DE4412703A1 - Verfahren und Vorrichtung zur Herstellung von Lösungsmittelgemischen bei der Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Lö­ sungsmittelgemischen für die Versorgung einer Hochdruckpumpe bei der Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie, wobei die zu mischenden Lösungsmittel jeweils über zugeordnete, steuerbare Ventile angesaugt und in eine an die Saugseite der Hochdruck­ pumpe angeschlossene Mischkammer gepumpt werden. Die Erfin­ dung betrifft weiterhin eine zur Durchführung eines solchen Verfahrens geeignete Vorrichtung mit einer Niederdruck-Pump­ einrichtung, mittels welcher mehrere zu mischende Lösungsmit­ tel über ihnen zugeordnete Zufuhrleitungen und steuerbare Ventile ansaugbar und zu einer an die Saugseite einer Hoch­ druckpumpe für die Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie an­ schließbaren Mischkammer förderbar sind.

Bei der abgekürzt als HPLC (High Performance Liquid Chromato­ graphy) bezeichneten Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie kommen zwei verschiedene Verfahren zur Trennung und Elution der auf eine chromatische Säule injizierten Substanzen zur Anwendung. Bei der sog. isokratischen Elution bleibt die Zu­ sammensetzung des Fließmittels (Eluenten) während des ge­ samten Arbeitsvorgangs unverändert. Demgegenüber wird bei der sog. Grandientenelution die Zusammensetzung des als Fließmit­ tel dienenden Lösungsmittelgemischs kontinuierlich oder schrittweise geändert, um die Analyse zu beschleunigen und die Detektierbarkeit zu verbessern.

Die Gradientenformung kann hochdruckseitig oder niederdruck­ seitig vorgenommen werden. Bei der hochdruckseitigen Beein­ flussung des Gradienten der Elutionsmittelzusammensetzung werden zwei oder mehr eigenständige Hochdruckpumpen so ge­ steuert, daß sich die Teilfördermengen der jeweils ein be­ stimmtes Lösungsmittel fördernden Pumpen jederzeit zu einem konstanten Volumen von z. B. 1,00 ml/min ergänzen, wobei man die Förderung aller Pumpen zusammenführt und in einer Misch­ kammer homogenisiert. Diese Methode hat den Nachteil, daß so viele teure Hochdruckpumpen wie Lösungsmittel gebraucht wer­ den, und alle Pumpen müssen exakt und pulsationsfrei arbei­ ten, damit die Mischung genau und reproduzierbar erfolgt, wie dies in der HPLC unerläßlich ist. Ein weiterer Nachteil be­ steht darin, daß die einzelnen Hochdruckpumpen nicht genügend weit nach unten geregelt werden können. Selbst wenn sie z. B. bei einem Anteil eines bestimmten Lösungsmittels von nur 1% in der Lage sind, die geringe Menge von 10 µl/min zu fördern, dann sicherlich nicht ruckfrei und reproduzierbar.

Aus den genannten Gründen wird in jüngster Zeit fast aus­ schließlich die niederdruckseitige Gradientenformung einge­ setzt. Hier erfolgt die Gemischbildung mit Hilfe von Magnet­ ventilen bereits vor der Hochdruckpumpe, also im Niederdruck­ bereich. Bei den meisten gegenwärtig angebotenen Geräten ist ein in Fig. 1 ganz links gezeigter Magnetventilblock 4 unmit­ telbar an eine in Fig. 1 ganz rechts gezeigte Hochdruckpumpe 5 angeschlossen. Die normalerweise zwei bis vier 2-Wege-Ven­ tile, die auf dem aus Teflon bestehenden Block montiert sind, verfügen jeweils über einen separaten Eingang für ein ihnen zugeordnetes Lösungsmittel. Die Ausgänge der im Beispielsfall mit 1, 2 und 3 bezeichneten Magnetventile werden durch inter­ ne Bohrungen in dem Block 4 zusammengeführt und direkt mit der Saugseite der Hochdruckpumpe 5 verbunden. Während deren Ansaugphase werden die Ventile so unterschiedlich lange und zeitlich versetzt geöffnet, daß jede beliebige Lösungsmittel­ zusammensetzung erzeugt werden kann. Die Öffnungs- und Schließzeiten der Magnetventile liegen, gemessen gegen Luft, zwischen 6 und 20 ms. Damit steht bei sog. Langhuber-Hoch­ druckpumpen, die pro Kolbenhub 50-100 µl verdrängen und bei einer Pumpleistung von 1 ml/min etwa 10-20 Ansaughübe pro Minute ausführen, noch eine ausreichende Zeitspanne zur sicheren und reproduzierbaren Schaltung der Magnetventile zur Verfügung.

Die heutigen Standard-HPLC-Pumpen haben jedoch meistens einen Flußratenbereich zwischen 10 µl/min und 10 ml/min. Dement­ sprechend kann sich die Ansaugfrequenz um den Faktor 1000 erhöhen und sich die Zeit für die Ventilfunktionen um den Faktor 1000 verkürzen. Es ist mit den bekannten Vorrichtun­ gen praktisch unmöglich, mit einer bestimmten Einstellung der Ventilöffnungszeiten relativ zueinander innerhalb dieses großen Flußratenbereichs ein bestimmtes Lösungsmittelgemisch mit konstanter Zusammensetzung zu erhalten.

Ein weiterer erheblicher Nachteil besteht darin, daß die Lösungsmittel vor dem Eingang in die Magnetventile sorgfältig entgast sein müssen, weil sonst beim Mischen von organischen Lösungsmitteln, insbesondere Methanol, mit Wasser Luftblasen entstehen, denn die Löslichkeit von Luft ist in den reinen Lösungsmitteln wesentlich größer als in der Mischung, und außerdem ist das Vermischen ein exothermer Vorgang. Luftbla­ sen stören die konstante Förderleistung der Hochdruckpumpen. Die Förderung hört vollständig auf, wenn in einer Pumpe eine Luftblase eine bestimmte Größe erreicht hat, die dann im Pum­ penkopf ständig komprimiert und dekomprimiert wird, während die Ein- und Ausgangsventile nicht mehr schließen können. Da viele Anlagen auch über Nacht laufen müssen, sind solche Vor­ kommnisse nicht akzeptabel.

Weiterhin kommt erschwerend hinzu, daß sich in den letzten zehn Jahren auf dem Pumpensektor die sog. Kurzhubpumpen eta­ bliert haben, um die Pulsationen, die zwischen Ansaug- und Förderphase entstehen, besser dämpfen zu können. Diese Pumpen haben einen um den Faktor 5-10 kleineren Hub, eine entspre­ chend höhere Frequenz und kleinere Ansaugvolumina von ca. 10-20 µl. Bei der hohen Frequenz ist eine Synchronisation der Öffnungszeiten der Magnetventile mit der Ansaugphase des Kol­ ben vielfach nicht mehr möglich. Außerdem führen die Pump­ effekte der Ventilmembranen im Verhältnis zu den geringen An­ saugvolumina der Kurzhubpumpen zu inakzeptablen Fehlern beim Mischungsverhältnis. Die Magnetventile "pumpen" nämlich beim Schließvorgang das unter der Membran befindliche Volumen her­ aus. Es kann bis zu 10 µl betragen und muß der in der vorbe­ stimmten Öffnungszeit des Ventils hindurchgeströmten Menge hinzugerechnet werden.

Zur Behebung der genannten Mängel der üblichen Niederdruck- Gradientenformer, insbesondere bei Verwendung von Kurzhubpum­ pen, war vorübergehend von der Firma Gynkotek, 82110 Germe­ ring unter der Typenbezeichnung M 250 ein Gerät angeboten worden, welches in Fig. 3 schematisch dargestellt ist. Es war mit drei Niederdruckpumpen 6, 7, 8 bestückt, die über eine Nockenwelle angetrieben wurden und jeweils mit einem 3/2- Wege-Magnetventil 6′, 7′, 8′ zusammenwirkten. In der Ansaug­ phase wurden diese Ventile so geschaltet, daß über die zuge­ hörigen Lösungsmittel-Zufuhrleitungen 6′′, 7′′, 8′′ die zu mischenden Lösungsmittel in die jeweiligen Pumpenzylinder einströmen konnten, während die Pumpenkolben synchron zurück­ gezogen wurden. In der anschließenden Verdrängungsphase wur­ den dann die Magnetventile 6′, 7′, 8′ jeweils für eine kurze Zeitdauer, die den Anteilen der Lösungsmittel am Gemisch ent­ sprach, umgeschaltet, um einen Teil des jeweils im Pumpenzy­ linder befindlichen Lösungsmittels in eine offene Mischkammer 9 zu pumpen. Der Rest wurde wieder über die Zufuhrleitungen 6′′, 7′′, 8′′ in das zugeordnete Vorratsgefäß zurückgepumpt.

In der Mischkammer 9 wurde das Lösungsmittelgemisch durch einen Rührer 10 mit Rührstab bewegt und weitgehend homogeni­ siert. Dabei konnten Luftblasen aufsteigen und entweichen, ohne daß sie von der an die Mischkammer 10 angeschlossenen Hochdruckpumpe 5 angesaugt wurden. Ein Füllstandsfühler 11 überwachte den Flüssigkeitsspiegel in der Mischkammer und schaltete die drei Niederdruckpumpen 6, 7, 8 aus, wenn das Lösungsmittelgemisch einen bestimmten Höchststand erreicht hatte. Sank der Flüssigkeitsspiegel infolge der Förderung der Hochdruckpumpe 5 unter einen vorbestimmten Stand, wurden die Niederdruckpumpen 6, 7, 8 jeweils wieder so lange aktiviert, bis die maximale Füllhöhe erreicht wurde. Auf diese Weise konnten der Gradientenformer und die Hochdruck-HPLC-Pumpe un­ abhängig voneinander arbeiten, ohne daß eine aufwendige Kom­ munikation zwischen diesen beiden Einheiten aufgebaut werden mußte. Es war lediglich eine Abschaltung der Hochdruckpumpe vorgesehen, wenn entweder der Gradientenformer nicht lief oder die Mischkammer 9 innerhalb einer bestimmten Zeitdauer nicht gefüllt werden konnte.

Das bekannte Gerät gemäß Fig. 3 konnte sich nicht durch­ setzen, weil es von seiner Konzeption her mechanisch und elektronisch sehr aufwendig war. Außerdem erwiesen sich die 3/2-Wege-Magnetventile als störungsanfällig. Es kam oft vor, daß ein Ventil infolge Leckage während des Zurückpumpens des Lösungsmittels in das Vorratsgefäß einen Teil dieses Lösungs­ mittels zusätzlich in die Mischkammer leitete und dadurch das Mischungsverhältnis verfälschte. Darüberhinaus bereitete ein Wechsel der Lösungsmittel große Probleme, weil die Nieder­ druckpumpen einen Teil des alten Lösungsmittels in der Zu­ fuhrleitung immer weiter hin und her schoben, so daß das neue Lösungsmittel sehr lange durch das alte kontaminiert wurde.

Ausgehend von dem zuletzt genannten Stand der Technik, liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine zu dessen Durchführung geeignete Vorrichtung zu schaffen, durch die mit wesentlich einfacheren, zuverlässig wirkenden Mitteln bei unterschiedlichen Förderraten sehr genau die vorbestimm­ ten Lösungsmittelgemische hergestellt werden können.

Vorstehende Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß sämtliche Lösungsmittel von einer einzigen Niederdruckpumpe über die ihnen jeweils zugeordneten, im Verhältnis der Mischungsanteile geöffnet gehaltenen Ventile angesaugt und in die Mischkammer gepumpt werden.

Die Erfindung bietet den Vorteil, daß der technisch ausge­ reifte und vielfach eingesetzte Ventilblock mit zwei oder mehr, im Regelfall vier bis sechs 2-Wege-Magnetventilen ver­ wendet werden kann. Es bedarf nur einer einzigen Niederdruck­ pumpe, die im Gegensatz zu den bisher zum Einsatz gekommenen Niederdruckpumpen zwischen den Magnetventilen und der Misch­ kammer angeordnet ist.

In bevorzugter Ausgestaltung der Erfindung ist die Nieder­ druckpumpe eine ventillose Taumelkolbenpumpe, deren Kolben und Zylinder aus keramischem Material bestehen. Sie wird zweckmäßigerweise durch einen derart gesteuerten Schrittmotor angetrieben, daß sie jeweils für eine vollständige Umdrehung antreibbar ist und ein Steuersignal für den Schrittmotor zur Ausführung jeweils einer weiteren Umdrehung auslösbar ist, solange der Flüssigkeitsspiegel in der Mischkammer unterhalb einer bestimmten Füllstandshöhe liegt.

In der bevorzugten praktischen Ausführung kommt eine neue Mischkammer zur Anwendung, die einen mit der Druckseite der Niederdruckpumpe verbundenen Einlaß und einen an die Saug­ seite der Hochdruckpumpe angeschlossenen Auslaß hat, der sich horizontal hinter einem Blasenschutz, unterhalb von dessen Oberkante befindet.

Ein Ausführungsbeispiel der neuen Vorrichtung zur nieder­ druckseitigen Gradientenformung ist in Fig. 1 und 2 der bei­ liegenden Zeichnung dargestellt, wobei Fig. 1 eine schemati­ sche Darstellung der gesamten an eine Hochdruck-HPLC-Pumpe angeschlossenen Vorrichtung und Fig. 2 einen senkrechten Querschnitt durch die Mischkammer zeigen.

Die Vorrichtung nach Fig. 1 besteht aus dem oben bereits er­ wähnten, bewährten Ventilblock 4 aus Teflon mit im Beispiels­ fall drei daran montierten 2-Wege-Magnetventilen 1, 2, 3, weiterhin einer offenen Mischkammer 9 der ebenfalls bereits oben erwähnten Art, die ausgangsseitig an die Saugseite einer herkömmlichen Hochdruck-HPLC-Pumpe 5 angeschlossen ist, sowie schließlich einer einzigen Niederdruckpumpe 12, die saugsei­ tig an den gemeinsamen Ausgang der an den Zufuhrleitungen für die verschiedenen Lösungsmittel angeordneten Magnetventile 1, 2, 3 angeschlossen und druckseitig mit der Mischkammer 9 ver­ bunden ist.

Bei der Niederdruckpumpe 12 handelt es sich um eine sog. Tau­ melkolbenpumpe, wie sie z. B. von der Firma Fluid Metering, Inc., Oyster Bay, New York angeboten wird. Ein Vorteil dieser Pumpe besteht darin, daß sie keine Ventile und keine Kolben­ dichtungen besitzt. Außerdem kann durch eine einfache Winkel­ veränderung das Fördervolumen pro Umdrehung verkleinert oder vergrößert werden. Da der Kolben und der Zylinder aus kerami­ schem Material mit sehr engen Toleranzen gefertigt werden, ist die Pumpe wartungsfrei und resistent gegen alle in der Chromatographie verwendeten Chemikalien und Lösungsmittel. In Verbindung mit einem Schrittmotor als Antrieb, der sie bei jedem Steuerimpuls genau eine Umdrehung ausführen läßt, ist die Förderung sehr konstant. Die Schwankungen halten sich normalerweise innerhalb einer Grenze von 0,5%.

In der Regel wird die Niederdruckpumpe 12 auf eine Volumen­ förderung zwischen 250 und 500 µl pro Hub (= Drehung) einge­ stellt. Während einer Umdrehung sind die Ansaug- und die Aus­ stoßphase mit 180°C gleich groß. Während der Ansaugphase wer­ den die Magnetventile 1, 2, 3 zeitlich so aufeinander abge­ stimmt geöffnet, daß sich das jeweils gewünschte Lösungsmit­ telgemisch und in der Veränderung von dessen Zusammensetzung der gewünschte Gradient ergeben.

In der Ausstoßphase der Niederdruckpumpe 12 wird das ange­ saugte Lösungsmittelgemisch in die offene Mischkammer 9 gemäß Fig. 2 gefördert und dort mittels des Rührers 10 homogeni­ siert. Die elektronische Steuerung des Geräts kontrolliert mittels des Füllstandsfühlers 11, ob ein bestimmter Füllstand erreicht wurde. Ist dies nicht der Fall, wird ein weiterer Pumpzyklus der Niederdruckpumpe 12 gestartet. Die Lösungsmit­ tel brauchen nicht entgast zu sein, weil die Gasblasen in der offenen Mischkammer 9 nach oben entweichen können. Ergänzend sind Vorkehrungen getroffen worden, um zu verhindern, daß die Luftblasen von der Hochdruck-HPLC-Pumpe 5 angesaugt werden. Hierzu gehört eine Leiteinrichtung 13, z. B. in Form einer von der Innenwand der Mischkammer 9 radial nach innen ragen­ den Rippe, die auf einem mittleren Niveau zwischen dem unten angeordneten Einlaß 14 und dem oben angeordneten Auslaß 15 der Mischkammer 9 angebracht ist. Die Leiteinrichtung 13 lenkt die Luftblasen von der senkrechten Wand der Mischkammer zur Mitte hin ab. Außerdem ist oben im Bereich des Auslasses die Wand stufenförmig abgesetzt und verjüngt oder mit einem Rücksprung nach außen versetzt, so daß auch die Eintrittsöff­ nung der Auslaßleitung 15 gegenüber der Innenwand im unteren Bereich der Mischkammer nach außen zurückgesetzt ist. Als weitere Sicherheitsmaßnahme ist in der Verlängerung des unte­ ren Bereichs der Innenwand nach oben ein bis über die Auslaß­ leitung 15 hinaus nach oben reichender, vorzugsweise gitter­ förmiger Blasenschutz 16 vorgesehen, welcher die Luftblasen auch in der Saugphase der Hochdruckpumpe an der Auslaßleitung 15 vorbei leitet.

Die vorstehend beschriebene Vorrichtung hat den Vorteil, daß den Vorratsgefäßen bei jedem Arbeitszyklus der Niederdruck­ pumpe 12 nur so viel Lösungsmittel entnommen wird, wie für die Mischung gebraucht wird. Es wird nicht ein Teil der Lö­ sungsmittel zu den Vorratsgefäßen zurückgepumpt und somit nach einem Lösungsmittelwechsel die Kontamination der neuen Lösungsmittel verhindert.

Da nur eine einzige Niederdruckpumpe erforderlich ist und ein Ventilblock mit einfachen 2-Wege-Ventilen Verwendung finden kann, ergibt sich insgesamt eine wesentliche Vereinfachung im Vergleich zu der Vorrichtung nach Fig. 3. Gleichwohl kann das neue Gerät mit allen verfügbaren Hochdruck-HPLC-Pumpen, auch Kurzhubpumpen, kombiniert werden. Die Dosiergenauigkeit bleibt unabhängig von der Flußrate der Hochdruckpumpe stets konstant, weil die Niederdruckpumpe immer unter den gleichen Bedingungen läuft. Die Hubgeschwindigkeit ist auf die Öff­ nungs- und Schließzeiten der Ventile unter Lösungsmittelbe­ dingungen abgestimmt. Das Totvolumen des Systems kann sehr klein gehalten werden, weil wenige, kurze Verbindungsschläu­ che genügen. Daher kann auch der gesamte Gradientenformer in einem kleinen Gehäuse untergebracht werden.

Claims (8)

1. Verfahren zur Herstellung von Lösungsmittelgemischen für die Versorgung einer Hochdruckpumpe bei der Hochdruck- Flüssigkeits-Chromatographie, wobei die zu mischenden Lösungsmittel jeweils über zugeordnete, steuerbare Ven­ tile angesaugt und in eine an die Saugseite der Hoch­ druckpumpe angeschlossene Mischkammer gepumpt werden, dadurch gekennzeichnet, daß sämtliche Lösungsmittel von einer einzigen Niederdruckpumpe über die ihnen jeweils zugeordneten, im Verhältnis der Mischungsanteile geöffnet gehaltenen Ventile angesaugt und in die Mischkammer ge­ pumpt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Niederdruckpumpe unabhängig von der Förderrate und dem Pumpzyklus der Hochdruckpumpe mit konstanter Dauer und gleichem Bewegungsablauf aller Pumpzyklen betrieben wird.

3. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 mit einer Niederdruck-Pumpeinrichtung, mittels welcher mehrere zu mischende Lösungsmittel über ihnen zugeordnete Zufuhrleitungen und steuerbare Ventile (1, 2, 3) ansaug­ bar und zu einer an die Saugseite einer Hochdruckpumpe (5) für die Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie an­ schließbaren Mischkammer (9) förderbar sind, dadurch gekennzeichnet, daß eine einzige Niederdruckpumpe (12) vorhanden ist, welche saugseitig an die Ventile (1, 2, 3) in sämtlichen Zufuhrleitungen der zu mischenden Lösungs­ mittel angeschlossen ist, wobei während der Saugphase der Niederdruckpumpe (12) die Ventile im Verhältnis der Mi­ schungsanteile der Lösungsmittel geöffnet gehalten sind.

4. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Ventile (1, 2, 3) in an sich bekannter Weise an einem gemeinsamen Block (4) montierte 2-Wege-Magnetventile sind, derer Eingänge jeweils einzeln an die Zufuhrleitung für ein Lösungsmittel angeschlossen sind und deren Ausgänge zusammengeführt und mit der Niederdruckpumpe (12) verbunden sind.

5. Vorrichtung nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeich­ net, daß die Niederdruckpumpe (12) eine an sich bekannte, ventillose Taumelkolbenpumpe ist, deren Kolben und Zylin­ der aus keramischem Material bestehen.

6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Taumelkolbenpumpe (12) durch einen Schrittmotor je­ weils für eine vollständige Umdrehung antreibbar ist und ein Steuersignal für den Schrittmotor zur Ausführung je­ weils einer weiteren Umdrehung auslösbar ist, solange der Flüssigkeitsspiegel in der Mischkammer (9) unterhalb einer bestimmten Füllstandshöhe liegt.

7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3-6, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die Mischkammer (9) einen mit der Druckseite der Niederdruckpumpe (12) verbunden Einlaß (14) und einen an die Saugseite der Hochdruckpumpe (5) angeschlossenen Auslaß (15) hat, der sich horizontal hinter einem Blasenschutz (16), unterhalb von dessen Oberkante befindet.

8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß sich zwischen dem auf niedrigem Niveau angeordneten Ein­ laß (14) und dem auf höheren Niveau angeordneten Blasen­ schutz (16) und Auslaß (15) eine Leiteinrichtung (13) be­ findet, durch welche Gasblasen in horizontaler Richtung vom Blasenschutz (16) wegleitbar sind.