DE4407538C1 - Bindungsreagens für Zell-Oberflächenprotein und Effektorzelle - Google Patents

Bindungsreagens für Zell-Oberflächenprotein und Effektorzelle

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Description

Die Erfindung betrifft ein Bindungsreagens, ein Verfahren zu seiner Herstellung und eine das Bindungsreagens enthaltende Vakzine.
Es ist bekannt, daß bei aktiver Immunisierung die verwendeten Zellen oftmals nur eine schwache oder gar keine Immunogenität zeigen. Dies findet sich insbesonde­ re, wenn Tumorzellen verwendet werden.
Versuche wurden unternommen, die Immunogenität von Zellen zu steigern. Viel­ fach führten solche Versuche, wie bei der Verwendung von durch Newcastle Disease Virus (nachstehend mit NDV bezeichnet) erhaltenen Onkolysaten, nicht zu befriedigenden Ergebnissen.
Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzustellen, mit dem die Immunogenität von Zellen gesteigert werden kann.
Erfindungsgemäß wird dies durch Bereitstellung eines Bindungsreagens erreicht, das sich dadurch auszeichnet, daß es eine erste Bindungskomponente für ein Zell- Oberflächenprotein und eine zweite Bindungskomponente für ein kostimulatorisch wirkendes Molekül einer Effektorzelle aufweist.
Der Ausdruck "erste Bindungskomponente" umfaßt jegliche Verbindung, die einer­ seits an ein Zell-Oberflächenprotein und andererseits an eine zweite Bindungskom­ ponente binden kann. Vorzugsweise ist eine solche Verbindung ein Antikörper oder ein eine Bindungsdomäne aufweisender Teil davon. Günstigerweise ist ein solcher Teil ein Fab′-, (Fab′)₂-, Fv- oder (Fv)₂-Fragment. Als besonders günstig hat sich das Fv-Fragment eines Anti-Hämaglutinin-Neuraminidase-Antikörpers erwiesen.
Der Ausdruck "Zell-Oberflächenprotein" umfaßt jegliches Molekül, das auf einer Zelloberfläche vorliegen kann. Ein solches kann z. B. ein Peptid oder Protein sein, das von der Zelle selbst oder von einem die Zelle befallenen Virus stammt. Vor­ zugsweise ist das "Zell-Oberflächenprotein" ein Virusprotein, wie das Hämagluti­ nin-Neuraminidase-Molekül von NDV, das Hämaglutinin-Molekül von Influenza Virus oder das Hüllprotein von HTLV-I bzw. HIV, ein Wachstumsfaktor-Rezeptor, ein Onkogen-Produkt, wie v-Erb B2, oder ein Adhäsionsmolekül. Als besonders günstig hat es sich erwiesen, wenn das Zell-Oberflächenprotein ein Virusprotein von NDV ist, wobei insbesondere das Hämaglutinin-Neuraminidase-Molekül von NDV zu erwähnen ist.
Der Ausdruck "zweite Bindungskomponente" umfaßt jegliche Verbindung, die einerseits an eine erste Bindungskomponente und andererseits an ein kostimulato­ risch wirkendes Molekül einer Effektorzelle binden kann. Vorzugsweise ist eine solche Verbindung ein Antikörper oder ein eine Bindungsdomäne aufweisender Teil davon. Günstigerweise ist ein solcher Teil ein Fab′-, (Fab′)₂-, Fv oder (Fv)₂-Frag­ ment. Als besonders günstig hat sich das Fv-Fragment eines Anti-CD28-Antikör­ pers erwiesen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die vorstehende Verbindung ein B7 Protein oder ein Teil davon (vgl. Nature 366 (1993), 76; Science 262 (1993), 909″). Als besonders günstig hat es sich erwiesen, wenn ein solcher Teil nicht die Membran-gebundene Domäne umfaßt.
Der Ausdruck "Effektorzelle" umfaßt jegliche an einer Immunreaktion beteiligte Zelle. Vorzugsweise handelt es sich um eine T-Zelle.
Der Ausdruck "kostimulatorisch wirkendes Molekül" umfaßt jegliches Molekül einer Effektorzelle, das durch Bindung oder in sonstiger Weise veranlaßt werden kann, die Effektorzelle zu stimulieren. Ein solches Molekül kann z. B. ein Rezeptor sein. Im Falle einer T-Zelle bieten sich insbesondere die Rezeptoren CD2-, CD3-, CD26-, CD28- und CTLA-4 sowie HSA (Heat Stable Antigen) als günstig für die Erfindung an. Der Rezeptor CD28 ist dabei besonders zu betonen.
Erfindungsgemäß wird auch ein Verfahren zur Herstellung eines Bindungsreagens bereitgestellt. Ein solches umfaßt die folgenden Schritte:
  • a) Insertion einer eine erste Bindungskomponente codierenden DNA in einen Expressionsvektor, Expression der DNA, Isolierung des Expressionsprodukts und seine Reinigung,
  • b) Insertion einer eine zweite Bindungskomponente codierenden DNA in einen Expressionsvektor, Expression der DNA, Isolierung des Expressionsprodukts und seine Reinigung,
  • c) Kopplung des Expressionsprodukts von (a) mit jenem von (b) in üblicher Weise.
In den Verfahrensschritten (a) und (b) werden eine erste Bindungskomponente bzw. eine zweite Bindungskomponente durch übliche DNA-Rekombinationstechni­ ken hergestellt. Dem Fachmann sind Systeme bekannt, die zur Expression der einzelnen Bindungskomponenten verwendet werden können. Er kennt Vektoren, Expressions-Kontrollelemente und Zellen, die hierfür herangezogen werden können. Als günstig hat es sich erwiesen, beide Bindungskomponenten als Fv-Fragmente von Antikörpern bereitzustellen. Beispielhaft wird auf die Herstellung des Fv-Frag­ ments eines Anti-Hämaglutinin-Neuraminidase-Antikörpers und des Fv-Fragments eines Anti-CD28-Antikörpers hingewiesen. Hierzu werden die Expressionsplasmide pOPE51-αHN bzw. pOPE51-αCD28 konstruiert (vgl. nachstehendes Beispiel 1).
Die Expressionsplasmide pOPE51-αHN und pOPE51-αCD28 gehören zur vorliegen­ den Erfindung.
Desweiteren sind dem Fachmann Verfahren bekannt, die erhaltenen Bindungskom­ ponenten zu reinigen. Beispielhaft wird auf die Reinigung des Fv-αHN-Fragments und des Fv-αCD28-Fragments in nachstehendem Beispiel 2 verwiesen.
Im Verfahrensschritt (c) wird die Bindungskomponente von (a) mit jener von (b) gekoppelt. Dem Fachmann sind hierfür verwendbare Verfahren bekannt. Beispiel­ haft wird auf die Kopplung des Fv-αHN-Fragments mit dem Fv-αCD28-Fragment in nachstehendem Beispiel 3 verwiesen.
Erfindungsgemäß wird auch eine Vakzine mit inaktivierten Zellen bereitgestellt, die sich dadurch auszeichnet, daß ein Bindungsreagens an ein Zell-Oberflächenprotein gebunden ist. Eine solche Vakzine weist vorzugsweise Tumorzellen auf. Diese können aus durch Operation entfernten Tumoren oder aus einer etablierten Zellinie stammen. Die (Tumor)-Zellen können Virus-modifiziert sein. Auch können durch Virus erhaltene Lysate von (Tumor)Zellen vorliegen. Vorteilhafterweise wird NDV als Virus verwendet. Als günstig hat es sich erwiesen, wenn das Bindungsreagens gegen ein Virusprotein von NDV, insbesondere dem Hämaglutinin-Neuraminidase- Molekül, gerichtet ist. Beispielhaft wird auf die Herstellung der Tumorvakzine von nachstehendem Beispiel 4 verwiesen.
Mit den erfindungsgemäßen, an (Tumor)Zellen anzubringenden Bindungsreagentien ist es möglich, Signale auf kostimulatorisch wirkende Moleküle, z. B. Rezeptoren, von Effektorzellen zu übertragen. Somit empfangen Effektorzellen nicht nur das durch ein Antigen von (Tumor)Zellen vermittelte Signal, sondern werden ferner kostimuliert. Die erfindungsgemäßen Bindungsreagentien eignen sich daher be­ stens, die Immunogenität von Zellen, insbesondere Tumorzellen, zu steigern. Sie stellen eine große Verbesserung für die aktive Immunisierung dar.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung des Expressionsplasmids pOPE51-αHN, und
Fig. 2 zeigt eine schematische Darstellung des Expressionsplasmids pOPE51- αCD28.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1 Konstruktion der Expressionsplasmide pOPE51-αHN und pOPE51-αCD28 A) Konstruktion von pOPE51-αHN
Als Ausgangsmaterial wurde der Vektor pOPE40 verwendet (vgl. Dübel et al., Gene 128 (1993), 97). Dieser enthält eine DNA, die für das Fv-Fragment (VH + VL) eines Anti-Lysozym-Antikörpers codiert. Die DNA für VH ist mit jener für VL über einen Linker verbunden. Der DNA vorstehenden Fragments schließt sich in 3′- Richtung eine DNA an, die für ein Epitop des monoklonalen Antikörpers 9E10 auf dem myc Genprodukt codiert.
Zur Herstellung von pOPE51-αHN wurde am 3′-Ende vorstehender myc DNA von pOPE40 die DNA-Sequenz TGC ATA CAT CAC CAT CAT CAT eingefügt. Mit dieser für die Aminosäure-Sequenz Cys IIe His His His His His codierenden DNA wurde das Codon für die Aminosäure Asn am 3′-Ende der myc DNA ersetzt. Ferner wurden im Linker zwischen VH und VL die Restriktionsstellen BssHII und EcoRI entfernt. Darüber hinaus wurden in den Vektoranteil drei Restriktionsstellen, nämlich Ncol (nt. 76-81), MInI (nt. 579-584) und Notl (nt. 910-917), eingefügt. Es wurde das Expressionsplasmid pOPE51-αLys erhalten.
In diesem Expressionsplasmid wurde schließlich die DNA vorstehenden Fv-Frag­ ments (VH : PvuII-HindIII-Fragment; VL : EcoRV-BamHI-Fragment) durch jene für das Fv-Fragment (VH : PvuII-HindIII-Fragment; VL : Eco-RV-BamHI-Fragment) eines Anti- Hämaglutinin-Neuraminidase-Antikörpers ersetzt. Die DNA letzteren Fragments wird nachstehend mit Fv-αHN-DNA bezeichnet. Die DNA für VH und VL dieses Fragments wurde aus der cDNA einer Hybridomzellinie mittels üblicher PCR-Tech­ nik erhalten (vgl. Iorio, R. M. et al., J. gen. Virol. 67 (1986), 1393).
Es wurde das Expressionsplasmid pOPE51-αHN (vg. Fig. 1) erhalten.
B) Konstruktion von pOPE51-αCD28
Die Konstruktion von pOPE51-αCD28 wurde ausgehend von pOPE51-αLys, wie unter (A) für pOPE51-αHN beschrieben, durchgeführt. Die DNA, welche für das Fv- Fragment (VH + VL) eines Anti-CD28-Antikörpers codiert, wurde aus der cDNA einer Hybridomzellinie mittels üblicher PCR-Technik erhalten (vgl. van Lier, R. et al. in Leucocyte Typing IV, Oxford University Press (1989), 353). Die DNA dieses Fragments wird nachstehend mit Fv-αCD28-DNA bezeichnet.
Das erhaltene Expressionsplasmid pOPE51-αCD28 ist in Fig. 2 gezeigt.
Beispiel 2 Expression der Fv-GHN und Fv-GCD28-DNA sowie Reinigung der Expressionsprodukte (Fv-αHN- und Fv-αCD28-Fragmente) A) Expression der Fv-αHN-DNA und Reinigung des Expressionsprodukts (Fv- αHN-Fragment)
E.coli JM109-Zellen wurden in üblicher Weise mit dem Expressionsplasmid pOPE51-αHN transformiert und in 2 l LB-Medium bei 30°C bis zu einer OD₆₀₀ von 0,7 kultiviert. Isopropyl-β-thiogalactosid (IPTG) wurde bis zu einer Endkonzen­ tration von 20 µm zugegeben. Die Zellen wurden bei Raumtemperatur 3 h inkubiert und anschließend durch Zentrifugation (4500 g, 4°C, 15 min) gesammelt. Die Zellen wurden in 1/50 des ursprünglichen Volumens in 0,1 M Natriumacetat, pH 5,5, 10 mM EDTA, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) bei 0° suspendiert. Lysozym wurde bis zu einer Endkonzentration von 1 mg/ml zugegeben. Nach 30 minütiger Inkubation auf Eis unter schwachem Schütteln wurden lösliche Zell­ plasmaproteine durch Zentrifugation (30 000 g, 4°C, 30 min) entfernt. Die Zell­ pellets wurden in 1/140 des ursprünglichen Volumens in 30 mM Natriumphosphat, 0,3 M NaCl, mM PMSF, pH 7,0 resuspendiert und durch Beschallung lysiert. Anschließend wurde zentrifugiert (30 000 g, 30 min, 4°C), wodurch lösliche Cytoplasmaproteine entfernt wurden. Die Pellets wurden in dem gleichen Volumen in 3 M Harnstoff, 25 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 7,0 suspendiert und die lösli­ chen Proteine durch Zentrifugation, wie vorstehend beschrieben, entfernt. Ein­ schlußkörper wurden in 1/40 des ursprünglichen Volumens in 6 M GuHCl, 0,1 M Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 7,0 resuspediert. Das Gemisch wurde erneut zen­ trifugiert (30 000 g, 30 min, 4°C) und der Überstand gegen 6 M Harnstoff, 25 mM Tris-HCl, pH 7,0 dialysiert. Imidazol wurde bis zu einer Endkonzentration von 30 mM zugegeben. Die Proteinlösung wurde auf eine Chelating Sepharose Fast Flow-Säule gegeben, die mit NiCl₂ beladen und mit 6 M Harnstoff, 25 mM Tris-HCl und 50 mM lmidazol, pH 7,0 äquilibiriert worden war. Die Säule wurde mit dem fünffachen Säulenvolumen an 6 M Harnstoff, 25 mM Tris-HCl, 50 mM lmidazol, pH 7,0 gewaschen. Gebundene Fv-αHN-Fragmente wurden mit dem 1,5fachen Säulenvolumen an 6 M Harnstoff, 25 mM Tris-HCl, 250 mM lmidazol, pH 7,0 eluiert. Anschließend wurde eine IMAC bei Raumtemperatur durchgeführt. Das eluierte Protein wurde bei 4°C gegen 0,4 M L-Arginin-HCl, 0,1 M Tris-HCl, 5 mM EDTA, pH 7,0 dialysiert, anschließend unter Verwendung permeabler Collodion- Beutel (Rückhaltevermögen: 12,4 kDa) konzentriert und dann auf eine Superdex 75 HL26/60-Säule aufgetragen, die mit 0,4 M L-Arginin-HCl, 0,1 M Tris-HCl, 5 mM EDTA, pH 7,0 äquilibriert worden war. Eine Größenausschlußchromatographie wurde unter Bedingungen, wie von Kurucz et al., PNAS USA, 90 (1993), 3830 beschrieben, durchgeführt. Zur Kalibrierung der Säule wurde ein Gelfiltrations­ kalibrierungskit aus Ribonuklease A (13,7 kDa), Chymotrypsinogen A (25 kDa), Ovalbumin (43 kDa) und Rinderserumalbumin (67 kDa) verwendet. Die eluierten Fraktionen mit dem Fv-αHN-Fragment wurden gesammelt und gegen PBS (15 mM Natriumphosphat, 0,15 m NaCl, pH 7,0) dialysiert. Die Proteinkonzentrationen wurden in üblicher Weise bestimmt.
B) Expression der Fv-αCD28-DNA und Reinigung des Expressionsprodukts (Fv-αCD28-Fragment)
Die Expression der Fv-αCD28-DNA und die Reinigung des Fv-αCD28-Fragments erfolgten, wie unter (A) für Fv-αHN-DNA (Fragment) beschrieben.
Beispiel 3 Kopplung des Fv-αHN-Fragments mit dem Fv-αCD28-Fragment
10 mg des Fv-αHN-Fragments (1 mg/ml) von Beispiel 2(A) wurden mit einem 100 fachen Überschuß der bifunktionellen Sulfhydryl-Verbindung Bismaleimidohexan (BMH) 1 mM 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden Reste der Sulfhydryl-Verbindung durch Dialyse gegen PBS entfernt. Danach wurde das Fv-αCD28-Fragment von Beispiel 2 (B) in äquimolarer Menge zugegeben. Das Gemisch wurde 30 min bei Raumtemperatur inkubiert, wodurch das erfindungs­ gemäße Bindungsreagens Fv-αHN/Fv-αCD28 erhalten wurde.
Beispiel 4 Herstellung einer Tumorvakzine
Von frisch operiertem Tumorgewebe wurden Fett und Bindegewebe in üblicher Weise entfernt. Das Tumorgewebe wurde in kleine Stücke geschnitten und mit 40 ml eines Enzym-Cocktails (Collagenase 0,32 mg/ml, DN-ase 0,535 mg/ml und Hyaluronidase 0,535 mg/ml in HBSS) 1 h bei 37°C unter Rühren inkubiert. Die erhaltene Zellsuspension wurde über ein gebräuchliches Nylon-Netz abgegossen. Bei "sehr harten" Tumoren wurden Gewebereste ein zweitesmal mit vorstehendem Enzym-Cocktail (40 ml) inkubiert und filtriert. Alle Suspensionen wurden vereinigt, mit HBSS auf 50 ml aufgefüllt und 15 min bei 1200 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in 10 ml vorstehender DN-ase-Lösung resuspendiert und 10 min bei 37°C inkubiert. Die Suspension wurde auf 50 ml HBSS aufgefüllt und 10 min bei 1300 U/min zentrifugiert. Das Pellet wurde in 10 ml HBSS resuspendiert und die Zellen wurden in einer Neubauer-Zellkammer mit Trypan-Blau gezählt.
Bei Vorliegen von mehr als 6×10⁷ lebenden Tumorzellen und einem Anteil von Nicht-TumorzeIlen (Lymphozyten und Monozyten) von mehr als 50% der Gesamt­ zellen wurde ein weiterer Separationsschritt zur Entfernung der Lymphozyten und Nicht-Tumorzellen (Lymphozyten und Monozyten) von mehr als 50% der Gesamt­ zellen wurde ein weiterer Separationsschritt zur Entfernung der Lymphozyten und Monozyten durchgeführt. Je 100 µl Dynabeads Anti-CD2 (Pan-T), Anti-CD19 (Pan- B) und Anti-CD14 (Pan-Monocyten) wurden in Röhrchen gegeben und dreimal mit je 7 ml gekühltem HBSS/HSA gewaschen. Diesen Röhrchen wurden in 2 ml kaltem HBSS/HSA resuspendierte Zellen zugegeben und die Röhrchen wurden 30 min auf Eis inkubiert. Magnetbeads wurden mit einem Magnet entfernt und die Zellsuspen­ sion wurde abgesaugt, in Röhrchen mit 50 ml HBSS aufgefüllt und 10 min bei 1300 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, das Pellet in 50 ml HBSS resuspendiert und anschließend 10 min bei 1300 U/min zentrifugiert.
Das erhaltene Zellpellet wurde in HBSS resuspendiert, wobei 1×10⁷ Zellen in 0,5 ml HBSS aufgenommen wurden. Von der erhaltenen Zellsuspension wurden ca. 0,5 ml in vorbereitete Einfrierröhrchen gegeben. Diesen wurden ca. 0,5 ml Zwei­ fach-Einfriermedium auf Eis zugegeben, bevor die Einfrierröhrchen bei -70°C über Nacht gelagert und dann in flüssigem Stickstoff aufbewahrt wurden.
50 µl vorstehender, nicht mit Einfriermedium versehener Zellsuspension wurden für Cytospin-Präparate auf Eis gestellt und mit PBS in einer Verdünnungsreihe jeweils 1 : 1 verdünnt. 6 Eppendorf-Hütchen mit je 50 µl PBS/BSA wurden jeweils 50 µl vorstehender Verdünnungsreihe zugegeben und die Hütchen wurden in eine Cytospin-Apparatur eingeführt. Nach 5minütiger Zentrifugation bei 1000 U/min wurden die Objektträger 1 min mit 100% Methanol an der Luft fixiert. Anschlie­ ßend erfolgte eine Färbung nach dem bekannten Verfahren von Pappenheim. Dann wurden lichtmikroskopisch die Zellen auf ihren Gehalt an Tumorzellen untersucht. Bei einem Gehalt von weniger als 50% Tumorzellen wurde vorstehende Zell­ suspension nicht als Vakzine verwendet.
Bei einem Gehalt von mehr als 50% Tumorzellen wurde vorstehende Zellsuspen­ sion bei 37°C aufgetaut, in ein Röhrchen überführt und auf 14 ml mit PBS aufge­ füllt. Nach 10minütiger Zentrifugation bei 1300 U/min wurde der Überstand verworfen. Das Pellet wurde in 100 µl PBS resuspendiert, in Einfrierröhrchen überführt und mit 30 ml NDS-Suspension (Konzentration 1000 HAU/ml) versetzt. Es folgte eine 30minütige Inkubation bei 37°C, wobei nach 15 min leicht aufge­ schüttelt wurde. Nach der Inkubation wurde sorgfältig gewaschen, ehe ein Aliquot von Tumorzellen (5×10⁶ vitale Tumorzellen) mit ca. 5 µg Protein des erfindungs­ gemäßen Bindungsreagens von Beispiel 3 30 min bei 37°C inkubiert wurde. Danach wurde die Zell-Suspension mit 200 Gy bestrahlt. Die Zell-Suspension wurde bis zur Injektion auf Eis gelagert, dann in eine Spritze aufgezogen und mit einer 0,9×40 ml Kanüle intradermal injiziert.

Claims (23)

1. Bindungsreagens, dadurch gekennzeichnet, daß es eine erste Bindungskom­ ponente für ein Zell-Oberflächenprotein und eine zweite Bindungskomponen­ te für ein kostimulatorisch wirkendes Molekül einer Effektorzelle aufweist.
2. Bindungsreagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Bindungskomponente ein Antikörper oder ein eine Bindungsdomäne auf­ weisender Teil davon ist.
3. Bindungsreagens nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Teil des Antikörpers ein Fab′-, (Fab′)₂-, Fv oder (Fv)₂-Fragment ist.
4. Bindungsreagens nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeich­ net, daß das Zell-Oberflächenprotein ein Virusprotein, ein Wachstumsfaktor- Rezeptor, ein Onkogen-Produkt oder ein Adhäsionsmolekül ist.
5. Bindungsreagens nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Virusprotein das Hämaglutinin-Neuraminidase-Molekül des Newcastle Disea­ se Virus ist.
6. Bindungsreagens nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeich­ net, daß die zweite Bindungskomponente ein Antikörper oder ein eine Bindungsdomäne aufweisender Teil davon ist.
7. Bindungsreagens nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Teil des Antikörpers ein Fab′-, (Fab′)₂-, Fv- oder (Fv)₂-Fragment ist.
8. Bindungsreagens nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeich­ net, daß die zweite Bindungskomponente ein B7 Protein oder ein Teil davon ist.
9. Bindungsreagens nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Teil von B7 nicht die Membran-gebundene Domäne umfaßt.
10. Bindungsreagens nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeich­ net, daß die Effektorzelle eine T-Zelle ist.
11. Bindungsreagens nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das kostimulatorisch wirkende Molekül ein CD2-, CD3-, CD28-, CD26- oder CTLA-4-Rezeptor oder HSA ist.
12. Verfahren zur Herstellung eines Bindungsreagens nach Anspruch 1, um­ fassend die folgenden Schritte:
  • a) Insertion einer eine erste Bindungskomponente codierenden DNA in einen Expressionsvektor, Expression der DNA, Isolierung des Expres­ sionsprodukts und seine Reinigung,
  • b) Insertion einer eine zweite Bindungskomponente codierenden DNA in einen Expressionsvektor, Expression der DNA, Isolierung des Expres­ sionsprodukts und seine Reinigung, und
  • c) Kopplung des Expressionsprodukts von (a) mit jenem von (b) in übli­ cher Weise.
13. Expressionsplasmid, dadurch gekennzeichnet, daß es eine eine erste Bin­ dungskomponente des Bindungsreagens nach Anspruch 1 codierende DNA in einer Expressionseinheit enthält.
14. Expressionsplasmid nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß es jenes von Fig. 1 ist, wobei Fig. 1 Bestandteil dieses Anspruchs ist.
15. Expressionsplasmid, dadurch gekennzeichnet, daß es eine eine zweite Bindungskomponente des Bindungsreagens nach Anspruch 1 codierende DNA in einer Expressionseinheit enthält.
16. Expressionsplasmid nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß es jenes von Fig. 2 ist, wobei Fig. 2 Bestandteil dieses Anspruchs ist.
17. Vakzine mit inaktivierten Zellen, wobei an ein Zell-Oberflächenprotein ein Bindungsreagens nach Anspruch 1 gebunden ist.
18. Vakzine nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen Tumor­ zellen sind.
19. Vakzine nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Tumorzellen aus durch Operation entfernten Tumoren stammen.
20. Vakzine nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Tumorzellen aus einer etablierten Zellinie stammen.
21. Vakzine nach einem der Ansprüche 17-20, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen Virus-modifiziert sind.
22. Vakzine nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß das Virus ein Newcastle Disease Virus ist.
23. Vakzine nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß das Zell-Ober­ flächenprotein das Hämaglutinin-Neuraminidase-Molekül ist.
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