DE4214822A1

DE4214822A1 - Verfahren und Vorrichtung zur kontinuierlichen Bestimmung von Substraten von Oxidoreduktasen

Info

Publication number: DE4214822A1
Application number: DE4214822A
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Dr Schuhmann; Herbert Dr Stadler
Original assignee: Klaus Kuehn Konstruktion & Co Kg 12349 Berlin De GmbH; INSTITUT fur BIOANALYTIK GmbH
Current assignee: Sensolytics GmbH
Priority date: 1992-05-05
Filing date: 1992-05-05
Publication date: 1993-11-11
Anticipated expiration: 2012-05-06
Also published as: DE4214822C2

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur kontinuierlichen Bestimmung von Substraten von Oxidoredukta sen mit O₂, NADH oder NADPH oder künstlichen Redoxmediatoren als Akzeptor.

Die kontinuierliche Bestimmung von Leitsubstanzen ist für die Regelung von biotechnologischen Prozessen von herausragender Bedeutung. Besonders wichtig ist die Bestimmung von Glucose und Lactat. Jedoch ist auch die Bestimmung aller Substrate von H₂O₂-bildenden Oxidasen oder von mediator-abhängigen Oxidoreduktasen, also insgesamt die Gruppe der Oxidoredukta sen mit O₂, NAD und NADP oder künstlichen Redoxmediatoren als Akzeptor wichtig.

Es sind bereits Vorrichtungen zur kontinuierlichen Bestimmung von Substraten dieser Enzymvorrichtungen bekannt, die das Fließinjektionssystem benutzen. Sie enthalten mindestens zwei Pumpen und ein Injektionsventil. Abgesehen von diesem uner wünscht großem Aufwand weisen sie in der Regel ein oder mehrere der folgenden Nachteile auf.

Der Abstand des Meßsystems vom Ort der Probenahme ist fixiert und damit von den räumlichen Gegebenheiten abhängig. Die Pumpe wird vielfach von der Probelösung durchflossen, so daß Verschleppungen auftreten. Die Anpassungsfähigkeit an die Größe der Probenvolumina ist begrenzt, der Reagentienver brauch unerwünscht hoch. Die simultane Bestimmung mehrerer Substrate ohne gegenseitige Beeinflussung ist nicht möglich.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine verbesserte Vorrichtung nach dem Fließinjektionssystem zu schaffen, welche die obengenannten Nachteile nicht aufweist.

Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch eine Vorrich tung zur kontinuierlichen Bestimmung von Substraten von Oxidoreduktasen mit O₂, NAD oder NADP als Akzeptor, welche gekennzeichnet ist durch einen Standardlösungssammler 1, der durch eine Rohrleitung 2 mit einem Sterilfilter 3 und von dort weiter mit einer Probenzuführung 4 verbunden ist, durch eine Mehrwegeverbindung 5, die über Rohrleitung 6 mit der Rohrleitung 2 zwischen Sammler 1 und Sterilfilter 3 verbunden ist, durch einen Pufferlösungsbehälter 7, der über eine die Pumpe 8 enthaltene Rohrleitung 9 mit der Mehrwegeverbindung 5 verbunden ist, durch eine Meßzelle 10, die mit der Mehrwege verbindung 5 über eine Rohrleitung 11 verbunden ist, die eine Luftblasenfalle 12 enthält und innerhalb der Verbindung zwischen Arbeitselektrode in der Meßzelle 10 und der Mehrwe geverbindung 5 mindestens eine träger fixierte Oxidoreduktase angeordnet ist, einen Abfallösungsbehälter 13, der über Rohrleitungen 14 und 14a mit der Mehrwegeverbindung 5 bzw. der Meßzelle 10 verbunden ist, durch Sperrventile V zwischen jedem von mehreren Standardlösungsbehältern 15 und dem Stan dardlösungssammler 1, in jeder der in die Mehrwegeverbindung 5 eintretenden Leitungen 6, 11 und 14, und zwischen Steril filter 3 und der Einmündung von Rohrleitung 6 in Rohrleitung 2, sowie durch eine Steuervorrichtung, welche die Pumpe 8 und alle Ventile nach vorgegebenem Arbeitsschema steuert.

Die Rohrleitungen in der erfindungsgemäßen Vorrichtung beste hen vorzugsweise ganz oder teilweise aus Kunststoff, wobei besonders bevorzugt Kunststoffschläuche verwendet werden. Der Kunststoff soll inert gegenüber den Lösungsmitteln sein. Daher werden entsprechende Rohrleitungen oder Schläuche aus Polytretrafluorethylen, Polypropylen, Polyethylen, Polyamiden bevorzugt, es können jedoch auch andere Kunststoffe bzw. Nicht-Kunststoffmaterialien wie Glasrohre u. dgl. verwendet werden. Wichtig ist, daß eine trägerfixierte Oxidoreduktase zwischen der Mehrwegeverbindung 5 und der Meßzelle 10 an geordnet wird. Dies erfolgt zweckmäßig so, daß die Rohrlei tung 11 mindestens einen Kunststoffschlauch enthält, an dessen Innenseite Oxidoreduktase kovalent fixiert ist. Die Fixierung von Enzymen an Kunststoffoberflächen ist an sich bekannt. Als besonders geeignet im Hinblick auf die Einfach heit der Fixierung und die Dauerhaftigkeit derselben sind Polyamidrohre wie z. B. Nylonschläuche oder Perlonschläuche. Auch Polyolefinschläuche, insbesondere Polyethylen- und Polypropylenschläuche, sowie Copolymere derselben, sind gut geeignet. Generell können alle Kunststoffe verwendet werden für welche Enzymfixierungsmethoden zur Verfügung stehen, die eine ausreichend hohe Fixierungsausbeute ermöglichen. Derar tige Kunststoffe und die zugehörigen Fixierungsmethoden sind dem Fachmann bekannt und brauchen hier nicht näher erläutert zu werden.

Die Meßzelle 10 enthält eine elektrochemische, photometrische oder fluorometrische Detektionsanordnung. Im Falle der elek trochemischen Detektion enthält die Meßzelle 10 mindestens eine Arbeitselektrode, eine Referenzelektrode und eine Gegen elektrode sowie einen Potentiostaten, welcher der oder den Arbeitselektroden ein konstantes Arbeitspotential aufprägt.

Alternativ zur Fixierung des Enzyms an der Innenseite eines Kunststoffrohres oder Kunststoffschlauches ist auch die Verwendung eines Kunststoffnetzes möglich, welches den Vor teil hat, daß es direkt über der Arbeitselektrode in der Meßzelle 10 angebracht werden kann, beispielsweise einfach durch einen O-Ring. Damit wird der Weg zwischen der Bildung der zu messenden Substanz, also H₂O₂, NADH oder NADPH und der eigentlichen Meßstelle minimiert, was eine besonders hohe Genauigkeit und Empfindlichkeit der Messung ermöglicht. Im speziellen kann der Kunststoffträger ein gewobenes Netz mit definierter Fadenstärke und Fadenabstand sein, so daß die Diffusionscharakteristika vorbestimmt werden können.

Das unterscheidet diese Elektroden von Enzymmembran-Elektro den, die einen hohen Diffusionswiderstand aufweisen.

Die Rohrleitung 11 kann auch mehrere parallel angeordnete Leitungen enthalten, in denen verschiedene Oxidoreduktasen fixiert vorliegen, so daß eine simultane Bestimmung mehrerer Substrate durch Umschaltung des Flüssigkeitsstromes von einer der parallelen Rohrleitungen zu einer anderen ermöglicht wird.

Geeignete Meßzellen sind an sich bekannt. Im folgenden wird die Erfindung anhand einer elektrochemischen Meßzelle näher beschrieben. Bei photometrischen oder fluorometrischen Meß zellen gelten die Erläuterungen mit den für den Fachmann offensichtlichen analogen Anordnungen. Mehrere Arbeitselek troden werden benötigt, wenn entweder mehrere verschiedene Oxidoreduktasen zur Bestimmung verschiedener Substrate einge setzt werden und dabei jeweils auf einem Kunststoffnetz fixiert direkt über der Arbeitselektrode angebracht sind. Ebenfalls kann es vorteilhaft sein im Falle der Anwendung mehrerer parallelgeschalteter Leitungen 11 mit darin fixier ten verschiedenen Oxidoreduktasen entweder für jede Rohrlei tung eine spezielle Arbeitselektrode anzuordnen oder für jede Art von gebildetem Akzeptor eine gesonderte Arbeitselektrode vorzusehen.

Im Falle von H₂O₂-bildenden oder O₂-verbrauchenden Oxidore duktasen werden als Arbeitselektroden Platinelektroden, platinisierte Glaskohlenstoffelektroden, platinisierte Gra phitelektroden oder Goldelektroden bevorzugt. Jedoch können auch andere Arbeitselektroden verwendet werden, von denen bekannt ist, daß sie für die H₂O₂-Bestimmung geeignet sind.

Im Falle von NADH oder NADPH bildenden Oxidoreduktasen werden zweckmäßig mediator-modifizierte Elektroden mit einem Poten tial von 0 bis 200 mV gegen Kalomelelektrode vorgesehen.

Besonders bevorzugte Arbeitselektroden für letzteren Fall sind Polypyrrol-Chinon modifizierte Platinelektroden oder gleicherweise modifizierte Glaskohlenstoffelektroden oder mediator-modifizierte Kohlepasteelektroden. Derartige Elek troden sind dem Fachmann ebenfalls bekannt und werden daher nicht näher erläutert.

Zur Immobilisierung der Oxidoreduktasen an den Träger werden ebenfalls die bekannten Immobilisierungsmethoden eingesetzt. Im Falle von Nylonschlauch oder Nylongewebe wird vorzugsweise eine Aktivierung mit Dimethylsulfat vorgenommen, das akti vierte Nylon wird mit einem Diamin gekuppelt und das so aktivierte Nylon (oder Perlon) wird im Falle von Glycoenzymen mit einem Perjodat-oxidierten Glycoenzym unter Bildung von Schiff′schen Basen, die dann reduziert werden, fixiert. Im Falle einer Fixierung von Carboxylgruppen enthaltenden Enzy men werden letztere mit Carbodiimid aktiviert und in dieser aktivierten Form dann direkt an das aktivierte Nylon gebunden oder mit einem anderen divalenten Lösungsmittel wie Glutar dialdehyd vernetzt. Mit divalenten Fixierungsmitteln kann auch eine direkte Trägerbindung erfolgen, indem der Träger, z. B. das Nylon, zuerst mit dem divalenten Mittel inkubiert und dann mit dem Enzym umgesetzt wird. Ein besonders geeigne tes divalentes Fixierungsmittel Glutardialdehyd.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung zeichnet sich durch einen im Vergleich zu bekannten Fließinjektionssystemen erheblich vereinfachten Aufbau aus. Das gesamte Meßsystem wird mittels eines Computers gesteuert, wobei die Schlauchquetschventile (v1-v9), Start und Stop der Pumpe sowie deren Laufrichtung über eine DigitalIO-Karte mit angeschlossenem Relaisboard gesteuert werden. Die Geschwindigkeit der Pumpe wird über einen D/A-Wandler geregelt. Die Stromwerte, die an beiden Arbeitselektroden mittels eines Bipotentiostaten gemessen werden, werden mit Hilfe eines A/D-Wandlers digitalisiert und in den Computer eingelesen.

Ein typischer Meßvorgang hat folgenden Ablauf:

1. v1-v7, v9 geschlossen; v8 geöffnet
Die Pumpe läuft vorwärts und pumpt Pufferlösung durch die Meßzelle.
2. v2-v6, v8, v9 geschlossen; v1, v7 geöffnet
Die Pumpe läuft rückwärts und saugt den Standard #1 an. Dieser Vorgang erfolgt so lange, bis im Manifold 2 hinter dem Ventil v7 Standardlösung 1 anliegt.
3. v1-v8 geschlossen; v9 geöffnet
Die angesaugte Standardlösung wird bei vorwärts lau fender Pumpe in den Abfall gepumpt.
4. v2-v6, v8, v9 geschlossen; v1, v7 geöffnet
Die Pumpe läuft sehr langsam rückwärts und saugt den Standard #1 an.
5. v1-v7, v9 geschlossen; v8 geöffnet
Die Pumpe läuft vorwärts und pumpt Standard #1 durch die Meßzelle.

Die Schritte 4-5 werden so lange wiederholt, bis die im Pro gramm vorgegebene Anzahl an Injektionen erreicht ist. Dann werden analog für die Standardlösungen 2-5 dieser Zyklus wiederholt. Aus den Mittelwerten der Peakströme wird automa tisch eine Kalibrierkurve erhalten, die als Grundlage der Probenmessung dient.

5. v1-v7, v9 geschlossen; v8 geöffnet
Die Pumpe läuft vorwärts und pumpt Pufferlösung durch die Meßzelle.
6. v1-v5, v8, v9 geschlossen; v6, v7 geöffnet
Die Pumpe läuft rückwärts und saugt Probe an. Dieser Vorgang erfolgt so lange, bis im Manifold 2 hinter dem Ventil v7 frische Probe anliegt.
7. v1-v8 geschlossen; v9 geöffnet
Die angesaugte alte Probe wird bei vorwärts laufender Pumpe in den Abfall gepumpt.
8. v1-v5, v8, v9 geschlossen; v6, v7 geöffnet
Die Pumpe läuft sehr langsam rückwärts und saugt ein definiertes Volumen der Probe an.
9. v1-v7, v9 geschlossen; v8 geöffnet
Die Pumpe läuft vorwärts und pumpt die injizierte Probe durch die Meßzelle.

Die Schritte 8-9 werden so lange wiederholt, bis die im Pro gramm vorgegebene Anzahl in Injektionen erreicht ist. Dann werden die Schritte 5-9 bzw. 8-9 wiederholt, bis die Anzahl von Injektionen erreicht ist, nach der eine Überprüfung der Kalibrierung erfolgt. Der Nutzer hat die Möglichkeit, entwe der eine vollständige neue Kalibrierkurve mit allen z. B. 5 Standardlösungen durchzuführen, oder eine der Standardlösun gen zu injizieren.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung wird anhand der beigefügten Zeichnung näher beschrieben. In dieser stellen dar:

Abb. 1 eine schematische Darstellung der erfindungsgemäßen Vorrichtung;

Abb. 2 ein Konzentrationsprofil bei Injektion einer NAD-Lösung;

Abb. 3 eine den Verlauf einer Glucosebestimmung bei unter schiedlichen Konzentrationen über 100 h;

Abb. 4 den zeitlichen Verlauf einer Simultanbestimmung von Glucose und Lactat über 100 h;

Abb. 5 eine Kalibrierkurve für Glucose;

Abb. 6 den Ablauf einer Fermentation;

Abb. 7 eine weitere graphische Darstellung eines Fermentati onsverlaufes über 900 h.

Vorrichtungsaufbau

Als Leitung 11 wird ein Enzym-Nylonschlauch oder über Wech selventile werden verschiedene Enzym-Nylonschläuche einge baut. Im Falle der Verwendung von Enzymen-Nylonnetzen wird das Netz mit Hilfe eines O-Ringes über der Elektrodenfläche fixiert.

Nach Injektion eines Standards oder der Probe wird das Flüs sigkeitssegment mit Hilfe der Pumpe durch den bzw. durch einen der Enzymschläuche gepumpt. Dort wird das Substrat enzymatisch umgesetzt unter Bildung einer Spezies, die elek trochemisch an einer geeigneten Elektrode in der Meßzelle erfaßt werden kann. Als Meßsignal erhält man proportional zur Konzentration des Substrates und entsprechend der Selektivi tät der enzymatischen Reaktion einen Strom durch die Meßzel le. Die Meßzelle ist dabei ein Durchfluß-Dreielektrodensystem mit ca. 20 µl Volumen, einer 3 mm Arbeitselektrode, einer Ag/AgCl Referenzelektrode und einer Edelstahlkapillar als Auslaß und Gegenelektrode. Ein konstantes Arbeitspotential wird mittels eines Potentiostaten an der Arbeitselektrode aufgeprägt und die Potentialdifferenz zur Referenzelektrode wird zeitlich konstant gehalten.

Es sind verschiedene Kombinationen von immobilisierten Redox enzymen und Elektroden möglich. Dabei richtet sich die Art der Arbeitselektrode nach dem zu detektierenden Produkt der enzymatischen Reaktion. Für H₂O₂-bildende Oxidasen wie z. B. Glucoseoxidase, Lactatoxidase, Ascorbatoxidase, Galactoseoxi dase, Xanthinoxidase usw., ebenso wie für O₂-verbrauende Enzyme eignet sich insbesondere eine Platinelektrode, plati nisierte Glaskohlenstoffelektrode, platinisierte Graphitelek trode oder Goldelektrode. Für Dehydrogenasen wie z. B. Glucosedehydrogenase, Lactatdehydrogenase, Malatdehydrogena se, Alkoholdehydrogenase, Aldehyddehydrogenase usw. muß entweder dem Pufferstrom das Co-Enzym NAD+ zugemischt werden, oder es muß durch eine sequentielle Injektionsfolge, die durch das Vorwärts- und Rückwärtslaufen der Pumpe und das Öffnen und Schließen von Schlauchquetschventilen erreicht werden kann, ein Injektionsprofil geschaffen werden bei dem die Probe innerhalb eines Co-Enzymsegments injiziert wird. Dazu wird erst ein Flüssigkeitssegment co-enzym-haltiger Pufferlösung durch Rückwärtslaufen der Pumpe angesaugt, durch kurzes Vorwärtslaufen der Pumpe wird dieses Segment zur Hälfte am Probeneinlaß vorbeigeschoben, dann wird durch erneutes Rückwärtspumpen ein Probesegment angesaugt. Dadurch entsteht das in Abb. 2 gezeigte Konzentrationsprofil. Natür lich kann außer einem Coenzym auch ein beliebiger anderer Reaktionspartner, der für die gewünschte Nachweisreaktion benötigt wird, injiziert werden.

Beim Pumpen dieser Segmentanordnung durch das Schlauchsystem erfolgt eine Durchmischung durch kontrollierte Dispersion, so daß miteinander durchmischte Probe und Co-Enzym entweder im Nylonschlauch mit immobilisierter Dehydrogenase oder direkt in der Meßzelle am über die Arbeitselektrode gespannten Nylonnetz mit immobilisierter Dehydrogenase reagieren können. Das als Folge der enzymatischen Reaktion gebildete NADH wird dann an einer mediator-modifizierten Elektrode bei einem Potential von 0-200 mV gegen Kalomelelektrode umgesetzt. Als Elektroden kommen beispielsweise in Frage: Polypyrrol-Chinon modifizierte Platin- oder Glaskohlenstoffelektroden, media tor-modifizierte Kohlepasteelektroden als Hochdruckpreßlinge oder mediator-modifizierte Kohlepasteelektroden.

Zusätzlich kann der gewünschte Meßbereich mit dem beschriebe nen System durch die Variation der Pumpgeschwindigkeit und des Injektionsvolumens variiert werden. Bei hoher Pumpge schwindigkeit ist die Diffusion des Substrats durch das Netz (also zu den aktiven Zentren der immobilisierten Enzymen) langsam gegen die Breite des Konzentrationsprofils der Probe. Dadurch wird das Signal kleiner und am Enzym herrscht eine virtuell kleinere Konzentration des zu messenden Substrats.

Als Folge der Kalibrierung des Gesamtsystems unter Berück sichtigung der einstellbaren Parameter können für die gleiche Enzymelektrode Kalibrierkurven verschiedenen Linearitätsbe reichs und Steigung erhalten werden. Bei Verkleinerung des Probenvolumens wird eine höhere Verdünnung durch die system immanente kontrollierte Dispersion erreicht.

Das System hat folgende Vorteile:

Der Abstand des Meßsystems vom Ort der Probenahme kann durch die variable Laufzeit der Pumpe zum Ansaugen der alten Probe nahezu beliebig groß sein.

Das System benötigt lediglich eine (genaue) Pumpe und einige Magnetventile, wogegen in einem herkömmlichen Fließinjekti onssystem mindestens zwei Pumpen und ein Injektionsventil benötigt werden.

Die Pumpe wird nie von der Probenlösung durchflossen; dadurch ist eine Verschleppung der Probe unmöglich.

Die Verdünnung erfolgt durch kontrollierte Dispersion entlang der Teflonschläuche. Aufgrund der Möglichkeit, extrem kleine Probenvolumina reproduzierbar zu injizieren (<5 µl) kann der Linearitätsbereich der enzymatischen Reaktion in weiten Bereichen verschoben werden. Durch entsprechende Vergrößerung des Injektionsvolumens können gering-konzentrierte Proben untersucht werden, und im Extremfall können quasi-stationäre Messungen zur Bestimmung des Diffusionsgrenzstromes von oxidierbaren Spezies durchgeführt werden.

Das System hat einen äußerst geringen Reagenzienverbrauch.

Durch die Art der Injektion sind nahezu beliebige Injektions profile zu realisieren. So kann durch eine kleine Modifikati on des Systems eine Abfolge Coenzym-Probe-Coenzym oder allgemein Reaktionspartner-Probe-Reaktionspartner oder Standard-Reaktionspartner-Probe-Reaktionspartner realisiert werden. Im letzteren Fall erhält man simultan in jeder Mes sung einen Kalibrierwert.

Die Enzyme können entweder an die Innenseite eines Nylon schlauches nach dessen Aktivierung, oder an aktivierte Nylon gewebe kovalent immobilisiert werden. Die Enzym-Nylon schläuche werden dann zwischen der Luftblasenfalle und einer konventionellen Meßzelle eingesetzt; das beim Durchgang der Probe durch den Enzymschlauch gebildete H₂O₂ wird an der Arbeitselektrode (Platin oder platinisierter Kohlenstoff) oxidiert. Die Enzym-Nylonnetze werden direkt über die Ober fläche der Arbeitselektrode gespannt, so daß extrem kurze Diffusionswege bei in weiten Grenzen frei wählbarem Diffusi onswiderstand des Nylonnetzes gewährleistet werden. Diese Methode erlaubt die simultane Bestimmung mehrerer Substrate ohne gegenseitige Beeinflussung.

Die an aktiviertem Nylon immobilisierten Enzyme zeigen eine außergewöhnlich hohe Aktivität bei gleichzeitig guter Lang zeitstabilität.

Die Steuerung der Anlage erfolgt interaktiv mittels eines unter Microsoft Windows 3 × laufenden Programms. Die Kali brierkurve wird automatisch erstellt; die Meßwerte werden aus den Peakhöhen, die automatisch erkannt werden, berechnet und auf Diskette oder Festplatte abgespeichert, so daß eine nachvollziehbare Dokumentation möglich ist.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.

Beispiel 1 A: Aktivierung von Nylonschlauch oder Nylongewebe

Das Nylon (entweder Nylongewebe mit definierter Fadenstärke und prozentualer Öffnung oder Nylonschlauch) wird mit Dime thylsulfat aktiviert. Der Schlauch wird dazu mit Dimethylsul fat gefüllt und 4 min in ein kochendes Wasserbad eingetaucht. Die Nylonnetze werden in einem Glaskölbchen in Dimethylsulfat für eine definierte Zeit, die optimiert wurde bezüglich der maximalen Enzymbeladung bei höchstmöglicher Netzstabilität, in ein Wasserbad mit kochendem Wasser eingetaucht.

Die Reaktion wird durch Eintauchen des Schlauches bzw. des Kölbchens in Eiswasser gestoppt. Das Dimethylsulphat wird aus dem Schlauch bzw. Kölbchen gespült und das aktivierte Nylon wird mit eiskaltem Methanol 30 min gespült. Dann wird 2 h mit einer Lösung aus 1,6-Diaminohexan (1,5 g/50 ml) inkubiert, dann mit 0,1 M NaCl gespült.

B: Immobilisierung von Enzymen an aktiviertem Nylon

a) Immobilisierung von Perjodat-oxidierten Glycoenzy men. Bei Glycoenzymen können die protein-gebundenen Zuckerre ste mit Perjodat unter Bildung von Aldehydfunktionen an der Enzymoberfläche oxidiert werden. Die Immobilisierung des Enzyms erfolgt dann unter Bildung von Schiff′schen Basen zwischen den Aldehydgruppen am Enzym und den Aminogruppen am aktivierten Nylon.
Dazu wird der Nylonschlauch mit Perjodat-oxidierter Glucose oxidase (1 mg/ml) gefüllt und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Die Nylonnetze werden in einer entsprechenden Enzymlösung 3 h inkubiert. Der Schlauch oder das Netz wird dann mit 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,0 gespült. Dann werden die Schiff′schen Basen mittels einer wäßrigen Lösung von NaBH₄ zu den sekundären Aminen reduziert. Es wird erneut mit Phosphat puffer gespült. Der Enzym-Nylonschlauch oder die Enzym-Nylon netze werden in Phosphatpuffer im Kühlschrank bis zum Gebrauch aufbewahrt.
b) Immobilisierung von Enzymen nach Aktivierung pro tein-gebundener Carboxylgruppen mit Carbodiimid. 10 mg/ml Glucoseoxidase wird mit 1-cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl) carbodiimid-metho-p-toluolsulphonat in 0,1 M Acetatpuffer pH 4,5 in Gegenwart 0,1 M Glucose aktiviert. Das aktivierte Enzym wird in den vorbereiteten Nylonschlauch gefüllt, oder ein Nylonnetz wird in einer aktivierten Enzymlösung für 3 h inkubiert. Der Schlauch oder das Netz wird dann mit Phosphat puffer gewaschen, und das immobilisierte Enzym wird durch Reaktion mit 2,5% Glutardialdehydrolösung (10 min) querver netzt.
c) Immobilisierung von Enzymen mit Glutardialdehyd. Der Nylonschlauch bzw. das Nylonnetz wird 30 min mit 5% Glutardialdehydlösung inkubiert, mit Phosphatpuffer gewaschen und dann mit 1 mg/ml Enzym für 3 h inkubiert. Das nicht kovalent gebundene Enzym wird durch Spülen mit 0,1 m NaCl abgewaschen. Die Schiff′schen Basen werden wie unter a) beschrieben mit NABH₄ reduziert.

Die Immobilisierungsmethode a) ist geeignet für Glycoenzyme wie Glucoseoxidase, Invertase, Peroxidase. Methode b) ist geeignet für prinzipiell alle Enzyme durch Verwendung der proteingebundenen Carboxylgruppen von Asparaginsäure, Glut aminsäure (allerdings wird Lactatoxidase durch Carbodiimid desaktiviert). Methode c) ist ebenfalls im Prinzip für alle Enzyme durch Verwendung der Lysinseitenketten einsetzbar.

Bei den Messungen wurde im allgemeinen 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,4 + 0,5 M NaCl benutzt. Im Prinzip ist aber der für das jeweilige Enzym optimale Puffer mit dem entsprechend optima len pH-Wert verwendbar, solange er keine elektrochemisch interferierende Verbindungen enthält.

Beispiel 2

Abb. 3 zeigt den Verlauf einer Glucose-Messung über 100 h mit der in Beispiel 1 beschriebenen Vorrichtung unter Verwendung eines nach Methode a) immobilisierten Glucoseoxidase-Nylon schlauchs. Die Schwankungen entsprechen den Temperaturschwan kungen zwischen Tag/Nacht und können durch eine selbstverständlich notwendige Thermostatisierung der Meßzelle und des Enzymschlauchs verhindert werden. Nach anfänglichem Verlust an Aktivität durch Auswaschen nicht kovalent gebunde nen Enzyms aus dem Nylonschlauch bleibt die Response über den Versuchszeitraum konstant. Die Schläuche wurden mehrere Monate bei Raumtemperatur gelagert; ein signifikanter Aktivi tätsverlust war nicht feststellbar.

Beispiel 3

In einer Vorrichtung mit einer 4-Elektroden enthaltenden Meßzelle 10, wobei über eine 1. Arbeitselektrode ein Glucose oxidase-Nylonnetz (Immobilisierungsmethode a)), über eine zweite ein Lactatoxidase-Nylonnetz (Immobilisierungsmethode c)) gespannt war, wurden Lösungen mittels des beschriebenen Systems untersucht, die 1 mM an Glucose, 1 mM an Lactat, 2 mM an Glucose, 2 mM an Lactat und Mischungen aus Glucose/Lactat mit je 1 mM bzw. 2 mM waren. Die Gegenwart von Glucose hatte keinen Einfluß auf die Bestimmung von Lactat und umgekehrt. Abb. 4 zeigt den entsprechenden Versuch über einen Zeitraum von 100 h. Die Glucose bzw. Lactatsignale setzen sich zusam men aus den reinen Lösungen und den Mischungen.

Die Kalibrierkurven können durch die Fadenstärke im Verhält nis zu der Größe der Öffnungen im Netz, aber auch durch eine zusätzliche diffusionslimitierende Membran vor dem Nylonnetz im linearen Bereich beeinflußt werden. Abb. 5 zeigt Kali brierkurven für Glucose erhalten mit Nylonnetzen verschiede ner Qualität. Netz1pp558 wurde zusätzlich mit einer Dialysemembran mit Ausschlußgrenze 50 000 Daltons abgedeckt.

Beispiel 4

In einem Versuch unter realistischen Bedingungen wurde die beschriebene Vorrichtung zur kontinuierlichen Überwachung einer Hefefermentation benutzt. Dabei wurde eine Arbeitselek trode mit einem Nylon-Glucoseoxidase-Netz überspannt, die zweite mit einem vergleichbaren Netz und zusätzlich mit einer Dialysemembran mit Ausschlußgrenze 50 000 Daltons. So konnte mit der einen Elektrode der niedrige Konzentrationsbereich genau erfaßt werden, mit der zweiten die höhere Konzentrati on, bei denen die erste schon eine Sättigungscharakteristik aufwies. Abb. 6 zeigt den Verlauf der Fermentation mit den an beiden Elektroden erhaltenen unterschiedlichen Signalhöhen; die gute Übereinstimmung der bestimmten Konzentrationen an Glucose mit beiden Elektroden zeigt Abb. 7.

Claims

1. Vorrichtung zur kontinuierlichen Bestimmung von Sub straten von Oxidoreduktasen mit O₂, NAD oder NADP als Akzeptor oder künstlichen Redoxmediatoren gekennzeichnet durch einen Standardlösungssammler (1), der durch eine Rohr leitung (2) mit einem Sterilfilter (3) und von dort weiter mit einer Probenzuführung (4) verbunden ist, durch eine Mehrwegeverbindung (5), die über Rohrlei tung (6) mit der Rohrleitung (2) zwischen Sammler (1) und Sterilfilter (3) verbunden ist, durch einen Puf ferlösungsbehälter (7), der über eine die Pumpe (8) enthaltene Rohrleitung (9) mit der Mehrwegeverbindung (5) verbunden ist, durch eine Meßzelle (10), die mit der Mehrwegeverbindung (5) über eine Rohrleitung (11) verbunden ist, die eine Luftblasenfalle (12) enthält und innerhalb der Verbindung zwischen Arbeitselektrode in der Meßzelle (10) und der Mehrwegeverbindung (5) mindestens eine träger fixierte Oxidoreduktase an geordnet ist, einen Abfallösungsbehälter (13), der über Rohrleitungen (14) und (14a) mit der Mehrwegever bindung (5) bzw. der Meßzelle (10) verbunden ist, durch Sperrventile V zwischen jedem von mehreren Standardlösungsbehältern (15) und dem Standardlösungs sammler (1), in jeder der in die Mehrwegeverbindung (5) eintretenden Leitungen (6, 11 und 14), und zwi schen Sterilfilter (3) und der Einmündung von Rohrlei tung (6) in Rohrleitung (2), sowie durch eine Steuervorrichtung, welche die Pumpe (8) und alle Ventile nach vorgegebenem Arbeitsschema steuert.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Rohrleitungen (2, 6, 9, 11, 14 und 14a) ganz oder teilweise aus Kunststoff, insbesondere in Schlauchform, bestehen.

3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß Rohrleitung (11) mindestens einen Kunststoff schlauch enthält an dessen Innenseite Oxidoreduktase kovalent fixiert ist.

4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Meßzelle (10) mindestens eine Arbeitselektro de, eine Referenzelektrode und eine Gegenelektrode sowie einen Potentiostaten, welcher der oder den Arbeitselektroden ein konstantes Arbeitspotential aufprägt, enthält.

5. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß über dem Arbeitselektrode in der Meßzelle (10) ein Kunststoffnetz mit kovalent fixierter Oxidoreduktase angebracht ist.

6. Vorrichtung nach Anspruch 3 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Kunststoffträger der Oxidoreduktase aus Poly amid besteht.

7. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Arbeitselektrode bei H₂O₂-bildenden oder O₂ verbrauchenden Oxidoreduktasen eine Platinelektrode, platinisierte Glaskohlenstoffelektrode, platinisierte Graphitelektrode oder Goldelektrode ist.

8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Arbeitselektrode bei NADH oder NADPH bildenden Oxidoreduktasen eine mediator-modifizierte Elektrode mit einem Potential von kleiner 200 mV gegen Kalo melelektrode ist.

9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Arbeitselektrode eine Polypyrrol-Chinon modi fizierte Platinelektrode oder -Glaskohlenstoffelektro de oder eine mediator-modifizierte Kohlepasteelektrode ist.

10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Meßzelle (10) einen photometrischen oder fluorometrischen Detektor enthält.

11. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß durch sequentielle Schaltung der Ventile bei kontrollierter Pumpengeschwindigkeit und Richtung, beliebige Sequenzen von Probe, Reaktionspartnern, Standardlösungen einstellbar sind.