DE4329756A1

DE4329756A1 - Verfahren zur Herstellung und Reinigung von alpha-Interferon

Info

Publication number: DE4329756A1
Application number: DE19934329756
Authority: DE
Inventors: Rudolf Dr Hauptmann; Edgar Dr Falkner; Gerhard Prof Bodo; Tilman Dipl Chem Dr Vos; Ingrid Dr Maurer-Fogy
Original assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Priority date: 1993-09-03
Filing date: 1993-09-03
Publication date: 1995-03-09

Description

Die Erfindung betrifft ein Herstellungsverfahren für Interferon-α (IFNα) durch bakterielle Expression und anschließende Isolierung, einen Expressionsvektor dafür sowie ein Verfah ren zur Reinigung von IFNα.

Verfahren zur Herstellung von IFNα durch bakterielle Expression sind bekannt. Das übliche Verfahren beruht auf der cytoplasmatischen Expression des Proteins in Escherichia coli, bei dem das exprimierte IFNα entweder in unlöslicher Form in sogenannten Einschlußkörpern in der Zelle vorliegt oder in der löslichen Fraktion nach dem Aufschließen der Zellwand ge funden wird (Thatcher et Panayotatos, 1986; Goeddel et al., 1980; Dworkin-Rastl et al., 1983). Die cytoplasmatische Expression weist allerdings Nachteile auf. Das synthetisierte Protein ist nicht korrekt gefaltet, und weil im Zytoplasma reduzierende Bedingungen herr schen, enthält es nicht die erforderlichen Disulfidbrücken. Das gebildete IFNα muß daher bei der Präparation oxidiert und umgefaltet werden. Dieser Prozeß ist ineffizient und führt zu unerwünschten Nebenprodukten (ganz- oder teilreduzierte Formen, Oligomere durch in termolekulare Disulfidbrückenbildung, fehlgefaltete Formen durch Ausbildung falscher Disulfidbrücken), die schwierig abzutrennen sind. Ein weiteres Problem ist, daß das N-ter minale Methionin, mit dem die Translation beginnt, vom intrazellulär synthetisierten IFNα nur unvollständig abgespalten wird. Das daraus resultierende N-Met-IFNα kann vom nati ven IFNα praktisch nicht abgetrennt werden.

Ein weiterer Nachteil gegenwärtig benutzter Verfahren ist die Verwendung von Promoto ren, die in nicht-induziertem Zustand nicht vollständig abgeschaltet sind, die durch Zugabe von Chemikalien induziert werden müssen, und deren Expressionsrate im induzierten Zu stand nicht befriedigend ist, wie z. B. der trp-Promotor aus Serratia marcescens.

Um einige der genannten Nachteile zu überwinden und trotzdem das ökonomische E. -coli- System zu nutzen, versuchten Breitling et al. (Breitling et al., 1989) IFNα1 und ein IFNα 1/2-Hybrid mit einem Vektor zu exprimieren, der die Sekretion des Interferons durch die Zellmembran in den periplasmatischen Raum ermöglichte. Sie verwendeten dabei Promotor, Ribosomenbindungsstelle (RBS) und Signalsequenz eines bakteriellen Staphylokinasegens (sak42D). 60-80% des so hergestellten IFNα wurden in den periplasmatischen Raum sezerniert. Das Protein enthielt allerdings, bedingt durch das Vektorkonstrukt, zusätzliche N-terminale Aminosäuren, die im entsprechenden nativen IFNα nicht vorkommen. Als gra vierender Nachteil dieses Expressionssystems erwies sich indes die Tatsache, daß die mit diesem Konstrukt transformierten Stämme genetisch nicht stabil blieben; die Expressions kassette wurde durch die spontane Insertion eines IS1-Elements desaktiviert. Die Aufgabe, ein Expressions/Sekretionssystem in E. coli für die Herstellung von humanem IFNα bereit zustellen, war im Stand der Technik also ungelöst.

Als eine Expressions/Sekretions-Kassette, die im Falle der Expression des menschlichen Wachstumsfaktor-Rezeptors in E. coli zum Erfolg geführt hatte, war ein Konstrukt aus dem Promotor der alkalischen Phosphatase (phoA) und der Signalsequenz des hitzestabilen Entertoxins II (STII) bekannt (Fuh et al., 1990).

Ein weiteres Problem bei der Herstellung von rekombinantem IFNα in E. coli ist die Reini gung des Proteins aus dem Bakterienlysat. Hier sind eine Reihe von Verfahren bekannt (Thatcher et Panayotatos, 1986; EP-A 203 382). Um die native Faltung des Proteins zu er halten, sind dabei Verfahren vorzuziehen, die ohne Denaturierungs- und Fällungsschritte auskommen. Ein solches Verfahren wird in der EP-S 396 555 beschrieben. Es besteht aus den Schritten Immunoaffinitätschromatographie, Reversed-Phase-Chromatographie (RPC), Kationenaustauschchromatographie, Konzentrierung durch Ultrafiltration und Gelfiltra tionschromatographie. Dieses Verfahren beruht wie andere bekannte Verfahren auf der ho hen Selektivität der Immunoaffinitätschromatographie im ersten Schritt. Es ist kein Verfah ren zur Herstellung von hochgereinigtem IFNα insbesondere IFNα2, bekannt, das ohne Denaturierungs-/Fällungsschritte und ohne Immunoaffinitätschromatographie auskommt. Gleichzeitig ist ein solches Verfahren aus ökonomischen und technischen Gründen wün schenswert. Wegen der für die Immunoaffinitätschromatographie notwendigen monoklo nalen Antikörper sind ihre Kosten hoch, gleichzeitig ist, da die Lebensdauer der antikör pergekoppelten Matrices endlich ist, eine kontinuierliche Versorgung mit diesen Antikör pern notwendig.

Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines wirtschaftlicheren und leistungsfähigeren Verfahrens zur Herstellung von Interferon-α, insbesondere Interferon-α2, durch rekombin ante Expression in E. coli. Dabei mußte das Problem gelöst werden, ein effizientes und stabiles System zur Expression/Sekretion des Proteins in den periplasmatischen Raum oder das Kulturmedium zu etablieren. Ferner war ein Verfahren zu entwickeln, das exprimiertes Protein schonend ohne Denaturierungs-/Fällungsschritte und ohne die Notwendigkeit der Immunoaffinitätschromatographie hochreinigen kann.

Diese Aufgabe konnte mit der vorliegenden Erfindung gelöst werden. Die Etablierung eines stabilen Expressions/Sekretionssystems für IFNα in E. coli gelang durch die Konstruktion eines Vektors, der die Signalsequenz (Leadersequenz) des hitzestabilen Enterotoxins II (STII) aus E. coli verknüpft mit der kodierenden Sequenz für ein reifes menschliches Inter feron-α, vorzugsweise Interferon-α2, enthält. Bevorzugt erfolgt die Expressionskontrolle mittels des Promotors der alkalischen Phosphatase aus E. coli (phoA). Als vorteilhaft erwies sich ferner die Integration der Ribosomenbindungsstelle des STII Gens. Ein weiterer überraschender Fortschritt konnte durch die Bereitstellung eines Reinigungsverfahrens für Interferon-α, das aus den Schritten Adsorptionschromatographie auf Silicagel, hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC), Kationenaustauschchromatographie und Anionenaus tauschchromatographie besteht, erreicht werden.

Ein Aspekt der Erfindung betrifft somit ein Verfahren der Herstellung von IFNα durch bak terielle Expression, bei dem transformierte Bakterienzellen verwendet werden, die einen Expressionsvektor enthalten, in dem die STII-Signalsequenz mit einem IFNα-Gen verknüpft ist, und durch Isolierung des exprimierten IFNα. Ein weiterer Aspekt betrifft einen bakter iellen Expressionsvektor für die Herstellung von IFNα, der ein Konstrukt aus der Signalse quenz des STII-Gens und einem IFNα-Gen enthält, sowie die Verwendung eines solchen Vektors zur Herstellung von IFNα. Ein dritter Aspekt betrifft ein Verfahren zur Reinigung von IFNα durch die chromatographischen Schritte Adsorptionschromatographie auf Silica gel, hydrophobe Interaktionschromatographie, Kationen- sowie Anionenaustauschchro matographie.

Als Ausgangspunkt für die Konstruktion des Vektors kann ein in E. coli replikationsfähiges Plasmid dienen, beispielsweise eignet sich das Plasmid pAT153 (Twigg et al, 1980) sehr gut für diesen Zweck. Eine Nukleotidsequenz, die für das Signalpeptid des STII-Gens ko diert, ist Stand der Technik (Picken et al., 1983; Lee et al., 1983). Der Fachmann ist in der Lage, durch Mutationen (Substitution, Deletion, Insertion, Addition) Varianten dieser Se quenz herzustellen, ohne ihre Grundeigenschaften zu verändern, und insbesondere solche Nukleotidsequenzen herzustellen, die wegen der Degeneration des genetischen Codes für die gleiche Aminosäuresequenz des Signalpeptids kodieren (Sambrook et al., 1989, bes. Kapitel 15). Eine ganze Reihe von Sequenzen, die für Mitglieder der IFNα-Familie kodie ren, ist bekannt (Mantei et al., 1980; Streuli et al., 1980; Goeddel et al., 1981); die Homo logie der sie kodierenden Gene beträgt mehr als 70%. Weitere Varianten dieser Sequenzen können in der Natur gefunden werden oder mit Methoden aus dem Stand der Technik, z. B. durch Mutagenese, aus den bekannten Sequenzen hergestellt werden (Sambrook et al., 1989, bes. Kapitel 15). Der Begriff "IFNα" im Sinne der Erfindung schließt demzufolge ne ben den bekannten Sequenzen auch solche Varianten ein, deren Gene durch hohe Homolo gie zu den bekannten Sequenzen gekennzeichnet sind und die für biologisch aktives IFNα kodieren. Besonders bevorzugt ist dabei die Sequenz, die für IFNα2c kodiert (Dworkin- Rastl et al., 1983; Bodo et Fogy, 1985). Besonders bevorzugt ist ferner die Verwendung des phoA-Promotors zur Kontrolle der Expression und darüber hinaus vorteilhaft die Inte gration der Ribosomenbindungsstelle des STII-Gens. Die Sequenz des phoA-Promotors (Chang et al., 1986; Shuttleworth et al., 1981) sowie der STII-Ribosomenbindungsstelle (Picken et al., 1983; Lee et al., 1983) sind bekannt; auch aus diesen Sequenzen kann der Fachmann ohne weiteres äquivalente Varianten herstellen. Konstruktion des Vektors, Transformation geeigneter E. coli-Stämme, Fermentation sowie Extraktion können nach an sich bekannten Methoden erfolgen (Sambrook et al., 1989). Für die Expression ist bei spielsweise der E. coli-Stamm W3110 (E. coli K12 Wildtyp f⁻, λ⁻, IN (rrnD-rrnE)1) gut geeignet. Die Vorkultur kann gut in LB-Medium, die Hauptkultur unter Kontrolle von Sau erstoff- und Nährstoffzufuhr bis zu einer OD₅₄₆ von 250 bis 280 erfolgen. Als gut geeignet erwies sich ein Extraktionsverfahren, bei dem säureinaktivierte Biomasse in verdünnter Essigsäure mit Hilfe eines Homogenisators suspendiert, mit Polyethylenimin, bevorzugt in einer Konzentration von 0.25% (w/v) versetzt, auf alkalischen pH, vorzugsweise pH 10, eingestellt, gerührt und anschließend durch Zentrifugation die Bakterien abgetrennt wurden. Die Reinigung kann nach an sich bekannten Verfahren erfolgen (Thatcher et Panayotatos, 1986; EP-A 203 382). Besonders vorteilhaft ist jedoch ein Reinigungsverfahren mit vier chromatographischen Schritten, und zwar Adsorptionschromatographie auf Silicagel, hydrophobe Interaktionschromatographie, Kationen- und Anionenaustauschchromato graphie. Als Gelbett der Silicachromatographie erwies sich das vom Typ 953W der Firma Grace gut geeignet, als Elutionsmittel war ein Puffer, der 500-1500 mM Tetramethylam moniumchlorid (TMAC), bevorzugt 800 mM TMAC, vorteilhaft verwendbar. Für die hy drophobe Interaktionschromatographie erwies sich eine Phenylsepharose als gut zu ver wendendes Gelbett. Der Probenauftrag erfolgte vorzugsweise in Anwesenheit von 20% Ammoniumsulfat, die Säule war mit einem Puffer, der 30% Ammoniumsulfat enthielt, equi libriert worden. Das IFNα wurde mit einem linearen Gradienten mit einer Endkonzentration von 30% Ethylenglykol eluiert. Die Kationenaustauschchromatographie konnte sehr gut mit einem Sulfopropyl-Ionenaustauscherharz ausgeführt werden. Der Probenauftrag erfolgte bei einem pH-Wert von 3-5, vorzugsweise pH 3, die Säule war auf pH 5 equilibriert. IFNα konnte erfolgreich mit einem linearen Kochsalzgradienten mit einem Zusatz von 10% Ethylenglykol eluiert werden. Als Gelbett für die Anionenaustauschchromatographie war DEAE-Sepharose sehr vorteilhaft zu verwenden, Auftrag und Elution erfolgten bei pH 5.5- 6.0, vorzugsweise bei pH 5.8. Zur Elution war ein linearer Kochsalzgradient mit einem Zusatz von 0.1% Tween 20 gut geeignet. Es gehört zu den technischen Möglichkeiten des Fachmanns, ohne erfinderische Tätigkeit jeweils eines oder mehrere Gelmaterialien durch gleichwertige zu ersetzen, die auf den gleichen Trennprinzipien basieren, und auf diese Weise das erfindungsgemäße Verfahren äquivalent auszuführen.

Überraschenderweise konnte mit der Verknüpfung der STII-Signalsequenz mit dem IFNα- Gen ein stabiles Expressions/Sekretionssystem etabliert werden, was mit der vorbeschriebe nen sak42D-Leader/IFNα-Kombination nicht gelungen war. Als besonders erfolgreich er wies sich die Expression dieser Sequenz unter der Kontrolle des phoA-Promotors. Die Inte gration der Ribosomenbindungsstelle des STII-Gens erwies sich in diesem Zusammenhang als zusätzlich vorteilhaft. Die Expression kann über die Kontrolle der Phosphatkonzentra tion im Medium (Phosphatmangel aktiviert den phoA-Promotor) zuverlässig gesteuert wer den; im inaktivierten Zustand gibt es keine nachweisbare Basalexpression. Zusätzliche Chemikalien brauchen zur Aktivierung nicht zugegeben zu werden, die Expressionsrate im aktivierten Zustand ist hoch. Das synthetisierte Protein wird in hohen Anteilen in den peri plasmatischen Raum sezerniert. Das sezernierte Protein ist korrekt gefaltet, enthält den authentischen N-Terminus und die richtigen Disulfidbrücken. Die SDS-Gelanalyse der Ex pression in E. coli W3110 zeigte, daß 30-50% des synthetisierten IFNα korrekt prozessiert waren, dies entspricht praktisch dem kompletten Anteil des sezernierten Proteins.

Mit dem in Beispiel 3 beschriebenen Extraktionsverfahren konnten 29.3 ± 5.9% des insge samt in der Biomasse nachweisbaren IFNα2c extrahiert werden. Dies entsprach dem beob achteten Prozessierungsgrad von 30-50%. Der Extrakt aus der Biomasse enthielt 4.5 ± 1.8% IFNα2c, bezogen auf Gesamtprotein. Die Silica-Adsorptionschromatographie führte zu einem IFNα2c-Pool mit einer durchschnittlichen Reinheit von 16.7 ± 4.4%. Die Phenyl- Sepharose-Chromatographie mit einer Ausbeute von 93.2 ± 7.3% ergab ein IFNα2c mit einer Reinheit von 71.2 ± 15.5%. Die Sulfopropyl-Ionenaustauschchromatographie er brachte eine Ausbeute von 70.9 ± 14.8% und eine Reinheit von 97.6 ± 4.6%. Der letzte Schritt, die DEAE-Ionenaustauschchromatographie, führte bei einer Ausbeute von 86.9 ± 9.2% zu 100% reinem IFNα2c, wie unten charakterisiert. Die Daten aus 6 verschiedenen Reinigungen sind in den Tabellen 1 (Ausbeuten) und 2 (IFNα2c-Gehalt) zusammengefaßt. Fig. 3 zeigt charakteristische Chromatogramme von jedem Reinigungsschritt.

Aus 1 kg Biomasse wurden 340 ± 100 mg gereinigtes IFNα1c erhalten. Die Ausbeute des Reinigungsprozesses ist 56.1 ± 22.2%. Die Gesamtausbeute, bezogen auf den IFNα2c-Ge halt der Biomasse ist 14.4%. Diese Daten sind in Tabelle 3 zusammengefaßt. Fig. 4 zeigt ei ne typische SDS-PAGE von gereinigtem IFNα2c, eluiert beim letzten chromatographischen Schritt. Die 18-kDa-Bande von IFNα2c ist die einzige sichtbare Bande. Kontaminierende Banden werden nicht beobachtet. Fig. 5A zeigt ein typisches Reversed-Phase-HPLC- Chromatogramm. Das gereinigte IFNα2c eluiert als homogener Peak bei 24.8 Minuten. Wurde dieses Material mit einem flachen Acetonitrilgradienten eluiert (Fig. 5B), wurden 2 Kontaminationspeaks an beiden Seiten des Hauptpeaks beobachtet. Diese Schultern, die et wa 1.8% des Gesamt-IFNα2c-Gehaltes enthalten, repräsentieren Formen, die am Methionin 111 oxidiert (erste Schulter) oder am N-Terminus acetyliert (zweite Schulter) sind.

Tabelle 1

Ausbeuten verschiedener Reinigungsschritte in Prozent IFNα2, die nach dem jeweiligen Reinigungsschritt erhalten wurden, dargestellt für 6 verschiedene Reinigungsprozeduren (p1-p6) aus 6 verschiedenen Biomassen. Die letzten beiden Spalten enthalten den Mittelwert (M) und die Standardabweichung (sd)

Tabelle 2

IFNα2-Gehalt verschiedener Reinigungsschritte. Die Daten sind als Prozentsatz des IFNα2-Gehalts, bezogen auf den Gesamtproteingehalt; der bei diesem Reinigungsschritt erhalten wurde, so dargestellt wie in Tabelle 1

Tabelle 3 Gesamtausbeuten des Reinigungsverfahrens. Der IFNα2c-Gehalt der Biomasse ist als g IFNα2/kg Biomasse dargestellt. Prozessierung und Extraktion sind als Prozentsatz des Gesamtgehalts an IFNα2 ausgedrückt. Die Ausbeute der Reinigung ist dargestellt als Prozentsatz von IFNα2c relativ zum IFNα2-Gehalt des Extrakts. Die Gesamtausbeute ist in mg IFNα2, erhalten pro kg Biomasse, und als Prozentsatz von gereinigtem IFNα2c, bezogen auf den IFNα2c-Gehalt des Extrakts, ausgedrückt

Abbildungen

Fig. 1A) Genkarte von pCF2. Das EcoRI-BamHI-Fragment von pAT153 wurde durch die Expressionskassette für IFN-ω1 ersetzt.
B) Sequenz des EcoRI(zerstört)-BamHI-Teils, der den phoA-Promotor, STII-Lea der + IFNω1-Gen enthält.

Fig. 2A) Genkarte des Plasmids pDH13. Das SspI-PstI-Fragment von pAT153 wurde durch die IFNα2c-Expressionskassette (EcoRI-PstI-Fragment von 2B)) ersetzt. Das β-Lactamase-Gen ist zerstört.
B) Nukleotidsequenz des EcoRI-HindIII-Inserts von pDH13.

Fig. 3 Chromatographische Reinigung von IFN-α2c, extrahiert aus Biomasse.
A) Adsorptionschromatographie auf Silicagel. Der Pfeil zeigt die Elution mit 800 mM Tetramethylammoniumchlorid an.
B) Hydrophobe Interaktionschromatographie auf Phenylsepharose. Die Elution wurde mit einem linearen Gradienten von 0 bis 100% Lösungsmittel B wie ange zeigt (----) durchgeführt.
C) Sulfopropyl-Kationenaustauschchromatographie. Die Elution wurde mit einem Gradienten von 0 bis 100% Lösungsmittel B wie angezeigt (----) ausgeführt.
D) Anionenaustauschchromatographie auf DEAE-Sepharose. Die Elution wurde mit einem Gradienten von 0 bis 100% Lösungsmittel B wie angezeigt (----) durch geführt.
Die Balken unter den Hauptpeaks in jedem Chromatogramm zeigen die IFNα2- haltigen Pools an, die gesammelt und für die folgenden Schritte verwendet wurden.

Fig. 4 SDS-PAGE von gereinigtem IFNα2c, gefärbt mit Coomassie Blue. Die Zahlen am linken Rand zeigen die Molekulargewichte der Standardproteine an.
Spur 1: IFNα2c-Standard
Spur 2 : 3 µg IFNα2c
Spur 3 : 6 µg IFNα2c
Spur M: Molekulargewichtsstandard.

Fig. 5 Charakterisierung von gereingtem IFNα2c durch Reversed Phase HPLC.
A) Elution von IFNα2c mit einem linearen Gradienten von 20-68% Lösungsmittel B in 24 Minuten.
B) Elution von IFNα2c mit einem linearen Gradienten von 45-53% Lösungsmittel B in 30 Minuten.

Beispiele Beispiel 1: Herstellung des Expressionsvektors pDH13 sowie damit transformierter Zellen Allgemeine Methoden

Restriktionsverdau von DNA mit Restriktionsendonukleasen, Auffüllreaktionen, Phenolex traktion und Fällung von DNA, Agarose-Gelelektrophorese und Elution von DNA aus Agarosegelen, Ligation von DNA-Molekülen, Transformation von Bakterien und Plasmi disolierung aus Bakterien sind Standardverfahren und wurden durchgeführt wie von Sam brook et al. (1989) beschrieben.

Plasmide

pCF2 pCF2 wurde aus dem Plasmid pAT153 (Twigg et al, 1980) hergestellt. Es enthält den Promotor der alkalischen Phosphatase aus E. coli (phoA, Chang et al. , 1986; Schuttleworth et al., 1986), die kodierende Region des STII-Leaderpeptids (Picken et al., 1983; Lee et al., 1983) sowie das Gen für menschliches IFNα1 (Hauptmann et al., 1985). Fig. 1 zeigt die Genkarte von pCF2 sowie die Sequenz des relevanten Abschnitts.

pER21/1 pER 21/1 ist ein bakterieller Expressionsvektor für IFNα2c (Dworkin- Rastl et al., 1983)
Oligonukleotide (5′ → 3′):

Herstellung der Expressionskassette aus phoA-Promotor, IFNα2c-Sequenz und STII-Lea dersequenz in einer Zweischritt-PCR

pER21/1-DNA wurde mit HindIII linearisiert, pCF2-DNA mit PvuI. Die im folgenden ver wendete Methode ist als SOE-PCR beschrieben ("splicing by overlap extension", Ho et al., 1989).

PCR 1a (Amplifikation des IFN-α2c-Gens): 100 ng linearisierter pER21/1-DNA, 25 pmol EBI-2797 und 25 pmol EBI-2798 wurden in 50 µl Puffer, der 50 mM KCl, 10 mM Tris- HCl, pH 8.3, 1.5 mM MgCl₂, 0.01% Gelatine, 0.2 mM ATP, 0.2 mM dGTP, 0.2 mM dCTP, 0.2 mM dTTP und 1.25 Einheiten Taq-Polyinerase enthielt, in einem Perkin Elmer Cetus Thermocycler TC-1 Thermozyklen unterworfen. Nach 3 min Inkubation bei 94°C wurden 10 Stufenzyklen (Stufe 1 : 40 sec bei 94°C, Stufe 2 : 30 sec bei 55°C, Stufe 3 : 90 sec bei 72°C) ausgerührt.

PCR 1b (Amplifikation von phoA-Promotor plus STII-Leadersequenz): 100 ng linearisierter pCF2-DNA, 25 pmol EBI-2787 und 25 pmol EBI 2799 wurden im gleichen Puffer und un ter gleichen Bedingungen wie unter PCR 1a beschrieben Thermozyklen unterworfen.

Die resultierenden DNA-Fragmente von PCR 1a (540bp) und PCR 1b (374 bp) wurden gel gereinigt (1.2% low gelling type Agarose in TBE-Puffer, 1×TBE: 10.8 g Tris/l, 5.5 g Bor säure/l, 0.93 g EDTA/l). Das Agarosestückchen, das das jeweilige DNA-Fragment enthielt, wurde ausgeschnitten und die Agarose geschmolzen, indem 100 µl H₂O zugegeben und auf 70°C erhitzt wurde.

PCR 2: 5 µl von jeder Agarose/DNA-Lösung wurden vereinigt und in 100 µl Lösung, die jeweils 50 pmol von EBI-2787 und EBI-2797 enthielt, Thermozyklen unterworfen. Der Puffer war der gleiche wie unter PCR 1a beschrieben. Das Thermozyklusgerät wurde so programmiert, daß an eine Verzögerungszeit von 5 min bei 94°C 20 Stufenzyklen (Stufe 1: 40 sec bei 94°C, Stufe 2 : 30 sec bei 55°C, Stufe 3: 5 min bei 72°C; Stufe 3 wurde bei jedem neuen Zyklus um 5 Sekunden verlängert) angeschlossen wurden. Nach der Amplifikation wurde die DNA durch Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanol-Präzipitation gereinigt. Das PCR-Produkt wurde aufgelöst und mit HindIII und EcoRI in den entsprechenden Puf fern geschnitten.

Klonierung des PCR-Produktes (pDH9)

Bluescribe M13⁺ (Stratagene, San Diego, CA, USA) wurde mit HindIII und EcoRI doppelt geschnitten und das große Fragment wurde mit einem 1.2%igen Agarosegel gelgereinigt. 10 ng Bluescribe M13⁺ DNA und 50 ng mit EcoRI/HindIII geschnittenes PCR-Produkt wurden in 10 µl Lösung, die 50 mM Tris-HCl, pH 7.6, 10 mM MgCl₂, 20 mM Dithio threitol, 1 mM ATP, 50 µg/ml Rinderserumalbumin (BSA) und 2 Einheiten T4-DNA-Ligase (NEN) enthielt, 1 Stunde bei 0°C und 3 Stunden bei Raumtemperatur ligiert. 8 µl dieser Lösung wurden für die Transformation kompetenter E. coli-Zellen vom Stamm JM 101 (E. coli K12, SupE, thi, Δ(lac·proAB), [F′,traD36, proAB, lacIZΔM15]) verwendet.

Ein Klon wurde ausgewählt, die DNA isoliert und die Expressionskassette sequenziert. Die Sequenz entsprach genau der theoretisch erwarteten Sequenz (Fig. 2). Das Plasmid wurde als pDH9 bezeichnet.

Konstruktion des Expressionsplasmids pDH13

pAT153 wurde mit SspI und PstI doppelt geschnitten und das große Fragment wurde iso liert. pDH9 wurde mit Eco RI geschnitten und die Enden aufgefüllt unter Verwendung des Klenowfragments der DNA-Polymerase I und der 4 dNTPs. Nach Phenolextraktion und Fällung der linearen pDH9-DNA wurde diese DNA mit Pst I geschnitten und das Fragment, das den phoA-Promotor, die STII- Leadersequenz und das IFNα2c-Gen enthielt, aus einem 1%igen Agarosegel isoliert.

10 ng pAT153×SsoI×PstI und 30 ng des Fragments, das die Expressionskassette enthielt, wurden in 10 µl Lösung für 5 Stunden bei Raumtemperatur ligiert. 5 µl von diesem Ansatz wurden verwendet, um kompetente E. coli-Bakterien des Stammes HB101 zu trans formieren. Die Selektion der transformierten Bakterien wurde auf LB-Agarplatten (10 g Trypton/l, 5 g Hefeextrakt/l, 5 g NaCl/l, 15 g Bacto-Agar/l) durchgeführt:, die 10 µg/ml Tet racyclin enthielten. Eine Genkarte von pDH13 und die Sequenz der relevanten Region ist in Fig. 2 dargestellt.

Plasmid-DNA verschiedener so erhaltener Kolonien wurde isoliert und durch Restriktions analyse auf korrekte Zusammensetzung überprüft. Ein Plasmid wurde ausgewählt und als pDH13 bezeichnet. Das Plasmid pDH13 wurde zur Transformation von E. coli W3110 (E. coli K12 Wildtyp, f⁻, λ⁻, IN (rrnD-rnnE)1) verwendet.

Beispiel 2: Fermentation Vorkultur

700 ml autoklaviertes LB-Medium (10 g Bacto-Trypton/l, 5 g Bacto-Hefeextrakt/l, 10 g NaCl/l, pH 7.0), das 5 mg/l Tetracyclin enthielt, wurden in einem 2l-Glasgefäß aus einer Stockkultur so beimpft, daß eine OD₅₄₆ von 0.01 erhalten wurde. Die Kultur wurde 10 Stunden bei 37°C unter starkem Rühren (800 U/min) und Belüftung (5 Fermentervolumina pro Minute [vvm]) inkubiert.

Hauptkultur Mediumzusammensetzung

im Fermenter:

1.21 g/l (NH₄)₂HPO₄
3.96 g/l (NH₄)₂SO₄
6.53 g/l K₂HPO₄
1.23 g/l MgSO₄×7H₂O
0.32 g/l NaCl
0.25 g/l NH₄Cl
1.0 g/l Na₃-Citrat×2H₂O
1.0 ml/l Spurenelementekonzentrat
12.5 g/l Glucose
20 mg/l Thiamin-HCl
50 mg/l L-Tryptophan
100 mg/l L-Leucin
50 mg/l L-Methionin
5 mg/l Tetracyclin

Spurenelementekonzentrat:
(Mengenangaben pro 100 ml)

3.35 g FeCl₃×6H₂O
1.09 g ZnSO₄×7H₂O
0.267 g CoCl₂×6H₂O
0.267 g Na₂MoO₄×2H₂O
0.221 g CuSO₄×5H₂O
0.333 g H₃BO₃
1.37 g MnSO₄×H₂O
10 ml HCl conc.
H₂O ad 100 ml

Fütterung während der Fermentation:
(Mengen bezogen auf Fermentervolumen)

350 g/l Glucose
3.70 g/l MgSO₄×7H₂O
175 mg/l Thiamin-HCl
0.50 g/l L-Tryptophan
4.0 g/l L-Leucin
2.0 g/l L-Methionin
Zudosierung von Antischaummittel während der Fermentation:
(bezogen auf Fermentervolumen)

1.0 ml/l UCON LB625

Salze ((NH₄)₂PO₄, (NH₄)₂SO₄, K₂HPO₄, NaCl, NH₄Cl und Na-Citrat) wurden in einem Fermenter sterilisiert. Spurenelemente, MgSO₄, Glucose, Thiamin, L-Tretophan, L-Leucin, L-Methionin und Tetracyclin wurden nach Abkühlung aseptisch so zugegeben, daß ein Startvolumen von 7 Litern erhalten wurde. 600 ml der Vorkultur wurden automatisch in den Fermenter überimpft. Die Fermentationsbedingungen waren: Rühren bei 1000 U/min, Belüftung von 1 vvm, 0.3 bar Überdruck, eine Temperatur von 37.0 ± 0.1°C, der pH wurde auf 6.7 ± 0.1 mit NH₃ und H₂SO₄ gehalten. Die Konzentration an gelöstem Sauerstoff wurde durch Belüftung mit sauerstoffangereicherter Luft nach Bedarf oberhalb von 15% Luftsättigung (bei 0.3 bar Gegendruck Überdruck gehalten. Nach Verbrauch der anfanglich vorhandenen Glucose wurde eine Fütterungsprozedur gestartet, die durch die Sau erstoffkonzentration automatisch ausgelöst wurde und Glucose, Thiamin, MgSO₄, L- Tryptophan, L-Leucin und L-Methionin enthielt. Die Fütterungsgeschwindigkeit begann mit 2.5 g/l*h Glucose und wurde innerhalb von 24 Stunden kontinuierlich auf 5.0 g/l*h gestei gert und anschließend bis zum Ende des Fermentationsprozesses konstant gehalten.

Die Fermentation wurde beendet, nachdem eine Gesamtmenge von 350 g/l Glucose zuge geben worden war. Zu diesem Zeitpunkt war eine typische optische Dichte von 250 bis 280 bei 546 nm erreicht.

Zur Inaktivierung der Biomasse wurde der Ansatz auf etwa 10°C gekühlt und gleichzeitig der pH-Wert mit H₂SO₄ auf 2.0 eingestellt. Die Biomasse wurde durch Zentrifugation ab getrennt und bei -70°C gefroren aufbewahrt.

Beispiel 3: Extraktion

Säureinaktivierte Biomasse (etwa 0.5 kg) wurde in 500 ml 1%iger Essigsäure mit Hilfe ei nes Polytron-Homogenisators suspendiert und 1 Stunde bei 0°C gerührt. Polyethylenimin (50%ige Stammlösung, Serva, Heidelberg) wurde bis zu einer Endkonzentration von 0.25% (w/v) zugegeben. Die Suspension wurde mit 5 N NaOH auf einen pH von 10.0 eingestellt und weitere 2 Stunden bei 0°C gerührt. Nach Einstellung des pH-Wertes auf 7.5 mit 5 N HCl wurden die Bakterien durch Zentrifugation bei 17000×g (Beckmann J2-21 Zentrifuge) abgetrennt. Die durchschnittliche Extraktionsausbeute betrug 29.3 ± 5.9% des Gesamtge haltes an IFNα2c.

Beispiel 4: Chromatographische Reinigung Adsorptionschromatographie auf Silicagel

Der IFNα-haltige Überstand nach der Abtrennung des Bakterienpellets in Beispiel 3 wurde auf eine Silicagel-Säule geladen (Grace, Silica Typ 953W; 35 mg Protein/ml Säulenmaterial, Flußgeschwindigkeit 25 ml/mm), die mit 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, equilibriert worden war. Die Säule wurde mit 30 Säulenvolumina Startpuffer gewaschen, dann folgte ein Waschschritt mit 20 mM Tris-HCl, 100 mM Tetramethylammoniumchlorid (TMAC), pH 7.5. IFNα2c konnte durch Steigerung der TMAC-Konzentration auf 800 mM TMAC eluiert werden (Fig. 3A).

Hydrophobe Interaktionschromatographie

Das Material, das von der Silicalgelsäule eluiert wurde, wurde durch Zugabe von festem (NH₄)₂SO₄ auf eine Ammoniumsulfatkonzentration von 20% (w/u) eingestellt und auf eine Phenylsepharosesäule (Phenyl Toyopearl, 650S, Tosohaas) geladen, die mit 20 mM Tris- HCl, 30% Ammoniumsulfat equilibriert worden war. IFNα2c wurde mit einem linearen Gradienten von 100% Ladebedingungen bis 100% 20mM Tris-HCl, 30% Ethylenglykol, pH 7.5, bei einer Flußgeschindigkeit von 15 ml/min eluiert. Die Reinheit des IFNα-Pools betrug 71 ± 15%.

Kationenaustauschchromatographie

Das Eluat der hydrophoben Interaktionschromatographie wurde durch extensive Dialyse auf 20 mM Na-Succinat, pH 5.0, eingestellt. Der endgültige pH wurde mit HCl auf 3.0 einge stellt, bevor die Probe auf ein Sulfopropyl-Ionenaustauscherharz (Toyopearl TSK SP 5PW, Tosohaas), equilibriert mit 20 mM Na-Succinat, pH 5.0, geladen wurde. IFNα2c wurde mit einem linearen Gradienten von 100% Ladebedingungen bis 100% 20 mM Na-Succinat, 500 mM NaCl, 10% Ethylenglykol, pH 5.5 (Lösungsmittel B) mit einer Flußgeschindigkeit von 6 ml/min von der Säule eluiert. Das von dieser Säule eluierte IFNα2c hatte routinemäßig eine größere Reinheit als 95%.

Anionenaustauschchromatographie

Der IFNα-Pool wurde gegen 10 mM bisTris, pH 5.8, dialysiert und auf eine DEAE-Se pharose (DEAE-Sepharose FastFlow, Pharmacia) geladen, die mit dem gleichen Puffer equilibriert war. Die Elution von IFNα2c erfolgte mit einem linearen Gradienten auf 10 mM bisTris, 500 mM NaCl, 0.1% Tween 20, pH 5.8 (Lösungsmittel B), Fließgeschindigkeit 5 ml/min.

Beispiel 5: Analyse der IFNα2c-Präparationen Reversed-Phase-HPLC

Intaktes IFNα2c wurde mit einer BakerBond -WP- C18-Säule [250×4.5 mm, Partikel größe 5 µm] bei 30°C analysiert. Für die Trennung von tryptischen Peptiden wurde eine Merck Supersphere 120-4 C-18-Säule [125×4.5 mm, Partikelgröße 4 µm] bei 37°C ver wendet. Die Proben wurden unter Verwendung der Lösungsmittel A, 0.1% Trifluores sigsäure in Wasser, und B, 0.1% Trifluoressigsäure in Acetonitril und mit den Gradienten wie in der jeweiligen Abbildungslegende beschrieben chromatographiert.

SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

IFNα2c-Proben wurden auf 16%-SDS-Polyacrylamid-Gelen unter Standardbedingungen analysiert. Proben wurden vor der Elektrophorese mit Dithiotreitol reduziert. Proteinbanden wurden mit Coomassie-Blue-Färbung visualisiert.

Quantifizierung von IFNα2c durch ELISA

Der IFNα2c-Gehalt verschiedener Proben, die während der Reinigung anfielen, wurde mit einem Sandwich-ELISA mit den monoklonalen Antikörpern OMG-2 und MG-7 (Adolf et al, 1990) bestimmt.

Literatur

Adolf, G.R., Virology 175, 410-417 (1990)
Bodo, G. & Maurer-Fogy, I., in: The Biology of the Interferon System 1985 (Hrsg.: Ste wart. W.E., II & Schellekens, H.), S. 59-64, Elsevier Scientific Publishing Co., Amsterdam (1985)
Breitling R., Gerlach D., Hartmann M., Behnke D., Mol. Gen. Genet. 217, 384-391(1989)
Chang C.N., Kuang W.-J. and E.Y. Chen, Gene 44, 121-125 (1986)
Dworkin-Rastl E., Swetly P., Dworkin M.B., Gene 21, 237-248 (1983)
Fuh G., Mulkerrin M.G., Bass S., McFarland M., Brochier M., Bourell J.H., Light D.R., Wells J.A., J. Biol. Chem. 265, 3111-3115(1990)
Goeddel D.V., Yelverton E., Ullrich A., Heynecker H.L., Miozarri G., Holmes W., Seeburg P.H., Dull T., May L., Stebbing N., Crea R., Maeda S., McCandliss R., Sloma A., Tabor J.M., Gross M., Familletti P.C., Pestka S., Nature 287, 411-416 (1980)
Goeddel D.V., Leung D.W., Dull T.J., Gross M., Lawn R.M., McCandliss R., Seeburg P.H., Ullrich A., Yelverton E., Gray P., Nature 290, 20-26 (1981)
Hauptmann R. and P. Swetly, Nucl. Acids Res. 13, 4739-4749 (1985)
Ho S.N., Hunt S.N., Horton R.M., Pullen J.K. and L.R. Pease, Gene 77, 51-59 (1989)
Lee C.H., Mosely S.L., Moon H.W., Whipp S.C., Gyles C.L. and M. So, Infection and Im munity 42, 264-268 (1983)
Mantei N., Schwarzstein M., Streuli M., Panem S., Nagata S., Weissmann C., Gene 10, 1- 10 (1980)
Picken R.N., Mazaitis A.J., Maas W.K., Rey M. and H. Heyneker, Infection and Immunity 42, 269-275 (1983)
Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T., "Molecular cloning - a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989)
Shuttleworth M., Taylor J. and N. Minton, Nucl. Acids Res. 14, 8689 (1986)
Streuli M., Nagata S., Weissmann C., Science 209, 1343-1347 (1980)
Thatcher D.R., Panayotatos N., Methods Enzymol. 119, 166-177 (1986)
Twigg A.J. and D. Sherratt, Nature 283, 216-218 (1980).

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Interferon-α durch Expression in E. coli, dadurch ge kennzeichnet, daß

a) Interferon-α exprimiert wird in Zellen, die einen Vektor enthalten, in dem die Signalsequenz des Gens für das hitzestabile Enterotoxin II (STII) aus E. coli verknüpft ist mit einer Sequenz, die für reifes menschliches Interferon-α kodiert
b) das exprimierte Interferon-α isoliert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor zusätzlich einen Promotor für die alkalische Phosphatase (phoA) aus E. coli enthält.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor zu sätzlich die Sequenz für die Ribosomenbindungsstelle des STII-Gens enthält.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Isolierung des In terferons die Schritte

a) Adsorptionschromatographie auf Silicagel
b) Hydrophobe Interaktions-Chromatographie
c) Kationenaustauschchromatographie
d) Anionenaustauschchromatographie

enthält.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die hydrophobe Interak tionschromatographie auf einer Phenylsepharose-Säule durchgeführt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Kationenaustausch chromatographie auf einem Sulfopropyl-Ionenaustauscher durchgeführt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Anionenaustausch chromatographie auf einer DEAE-Sepharose durchgeführt wird.

8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Interferon- α Interferon-α2 ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Interferon-α2 die Ami nosauresequenz enthält.

10. Verfahren zur Reinigung von Interferon-α, dadurch gekennzeichnet, daß es die Schritte

enthält.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die hydrophobe Interak tionschromatographie auf einer Phenylsepharose-Säule durchgeführt wird.

12. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Kationenaustausch chromatographie auf einem Sulfopropyl-Ionenaustauscher durchgeführt wird.

13. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Anionenaustausch chromatographie auf einer DEAE-Sepharose durchgeführt wird.

14. Verfahren nach Ansprüchen 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Interferon-α bakteriell exprimiert wurde.

15. Verfahren nach den Ansprüchen 10 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Inter feron-α Interferon-α2 ist.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Interferon-α2 die Aminosäuresequenz enthält.

17. Vektor zur Expression von Interferon-α in E. coli, dadurch gekennzeichnet, daß er die Signalsequenz des STII-Gens in Verknüpfung mit einer Sequenz enthält, die für reifes menschliches Interferon-α kodiert.

18. Vektor nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß er zusätzlich einen phoA- Promotor enthält.

19. Vektor nach den Ansprüchen 17 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß er zusätzlich die Ribosomenbindungsstelle des STII-Gens enthält.

20. Vektor nach den Ansprüchen 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß das Interferon- α Interferon-α2 ist.

21. Vektor nach den Ansprüchen 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß er die Nukleo tidsequenz oder eine Sequenz, die zu dieser Sequenz zu mehr als 70% homolog ist und für Inter feron-α kodiert, enthält.

22. Vektor nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß er die Nukleotidsequenz enthält.

23. Verwendung des Vektors gemäß einem der Ansprüche 17 bis 22 zur Herstellung von Interferon-α.