DE4318692C2 - Verfahren zur Untersuchung von antigenhaltigen Blutserumproben - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Untersuchung von antigenhaltigen Blutserumproben, die mittels einfacher radialer Immundiffusion (RID) Präzipitatringe auf einer Gelplatte gebildet haben.

Bei einem radialen Immundiffusions-Test wird antigenhaltiges Untersuchungsmaterial in Stanzlöcher einer etwa 1 mm dicken an­ tikörperhaltigen Agarosegelschicht gefüllt, mit der eine Pro­ benplatte präpariert ist. Bei der im Anschluß beginnenden Dif­ fusion wandern die gelösten Antigene solange radial in die Um­ gebung der Stanzlöcher, bis im Äquivalenzbereich mit den Anti­ körpern ein Antigen-Antikörper-Immunkomplex als unlösliches, sichtbares Präzipitat ausfällt. Je höher die Antigenkonzentra­ tion der Probe ist, desto größer ist der Präzipitatring, der um das Stanzloch herum entsteht. Die Auswertung der Serumproben, d. h. die Quantifizierung des Antigens im Serum, kann somit über das bei geeigneten Verhältnissen meßbare Quadrat des Ringdurchmessers bzw. Durchmessers innerhalb des Präzipitatrings im Vergleich zu Standardproben vorgenommen werden.

Das Ausmessen der im Durchmesser etwa 10 mm großen Präzipitat­ ringe erfolgt für gewöhnlich unter Vergrößerungsgeräten durch Fachpersonal. Dabei wird in der Regel mit einer Meßlupe jede Probe einzeln ausgemessen und deren Meßwert und Position no­ tiert.

In der DE 31 19 269 A1 ist auch schon anstelle einer Meßlupe die Verwendung eines umgebauten Mikrofilm-Lesegerätes zum Aus­ messen erwähnt worden.

Ähnlich arbeitet ein Gerät nach der US 4 021 200, in das eine scheibenförmige Gelplatte mit kreisförmig angeordneten Proben eingelegt wird. Die beleuchtbare Platte kann durch einen durch­ sichtigen Deckel betrachtet werden. Mit einem motorisch ver­ stellbaren Fadenkreuzpaar werden nacheinander die Durchmesser der Präzipitatringe visuell eingegrenzt und die Ergebnisse der Messung digital angezeigt. Die Meßwerte werden notiert.

Das Ausmessen wird jeweils erschwert durch eine relativ schlechte Bildqualität. So sind die Ringe kontrastarm und be­ sitzen verschwommene sowie unregelmäßige, zusammenhanglose Kon­ turen. Mitunter bilden sich auch regelrechte Ausläufer, wodurch es zu deutlichen Abweichungen von der idealen Kreisform kommt. Deshalb führt die Auswertung zu stark subjektiv gefärbten Er­ gebnissen. Hinzu kommen die üblichen Fehlerquellen visueller Meßtätigkeit, also Ablese- und Notationsfehler. Nicht verschwie­ gen werden darf letztlich die starke Belastung der Augen bei permanenter Durchführung dieser Arbeiten.

Zur weiteren Auswertung müssen die notierten Meßwerte über eine Tastatur einem Rechner eingegeben werden, was wiederum Ablese- und Eingabefehler in sich birgt.

Alles in allem sind die bekannten Methoden nicht sehr genau, ergonomisch belastend, zeitaufwendig und personalbindend (GIT Labormedizin 7-8/90, S. 362).

An sich liegt es nahe, die Messung und Auswertung mittels elek­ tronischer Bildverarbeitungsverfahren zu automatisieren, zumal Verfahren zur photogrammetrischen Erfassung statischer Aufnah­ meobjekte mittels opto-elektronischer Festkörper-Flächensenso­ ren seit einiger Zeit bekannt sind. Bei einem solchen Verfahren (DE 38 11 837 A1) wird das Aufnahmeobjekt in geometrischen Be­ zug zu einem Raster gesetzt und beide digital abgespeichert. Ein kontrastreicher Randbereich des körperlich ausgedehnten Ob­ jekts wird durch entsprechende unterschiedlich fokussierte Teilbilder angestrebt.

Ein solches Verfahren läßt sich zur Messung der einfachen ra­ dialen Immundiffusion aber nicht anwenden.

Zum einen würde eine unterschiedliche Fokussierung nicht zur Bestim­ mung der unscharfen Zonengrenzen führen. Zum anderen wür­ den Ausläufer oder Ausfransungen nicht unterdrückt werden. Zu bedenken sind weiterhin Störquellen, die durch Kratzer, Staub- und Schmutzpartikel, Beschriftungen oder Schlieren im Gel oder in der Probenplatte gebildet werden und im praktischen Betrieb unausbleiblich sind.

Nach der DE 40 13 180 A1 wird eine Testflüssigkeit zum Nachweis von Hämolyse dahingehend bildverarbeitend untersucht, ob durch die Testflüssigkeit hindurch ein auf eine Mikroplatte aufgemaltes Bild (Dreieck) anhand seiner Randschärfe erkannt wird oder durch Partikel in der Testflüssigkeit bezüglich eines Schwellenwertes unscharf und damit nicht relevant wird. Ein Ausmessen eines größenvariablen, gestörten Objekts erfolgt nicht.

Auch ein Verfahren, basierend auf einer Konturenverfolgung mit­ tels Differenzieren der Bildinformationen nach der DE 40 40 726 A1 muß aufgrund der genannten Störungsvielfalt ausscheiden, da es zu völlig falschen bzw. nicht auszuwertenden Ergebnissen führen würde. Indem das Variationsverhältnis der Lichtintensi­ tät an den Grenzen des vorhandenen Musters gemessen wird, wür­ den, gleichgültig, ob das Muster zu dem zu bestimmenden Objekt gehört oder zu Störungen, unvermeidlich Objektmißbildungen und Störobjekte in die Konturenbildung einbezogen werden.

Nach der US 4 794 450 ist eine Hochgeschwindigkeitsapparatur zum bildverarbeitenden Erkennen von Agglutinationsmustern für diagnostische Untersuchungen bekannt. Mehrere Hundert Proben werden analysiert, je nach Befund unterschiedlich gekennzeich­ net ausgeplottet und das gewonnene Bild ausgewertet. Die Unter­ scheidung verschiedener Muster in störungsarmer Umgebung ist jedoch nicht Gegenstand dieser Patentschrift.

Die erste mit der vorliegenden Erfindung zu überwindende Schwierigkeit ist die, daß bei den in Betracht kommenden Gelplatten die einzelnen mit der Hand in die Platte eingebrachten Stanzlöcher zwar einen ausreichend exak­ ten Durchmesser besitzen, aber ihre Lage pro Lochfeld nicht ge­ nau genug positioniert werden kann. Es kann zwar sichergestellt werden, daß je Lochfeld nur ein Stanzloch eingebracht ist, aber dieses kann sich an verschiedenen Orten innerhalb dieses Feldes befinden. Dieser Ort muß erst durch die Bildverarbeitung gefunden werden.

Als weitere Schwierigkeit kommen Störobjekte, wie Beschriftun­ gen, Kratzer, Schlieren, Fingerabdrücke, Fremdpartikel und Ris­ se im Gel hinzu. Sie lassen sich auch bei äußerster Behutsam­ keit nicht zuverlässig vermeiden.

Drittens bilden die Bildpunkte, die zu der Probe gehören, nur im Idealfall einen konzentrischen, geschlossenen Ring um das Stanzloch im Gel. Wie die Praxis zeigt, sind von dieser Ideal­ ausbreitung mannigfache Abweichungen eher die Regel. Die Kreise sind somit nicht immer konzentrisch. Sie sind auch oft nicht ge­ schlossen, sondern lediglich halbkreisartig. Die Kreisperiphe­ rie kann auch so aussehen, daß kleine, nicht zusammenhängende Teilkreisbögen vorhanden sind. Weiterhin treten Ausbeulungen auf, also Deformierungen der idealen Kreisform oder gar Aus­ buchtungen, also kleine Fortsetzungen, die am Kreisrand hängen. Zusätzlich sind die Kreise von unterschiedlicher Qualität, sie sind mehr oder weniger verschwommen, kontrastarm und von Stör­ quellen überlagert.

Alle diese den verschiedensten Umständen geschuldeten Abwei­ chungen vom Idealfall verursachen ein dermaßen stark gestörtes Bild, so daß bisher eine radiale Immundiffusionsmessung mittels Bildverarbeitung unmöglich war.

Es ist somit die aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur vollautomatischen Auswertung von Blutserumproben nach dem einfachen radialen Immundiffu­ sionstest anzugeben, das weitestgehend unempfindlich gegen ei­ nen hohen Störbildanteil und unvollkommene Bildinformationen ist und unter Einbeziehung von Vergleichsproben eine zuverläs­ sige Aussage lie­ fert.

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1 gelöst. In diesem Verfahren wird, von einer bekannten idealen Geometrie des Meßobjekts, das Meßobjekt, das diese Geometrie nur teilweise sichtbar aufweist, aus Bildbestandteilen, die echten Objektteilen angehören und solchen ähnlicher Qualität, die auf Störobjekten beruhen, gefunden und rekonstruiert, um anschließend in bekannter Weise seine Fläche auszumessen.

Die erfindungsgemäßen Arbeitsschritte sind: Vereinzelung der Meßob­ jekte, Detektierung eines oder mehrerer Objektteile und Rekon­ struktion des Gesamtobjektes aus den erkennbaren mutmaßlichen Objektbegrenzungen und größenmäßiges Inbeziehungsetzen zu Stan­ dardobjekten. Diese Verfahrensschritte lassen erstmalig eine zuverlässige, automatische Auswertung nach dem Single-Radial-Immundiffusionstest möglich werden. Dadurch sind Ergebnisse beacht­ lich schneller und genauer als durch visuelle Auswertung und ohne ergonomische Belastungen für das Personal zu gewinnen.

In einen ersten Verfahrensschritt wird zunächst iterativ versucht, sich der Lage des in Form und Größe näherungsweise bekannten Stanzloches mit vorgebbarer Genauigkeit zu nähern, indem das Stanzloch mit einer kreisförmigen Maske als Referenzfläche in Größe (zur einmaligen Kalibrierung des Bildverarbeitungssystems) und Lage so zur Deckung gebracht wird, daß dessen mittlerer Grau­ wert ein Minimum ergibt.

Ist die genaue Lage eines Stanzlochs gefunden und damit eine Grobpositionierung bezüglich der Probe erreicht, erfolgen Ver­ suche, die um das Stanzloch erkannten Präzipitatteile, zu einem Kreis zu ergänzen. Jeder Bildpunkt wird nach einem bekannten Verfah­ ren in Lage und Intensität erfaßt. Die Bildpunkte stammen entweder von dem auszumessenden Präzipitatring oder von Störobjekten. Ein PC speichert alle Bildpunkte als Gesamtheit und ermittelt deren Schwerpunkt. Um diesen Schwerpunkt wird wiederum eine Maske in Kreisform gelegt und ständig wiederholend die Lage und Größe dieser Maske so lange verändert, bis eine optimale Deckung mit den Ringbestandteilen gefunden ist. Durch dieses Verfahren wer­ den praktisch nur Präzipitatteile verwertet, die der Probe zu­ zurechnen sind und von Störobjekten abgegrenzt. Ist auf diese Weise Lage und Größe der Probe bis zu einer vorgebbaren Genau­ igkeit ermittelt worden, kann der Kreisdurchmesser nach einem bekann­ ten Verfahren berechnet und ausgegeben werden. Er gibt Auskunft über die Antigenkonzentration der Probe.

Im Rahmen des Verfahrens wird die Größe eines Referenz-Stanzlochs zwecks Kalibrierung des Systems gemessen. Zum Finden des näch­ sten Stanzlochs im nächsten Lochfeld braucht dann nur die Lage der kalibrierten Maske in der X-Y Ebene geändert zu werden, da alle Stanzlöcher einen hinreichend genauen gleichen Durchmesser aufweisen.

Die Lage und Größe des Stanzlochs bzw. des Präzipitatringes wird durch iteratives Verändern der Lage und Größe der Maske gefunden, bis diese einen minimalen bzw. maximalen mittleren Grauwert bei größtmöglichem Maskendurchmesser erreicht.

Die Vorteile des Verfahrens bestehen insbesondere darin, daß die Proben frei von Subjektivität mit hinreichender Präzision ausgemessen und verglichen werden. Aufgrund des ge­ wählten Bildauswerteverfahrens werden die Proben trotz Unregel­ mäßigkeiten in deren Lage und Geometrie sowie in der Bildquali­ tät sicher erkannt und ausgemessen. Ergonomische Belastungen für das Personal entfallen ebenso wie eine zeitaufwendige und zu Fehlern neigende Bedienung und Auswertung.

Besonders bedienungsfreundlich ist die Verwendung eines hochauf­ lösenden Flachbett-Scanners als Bildaufnahmegerät.

Anstelle eines solchen Scanners kann auch eine schwarz/weiß-CCD-Kamera mit Macro-Zoom-Optik mit gutem Erfolg eingesetzt werden. Dabei läßt sich vorteilhafterweise zur Probenpositionierung ein han­ delsüblicher Plotter umrüsten, indem anstelle des Plotterstif­ tes ein einfacher Schieber eingespannt wird. Er steht ebenso wie die erfassende Kamera und der Personalcomputer nach Beendi­ gung der Probenmessungen für andere Aufgaben zur Verfügung. Die einzelnen Arbeitsschritte laufen programmgesteuert ab und ver­ langen keine speziellen Kenntnisse vom Fachpersonal.

Anhand eines Ausführungsbeispiels unter Verwendung einer CCD-Kamera und eines Plotters soll die Erfindung näher erläutert werden.

In der zugehörigen Zeichnung zeigen:

Fig. 1 ein Programmflußbild zum Verfahrensablauf;

Fig. 2 den schematischen Aufbau der Meßeinrichtungen zur Durchfüh­ rung des Verfahrens;

Fig. 3 einen Schieber im Austausch zu einem üblichen Plotter­ stift;

Fig. 4 eine Draufsicht auf eine Probenplatte; und

Fig. 5 ein Programmflußbild, die Probenausmessung veranschauli­ chend.

Die automatisierten Arbeitsschritte zum Auswerten einer Serum­ probe nach der Single-Radial-Immundiffusionsmethode zeigt Fig. 1. Zuerst legt der Bediener eine Platte 1, wie sie in Fig. 4 dargestellt ist, natür­ lich ohne Probennumerierung, auf eine definierte Stelle des Tableaus eines Plotters 2 mit dem Gel nach unten auf. Auf der Platte 1 sind Stanzlöcher 3, um die sich die Proben 3′ ausbrei­ ten, so eingebracht, daß sie in ein gedachtes Raster fallen und zwar exakt ein Stanzloch 3 je Raster- bzw. Lochfeld. Danach positioniert ein an Stelle eines Plotterstiftes eingesetzter Schieber 4 vgl. (Fig. 3) die Platte 1 so, daß sich eine erste Probe 3′ unter einer fest­ stehenden Kamera 5 befindet. Die Kamera 5, eine Schwarz-Weiß- CCD-Kamera, kann erforderlichenfalls an ihrem Stativ 6 unter Kontrolle am Monitor so justiert werden, daß die Probe 3′ mit­ tig und scharf erscheint, womit gleichzeitig alle Lochfelder der Platte 1 bezüglich des Plottertableaus positioniert sind. Zusätzlich erfolgt eine Feineinstellung der Beleuchtungskörper. Alle weiteren Arbeitsschritte erfolgen, durch einen Personal­ computer 7 gesteuert, vollautomatisch.

Sobald das Bild der ersten Probe 3′ im Personalcomputer 7 ge­ speichert ist, beginnt der Plotter 2 mit der Positionierung auf die nächste Probe 3′ durch Verschieben der Platte 1 unter der Kamera 5 zu dem entsprechenden Lochfeld. Dazu beaufschlagt der anstelle des Plotterstiftes eingespannte Schieber 4 jeweils seitenmittig die Probenplattenkanten. Der Schieber 4 (Fig. 3) hat im Einspannbereich die gleiche Geometrie wie die zum Plot­ ter 2 passenden Plotterstifte, lediglich eine eingefräste Nut 8 verhindert ein Verdrehen des Schaftes. Der Schieber 4 ist quaderförmig, seine Seitenkanten betragen im Ausführungsbei­ spiel 15 mm Länge. Über eine Madenschraube 9 ist er in der Höhe 50 verstellbar, daß er das Plottertableau gerade noch nicht be­ rührt.

Das von der CCD-Kamera gelieferte Videosignal der ersten Probe wird im Steuer­ rechner mittels einer Frame-Grabber-Karte digitalisiert und als Grauwert-Matrix in einem Grafikdateiformat auf der Festplatte gespeichert, im Anschluß auf eine definierte mittlere Hellig­ keit umgerechnet, mittels Tiefpaß werden unwesentliche Details ausgefiltert und es wird eine Kontrastverstärkung vorgenommen.

Dabei wird die Tatsache genutzt, daß sich der dunkle Prä­ zipitathof der Probe 3′, der kreisförmig mit variablem Durch­ messer erscheint (Fig. 4), sich um ein helleres Stanzloch 3 mit konstantem Durchmesser befindet.

Wie in Fig. 5 schematisiert dargestellt, sucht nun die Bildver­ arbeitungssoftware das hell erscheinende Stanzloch 3 in der Mitte des Bildfeldes als Suchmerkmal, indem es eine kreisförmi­ ge Maske so auf dem Bildfeld verschiebt, daß dessen mittlere Grauwerte ein Minimum ergeben. Iterativ werden die Schwerpunkt­ lage in der X-Y-Ebene und die Größe der Maske verändert, bis der mittlere Grauwert bei größtmöglichem Radius sein Minimum erreicht hat. Da der wahre Durchmesser des Stanzlochs 3 hinrei­ chend genau bekannt ist, kann der Rechner damit den Maßstab des Bildes errechnen und das Bildverarbeitungssystem kalibrieren.

Der Durchmesser des zugehörigen Präzipitatringes der Probe 3′ wird ermittelt, indem der mittlere Grauwert der kreisringarti­ gen Fläche zwischen dem Stanzloch 3 und einem zum Stanzloch 3 konzentrischen, größeren Kreis errechnet wird. Der Durchmesser der Maske wird so lange verändert, bis der mittlere Grauwert ein Maximum bei größtmöglichem Durchmesser aufweist. Da der Präzipitathof nicht immer konzentrisch zum Stanzloch 3 liegt, kann sich der Mittelpunkt des Kreises ebenfalls geringfügig verschieben. Iterativ werden Durchmesser und Schwerpunktlage der Maske verändert, bis der mittlere Grauwert bei größtmögli­ chem Radius sein Maximum erreicht ist. Der Maskendurchmesser stellt somit den Meßwert dar.

Der Rechner nimmt das nächste Bild der zweiten Probe auf, worauf der Plotter 2 mit der Positionierung eines weiteren Lochfeldes der dritten Probe unter der Kamera 5 beginnt.

Das nunmehr in der Größe bekannte Stanzloch 3 wird bei der Bildverarbeitung in der oben beschriebenen Art und Weise nunmehr für die zweite Probe gefunden und analog der Durchmesser des Präzipitathofs der zweiten Probe 3′ ermittelt. Wenn nach­ einander alle weiteren Proben 3′ ausgemessen worden sind, werden die Er­ gebnisse durch ein auf statistischen Rechenverfahren basieren­ des Auswerteprogramm verarbeitet und die quantitativen Merkmale des Präparats ermittelt und in Form eines Meßprotokolls ausge­ geben.

Anstelle einer CCD-Kamera eignet sich auch sehr gut ein hochauflösender Scanner zur Bildaufnahme. Die Platte 1 wird mittels eines geeigneten Rahmens definiert zum Scanner positio­ niert. Der Scanner erfaßt jedes einzelne Lochfeld, worauf die Auswertung mit den gleichen Arbeitsschritten erfolgt. Durch die Verwendung eines Scanners vereinfacht sich nicht nur der appa­ rative Aufwand, sondern auch die die manuelle Justierarbeit beim Aufbau des Meßplatzes.

Claims (8)

1. Verfahren zur Untersuchung von antigenhaltigen Blutserumpro­ ben, die zum Vergleich mit antigenhaltigen Standardproben in Stanzlöcher einer antikörperhaltigen Gelplatte eingebracht wur­ den, wobei und durch einfache radiale Immundiffusion (RID) um jedes Stanzloch ein Präzipitatring entstanden ist, wobei Lochfeld für Lochfeld der Platte (1) optoelektronisch abgetastet, als Grau­ stufen-Rasterbild abgelegt und wie folgt bildverarbeitend aus­ gewertet wird:

• a) Lagebestimmung jedes Stanzlochs (3) im jeweiligen Lochfeld durch iterati­ ves Verschieben einer softwaremäßig gebildeten Maske in der X-Y- Ebene, sowie mindestens einmalig Größenbestimmung eines Referenz-Stanzlochs (3) durch zusätzliche Größenänderung der Maske, bis zur größtmöglichen Deckung mit dem Referenz-Stanzloch (3);
• b) Größenbestimmung des Präzipitatrings (3′) durch iterative Größen- und Lageänderung der Maske um jedes gefundene Stanzloch (3) und den das Stanzloch (3) umgebenden Präzipitatring (3′) bis zur größtmöglichen Deckung mit dem Präzipitatring (3′), wobei eine Kalibrierung des Abbildungsmaßstabs mit Hilfe der bekannten Größe des vermessenen Referenz-Stanzloches (3) erfolgt und wobei die Größe der Präzipitatringe (3′) der zu untersuchenden Blutserumproben mit der Größe der Präzipitatringe (3′) der Standardproben ver­ glichen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch iteratives Verändern der Lage und Größe der Maske bezüglich eines hell er­ scheinenden Stanzlochs (3) und des ihn umgebenden Präzipitat­ rings (3′), bis der maskierte Bildausschnitt einen maximalen mittleren Grauwert bei größtmöglicher Fläche besitzt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei meh­ rere Referenz-Stanzlöcher (3) zur Kalibrierung des Systems abgetastet, abgelegt und ausgewertet werden, wobei die betreffenden Referenz-Stanzlöcher (3) nach dem Zufallsprinzip ausgewählt werden.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei ein Flachbett-Scanner als elektronisches Bildaufnahme­ gerät verwendet wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei eine schwarz/weiß-CCD-Kamera (5) mit Macro-Zoom-Optik als elektronisches Bildaufnahmegerät verwendet wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei nach jeder Lochfeldaufnahme die Platte (1) um jeweils ein weite­ res Lochfeld bezüglich der CCD-Kamera (5) verschoben wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei ein Plotter (2) mit einem anstelle des Plotter­ stiftes eingespannten quaderförmigen Schieber (4) zur Positio­ nierung der Platte (1) verwendet wird.

8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei ein PC als Steuerrechner, Bildverarbeitungsgerät und zur statistischen Auswertung der Meßergebnisse verwendet wird.