
Wie
aus dem Photomikrographen nach dem Einfärben in 10B ersichtlich
ist, förderte
die Verbindung (A) deutlich die Differenzierung von CL-1 zu Chondrozyten
und unterdrückte
die Differenzierung zu Adipozyten im Vergleich zur Trägerkontrolle
(10A).
-
BEISPIEL 5
-
Wirkungen der Verbindungen
(A), (B), (C), (D), (E), (F) und (G) auf die Aufnahme von 35S-markierter Schwefelsäure in die gemeinsame Mauschondrozyten-
und -adipozyten-Vorläuferzellinie
(CL-1):
-
Die
oben genannte Zellinie CL-1 wurde in einer 96-Quellen-Zellkulturplatte
(Wallac Corp.) für
einen Flüssigszintillationszähler (Wallac
Corp.) auf eine Zelldichte von 1.000/Quelle kultiviert. Das verwendete
Medium war α-MEM
(Gibco Corp.), das 100 U/ml Penicillin (Meiji Seika Co., Ltd.),
100 μg/ml
Streptomycin (Banyu Pharmaceutical Corp.) und 10 % Rinderfötusserum
(Intergen. Corp.) enthielt. Als die CL-1-Zellen Konfluenz erreichten,
wurde das Medium durch ein solches ausgetauscht, das 10 μmol/l der
Verbindungen (A), (B), (C), (D), (E), (F) und (G) enthielt, und
nach 24 Stunden wurde 35S-markierte Schwefelsäure in einer
Menge von 0,5 μCi
pro Quelle zugegeben und die Kultivierung wurde fortgeführt. Für die Verbindungen
(A) und (F) wurde auch ein Medium mit einer Konzentration von 1
oder 5 μmol/l
hergestellt. Nach 24 Stunden wurde das Medium verworfen und die
Zellschicht wurde für
2 Stunden bei Raumtemperatur unter Verwendung von 0,2 ml 5 % p-Formaldehyd
[0,1 mol/l Phosphatpufferlösung
(pH 7,4, Wako Pure Chemical Industries), die 0,4 % Cetylpyridiniumchlorid
(Wako Pure Chemical Industries) enthielt] fixiert. Nach dem Verwerfen
der Fixierlösung
wurde einmal mit der gleichen Lösung
gewaschen und die Waschlösung
wurde verworfen. Nach Zugabe von 0,1 ml Szintillator (Wallac Corp.)
zu der Zellschicht und Rühren
wurde die Radioaktivität
mit einem Szintillationszähler
(Wallac Corp.) gemessen. Die Ergebnisse sind in den 11 und 12 gezeigt.
-
Diese
Ergebnisse zeigten, dass die Verbindungen (A), (B), (C), (D), (E),
(F) und (G) eindeutig die Differenzierung von CL-1 zu Chondrozyten
förderten
und die Differenzierung zu Adipozyten unterdrückten. Die Ergebnisse zeigen
ferner, dass die Knorpelbildungsförderer der allgemeinen Formel
(I) als Mittel zur Induzierung der Differenzierung multipotenter
undifferenzierter Mesenchymalzellen (beispielsweise Zellen mit einem Differenzierungszustand ähnlich CL-1)
zu Chondrozyten zur Behandlung von Knorpelerkrankungen, die Knorpeltransplantation
beinhalten, und dergleichen verwendet werden können.
-
BEISPIEL 6
-
Knorpelreparaturwirkung
der Verbindung (A) in in voller Dicker knorpeldefizienten Rattenmodellen:
-
Ein
Kirschnerdraht mit einem Durchmesser von 2,4 mm (Mizuho Medical
Instruments Corp.) wurde zur Erzeugung einer 2,5 mm tiefen Fehlstelle
in der rechten Oberschenkelpatellaroberfläche unter Erreichen des Knochenmarks
bei 10 Wochen alten männlichen
CD-Ratten (Nihon Charles River Co., Ltd.) verwendet. Ab dem 7. Tag
nach der Operation wurden für
3 Wochen einmal täglich
50 μl einer
50 %-igen Dimethylsulfoxid (DMSO)-physiologischen Kochsalzlösung als
ein Lösungsmittel
(DMSO: Junsei Chemical Corp.; physiologische Kochsalzlösung: Otsuka
Pharmaceutical Corp.) oder eine 1,0 mmol/l Lösung der Verbindung (A) in
das rechte Kniegelenk verabreicht. Die Tagesdosis der Verbindung
(A) betrug 81,7 μg.
-
An
dem Tag, der auf den Tag der letzten Verabreichung folgte, wurde
der rechte Oberschenkel abgenommen und für 1 Woche in 20 % neutralgepuffertem
Formaldehyd (Wako Pure Chemical Industries) fixiert und dann für 2 Wochen
mit 20 % EDTA-4Na-Lösung
(pH 7,4, Wako Pure Chemical Industries) demineralisiert und dann
wurde der defiziente Bereich mit einer Schneidklinge (Feather Co.,
Ltd.) ausgeschnitten. Der ausgeschnittene Bereich wurde unter Verwendung
einer automatischen Einbettungsvorrichtung (Sakura Corp.) und Paraffin
(äquivalente
Mischung von Produkten von Kokusan Kagako Corp. und Fisher Scientific
Corp.) der Einarbeitung in einen Paraffinblock unterworfen. Hierbei
wurde ein automatisches Paraffinabgabe-Einbettungszentrum (Miles
Scientific Corp.) zur Fixierung jedes Paraffinblocks in einer Gewebeprobekassette
(TISSUE-TEK Corp.) verwendet.
-
Jeder
Paraffinblock wurde unter Verwendung eines Mikrotoms (Daiwa Optical
Instruments Corp.) und eines Mikrotommessers (Feather Co., Ltd.)
in 2 μm
dicke Abschnitte geschnitten und dann auf einem Objektträger (Matsunami
Glass Corp.) befestigt und getrocknet. Nach dem Trocknen wurden
die Abschnitte zur Entfernung des Paraffins in Xylol und dann in
einer schrittweisen Verdünnungsreihe
von Ethanol zu Wasser eingetaucht und dann in Wasser gelagert. Die
Abschnitte wurden mit 0,3 Safranin O (Merck Co., Ltd.) eingefärbt und
mit einem Mikroskop beobachtet (Vergrösserung: 10-fach-Objektlinse)
und eine histologische Bewertung wurde gemäss einer Modifizierung des
Verfahrens von Wakitani et al. (J. Bone Joint Surg. 76-A, 579–592, 1994)
durchgeführt.
-
Die
histologischen Bewertungen der Trägerkontrollgruppe und der Gruppe,
der die Verbindung (A) verabreicht worden war, wurde auf Basis der
nachstehend in Tabelle 10 gezeigten Kriterien verglichen. In der Gruppe,
der nur die Verbindung (A) verabreicht worden war, wurde eine signifikante
Abnahme der Zellmorphologie und der Knorpeldicke (13A) und des Gesamtresultats (13B) im Vergleich zu der Gruppe, der nur das Lösungsmittel
verabreicht worden war, beobachtet. Wie in den 14A und 14B gezeigt,
zeigten die defizienten Bereiche eine Reparatur in dem Safranin
O-positiven knorpelartigen Gewebe. Diese experimentellen Ergebnisse
bestätigten,
dass die Verbindung (A) eine Knorpelreparaturwirkung bei Defekten
oder anderen Gelenkknorpelschädigungen
zeigt.
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BEISPIEL 7
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Pathologieunterdrückende Wirkung
der Verbindung (A) in einem Kaninchen-Osteoarthritismodell:
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Unter
Verwendung von 12 Wochen alten männlichen
NZW-Kaninchen (Kitayama
Labes Co., Ltd.) und Durchführung
einer teilweisen Menisektomie im rechten Knie und Ausschneiden des
Lateralkollateralligaments und des Sesamoidligaments nach dem Verfahren
von Colombo et al. (Arthritis Rheum. 26(7):875–886, 1983) wurde ein Kaninchen-Osteoarthritismodell
präpariert.
Beginnend am 7. Tag nach der Operation wurden 500 μl einer 50
%-igen Dimethylsulfoxid (DMSO)-physiologischen Kochsalzlösung (DMSO:
Junsei Chemical Corp., physiologische Kochsalzlösung: Otsuka Pharmaceutical
Corp.) oder 3 mmol/l einer Lösung
der Verbindung (A) einmal täglich
in das rechte Kniegelenk für
einen Zeitraum von 3 Wochen intraartikulär verabreicht. Die tägliche Dosis
der Verbindung (A) betrug 816,8 μg.
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An
dem Tag, der dem Tag der letzten Verabreichung folgte, wurden der
rechte distale Oberschenkelabschnitt und proximale Unterschenkelabschnitt
entnommen und der Oberschenkel wurde über Nacht in 2 % p-Formaldehyd-2,5
Glutaraldehyd-Fixierlösung
(beide von Wako Pure Chemical Industries) zur Fixierung eingetaucht,
während
der Unterschenkel für
1 Woche in 20 % neutralgepuffertes Formalin (Wako Pure Chemical Industries)
zur Fixierung eingelegt wurde.
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Nach
Postfixierung des distalen Oberschenkelabschnitts mit 1 % Osmiumlösung (Wako
Pure Chemical Industries) wurde er zur Entwässerung in eine Reihe von Lösungen mit
zunehmendem Ethanolgehalt eingetaucht, dann mit Isoamylacetat substituiert
und anschliessend mit einer Kritischer-Punkt-Trocknungsvorrichtung
(Hitachi Co., Ltd.) getrocknet. Die getrocknete Gewebeoberfläche wurde
unter Verwendung einer Ionensputter-Beschichtungsvorrichtung (Eiko
Corp.) mit Gold beschichtet und die Oberschenkelgelenkkopf-Knorpeloberfläche wurde
mit einem Rasterelektronenmikroskop (Hitachi Co., Ltd.) beobachtet
(15A und 15B).
Die Fläche
der beschädigten
Abschnitte des Gelenkknorpels in dem Elektronenphotomikrographen wurden
unter Verwendung einer IPAP-Bildanalysesoftware (Sumika Technoservice
Co., Ltd.) gemessen und anhand der nachstehend in Tabelle 11 angegebenen
Skala bewertet. Wie in den 16A, 16B und 16C gezeigt,
zeigte die Gruppe, der die Verbindung (A) alleine verabreicht wurde,
eine signifikant geringere Fläche
beschädigten
Gelenkknorpels im Vergleich zu der Gruppe, der nur das Lösungsmittel
verabreicht wurde, wie sich aus der Bewertung der Läsionsfläche mittleren
Grades und der Gesamtläsionsfläche ergibt.
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Der
proximale Unterschenkelabschnitt wurde mit einer Bandsäge (Exakt
Corp.) geschnitten und dann für
4 Wochen in eine 20 % EDTA-4Na-Lösung
(pH 7,4, Wako Pure Chemical Industries) eingelegt. Der ausgeschnittene
Abschnitt wurde unter Verwendung einer automatischen Einbettungsvorrichtung
(Sakura Corp.) und Paraffin (einer äquivalenten Mischung aus Produkten
von Kokusan Kagaku Corp. und Fisher Scientific Corp.) zu einem Paraffinblock
verarbeitet. Hierbei wurde ein Einbettungszentrum mit automatischer
Paraffinabgabe (Miles Scientific Corp.) zur Fixierung jedes Paraffinblocks
in einer Gewebeprobekassette (TISSUE-TEK Corp.) verwendet.
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Der
Paraffinblock wurde in 2 μm
dicke Abschnitte geschnitten, wobei ein Mikrotom (Daiwa Optical
Instruments Corp.)und ein Mikrotommesser (Feather Co., Ltd.) verwendet
wurden, und dann auf einem Objektträger (Matsunami Glass Corp.)
befestigt und getrocknet. Nach dem Trocknen wurden die Abschnitte
zur Entfernung des Paraffins in Xylol und dann in eine schrittweise
Verdünnungsreihe
von Ethanol zu Wasser eingetaucht und in Wasser gelagert. Die Abschnitte wurden
mit 0,3 % Safranin O (Merck Co., Ltd.) eingefärbt und dann unter einem Mikroskop
(Vergrösserung:
10-fach-Objektlinse)
beobachtet, und gemäss
der folgenden Tabelle 12 wurde eine histologische Bewertung vorgenommen,
die eine Modifizierung des Verfahrens von Kikuchi et al. darstellt
(Osteoarthritis, Cartilage 4, 99–110, 1996).
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Die
Gruppe, der nur Verbindung (A) verabreicht worden war, erzielte
eine signifikant geringere histologische Gesamtbewertung, mit Ausnahme
des Verlustes an Oberflächenschicht,
im Vergleich zu der Gruppe, der nur das Lösungsmittel verabreicht worden
war (17A und 17B).
Diese experimentellen Ergebnisse bestätigen, das die Verbindung (A)
eine die Knorpeldegenerierung bei Osteoarthritis und ähnlichen
Bedingungen unterdrückende
Wirkung zeigt.
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INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT:
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Wie
oben erläutert,
werden erfindungsgemäss
Knorpelbildungsfördermittel
und Knorpelreparaturmittel bereitgestellt, die als aktiven Bestandteil
Indolin-2-on-Derivate
mit spezifischen Strukturen oder deren Salze umfassen. Diese Knorpelbildungsfördermittel
fördern
die Knorpelbildung in Warmblütern,
einschliesslich Menschen, und es wird daher erwartet, dass sie als
exzellente therapeutische Mittel gegen Knorpelerkrankungen, wie
beispielsweise rheumatoide Arthritis oder Osteoarthritis oder Knorpelschäden durch
Verletzungen dienen können.
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Darüber hinaus
sind die erfindungsgemässen
Indolin-2-on-Derivate
mit knorpelbildungsfördernder Wirkung
auch als Reagenzien für
die biologische, physikalische oder chemische Forschung an Knorpel
nützlich.