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Die
vorliegende Erfindung betrifft Öl
aus Samen mit einem Palmitinsäuregehalt
von mehr als 20 Gew.-% und weniger als 40 Gew.-% auf Basis des Gesamtfettsäuregehaltes,
während
der Palmitolsäuregehalt weniger
als 4% auf Basis des Gesamtfettsäuregehaltes
und der Asclepiolsäuregehalt
(n-7 Isomer der Ölsäure) weniger
als 4% ist.
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Im
Besonderen betrifft die Erfindung Sonnenblumenöl, das einen Ölsäuregehalt
von mehr als 5 Gew.-% und weniger als 65 Gew.-% auf Basis des Gesamtfettsäuregehaltes,
einen Linolsäuregehalt
von weniger als 65 Gew.-% auf Basis des Gesamtfettsäuregehaltes,
einen Palmitinsäuregehalt
von mehr als 20 Gew.-% und weniger als 40 Gew.-% auf Basis des Gesamtfettsäuregehaltes,
einen Stearinsäuregehalt
von mehr als 3 Gew.-% und weniger als 15 Gew.-% auf Basis des Gesamtfettsäuregehaltes
umfasst, während
der Palmitolsäuregehalt
weniger als 4% des Gesamtfettsäuregehaltes
und der Asclepiolsäuregehalt
weniger als 4% auf Basis des Gesamtfettsäuregehaltes ist.
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Das Öl der Erfindung
kann für
Anwendungen in der Nahrungsmittelindustrie, die hohe Thermostabilität oder plastische
Fette benötigt,
verwendet werden.
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Hintergrund der Erfindung
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Die
Sonnenblume wird im Allgemeinen kultiviert, um Öl, das gesättigte Fettsäuren (Palmitinsäure und Stearinsäure) und
ungesättigte
Fettsäuren
(Ölsäure und
Linolsäure)
hat, zu erhalten, wobei der Stearinsäuregehalt immer weniger als
10% ist (Gunstone, F.D. et al. „The lipid handbook"; Chapman and Hall,
1986), wobei er normalerweise zwischen 3 und 7% liegt. In Bezug
auf die ungesättigten
Fettsäuren
gibt es zwei verschiedene Arten von Sonnenblumensamen: die normale
Sonnenblume, die einen Linolsäuregehalt
zwischen 50 und 70% hat, (Knowles, P.F. „Recent advances in oil crops
breeding"; AOCS
Proceedings, 1988) und die Sonnenblume mit hohem Ölsäuregehalt,
die 2–10%
Linolsäure
und 75–90% Ölsäure hat
(Sodatov, K.I. „Chemical
mutagenesis in sunflower breeding"; Int. Proc. 7th Intern.
Sunflower Conference, 352–357,
1976). Fick bezieht sich auf eine andere Sonnenblumenlinie mit hohem Ölsäuregehalt
(US-B1-4, 627,192) mit einem Ölsäuregehalt von
wahrscheinlich 80% oder mehr.
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Hinsichtlich
gesättigter
Fettsäuren
sind Sonnenblumenlinien mit hohem Stearinsäuregehalt in der WO 95/20313
offenbart. Weitere Referenzen zu Sonnenblumenlinien mit hohem Palmitinsäuregehalt
sind WO 96/39804 (die sich auf US-A-5,710,366 bezieht) und Retske et al. „Triacylglycerol
composition and structure in genetically modified sunflower and
soybean oils"; JAOCS
74, 989–998
(1997), Europäische
Patentanmeldung 98201871.5 und Nikolova et al. "Gametocidal effect of gibberellic aid
(GA3) on biochemical characteristics of sunflower
seeds", Helia 15,
Nr. 17, 45–50,
(1992). Bei allen diesen Linien schließt der Anstieg der Palmitinsäure höhere Palmitolsäuregehalte,
immer über
4%, ein und, wo die zwei "cis"-Isomere n-7 Octadecensäure (Asclepiol)
und n-9 Octadecensäure
(Öl) analysiert
worden sind, ist ein Anstieg des n-7 Isomers (Asclepiolsäure) beobachtet
wurde.
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Tabelle
1 zeigt die Fettsäurezusammensetzung
für all
diese aufgezeigten Sonnenblumenölvarianten.
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Der
Gehalt an gesättigten
Fettsäuren
eines Öls
ist direkt mit dessen physikalischen und chemischen Charakteristika
verbunden. Für
den Fall, dass der Gehalt ausreichend hoch ist, kann das Öl wie einige
Tierfette bei Raumtemperatur fest sein. Normales Sonnenblumenöl ist unter
diesen Bedingungen immer eine Flüssigkeit.
In der Nahrungsmittelindustrie werden für die Herstellung von Süßwaren oder
Margarine normalerweise Tierfette oder hydrierte Pflanzenfette verwendet,
da ein festes oder halbfestes Produkt erforderlich ist. Ungesättigte Fettsäuren werden
durch Hydrierung in gesättigte
Fettsäuren
umgewandelt. Tierische Fette als auch hydrierte Fette sind vom Standpunktder
Ernährung
aus gesehen nicht sehr empfehlenswert (Chow, C.K. „Fatty acids
in food and their health implications", Dekker, N.Y., 1992). Tierische Fette
haben einen relativ hohen Cholesteringehalt. Zu viel Cholesterin
in der Nahrung kann nachteilig für
die Gesundheit sein. Deshalb sind tierische Fette in den letzten
Jahren durch hydrierte pflanzliche Fette, die kein Cholesterin enthalten,
ersetzt worden.
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Die
hydrierten Fette weisen jedoch ein anderes Problem auf, dass sich
aus dem Hydrierungsprozess ableitet. In dem Verfahren treten eine
positionsbezogene Isomerisierung (Shift von Doppelbindungen) und
stereochemische Transformationen (Bildung von „trans"-Isomeren) auf. Isomere werden in einer
Menge von bis zu 30–50%
der gesamten Fettsäuremenge
erzeugt. Diese Isomere sind vom Standpunkt der Ernährung aus gesehen
nicht sehr gesund (Wood, R. „Biological
effects of geometrical and positional isomers of monounsaturated
fatty acids in humans",
Dekker, N.Y. 1990; Willet, W.C. & Ascherio,
A., „Trans
Fatty Acids: Are the effects only marginal?", American Journal of Public Health,
Vol. 84, 5, 1994). Deshalb sollte die Verwendung von hydrierten
Fetten in der Nahrungsmittelindustrie vermieden werden.
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Wie
bisher berichtet, schließt
der Anstieg der Palmitinsäure
höhere
Palmitolsäuregehalte
ein, immer über
4% (siehe WO 96/39804). Diese Öle
sind für
die Nahrungsmittelindustrie, die hohe Thermostabilität verlangt,
nützlich,
aber die Anwesenheit der aufgezeigten Palmitolsäuregehalte ist weiterhin unerwünscht. Studien,
die für
Macadamiaöl,
das einen Palmitolsäuregehalt
von 4% hat, durchgeführt
wurden, deuten im Vergleich zu Palmitinsäure und Ölsäure einen negativen Effekt
auf das plasmatische Cholesterin an (Nestel et al., „Effects
of increasing dietary palmitoelic acid compared with palmitic and
oleic acids on plasma lipids of hypercholesterolemic men", Journal Lipid Research,
Vol. 35, S. 656–662,
1994). Dieses Öl
hat ebenfalls höhere
Asclepiolsäuregehalte
(n-7 Isomer der Octadecansäure)
als andere normale Sonnenblumenöle,
die 0.6% haben, oder andere pflanzliche Öle wie Sojabohnen oder Raps,
die 0.8% bzw. 0.9% haben (Mukherjee K.D, and Kiewitt I., „Formation
of (n-9) and (n-7) cis-monounsaturated fatty acids in seeds of higher
plants", Planta,
Vol. 149, S. 462–463).
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Man
kann zu dem Schluss kommen, dass ein Öl mit höheren Palmitin- und Stearinsäuregehalten
als normales Sonnenblumenöl,
das aber verringerte Niveaus an Palmitol- und Asclepiolsäure beibehält, alle
Anforderungen der Nahrungsmittelindustrie, die hohe Thermostabilität und Plastizität voraussetzt,
erfüllt.
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Kurze Beschreibung der
Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Öl
aus Samen, die einen Ölsäuregehalt
von mehr als 5 Gew.-% und weniger als 65 Gew.-% auf Basis des Gesamtfettsäuregehaltes,
einen Linolsäuregehalt
von mehr als 1 Gew.-% und weniger als 65 Gew.-% auf Basis des Gesamtfettsäuregehaltes,
einen Palmitinsäuregehalt
von mehr als 20 Gew.-% und weniger als 40 Gew.-% auf Basis des Gesamtfettsäuregehaltes,
einen Stearinsäuregehalt
von mehr als 3 Gew.-% und weniger als 15 Gew.-% auf Basis des Gesamtfettsäuregehaltes
umfasst, während
der Palmitolsäuregehalt
weniger als 4% auf Basis des Gesamtfettsäuregehaltes und der Asclepiolsäuregehalt
weniger als 4% auf Basis des Gesamtfettsäuregehaltes ist. Bevorzugt
ist der Palmitolsäuregehalt weniger
als 3% auf Basis des Gesamtfettsäuregehaltes
und der Asclepiolsäuregehalt
ist weniger als 3% auf Basis des Gesamtfettsäuregehaltes.
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Das Öl aus Samen
gemäß der vorliegenden
Erfindung hat einen Ölsäuregehalt,
der weniger als 40 Gew.-% auf Basis des Gesamtfettsäuregehaltes
ist, und einen Linolsäuregehalt,
der weniger als 18% ist. Das Gesamtniveau der gesättigten
Fettsäuren
des Öls
ist wenigstens 26%, bevorzugt höher
als 35%, am bevorzugtesten höher
als 45% auf Basis des Gesamtfettsäuregehaltes.
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In
Bezug auf die Position der Fettsäuregruppen
in dem Triacylgycerol (TAG) sind weniger als 10 Gew.-%, bevorzugt
weniger als 5 Gew.-% der gesättigten
Fettsäuregruppen
des Öls
der Erfindung in der 2-Position der TAGs.
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Die
Erfindung betrifft im Besonderen Sonnenblumenöl, das aus Sonnenblumensamen,
die durch Kreuzen von Sonnenblumensamen der mutanten Sonnenblumenlinie
IG-1297M, die am 20. Januar 1998 bei der ATCC unter der Hinterlegungs-Akzessionsnummer
ATCC-209591 hinterlegt
wurde, mit der mutanten Sonnenblumenlinie CAS-3, die am 14. Dezember
1994 bei der ATCC unter der Hinterlegungs-Akzessionsnummer ATCC-75968
hinterlegt wurde, erhalten werden, extrahiert wird.
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Die
Erfindung betrifft des weiteren Sonnenblumensamen, die ein Sonnenblumenöl mit einer
Fettsäurezusammensetzung
wie hier oben beschrieben umfasst, und betrifft ein Verfahren zur
Herstellung von Sonnenblumensamen, das die Schritte umfasst:
- a) Kreuzen von Sonnenblumensamen der mutanten
Sonnenblumenlinie IG-1297M, die am 20. Januar 1998 bei der ATCC
unter der Hinterlegungs-Akzessionsnummer ATCC-209591 hinterlegt wurde, mit der mutanten
Sonnenblumenlinie CAS-3, die am 14. Dezember 1994 bei der ATCC unter
der Hinterlegungs-Akzessionsnummer ATCC-75968 hinterlegt wurde;
- b) Selbstbefruchten von F1-Pflanzen der Nachkommenschaft nach
Schritt a) für
wenigstens zwei Generationen, um Inzuchtpflanzen herzustellen;
- c) Auswählen
von Pflanzen aus der Nachkommenschaft aus Schritt b) mit Samen die
ein Öl
mit einem Palmitinsäuregehalt
von mehr als 20%, einem Palmitolsäuregehalt von weniger als 4%
und einem Asclepiolsäuregehalt
von weniger als 3% enthalten;
- d) Sammeln der Samen der Nachkommenschaft aus Schritt c) und
optional
- e) Wiederholen des Zyklusses der Selbstbefruchtung, Auswahl
und Sammlung der Samen.
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Die
Erfindung betrifft des weiteren Pflanzen, die den Samen der Erfindung
erzeugen, und Pflanzen, die durch Züchten der Samen der Erfindung
und ihrer Abkömmlinge
erhältlich
sind.
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Das
Sonnenblumenöl,
das durch Extrahieren der Sonnenblumensamen hergestellt wird, kann
beim Rösten,
Kochen, Braten, Backen und im Allgemeinen unter Hochtemperaturbedingungen,
die Erhitzen mit irgendwelchen Mittel bei Temperaturen von wenigstens
70° darstellen,
verwendet werden. Das Öl
kann ebenso in der Herstellung essbarer Fette oder Fettmischungen
wie z.B. Margarine, Butter oder pflanzlichen Milchprodukten, als
auch in der Feinbäckerei
und Bäckerei
verwendet werden.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Das
Verfahren zur Herstellung von Samen mit einer modifizierten Fettsäurezusammensetzung
umfasst die Mutagenese der Samen mit einem geeigneten mutagenen
Agens. Die Mutagenese wird vererbbare genetische Veränderungen
in der DNA der Samen erzeugen. Gemäß der Erfindung war es nach
verschiedenen unterschiedlichen Experimenten möglich, einige Behandlungen,
die eine höhere
Anzahl genetischer Modifikationen in den Genen, die die Fettsäurebiosynthese
der Samen kontrollieren, erzeugen, auszuwählen. Diese Behandlungen umfassen
die Verwendung von Natriumazid oder einem alkylierenden Agens wie
z.B. Ethylmethansulfonat. Natürlich
kann jedes andere mutagene Agens, das gleiche oder ähnliche
Wirkungen hat, verwendet werden.
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Die
nächste
Samengeneration wurde dann mit einem neuen Verfahren, das von Garcés, R.
and Mancha, M. „One
step lipid extraction and fatty acid methyl esters preparation from
fresh plant tissues";
Analytical Biochemistry, 211:139–143, 1993) beschrieben wurde,
analysiert. Dies ermöglichte
den Nachweis von Samen mit Modifikationen in der Zusammensetzung
jeder Fettsäure.
Ausgewählte
Samen, die eine erwünschte
Fettsäurezusammensetzung
aufweisen, sind bis zur fünften
Generation kultiviert worden, wobei sie zeigten, dass dieses neue
genetische Merkmal vererbbar und stabil und unabhängig von
den Wachstumsbedingungen ist. In dem Verfahren der Erfindung werden
die Muttersamen z.B. innerhalb von zwei Stunden bei Raumtemperatur
mit einer Lösung
von 70 mM Ethylmethansulfonat in Wasser oder innerhalb von zwei
Stunden bei Raumtemperatur mit einer Lösung von 2 mM Natriumazid in
Wasser behandelt. Des weiteren können
sich herkömmliche
Techniken zur Optimierung von Pflanzen an die Mutations- und Auswahlschritten
anschließen,
was somit zu Samen mit einem erwünschten
Fettsäuregehalt
führt.
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Die
Samen der Erfindung können
einer oder mehreren weiteren Mutationsbehandlungen unterzogen werden.
Ein anderer Weg, um mutagenisierte Samen zu erhalten, besteht darin,
die Samen dem Einfluß von Röntgenstrahlen
auszusetzen, die behandelten Samen zu züchten, selbst zu befruchten
und einer weiteren Analyse des Fettsäuregehaltes. Weitere Zucht
und Auswahlschritte werden zu Pflanzen mit dem erwünschten festgelegten
neuen Charakter führen.
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Sonnenblumenöl mit der
erwünschten
Fettsäurezusammensetzung
kann durch Extraktion aus Sonnenblumensamen der Erfindung in einer
dem Durchschnittsfachmann bekannten Art und Weise hergestellt werden.
Diese Extraktionsverfahren sind gut bekannt und z.B. in „Bailey's industrial oil
and fat products",
Vol. 2, Chapter 3; 4th Edition, John Wiley
and Sons, New York (1982) beschrieben.
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Durch
die bezeichneten Verfahren können
Samen und Öl
mit hohem Stearinsäure-
und hohem Palmitinsäuregehalt
erhalten werden. Ein hoher Palmitinsäuregehalt schließt normalerweise
einen hohen Palmitolsäuregehalt
ein, was von Standpunkt der Ernährung
aus gesehen, wie zuvor angedeutet, nicht erwünscht ist. Biochemische Forschung
an Mutantenlinien von Sonnenblumen zeigen jedoch, dass der Mutant
mit hohem Stearinsäureanteil
weniger Stearoyldesaturase-Aktivität gegenüber Palmitoyl-ACP als andere
Sonnenblumenmutantlinien hat. Es hat sich gezeigt, dass sich durch
das Kreuzen einer Linie mit hohem Stearinsäureanteil (CAS-3) mit einer
Linie mit hohem Palmitinsäureanteil
(CAS-12) und das Auswählen
auf der Suche nach verschiedenen Fettsäurezusammensetzungen, in bestimmten
F2-Generationen diese Mengen an Palmitol- und Asclepiolsäure verringerten.
Somit könnte
die Entsättigung
von Palmitinsäure
in Palmitolsäure
bei den Mutanten mit hohem Palmitinsäureanteil durch Einbringen
der enzymatischen Aktivität
der Stearoyldesaturase der Mutantlinien mit hohem Stearinsäureanteilen
verringert werden.
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Die
Erfindung wird mittels der folgenden Beispiele weiter veranschaulicht.
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Beispiel 1:
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Die
Sonnenblumensamen RDF-1-532 (Sunflower Collection of Instituto de
Agricultura Sostenible, CSIC, Córdoba, Spain), die einen
Stearinsäuregehalt
von 4–7%
haben, wurden mit einer Lösung
von 70 mM Ethylmethansulfonat (EMS) in Wasser mutagenisiert. Die
Behandlung wurde bei Raumtemperatur innerhalb von zwei Stunden unter
Schütteln
(60 rpm) durchgeführt.
Nach der Mutagenese wurde die EMS-Lösung verworfen, und die Samen
wurden innerhalb von 16 Stunden mit Leitungswasser gewaschen.
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Man
ließ die
behandelten Samen im Feld auskeimen, und die Pflanzen wurden selbstbefruchtet.
Die von diesen Pflanzen gesammelten Samen wurden verwendet, um neue
Sonnenblumenlinien mit Modifikationen in der Fettsäurezusammensetzung
auszuwählen.
Unter Verwendung des Verfahrens von Garces, R. und Mancha, M, auf
das oben hier Bezug genommen wurde, wurde, nachdem die Fettsäuren in
ihre entsprechenden Methylester umgewandelt wurden, die Fettsäurezusammensetzung
des Samens durch Gas-Flüssigchromatographie
bestimmt.
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Eine
erste Pflanze mit einem Stearinsäuregehalt
in dem Öl
von 9–17%
wurde ausgewählt.
Die Nachkommenschaft wurde über
fünf Generationen
kultiviert, wobei der Stearinsäuregehalt
anstieg und das neue genetische Merkmal im genetischen Material
des Samens fest fixiert wurde. Diese Linie wird CAS-3 genannt. Eine
ausgewählte
Probe dieser Linie wurde analysiert, was zu einem Stearinsäuregehalt
von 26% führte
(Tabelle 2). Der minimale und der maximale Stearinsäuregehalt
der Linie war 19% bzw. 35%. Der Stearinsäuregehalt des Öls, das
aus Samen dieser Zelllinie extrahiert wurde, kann zwischen 19% und
35% liegen.
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Beispiel 2
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Die
Sonnenblumensamen RDF-1-532 wurden mit Natriumazid bei einer Konzentration
von 2 mM in Wasser mutagenisiert. Die Behandlung wurde bei Raumtemperatur
innerhalb von 2 Stunden unter Schütteln durchgeführt. Dann
wurde die Mutageneselösung
verworfen, und die Samen wurden innerhalb von 16 Stunden mit Leitungswasser
gewaschen.
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Die
Samen wurden in das Feld eingepflanzt, und die Pflanzen wurden selbst
befruchtet. Die Samen aus diesen Pflanzen wurden gesammelt und die
Fettsäurezusammensetzung
wurde durch Gas-Flüssigchromatographie
bestimmt, nachdem die Fettsäuren
in ihre entsprechenden Methylester unter Verwendung des in Beispiel
1 beschriebenen Verfahrens umgewandelt wurden. Die Samen von einer
Pflanze, die ungefähr
10% Stearinsäure
in dem Öl
hatten, wurden ausgewählt
und über
fünf Generationen
kultiviert. Während
dieses Verfahrens stieg der Stearinsäuregehalt an, und das neue
genetische Merkmal wurde fixiert. Diese Linie wird CAS-4 genannt.
Eine ausgewählte
Probe dieser Linie wurde analysiert, was zu einem Stearinsäuregehalt
von 16.1% führte.
Die minimalen und die maximalen Werte waren 12% bzw. 19%.
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Beispiel 3
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5.000
trockene Sonnenblumensamen wurden durch Behandlung mit Röntgenstrahlen
300 cGy/min, Strahl 200 kV, 18 mA–1 und
Dosis 160 Gy mit einem Siemens Stabilipan (Erlangen, Germany) mutagenisiert, wobei
die Samen im Frühjahr
auf dem Felde gezüchtet
wurden. Selbstbefruchtete Pflanzen wurden einzeln gesammelt und
die Samen bezüglich
ihres Fettsäuregehaltes
analysiert. Es wurden Samen mit einem wenigstens dreimal höheren Gehalt
an gesättigten
Fettsäuren
als die Standardabweichung für
die spezifischen Fettsäuren
ausgewählt
und sukzessive gezüchtet,
bis der neue Charakter fixiert war. Verschiedene mutmaßliche neue
Mutantlinien wurden durch dieses Verfahren ausgewählt. Nach
weiterer Auswahl für
Triacylglycerolzusammensetzung wurde die Linie IG-1297M ausgewählt.
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Beispiel 4
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Sonnenblumenpflanzen
wurden aus den Sonnenblumensamen von CAS-3 gemäß Beispiel 1 gezüchtet. Sonnenblumenpflanzen
wurden aus den Sonnenblumensamen von IG-1297M gemäß Beispiel
3 gezüchtet.
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Die
Linien wurden gekreuzt. Man unterstütze die Pflanzen mit künstlicher
Bestäubung,
um sicherzustellen, dass eine adäquate
Samenproduktion auftrat. Der F1 wurde aus dem IG-1297M hergestellt
und geerntet. F2 IG-1297M Muttersamen mit einem hohen Ölsäuregrundgehalt,
die mehr als 20% Palmitinsäure
und weniger als 4% sowohl von Palmitolsäure als auch von Asclepiolsäure haben,
wurden ausgewählt.
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Obwohl
das durch diese ausgewählten
Linien hergestellte Öl
das Öl
der vorliegenden Erfindung ist, ist das Niveau der Herstellung begrenzt,
weshalb fixierte Inzuchtlinien, die Samen mit diesen Ölprofilen
zeigen, wünschenswert
sind. Da diese homozygot fixierten Inzuchtlinien mit hohem Ölsäure-, hohem
Palmitinsäure-, niedrigem
Palmitolsäure-,
niedrigem Asclepiolsäuregehalt
können
dann gekreuzt werden, um Hybridsamen zu bilden, die F2-Samen, die
die erwünschten
Merkmale des Öls
der vorliegenden Erfindung zeigen, erzeugen.
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Aus
diesem Grund wurden F1-Samen gezüchtet
und die hergestellten Pflanzen wurden unter isolierten Bedingungen
einzeln gehalten, und F2-Samen wurden hergestellt. Der F2-Samen, der QQ-3598-M
bezeichnet wird, wurde für
vier Merkmale getestet: hoher Palmitinsäure-, hoher Ölsäure-, hoher
Palmitolsäure- und
hoher Asclepiolsäuregehalt.
Der restliche Teil der Samen, die diese Merkmale zeigen, wurde verwendet, um
Pflanzen zu züchten,
um F3-Samen zu bilden. Das Abgrenzungs- und Screen- und Auswahlverfahren wird wiederholt,
um die fixierte homozygote QQ-3598-M Linie zu entwickeln, wobei
sie die folgenden Fettsäureprofile
hat: C16:0 30.5%; C18:0 9.6%; C18:1 47.2%; C18:2 6.7%; C16:1 2.1%;
C18:1A 1.1% und weniger als 1% anderer kleinerer Fettsäuren.
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Sobald
das Merkmal fixiert ist, können ähnliche
QQ-3598-M Linien gekreuzt werden, um Hybridsamen mit den erwünschten
Merkmalen zu bilden. Dieses charakteristische Fettsäureprofil
ist ein vererbbares Merkmal und ist gänzlich unabhängig von
den Züchtungsbedingungen.