DE60015737T2

DE60015737T2 - Probenabbildung

Info

Publication number: DE60015737T2
Application number: DE60015737T
Authority: DE
Inventors: John Gordon Rushbrooke; Elizabeth Claire HOOPER
Original assignee: Packard Instrument Co Inc
Current assignee: PerkinElmer Health Sciences Inc
Priority date: 1999-03-16
Filing date: 2000-01-25
Publication date: 2006-02-16
Anticipated expiration: 2020-01-26
Also published as: DE60015737D1; US6730901B1; EP1166087B1; GB9905954D0; EP1166087A1; WO2000055601A1

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft optische Systeme zum Abbilden von mehrere Sacklöcher aufweisenden Probenplatten und dergleichen auf Kameravorrichtungen zum Analysieren und Überwachen der Lichtaktivität in den Sacklöchern.
Vorgeschichte der Erfindung
Biomedizinische Proben, die im typischen Fall in viele Sacklöcher aufweisenden Probenplatten vorliegen, können mit einer CCD-Kamera unter Verwendung einer geeigneten Linse betrachtet und gemessen werden. Die Linsenverkleinerung läßt sich zum Anpassen der Größe der gesamten Probenplatte (zum Beispiel im typischen Fall 10 mm × 75 mm) oder eines Teils hiervon an die CCD-Kamera wählen. Die CCD-Kamera ist entweder eine nackte gekühlte CCD (bare cooled CCD) oder eine bildverstärkte CCD (image intensified CCD).
Im typischen Fall hat ein Sensor einer CCD-Kamera 1 Zoll (25 mm) im Quadrat. Eine Verkleinerung von ~110/25 = 4,4 ist deshalb zum Betrachten einer vollständigen Probenplatte erforderlich.
Bei der modernen biomedizinischen Analysenchemie, bei der eine lumineszente oder fluoreszente Lichtemission mit langen Wellenlängen in Richtung auf das rote Ende des Spektrums (600 bis 700 mm) auftritt, hat eine nackte gekühlte CCD einen großen Vorteil. Zum ausreichenden Herabsetzen des dunklen Rauschens der CCD wird diese mit Peltier- oder kryogenen Mitteln gekühlt. Eine besondere Elektronik wird zum Herabsetzen des Ableserauschens auf ein Minimum benötigt, aber sehr kleine Lichtstärken lassen sich dann noch bei Vorhandensein eines geringen Rauschens detektieren. Die Quantenausbeute einer CCD über dem größten Teil des sichtbaren Bereichs liegt bei 35 bis 40 %. Bei Verwen dung einer dünnen, von hinten beleuchteten CCD kann die Ausbeute den hohen Wert von 80 bis 90 % erreichen.
Diese Situation steht im Gegensatz zu den bildverstärkenden CCD-Kameras, bei denen die Photonen in der Photokathode des Bildverstärkers detektiert werden. Die Quantenausbeute von typischen, mit geringem Rauschen arbeitenden Photokathoden im Bereich Rot ist verhältnismäßig gering (< 5 %). Bei Verwendung von Gen1-Bildverstärkern ergibt sich im allgemeinen auch eine Abschattung, das heißt ein Abfall des Detektionswirkungsgrades in einem Abstand vom Mittelpunkt des Gesichtsfeldes. Bei Verwendung von Gen2(Mikrokanalplatten)-Bildverstärkern ergeben sich auch bei mittleren und hohen Lichtstärken Schwierigkeiten, da die Lebensdauer der Röhren begrenzt ist. Gen3-Bildverstärker bieten im roten Bereich eine stark verbesserte Quantenausbeute. In gewissem Maß befinden sie sich jedoch noch im Entwicklungsstadium, mindestens bei Verwendung von Röhren mit einem vernünftigen Durchmesser, zum Beispiel 40 mm, und der Rauschpegel kann zu einem Problem werden.
Bei einer bildverstärkenden CCD kann ein einziges delektiertes Photon in der CCD zu einer über eine Anzahl von Pixeln verteilten Elektronenentladung führen. Zum Erreichen einer unter-pixel-räumlichen Auflösung, zum Beispiel in der Größenordnung von 10 Mikron, zum Auffinden der Koordinaten eines detektierten Photons, was bei einigen Bildanwendungen, bei denen sich in der Probe viele winzige lichtemittierende Stellen finden, wichtig ist, sind zentroide Verfahren vorgeschlagen worden, und die Verfahren zur Bildwiedergabe verlangen eine Abtrennung der verschiedenen lichtemittierenden Stellen.
Zentroide Verfahren können im allgemeinen nicht bei einer nackten gekühlten CCD angewendet werden, da ein detektiertes Photon im Silizium nur zu einem einzigen Elektron führt.
Statt Verwendung einer Linse zur Bildwidergabe kann zum Abbilden der Probenplatte auf der CCD ein faseroptischer Taper verwendet werden. Ein Nachteil liegt jedoch darin, daß zum Erfassen der gesamten Platte mehrere Belichtungen notwendig sind.
Die Erfindung
Gemäß einem Gesichtspunkt der vorligenden Erfindung wird eine Probenplatte auf einer CCD-Kamera mit einem optischen System nach Anspruch 1 abgebildet. Ein faseroptischer Taper weist einige Vorteile auf, und die Verwendung einer Sammellinse bietet auch andere Vorteile. Aus der folgenden Beschreibung ergibt sich jedoch, daß mit der Erfindung mehr als die Summe dieser verschiedenen Vorteile erreicht werden kann.
Vorzugsweise ist die CCD-Kamera eine nackte gekühlte CCD.
Vorzugsweise liegt im Lichtweg zwischen der Probenplatte und der CCD-Kamera ein Verschluß oder eine Blende.
Bei Verwendung einer einzigen Linse kann der Verschluß zwischen der Linse und der Frontplatte der CCD-Kamera angeordnet werden. Bei Verwendung von zwei Linsen wird der Verschluß zwischen den beiden Linsen angeordnet.
Eine viele Sacklöcher aufweisende Probenplatte läßt sich im allgemeinen mit dem erfindungsgemäßen System mit einer einzigen Belichtung (shot) im Unterschied zu dem Fall, bei dem ein faseroptischer Taper ohne eine Linse verwendet wird, abbilden und analysieren, wenn zum Erreichen einer vollständigen Abbildung und Analyse der gesamten Probenplatte zwei oder mehr Belichtungen (shots) im allgemeinen erforderlich sind.
Mit Vorteil kann eine zweite Linse verwendet werden, und im typischen Fall wird die abbildende Linse dicht an der Probe und eine Feldlinse dicht an der Eingangsfrontplatte der Kamera angeordnet.
Beim Lichtsammeln weist daß erfindungsgemäße System insbesondere einen hohen Wirkungsgrad auf. Wirkungsgrade in der Größenordnung von 3,5 % werden ins Auge gefaßt.
Vorzugsweise beugt die Feldlinse die Lichtstrahlen so, daß sie senkrecht zum Taper stehen, und vermindere damit den Verlust jeglichen Lichtes aufgrund des Eintritts von Strah len in den Taper unter Winkeln außerhalb des maximal zulässigen Winkels θ =sin¹ (NA), wobei NA die numerische Öffnung des Tapers ist (gleich der Vergrößerung), das heißt 24,6/70,7 = 0,348 bei dem oben gegebenen Beispiel.
In einer bevorzugten Ausführungsform läßt sich eine wirksame Lichtsammlung darüber hinaus durch Anordnen der Probenplatte so dicht wie möglich an der Abbildungslinse erreichen und durch Ausbilden der Linsenstärken derart, daß der Konus des in den faseroptischen Taper eintretenden Lichts gerade dessen numerische Öffnung (NA) ausfüllt.
Bei einer ersten bevorzugten Ausführungsform weist der Taper einen Durchmesser von 110 mm mit einer Verkleinerung von 2,87 auf. Linsen mit einer Öffnung in der Größenordnung von F 1,1 oder besser werden bevorzugt.
Im allgemeinen ist die Abbildungslinse eine komplexe Linse aus einer Anzahl von getrennten Linsenbauteilen.
Die Lichtquelle ist vorzugsweise eine Laserlichtquelle.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann eine zweite Feldlinse in dichter Anordnung an der Probenplatte zum Auswählen von im allgemeinen senkrecht zu dieser einfallenden Strahlen eingebaut werden, selbst nahe an der Plattenkante. Dadurch werden Parallaxenauswirkungen auf ein Minimum zurückgeführt.
Jede oder beide der Feldlinsen können einfache Ein-Element-Linsen oder mit Vorteil auch Viel-Element-Linsen sein.
Im allgemeinen sind die Abbildungs- und Feldlinsen ein aus mehreren Teilen bestehendes Einzelsystem mit der Eigenschaft der Telezentrinzität am Objekt und Bild, das heißt der Fähigkeit zum Auswählen von Strahlen, die im Durchschnitt senkrecht zum Objekt verlaufen, und das Bild ist parallaxenfrei.
Beschreibung der Beispiele
In den beiliegenden Zeichnungen
sind die 1(a), (b) und (c) vorgesehen zum schematischen Darstellen eines Vergleichs zwischen verschiedenen möglichen Anordnungen und
zeigen die 2 und 3 verschiedene praktische, ein erfindungsgemäßes System verkörpernde Ausführungsformen.
Es wird angenommen, daß die Linsen in den 1(a) und 1(c) hochwertige vielteilige Linsen sein können.
Ein Beispiel für eine im Prinzip bekannte Anordnung verwendet eine nackte gekühlte CCD und wird in 1(a) schematisch gezeigt. Zum Abbilden der Probenplatte 12 auf der CCD 14 verwendet sie eine Linse 10. Eine typische 1"-CCD weist 1024 × 1024 Pixel auf, und diese sind 24 Mikorn × 24 Mikron groß. Ein Verschluß 16 (oder eine Blende) ist in den Lichtweg eingeschlossen zum Schutz der CCD, falls eine starke Lichtquelle, zum Beispiel ein Laser, zum Erregen einer Fluoreszenz in der Probe verwendet wird, insbesondere falls ein zeitaufgelöstes (time-resolved) Fluoreszenzverfahren verwendet wird (das heißt Licht an, Licht aus, die Probe Lesen, Wiederholen).
Unter anderen Bedingungen kann der Verschluß oder die Blende zum Herabsetzen des frame shift smear wie bei Verwendung von selbstlumineszierenden Proben verwendet werden.
Eine allgemein bekannte Alternative zum Abbilden mit Linsen ist das Kontaktabbilden, bei dem die Probenplatte 12 der CCD unmittelbar dargeboten wird, entweder über eine 1 : 1 dünne faseroptische Platte, an die die CCD angesetzt ist, oder über einen verkleinernden Taper, an den die CCD angesetzt ist. Dies wird in 1(b) gezeigt, in der ein Taper 18 (der im typischen Fall am Eingang einen Durchmesser von 78 mm aufweist) die Betrachtung einer Platte 12 in vier shots (oder Belichtungen) zuläßt. Falls ein höherer Wirkungs grad bei der Lichtaufnahme gewünscht wird, sollte Kontaktabbildung bevorzugt werden. 1(b) zeigt eine nackte gekühlte CCD 14, statt der aber auch eine lichtverstärkende CCD verwendet werden könnte.
Der relative Wirkungsgrad der Lichtaufnahme der Abbildung über Linsen und der Kontaktabbildung mit einem Taper wird auch in den 1(a) und 1(b) gezeigt. Im Fall einer Linse gilt die in 1(a) dargestellte Standardformel mit den Bezeichnungen Verkleinerung m und dem Verhältnis F von Brennweite zu Durchmesser. Dies bedeutet, daß selbst bei einer hochwertigen F 1,1-Linse im gegebenen Beispiel nur ein Gesamtwirkungsgrad von nur etwa 0,7 % erreichbar ist. Die Linse weist den Vorteil auf, daß sie die Probe in einem Arbeitsgang betrachten kann. Auch ein Verschluß kann verwendet werden, wie oben erwähnt wurde. Bei einer Abbildung mit Taperkontakt gemäß der Darstellung in 1(b) läßt sich ein Wirkungsgrad von etwa 3 % erreichen, das heißt vier- bis fünfmal so hoch wie bei der Linse. Bei der Formel für den Taper ergibt sich ein Faktor von 0,7 aus der Packungsdichte der Fasern im Taper. Ein Faktor 1/4 ergibt sich aus der Tatsache, daß die Betrachtung der gesamten Platte vier Abbildungen erfordert, und es ergibt sich ein Faktor von 1/m², wobei m die Taperverkleinerung ist.
Eine bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform der Abbildung mit Linsen-Taper wird in 2 gezeigt, bei der eine Feldlinse 20 die Strahlen von der Abbildungslinse 24 so beugt, daß sie zum Herabsetzen von Parallaxen- und Lichtverlusten senkrecht zum Taper 22 stehen, das heißt, die Anordnung ist telezentrisch. Die Abbildungslinse 24 bündelt die Probenplatte 26 auf der CCD-Kamera 28. Die Linsenstärken werden so ausgewählt, daß der in den Taper 22 eintretende Lichtkonus gerade seine numerische Öffnung einnimmt. Aus den oben genannten Gründen wird ein Verschluß 30 verwendet. Der optische Pfad zwischen der Feldlinse 20 und dem Taper 22 ist telezentrisch.
1(c) enthält eine Formel mit Darstellung des Wirkungsgrads der in 2 gezeigten Anordnung für m = 4,47 und zeigt, daß der gleiche Wirkungsgrad von 3,5 % wie allein mit einem Taper auch mit einer Linsen-Taperkombination erreicht werden kann, vorausgesetzt, daß das NA der Linse so gewählt wird, daß sie die numerische Öffnung des Tapers ausfüllt. In diesem Beispiel bedeutet dies eine geringere NA von 0,224.
Der Grund, aus dem eine Linse allein wie in 1(a) nicht so wirkungsvoll wie die Linsen-Taperanordnung von 1(c) sein kann, liegt darin, daß die Linse in 1(a) die numerische Öffnung der CCD, die Eins ist, nicht ausfüllen kann, während der Taper in 1(b) einen Ausgang von NA = 1 aufweisen kann und damit der CCD-NA gleichkommt.
Es sei erwähnt, daß auch eine andere Feldlinse geeigneter Stärke mit Vorteil vor der Probenplatte, das heißt zwischen der Probenplatte und der Abbildungslinse, eingesetzt werden könnte. Diese zusätzliche Feldlinse nimmt die Lichtstrahlen auf einer Durchschnittsnormalen zu der Probe auf und richtet sie auf die Abbildungslinse. Diese telezentrische Anordnung setzt die Auswirkungen der Parallaxe herab, die zu einem Verlust an aus der Tiefe der Sacklöcher einer Probenplatte empfangenem Licht führen könnten.
3 zeigt eine gerade unter der Probenplatte 26 befestigte zweite Feldlinse 32, die Licht aufnimmt, das auf einer Durchschnittsnormalen zu der Platte steht. Das Sammeln der normalen Strahlen verläuft über der gesamten Fläche der Platte selbst an den Kanten. Gemäß der obigen Beschreibung minimiert diese telezentrische Anordnung die Auswirkungen der Parallaxe, die sonst das Sammeln von Licht von tief unten aus einem Probenplatten-Sackloch erschweren würde. Die hier erläuterten Abbildungstechniken können mit Vorteil in Systemen zum Analysieren von Photonen emittierenden Analysen verwendet werden, wie sie in der GB-Patentschrift Nr. 2 294 319 beschrieben werden.
Es sei noch erwähnt, daß die Brennweite und die relativen Öffnungen in 2 ebenso wie der axiale Separator der einzelnen Teile angegeben werden. Die entsprechenden Einzelheiten der in 3 gezeigten Anordnung lassen sich leicht errechnen. Sie sind jedoch anders als die in 2 angegebenen Einzelheiten.

Claims

Ein optisches System zum Abbilden einer Probenplatte (26) auf einer Kameravorrichtung, wobei das System eine CCD-Kamera (28), mindestens eine Linse und einen faseroptischen Taper (20) enthält und die Probenplatte auf der CCD-Kamera durch eine optische Kombination aus mindestens dieser einen Linse abgebildet wird, durch die das Licht in den faseroptischen Taper eintritt, dadurch gekennzeichnet, daß die Linse eine komplexe Linse und so ausgebildet ist, daß sie mindestens an ihrem Ausgang telezentrisch ist, so daß das Licht an jeder Stelle ihrer Eingangsseite auf einer Durchschnitts-Senkrechten dazu in den Taper eintritt.
Ein System nach Anspruch 1, wobei die Linse eine Vielteil-Linse ist.
Ein System nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die CCD-Kamera eine nackte gekühlte (bare cooled) CCD-Kamera oder eine versterkende (intensified) CCD-Kamera ist.
Ein System nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, wobei ein Verschluß (30) oder eine Blende im Lichtweg zwischen der Probe und der CCD-Kamera enthalten ist.
Ein System nach Anspruch 4, wobei der Verschluß zwischen der Linse und dem Tapereingang oder zwischen der Probe und der Linse angeordnet ist.
Ein System nach Anspruch 4, bei Abhängigkeit von Anspruch 2, wobei der Verschluß zwischen jedem beliebigen Teilepaar der Vielteil-Linse angeordnet ist.
Ein System nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die gesamte Probenplatte mit einer einzigen Belichtung abgebildet und analysiert wird.
Ein System nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, wobei ein Teil der Probenplatte zu einem Zeitpunkt abgebildet wird, so daß die gesamte Platte mit vielen Belichtungen abgebildet und analysiert werden kann.
Ein System nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die komplexe Linse eine dicht an der Probe angeordnete Abbildungslinse und eine dicht an dem Tapereingang angeordnete Feldlinse aufweist.
Ein System nach Anspruch 9, wobei die Feldlinse zum Biegen der Lichtstrahlen dient zum Erreichen einer Durchschnitts-Senkrechten zu dem Taper, um damit jegliche Lichtverluste aufgrund von außerhalb des maximal annehmbaren Winkels von θ = sin^–1(NA) in den Taper eintretenden Strahlen zu minimieren, wobei NA die numerische Öffnung des Tapers (gleich der Vergrößerung) ist.
Ein System nach Anspruch 9 oder Anspruch 10, wobei ein wirkungsvolles Sammeln des Lichts dadurch erreicht wird, daß die Probenplatte so dicht wie möglich an die Abbildungslinse herangebracht wird und die Linsenstärken so eingerichtet werden, daß der in den faseroptischen Taper eintretende Lichtkonus die numerische Öffnung (NA) des Tapers mindestens im wesentlichen ausfüllt.
Ein System nach irgendeinem der Ansprüche 9 bis 11, wobei der Wirkungsgrad des Sammelns des Lichtes in der Größenordnung von 3,5 % liegt.
Ein System nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 12, wobei der Taper zu einer Entvergrößerung in der Größenordnung von 2,87 führt.
Ein System nach irgendeinem der Ansprüche 9 bis 13, wobei die Abbildungslinse eine numerische Öffnung von zum Füllen der numerischen Öffnung des Tapers ausreichender Größe aufweist.
Ein System nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die komplexe Linse so ausgebildet ist, daß sie auch an ihrem Eingang telezentrisch ist.
Ein System nach Anspruch 9 oder irgendeinem von diesem abhängigen Anspruch, wobei die komplexe Linse auch eine dicht an der Probenplatte eingebaute zweite Feldlinse enthält zum Auswählen von Strahlen im allgemeinen senkrecht zu der Platte, selbst nahe der Kante der Platte, und zum Minimieren von Parallaxen-Effekten auf diese Weise.
Ein System nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 12 mit Verwendung einer Laserlichtquelle zum Beleuchten der Probe.
Ein System nach Anspruch 16, wobei beide Feldlinsen Vielteil-Linsen sind.