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Die
Erfindung betrifft ein kontinuierliches oder halbkontinuierliches
Verfahren zur Herstellung von Metaboliten aus Pflanzen in erdloser
Kultur, ohne daß die
Lebensfähigkeit
der Pflanzen verlorengeht, sowie eine Anlage zur Durchführung des
Verfahrens.
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Pflanzen
produzieren eine Vielzahl von Molekülen, die als Medikamente, Farbstoffe,
Aromen, Nahrungszusätze
oder Pestizide verwendet werden. Diese Verbindungen sind oft typisch
für eine
Familie einer bestimmten Pflanzenart oder -spezies. Man rechnet
sie zu den sekundären
Metaboliten, da sie für das Überleben
nichtgestreßter
Pflanzen nicht unbedingt unentbehrlich zu sein scheinen (Bentley,
1999, Bourgaud et al., 1999, Gontier, 1993). Viele dieser Moleküle pflanzlichen
Ursprungs dienen oder dienten als Modelle für chemische Synthesen im Hinblick
auf eine kommerzielle Nutzung.. Bisweilen sind die Moleküle komplex,
und die Extraktion aus wilden Pflanzen bzw. aus Pflanzen, die im
Feld oder in vitro kultiviert werden, bleibt die beste Art der Versorgung
(Herman 1993).
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Besonders
für Moleküle mit hohem
wirtschaftlichen Wert (Kilogramm- und Volumenpreis am Markt) wurden
Zell- oder Gewebekulturen in Bioreaktoren entwickelt (Herman, 1993).
In diesem Falle müssen
die Kulturen axenisch sein, d.h., frei von Mikroorganismen (Bakterien
und Pilze), deren Gegenwart für
das Wachstum des pflanzlichen Materials und für die Produktion von Metaboliten
aus dem letzteren nachteilig sein konnte. Das Aufrechterhalten axenischer
Bedingungen ist mit der Zeit bisweilen schwierig und führt zu erheblichen
finanziellen Belastungen (Gontier, 1993). Durch den Einsatz von
verfeinerten Systemen für
in vitro-Kulturen (Fermenter) kommen bisweilen inakzeptable Kosten
hinzu, die das System wirtschaftlich nichttragfähig machen. Im allge meinen
ist die Erzeugung von Biomasse in vitro kostspielig. Um das System
rentabel zu machen, wird versucht, das Maximum an Molekülen von
dieser Biomasse produzieren zu lassen, ohne sie zu zerstören, und
sie maximal als Biokatalysator wiederzuverwenden (Herman, 1993).
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Die
Stimulierung der Produktion kann erreicht werden durch Zugabe von
Vorläufern
in das Kulturmedium (Boitel et al., 1997), durch reversible Permeabilisierung
der Biomasse oder durch physikalischen Streß (Erhöhung der Temperatur, Änderung des
pH, Verletzung), chemischen Streß (Zugabe der Salze CuSO4, NaCl, CaCl2, (NH4)2SO4 etc.
oder von anderen Permeabilisierungsmitteln, EDTA, DMSO, Tween 20,
anderen Tensiden oder Detergentien etc.) oder biochemischen Streß (Elicitation
etc.) etc. (Boitel et al., 1995–1997;
Weather et al., 1991; Herman, 1999; Mukundan et al., 1998).
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Ziel
dieser Manipulationen ist es, den Gang der Biosynthese durch Erhöhen des
gesamten Stroms der Vorläufer
hin zum gesuchten Molekül
zu forcieren. Zahlreiche Veröffentlichungen
berichten äußerst positive
Ergebnisse, die auf diesen verschiedenen Wegen erhalten wurden (darunter:
Boitel et al., 1995–1997;
Weather et al., 1991; Herman, 1993). Trotzdem bleibt das Problem
des axenischen Charakters der Kulturen völlig offen.
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Andere
Autoren beschreiben die Verwendung fungizider und antibiotischer
Cocktails, mit denen das Überleben
des pflanzlichen Materials unter nichtaxenischen Bedingungen sichergestellt
werden kann ("Plant
Preservative Mixture", üblicherweise
als PPM® bezeichnet).
In diesem Falle ist es schwierig, die Mikrobenhemmer so zu dosieren,
daß nur
die Bakterien und Pilze angegriffen werden, und dies ohne abträgliche Wirkung
auf die pflanzliche Biomasse.
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Eine
interessante Alternative zur in vitro-Kultur ist die Herstellung
von Molekülen
aus Pflanzen, die in der Natur geerntet oder auf Feldern angebaut werden.
Das Abernten in der Natur kann jedoch bei übermäßiger Ausbeutung zum Verschwinden
von Spezies führen
(Gontier, 1993). Auch kann es mit erheblichen qualitativen und quantitativen
Veränderungen
in der Herstellung verbunden sein. Die Kultivierung auf dem Feld
ist nicht immer realisierbar, da man die Pflanze nicht gut genug
kennt, oder – was noch
schwerwiegender ist – weil
es unmöglich
ist, wieder zu mittelfristigen Investitionen zurückzukehren. Dies ist häufig der
Fall bei Holzgewächsen,
z.B. bei der Eibe (Chen und Chen, 1997; Ketchum et al., 1999), die
langsam wachsen und deren Wachstum sich über Jahrzehnte hinzieht.
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Seit
einigen Jahren gab es bei diesen erdlosen Kulturen (Morard, 1995;
Toda et al., 1999) im Gewächshaus
oder im Freien eine Entwicklung, und sie ermöglichen nunmehr die Kultivierung
von Zier- oder Gemüsepflanzen
mit höherem
Rentabilitätsgrad.
Innerhalb von etwa fünfzehn
Jahren gab es bei diesen Techniken hinsichtlich der Vorrichtungen,
Nährlösungen sowie
der Steuerung und Automatisierung dieser Systeme glänzende Fortschritte
(Morard, 1995). Bis heute wurde kein Versuch zur Herstellung von
sekundären
Metaboliten aus solchen Kulturen unternommen, nicht einmal vorgeschlagen,
insbesondere zur Gewinnung von Metaboliten, die natürlich oder
nicht natürlich
von den Wurzeln der Pflanzen oder den oberirdischen Teilen ausgeschieden
werden. Insbesondere findet sich im Stand der Technik absolut kein Hinweis,
auch kein Vorschlag, daß es
a priori möglich ist,
solche Metaboliten zu gewinnen, ohne daß diese von der in den erdlosen
Kulturen vorhandenen Mikroflora abgebaut werden.
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Es
ist gegenwärtig
also nicht bekannt:
- – ob die Pflanzen allgemein
sekundäre
Metaboliten aus ihren Wurzeln oder Blättern in einer Weise ausscheiden,
daß diese
Erscheinung für
eine industrielle Anwendung genutzt werden kann;
- – ob
es möglich
ist, die natürliche
oder nicht natürliche
Ausscheidung dieser sekundären
Metaboliten bei Kulturpflanzen insbesondere in erdloser Kultur zu
steigern;
- – ob
eine Behandlung, die die Synthese und Ausscheidung dieser sekundären Metaboliten
bei der Pflanze begünstigt,
das Überleben
dieser Pflanze in einer Weise beeinflußt, daß eine industrielle Anwendung
nicht in Betracht kommt;
- – ob
die Metaboliten durch die Mikroflora, die sich um die so kultivierten
Pflanzen entwickeln kann, in erheblichem Ausmaß abgebaut werden oder nicht.
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Aufgabe
der vorliegenden Erfindung ist daher die Bereitstellung eines Verfahrens
zur Erzeugung von Molekülen
aus Pflanzen, das keine axenischen oder sterilen Bedingungen erfordert,
die Herstellung erheblicher Mengen erlaubt, wirtschaftlich rentabel
ist und nicht zur Zerstörung,
auch nicht zur teilweisen Zerstörung
der Pflanzen bei der Extraktion der gesuchten Moleküle führt.
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung
von Molekülen aus
Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, daß die Pflanzen unter erdlosen
Bedingungen kultiviert und mit einer Nährlösung versorgt und/oder mit
einer Waschflüssigkeit
besprüht
werden, wobei die Lösung und/oder
die Flüssigkeit
anschließend
wiedergewonnen und behandelt wird, um daraus einige bestimmte, darin
enthaltene Moleküle
zu extrahieren, die von den Wurzeln und/oder den oberirdischen Teilen
der Pflanzen abgegeben werden.
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Gemäß einem
ersten Merkmal der Erfindung kann das Verfahren im einzelnen in
der Durchführung der
folgenden Schritte bestehen:
- a) Initiierung
der Pflanzenkultur unter erdlosen Bedingungen, so daß die Pflanzen
wachsen und sich entwickeln können
und Biomasse in ausreichender Menge erhalten werden kann, um das Verfahren
rentabel zu machen;
- b) Gewinnung der Metaboliten, die von den Wurzeln oder den oberirdischen
Teilen der Pflanze abgegeben werden, mit Hilfe einer Flüssigkeit,
die durch Perkolieren oder Eintauchen mit den Wurzeln oder durch
Besprühen
mit den Blättern
der Pflanzen in Kontakt gebracht wird;
- c) Auffangen der gebrauchten bzw. beladenen Lösung in
Form eines Perkolats (bei den Wurzeln) oder einer Auswaschflüssigkeit
(bei den Blättern) und
Isolierung der gesuchten, in dieser Lösung enthaltenen Moleküle durch
Flüssig/flüssig-Extraktion,
Flüssig/fest-Extraktion,
Umkristallisieren, Sublimieren oder durch Verdampfen des Wassers.
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Das
Verfahren kann auch einen zusätzlichen Schritt
der erzwungenen Permeabilisierung der wurzeln oder der oberirdischen
Teile der Pflanzen mit einer Lösung
umfassen, die insbesondere Salze, Tenside, Detergentien, Lösungsmittel,
Elicitoren aus Pilzen oder Bakterien, Derivate der Jasmonsäure oder andere
Substanzen enthält,
die die natürliche
Abwehr der Pflanzen in einer Weise stimulieren, daß sich der
Stoffstrom aus den Wurzeln oder Blättern in die Nährlösung bzw.
in die Waschflüssigkeit
deutlich erhöht,
ohne daß die
Lebensfähigkeit
der Pflanzen völlig
verlorengeht, so daß sie
direkt wiederverwendet werden können
oder nach einer Phase des Spülens
und Rücksetzens
in Kulturbedingungen, die zumindest die Wiederherstellung eines
guten physiologischen Zustandes der Pflanzen ermöglichen.
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Demzufolge
umfaßt
das Verfahren die folgenden Schritte a) bis e)
- a)
Initiierung der Pflanzenkultur unter erdlosen Bedingungen, so daß die Pflanzen
wachsen und sich entwickeln können
und Biomasse in ausreichender Menge erhalten werden kann, um das Verfahren
rentabel zu machen. Die Gewinnung dieser ausreichender Menge Biomasse,
insbesondere aus den Wurzeln, kann durch eine genetische Transformation
mittels Agrobacterium rhizogenes unterstützt werden (Hooykaas und Schilperoort,
1992);
- b) Permeabilisierung der Wurzel- oder oberirdischen Teile der
Pflanzen mittels chemischer (Salze, Tenside, Detergentien, Lösungsmittel)
physikalischer (Erhöhung
der Temperatur) oder biochemischer Behandlung (Elicitor aus Pilzen
oder anderen Ursprungs). Bei der biochemischen oder chemischen Behandlung
kann diese Permeabilisierung aus der Nährlösung für die Pflanzen oder durch Besprühen der
oberirdischen Teile erfolgen;
- c) Gewinnung der Metaboliten, die von den Wurzeln oder den oberirdischen
Teilen der Pflanzen abgegeben werden, indem die Pflanzen mit einer Flüssigkeit
in Kontakt gebracht werden;
- d) Rückgewinnung
der gebrauchten Nährlösung oder
der beladenen Sprühflüssigkeit
(im folgenden anders bezeichnet als: Perkolat bei Permeabilisierung
der Wurzeln und Auswaschflüssigkeit bei
Permeabilisierung der oberirdischen Teile) und Isolierung der gesuchten
Moleküle,
die in dieser Lösung
(Perkolat oder Auswaschflüssigkeit) enthalten
sind, durch Verdampfen des Wassers oder Flüssig/flüssig-Extraktion (Nährlösung und wasserunlösliches
Lösungsmittel),
Flüssig/fest-Extraktion
(Nährlösung und
adsorbierender hydrophiler, hydrophober, anionischer, kationischer
oder anderer Träger,
der jedoch eine starke Affinität
zu den gesuchten Metaboliten aufweist) oder durch Umkristallisieren;
- e) Spülung
des Wurzelsystems und/oder der oberirdischen Teile der Pflanzen,
anschließend Rücksetzen
in Wachstumsbedingungen über
einen hinreichenden Zeitraum, um die Durchführung einer erneuten Behandlung
zu ermöglichen.
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In
einer Variante der sequentiellen Abfolge der Schritte der Permeabilisierung,
Rückgewinnung und
des Rücksetzens
in die vorstehend erwähnten Bedingungen,
deren Kreisführung
in mehreren, sich wiederholenden Zyklen eine effiziente Nutzung
der Pflanzen gestattet, kann es auch vorgesehen sein, daß die erzwungene
Permeabilisierung permanent erfolgt, indem eine permeabilisierende
Lösung
zur Nährlösung gegeben
wird, die den Pflanzen kontinuierlich oder in regelmäßigen Abständen zugeführt wird.
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In
diesem letzteren Fall können
die Schritte des Rücksetzens
in die Bedingungen für
die Pflanzen komplett weggelassen werden, indem geringere Dosen
an permeabilisierenden Substanzen gewählt und Substanzen ausgewählt werden,
die weniger aggressiv oder streßbildend
für die
Pflanzen sind oder zumindest in größeren Abständen gegeben werden.
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Nach
dem Schritt der Permeabilisierung oder einer längeren Phase der Permeabilisierung
erfolgt eine Spülung
des Wurzelsystems und/oder der oberirdischen Teile der Pflanzen,
anschließend
das Rücksetzen
in Wachstumsbedingungen für
die Pflanzen über
einen hinreichenden Zeitraum, um die Durchführung einer erneuten Behandlung
mit erzwungener Permeabilisierung zu ermöglichen, gefolgt oder begleitet
von einem Schritt der Gewinnung der gesuchten Moleküle.
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In
vorteilhafter Weise kann auch vorgesehen sein, die Biosynthesekapazität der Pflanze
und ihr Potential zur Ausscheidung von Metaboliten in die Lösung durch
eine physikalische Behandlung zu verstärken, die ausgewählt ist
aus der Gruppe bestehend aus Erhöhung
der Temperatur, ergänzender oder
längerer
Bestrahlung mit Licht, Erhöhung
des CO2-Gehalts
in der mit der Pflanze in Kontakt stehenden Atmosphäre sowie
Kombinationen aus mehreren dieser physikalischen Behandlungen.
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Um
das erfindungsgemäße Verfahren
noch rentabler zu machen, kann die Produktion und Ausscheidung der
von den Pflanzen synthetisierten Metaboliten zum einen durch eine
Neusynthese dieser Moleküle
nach Bereitstellung von Vorläufern
dieser Metaboliten verstärkt
werden, wobei diese Vorläufer bei
der Biosynthese der Metaboliten der Pflanze mit der Nährlösung an
den Wurzeln zugeführt
werden oder durch Besprühen
der oberirdischen Teile in Mischung mit Tensiden, um Eindringen
in die Blätter
zu erreichen, und zum andern durch Steigern der Photosyntheseaktivität mittels
künstlicher
Beleuchtung über
eine Zeitdauer, die länger
ist als die, an die die Pflanze gewöhnt ist.
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Gemäß einer
ersten Ausführungsform
der Erfindung werden die gesuchten Metaboliten an den Wurzeln der
Pflanzen freigesetzt und aus der gebrauchten Nährlösung gewonnen.
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Gemäß einer
zweiten Ausführungsform
der Erfindung werden die gesuchten Metaboliten aus den oberirdischen
Teilen der Pflanzen durch Bespritzen oder Besprühen der Pflanzen mit einer
geeigneten Lösung
oder Flüssigkeit
erhalten, die vorzugsweise Tenside, oberflächenaktive Mittel und/oder
Detergentien enthält,
wobei die beladene Spritz- oder Sprühlösung für sich oder in Mischung mit
der Nährlösung zur
Extraktion und Reinigung der gesuchten Moleküle wiedergewonnen wird.
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Es
ist bevorzugt, daß die
verwendeten Pflanzen ausgewählt
sind aus der Gruppe der höheren Pflanzen
oder Gefäßpflanzen,
die in der Lage sind, wirtschaftlich interessante Metaboliten in
großer Menge
zu synthetisieren, und daß die gesuchten
Moleküle
sekundären
Metaboliten entsprechen, die natürlicherweise
von diesen Pflanzen produziert werden.
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Die
gewonnenen und isolierten Metaboliten sind ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus Alkaloiden vom Tropan- und Indol-Typ, gegen
Krebs wirksamen Verbindungen, Taxanen oder Taxol-Derivaten, Furocumarinen,
Terpenen, Glycosiden, Phenylpropan-Verbindungen, Saponinen und Steroiden und
allgemeiner aus Substanzen, die für die Mikroorganismen, die
möglicherweise
in der Umgebung dieser Pflanzen vorhanden sind, nicht assimilierbar
oder toxisch sind.
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Entsprechend
einem zusätzlichen
Merkmal der Erfindung können
die Pflanzen genetisch verändert
sein, um sie mehr Metaboliten produzieren zu lassen oder ihre Morphologie
zu verändern,
beispielsweise durch Erhöhen
ihrer Wurzelbiomasse nach genetischer Transformation mit Agrobacterium rhizogenes.
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Die
Erfindung läßt sich
besser verstehen anhand der nachstehenden Beschreibung, in der auf bevorzugte
Ausführungsformen
Bezug genommen wird, die beispielhaft und nicht einschränkend sein sollen
und anhand der beigefügten
schematischen Zeichnungen erklärt
werden, in denen die 1 bis 8 schematisch
verschiedene Möglichkeiten
der Durchführung
in Verbindung mit verschiedenen Hilfsmitteln und praktischen Vorrichtungen
darstellen.
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So
zeigt 1 das System, das für das nachstehend beschriebene
Beispiel 1 verwendet wird. Die Pflanzen 1 (Datura) werden
in Glastöpfen 2 kultiviert,
die mit Nährlösung 3 gefüllt sind.
Der Stengel der Pflanzen 1 ist am Deckel 2' der Töpfe befestigt,
in den vorher drei Löchern
gebohrt wurden. Eine Öffnung 4 dient
zur Rückstellung
des Niveaus der Nährlösung und
die andere ermöglicht
den Durchgang eines Lufteinlaßrohrs 5,
mit dem gute Sauerstoffversorgung der Nährlösung für die Pflanzen durch Einperlen
(Blasen 6) aufrechterhalten werden kann.
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2 zeigt
die Vorrichtung, die zur Kultivierung von Eiben verwendet wird,
wie nachstehend in der Beschreibung in Beispiel 2 beschrieben ist.
In diesem Fall befinden sich die Pflanzen 1 am Grund eines
mit Nährlösung 3 gefüllten Behälters 2 aus PVC
(Polyvinylchlorid), und durch Einperlen von Luft wird die Sauerstoffversorgung
der Nährlösung sichergestellt
(Blasen 6).
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3 beschreibt
die Vorrichtung, die zur Durchführung
der nachstehend in Beispiel 4 beschriebenen Arbeiten verwendet wird.
Die Pflanzen 1 (Datura) werden auf durchbohrte Platten 7 gesetzt, die
auf einen Kulturbehälter 2 aus
PVC aufgelegt sind. Die Nährlösung wird
mit Hilfe programmierbarer Zerstäuber 9 in
regelmäßigen Abständen in
Form eines Nebels 8 auf die Wurzeln gestäubt.
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Die 4 bis 7 zeigen
verschiedene Kulturvorrichtungen, die für die Herstellung von Metaboliten
aus Pflanzen brauchbar sind.
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Im
einzelnen zeigen die 4A und 4B Kulturvorrichtungen,
in denen die Nährlösung 3 mit Hilfe
von Kapillaren an die Pflanzen 1 gebracht wird. Sobald
sie mit den Wurzeln der Pflanzen in Kontakt gekommen ist, wird die
gebrauchte Nährlösung 3, auch
als Perkolat bezeichnet, abgeleitet und dann in den Kreislauf zurückgeführt. In
diesem Falle können die
Pflanzen mit oder ohne Substrat 2" kultiviert werden. Dieses Substrat
kann von verschiedenartiger Beschaffenheit sein wie z.B. Steinwolle,
Sand, Perlit, Vermiculit, wiederaufbereitete Erde oder von irgendeiner
anderen Beschaffenheit, die gegenwärtig für erdlose Kulturen genutzt
wird.
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Die
Pflanzen 1 können
auch nach dem NFT-Verfahren (Nutrient Film Technique) kultiviert werden.
In diesem Falle wird die Nährlösung 3 durch Berieselung
(5) auf einer Rinne oder einem ebenen, leicht geneigten
Träger 10 an
die Wurzeln der Pflanzen 1 gebracht. Die Rückgewinnung
der gebrauchten Nährlösung 3' erfolgt am
Ende der Rinne 10, und diese Lösung kann mit oder ohne Gewinnung der
darin enthaltenen Metaboliten in den Kreislauf zurückgeführt werden.
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Die 6A und 6B beschreiben
erdlose Kultursysteme, bei denen die Wurzelsysteme der Pflanzen 1 in
eine Nährlösung eingetaucht
werden. Zufuhr der Nährlösung 3 und
Abfluß der
gebrauchten Nährlösung 3' können permanent
(kontinuierliches System) oder nicht permanent sein (diskontinuierliches
System). Das Eintauchen des Wurzelsystems kann ebenfalls permanent
(6A) mit Einperlen von Luft in diese Nährlösung oder
temporär
erfolgen (6B). Im zweiten Fall kann der
Ablauf in einen hermetischen, tieferliegenden Behälter 11 erfolgen. Die Überführung dieser
Flüssigkeit
kann dann mit einer Pumpe oder einem Kompressor 12 erfolgen, die/der
die in dem hermetischen Behälter 11 enthaltene
Lösung
gegebenenfalls nach Ergänzung
mit zusätzlichen
Substanzen in den Kulturbehälter 2 pumpt.
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7 beschreibt
eine Kulturvorrichtung vom Aeroponik-Typ, bei der die Wurzeln der Pflanzen
regelmäßig mit
Nährlösung 3 in
Form eines Nebels 8 besprengt werden. Letzterer wird mit
Hilfe von Zerstäubern 9 erhalten,
die im Innern des Kulturbehälters 2 angeordnet
sind. Die gebrauchte Nährlösung 3' kann am unteren
Teil abgelassen werden.
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8 zeigt
schematisch eine Anlage zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur
Herstellung von Metaboliten in großem Maßstab, gegebenenfalls automatisch
oder halbautomatisch.
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Wie
in obenerwähnter 8 gezeigt,
ist die Anlage im wesentlichen aufgebaut aus einerseits mehreren
Behältern 2 für die erdlose
Kultur der Pflanzen 1, enthaltend einen inerten Kulturträger bzw.
ein solches Substrat 2" oder
nicht, und zum anderen einer Vorrichtung zur Lagerung und Bereitstellung
von Nährlösung 3 für die Pflanzen 1,
umfassend einen Tank 13 und eine Versorgungsleitung 13', die mit einem
Leitungsnetz 13" verbunden
ist, das die Lösung 3 kontrolliert
zur Unterlage der Pflanzen 1 bringt, sowie einer Vorrichtung
zur Abgabe der Permeabilisierungslösung und/oder der Waschflüssigkeit,
umfassend insbesondere einen Misch- und Vorratstank 14 für die Permeabilisierungslösung und/oder
einen Tank 14' für die Waschflüssigkeit,
der/die mit Versorgungsleitungen 14" zum Besprühen und/oder Einspritzen verbunden
ist/sind, und schließlich
einer Gruppe aus Einrichtungen 15, 15', 15", 16 zur
Wiedergewinnung, Behandlung und Rückführung zumindest der gebrauchten
Nährlösung 3'.
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Die
Einrichtungen für
die Wiedergewinnung, Behandlung und Rückführung bestehen vorteilhaft aus
einem Bottich zur Zwischenlagerung 15, in dem die gebrauchte
Nährlösung 3' aufgefangen
wird, die durch Entleerung der Behälter 2 für die erdlose
Kultur abgeführt
wird, und der mit einer direkten Rückführungsleitung 15' und einer zweiten
Rückführungsleitung 15", umfassend
eine Einheit 16 zur Trennung oder Extraktion der gesuchten
Metaboliten, zu einer Reinjektionsschleife zum Vorratstank 13 für die Nährlösung 3 verbunden
ist, wobei letzterer über
eine Einspritzleitung 13"' auch mit zusätzlichen
Nährstoffen versorgt
wird, die in geeigneten Tanks 13"" gelagert werden, um so die Mengen derjenigen
Substanzen auszugleichen, die von den Pflanzen 1 aufgenommen
wurden.
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Zur
Erhöhung
der Produktivität
der Anlage kann diese auch eine Vorrichtung zur Abgabe von Lösung(en)
des/der Vorläu fer(s)
der von den Pflanzen zu synthetisierenden Metaboliten und/oder von
Substanzen umfassen, die die Synthese der Metaboliten stimulieren,
umfassend einen Vorratstank 1–7
und eine Versorgungsleitung 17', die gleichzeitig mit der Versorgungsleitung 13' bzw, mit dem
Leitungsnetz 13" verbunden
ist, durch die die Versorgung mit Nährlösung 3 erfolgt, sowie
mit Einrichtungen 18 zur Abgabe durch Besprühen der
Pflanzen 1 an ihren oberirdischen Teilen, sowie die Vorrichtung 14, 14', 14" zur Abgabe
von Permeabilisierungslösung und/oder
Waschflüssigkeit.
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Entsprechend
einem weiteren Merkmal der Erfindung, das ebenfalls in 8 dargestellt
ist, kann die Anlage zum einen auch Einrichtungen 19', 19" zur Beheizung
der Pflanzen 1 und/oder ihrer Behälter 2 umfassen, beispielsweise
in Form eines Netzes paralleler und beabstandeter Leitungen, durch
die eine Wärmetauscherflüssigkeit
strömt
und die oberhalb und/oder unterhalb der Behälter 2 verlaufen,
sowie zum anderen Einrichtungen 20 zur künstlichen
Beleuchtung oder Bestrahlung der Pflanzen 1.
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Die
Funktionsweise der in 8 dargestellten Anlage soll
im folgenden ausführlicher
beschrieben werden.
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Die
Nährlösung 3 wird
in einem ersten Tank 13 vorbereitet und gelagert. Sie wird
anschließend mit
einem System immer kleinerer Rohrleitungen, die ein Leitungsnetz 13" bilden, an
die Basis der Pflanzen 1 geführt. Die Pflanzen befinden
sich in erdloser Kultur, gegebenenfalls auf einem inerten Träger 2". Die gebrauchte
Nährlösung 3' läuft auf
einen vorzugsweise geneigten Träger,
der gegebenenfalls den Boden des entsprechenden Behälters 2 bildet,
wobei dieses Ablaufen permanent, zyklisch oder gelegentlich erfolgt.
Das Wasser dieses Ablaufs wird im Lagerbottich 15 aufgefangen.
Es wird anschließend
direkt in den Kreislauf zurückgeführt, oder
die darin enthaltenen Moleküle
werden vor der Rückfüh rung in den
Kreislauf mit Hilfe der Einheit 16 extrahiert und gereinigt.
Ein erster fakultativer Zusatzbehälter 14 und gegebenenfalls
ein zweiter Zusatzbehälter 14' enthält bzw.
enthalten Permeabilisierungsmittel, Vorläufer oder andere Verbindungen,
die die Produktion von Metaboliten bei den Pflanzen stimulieren.
Diese Stoffe, die mit der Nährlösung gemischt
werden oder nicht, werden mit den Pflanzen 1 an den Wurzeln durch
Perkolation (Einspritzen in die Nährlösung 3) oder an den
Blättern
durch Besprühen
in Kontakt gebracht. Die Pflanzen werden natürlich oder künstlich beleuchtet.
Die oberirdischen Teile und die Wurzelteile der Pflanzen können mit
Hilfe von Wärmetauscherflüssigkeiten,
die in der die Netze 19', 19" bildenden Anordnung
von Rohrleitungen zirkulieren, oder anderen, gleichwertigen Hilfsmitteln
beheizt oder gekühlt werden.
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In
Verbindung mit den verschiedenen Ausführungsvarianten der Erfindung
und insbesondere mit der in 8 dargestellten
Ausführungsform
besteht das Verfahren vorteilhaft aus drei Hauptschritten, nämlich einem
ersten Schritt der Kultivierung mit dem Ziel, Biomasse in ausreichender
Menge zu erhalten, einem zweiten Schritt, der die Freisetzung von
Metaboliten durch die Pflanzen entweder an ihren Wurzelteilen oder
an ihren oberirdischen Teilen begünstigt, und einen dritten Schritt
mit dem Ziel, den Zustand der Pflanzen wiederherzustellen, ehe der erste
oder der zweite Schritt erneut durchlaufen wird (Wiederholung der
Zyklen).
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Die
vorliegende Erfindung betrifft daher ein Verfahren und ein System,
womit die Gewinnung von Metaboliten möglich ist, die natürlich (Permeabilisierung
nicht unentbehrlich) oder nicht natürlich von der Pflanze freigesetzt
werden (Permeabilisierung unentbehrlich), die unter erdlosen Bedingungen
(Definition von Morard, 1995) mit oder ohne inerten Träger kultiviert
wird (unter erdloser Kultur sind alle Kulturformen außer der
Kultur in Vollerde auf Feldern oder in der Natur zu verstehen).
Diese Pflanze kann kultiviert werden durch Besprengen mit einer
geeigneten Nährlösung [erdlose
Kultur auf porösem
Träger,
auf Kaskade (NFT-Verfahren
nach Morard, 1995)], durch permanentes Eintauchen in Nährlösung mit
Einperlen von Luft (Hydrokultur nach Morard, 1995) oder temporäres Eintauchen
in die Nährlösung (Bewässerung
von unten, Hydroponik, Nährfilm)
oder durch Inkontaktbringen mit der Nährlösung in Form eines Nebels (Aeroponik
nach Morard, 1995).
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Werden
die Metaboliten von den Wurzeln der Pflanze freigesetzt, so sind
sie in der Nährlösung (Perkolat)
enthalten und werden folglich durch Abfangen entweder in einem mit
Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel
oder auf einem die Moleküle
adsorbierenden Träger
oder auch durch Verdampfen oder Sublimieren des Wassers der Nährlösung gewonnen. Diese
verschiedenen Arbeitsweisen können
gegebenenfalls kombiniert werden.
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Werden
die Metaboliten von den oberirdischen Teilen der Pflanze – mit oder
ohne Permeabilisierung – freigesetzt,
so werden sie durch Bespritzen der Pflanzen gewonnen, wobei die
Spritzlösung (Auswaschflüssigkeit) – wie vorstehend
für das
Perkolat angegeben – aufgefangen
und die darin enthaltenen Metaboliten extrahiert werden.
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In
allen Fällen
kann das Wasser, die gebrauchte Nährlösung oder die beladene Auswaschflüssigkeit
nach Wiederherstellung der für
das Wachstum und den sekundären
Metabolismus der Pflanze notwendigen mineralischen und organischen Komponenten
zur Kultivierung der Pflanzen wiederverwendet werden. Wurde eine
Permeabilisierungsbehandlung durchgeführt, so kann es notwendig sein,
die gebrauchte Lösung
(Perkolat oder Auswaschflüssigkeit)
vor der Wiederverwendung für
eine neue Permeabilisierungsbehandlung oder für eine Wiederver wendung als
normale Nährlösung (für das Wachstum
der Pflanzen) in geeigneter Weise zu behandeln.
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Wurden
die Metaboliten aus der Nährlösung mit
Hilfe eines mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittels extrahiert, so
wird dieses von der wäßrigen Phase
abgetrennt, verdampft und der trockene Rückstand wird verwertet. Die
Metaboliten können dann
gereinigt und von möglichen
Verunreinigungen abgetrennt werden. Wurden die Metaboliten auf einem
festen Träger
abgefangen, so wird dieser feste Träger aus der Nährlösung isoliert,
die Metaboliten werden mit einer wäßrigen flüssigen Phase eluiert, indem
man die Ionenstärke,
den pH variiert oder Gegenionen zugibt oder ein organisches Lösungsmittel verwendet,
das mit Wasser mischbar ist oder nicht (Alkohole, Kohlenwasserstoffe,
chlororganische Verbindungen, Nitrile oder andere). In letzterem
Falle wird man die umweltfreundlichsten, am wenigsten entzündlichen,
am wenigsten toxischen, die am wenigsten kostspieligen und am besten
biologisch abbaubaren Lösungsmittel
einsetzen. In jedem Falle wird man alle klassischen Mittel der Chromatographie
und der Chemie einsetzen, um die im Eluat enthaltenen Moleküle zu reinigen
und aufzukonzentrieren.
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Sobald
die Pflanzen über
die Zeit permeabilisiert worden sind, die zur Erzielung des maximalen Austritts
der Metaboliten ohne irreversible Beeinträchtigung ihres Überlebens
(sequentielle, stärkere Permeabilisierung über kurze
Zeit oder mildere Permeabilisierung über längere Zeit), als optimal bestimmt
wurde, wird die Permeabilisierungsbehandlung gestoppt. Die Pflanzen
werden in normale Kulturbedingungen zurückgesetzt. Wurden sie mit einer Permeabilisierungslösung behandelt,
so wird eine Spüllösung eingesetzt,
um dieses Permeabilisierungsmittel (Tenside, Detergentien, Salze,
Säuren, Basen)
zu beseitigen. Diese Lösung
ersetzt vorübergehend
die Nährlösung. Erst
dann werden die Pflanzen in normale Kulturbedingungen zurückgesetzt. Nach
einer ausrei chenden Kultivierungszeit können die Pflanzen erneut permeabilisiert
werden. Diese Zyklen können
wiederholt werden, bis sich die Produktion, die Produktivität und der
Gesundheitszustand der Pflanzen merklich verschlechtern. In diesem
Falle wird die gesamte oder ein Teil der Kultur durch junge Pflanzen
ersetzt, die man vor der ersten Permeabilisierungsbehandlung wachsen
läßt, vorzugsweise
bis optimale Entwicklung erreicht ist.
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In
einigen Fällen
kann eine kontinuierliche Permeabilisierungsbehandlung in Betracht
gezogen werden. In diesem Falle sollte die Permeabilisierungsbehandlung
mild genug sein, um den Austritt der Metaboliten und vor allem das Überleben
der Pflanze während
der gesamten Permeabilisierungsbehandlung zu ermöglichen. Wenn die Wirksamkeit der
Behandlung merklich nachzulassen beginnt und sich dadurch ein wirtschaftlich
nicht annehmbarer Leistungsabfall ergibt, so werden die "alten" Pflanzen durch jüngere ersetzt,
die sofort oder nach einer Beschleunigung des Wachstums permeabilisiert
werden.
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Im
allgemeinen kann die Zugabe der Vorläufer der gesuchten Metaboliten
während
der Permeabilisierung der Pflanzen erfolgen. In diesem Falle können die
Moleküle
von den Zellen dieser Pflanze biotransformiert werden. Die Zugabe
der Vorläufer sollte
kontrolliert erfolgen, um zu vermeiden, daß letztere nicht als Kohlenstoffquelle
für die
Mikroorganismen dienen, deren Entwicklung das Überleben der Pflanzen mit der
Zeit gefährden
könnte.
Die Zugabe der Vorläufer
kann direkt in die Nährlösung erfolgen,
wenn die Wurzeln permeabilisiert werden. Sie kann durch die Nährlösung über die
Wurzeln erfolgen, wenn auch die Blätter permeabilisiert werden, doch
kann sie auch durch die Blätter über die
Pflanzensprühflüssigkeit
erfolgen.
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Zur
weiteren Erläuterung
der möglichen praktischen
Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens
seien im folgenden vier nichteinschränkende Ausführungsbeispiele für dieses
Verfahren beschrieben.
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Beispiel 1
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Herstellung von Tropan-Alkaloiden
aus Datura innoxia Mill. in Hydroponik-Kultur
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Die
verwendeten Pflanzen stammen aus Samen, die vom Institut für Pflanzengenetik
und Kulturpflanzenforschung (D-06466
Gatersleben, Corrensstr. 3, Deutschland) zur Verfügung gestellt
wurden. Diese Samen wurden 10 Minuten bei Raumtemperatur in konzentrierter
Schwefelsäure
skarifiziert. Nach gründlichem
Spülen
unter laufendem Wasser wurden sie in Töpfe mit feuchter Erde gesetzt,
um bei einer Temperatur von 25°C ± 1°C mit einer
Photoperiode von 16 h und einer Luftfeuchtigkeit von 60–70% zu keimen.
Nach Ablauf von zwei Monaten, als die Pflanzen eine Größe von 15–20 cm erreicht
hatten, d.h., in einem Stadium mit 8–10 Blättern, wurden sie umgetopft
und in Glasbehälter
einer bekannten Art mit der Bezeichnung "Baby Food Jar" (Sigma-Aldrich Inc., Frankreich) mit 175 ml überführt. Die
Pflanzen wurden durch die Deckel der Töpfe gehalten, die vorher mit
drei Bohrlöchern
versehen worden waren (eines für
den Stengel, eines für
das Lufteinperlen und eines für
das Wiederauffüllen
der Flüssigkeit
(siehe 1). Eine Lösung
des Typs MS mit vierfacher Verdünnung
(Murashige und Skoog, 1962) wurde in den Topf gegeben. Durch Siliconschläuche kann
Luft in die Nährlösung eingeperlt
werden, um gute Sauerstoffversorgung des Wurzelsystems der Pflanzen aufrechtzuerhalten
und auch um übermäßige Entwicklung
von Mikroorganismenpopulationen zu vermeiden. Es wurden sechzig
Pflanzen auf diese Weise eingesetzt. Sie wurden zwei Wochen unter
denselben Licht-, Temperatur- und Luftfeuchtigkeitsbedingungen kultiviert
wie vorstehend angegeben.
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Die
Nährlösung wurde
mit steigenden Mengen (0, 1, 2, 3 oder 5% Vol./Vol.) Tensid versetzt
(des bekannten Typs mit der Bezeichnung Tween 20: Polyoxyethylensorbitanmonolaurat).
Die Permeabilisierung mit Tween 20 (vertrieben durch die Firma Prolabor)
erfolgte 0, 12, 24 oder 48 Stunden lang ohne Einperlen von Luft
(zur Vermeidung von Schaumbildung). Die Nährlösung einer jeden Pflanze wurde aufgefangen,
filtriert und mittels Chromatographie in der Gasphase analysiert.
Die mittlere Gesamtkonzentration an Hyoscyamin und Scopolamin steigt langsam
mit der Tensid-Konzentration. Sie steigt über 7 mg/l ohne Tensid und
auf 45 mg/l mit 5% Tween 20. Die Konzentration an Hyoscyamin und Scopolamin
steigt mit der Dauer der Behandlung.
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Die
gesamten Permeabilisierungslösungen wurden
aufgefangen und die darin enthaltenen Moleküle wurden nach Zugabe von Ammoniak
bis auf pH 9 in Chloroform aufgenommen. Das Chloroform wurde abgedampft,
und der trockene Rückstand
enthielt die Gesamtmenge der beiden Moleküle Hyoscyamin und Scopolamin.
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Das
Wurzelsystem der permeabilisierten Pflanzen wurde unter laufendem
Wasser gespült, und
die Pflanzen wurden wie vorstehend beschrieben in eine Hydroponik-Kultur
zurückgesetzt.
Nach drei Wochen Kultivieren hatten alle Pflanzen überlebt.
Sie waren weitergewachsen, und einige der permeabilisierten Pflanzen
zeigten sogar stärkeres Wachstum
als die Kontrollpflanzen.
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Einen
Monat später
wurden die ein erstes Mal permeabilisierten Pflanzen ein zweites
Mal gemäß mehreren
Bedingungen permeabilisiert:
- a) 4 Kontrollpflanzen
(nicht permeabilisiert),
- b) 4 Pflanzen, die 24 h mit 3% eines Tensids permeabilisiert
wurden, das unter der Bezeichnung Teepol bekannt ist (eingetragenes
Warenzeichen – Firma
TEMANA),
- c) 4 Pflanzen, die 24 h mit 5% Tween 20 permeabilisiert wurden,
- d) 4 Pflanzen, die 24 h mit 5% Tween 20 permeabilisiert und
bei 27°C
ständig
beleuchtet wurden,
- e) 4 Pflanzen, die 24 h mit 5% Tween 20 + 1 g/l Ornithin und
1 g/l Phenylalanin permeabilisiert wurden,
wobei die Nährlösungen entnommen,
filtriert und wie vorstehend angegeben analysiert wurden.
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Die
Konzentrationen an Hyoscyamin und Scopolamin waren wie folgt:
- a) 1,5 mg/l ± 1
- b) 2,4 mg/l ± 1,4
- c) 9,1 mg/l ± 4
- d) 18,8 mg/l ± 3,7
- e) 22,7 mg/l ± 2,4
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Schlußfolgerung:
Es ist möglich,
Datura in Hydrokultur wachsen zu lassen. Daturas setzen spontan
Alkaloide (Hyoscyamin und Scopolamin) in die Nährlösung frei. Diese Freisetzung
(im folgenden auch als Ausscheidung bezeichnet) läßt sich
durch Permeabilisierung der Pflanzen mit Tensiden verstärken. Dabei
ist es durch Ändern
der Beschaffenheit des Tensids, der Konzentration desselben und
der Kontaktzeit möglich,
eine permeabilisierende Wirkung zu haben, ohne daß das Überleben
der Pflanzen beeinträchtigt
wäre. Für diese
Anwendung ist Tween 20 ein wirksames Tensid. Bei gleicher Menge ist
Tween 20 wirksamer als Teepol. Der Zusatz von Vorläufern von
Hyoscyamin und Scopolamin ist im Hinblick auf die in die Nährlösung freigesetzte
Menge an Alkaloiden sehr vorteilhaft. Bei ständiger Beleuchtung der Pflanzen
bei höherer
Temperatur über
einen Zeitraum von 24 Stunden werden Ergebnisse erhalten, die denen
bei Zugabe von Vorläufern
nahekommen. Hier liegt der Gedanke nahe, daß man mit einer Optimierung
des Systems die Produktivität
des Verfahrens noch weiter erhöhen
könnte.
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Die
permeabilisierten Pflanzen wurden abgespült und in Kultur zurückgesetzt.
Alle Pflanzen überlebten
und erlaubten auch spätere
Permeabilisierungen.
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Aus
dem Vorstehenden ergibt sich, daß Pflanzen der Art Datura unter
erdlosen Bedingungen kultiviert werden können, um sie Tropan-Alkaloide produzieren
zu lassen, die aus der gebrauchten Nährlösung gewonnen werden. Die Produktion
kann durch eine angepaßte
Behandlung erhöht
werden. Diese Behandlung kann Mit Hilfe von Tensiden erfolgen. Dabei
sind nicht alle Tenside gleich wirksam. Je höher die Menge des Tensids,
desto wirksamer ist die Behandlung. Je länger die Behandlung dauert,
desto wirksamer ist sie. Eine unter geeigneten Bedingungen durchgeführte Behandlung
ermöglicht
das Überleben
der Pflanze, ja sogar eine weitergehende Entwicklung, und sie läßt sich
zudem mehrmals permeabilisieren. Die Wirksamkeit der Permeabilisierungsbehandlung
kann durch Zugabe von Vorläufern
zur Permeabilisierungslösung
verstärkt
werden. Die Wirksamkeit kann auch durch Intensivieren der Photosynthese
verstärkt
werden, indem die Pflanzen ständig
beleuchtet werden, der CO2-Gehalt erhöht wird
und/oder die Umgebungstemperatur erhöht wird.
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Beispiel 2
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Produktion
von Taxanen aus Eiben in erdloser Kultur Vier Eiben-Pflanzen mit
60 cm Höhe
wurden im Handel erworben, umgetopft und in Töpfe aus PVC (Polyvinylchlorid)
gesetzt, die ein Fassungsvermögen
von 6 Litern aufwiesen und 5 Liter einer Nährlösung vom Typ MS (Murashige
und Skoog, 1962) in 12facher Verdünnung enthielten. Nach 4 Tagen
der Kultivierung im Gewächshaus
unter Einperlen von Luft (0,25 vvm: 0,25 Volumina Gas pro Volumen
Medium pro Minute) (2) wurde die Nährlösung entnommen,
auf Filtern des Typs Millex 0,45 μm
filtriert und mittels HPLC (Hochdruckflüssigkeitschromatographie) auf
einer C18-Säule
mit 30 cm mit einem Gradienten von 0 bis 100 Methanol und UV-Detektion bei 254
nm analysiert. Es konnte kein Taxol in dieser Nährlösung nachgewiesen werden. Die
Lösung
wurde durch eine neue Lösung
ersetzt, und es wurden 2% Tween 20 in die Kulturtöpfe von
zwei dieser Pflanzen gegeben. Nach 24 Stunden wurde eine Konzentration
von 2,1 mg/l ± 1,04
(d.h. 5 μg/l/g
frisches Material) in der Nährlösung für die permeabilisierten
Pflanzen gemessen, während
nur 0,2 mg/l ± 0,16
(d.h. 0,2 μg/l/g
frisches Material) bei den nicht permeabilisierten Pflanzen gemessen
werden konnten. Hinreichend ähnliche
Ergebnisse wurden erhalten bei der Messung von Baccatin III (ein
anderer interessanter sekundärer
Metabolit bei der Eibe). Nach Spülen
der Wurzeln konnten die Pflanzen erneut permeabilisiert werden,
ohne ihre Lebensfähigkeit
zumindest während
der dreiwöchigen
Versuchsdauer zu gefährden.
Diese Ergebnisse zeigen also, daß es möglich ist, partielle Freisetzung
der Taxane (Paclitaxel) aus Eiben in erdloser Kultur (in diesem
Falle eine Hydroponik-Kultur
von der Art einer Hydrokultur) zu erreichen. In unserem Beispiel
wurde weder die Nährlösung, noch
die Permeabilisierungsbehandlung optimiert. Nach einer Optimierung
der Nährlösung (siehe
Morard, 1995), der Kulturbedingungen (Temperatur, Licht, CO2) und der Permeabilisierungsbehandlung wären also
noch interessantere Ergebnisse zu erwarten.
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Beispiel 3
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Produktion
von Furocumarinen aus der Raute (Ruta graveolens) in Hydroponik-Kultur
(Hydrokultur nach Morard, 1995) Acht im Topf kultivierte Pflanzen
im Alter von 10 Monaten wurden zwei Wochen unter Einperlen von Luft
in eine Kultur in Nährlösung MS/4
(Lösung
von Murashige und Scoog, 1962, in 4facher Verdünnung) gesetzt (dieselbe Vorrichtung wie
in 1). Vier der acht Pflanzen wurden 24 Stunden mit
3% (Vol./Vol.) Tween 20 permeabilisiert. Die Nährlösungen wurden dann entnommen,
filtriert und mittels Gaschromatographie analysiert. Die Nährlösungen der
permeabilisierten Pflanzen enthielten durchschnittlich 8,1 ± 4,1 mg/l
Furocumarine (Psoralen, 8-Methoxypsoralen, 5-Methoxypsoralen und 5,8-Dimethoxypsoralen)
gegenüber
5,2 ± 2,8
mg/l für die Nährlösungen der
vier Kontrollpflanzen. Die Wurzeln der Pflanzen wurden mit Wasser
abgespült, dann
wurden die Pflanzen eine Woche lang in Kultur zurückgesetzt.
Anschließend
wurden die vier bereits ein erstes Mal permeabilisierten Pflanzen
in der gleichen Weise erneut permeabilisiert. Die Ergebnisse sind
wie folgt: 22,5 ± 6,1
mg/l für
die permeabilisierten gegenüber
19 ± 8,5
mg/l für
die nicht permeabilisierten Pflanzen.
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Es
wurde noch eine dritte Permeabilisierung mit denselben Pflanzen
vorgenommen, die ähnliche Ergebnisse
lieferte, wobei alle Pflanzen überlebten.
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Schlußfolgerung:
Rauten können
unter erdlosen Bedingungen kultiviert werden. Sie scheiden in natürlicher
Weise Furocumarine in die Nährlösung aus,
doch läßt sich
diese Freisetzung durch eine angepaßte Permeabilisierungsbehandlung
erhöhen (hier:
Tween 20 mit 3%). Auch andere Behandlungsarten können in Betracht gezogen werden:
andere Tenside, Erhöhung
der Temperatur der Nährlösung oder
Erhöhung
des Salzgehalts der Nährlösung, Zugabe
von z.B. Umbelliferon oder Phenylalanin. Es sei klar, daß wie in
Beispiel 2 die Kulturbedingungen und die Permeabilisierungsbehandlung
optimiert werden können,
um noch bessere Ausbeuten zu ergeben.
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Beispiel 4
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Aeroponik-Kultivierung
von Datura innoxia und Datura stramonium
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Samen
von Datura stramonium und Datura innoxia wurden zum Keimen in kleine
Näpfchen
mit Vermiculit gesetzt, der mit Nährlösung besprengt wurde. Diese
Näpfchen
wurden anschließend
auf Träger
verbracht, die aus durchbohrten Platten (aus PVC) bestanden. Diese
Platten wurden in einen großen
Bottich mit 1,2 m × 1
m × 1
m gesetzt, auf dessen Boden sechs Zerstäuber in die Nährlösung eintauchten
(3). Alle 30 Minuten lösten die Zerstäuber 15 Minuten
lang aus. Die gesamte Vorrichtung wurde in ein Phytotron mit identischen
Bedingungen wie in Beispiel 1 gesetzt. Nach einem Monat Kultivierung war
die gesamte Biomasse von einigen zig Gramm frischen Materials auf über ein
Kilogramm angewachsen (Stengel + Blätter + Wurzeln). Eine HPLC-Analyse
zeigte, daß 8
mg/l Alkaloide in den 40 Litern Nährlösung vorhanden waren, woraus
sich insgesamt 320 mg Hyoscyamin und Scopolamin errechnen.
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Schlußfolgerung:
das Wachstum der Daturas in der Aeroponik ist sehr schnell. Die
Pflanzen sind gesund und kräftig.
Zudem scheiden sie die Alkaloide spontan in die Nährlösung aus.
Diese Ausscheidung läßt sich
durch eine angepaßte
Behandlung wie etwa eine Permeabilisierung, eine Veränderung
der Lösung
mit Erhöhung
der Salzkonzentration oder eine Erhöhung der Inkubationstemperatur
der Wurzeln und gegebenenfalls durch Zugabe von Vorläufern der Tropan-Alkaloide
verbessern (Gontier, 1993).
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Aus
dem Vorstehenden ergibt sich, daß Daturas mittels Aeroponik
kultiviert werden können,
wobei in diesem Falle das Wachstum des Pflanzenmaterials sehr schnell
ist. Große
Mengen Biomasse können
in kürzerer
Zeit als mit der Hydroponik (Hydrokultur nach Morard, 1995) erhalten
werden. Außerdem können sekundäre Metaboliten
aus der gebrauchten Nährlösung gewonnen
werden. Der Gehalt an Metaboliten in dieser Lösung hängt ab von der Menge der Biomasse
und der Kontaktzeit der Nährlösung mit dem
Wurzelteil dieser Biomasse. Vorstellbar ist auch eine Erhöhung der
Metaboliten-Konzentration durch eine angepaßte Behandlung (Permeabilisierung,
Ionenstärke,
Temperatur, Elicitation).
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Nachdem
es also möglich
ist, Pflanzen auf mehreren tausend Gewächshaus-Quadratmetern zum Wachsen
zu bringen (wie es der Fall bei Tomate und Gurke ist) und nachdem
es möglich
ist, die gebrauchten Nährlösungen in
den Kreislauf zurückzuführen (wie
es der Fall ist bei Verfahren vom Typ Hydrokultur, Aeroponik, NFT
(Nutrient Film Technique)), sollte das erfindungsgemäße Verfahren
die Kultivierung von Pflanzen, die sekundäre Metaboliten produzieren,
auf mehreren tausend Gewächshaus-Quadratmetern
ermöglichen.
Die spontan ausgeschiedenen Metaboliten können aus der gebrauchten Nährlösung gewonnen
werden. Auch läßt sich
die Freisetzung dieser Moleküle
sowie die Biosynthese vor der Ausscheidung sogar noch steigern.
Bei Pflanzen, die sekundäre
Metaboliten produzieren, die dann an der Oberfläche der Blätter "herausgedrückt" oder "ausgeschieden" werden (Brown und Zobel, 1990), lassen
sich diese Verbindungen auch durch Besprengen der Pflanzen mit einer
angepaßten
Lösung
und Auffangen der die fraglichen Metaboliten enthaltenden Auswaschflüssigkeiten
gewinnen. Eine solche Vorrichtung dient zur Herstellung von Molekülen pflanzlichen
Ursprungs, und diese Moleküle
können für verschiedene
Anwendungen eingesetzt werden, etwa bei therapeutischen, kosmetischen,
diätetischen
oder nichtdiätetischen
Anwendungen. Diese Moleküle
besitzen vorzugsweise ein hinreichend geringes Molekulargewicht
und müssen
nicht völlig
unlöslich
in Wasser sein, dem ein Tensid zugesetzt wurde oder nicht.
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Selbstverständlich ist
die Erfindung nicht auf die in den beigefügten Zeichnungen dargestellten Ausführungsformen
beschränkt.
Abwandlungen sind möglich,
insbesondere im Hinblick auf den Aufbau der verschiedenen Elemente
oder durch Ersetzen technischer Äquivalente,
ohne vom Schutzumfang der Erfindung abzuweichen, der in den Patentansprüchen definiert
ist.