JP2001503446A

JP2001503446A - 骨欠乏状態を治療するためのピペラジン誘導体

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Publication number: JP2001503446A
Application number: JP54267699A
Authority: JP
Inventors: アール．ピゴット，ジェイムス
Original assignee: ザイモジェネティクス，インコーポレイティド
Priority date: 1998-02-23
Filing date: 1999-02-17
Publication date: 2001-03-13
Also published as: US6268367B1; AU2768999A; WO1999042107A1; EP0977571A1; AU750816B2; CA2288178A1

Abstract

(57)【要約】骨粗しょう症、骨折又は骨の欠乏、原発生又は二次性副甲状腺機能亢進症、歯周疾患又は欠損、転移性の骨の疾患、溶骨性の骨の疾患、形成手術後、プロテーゼ接合手術後、及び歯の移植後を治療するのに役立つピペラジン誘導体。

Description

【発明の詳細な説明】骨欠乏状態を治療するためのピペラジン誘導体発明の背景骨は静的組織ではない。それは、新しい骨を作り出す骨芽細胞及び骨を破壊する破骨細胞により媒介される複合過程において一定の破壊及び再生にかけられる。これらの細胞の活性化は、その多くが現在同定され、クローン化されている多数のサイトカイン及び成長因子により制御される。Mundyは、現在のこれらの因子に関する知見を記述する(Mundy，Clin ．Orthop．324：24-28，1996；Mundy，J ．Bone Miner．Res ．8：8505-10，1993)。骨の破損及び吸収に作用する因子に関する利用できる多くの情報があるが、新しい骨の形成を刺激する成長因子に関する情報はより限定されている。研究者らはこのような活性の源について調査しており、骨組織自体が骨細胞を刺激する能力を有する因子のための貯蔵庫であることを見い出した。これにより、屠殺場から得られたウシの骨組織の抽出物は、骨の構造物一体性を維持する原因となる構造タンパク質ばかりでなく、骨細胞の増殖を刺激することができる生物学的に活性を骨の成長因子も含む。これらの因子の中には形質転換成長因子β−ヘパリン結合性成長因子（酸性及び塩基性繊維芽細胞成長因子）、インスリン様成長因子（インスリン様成長因子Ｉ及びインスリン様成長因子II）、骨形態発生タンパク質(BMP)と呼ばれる現在記載されるタンパク質のファミリーがある。これらの成長因子は全て、他の型の細胞及び骨細胞に効果を有する。 BMPは広大な形質転換成長因子βスーパーファミリーの中の新しい因子である。それらは最初に、Wozney J．ら(Science 242：15 28-34，1980)により、遺伝子クローニング技術を用いて、脱灰化骨の抽出物において生物活性をキャラクタライズする初期の記述(Urist，Science 150：893-99 ，1965)の後に同定された。組換えBMP２及びBMP４は、ラットの皮下組織内に局所的に注入した時に新しい骨の形成を誘導することができる(Wozney，Molec ．Re prod．Dev ．32：160-67，1992)。これらの因子は、それらが分化した時に正常な骨芽細胞により発現され、試験管内で骨芽細胞分化及び骨小節形成を、並びに生体内で骨形成を刺激することが示されている(Harrisら、J ．Bone．Miner．Res． 9：855-63，1994)。この後者の特性は、骨欠乏を生ずる病気において治療剤として潜在的に役立つことを示唆する。骨を形成する原因である細胞は骨芽細胞である。骨芽細胞が前駆体から成熟骨形成細胞に分化するにつれ、それらはいくつかの酵素及び骨マトリックスの構造タンパク質、たとえばＩ型コラーゲン、オステオカルシン、オステオポンチン及びアルカリホスファターゼを発現し、分泌する（Stein Gら、Curr ．Opin．Cell Biol ．2：1018-27，1990；Harris Sら(1994)、前掲）。それらは、骨マトリックス内に貯蔵され、おそらく正常な骨形成の原因であるいくつかの成長調節ペプチドも合成する。これらの成長調節ペプチドには、BMPがある（Harrisら、1994、前掲）。胎児ラット頭蓋冠骨芽細胞の一次培養物の研究において、BMP１，２，３，４、及び６は、脱灰化骨結節の形成の前に、培養された細胞によ発現される（Harrisら（1994）、前掲）。アルカリホスファターゼ、オステオカルシン及びオステオパンチンと同様に、BMPはそれらが増殖し、分化するにつれて培養された骨芽細胞により発現される。 BMPは試験管内及び生体内において骨形成の潜在的な刺激剤であるが、骨の治癒を増強するための治療剤として用いるのに欠点がある。骨形態発生タンパク質のためのレセプターが多くの組織内で同定されており、BMP自体は特定の一時的及び場所的パターンで多くの種々の組織内で発現される。このことは、BMPが骨以外の多くの組織への効果を有し得、全身に投与した時の治療剤としての有用性を潜在的に制限する。更に、それらはペプチドであるので、注入により投与されなければならない。これらの欠点は、治療剤としての BMPの開発にきびしい制限を課す。骨形成を増強することが必要であることを特徴とする多くの状態がある。おそらく、最も明白なのは骨折の場合である。この場合には、骨の成長を刺激すること並びに骨の修復を促進し、完了することが要求されよう。骨形成を増強する剤は、顔の再構成術にも役立つであろう。他の骨欠損状態には、骨分節欠損、歯周疾患、転移性の骨の疾患、溶骨性疾患、及び結合組織修飾が有益であろう状態、例えば軟骨欠損又は傷害の治癒又は再生がある。また、かなり重要なのは、骨粗しょう症の慢性状態、例えば老化関連の骨粗しょう症及び閉経期後ホルモン状態に関連する骨粗しょう症である。他の骨の成長を必要とすることを特徴とする状態には、原発性及び二次性副甲状腺機能亢進症、非活動性骨粗しょう症、糖尿病関連骨粗しよう症、及びグルココルチコイド関連骨粗しょう症がある。更に、又はあるいは、本発明の化合物は、正常又は異常細胞又は組織の代謝、増殖及び／又は分化を調節することができる。現在、これらの状態のいずれをも処理するための満足いく医薬物アプローチはない。骨折は、なお、キャスト、ブレス、固定具及び他の精密を機械的手段を用いて排他的に処理されている。閉経期後の骨粗しょう症に関連する更なる骨の悪化はエストロゲン又はビスホスホネートで削減され又は防止されている。米国特許第5,703,074号、5,670,535号及び5,061,704号は、骨の代謝において治療価値があるチオフェン化合物を開示する。これらのチオフェン化合物は、骨組織の欠乏を特徴とする病因、例えば骨粗しょう症、ページェット病、歯周炎及び慢性関節リウマチに役立つ。更に骨形成を刺激することが見い出されているいくつかのもの、特にＮ−（３，３−ジメチル５−（５−（３−ｐ −トリルプロピル）チオフェン−２−イル）ペンチル）Ｎ’−（２，３，４−トリメトキシベンジル）ピペラジンがある（Sabatiniら（J ．Bone Miner．Res．9 （Suppl 1）：S350，1995）。本発明は、不要な骨喪失又は骨成長の必要性を特徴とする状態を治療することにおいて、骨折を治療することにおいて、及び軟骨疾患を治療することにおいて、このような骨の喪失の危険を有する脊椎動物において不要な骨の喪失を抑制するのに用いるための方法に関する。これにより、本発明は、記述される化合物を用いて骨の疾患を治療するための方法に、及びこの使用のための医薬組成物に関する。発明の概要本発明は、脊椎動物において骨の形成を増加させるための方法であって、治療の必要な脊椎動物被検体に、所定量の式Ｉ：（式中、Ａ及びＢは各々独立して、アリール、置換化アリール、炭素環、置換化炭素環、ヘテロ環、置換化ヘテロ環、及びそれらの組合せからなる群から選択されるメンバーであり、ここで前記組合せは融合し又は共有結合しており、そして前記置換基は、ハロゲン、ハロアルキル、ヒドロキシ、アリールオキシ、ベンジルオキシ、アルコキシ、ハロアルコキシ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アシルオキシ、アシル、アルキル及びアリールからなる群から選択され；Ｒ¹及びＲ²は各々独立して、水素及び１〜６の炭素原子を有するアルキル基からなる群から選択されるか、又は一緒に、飽和もしくは不飽和５員環、飽和もしくは不飽和６員環及び飽和もしくは不飽和７員環からなる群から選択される環を形成し；Ｙ¹及びＹ²は各々独立して、単結合であるか、又は −CH₂−，−NHC(O)−，−NRC(O)−，−NHC(S)−，−NRC(S)−， −NHC(＝NH)−，−OC(O)−，−C(O)−、及び−C(S)− からなる群から選択される２価の基であり、ここでＲは１〜６の炭素原子の低級アルキル基であり；ｎは０〜４の整数である）の化合物を投与することを含む方法を供する。関連する実施形態において、前記化合物は、式：（式中、Ｙ¹及びＹ²は、各々独立して、 −CH₂−，−NHC(O)−，−NRC(O)−，−NHC(S)−，−NRC(S)−， −NHC(＝NH)−，−OC(O)−，−C(O)−、又は−C(S)− からなる群から選択される２価の基であり、ここでＲは１〜６の炭素原子の低級アルキル基であり；Ｓ¹¹，Ｓ¹²，Ｓ¹³，Ｓ¹⁴，Ｓ¹⁵、及びＳ¹⁶は各々独立して、水素、ハロゲン、ハロアルキル、ヒドロキシ、アリールオキシ、ベンジルオキシ、アルコキシ、ハロアルコキシ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アシルオキシ、アシル、アルキル及びアリールからなる群から選択されるメンバーである）を有する。Ｙ¹は−NHC(O)又は−CH₂−であり、Ｙ²は−CH₂−であり、そしてＳ¹¹，Ｓ¹²，Ｓ¹³，Ｓ¹⁴，Ｓ¹⁵、及びＳ¹⁶は各々独立して、水素、ハロゲン、ハロアルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロアルコキシ、アミノ、モノアルキルアミノ又はジアルキルアミノである。Ｓ¹¹，Ｓ¹²，Ｓ¹³，Ｓ¹⁴，Ｓ¹⁵、及びＳ¹⁶は各々独立して、水素、ハロゲン、トリフルオロメチル、ヒドロキシ及びメトキシからなる群から選択されるメンバーである。Ｙ¹は−NHC(O)又は−CH₂−であり、Ｙ²は−CH₂−であり、そしてＳ¹¹，Ｓ¹²，Ｓ¹³，Ｓ¹⁴，Ｓ¹⁵、及びＳ¹⁶は各々独立して、水素、ハロゲン、トリフルオロメチル、ヒドロキシ及びメトキシからなる群から選択されるメンバーである。他の実施形態において、前記被検体は、骨粗しょう症、骨折もしくは骨の欠乏、原発性もしくは二次性副甲状腺機能亢進症、歯周疾患もしくは欠損、転移性の骨の疾患、溶骨性の骨の疾患、形成手術後、プロテーゼ接合手術後、及び歯の移植後からなる群から選択される状態を特徴とする。関連する態様において、骨の成長を促進する又は骨の吸収を阻害する１又は複数の剤が被検体に投与される。前記剤は、骨形態発生因子、骨原因子、軟骨由来形態発生タンパク質、成長ホルモン、及び分化因子からなる群から選択される。別の態様において、本発明は、脊椎動物において骨の形成を増強するための医薬組成物であって、医薬として許容される賦形剤と、骨の形成を促進するために有効な量の式（Ｉ）：（式中、Ａ及びＢは各々独立して、アリール、置換化アリール、炭素環、置換化炭素環、ヘテロ環、置換化ヘテロ環、及びそれらの組合せからなる群から選択されるメンバーであり、ここで前記組合せは融合し又は共有結合しており、そして前記置換基は、ハロゲン、ハロアルキル、ヒドロキシ、アリールオキシ、ベンジルオキシ、アルコキシ、ハロアルコキシ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アシルオキシ、アシル、アルキル及びアリールからなる群から選択され；Ｒ¹及びＲ²は各々独立して、水素及び１〜６の炭素原子を有するアルキル基からなる群から選択されるか、又は一緒に、飽和もしくは不飽和５員環、飽和もしくは不飽和６員環及び飽和もしくは不飽和７員環からなる群から選択される環を形成し；Ｙ¹及びＹ²は各々独立して、単結合であるか、又は −CH₂−，−NHC(O)−，−NRC(O)−，−NHC(S)−，−NRC(S)−， −NHC(＝NH)−，−OC(O)−，−C(O)−、及び−C(S)− からなる群から選択される２価の基であり、ここでＲは１〜６の炭素原子の低級アルキル基であり；ｎは０〜４の整数である）の化合物と、を含む医薬組成物を供する。関連する実施形態において、前記化合物は、式：（式中、Ｙ¹及びＹ²は、各々独立して、 −CH₂−，−NHC(O)−，−NRC(O)−，−NHC(S)−，−NRC(S)−， −NHC(＝NH)−，−OC(O)−，−C(O)−、又は−C(S)− からなる群から選択される２価の基であり、ここでＲは１〜６の炭素原子の低級アルキル基であり；Ｓ¹¹，Ｓ¹²，Ｓ¹³，Ｓ¹⁴，Ｓ¹⁵、及びＳ¹⁶は各々独立して、水素、ハロゲン、ハロアルキル、ヒドロキシ、アリールオキシ、ベンジルオキシ、アルコキシ、ハロアルコキシ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アシルオキシ、アシル、アルキル及びアリールからなる群から選択されるメンバーである）を有する。Ｙ¹は、−NHC(O)又は−CH₂−であり、Ｙ²は−CH₂−であり、そしてＳ¹¹，Ｓ¹² ，Ｓ¹³，Ｓ¹⁴，Ｓ¹⁵、及びＳ¹⁶は各々独立して、水素、ハロゲン、ハロアルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロアルコキシ、アミノ、モノアルキルアミノ又はジアルキルアミノである。Ｓ¹¹，Ｓ¹²，Ｓ¹³，Ｓ¹⁴，Ｓ¹⁵、及びＳ¹⁶は各々独立して、水素、ハロゲン、トリフルオロメチル、ヒドロキシ及びメトキシからなる群から選択されるメンバーである。Ｙ¹は−NHC(O)又は−CH₂−であり、Ｙ²は−CH₂−であり、そしてＳ¹¹，Ｓ¹²，Ｓ¹³，Ｓ¹⁴，Ｓ¹⁵、及びＳ¹⁶は各々独立して、水素、ハロゲン、トリフルオロメチル、ヒドロキシ及びメトキシからなる群から選択されるメンバーである。本発明のこれら及び他の態様は以下の詳細な説明を引用することにより明らかになるであろう。発明の詳細な説明本明細書において引用する文献は全て本明細書に組入れる。本発明の化合物はカルシトニンのそのレセプターとの相互作用により生ずる効果を擬態する能力、及びかかる相互作用を介してアデニルシクラーゼによりＧプロテイン媒介活性化を剌激する能力を有する化合物についての大量スクリーニングにおいてまず同定された。かかる擬似化合物は骨再吸収の阻害のために有用である。哺乳類の甲状腺及び胸腺により分泌されるペプチドホルモン、カルシトニンは骨の恒常性を維持するうえで重要な役割を果たす。カルシトニンは破骨細胞上の特異的なカルシトニンレセプターの結合及び活性化を介して骨再吸収を阻害し、その結果骨から細胞外流体へと放出されるカルシウムの量は減少する(The C alcitonins-Physiology and Pharmacology，Azria（編）、Karger，Bael，Su.， 1989)。同定したピペラジン誘導体は骨再吸収を阻害する。ここに記載の更なる分析は同様に骨形成活性を示唆した。Sabatiniら（1995）前掲により発表された抗再吸収性複素環化合物も骨形成活性を有する。エストロゲンは抗再吸収活性に加えて同化特性を有することが報告されている（Bainら、J ．Bone Miner．Res． 8 ：435-42，1993）。更に、ビスホスホネートがヒトにおいて抗再吸収性及び同化又は骨形成活性の双方を有するものと主張され（Devogalaerら、Bone 18：141 -50，1996）、そしてカルシトニンは骨に対して同化作用を有するものと主張されている（Farleyら、Calcif Tissue Int ．50：67-73，1992及びWallachらCalci f ．Tissue Int ．52：335-39，1993）。再吸収インヒビターは骨形成活性を有するようであり、なぜなら骨形成は再吸収が停止した後の期間にわたり持続するからである。本明細書でいう「抑制」、「処置」又は「治療」は同義語である。これらの語は骨欠損症状の発症の延期及び／又は発症する又はするものと予測されるかかる症状の症度の軽減を含む。この語は更に現存の骨又は軟骨欠損症状の緩和、更なる症状の予防、症状の基礎的な代謝性原因の緩和又は予防、及び／又は骨成長の促進を含む。かくして、これらの語は軟骨、骨もしくは骨格欠損、又はかかる欠損を発症する潜在性を有する脊椎被検体に対して有益な効果を授けるものを意味する。「骨欠損」又は「骨欠乏」とは骨形成、対、骨再吸収の比における不均衡を意味し、即ち、そのままでいると、被検体は所望するよりも少ない量の骨を有するか、又は被検体の骨の完全性及び凝集性は所望するよりも弱くなるであろう。骨欠損は骨折、外科的介入又は歯科もしくは歯周病にも由来しうる。「軟骨欠損」とは損傷を受けた軟骨、所望するよりも少ない量の軟骨、又は所望するよりも完全性及び凝集性が弱い軟骨を意味する。本発明の化合物の代表的な用途には以下が挙げられる：骨欠損及び骨欠乏症、例えば開放、密閉及び偽関節骨折において起こるもの；密閉及び開放骨折整復における予防的用途；整形外科における骨治癒の促進；非セメント質補ていジョイント及び歯科インプラントへの骨内成長の刺激；閉月経期前の女性の最大骨質量の高揚；骨欠乏症の処置；歯周病及び欠陥の処置、並びにその他の歯修復工程；伸延骨発生の際の骨形成の増強；並びにその他の骨格障害、例えば老齢関連骨粗しょう症、閉月経期後の骨粗しょう症、グルココルチコイド誘導骨粗しょう症、糖尿病関連骨粗しょう症又は不使用（disuse）骨粗しょう症及び関節炎の処置。本発明の化合物は骨の先天的、外傷誘導又は外科的切除（例えば、癌の処置のため）の修復において、並びに美容外科においても有用でありうる。更に、本発明の化合物は軟骨欠陥又は障害を抑制又は処置するために利用でき、そして創傷治癒又は組織修復において有用でありうる。抗再吸収及び骨形成の二重機能を有する化合物についての重要な指標は閉月経期過程の際の骨の維持及び再吸収の促進にあるであろう。骨又は軟骨の欠損又は欠陥は脊椎被検体において、所定の構造的及び機能的特性を発揮する本発明の化合物を投与することにより処置できる。本発明の組成物は全身的に又は局部的に投与してよい。全身的用途のためには、本発明の化合物は慣用の方法に従って非経口的（例えば静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、鼻内又は経皮）又は経腸（例えば経口又は経直腸）導入のために処方される。静脈内投与は一連の注射により、または長期間にわたる連続点滴によることができる。注射、又はその他の独立に間隔を置いた投与ルートによる投与は毎週から１日１〜３回に範囲する間隔で行ってよい。他方、本明細書において開示する化合物は周期的に投与してよい（開示の化合物の投与；しかる後の投与なし；しかる後の開示の化合物の投与、等）。処置は所望の結果が達成されるまで続けられるであろう。一般に、医薬製剤は本発明の化合物を、医薬的に許容されるビヒクル、例えば食塩水、緩衝食塩水、５％のデキストロース水溶液、微量の金属を含む硼酸緩衝食塩水、等と一緒に含むであろう。製剤は更に１又は複数種の賦形剤、保存剤、可溶化剤、緩衝剤、ウィルス表層上でのタンパク質損失を防ぐためのアルブミン、潤滑剤、充填剤、安定化剤、等を含みうる。製剤化の方法は当業界において周知であり、そして例えばRemingtonのThe Science and Practice of Pharmacy ，Gennaro編、Mack Publishing Co.，Easton，PA、第19版、1995に開示されている。本発明において利用するための医薬組成物は無菌、非パイロジェン液体溶液もしくは懸濁物、被覆カプセル、座薬、凍結乾燥粉末、経皮パッチの形態又は当業界において公知のその他の形態であってよい。局部投与は負傷もしくは欠陥部位での注射、又はその部位での固体担体の挿入もしくは装着、又は粘性液体の直接的な局部塗布、等によることができうる。局部投与のためには、導入ビヒクルは好ましくは成長する骨又は軟骨のための基質を担い、そしてより好ましくは有害な作用を及ぼすことなく被検体により吸収されうるビヒクルである。本発明の化合物の創傷部位への導入は放出制御型組成物、例えばWIPO公開WO93 /20859に記載のものの利用により高めることができうる。このタイプのフィルムは補てつ及び外科インプラントのためのコーティングとして極めて有用である。このようなフィルムは、例えば手術用スクリュー、ロッド、ピン、プレート等の外面のまわりに巻き付けられていてよい。このタイプの移植用器具は整形外科においてもよく利用されている。このようなフィルムは骨充填材料、例えばヒドロキシアパタイトブロック、脱鉱化骨基質プラグ、コラーゲン基質、等をコーティングするためにも利用できうる。一般に、本明細書に記載のフィルム又は器具は骨にその骨折部位にて適用する。適用は一般に標準の外科手順を利用して骨の中への移植又はその表面への装着による。上記のコポリマー及び担体の他に、生体適合性フィルム及びマトリックスはその他の活性又は不活性成分を含みうる。特に関心のもたれるのは組織成長又は浸潤を促進する因子、例えば成長因子である。この目的のために典型的な成長因子には表皮成長因子(EGF)、繊維芽細胞成長因子(FGF)、血小板由来成長因子（PDGF ）、形質転換成長因子(TGF)、甲状腺傍ホルモン(PTH)、白血病阻害因子(LIF)及びインスリン様成長因子(IGF)等が挙げられる。骨成長を促進する因子、例えば形態発生タンパク質（WIPO公開WO90/11366）、オステオゲニン(Sampathら、Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 84：7109-13，1987)及びNaF（TencerらJ ．Biomed．Mat．Res．23：571-89，1989）も好ましい。生体適合性フィルム又はマトリックスは硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸、ポリアンヒドリド、骨又は皮膚コラーゲン、純粋タンパク質、細胞外マトリックス成分等及びそれらの組合せを含む。かかる生体適合性材料は所望の機械的、美容的又は組織もしくは基質界面特性を発揮するように非生体適合性材料と組合せて用いてよい。本発明の化合物の導入のための別の方法にはALZET浸透圧ミニポンプ（Alza Co rp．Palo Alto，CA）；持放式マトリックス材料、例えばWangら（WIPO公開WO90/ 11366）に開示のもの；Baoら（WIPO公開WO92/03125）に開示の如き帯電デキストランビーズ；コラーゲンベース導入システム、例えばKsanderらAnn ．Surg．211 ：288-94，1990に開示のもの；BeckらJ ．Bone Min．Res．6：1257-65，1991に開示のメチルセルロースゲルシステム；及びEdelmanら、Biomaterials 12：619-26 ，1991に開示のアルギネートベースシステム等の利用が挙げられる。骨における持続式局部導入のための当業界において周知のその他の方法には、含浸せしめることができる多孔質被覆金属補てつ及び中に組込まれた治療組成物を有するプラスチックロッドが挙げられる。更なる製剤、慣用の調製品、例えば以下に挙げるものを利用してよい。水性懸濁物は当該活性成分を、懸濁剤、例えばメチルセルロース、及び湿潤剤、例えばレシチン、リソレシチン又は長鎖脂肪アルコールを含んで成る医薬的に許容されるビヒクルと一緒に含みうる。前記水性懸濁物は保存剤、着色料、風味料及び甘味料を産業基準に従って含んでもよい。局部及び局所適用のための調製品は、低級脂肪族アルコール、ポリグリコール、例えばグリセロール、ポリエチレングリコール、脂肪酸のエステル、油及び脂肪、並びにシリコーンを含んで成りうる医薬的に適当なビヒクル中のエアロゾールスプレー、ローション、ゲル及びオイントメントを含んで成る。この調製品は更に酸化防止剤、例えばアスコルビン酸又はトコフェロール、及び保存剤、例えばｐ−ヒドロキシ安息香酸エステルを含みうる。非経口調製品は特に無菌又は無菌化製品を含んで成る。注射用組成物は当該活性化合物及び任意の周知の注射用担体を含んで提供されうる。これらは浸透圧の調節のための塩類を含みうる。所望するなら、骨形成剤をリポソームの中に、様々な病原性症状を処置するうえで利用するためのリポソームを調製する任意の報告された方法により組込んでよい。当該組成物は上記の化合物をマクロファージ、単球、その他の細胞並びに組織及び器官であってこのリポソーム組成物を取り込むものに導くため、リポソームの中に組込まれたかかる化合物を利用する。本発明の化合物を含むリポソームは当該化合物の少なめの用量の効率的な利用を可能とするため、非経口投与により利用できうる。リガンドも含ませ、リポソームの特異性を更に集中させることができる。リポソーム調製の適当な慣用の方法には、限定することなく、BanghamらJ ．Mo l．Biol ．23：238-52，1965，OlsonらBiochim ．Biophys．Acta 557：9-23，1979 ，SzokaらProc ．Natl．Acad．Sci．USA 75：4194-8，1978，MayhewらBiochim Bi ophys Acta 775：169-74，1984らBiochim Biophys Acta 728：339-48，1983及び MayerらBiochim Biophys Acta 858：161-8，1986により開示のものが挙げられる。リポソームは本化合物と、任意の慣用の合成又は天然リン脂質リポソーム材料、例えば天然資源、例えば卵、植物又は動物資源由来のリン脂質、例えばホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、スフィンゴミエリン、ホスファチジルセリン、又はホスファチジルイノシトールとの組合せからできうる。更に利用されうる合成リン脂質には、限定することなく、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、並びに対応の合成ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジルグリセロールが挙げられる。コレステロール又はその他のステロール、コレステロールヘミスクシネート、糖脂質、セレブロシド、脂肪酸、ガングリオシド、スフィンゴ脂質、１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン(DOTAP)、Ｎ−〔１−（２，３−ジオレオイル）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド(DOTMA)、及びその他の陽イオン脂質を、当業者に知られている通り、リポソームの中に組込んでよい。リポソームの中に使用するリン脂質及び添加剤の相対量は所望するなら変えてよい。好適な範囲は60〜90モル％のリン脂質である；コレステロール、コレステロールヘミスクシネート、脂肪酸又は陽イオン性脂質は０〜50モル％の範囲の量で使用できうる。リポソームの脂質層の中に組込む本化合物の量は約0.01〜約50モル％に範囲する脂質濃度で変えてよい。慣用の方法を利用し、溶液内に存在する約20〜30％の当該化合物がリポソームの中に捕捉されうる。かくして、約70〜80％の活性化合物が廃棄される。対照的に、当該化合物がリポソームの中に組込まれているとき、事実上全ての化合物がリポソームの中に組込まれ、そして廃棄される化合物は本質的にない。上記の処方による当該リポソームはモノクローナル抗体又は標的に特異的なその他のリガンドの組込みによりその意図する標的に対して更に一層特異的なものとすることができうる。例えば、BMPレセプターに対するモノクローナル抗体をリポソームの中に、Lesermanら、Nature 288：602-4，1980の方法によりリポソームの中に組込まれたホスファチジルエタノールアミン（PE）への連結により組込むことができうる。開示の化合物の獣医用途も考慮される。かかる用途には、飼育動物、家畜及びサラブレッド馬における骨又は軟骨欠損もしくは欠陥の抑制又は処置が挙げられる。本明細書に記載化合物は標的組織又は器官環境を改変せしめ、骨形成細胞をかかる細胞を要する環境へと引きつけるようにすることもできる。本発明の化合物は骨形成細胞もしくはその前駆体の成長を刺激するため、又は骨形成細胞の分化を誘導するため、in vitroでもex vivoでも利用できうる。本明細書において用いる語「前駆体細胞」とは分化経路へと送られるが、一般に成熟完全分化細胞としてのマーカー又は機能を発現しない細胞を意味する。本明細書において用いる語「間葉細胞」又は「間葉幹細胞」とは何回も***でき、そしてその子孫が骨格組織、例えば軟骨、骨、朧、靱帯、骨髄支質及び接続組織へと発達する多能始祖細胞を意味する(Caplan J ．Orthop．Res．9：641-50，1991)。本明細書で用いる語「骨形成原細胞」には骨芽細胞及び骨芽細胞前駆細胞が挙げられる。より詳しくは、開示の化合物は骨髄間葉細胞を含む細胞集団を刺激するために有用であり、かくしてその細胞集団における骨形成原細胞の数を増大させる。好適な方法において、造血細胞を細胞集団から、開示の化合物による刺激の前又は後に取り出す。かかる方法の実施を通じて、骨形成原細胞は増殖しうる。増殖した骨形成原細胞はそれを要する脊椎被検体に注入（又は再注入）してよい。例えば、被検体自身の間葉幹細胞を本発明の化合物にex vivoで曝露し、そして得られる骨形成原細胞を被検体内の所望の部位に注入又は誘導し、そこで骨形成原細胞の更なる増殖及び／又は分化が免疫拒絶なしで起こりうる。他方、開示の化合物に曝露された細胞集団は不死化ヒト胎児骨芽細胞又は骨形成原細胞であってよい。もしかかる細胞を脊椎被検体内に注入又は移植するなら、このような非自己細胞を「免疫保護」する、又は受容体を免疫抑制（好ましくは局部的）して移植及び骨又は軟骨修復を促進することが好都合でありうる。本発明において、組成物の「有効量」とは統計学的に有意な効果を奏する量である。例えば、治療的用途にとっての「有効量」とは骨折修復における治癒速度の臨床的に有意な上昇；骨粗しょう症における骨損失の復帰；軟骨欠陥又は障害の復帰；骨粗しょう症の発症の予防又は遅延；骨折偽関節及び伸延骨発生における骨形成の刺激及び／又は補強；補てい具への骨成長の増加及び／又は加速；並びに歯科欠陥の修復を供するのに要する本発明の活性化合物を含んで成る組成物の量を意味する。かかる有効量は日常の最適化技術を利用して決定され、そして処置する特定の症状、患者の症状、投与ルート、製剤及び医師の判断、並びに当業者にとって明らかなその他の要因に依存する。本発明の化合物にとって必要な用量（例えば、骨形成の増大が所望される骨粗しょう症）は処置及びコントロールグループ間での骨質量における統計学的に有意な差として明示される。骨質量におけるこの差は例えば処置グループにおける骨質量の５〜20％又はそれを超える上昇として認められうる。治癒における臨床学的に有意な増大のその他の尺度には、例えば破断強度及び張力、破断強度及び応力、４点屈曲、骨生検の持続力の増大についての検査、並びに当業者に周知のその他の生体機械的検査が挙げられうる。処置療法についての一般的な指針は注目の病気の動物モデルで実施する実験から得られる。試験化合物のその他の効果を決定するためのコントロールとして補助的なアッセイが利用できうる。例えば、有系***活性はプロモーターとしての血清応答要素(SRE)及びルシフェラーゼリポーター遺伝子を際立たせたスクリーニングアッセイを利用して測定できうる。より詳しくは、このようなスクリーニングアッセイはSRE媒介経路、例えばタンパク質キナーゼＣ経路におけるシグナル生成を検出できうる。例えば、骨芽細胞アクチベーターSRE−ルシフェラーゼスクリーン及びインスリン擬似体SRE−ルシフェラーゼスクリーンがこの目的のために有用である。本発明の化合物はin vivo投与アッセイを利用して無傷な動物で更に試験できる。模範囲的な投与は皮下、腹腔内又は経口投与により達成し得、そして注射、持放又はその他の導入技術により実施できうる。試験化合物の投与のための期間は様々でありうる（例えば、適宜28日及び35日であってよい）。典型的なin viv o皮下投与アッセイは下記の通りにして行うことができる：典型的な研究において、生後３ヶ月の70匹の雌Sprague-Dawleyラットを体重対合させ、そして各グループ10匹づつの動物の７つのグループに分ける。これは研究の開始時に殺す基底動物コントロールグループ、即ち、ビヒクルのみを投与したコントロールグループ；PBS処置コントロールグループ；及び骨成長を促進することで知られる化合物（非タンパク質又はタンパク質）を投与した陽性コントロールグループ、を含む。試験する化合物の３通りの用量を残り３つのグループに投与する。テスト化合物、ポジティブコントロール化合物、PBS、又は溶媒単独を、35日間１日１回皮下に投与する。殺死９日前及び２日前に、カルセインを全動物に注射する（各指定日にカルセインを２回注射投与する）。１週間毎に体重を測る。35日間のサイクルの終了時に、動物の体重を測り、そして眼窩又は心臓穿刺によって血液をとる。血清カルシウム、リン酸塩、オステオカルシン及びCBSを測定する。両脚骨（大腿骨及び脛骨）及び腰椎を取り出し、接着軟組織を除いてから、評価のために70％エタノール中に保存する。末梢定量コンピュータトモグラフィー（pQCT；Ferretti，Bone．17：353S -64S，1995）、二重エネルギーＸ線吸収測定(DEXA；Laval-Jeantet et al.，Cal cif．Tissue Intl．56：14-18，1995；Casez et al.，Bone and Mineval 26：61 -8，1994)及び／又は組織形態計測によって、評価する。骨再形成に対するテスト化合物の効果を、この様にして評価できる。急性卵巣切除動物（予防モデル）において、インビボ投与検査によって、代表的な化合物をテストすることもできる。この検査では、コントロールとしてエストロゲン処理群を含んでよい。代表的な皮下投与検査を以下の様に行う。典型的な研究では、80ひきの３か月齢メスSprague-Dawleyラットを、体重をそろえて、８群に分ける。各群は10ひきとする。これには、研究開始時に殺死するベースラインコントロール群；３つのコントロール群(にせの卵巣切除(にせOVX) ＋溶媒のみ；卵巣切除(OVX)＋溶媒のみ；PBS処理OVX)；及び、骨成長を促進することが知られている化合物を投与したコントロールOVX群が含まれる。３段階の投与量のテスト化合物を、残りの３群のOVX動物に投与する。卵巣切除(OVX)は、過食症を誘発するので、全てのOVX動物は、35日間の研究中、にせOVX動物と対で飼育する。テスト化合物、ポジティブコントロール化合物、PBS、又は溶媒単独を、35日間１日１回皮下投与する。あるいは、テスト化合物を、移植できるペレットに調合して、35日間移植するか、又は、胃管による強制栄養法などによって経口投与することもできる。全ての動物（にせOVX／溶媒群及びOVX／溶媒群を含む）に、殺死９日前及び２日前に、カルセインを腹腔内注射する（新しく形成される骨を適切に標識するために、各指定日に、カルセインを２回注射投与する）。１週間毎に、体重をはかる。35日間のサイクル終了時に、前記通り動物の血液及び組織を処理加工する。慢性OVX動物（治療モデル）において、代表的な化合物をテストすることもできる。固化作用因子の効率を測定するために用いることができる卵巣切除動物において、確立した骨損失を治療する代表的な方法は、以下の様にして行われる。 80〜100ひきの６か月齢メスSprague-Dawleyラットに、時間０において、にせ手術（にせOVX）又は卵巣切除(OVX)を施し、そして10ひきのラットを、ベースラインコントロールのために殺死する。体重を、実験中１週間毎に記録した。骨欠失の約６週間（42日目）以上後に、10ひきのにせOVX及び10ひきのOVXラットを、欠失期間コントロールとして殺死するために、ランダムに選ぶ。残りの動物のうち、10ひきのにせOVX及び10ひきのOVXラットをプラセボ処理コントロールのために用いる。残りのOVX動物に、５週間（35日間）、テスト化合物を３〜５回投与処理する。ポジティブコントロールとして、本モデルにおいて既知の同化作用因子であるPTHなどの因子（Kimmel et al.，Endocrinology 132：1577-84，1993）によって、１群のOVXラットを処理する。骨形成に対する効果を決定するために、以下の方法を行う。大腿骨、脛骨及び腰椎１〜４を切り出して集める。pQCT測定、海綿骨質の鉱物密度（BMD）(重量測定)、及び組織学検査のために、近位左及び右脛骨を用いる。各脛骨の中間幹を用いて、皮質のBMD又は組織学検査を行う。生物機械検査の前に、中間幹のpQCTスキャニングを行うために、大腿骨を用意する。腰椎（LV）に関しては、LV ２を、BMDのために用いる（pQCTを行ってもよい）；LV３を、未脱灰骨の組織学検のために用いる；そしてLV４を、機械検査のために用いる。本発明の方法において有用な化合物は、以下の式のものである：この式中では、Ａ及びＢは、各々独立に、アリール基、置換アリール基、炭素環、置換炭素環、複素環、置換複素環、又はこれらの組合せである。組合せは、縮合又は共有結合であってよい。炭素環基及び複素環基の例には、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、ピペラジニル、ピラジニル、モルホリニル、イミダゾーリル、トリアゾーリル及びチアゾーリルがある。前記した様に、Ａ及びＢは、各々アリール基でもよい。用語「アリール」は、単一環、あるいは、互いに縮合するか、エチレンもしくはメチレン部分などの共通基に共有結合するか、又は結合する複素環である芳香族置換基を指す。この芳香族環は、各々ヘテロ原子を含んでよい。アリール基の例には、フェニル、ナフチル、ビフェニル、ジフェニルメチル、２，２−ジフェニル−１−エチル、チエニル、ピリジル、及びキノキサリルがある。更に、このアリール基は、本分子の他の部分に、別の場合には水素原子によって占められているアリールラジカル上の任意の位置を介して、結合してもよい（例えば、２−ピリジル、３−ピリジル及び４−ピリジル）。本アリール基は、他の炭素環基又は複素環基と共に、場合によっては置換され得る。置換基は、典型的には、ハロゲン、ハロアルキル、ヒドロキシ、アリールオキシ、ベンジルオキシ、アルコキシ、ハロアルコキシ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アシルオキシ、アシル、アルキル又は追加のアリール基である。用語「アルキル」は、直鎖状又は分鎖状（例えばエチル、イソプロピル、又はｔ−アミル）、又は環状（例えば、シクロブチル、シクロプロピル、又はシクロペンチル）である飽和炭化水素ラジカルを指す。好ましいアルキル基は、１〜６個の炭素原子を有するものである。本明細書及び請求の範囲に示す数字範囲は、上限値及び下限値を含んで意味する。用語「アルコキシ」は、別の炭化水素ラジカルに共有結合することができる酸素置換基を保持する、前記の様なアルキルラジカルである（例えばメトキシ、エトキシ及びｔ−ブトキシ）。記号Ｒ¹及びＲ²は、各々独立に水素又は１〜６個の炭素原子を有するアルキル基である。いくつかの態様では、Ｒ¹及びＲ²は互いに結合して、飽和もしくは不飽和の４，５，６又は７員環を形成することもある。前記環が不飽和である態様では、その環は、芳香族環（例えばフェニル又はナフチル）又はヘテロ芳香族環（例えばピリジル、チエニル、イミダゾーリル）でよい。記号Ｙ¹及びＹ²は、各々独立に、単なる結合か、又は、−CH₂−，−NHC(O)− ，−NRC(O)−，−NHC(S)−，−NRC(S)−，−NHC(＝NH)−，−OC(O)−，−C(O)− もしくは−C(S)−である（ただしＲは、１〜６個の炭素原子を有する低級アルキル基である）二価ラジカルである。好ましい態様では、Ｙ²は、カルボニル、チオカルボニル又はメチレン（各々−C(O)−，−C(S)−又は−CH₂−で表わせる）である二価ラジカルである。別の好ましい態様では、Ｙ¹は、−NHC(O)−，−NRC (O)−，−C(O)−、又は−C(S)−である。記号には、０〜４の整数である。好ましい態様では、本化合物は、ピペラジンを基にした、以下の式の化合物である：前記式中、記号Ｙ¹及びＹ²は、前記の意味である。記号Ｓ¹¹，Ｓ¹²，Ｓ¹³，Ｓ¹⁴ ，Ｓ¹⁵及びＳ¹⁶は、各々独立して、結合された芳香族環上の置換であり、水素、ハロゲン、ハロアルキル、ヒドロキシ、アリールオキシ、ベンジルオキシ、アルコキシ、ハロアルコキシ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アシルオキシ、アシル、アルキル及びアリールである。特に好ましい態様では、Ｙ¹は、−NHC(O)−又は−CH₂−であり、Ｙ²は−CH₂−であり、そしてＳ¹¹，Ｓ¹² ，Ｓ¹³，Ｓ¹⁴，Ｓ¹⁵及びＳ¹⁶は、各々独立に水素、ハロゲン、ハロアルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロアルコキシ、アミノ、モノアルキルアミノ、又はジアルキルアミノである。ある好ましい態様では、各芳香族環上の少くとも１つの置換基、好ましくは少くとも２つの置換基は、水素以外のものである。最も好ましくは、この置換基は、ハロゲン、トリフルオロメチル、ヒドロキシ及びメトキシである。本発明の化合物は、当業者に既知の標準的な合成方法によって調製される。ピペラジン誘導体を目的とする一般的合成手順を以下に示す。従って、単一保護されたピペラジン（例えばｔ−BOC−ピペラジン）を、アリールイソシアネートで処理して、尿素１ａを得ることができる。１ａから保護基を取り除いて１ｂを得て、これを、従来の方法に従って、例えば置換ベンジルハリド又は置換ベンゾイルクロリドによって、アルキル化又はアシル化して、各々１ｃ及び１ｄを得ることができる。あるいは、以下に示す様に、還元的アミノ化経路によって、ｔ−Bocピペラジンをアルキル化することができる。例えば芳香族アルデヒドによる還元的アルキル化に続いて、その保護基を取り除き、そして残りのピペラジン窒素を、アリール又はアルキルイソシアネートによってアシル化することができる。米国特許5,286,728及び5,384,319に記載の類縁化合物の調製方法に類似したその他の調製方法を利用してもよい。別の合成方法では、適当に置換されたヒドロキシベンズアルデヒドを、最初に、固体支持体、例えばWang樹脂に結合する。次に、遊離のアルデヒド基を、単一保護されたジアミン、例えばBOC−ピペラジンを用いて、還元的アルキル化する。次に、その保護基を取り除き、そして樹脂に結合した化合物を、種々の試薬、例えばカルボン酸、イソシアネート、イソチオシアネート又はスルホニルハリドによってアシル化する。この単一保護されたジアミン、例えばピペラジンは、商業的に得るか、又は、有機合成分野の当業者に既知の種々の方法によって調製する。１つの方法では、４−ヒドロキシ−３−メトキシベンズアルデヒドを、トリフェニルホスフィン及びジエチルアゾジカルボキシレートを用いたMitsonobuのアルキル化によってWang樹脂に結合させる。次に、この樹脂結合化合物の遊離アルデヒド基を、ボラン−ピリジン複合体を用いて、BOC−ピペラジンによって還元的にアルキル化する。次に、BOC基を、10％TFA／ DCMによって選択的に取り除き、そして次に、遊離の窒素を、アリールイソシアネートによってアシル化する。できた化合物の切断を、標準的な方法、例えば、 50％TFA／DCMによる30分間処理によって実行する。当業者に明かな様に、本化合物を調製するために、多数の代替方法が存在し、例えば、樹脂上の合成順序を逆にすること、アシル化及び結合のために他の試薬を用いることが考えられ、これらは、例えば、March，Advanced Organic Chemistry，4th Edition，Wiley-Inte rscieuce，NY，1992に記載されている。前記載及び以下の実施例は、限定するためではなく、説明するためのものである。当業者に明かな様に、本発明系の操作条件、材料、手順工程及びその他のパラメータは、本発明の範囲から離れることなく、種々の方法で、更に改修又は交換することができる。以下の実施例によって、限定することなく、本発明を更に説明する。実施例実施例１ 50−0231の合成この実施例では、前記の合成手順による、市販品の出発材料からの50−0231の合成を説明する。ｔ−Boc−ピペラジン(8.6ｇ，100mmol)及びバニリンアセテート(100mmol)を無水メタノール(150ml)と混合し、そして溶液が透明になるまで撹拌する。酢酸(6.0ｇ)を加え、続いて分子シーブ（４Ａ）47ｇを加える。１時間穏やかに撹拌した後、この混合液を氷上で冷却し、そして穏やかに撹拌しながら、1.5時間に亘って、少量ずつNaCNBH₄(6.1ｇ，100mmol)を加える。70時間撹拌した後、この混合液を濾過し、その濾液を減圧下で蒸発させる。生じた油性残査を、水及びNH₄Cl 10ｇで処理する。この懸濁液を撹拌し、固形KHSO₄によってpH約４まで酸性化する。この懸濁液を、NaHCO₃によって中和し、EtOAcによって完全に抽出する。その有機層を水で洗浄し、Na₂SO₄上で乾燥させ、そして減圧下で濃縮して、半固体の残査を得る。この残査を、無水エーテルで滴定し、そして結晶性固体を濾過して取り出し、冷エーテルで洗浄する。この固体を、２時間空気中で、次に２時間真空中で乾燥させる。当固体の一部（20mmol）を、冷やした95％TFA／H₂O(50mL)中に溶解する。この混合液を、30分間氷上で撹拌し、そして減圧下でTFAを除いた。この残査を、水で処理して、１Ｎ HClによってpH３〜４に酸性化して、そしてエーテルで抽出する（３×20mL）。その水層を、氷上で冷却し、固形Na₂CO₃によって中和し、そして１Ｎ NaOHによってpH10に調整する。生じた溶液をEtOAcで抽出する（５×40mL ）。その水層をNaClで飽和し、そして再びEtOAcで抽出する（２×30mL）。混合したEtOAc抽出液を水で、そして塩水で洗浄し、Na₂SO₄上で乾燥させ、濾過し、そして減圧下で蒸発させる。この化合物を、真空デジケーター内で一晩乾燥させてから、無水DMF（35mL）中に溶解し、そして氷上で冷やす。この冷却した撹拌中の溶液に、３−トリフルオロメチルイソシアネート（3.74ｇ，20mmol）の乾燥 DMF（15ml）溶液を、分割して加える。本反応において、イソシアネートの消費及び遊離アミンの消費を監視する。イソシアネートの各添加後、この反応混合液を20分間撹拌してから、TLCのために少量を取り出す。最終添加後、この反応混合液を一晩撹拌する。減圧下でDMFを取り除き、そしてその残査を10％Na₂CO₃溶液（50mL）で処理する。生じた懸濁液を10分間撹拌し、次にEtOAc（５×50mL）で抽出する。その有機層を水で（２×25mL）、そして塩水で洗浄し、Na₂SO₄上で乾燥させ、そして減圧下で蒸発させる。この残査をエーテル中に溶解し、そして数時間保ち、その間、結晶性の固まりを分離させ、それを濾過して取り出し、冷エーテルで洗浄し、そして空気中で乾燥させる。更に真空デジケーター内で一晩乾燥させて、生成化合物50−0231 を得る：実施例２頭蓋冠のエクソビボ固化作用検査４〜５日齢の新生CD−１マウスから頭蓋冠を取り出し（妊娠マウスをCharles River Laboratories，Wilmington，MAから入手した）、そして先の鋭いはさみで、矢状縫合を含む頭頂部を残す様に調整した。これらの調整骨を、６ウェルの細胞培養クラスタープレート（Coster，Pleasanton，CA）に、ウェルあたり１つ入れ、そしてテスト化合物又はコントロールを含む培地を、ウェルあたり１ml加えた。用いた培地は、BGJb，0.1％ BSA，50μｇ／mlアスコルビン酸であった。粉末のBGJb（Fitton-Jaekson改変；Sigma Chemical Co．，St．Louis，Mo.）を、滅菌蒸留水（Baxter Healthcare Corp.，Deerfield，IL）に溶解し、終濃度3.5 ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウムを加え、pHを6.83に調整し、最終的に容量を合わせた。これに、終濃度１mg／mlのBSA（分画Ｖ，Sigma Chemical Co.）、終濃度100Ｕ／mlのペニシリン−ストレプトマイシン、及び10mL／Ｌの割合で200mMのＬ−グルタミン保存液を加えた。この培地を、0.22μｍフィルターで濾過滅菌した。頭蓋冠を、37℃で、５％CO₂保湿インキュベーター内で、24時間、ゆっくりゆらしながら(RedRocker^TM，model PR50-115V，Hoefer，San Francisco，CA or Lablin e Rocking Shaker，model 4635，Labline Instruments，Melrose Park，IL)、事前にインキュベーションした。事前インキュベーション後、培地を取り除き、テスト化合物（終濃度５，10， 20及び30μｇ／ml）のDMSO溶液（検査時の最終DMSO濃度は0.1％以下とする）を含んでいる培地を、ウェルあたり1.5mL加えた。各実験において、ポジティブコントロールとして、10％ウシ胎児血清を加えた。全てのコントロール用ウェルには、最終的に検査時にテスト化合物のウェルに存在しているのと同濃度のDMSOを加えた。各サンプル群では、４つの骨を用いた。12ウェルプレートでは、１mlの培地を含んだ１ウェルに１個、又は場合によっては、６ウェルプレートで、５ml の培地を含んだ１ウェルに４個の割合で、ステンレススチール製の格子上で、骨をインキュベーションした。骨を、96時間インキュベーションした。このインキュベーション中、細胞毒性の可能な指標として、一般的な外観、健全性、頭蓋冠から移動した細胞数を観察した。組織学的に検査する頭蓋冠を、10mlの冷却した 10％ホルマリン中性緩衝液を含んだガラス製シンチレーション用バイアルに移した。固定後、頭蓋冠を、５％ホルマリン中性緩衝液を含んだ５％ギ酸中で脱灰し、流水で洗浄し、濃度を段階的に増やしたエタノール中で脱水し、キシレン中で透明化し、そしてパラフィン中に包埋した。中間頭頂部骨のところで、５ミクロンの横断切片を切り出し、脱パラフィンし、そしてヘマトキシリン及びエオシン／フロキシンＢ／オレンジＧで染色して、骨変化を評価した。骨芽細胞を、強い好塩基性細胞質染色、中央の非染色ゴルジ領域、そして中心から離れて位置する核によって同定した。本染色方法では区別できない、骨膜表面上の線維芽細胞及び骨形成細胞（骨芽細胞の前駆細胞）を、骨形成性／線維芽細胞様組織として認識した。骨形成の評価を、骨膜組織（骨形成性／線維芽細胞様組織）、骨芽細胞及び新しく形成された骨（既存骨のピンクがかった／灰色に対して明るいオレンジ色を呈する）の量、の各変化を半定量的に調べることによって行った。骨形成活性の異なったレベルに対して、０〜３の任意の評価点を割り当てる。評価点０：これは、一般的に、極端な細胞毒性、ネクローシス及び／又は細胞死を示す。評価点１：コントロール培養において一般的に観察される骨形成活性。骨膜表面が、１層の骨芽細胞によって被われる（骨表面の約50％、残りの50％は、骨内層細胞によって被われる）。テスト薬剤又は化合物の阻害活性又は少量毒性のために、骨膜表面の50％未満が骨芽細胞によって被われている場合には、評価点「１−」を与える（そして、骨膜表面の50％超の場合には、評価点「１＋」を与える）。評価点２：これは、骨形成活性の中程度の増加を示す。骨膜表面の約20〜40％が、２層までの骨芽細胞によって被われている。骨膜表面の20％未満が、２層の骨芽細胞によって被われている場合には、評価点「２−」を与える（そして、骨膜表面の40％超の場合には、評価点「２＋」を与える）。評価点３：これは、骨形成活性の著しい増加を示す（例えば、10％ウシ胎児血清による刺激）。骨膜表面の20％超が、３層の骨芽細胞によって被われている。同時に、細胞が丸々と太る（最大サイズが100μｍ²を超える）。骨膜表面の20％未満が、３層の骨芽細胞によって被われ、及び／又は、骨芽細胞の最大サイズが 100μｍ²未満である場合には、評価点「３−」を与える。３を超える評価点（すなわち「３＋」）は、これまで観察されていない。化合物50−0231は、骨芽細胞数、骨形成性／線維芽細胞様組織（すなわち骨膜幅の増加）、及び新骨形成の増加によって示される様に、BGJ処理コントロールの場合と比較して、明かな同化作用効果を示した。これの最大効果濃度は、10〜20μｇ／mlであると思われる（表１参照）。前記載から、説明のために、本発明の特別の実施例を記載したが、種々の改修が、本発明の範囲からはずれることなく、行われ得る。従って、本発明は、請求の範囲以外によっては、限定されない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．脊椎動物において骨の形成を増加させるための方法であって、治療の必要な脊椎動物被検体に、所定量の式Ｉ：（式中、Ａ及びＢは各々独立して、アリール、置換化アリール、炭素環、置換化炭素環、ヘテロ環、置換化ヘテロ環、及びそれらの組合せからなる群から選択されるメンバーであり、ここで前記組合せは融合し又は共有結合しており、そして前記置換基は、ハロゲン、ハロアルキル、ヒドロキシ、アリールオキシ、ベンジルオキシ、アルコキシ、ハロアルコキシ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アシルオキシ、アシル、アルキル及びアリールからなる群から選択され；Ｒ¹及びＲ²は各々独立して、水素及び１〜６の炭素原子を有するアルキル基からなる群から選択されるか、又は一緒に、飽和もしくは不飽和５員環、飽和もしくは不飽和６員環及び飽和もしくは不飽和７員環からなる群から選択される環を形成し；Ｙ¹及びＹ²は各々独立して、単結合であるか、又は −CH₂−，−NHC(O)−，−NRC(O)−，−NHC(S)−，−NRC(S)−， −NHC(＝NH)−，−OC(O)−，−C(O)−、及び−C(S)− からなる群から選択される２価の基であり、ここでＲは１〜６の炭素原子の低級アルキル基であり；ｎは０〜４の整数である）の化合物を投与することを含む方法。２．前記化合物が、式：（式中、Ｙ¹及びＹ²は、各々独立して、 −CH₂−，−NHC(O)−，−NRC(O)−，−NHC(S)−，−NRC(S)−， −NHC(＝NH)−，−OC(O)−，−C(O)−、又は−C(S)− からなる群から選択される２価の基であり、ここでＲは１〜６の炭素原子の低級アルキル基であり；Ｓ¹¹，Ｓ¹²，Ｓ¹³，Ｓ¹⁴，Ｓ¹⁵、及びＳ¹⁶は各々独立して、水素、ハロゲン、ハロアルキル、ヒドロキシ、アリールオキシ、ベンジルオキシ、アルコキシ、ハロアルコキシ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アシルオキシ、アシル、アルキル及びアリールからなる群から選択されるメンバーである）を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。３．Ｙ¹が−NHC(O)又は−CH₂−であり、Ｙ²が−CH₂−であり、そしてＳ¹¹，Ｓ¹² ，Ｓ¹³，Ｓ¹⁴，Ｓ¹⁵、及びＳ¹⁶が各々独立して、水素、ハロゲン、ハロアルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロアルコキシ、アミノ、モノアルキルアミノ又はジアルキルアミノであることを特徴とする請求項２に記載の方法。４．Ｓ¹¹，Ｓ¹²，Ｓ¹³，Ｓ¹⁴，Ｓ¹⁵、及びＳ¹⁶が各々独立して、水素、ハロゲン、トリフルオロメチル、ヒドロキシ及びメトキシからなる群から選択されるメンバーであることを特徴とする請求項２に記載の方法。５．Ｙ¹が−NHC(O)又は−CH₂−であり、Ｙ²が−CH₂−であり、そしてＳ¹¹，Ｓ¹² ，Ｓ¹³，Ｓ¹⁴，Ｓ¹⁵、及びＳ¹⁶が各々独立して、水素、ハロゲン、トリフルオロメチル、ヒドロキシ及びメトキシからなる群から選択されるメンバーであることを特徴とする請求項２に記載の方法。６．前記被検体が、骨粗しょう症、骨折もしくは骨の欠乏、原発性もしくは二次性副甲状腺機能亢進症、歯周疾患もしくは欠損、転移性の骨の疾患、溶骨性の骨の疾患、形成手術後、プロテーゼ接合手術後、及び歯の移植後からなる群から選択される状態を特徴とする請求項１に記載の方法。７．前記被検体に、骨の成長を促進する１又は複数の剤を投与することを更に含む請求項１に記載の方法。８．前記剤が、骨形態発生因子、骨原因子、軟骨由来形態発生タンパク質、成長ホルモン、及び分化因子からなる群から選択されることを特徴とする請求項７に記載の方法。９．脊椎動物において骨の形成を増強するための医薬組成物であって、医薬として許容される賦形剤と、骨の形成を促進するために有効な量の式（Ｉ）：（式中、Ａ及びＢは各々独立して、アリール、置換化アリール、炭素環、置換化炭素環、ヘテロ環、置換化ヘテロ環、及びそれらの組合せからなる群から選択されるメンバーであり、ここで前記組合せは融合し又は共有結合しており、そして前記置換基は、ハロゲン、ハロアルキル、ヒドロキシ、アリールオキシ、ベンジルオキシ、アルコキシ、ハロアルコキシ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アシルオキシ、アシル、アルキル及びアリールからなる群から選択され；Ｒ¹及びＲ²は各々独立して、水素及び１〜６の炭素原子を有するアルキル基からなる群から選択されるか、又は一緒に、飽和もしくは不飽和５員環、飽和もしくは不飽和６員環及び飽和もしくは不飽和７員環からなる群から選択される環を形成し；Ｙ¹及びＹ²は各々独立して、単結合であるか、又は −CH₂−，−NHC(O)−，−NRC(O)−，−NHC(S)−，−NRC(S)−， −NHC(＝NH)−，−OC(O)−，−C(O)−、及び−C(S)− からなる群から選択される２価の基であり、ここでＲは１〜６の炭素原子の低級アルキル基であり；ｎは０〜４の整数である）の化合物と、を含む医薬組成物。 10．前記化合物が、式：（式中、Ｙ¹及びＹ²は、各々独立して、 −CH₂−，−NHC(O)−，−NRC(O)−，−NHC(S)−，−NRC(S)−， −NHC(＝NH)−，−OC(O)−，−C(O)−、又は−C(S)− からなる群から選択される２価の基であり、ここでＲは１〜６の炭素原子の低級アルキル基であり；Ｓ¹¹，Ｓ¹²，Ｓ¹³，Ｓ¹⁴，Ｓ¹⁵、及びＳ¹⁶は各々独立して、水素、ハロゲン、ハロアルキル、ヒドロキシ、アリールオキシ、ベンジルオキシ、アルコキシ、ハロアルコキシ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アシルオキシ、アシル、アルキル及びアリールからなる群から選択されるメンバーである）を有することを特徴とする請求項９に記載の組成物。 11．Ｙ¹が−NHC(O)又は−CH₂−であり、Ｙ²が−CH₂−であり、そしてＳ¹¹，Ｓ¹² ，Ｓ¹³，Ｓ¹⁴，Ｓ¹⁵、及びＳ¹⁶が各々独立して、水素、ハロゲン、ハロアルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロアルコキシ、アミノ、モノアルキルアミノ又はジアルキルアミノであることを特徴とする請求項10に記載の組成物。 12．Ｓ¹¹，Ｓ¹²，Ｓ¹³，Ｓ¹⁴，Ｓ¹⁵、及びＳ¹⁶が各々独立して、水素、ハロゲン、トリフルオロメチル、ヒドロキシ及びメトキシからなる群から選択されるメンバーであることを特徴とする請求項10に記載の組成物。 13．Ｙ¹が−NHC(O)又は−CH₂−であり、Ｙ²が−CH₂−であり、そしてＳ¹¹，Ｓ¹² ，Ｓ¹³，Ｓ¹⁴，Ｓ¹⁵、及びＳ¹⁶が各々独立して、水素、ハロゲン、トリフルオロメチル、ヒドロキシ及びメトキシからなる群から選択されるメンバーであることを特徴とする請求項10に記載の組成物。