DE4224738A1

DE4224738A1 - Verfahren zur Analyse molekularer organischer Strukturen

Info

Publication number: DE4224738A1
Application number: DE4224738A
Authority: DE
Inventors: Gabriele Engler-Blum
Original assignee: ENGLER BLUM GABRIELE; MUELLER GERHERD
Current assignee: ENGLER BLUM GABRIELE; MUELLER GERHERD
Priority date: 1992-07-27
Filing date: 1992-07-27
Publication date: 1994-02-03

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse molekula rer organischer Strukturen, insbesondere von Nukleinsäuren, mit den Verfahrensschritten:

- Synthese nicht-radioaktiv markierter Sondenstrukturen
- Hybridisierung der markierten Sondenstrukturen und der zu untersuchenden Struktur
- Detektion von Strukturbereichen mit angelagerten Sondenstrukturen mit Hilfe von Enzym-Konjugat-Komplexen, die Chemilumineszenz-Reaktionen von Substraten bewirken.

Die bevorzugte Anwendung der hier beschriebenen Erfindung ist die Nukleinsäure-Detektion. Die gewonnenen Erkennt nisse sind jedoch nicht auf diese Anwendung beschränkt, sondern können auf die Detektion von Proteinen und anderen biologisch relevanten Strukturen übertragen werden.

Die Identifiktation von Proteinen als auch von Oligo sacchariden wird durch die Anwendung von ELISA- und Immunoassay-Methoden ermöglicht, während Nukleinsäuren vorwiegend durch Hybridisierungstechniken identifiziert werden. Mit diesen Hybridisierungstechniken können spezi fische komplementäre Nukleinsäure-Sequenzen detektiert und quantifiziert werden. Unter bestimmten Bedingungen binden die komplementären Fragmente mit entsprechender Basen sequenz sehr spezifisch und mit hoher Affinität. Die An wendung dieser Hybridisierungstechniken liefert insbe sondere Informationen über die Genstruktur, -funktion und -expression. Die DNA- oder RNA-Analysen werden meist durch eine elektrophoretische Trennung der Nukleinsäurefragmente in einem Gel, Übertragung dieser Fragmente auf eine Mem bran und anschließende Hybridisierung mit einer markierten Sondenstruktur durchgeführt. Hierbei werden bislang noch häufig ³²P- und ³⁵S-markierte Nukleinsäure-Sonden verwendet, da sich hiermit Analysen sehr hoher Empfind lichkeit durchführen lassen. Die Detektion der radioaktiv markierten Proben erfolgt durch Autoradiographie auf einem Röntgenfilm. Diese radioaktiven Markierungsmethoden haben jedoch wegen des hohen Gesundheitsrisikos, den notwendigen Schutzvorkehrungen, der geringen Stabilität, den hohen Kosten sowie den Lagerungsproblemen viele Nachteile und werden daher zunehmend durch nicht-radioaktive Methoden ersetzt. Hierzu werden Sonden mit fluoreszierenden Agenzien, Enzymen sowie vor allem mit Biotin, Fluorescein oder Digoxigenin gekoppelt. Biotin-gekoppelte Sonden wer den durch Streptavidin-Enzymkomplexe detektiert, wobei die hohe Affinität zwischen Biotin und Streptavidin zur Anwen dung kommt. Fluorescein oder Digoxigenin-markierte Sonden werden dagegen durch hochspezifische Antikörper-Enzym- Konjugate detektiert. Durch die Enzymkomponente dieser Komplexe wird in einer folgenden Detektionsreaktion mit einem Substrat eine Farbreaktion oder eine noch sensi tivere Chemilumineszenz-Reaktion bewirkt. Die Dokumenta tion von hybridisierten Sonden kann dann bei membrangebun denen Strukturen durch Röntgenfilm erfolgen oder bei an andere Festphasen gebundenen oder in Lösung befindlichen zu analysierenden Strukturen durch den Einsatz von Photo multipliern.

Bei den seither bekannten Chemilumineszenz-Verfahren läßt jedoch die Empfindlichkeit zu wünschen übrig. Häufig sind die spezifischen Signale, die auf einem Röntgenfilm fest gehalten werden, von einem unspezifischen Membranhinter grund überdeckt. Dieser unspezifische Hintergrund wird zum einen durch unspezifische Bindungen der Sondenstrukturen während der Hybridisierung als auch durch unspezifische Bindungen des Enzym-Konjugat-Komplexes während der Detek tion verursacht.

Sensitive Nachweisverfahren, wie z. B. die sogenannte Northernblotanalysen von schwach transkribierten mRNA- Spezies, waren deshalb bisher mit nicht-radioaktiven Methoden nicht durchführbar. Eine Routineanwendung der nicht-radioaktiven Detektion bei Northernblotanalysen im molekularbiologischen Labor war deswegen bislang ausge schlossen.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein nicht radioaktives, sensitives Analyseverfahren, insbesondere für Nukleinsäuren, zu schaffen, das in kurzer Zeit zuver lässige Signale mit einem hohen Rauschabstand ermöglicht.

Die Aufgabe wird mit einem Analyseverfahren der eingangs genannten Art erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß für die Detektion ein unphysiologisches Lösungsmittel mit einer Detergenskomponente verwendet wird und/oder die Hybridi sierung mit einer Lösung, die neben Na₂HPO₄ und EDTA eine hohe Detergenskonzentration und weniger als 1% eines Blockierungs-Reagens enthält, durchgeführt wird. Mit diesen Maßnahmen wird eine Reduktion des Hintergrundes erreicht, indem erhebliche Stringenzerhöhungen während der Detektion und/oder der Hybridisierung zur Anwendung kom men. Unspezifische Signale, verursacht durch unspezifische Bindungen der Sondenstruktur während der Hybridisierung und durch unspezifische Bindungen des Enzym-Konjugat- Komplexes während der Detektion, können durch diese Stringenzerhöhungen unterdrückt werden. Starke Verbesse rungen des Rauschabstandes ergeben sich bei Verwendung einer unphysiologischen Detektionslösung. Die unspezifi schen Bindungen von Enzym-Konjugat-Komplexen mit dem Trägersubstrat, beispielsweise einer Membran, sind schwä cher ausgebildet als die spezifischen Bindungen der markierten Sondenstruktur mit der zu analysierenden mole kularen Struktur und lassen sich beispielsweise durch einen hohen Salzgehalt in der Detektionslösung und einen unphysiologischen pH-Wert als auch durch bestimmte Detergentien wieder lösen. Als besonders vorteilhaft hat sich hierbei eine Konzentration von 3M NaCl in einer Lösung mit einem pH-Wert von 8-10 herausgestellt. Alternativ hierzu kann für die Detektion ein Lösungsmittel mit einer Pufferlösung, die ein Detergens enthält, verwen det werden. Vorteilhafterweise kann SDS als Detergens ein gesetzt werden. Als Detergenskomponenten eignet sich neben SDS jedoch auch Tween-20. Ebenfalls starke Verbesserungen des Rauschabstandes lassen sich mit einer Hybridisierungs lösung, die neben den Basiskomponenten Na₂HPO₄ und EDTA eine SDS-Konzentration von mehr als 7% enthält, er reichen. Statt mit dem normalerweise üblichen BSA werden mit einem Blockierungs-Reagens von weniger als 1% bessere Ergebnisse erzielt. Die optimale Konzentration des Blockierungs-Reagens liegt bei 0,5%. Weitere starke Ver besserungen des Membranhintergrundes lassen sich während der Hybridisierung durch die strikte Einhaltung einer Temperatur von mindestens 68°C auch während der folgenden Waschvorgänge erzielen.

Die elektrophoretisch aufgetrennten Nukleinsäurefragmente oder Proteine werden in der Regel für die Folgereaktionen auf eine Membran transferiert. Verbesserungen der Empfind lichkeit des Verfahrens zur Analyse solcher Strukturen können hierbei nicht nur durch eine Optimierung der Hybridisierung und der Detektion erzielt werden, sondern bereits beim Transfer der Strukturen vom Gel auf die Mem bran. So werden beispielsweise RNA-Gele zweckmäßigerweise vor dem Transfer mehrmals in sterilem destilliertem Wasser und in 20×SSC gewaschen, um in ihm enthaltenes Formaldehyd zu entfernen, da durch Formaldehydreste eine Verschlechterung des Hintergrundes der Membran begünstigt wird. Des weiteren können neben ungeladenen Membranen auch positiv geladene Nylon-Membranen als Träger für die zu untersuchenden Strukturen verwendet werden, da sich diese durch ihre höhere Bindungskapazität auszeichnen.

Es kann außerdem eine Fixierung der zu untersuchenden Strukturen auf der Membran mit Hilfe von UV-Vernetzung und/oder Backen bei 80°C erfolgen. Durch diese Maßnahme ist im Vergleich zu einem Alkali-Transfer der Strukturen auf eine Membran, der ebenfalls einsetzbar wäre, eine Erhöhung der Sensitivität möglich. Ein optimaler Rausch abstand der Analysesignale kann durch eine Kombination aller oben aufgeführten Maßnahmen erzielt werden.

Im folgenden sind bevorzugte Ausführungsbeispiele des Analyseverfahrens der Erfindung näher erläutert:

Beispiel 1

Vergleich der nicht-radioaktiven Detektion mit der traditionellen ³²P-Detektion im Grenzbereich der Nach weismöglichkeiten am Beispiel Northernhybridisierung.

RNA-Isolierung und Auftrennung

Gesamt-RNA wurde aus menschlichen Nierenzellen isoliert. Hierzu wurden die Zellen in Guanidin-iso-thiocyanat lysiert und die RNA nach einer Methode aus Maniatis T. et al: Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press 1989, isoliert. Die Konzentration der RNA wurde photometrisch bestimmt und für eine Verdün nungsreihe eingesetzt. Nach Denaturierung der RNA wurden zwei identische Verdünnungsreihen auf ein 1%iges Formal dehyd-Agarose-Gel aufgetragen und elektrophoretisch aufge trennt. Folgende RNA Konzentrationen wurden eingesetzt: 5 µg, 1 µg, 500 ng, 100 ng und 50 ng Gesamt-RNA.

Blotting

Vor dem Transfer der RNA aus dem Gel auf eine positiv ge ladene Nylon-Membran wurden die Gele mehrfach in sterilem Wasser und in 20×SSC gewaschen, um Formaldehydreste zu entfernen. Anschließend wurde die RNA mittels Kapillar- Blotting in einer neutralen Transferlösung (20×SSC) oder (1M NH₄Ac) auf die Membran transferiert und dort durch UV-Bestrahlung und Backen bei 80°C fixiert. Die UV-Be strahlung wurde mit einem Biometra Fluo-Linker mit gerin gen Strahlungsdosen, vorzugsweise mit 0,12 J/cm² ausge führt. Entscheidend war hierbei die optimale UV-Vernetzung durch eine ausgetestete UV-Dosis.

Nach dem Transfer und der Fixierung der RNA-Verdünnungs reihen wurde der Northernblot in zwei identische Teile unterteilt, wovon die eine Hälfte der radioaktiven Detek tion unterzogen wurde und die zweite Hälfte für die nicht radioaktive Detektion eingesetzt wurde.

Synthese von markierten cDNA-Sonden

Als cDNA diente eine spezifische Probe für GAPDH (Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase) ein Enzym der Glykolysekontrolle (Fort P.H. et al: Nucleic Acid Research (1985) 13: 1431-1442). Die Markierung dieser cDNA er folgte entweder über Digoxigenin-11-dUTP (Boehringer) oder mit α-³²P-dCTP (Amersham Buchler) durch sogenannte "random primed labeling reactions". Die Markierungen er folgten nach Angaben der Hersteller.

Hybridisierung

Die radioaktive Hybridisierung erfolgte nach einem modifizierten Protokoll nach Church and Gilbert (Proc. Natl. Acad. Sci. (1984) 81: 1991-1995).

Für die nicht-radioaktive Hybridisierungsmethode wurde folgende modifizierte Hybridisierungslösung eingesetzt: Basiskomponenten: 0,25 M Na₂HPO₄
1 mM EDTA
+ 20% SDS
+ 0,5% Blockierungs-Reagens (Boehringer).

Zunächst wurde eine Prähybridisierung in oben beschriebe ner, modifizierter Hybridisierungslösung durchgeführt. Für 100 cm² Membran wurden 20 ml Hybridisierungslösung einge setzt. Die Prähybridisierung erfolgte bei 72°C für eine Stunde. Die Hybridisierung erfolgte über Nacht bei 72°C. Analog zur radioaktiven Hybridisierung wurden 2,5 ng markierte cDNA-Sonde/ml Hybridisierungslösung eingesetzt. Nach der Hybridisierung wurde die Membran 3×5 Min. bei 72°C in Waschpuffer (20 mM Na₂HPO₄, 1 mM EDTA und 1% SDS) gewaschen.

Detektion

Die Detektion der radioaktiv markierten cDNA-Sonde er folgte mittels Autoradiographie auf einem Röntgenfilm.

Die Detektion der DIG-markierten cDNA-Sonde wurde mit Hilfe eines Anti-DIG-Alkalische Phosphatase-Konjugates (α-DIG-AP) durchgeführt. Hierzu wurden folgende modifizierte Detektionslösungen eingesetzt:

1. Wasch-Puffer:
Basiskomponenten 0,1 M Maleinsäure
0,3% Tween-20
+ 3 M NaCl
+ Zugabe von NaOH bis pH8.
2. Blockierungs-Lösung:
bestehend aus Wasch-Puffer und 0,5% Blockierungs-Reagens.
3. Konjugat-Lösung:
bestehend aus Blockierungs-Lösung und α-DIG-AP Konjugat (1: 15 000).
4. Substrat-Lösung:
mit 0,1 M Tris-HCl, 0,1 M NaCl, 50 mM MgCl₂ und 0,24 mM AMPPD bzw. CSPD.

Alle Detektionsschritte wurden bei Raumtemperatur und leichtem Schütteln durchgeführt. Nach 5 Min. in Wasch- Puffer 1 wurde die Membran 1 Std. in Blockierungs-Puffer 2 inkubiert. Die Blockierungs-Lösung wurde anschließend durch 20 ml frisch hergestellte Konjugat-Lösung 3 ersetzt und die Membran weitere 30 Min. inkubiert. Danach folgten vier Waschschritte in Wasch-Puffer 1 a 10 Min . . Vor dem Start der Chemilumineszenzreaktion wurde die Membran 5 Min. in Substrat-Puffer ohne Substrat äquilibriert. Die Reaktion selbst wurde in einer frisch hergestellten Substrat-Lösung 4 (Verdünnung 1 : 100) hergestellt. Die Dokumentation erfolgte ebenfalls auf einem Röntgenfilm nach Verschluß der Membran in einer Plastikfolie, um die Membran vor dem Austrocknen zu bewahren.

Ergebnis

Über den untersten Sensitivitätsbereich der radioaktiven Detektion hinaus zeigte die nicht-radioaktive Detektion eine erhöhte Sensitivität. Mit der radioaktiven Detektion war die Nachweisgrenze nach 5 Tagen Exposition bei 500 ng erreicht. Die nicht-radioaktive Methode erlaubte jedoch eine Detektion bis herunter zu 50 ng Gesamt-RNA nach nur 5 Stunden. Im Sensitivitätsbereich der radioaktiven Detek tion ist der Signalhintergrund und damit der Rauschabstand ebenso makellos wie bei der ³²P-Markierung. Selbst längere Expositionen zeigen noch hervorragende Ergebnisse. Neben der Verbesserung der Sensitivität ließ sich auch eine dramatische Reduktion der erforderlichen Expositions zeiten erzielen. Um die gleiche Sensitivität wie mit einer ³²P-markierten cDNA-Sonde nach 5 Tagen zu erreichen, genügen wenige Minuten Expositionszeit nach einer Über- Nacht-Inkubation der Membran. Wird sofort nach Beginn der Reaktion exponiert, reichen ca. 2 Std. Expositionszeit aus, um die gleiche Signalstärke zu erhalten.

Beispiel 2

Nicht-radioaktive Northernanalyse durch Oligonukleotiden.

Da Oligonukleotide aufgrund ihrer geringen Größe nur schwächer markiert werden können als längere cDNA-Sonden, stellt diese Anwendung besondere Ansprüche an die Sensitivität der verwendeten Hybridisierungstechnik.

RNA-Isolierung, -Auftrennung und -Blotting wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt. Je Gelspur wurden 20 µg Gesamt- RNA aufgetragen.

Oligonukleotidmarkierung

Um einen direkten Vergleich zu Beispiel 1 zu ermöglichen, wurde ein 30mer Oligonukleotid synthetisiert, welches spezifisch für GAPDH ist und einen GC-Gehalt von ca. 50% aufweist. Die Markierung der Oligonukleotide mit DIG wurde entweder durch eine 3′OH-Markierung durchgeführt, bei welcher nur ein DIE je Oligonukleotid gekoppelt wird, oder durch eine Tailing-Reaktion, bei welcher mehrere DIG (ca. 5) je Oligonukleotid gekoppelt werden. Die Markierun gen der Oligonukleotide wurden nach Angaben des Herstel lers durchgeführt.

Hybridisierung

Die Hybridisierung wurde analog zum Beispiel 1 durchge führt, mit der Ausnahme, daß die Hybridisierung nur eine Stunde dauerte und die Hybridisierungs- und Waschtempera turen nur 68°C betrugen.

Detektion

Die Detektion wurde ebenfalls analog zum Beispiel 1 durch geführt. Die Expositionszeiten waren aufgrund der schwä cheren Markierung der Oligonukleotide etwas verlängert.

Ergebnis

Trotz der etwas verlängerten Expositionszeiten konnte auch mit Oligonukleotiden ein hervorragendes Ergebnis erzielt werden. Auch die Oligonukleotide zeigen keinerlei un spezifische Kreuzreaktion mit fremden Nukleotid-Sequenzen und mit der Membran. Sogar mit der unsensitiven 3′OH-End markierung können noch spezifische Signale detektiert werden. Es empfiehlt sich jedoch die Tailing-Reaktion auf grund der höheren Sensitivität.

Beispiel 3

Dot-Blot Hybridisierungen mit RNA und homologer DNA.

Um die Sensitivitätsgrenzen für RNA und DNA zu bestimmen, wurden Verdünnungsreihen der RNA (Beispiel 1) und homologer DNA direkt auf eine positiv geladene Membran aufpipettiert, UV-fixiert und bei 80°C gebacken. Als homologe DNA-Probe diente unmarkierte Sonde.

Die Synthese von markierten cDNA-Sonden erfolgte wie oben beschrieben. Die Hybridisierung und Detektion erfolgte analog zum Beispiel 1.

Ergebnis

Ein Signal für GAPDH konnte sogar noch detektiert werden, wenn die geringe Menge von nur 17 ng Gesamt-RNA aufgetra gen wurde. Homologe DNA konnte bis zu einer Grenze von 15 fg nachgewiesen werden.

Mit diesem hier beschriebenen Analyseverfahren, mit seinen Vorteilen bezüglich der Sensitivität und der Detektions geschwindigkeit, können bislang eingesetzte radioaktive Hybridisierungsverfahren, mit ihren Nachteilen bezüglich der Umweltbelastung und des Arbeitsschutzes sowie ihrer geringen Haltbarkeit, ersetzt werden. Selbst sensitivste Anforderungen werden durch dieses Protokoll erfüllt. Auch andere Chemilumineszenz-Verfahren sind durch diese Ver fahrensschritte zu optimieren. Das oben bevorzugte Ver fahren ist jedoch nicht nur auf Nukleinsäuren anwendbar, sondern kann in einzelnen Schritten auch bei anderen Detektionen von markierten molekularen Strukturen Anwen dung finden.

Claims

1. Verfahren zur Analyse molekularer organischer Struk turen, insbesondere von Nukleinsäuren, mit den Verfah rensschritten:

- Synthese nicht-radioaktiv markierter Sondenstruk turen
- Hybridisierung der markierten Sondenstrukturen und der zu untersuchenden Struktur
- Detektion von Strukturbereichen mit angelagerten Sondenstrukturen mit Hilfe von Enzym-Konjugat- Komplexen, die Chemilumineszenz-Reaktionen von Sub straten bewirken, dadurch gekennzeichnet, daß für die Detektion ein unphysiologisches Lösungsmittel mit einer Detergens komponente verwendet wird und/oder die Hybridisierung mit einer Lösung, die neben Na₂HPO₄ und EDTA eine hohe Detergenskonzentration und weniger als 1% eines Blockierungs-Reagens enthält, durchgeführt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß für die Detektion ein Lösungsmittel mit einer hohen Salzkonzentration und einem unphysiologischen pH-Wert verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß für die Detektion ein Lösungsmittel mit 3M NaCl und einem pH-Wert von 8-10 verwendet wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß für die Detektion ein Lösungsmittel mit einer Puffer lösung, die ein Detergens enthält, verwendet wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Detergens SDS eingesetzt wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Hybridisierung mit einer Lösung, die neben Na₂HPO₄ und EDTA 20% SDS und 0,5% eines Blockierungs-Reagens enthält, und bei einer Temperatur von 68°C-72°C durchgeführt wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die zu untersuchenden Strukturen zunächst durch Elektrophorese in einem Gel getrennt und auf eine Membran aufgebracht werden.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Gel für die Trennung der Strukturen vor seiner Verwendung mehrmals in sterilem destilliertem Wasser und in 20×SSC zur Entfernung des in ihm enthaltenen Formaldehyds gewaschen wird.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeich net, daß die zu untersuchenden Strukturen anschließend auf der Membran mit Hilfe von UV-Vernetzung und/oder Backen bei 80°C fixiert werden.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die zu untersuchenden Strukturen auf eine neutrale oder positiv geladene Nylon-Membran abgeschieden werden.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, gekenn zeichnet durch folgende Verfahrensschritte:

- Isolierung und Trennung der zu untersuchenden Struk turen durch Elektrophorese in einem Gel, das vor seiner Verwendung mehrmals in sterilem destilliertem Wasser und in 20×SSC zur Entfernung des in ihm enthaltenen Formaldehyds gewaschen wird
- Aufbringen der Strukturen auf eine positiv geladene Nylon-Membran und Fixierung der Strukturen auf der Membran mit Hilfe von UV-Vernetzung und/oder Backen bei 80°C
- Hybridisierung von mit Digoxigenin markierten Sondenstrukturen und der zu untersuchenden Struktur mit einer Lösung, die neben Na₂HPO₄ und EDTA 20% SDS und 0,5% eines Blockierungs-Reagens ent hält, wobei die Hybridisierungstemperatur mindestens 68°C beträgt
- Detektion von Strukturbereichen mit angelagerten, Digoxigenin-markierten Sondenstrukturen mit Hilfe eines Enzym-Antikörper-Komplexes in einer Lösung mit 3 M NaCl und einem pH-Wert von 8-10.