DE4301693A1 - Amplification methods and methods for the detection of solid phase polynucleotide sequences - Google Patents
Amplification methods and methods for the detection of solid phase polynucleotide sequencesInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Amplifikation einer Nucleinsäure- bzw. Polynucleotidsequenz und insbesondere ein Verfahren zum Nachweis einer Nucleinsäure- bzw. Polynucleotid sequenz an fester Phase, bei dem das Verfahren zur Amplifika tion der Nucleinsäure- bzw. Polynucleotidsequenz verwendet wird.The invention relates to a method for amplifying a Nucleic acid or polynucleotide sequence and in particular a Method for the detection of a nucleic acid or polynucleotide sequence on solid phase in which the method for amplification tion of the nucleic acid or polynucleotide sequence used becomes.
In der Vergangenheit sind zahlreiche Verfahren entwickelt wor den, um eine spezifische Nucleinsäure- bzw. Polynucleotidse quenz künstlich bzw. in-vitro zu amplifizieren. Als erstes und inzwischen weitverbreitetes Verfahren zur Amplifikation einer Polynucleotidsequenz in-vitro wurde die Polymerase-Kettenreak tion (engl. "polymerase chain reaction", im folgenden abge kürzt durch PCR), entwickelt, die beschrieben ist US-A 4 683 202 und US-A 4 683 195. Bei der PCR wird eine definierte DNA- Sequenz mittels zweier flankierender Polynucleotid-Primer, die jeweils so an einen terminalen Sequenzbereich der komplementä ren DNA-Stränge der definierten DNA-Sequenz binden, daß die 3′-Enden der Primer zueinandergerichtet sind, und auf diese Weise eine gegenläufige DNA-Polymerase-abhängige Synthese neue komplementärer DNA-Stränge ablaufen, um über einen häufig wie derholten Reaktionszyklus, der die Schritte DNA-Denaturierung, Primer-Bindung ("annealing") und Polymerisation umfaßt, die definierte DNA-Sequenz exponentiell zu amplifizieren. Auf diese Weise können Polynucleotidsequenzen bis zu einer Länge von etwa 6000 Basen (bei einzelsträngig vorliegenden Nuclein säuren) oder Basenpaaren (bei doppelsträngig vorliegenden Nucleinsäuren), amplifiziert werden, wobei auch von einer ein zigen oder wenigen Kopien der Nucleinsäure ausgegangen werden kann. Da ein RNA-Molekül durch die Reverse Transcriptase-Reak tion in ein DNA-Molekül umgewandelt werden kann, kann die Nucleinsäureprobe für die PCR ursprünglich auch als RNA vor liegen. Numerous processes have been developed in the past to a specific nucleic acid or polynucleotide to amplify the sequence artificially or in vitro. First and now widely used method for the amplification of a Polynucleotide sequence in vitro was the polymerase chain craze tion (Engl. "polymerase chain reaction", abge abbreviated by PCR), which is described in US Pat. No. 4,683,202 and US-A 4 683 195. In the PCR, a defined DNA Sequence using two flanking polynucleotide primers, the each so at a terminal sequence region of the complementary ren DNA strands of the defined DNA sequence bind that the 3'-ends of the primers are directed towards each other, and on this New, contradicting DNA polymerase-dependent synthesis complementary strands of DNA expire to over a frequently like the repeated reaction cycle that includes the steps of DNA denaturation, Primer binding ("annealing") and polymerization to amplify the defined DNA sequence exponentially. On this way polynucleotide sequences can be up to a length of about 6000 bases (with single-stranded nuclein acids) or base pairs (in the case of double - stranded Nucleic acids), are amplified, also from a tens or a few copies of the nucleic acid can be assumed can. Since an RNA molecule through the reverse transcriptase react tion can be converted into a DNA molecule, the Nucleic acid sample for PCR originally also available as RNA lie.
Neben der PCR haben sich noch andere Verfahren zur Amplifika tion von Nucleinsäure- bzw. Polynucleotidsequenzen herausge bildet, wie das auf Transkription basierende Amplifikationssy stem (abgekürzt TAS, siehe D.Y. Kwo et al., Proceedings of the National Academy of Sciences USA 86, Seiten 1173 bis 1177 (1989)), das nach retroviralem Replikationsmuster ablaufende "Sequenz-Replikationssystem" (abgekürzt 3SR, siehe JP.C. Gua telli et al., Proceedings of the National Academy of Sciences USA 87, Seiten 1874 bis 1878 (1990)) und das Q-beta Replicase- System (siehe F.R. Kramer und P.M. Lizadi, Nature 339, Seiten 401 bis 402 (1989)).In addition to PCR, there are other methods of amplification tion of nucleic acid or polynucleotide sequences forms, like the transcription-based amplification system stem (abbreviated TAS, see D.Y. Kwo et al., Proceedings of the National Academy of Sciences USA 86, pages 1173 to 1177 (1989)), the one that follows the retroviral replication pattern "Sequence Replication System" (abbreviated 3SR, see JP.C. Gua telli et al., Proceedings of the National Academy of Sciences USA 87, pages 1874 to 1878 (1990)) and the Q-beta replicase System (see F.R. Kramer and P.M. Lizadi, Nature 339, pages 401-402 (1989)).
Die Reaktionen dieser bekannten Amplifikationsverfahren finden üblicherweise in flüssigem Medium statt. Dies hat den Nach teil, daß für die Verfügbarkeit der amplifizierten Polynucleo tidsequenz für weitere Anwendungen das Amplifikationsprodukt durch aufwendige Verfahrensschritte, z. B. durch chromatogra phische Verfahren oder durch elektrophoretische Trennverfah ren, gewonnen und ggf. gereinigt werden muß.Find the reactions of these known amplification methods usually in a liquid medium. This has the aftermath part that for the availability of the amplified polynucleo tidsequenz the amplification product for further applications through complex process steps, e.g. B. by chromatogra phic processes or by electrophoretic separation Ren, won and cleaned if necessary.
Für viele Anwendungsbereiche, in denen eine Amplifikation einer definierten Polynucleotidsequenz gewünscht oder erfor derlich ist, insbesondere zum Nachweis einer spezifischen Po lynucleotidsequenz, besteht das Bedürfnis, ein Verfahren, wel ches die Amplifikation einer Polynucleotidsequenz umfaßt, we sentlich zu vereinfachen.For many areas of application where amplification a defined polynucleotide sequence desired or explored is necessary, especially for the detection of a specific Po lynucleotide sequence, there is a need for a method which ches comprises the amplification of a polynucleotide sequence, we to simplify considerably.
Es ist daher Aufgabe vorliegender Erfindung, ein Verfahren zur Amplifikation einer Polynucleotidsequenz zur Verfügung zu stellen, bei dem die amplifizierte Polynucleotidsequenz ohne weitere Schritte aus dem Ansatz zur Amplifikation gewonnen werden kann und die so gewonnene, amplifizierte Polynucleotid sequenz leicht weiteren Anwendungen, insbesondere einer Nach weisbestimmung, zugänglich ist. It is therefore an object of the present invention to provide a method for Amplification of a polynucleotide sequence is also available in which the amplified polynucleotide sequence without further steps gained from the approach to amplification and the amplified polynucleotide thus obtained sequence easily other applications, especially one after determination of wisdom, is accessible.
Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daß die Polynucleotidsequenz in Gegenwart eines Kunststoff-Trägers amplifiziert wird, wobei mindestens ein Teil der mit der Polynucleotidsequenz in Kon takt tretenden Oberfläche des Kunststoff-Trägers aktiviert wurde durch Erhöhung des Oberflächeninhalts, so daß die ampli fizierten Polynucleotide an die aktivierte Oberfläche des Kunststoff-Trägers gebunden werden.The object is achieved in that the polynucleotide sequence is amplified in the presence of a plastic support, wherein at least a part of the with the polynucleotide sequence in Kon clock-stepping surface of the plastic carrier activated was by increasing the surface area so that the ampli infected polynucleotides on the activated surface of the Plastic carrier are bound.
Ein weiterer Gegenstand vorliegender Erfindung besteht in einem Verfahren zum Nachweis einer Polynucleotidsequenz an fe ster Phase, bei dem die Polynucleotidsequenz nach dem oben ge nannten Verfahren amplifiziert und an den Kunststoff-Träger als feste Phase gebunden wird, und die amplifizierte Poly nucleotidsequenz anschließend bestimmt wird.Another object of the present invention is in a method for the detection of a polynucleotide sequence on fe ster phase in which the polynucleotide sequence according to the above ge called procedures amplified and attached to the plastic carrier is bound as a solid phase, and the amplified poly nucleotide sequence is then determined.
Vorteilhafte Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung sind in den Unteransprüchen gekennzeichnet.Advantageous embodiments of the present invention are shown in marked the subclaims.
Die Erfindung wird im folgenden näher erläutert.The invention is explained in more detail below.
Fig. 1 zeigt eine Vorrichtung, mit der das erfindungsgemäße Verfahren zur Amplifikation und das Verfahren zum Nachweis einer Polynucleotidsequenz vorzugsweise ausgeführt wird. Fig. 1 shows an apparatus with which the method according to the invention for the amplification and the process is preferably carried out for detection of a polynucleotide sequence.
Fig. 1A stellt eine schematische Draufsicht, und Fig. 1B stellt einen schematischen Querschnitt entlang der Linie 2-2 aus Fig. 1A der Vorrichtung dar. FIG. 1A shows a schematic top view and FIG. 1B shows a schematic cross section along the line 2-2 from FIG. 1A of the device.
Zur Amplifikation einer Nucleinsäure- bzw. Polynucleotidse quenz kann irgendeine Technik verwendet werden, bei der die Polynucleotidsequenz vervielfältigt bzw. reproduziert wird. Geeignet sind beispielsweise die Amplifikationssysteme TAS, 3SR und das Q-beta Replikase-System, insbesondere jedoch die PCR, wie sie oben genannt sind und mit Quellennachweis angege ben wurden.Any technique can be used to amplify a nucleic acid or polynucleotide sequence in which the polynucleotide sequence is reproduced. For example, the amplification systems TAS, 3 SR and the Q-beta replicase system are suitable, in particular, however, the PCR, as mentioned above and with evidence of source.
In den Amplifikationsreaktionen, welche Schritte unter Bedingungen erhöhter Temperatur durchlaufen, werden vorzugs weise thermostabile Reaktionskomponenten verwendet, wie zum Beispiel thermostabile DNA-Polymerasen für die PCR, die im Stand der Technik hinreichend bekannt sind. Geeignet sind bei spielsweise die thermostabilen DNA-Polymerasen aus Thermus aquaticus, Thermus flavis oder Thermococcus litoralis. Die für die Amplifikationsreaktionen erforderlichen Enzyme müssen nicht von Enzymisolierungen stammen, sondern können auch klo nierten Ursprungs sein.In the amplification reactions, what steps below High temperature conditions are preferred as thermostable reaction components used, such as Example thermostable DNA polymerases for PCR, which in State of the art are well known. Are suitable for for example the thermostable DNA polymerases from Thermus aquaticus, Thermus flavis or Thermococcus litoralis. The for the enzymes required for the amplification reactions do not come from enzyme isolations, but can also be loo be of origin.
Einen Überblick über neuere Entwicklungen und die Reaktionsbe dingungen für die PCR werden z. B. gegeben in: H.A. Erlich, R. Gibbs und H.H. Kazazian: "Polymerase Chain Reaction", in "Current Communications in Molecular Biology", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988), sowie in: T. Maniatis et al., "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988).An overview of recent developments and the response conditions for the PCR are e.g. B. given in: H.A. Erlich, R. Gibbs and H.H. Kazazian: "Polymerase Chain Reaction", in "Current Communications in Molecular Biology," Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988), as well as in: T. Maniatis et al., "Molecular Cloning. A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988).
Es können jegliche Arten von Nucleinsäure- bzw. Polynucleotid sequenzen gemäß Erfindung amplifiziert werden, wie doppel strängige und einzelsträngige DNA und RNA. Die zu amplifizie rende Polynucleotidsequenz kann selbst Teil einer längeren Po lynucleotidsequenz sein, beispielsweise Teil eines Gens, einer regulatorischen Sequenz, einer viralen oder bakteriellen DNA- oder RNA-Sequenz, einer Boten-RNA (m-RNA) oder eines Plasmids.Any kind of nucleic acid or polynucleotide can be used sequences are amplified according to the invention, such as double stranded and single-stranded DNA and RNA. The one to amplify The resulting polynucleotide sequence can itself be part of a longer Po lynucleotide sequence, for example part of a gene, one regulatory sequence, a viral or bacterial DNA or RNA sequence, a messenger RNA (m-RNA) or a plasmid.
Der Reaktionsansatz zur Amplifikation einer gewünschten Poly nucleotidsequenz wird in einem wäßrigen Medium, welches die für die entsprechende Amplifikationsreaktion erforderlichen Zusätze enthält, mit einem Kunststoff-Träger in Kontakt ge bracht, wobei mindestens ein Teil der mit dem Amplifikations ansatz in Kontakt tretenden Oberfläche des Kunststoff-Trägers in aktiviertem Zustand vorliegt.The reaction approach for the amplification of a desired poly nucleotide sequence is in an aqueous medium which the required for the corresponding amplification reaction Contains additives, in contact with a plastic carrier brings, with at least part of that with the amplification approach contacting surface of the plastic carrier is in the activated state.
Aktivierung bedeutet, daß der Oberflächeninhalt im aktivierten Oberflächenbereich des Kunststoff-Trägers erhöht worden ist, oder mit anderen Worten, daß die tatsächliche Oberfläche bzw. Ist-Oberfläche gegenüber der die Mantelfläche (die Einhüllende des Oberflächenprofils) des Kunststoff-Trägers vergrößert wurde. Die Aktivierung kann durch mechanische oder chemische Mittel bewirkt werden. Ausführliche Erläuterungen zu der Art des zu verwendenden Kunststoff-Trägers sowie zu dessen Akti vierung werden in den anhängigen PCT-Anmeldungen PCT/EP 92/02256 (Anmeldetag: 8. Oktober 1992) und PCT/EP 92/02432 (Anmeldetag: 23. Oktober 1992) gegeben, deren Beschreibungen als Teil der Offenbarung vorliegender Anmeldung gelten.Activation means that the surface content in the activated Surface area of the plastic carrier has been increased or in other words that the actual surface or Actual surface opposite the outer surface (the envelope of the surface profile) of the plastic carrier is enlarged has been. Activation can be by mechanical or chemical Means are effected. Detailed explanations on Art of the plastic carrier to be used and its acti are pending in the pending PCT applications PCT / EP 92/02256 (filing date: October 8, 1992) and PCT / EP 92/02432 (Filing date: October 23, 1992) given their descriptions are considered part of the disclosure of this application.
Vorzugsweise wird in dem erfindungsgemäßen Verfahren für den Kunststoff-Träger ein Material verwendet, das eine Matrix aus Copolymer oder Polymerblend aufweist. Dieses Material kann nämlich leicht durch chemische Mittel aktiviert werden, wie nachstehend erläutert wird. Das Material kann ggf. noch wei tere übliche Zusätze enthalten, wie Farbstoffe, Pro zessierhilfsmittel, Stabilisatoren, Vernetzungsmittel, Weich macher, Füllstoffe und dergleichen. Als Copolymere oder Poly merblends können solche verwendet werden, die in den oben ge nannten PCT-Anmeldungen Nr. 92/02256 und Nr. 92/02432 genannt sind, insbesondere Copolymere von Styrol und Butadien oder Styrol und Chloropren oder Polymerblends von Polystyrol und Polybutadien oder Polystyrol und Polychloropren. Bei Aktivie rung durch chemische Mittel wurde der Kunststoff-Träger, der in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden soll, und zwar mindestens ein Teil des Oberflächenbereiches des Kunst stoff-Trägers, der mit dem Amplifikationsansatz in Kontakt kommen soll, in einen aktivierten Zustand versetzt, indem mindestens dieser Teil des Oberflächenbereiches des Kunst stoff-Trägers mit einem Lösungsmittel behandelt wurde, welches eine Polymerkomponente des Copolymers bzw. des Polymerblends leichter löst als die andere bzw. die anderen Polymehrkompo nente(n) des Copolymers bzw. Polymerblends. Zu diesem Zweck eignen sich beispielsweise Lösungsmittel wie Ether, z. B. Diethylether, Ester, Alkohole, Ketone, Aldehyde, Säuren, Ba sen, ungesättigte oder aliphatische (lineare, verzweigte oder zyklische) Kohlenwasserstoffe, aromatische Kohlenwasserstoffe, halogenierte Kohlenwasserstoffe und ähnliche Materialien, wel che das polymere Material teilweise lösen, so daß die Polymer matrix geöffnet wird. Im Resultat ist die mit dem Lösungsmit tel behandelte Oberfläche des Kunststoff-Trägers in ihrer tatsächlichen Oberflächen bzw. Ist-Oberfläche erhöht.Preferably in the method according to the invention for the Plastic carrier uses a material that is made of a matrix Has copolymer or polymer blend. This material can namely easily activated by chemical means, such as is explained below. The material may still be white tere usual additives contain, such as dyes, Pro cessation aids, stabilizers, crosslinking agents, soft makers, fillers and the like. As copolymers or poly Merblends can be used in the ge named PCT applications No. 92/02256 and No. 92/02432 are, in particular copolymers of styrene and butadiene or Styrene and chloroprene or polymer blends of polystyrene and Polybutadiene or polystyrene and polychloroprene. With activation The plastic carrier, the to be used in the method according to the invention, and at least part of the surface area of art carrier that is in contact with the amplification approach should come into an activated state by at least this part of the surface area of art was treated with a solvent which a polymer component of the copolymer or the polymer blend solves easier than the other or the other multi-polymer compo nente (s) of the copolymer or polymer blend. To this end are, for example, solvents such as ethers, e.g. B. Diethyl ether, esters, alcohols, ketones, aldehydes, acids, Ba sen, unsaturated or aliphatic (linear, branched or cyclic) hydrocarbons, aromatic hydrocarbons, halogenated hydrocarbons and similar materials, wel che partially dissolve the polymeric material so that the polymer matrix is opened. The result is that with the solution tel treated surface of the plastic carrier in their actual surface or actual surface increased.
Im Rahmen der Erfindung wurde nun überraschenderweise festge stellt, daß die zu amplifizierende Polynucleotidsequenz ebenso wie die Polynucleotide, die im Laufe des Amplifika tionsprozesses synthetisiert werden, an die aktivierte Ober fläche des Kunststoff-Trägers gebunden werden. Dies geschieht automatisch während der ablaufenden Amplifikationsreaktion, ohne daß ein zusätzlicher Schritt zur Bindung der gebildeten Polynucleotide an den Kunststoff-Träger erforderlich ist. Bin dungskapazität, -affinität und -stabilität der aktivierten Oberfläche des Kunststoff-Trägers gegenüber den Polynucleoti den sind so hoch, daß die während der Amplifikationsreaktion fortlaufend gebildeten Polynucleotide fest an dem aktivierten Kunststoff-Träger anhaften und nicht mehr von dessen Oberflä che abdiffundieren. Es wird angenommen, daß sich ein Gleichge wicht zwischen in der flüssigen Phase des wäßrigen Milieus be findlichen, niedermolekularen Komponenten des Amplifikations ansatzes und an der festen Phase des Kunststoff-Trägers gebun denen höhermolekularen Komponenten des Amplifikationsansatzes einstellt. D.h., die niedermolekularen Komponenten des Ampli fikationsansatzes, wie z. B. bei dem PCR-Ansatz verwendete Pri mer und Nucleotide, befinden sich im wesentlichen in der flüs sigen Phase, während die hochmolekularen Polynucleotide, die bei der Amplifikation gebildet werden, weitgehend an der fe sten Phase der aktivierten Trägeroberfläche gebunden vorlie gen.In the context of the invention has now surprisingly been festge represents that the polynucleotide sequence to be amplified as well like the polynucleotides that appear in the course of the amplification tion process are synthesized to the activated super surface of the plastic carrier are bound. this happens automatically during the amplification reaction, without an additional step to bind the formed Polynucleotides on the plastic carrier is required. I am capacity, affinity and stability of the activated Surface of the plastic carrier opposite the polynucleoti that are so high that during the amplification reaction continuously formed polynucleotides firmly on the activated Plastic carrier stick and no longer from its surface diffuse surface. It is believed that a match important between in the liquid phase of the aqueous environment sensitive, low molecular weight components of the amplification approach and on the solid phase of the plastic carrier those of higher molecular weight components of the amplification approach sets. That is, the low molecular weight components of the Ampli fiction approach, such as B. Pri used in the PCR approach Mer and nucleotides are mainly in the river phase while the high molecular weight polynucleotides that formed during amplification, largely at the fe most phase of the activated carrier surface is bound gene.
Damit eine effiziente Bindung der während der Amplifikation gebildeten Polynucleotide an die aktivierte Oberfläche des Kunststoff-Trägers stattfindet, sollte die Länge der zu ampli fizierenden Polynucleotidsequenz nicht zu kurz sein. Geeigneterweise weist sie eine Sequenzlänge von mindestens 100, bevorzugt mindestens 200 und weiter bevorzugt mindestens 500 Nucleotide bzw. Basenpaare auf.So that an efficient binding of the during amplification formed polynucleotides on the activated surface of the Plastic carrier takes place, the length of the ampli The resulting polynucleotide sequence should not be too short. It suitably has a sequence length of at least 100, preferably at least 200 and more preferably at least 500 nucleotides or base pairs.
Selbstverständlich können in dem erfindungsgemäßen Verfahren nicht nur eine, sondern auch mehrere verschiedene, spezifische Polynucleotidsequenzen in einem Ansatz amplifiziert und an den Kunststoff-Träger gebunden werden. Ferner ist es auch im Rah men der Erfindung möglich, daß in dem Verfahren zur Amplifika tion einer Polynucleotidsequenz mehrere Amplifikationsstufen durchgeführt werden, wobei nur die letzte Amplifikationsstufe in Gegenwart eines oberflächenaktivierten Kunststoff-Trägers durchgeführt wird, während die übrigen, vorangehenden Amplifi kationsstufen auf herkömmliche Weise in rein wäßrigem Medium erfolgen. Mehrstufige Amplifikationsverfahren sind dem Fach mann beispielsweise für die PCR bekannt.Of course, in the method according to the invention not just one, but also several different, specific ones Polynucleotide sequences amplified in one approach and attached to the Plastic straps are tied. It is also in the frame men of the invention possible that in the method for amplification tion of a polynucleotide sequence several amplification stages be carried out using only the last amplification stage in the presence of a surface-activated plastic carrier is performed while the remaining, previous amplifi cation stages in a conventional manner in a purely aqueous medium respectively. Multi-stage amplification methods are the subject known for example for PCR.
Weiter ist es möglich, bei einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Amplifikation einer Polynucleotidsequenz mittels der PCR- Reaktion, zuerst einen Primerüberschuß auf dem Träger zu immo bilisieren und die zu amplifizierende Polynucleotidsequenz an den Primer zu hybridisieren, und dann die PCR-Reaktion anzu schließen. In der nachfolgenden PCR-Reaktion bleibt das Reak tion- (Amplifikations-)Produkt am Träger verankert.It is also possible with a method according to the invention for the amplification of a polynucleotide sequence using the PCR Reaction, first immo a primer excess on the support bilize and the polynucleotide sequence to be amplified hybridize the primer, and then start the PCR reaction shut down. The reak remains in the subsequent PCR reaction tion- (amplification) product anchored to the carrier.
Je nach Wunsch kann der Kunststoff-Träger auf seiner gesamten Oberfläche oder nur in Oberflächenbereichen, die für den Kon takt mit dem Amplifikationsansatz vorgesehen sind, aktiviert worden sein. Es kann sogar erwünscht sein, daß lediglich ein kleinerer Teilbereich des Kunststoff-Trägers, der mit dem Amplifikationsansatz in Kontakt kommt, aktiviert wurde.Depending on your wishes, the plastic carrier can be used throughout Surface or only in surface areas that are suitable for the con are provided with the amplification approach activated have been. It may even be desirable that only one smaller section of the plastic carrier, which with the Amplification approach comes into contact, has been activated.
Der in dem erfindungsgemäßen Verfahren zu verwendende Kunst stoff-Träger wird geeigneterweise selbst das Gefäß sein, in dem die Amplifikationsreaktion abläuft. Ein solches Gefäß kann beispielsweise die Form eines Röhrchens, eines Mikrozentrifu genröhrchens oder einer Vertiefung einer Mikrotiterplatte ha ben. Eine Mikrotiterplatte hat den Vorteil, daß sie zahlreiche Vertiefungen aufweist (in der Regel 96) und somit viele Ampli fikationsansätze zur gleichzeitigen Durchführung des erfin dungsgemäßen Verfahrens aufnehmen kann.The art to be used in the method according to the invention suitably the carrier itself will be the vessel in which the amplification reaction takes place. Such a vessel can for example the shape of a tube, a microcentrifuge tube or a well of a microtiter plate ha ben. A microtiter plate has the advantage that it has numerous Has depressions (usually 96) and thus many ampli fiction approaches for the simultaneous implementation of the invent can process according to the invention.
Die Fig. 1 zeigt eine Vorrichtung, die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Amplifikationsverfahrens besonders gut ge eignet ist. Die Mikro(-titer-)vorrichtung umfaßt als Bestand teile eine Mikro(-titer-)maske 101, eine Deckplatte 103 sowie eine Platte 104 des Kunststoff-Trägers, der als aktivierter Kunststoff-Träger zur Bindung der amplifizierten Polynucleotidsequenz eingesetzt wird. Die Mikro(-titer-)maske 101 weist eine Vielzahl zylindrischer Hohlräume 102 auf, wobei die Hohlräume 102 jeweils einzelne Amplifikationsansätze aufnehmen sollen. Damit die einzelnen Hohlräume besser gegeneinander abgedichtet sind, wird vorzugsweise zwischen der Kunststoff-Trägerplatte 104 und der Mikro(-titer-)maske 101 eine Dichtungsschicht 105 aus elastischem Kunststoffmaterial eingebracht, welche korrespondierend zu den einzelnen Hohlräumen 102 entsprechende Ausnehmungen (nicht dargestellt) aufweist, damit die Amplifikationsansätze mit der Kunststoff- Trägerplatte 104 in Kontakt treten. Die Kunststoff- Trägerplatte ist also mindestens in den Bereichen, die mit den zylindrischen Hohlräumen 102 in Verbindung stehen, aktiviert, kann jedoch auch auf der ganzen, der Mikro(-titer-)maske 101 zugewandten Oberflächenseite aktiviert sein. Die Deckplatte 103, die aus beliebigen Materialien bestehen kann, schließt die einzelnen Hohlräume 102 gegeneinander und nach außen hin ab. Die Abdichtung sollte insbesondere im Hinblick auf erhöhte Dampfdruckphasen in den einzelnen Gefäßen (Wells) 102 ausgestaltet werden, die auftreten, wenn Am plifikationsverfahren Hochtemperaturzyklen durchlaufen, wie z. B. bei der PCR. Zu diesem Zweck kann auch noch eine weitere Elastomer-Dichtungsschicht zwischen Mikro(-titer-)maske 101 und Deckplatte 103 eingebracht werden. Fig. 1 shows a device which is particularly well suited for carrying out the amplification method according to the invention. The micro (titer) device comprises, as components, a micro (titer) mask 101 , a cover plate 103 and a plate 104 of the plastic carrier, which is used as an activated plastic carrier for binding the amplified polynucleotide sequence. The micro (titer) mask 101 has a multiplicity of cylindrical cavities 102 , the cavities 102 each being intended to accommodate individual amplification approaches. So that the individual cavities are better sealed against one another, a sealing layer 105 made of elastic plastic material is preferably introduced between the plastic carrier plate 104 and the micro (titer) mask 101 , which has corresponding recesses (not shown) corresponding to the individual cavities 102 , so that the amplification approaches come into contact with the plastic carrier plate 104 . The plastic carrier plate is thus activated at least in the areas which are connected to the cylindrical cavities 102 , but can also be activated on the entire surface side facing the micro (titer) mask 101 . The cover plate 103 , which can be made of any materials, closes off the individual cavities 102 from one another and from the outside. The seal should be designed in particular with regard to increased vapor pressure phases in the individual vessels (wells) 102 , which occur when the plication process undergoes high-temperature cycles, such as. B. in PCR. For this purpose, a further elastomer sealing layer can also be introduced between the micro (titer) mask 101 and the cover plate 103 .
Zum Zusammenbau der einzelnen Bestandteile der Vorrichtung, wie sie in Fig. 1B zu sehen ist, können beliebige Befestigungseinrichtungen verwendet werden. Vorzugsweise dienen Nutverschlüsse 106, 107 zum Zusammenbau der Vorrichtung. Geeignet sind jedoch auch andere Befestigungs- oder Verschlußeinrichtungen, die dem Fachmann geläufig sind, z. B. Klammern, Spangen, Schraubverschlüsse oder dergleichen. Vorzugsweise wird durch die Befestigungs- oder Verschlußeinrichtung ein Druck zwischen der Deckplatte 103 und der Mikro(-titer-)maske 101 und/oder zwischen der Kunststoff- Trägerplatte 104 und der Mikro(-titer-)maske 101 angelegt, um die Abdichtung der einzelnen Hohlraum-Gefäßkammern 102 zu verbessern.Any fastening means can be used to assemble the individual components of the device, as can be seen in FIG. 1B. Groove closures 106 , 107 are preferably used to assemble the device. However, other fastening or closing devices which are known to the person skilled in the art are also suitable, for. B. clips, clips, screw caps or the like. A pressure is preferably applied by the fastening or closure device between the cover plate 103 and the micro (titer) mask 101 and / or between the plastic carrier plate 104 and the micro (titer) mask 101 in order to seal the individual To improve void chambers 102 .
Wie oben bereits erwähnt, kann dabei die Oberfläche des als Kunststoff-Träger verwendeten Reaktionsgefäßes vollständig oder teilweise aktiviert vorliegen, vorausgesetzt, daß minde stens ein Teil der mit der Polynucleotidsequenz im Amplifika tionsansatz in Kontakt tretenden Oberfläche der einzelnen Re aktionsgefäße aktiviert vorliegt. Es kann beispielsweise vor teilhaft sein, daß nur der Bodenbereich der den Amplifikati onsansatz auf nehmenden Vertiefung des jeweiligen Reaktionsge fäßes aktiviert wurde, während der übrige Bereich der mit dem Amplifikationsansatz in Kontakt tretenden Oberfläche sowie die restliche Oberfläche des Reaktionsgefäßes in nichtaktiviertem Zustand vorliegt, um so eine Konzentration der Bindung der während der Amplifikation gebildeten Polynucleotide auf einer kleineren Fläche zu erreichen.As already mentioned above, the surface of the as Plastic carrier used reaction vessel completely or partially activated, provided that min least part of that with the polynucleotide sequence in the amplifica approach approaching surface of each Re action vessels activated. For example, it can be partaking that only the bottom area of the amplification on approach to the deepening of the respective reaction gene barrel was activated, while the rest of the area with the Amplification approach contacting surface as well as the remaining surface of the reaction vessel in unactivated Condition, so as to concentrate the binding of the polynucleotides formed during amplification on a to reach a smaller area.
Der Kunststoff-Träger kann jedoch auch in anderen Formen als in Form des Reaktionsgefäßes selbst vorliegen. Insbesondere kann der Kunststoff-Träger in Form von Kügelchen ("beads"), Granulaten, Fasern, Scheibchen, Folien, Stäbchen und derglei chen mit dem die definierte Polynucleotidsequenz enthaltenden Amplifikationsansatz in Kontakt gebracht werden. Die Form des Kunststoff-Trägers und das Ausmaß der Aktivierung des Kunst stoff-Trägers (ganz oder nur bestimmte Teilbereiche davon) kann wie gewünscht oder je nach Anforderungen für den jeweili gen Anwendungszweck des erfindungsgemäßen Verfahrens oder der durch das erfindungsgemäße Verfahren gewonnenen Polynucleotide gewählt werden.However, the plastic carrier can also be in other forms exist in the form of the reaction vessel itself. Especially the plastic carrier can be in the form of beads, Granules, fibers, discs, foils, chopsticks and the like Chen with that containing the defined polynucleotide sequence Amplification approach are brought into contact. The shape of the Plastic carrier and the extent of activation of the art fabric carrier (whole or only certain sub-areas thereof) can be as desired or depending on the requirements for the respective gene application of the method according to the invention or polynucleotides obtained by the method according to the invention to get voted.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann in vielen Bereichen ange wandt werden. So kann beispielsweise mit dem erfindungsgemäßen Verfahren aus einer sehr geringen, d. h. nicht konventionell nachweisbaren Menge einer Polynucleotidsequenz eine merklich größere Menge der Polynucleotidsequenz hergestellt und auf einfache Weise gewonnen werden. Die durch das erfindungsgemäße Verfahren amplifizierte Polynucleotidsequenz, insbesondere eine durch die PCR amplifizierte DNA, ist weiterhin hervorra gend für Klonierungszwecke und andere gentechnologische Anwen dungen geeignet. Ein weiteres Anwendungsgebiet wird durch die Nucleinsäure-Sequenzanalyse der durch das erfindungsgemäße Verfahren amplifizierten Polynucleotidsequenz geboten.The method according to the invention can be used in many areas be turned. For example, with the invention Process from a very low, i.e. H. not conventional detectable amount of a polynucleotide sequence a noticeable larger amount of the polynucleotide sequence produced and on easily obtained. The through the invention Method amplified polynucleotide sequence, in particular a DNA amplified by the PCR is still outstanding suitable for cloning purposes and other genetic engineering applications suitable. Another area of application is the Nucleic acid sequence analysis of the by the invention Procedure amplified polynucleotide sequence offered.
Falls gewünscht und je nach Anforderungen an die Reinheit der mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens amplifizierten Poly nucleotidsequenz im Hinblick auf den jeweiligen Anwendungs zweck, d. h. je nach dem, ob die amplifizierte Polynucleotidse quenz im isolierten Zustand vorliegen muß oder nicht, können die durch das erfindungsgemäße Verfahren amplifizierten und hergestellten Polynucleotide auf dem Kunststoff-Träger ver bleiben, oder-die Polynucleotide können von dem Kunststoff- Träger in einem weiteren Verfahrensschritt entfernt werden. Zum Entfernen der Polynucleotide von dem Kunststoff-Träger kann die auf hydrophobe Wechselwirkung beruhende Bindung zwi schen den Polynucleotiden und dem Kunststoff-Träger durch ge eignete chemische Mittel, z. B. durch Lösungsmittel, aufgebro chen werden. Ggf. kann auch der Kunststoff-Träger durch pas sende Lösungsmittel vollständig gelöst werden. In beiden ge nannten Fällen liegen dann die synthetisierten Polynucleotide in flüssigem Medium vor, so daß diese dann durch dem Fachmann geläufige Reinigungsmethoden isoliert werden.If desired and depending on the purity requirements poly amplified by means of the method according to the invention nucleotide sequence with regard to the respective application purpose, d. H. depending on whether the amplified polynucleotide quenz must or may not be in the isolated state those amplified by the method according to the invention and ver produced polynucleotides on the plastic carrier or the polynucleotides can be removed from the plastic Carriers are removed in a further process step. To remove the polynucleotides from the plastic carrier can the bond between hydrophobic interaction between the polynucleotides and the plastic carrier by ge suitable chemical agents, e.g. B. by solvent will be. Possibly. the plastic carrier can also be replaced by pas transmitting solvents are completely dissolved. In both ge the synthesized polynucleotides then lie in the named cases in a liquid medium, so that this can then be carried out by the skilled person common cleaning methods are isolated.
Ein weiterer Gegenstand vorliegender Erfindung besteht in einem Verfahren zum Nachweis einer spezifischen Polynucleotid sequenz an fester Phase, bei dem die nachzuweisende Poly nucleotidsequenz nach dem oben beschriebenen Verfahren ampli fiziert und gleichzeitig an den Kunststoff-Träger als feste Phase gebunden wird und anschließend nachgewiesen bzw. be stimmt wird. Somit ist das oben beschriebene Verfahren zur Am plifikation einer Polynucleotidsequenz Bestandteil dieses Ver fahrens zum Nachweis der Polynucleotidsequenz, so daß die oben ausgeführten Erläuterungen auch für diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung gelten.Another object of the present invention is in a method for the detection of a specific polynucleotide Sequence on solid phase, in which the poly amplify nucleotide sequence according to the method described above fected and at the same time to the plastic carrier as a solid Phase is bound and then detected or be is true. Thus, the method described above for Am plification of a polynucleotide sequence part of this ver to detect the polynucleotide sequence so that the above explained explanations also for this embodiment of the present invention apply.
Für die Bestimmung der amplifizierten und an der festen Phase gebundenen Polynucleotidsequenz bieten sich zahlreiche Metho den an. Bei der Bestimmung erfolgt ein qualitativer oder quan titativer Nachweis der amplifizierten Polynucleotide.For the determination of the amplified and on the solid phase linked polynucleotide sequence offer numerous metho the one. In the determination there is a qualitative or quan quantitative detection of the amplified polynucleotides.
Für die grob-quantitative Bestimmung von amplifizierter DNA kann beispielsweise ein Fluoreszenznachweis mit DNA-spezifi schen Fluoreszenzfarbstoffen, wie z. B. Ethidiumbromid, DAPI oder den bis-Benzimidazol-Farbstoff 33258 Hoechst (s. V.W. Burns in Photochem. Photobiol. Rev. 5, Seiten 87 bis 103 (1980)), angewandt werden.For the rough-quantitative determination of amplified DNA For example, a fluorescence detection with DNA-specific rule fluorescent dyes such. B. Ethidium bromide, DAPI or the bis-benzimidazole dye 33258 Hoechst (see V.W. Burns in Photochem. Photobiol. Rev. 5, pages 87-103 (1980)).
Vorzugsweise wird jedoch das erfindungsgemäße Nachweisverfah ren so durchgeführt, daß die nachzuweisende Polynucleotidse quenz mittels der PCR amplifiziert wird, und zwar unter Ver wendung von entweder markierten Primern und/oder markierten Nucleotiden, mit dem Zweck, daß die Markierungen durch die je weiligen Bausteine (Primer und/oder Nucleotide) durch die PCR in die synthetisierten Polynucleotide eingebaut werden. Die somit eingebauten Markierungen können anschließend leicht be stimmt werden und sind eine Funktion für die Menge der gebil deten Polynucleotide. Mit Hilfe passender Standard-Vergleichs werten können somit quantitative Nachweisbestimmungen einer zu bestimmenden Polynucleotidsequenz auf einfache Weise durchge führt werden.However, the detection method according to the invention is preferred ren performed so that the polynucleotide to be detected is amplified by means of the PCR, namely under Ver using either labeled primers and / or labeled Nucleotides, with the purpose that the markings by the depending because of the building blocks (primers and / or nucleotides) by PCR are incorporated into the synthesized polynucleotides. The thus built-in markings can then be easily be true and are a function of the amount of Gebil detain polynucleotides. With the help of suitable standard comparison can thus evaluate quantitative evidence provisions determining polynucleotide sequence in a simple manner leads.
Entsprechend können auch andere Amplifikationsansätze als die PCR angewandt werden, um Markierungen über entsprechende, mar kierte Bausteine in die gebildeten Polynucleotide, einzubauen und somit einen einfachen Nachweis zu ermöglichen.Similarly, other amplification approaches than that PCR can be applied to mark over appropriate, mar cated building blocks in the polynucleotides formed and thus enable easy verification.
Durch die Verwendung des speziell aktivierten Kunststoff-Trä gers wird eine bisher nicht erreichte, hervorragende Trennung zwischen einerseits in die Polynucleotidsequenz eingebauten Markierungen und andererseits in den eingesetzten, niedermole kularen Bausteinen vorliegenden Markierungen bewirkt, indem die in die Polynucleotide eingebauten Markierungen fest an die aktivierte Oberfläche des Kunststoff-Trägers gebunden werden, während die niedermolekularen, markierten Bausteine im wesent lichen in der flüssigen Phase verbleiben. Eventuell schwach mit der festen Phase assoziierte, markierte niedermolekulare Bausteine können leicht im Anschluß an die Amplifikationsreak tion durch geeignete Waschschritte vollständig entfernt wer den, so daß sich ein spezifischer Nachweis der Polynucleotid sequenz mit hohem Signal : Rausch-Verhältnis ergibt.By using the specially activated plastic carrier It is an excellent separation that has not yet been achieved between built into the polynucleotide sequence Markings and on the other hand in the used, low mole markers present markers by the markings built into the polynucleotides firmly on the activated surface of the plastic carrier are bound, while the low molecular weight, labeled building blocks essentially lichen remain in the liquid phase. Possibly weak labeled low molecular weight associated with the solid phase Building blocks can easily follow the amplification freak tion completely removed by suitable washing steps the so that there is a specific detection of the polynucleotide sequence with high signal: noise ratio results.
Die Trennung zwischen der festen Bindung der synthetisierten Polynucleotide und der Nicht-Bindung der ggf. markierten nie dermolekularen Bausteine kann durch die Zugabe eines Detergens verbessert werden, wobei die Menge des zugesetzten Detergens den jeweiligen Bedingungen (Art des aktivierten Trägers, Art und Menge der Bausteine, Länge der Primer und der syntheti sierten Polynucleotide usw.) im Rahmen des fachmännischen Kön nens angepaßt werden können.The separation between the tight bond of the synthesized Polynucleotides and the non-binding of the possibly labeled never The molecular building blocks can be added by adding a detergent be improved, the amount of detergent added the respective conditions (type of activated carrier, Art and amount of building blocks, length of primers and syntheti based polynucleotides, etc.) within the scope of the expert knowledge nens can be adjusted.
Zum Zweck der Markierung können jegliche Arten von Markierun gen verwendet werden, die dem Fachmann aus dem Stand der Tech nik hinreichend bekannt sind. Geeignet sind beispielsweise Ra diomarkierungen, wie 3H-, 125J- und 32P-markierte Nucleotide und Primer; Markierungen mit Chromophoren, Fluorophoren; zeit verzögerte Fluoreszenz- und Chemilumineszenz-erzeugende Mar kierungssysteme; insbesondere Markierungen mit Reporter gruppen, wie Haptenen bzw. Biotin, welche Nachweisbestimmungs methoden immunchemischer Art oder mit dem Biotin-Avi din/Streptavidin-System ermöglichen. Als Hapten-markierte Nucleotid-Bausteine haben sich beispielsweise Brom- und Digi toxigenin-modifizierte Nucleosidtriphosphate (insbesondere BrdU und Dig-dUTP) in der Praxis bewährt. Selbstverständlich können auch Kombinationen verschiedener Markierungsarten ange wandt werden, insbesondere dann, wenn mehrere definierte Polynucleotidsequenzen in einem Ansatz nachgewiesen werden sollen.For the purpose of marking any kind of markings can be used which are sufficiently known to the person skilled in the art from the prior art. Suitable for example are radio labels, such as 3 H, 125 J and 32 P labeled nucleotides and primers; Markings with chromophores, fluorophores; time-delayed fluorescence and chemiluminescence generating marking systems; especially markings with reporter groups, such as haptens or biotin, which enable detection methods of immunochemical type or with the biotin avidin / streptavidin system. For example, bromine and digi toxigenin-modified nucleoside triphosphates (especially BrdU and Dig-dUTP) have proven themselves as hapten-labeled nucleotide building blocks. Of course, combinations of different types of labels can also be used, in particular when several defined polynucleotide sequences are to be detected in one approach.
Bei Verwendung markierter Bausteine (Primer und/oder Nucleotide) zur Amplifikation und zum späteren Nachweis der amplifizierten Polynucleotidsequenz werden diese vorzugsweise in Kombination mit nicht-markierten Analoga der Bausteine in die Amplifikationsreaktion eingesetzt. Geeignete Verhältnisse zwischen den markierten Bausteinen und den nicht-markierten Analoga sind bekannt (s. obige Literaturstellen von H.A. Er lich et al. und T. Maniatis et al.). Häufig ist es auch er wünscht, die markierten Bausteine nur in bestimmten Stufen der Amplifikationszyklen, insbesondere in den letzten Amplifika tionszyklen oder sogar nur im letzten Amplifikationszyklus zu zusetzen.When using marked blocks (primer and / or Nucleotides) for amplification and later detection of the amplified polynucleotide sequence, these are preferred in combination with non-labeled analogues of the building blocks in the amplification reaction used. Suitable conditions between the marked blocks and the unmarked Analogs are known (see above references by H.A. Er lich et al. and T. Maniatis et al.). It is often him too wishes the marked blocks only in certain stages of Amplification cycles, especially in the last amplification tion cycles or even only in the last amplification cycle clog.
Unter den immunchemischen Bestimmungsmethoden, zu denen auch das Biotin-Avidin/Streptavidin-System gezählt werden kann, stehen dem Fachmann eine große Auswahl aus dem Stand der Tech nik zur Verfügung und es bestehen in dieser Hinsicht keine Li mitierungen. Beispielsweise sind Fluoreszenz-Immunoassays (FIA) und Enzym-Immunoassays (EIA) geeignet. Das erfindungsge mäße Nachweisverfahren ist insbesondere dann sehr einfach, aber auch sehr empfindlich, wenn Hapten- bzw. Biotin-Markie rungen angewandt werden, deren Einbau in die synthetisierten Polynucleotide durch Enzym-Immunoassays bestimmt werden, ins besondere in Verbindung mit einem Antikörper-Nachweisreagenz, welches mit einem Enzym konjugiert ist, das präzipitierende Nachweisfarbstoffe bildet, die sich auf dem Kunststoff-Träger am Ort der Polynucleotidbindung niederschlagen. Nähere Erläu terungen zu geeigneten Nachweisbestimmungsmethoden, insbeson dere durch immunchemische Techniken, werden in den oben ge nannten, anhängigen PCT-Anmeldungen Nr. 92/02256 und Nr. 92/02432, auf die hier ausdrücklich Bezug genommen wird, gege ben.Among the immunochemical methods of determination, to which too the biotin-avidin / streptavidin system can be counted, the specialist has a large selection from the state of the art nik available and there are no Li in this regard mititations. For example, fluorescence immunoassays (FIA) and enzyme immunoassays (EIA) are suitable. The fiction Proof of verification is very simple, but also very sensitive when hapten or biotin markie are applied, their incorporation into the synthesized Polynucleotides can be determined by enzyme immunoassays especially in connection with an antibody detection reagent, which is conjugated to an enzyme, the precipitating Detection dyes that form on the plastic carrier precipitate at the site of the polynucleotide bond. Further explanation statements on suitable methods of determination, in particular others by immunochemical techniques are described in the above pending PCT applications No. 92/02256 and No. 92/02432, to which express reference is made here ben.
Wenn dies gewünscht wird oder falls dies erforderlich ist, können, um die Spezifität des erfindungsgemäßen Nachweisver fahrens zu erhöhen, weitere Schritte an die Amplifikation der definierten Polynucleotidsequenz angeschlossen werden. In der Regel sollten Waschschritte zum Abwaschen unspezifisch gebun dener, leicht mit der Oberfläche des Kunststoff-Trägers asso ziierter Markierungssubstanzen durchgeführt werden. Eine be sonders hohe Spezifität des Nachweises definierter Polynucleo tidsequenzen wird dadurch erreicht, daß die amplifizierte und an den Kunststoff-Träger gebundene Polynucleotidsequenz mit tels der Nucleinsäure-Hybridisierungstechnik bestimmt wird. Bei dieser Technik erfolgt die Detektion über markierte Nucleinsäure-Sonden, welche spezifisch an die nachzuweisende Polynucleotidsequenz oder an Teilbereiche dieser Polynucleo tidsequenz binden. Die Nachweisbestimmung erfolgt in diesem Fall wiederum durch eine geeignete Markierung, welche die Nucleinsäure-Sonde trägt, wobei die oben genannten Markie rungsarten auch hier angewandt werden können.If so desired or if required can to determine the specificity of the detection ver driving, further steps to the amplification of the defined polynucleotide sequence. In the As a rule, washing steps for washing up should be non-specific dener, light asso with the surface of the plastic carrier of the specified labeling substances. A be particularly high specificity of the detection of defined polynucleo tidsequenzen is achieved in that the amplified and polynucleotide sequence bound to the plastic support is determined by the nucleic acid hybridization technique. With this technique, the detection takes place via marked Nucleic acid probes that are specific to the one to be detected Polynucleotide sequence or at parts of this polynucleo tie tide sequence. The determination of evidence takes place in this Case again by a suitable marking, which the Nucleic acid probe carries, the above-mentioned markie types of application can also be applied here.
Einen Überblick über die Nucleinsäure-Hybridisierungstechnik geben U. Landegren et al., Science 242, Seiten 229 bis 237 (1988), J. Meinkoth und G. Wahl in Analytical Biochemistry 138, Seiten 267 bis 284 (1984) und B.D. Hames und S.J. Higgins in "Nucleic Acid Hybridization. A Practical Approach", IRL Press (1985).An overview of the nucleic acid hybridization technique give U. Landegren et al., Science 242, pages 229 to 237 (1988), J. Meinkoth and G. Wahl in Analytical Biochemistry 138, pages 267 to 284 (1984) and B.D. Hames and S.J. Higgins in "Nucleic Acid Hybridization. A Practical Approach", IRL Press (1985).
Bei dem erfindungsgemäßen Nachweisverfahren sollte darauf ge
achtet werden, daß in allen Schritten, die nach dem Amplifi
zierungsschritt in dem erfindungsgemäßen Nachweisverfahren
durchgeführt werden, wenn dies erforderlich ist oder gewünscht
wird, Emulgatoren bzw. Detergentien in den Inkubationsansätzen
vorhanden sind. Dies gilt beispielsweise für die Wasch
schritte, die immunchemischen inkubationsschritte, die
Nucleinsäure-Hybridisierungsreaktionen und die Enzym- Substrat-
Detektionsreaktionen. Dies unterbindet wirksam die unspezifi
sche Bindung markierter Nachweisreagenzien an die aktivierte
Oberfläche des Kunststoff-Trägers verursacht jedoch nicht die
Abdissoziation der Polynucleotide vom aktivierten Träger. Ge
eignete Emulgatoren bzw. Detergentien umfassen beispielsweise
Triton X-100 (Octylphenoxypolyethoyyethanol), Tween 20
(Polyoxyethylensorbiton), SDS (Natriumdodecylsulfat), nicht
ionische, anionische oder kationische Tenside, Borate und Sei
fen.In the detection method according to the invention, care should be taken to ensure that in all steps following the amplification step in the detection method according to the invention
be carried out if this is necessary or desired, emulsifiers or detergents are present in the incubation batches. This applies, for example, to the washing steps, the immunochemical incubation steps, the nucleic acid hybridization reactions and the enzyme-substrate detection reactions. This effectively prevents the unspecific binding of labeled detection reagents to the activated surface of the plastic carrier, but does not cause the polynucleotides to dissociate from the activated carrier. Suitable emulsifiers or detergents include, for example, Triton X-100 (octylphenoxypolyethoyyethanol), Tween 20 (polyoxyethylene sorbiton), SDS (sodium dodecyl sulfate), nonionic, anionic or cationic surfactants, borates and be fen.
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