DE4209988A1

DE4209988A1 - Endotoxinadsorber und verfahren zu seiner herstellung

Info

Publication number: DE4209988A1
Application number: DE4209988A
Authority: DE
Inventors: Dieter Dr Falkenhagen; Steffen Dr Med Mitzner; Jana-Maria Dr Med Schneidewind
Original assignee: SCHNEIDEWIND JANA MARIA DR MED
Current assignee: SCHNEIDEWIND JANA MARIA DR MED
Priority date: 1991-04-23
Filing date: 1992-03-27
Publication date: 1993-03-04

Description

Die Erfindung betrifft einen Adsorber zur Entfernung von bakteriellen Endotoxinen aus Flüssigkeiten, wäßrigen, kristallinen und kolloidalen Lösungen, Emulsionen oder Mischungen, aus Körperflüssigkeiten (wie etwa Blutplasma oder Vollblut) sowie ein Verfahren zu seiner Herstellung. Die Erfindung gehört zum Gebiet der Medizin, Biomedizin, Biomedizintechnik, Pharmazie, biologischen und medizinischen Forschung, der Lebensmitteltechnologie und des Umweltschutzes.

Endotoxine sind Lipopolysaccharidmoleküle aus der äußeren Zellwand gram-negativer Bakterien. Sie werden beim Zerfall der Bakterien freigesetzt. Bei Kontakt zu Zellen des Monozyten-Makrophagen-Systems werden verschiedene Mediatoren und reaktive Verbindungen durch diese Zellen abgegeben (Interleukine, TNF, PAF, Sauerstoffradikale u. a.). Als Folge davon kann es zu schweren Störungen der Homöostase verschiedener Regelkreise und Körpersysteme kommen, wie etwa Fieber, Hypotonie, Disseminierter Intravasaler Gerinnung, Komplementaktivierung, erhöhter Vasopermeabilität, Thromozytopenie. Krankheitsbilder, bei denen Endotoxine eine pathogenetische Rolle spielen, sind z. B. die gramnegative Sepsis, der septische Schock, das Akute Leberversagen, Akute Pancreatitis, ARDS oder das Multiorganversagen. Die Letalität der genannten Erkrankungen ist durchweg sehr hoch (z. T. bis 80%). Außerdem ist eine Reihe von Nebenwirkungen von Medikamenten, von der extrakorporalen Blutreinigung (Dialyse) und anderen Behandlungsverfahren auf Endotoxine zurückzuführen, die von außen als "pyrogene Verunreinigungen" in den Körper getragen werden. Die Menschen sind die am empfindlichsten auf Endotoxine reagierende Spezies; 0,2×10^-9 g/kg KM reichen aus, um Fieber zu erzeugen.

Der Stand der Technik auf dem Gebiet der Endotoxin-Elimination bzw. der Behandlung von Zuständen mit Endotoxinämie ist gekennzeichnet durch den Einsatz von monoklonalen bzw. polyklonalen Antikörpern gegen verschiedene Epitope des Endotoxinmoleküls, Verfahren zur selektiven Dekontamination des Darms (SDD), Einsatz spezifischer und unspezifischer Affinitätsmembranen und Adsorber und die Nutzung von antiendotoxämisch wirkenden Antibiotika (Polymyxin, Neomycin). Zu Entfernung und Verhinderung von Endotoxin- Verunreinigungen können Verfahren wie die Sterilisation, das Autoklavieren, Gamma- Strahlung oder Chromschwefelsäure-Behandlung eingesetzt werden.

Die Mängel der o. g. Verfahren zur Endotoxinelimination und -inaktivierung bestehen z. B. in den hohen Kosten einer Antikörpertherapie, der relativ hohen Rate von Therapieversagen beim Einsatz von Endotoxin-Antikörpern (bedingt z. B. durch die Heterogenität der O- Antigene der Endotoxinmoleküle bzw. die Maskierung der potentiellen Bindestellen durch Bluteiweiße), der Gefahr der allergischen Gegenreaktion des Körpers auf die Antikörper, der Gefahr der Verzögerung bzw. des Ausbleibens der Neutralisation von Endotoxin- Antiendotoxin-Komplexen sowie der Reliberalisierung von Endotoxinen und Immunkomplexen durch einen Phagozytosedefekt der Freßzellen des Patienten mit oben genannten Erkrankungen.

Die SDD greift massiv in die Zusammensetzung der Darmflora ein und kann zu Fehlbesiedlungen durch Bakterien und/oder Pilze führen. Die antiendotoxische Wirkung bleibt dabei zweifelhaft, da durch die Abtötung von gram-negativen Bakterien erst Endotoxine freigesetzt werden, die dann in das Blut übertreten können. Die besonders wichtige Neutralisierung in und an der Darmschleimhaut erfolgt nur unvollständig. Unspezifische Adsorbentien bzw. Affinitätsmembranen zur Endotoxinbindung fallen durch mangelnde Selektivität auf wie z. B. Aktivkohle-Adsorber (A. S. PEGUES et al.: Internat. J. Art. Organs 2 (1979) 153). Die Selektivität der Endotoxin-Anbindung ist wegen der mangelnden Spezifität gering und die Wiederablösung wahrscheinlich.

Spezifische Adsorbentien liegen in Form von Polymyxin B-Adsorbern vor (M. UMEDA et al.: Biomat., Art. Cells, Art. Org. 18 (1990) 4, 491-497). Polymyxin B (PMB) ist ein nephro- und neurotoxisches Antibiotikum. Es besteht die Gefahr der Ablösung von PBM-Molekülen und der Einschwemmung in die Blutbahn des Patienten. Der PMB-Adsorber verfügt über eine schlechte Biokompatibilität aufgrund der hohen Anzahl positiver Oberflächenladungen (dadurch massive Proteinbeschichtung, Zelladhäsion, Komplementaktivierung).

Es gibt andere Endotoxinadsorber auf Basis von Polysacchariden, an die als endotoxinbindendes Element Diethylaminoethylgruppen (DEAE) (US-PS 38 97 309) oder andere stickstoffhaltige Gruppen (US-PS 43 81 239) gekoppelt sind. Nachteile dieser Adsorber ergeben sich aus der teilweise vorhandenen Blutunverträglichkeit der Oberflächensubstituenten. Weiterhin beschrieben wurden Endotoxinadsorber unter Verwendung von Aminen (EP-PS 03 08 239, EP-PS 03 33 474), von an Agarose gekoppeltem Protamin (I. M. HELANDER: Febr. 1987, 51-55), sowie unter Verwendung von Surfactantmolekülen (US-PS 44 12 985). Auch hier treffen die Nachteile der mangelnden Selektivität und zu geringen Effektivität der Adsorber zu.

Das der in den Ansprüchen dargelegten Erfindung zugrundeliegende Problem besteht darin, einen Adsorber zur Bindung von Endotoxinen aus Flüssigkeiten, wäßrigen, kristallinen und kolloidalen Lösungen, Emulsionen oder Mischungen sowie Körperflüssigkeiten (z. B. Plasma, Blut) zu entwickeln, der eine hohe Endotoxin- Bindungskapazität und Selektivität besitzt, biokompatibel ist und kostengünstig auch großindustriell herstellbar ist.

Erfindungsgemäß wird das Problem dadurch gelöst, daß als Endotoxinadsorber poröse Träger auf Basis von Celluloseprodukten oder anderen geeigneten Trägermaterialien verwendet werden, die Polyethylenimin als Ligand gebunden enthalten. Das Polyethylenimin kann dabei adsorptiv, ionisch oder kovalent an der inneren oder äußeren Oberfläche des porösen Trägermaterials (z. B. Perlcellulose) gebunden sein. Der Adsorber ist weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß die Menge an Polyethylenimin im Endprodukt 1 bis 25 Masse-%, bezogen auf die Trockenmasse des Adsorbers, beträgt entsprechend einem Stickstoffgehalt von 0,3 bis 8 Masse-%. Neben anderen geeigneten Trägermaterialien werden erfindungsgemäß als poröse Cellulosematerialien

1) unmodifizierte Regeneratcelluloseperlen mit Teilchengrößen von 0,1 bis 5 mm,
2) anionisch modifizierte, insbesondere Carboxyl-, Sulfat- oder Phosphatgruppen enthaltende Perlcelluloseprodukte oder auch
3) reaktive funktionelle Gruppen, wie z. B. Aldehydgruppen oder Epoxidgruppen, enthaltende Perlcelluloseprodukte eingesetzt.

Die Anwendung des Endotoxinadsorbers erfolgt im wasserfeuchten, gequollenen Zustand, wobei der Wassergehalt des Adsorbers 50 bis 95 Masse-%, vorzugsweise 80 bis 90 Masse-% beträgt.

Der erfindungsgemäße Endotoxinadsorber ist besonders vorteilhaft anwendbar bei der selektiven Entfernung von Endotoxinen aus Flüssigkeiten, wäßrigen, kristallinen oder kolloidalen Lösungen, Emulsionen oder Mischungen, Körperflüssigkeiten, wie z. B. Blut oder Plasma, durch ein Kontaktieren in der Weise, daß die endotoxinhaltige Flüssigkeit mit dem erfindungsgemäßen Endotoxinadsorber bei 20 bis 37°C eine Minute bis drei Stunden lang in Kontakt gebracht wird und die endotoxinfreie Flüssigkeit vom Adsorber abgetrennt wird.

Eine vorteilhafte Herstellung der Erfindung ist in den Patentansprüchen 7 bis 10 angegeben. Danach erfolgt die Herstellung in einfacher Weise dadurch, daß die genannten porösen Trägermaterialien (i. d. R. Celluloseprodukte) mit einer wäßrigen 0,1 bis 20masse-%igen Lösung von Polyethylenimin eine Minute bis sechs Stunden bei 0 bis 50°C behandelt werden und anschließend überschüssiges bzw. nicht gebundenes Polyethylenimin durch Absaugen und Waschen mit Wasser bzw. physiologischer NaCl-Lösung entfernt wird. Durch Versuche wurde gefunden, daß das adsorptiv oder ionisch gebundene Polyethylenimin durch Wasser, NaCl-Lösung oder andere gepufferte wäßrige Lösungen nicht mehr von dem erfindungsgemäßen Adsorber entfernt werden kann. Außerdem besitzen diese Produkte eine gute Selektivität und Biokompatibilität, wie in Blutkontaktstudien gezeigt werden konnte. Der Adsorber läßt sich ohne Beeinträchtigung seiner vorteilhaften Eigenschaften autoklavieren und aufgrund seiner guten mechanischen Stabilität auch abriebfrei behandeln. Bei der Anwendung in Säulen oder Plasmaperfusionseinrichtungen zeigt er ein stabiles Laufverhalten. Er läßt sich regenerieren und mehrfach einsetzen.

Der erfindungsgemäße Adsorber wurde mit endotoxinhaltigen wäßrigen und kristallinen Lösungen sowie Plasma im batch-Verfahren und unter Kreislaufbedingungen getestet. Die nachfolgenden Beispiele dienen zur näheren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

100 g makroporöse, wasserfeuchte Perlcellulose mit einem Cellulosegehalt von 10 Masse-% und einem mittleren Teilchendurchmesser von 0,2 mm werden mit 200 ml einer 10masse-%igen Polyethyleniminlösung vermischt und 60 min bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird die behandelte Perlcellulose auf einer Fritte abgesaugt und fünfmal mit je 200 ml 1%iger NaCl-Lösung und fünfmal mit je 200 ml Wasser gewaschen. Der erhaltene Adsorber wies einen Stickstoffgehalt von 0,8 Masse-% auf, bezogen auf die Adsorbertrockenmasse. Zur Bestimmung der Endotoxinbindung wurde zunächst der Adsorber wie folgt aktiviert.

2 g des Adsorbers wurden mit 10 ml NaOH in einer Konzentration von 500 mmol/l 20 min inkubiert und anschließend mit Wasser solange gespült, bis ein neutraler pH-Wert erreicht wurde; dann wurden die gleichen 2 g des Adsorbers mit 10 ml HCl in einer Konzentration von 500 mmol/l 20 min inkubiert und anschließend mit Wasser solange gewaschen, bis ein neutraler pH-Wert erreicht war. Es schloß sich eine fünfmalige Spülung mit pH-neutralem Puffer an. Die Reaktionstemperatur betrug konstant 21°C.

Bei den Versuchen zur Endotoxinadsorption wurde sowohl im batch-Versuch als auch im Kreislauf ein Verhältnis-Adsorber zu endotoxinhaltiger Lösung von 1 : 10 gewählt. Die Reaktionstemperatur betrug konstant 37°C. Oben beschriebener Adsorber hatte bereits nach 30 min Inkubation mit der endotoxinhaltigen Lösung (Wasser, Plasma) von der Ausgangskonzentration von 100 ng/ml Lösung 98% adsorptiv gebunden. Zum quantitativen Endotoxinnachweis wurde der handelsübliche Limulus-Amöbocyten-Lysat-Test verwendet.

Beispiel 2

100 g wasserfeuchte Perlcellulose mit einem Cellulosegehalt von 15 Masse-% und einem mittleren Teilchendurchmesser von 2,5 mm wurden wie in Beispiel 1 mit Polyethylenimin behandelt und gewaschen. Der Stickstoffgehalt in der resultierenden Probe betrug 2,6 Masse-% bezogen auf die Trockenmasse.

Die Untersuchung des Adsorbers auf Endotoxinbindung erfolgte wie in Beispiel 1 beschrieben. Nach 90 min Reaktionszeit waren bei einer Ausgangskonzentration von 100 ng/ml Lösung 99% des enthaltenen Endotoxins gebunden (Ausgangskonzentration 100 ng/ml).

Beispiel 3

100 g abgesaugte, wasserfeuchte Perlcellulose mit einem Carboxylgehalt von 1,2 meq/g Trockensubstanz, einem Wassergehalt von 92 Masse-% und einer mittleren Teilchengröße von 0,2 mm werden mit 200 ml einer 5masse-%igen Polyethyleniminlösung vermischt und 360 min bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird das Produkt wie unter Beispiel 1 beschrieben gewaschen und auf Endotoxinbindung untersucht. Der auf die Trockenmasse bezogene Stickstoffgehalt betrug 5,8 Masse-%. Bei den Testungen zur Endotoxinadsorption ergab sich bereits nach 15 min Inkubationszeit eine Bindungsrate von 99%.

Beispiel 4

100 ml abgesaugte, wasserfeuchte, vernetzte, perlförmige Carboxymethylcellulose mit einem Substitutionsgrad von 0,7 und einer mittleren Teilchengröße von 3 mm wird wie in Beispiel 1 mit Polyethylenimin behandelt und auf Endotoxinbindung untersucht. Der auf die Trockenmasse bezogene Stickstoffgehalt betrug 8,9 Masse-%. Bei einer Endotoxinausgangskonzentration von 100 ng/ml waren nach 90 min Inkubationszeit 96% des Endotoxins adsorbiert.

Claims

1. Endotoxinadsorber in Form von Hohlfasern und daran gekoppelten Liganden, dadurch gekennzeichnet, daß an poröse Trägermaterialien in Form von Flachmembranen, Perlen oder anderen geeigneten Formen, beispielsweise aus Polysacchariden, Cellulose, Polysulfon, Polyacrylnitril, Polyamid als funktioneller Ligand Polyethylenimin adsorptiv, ionisch oder kovalent an die innere und/oder äußere Oberfläche des Trägermaterials gebunden ist.

2. Endotoxinadsorber nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß an eine wassergequollene, poröse, perlförmige Polysaccharidmatrix 0,1 bis 25 Masse-% Polyethylenimin, bezogen auf die Trockenmasse, als Ligand gebunden sind.

3. Endotoxinadsorber nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Celluloseprodukt unmodifizierte Regeneratcellulose ist und das Polyethylenimin adsorptiv gebunden ist.

4. Endotoxinadsorber nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Celluloseprodukt ein anionisches Cellulosederivat ist, welches Carboxyl-, Sulfat- oder Phosphatgruppen enthält, und an das Polyethylenimin ionisch gebunden ist.

5. Endotoxinadsorber nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß Polyethylenimin über reaktionsfähige funktionelle Gruppen, insbesondere Dialdehyd- und Epoxi-Gruppen an die Cellulosematrix gekoppelt ist.

6. Endotoxinadsorber nach Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Größe der Perlen 0,1 bis 5 mm, vorzugsweise 0,5 bis 3 mm, beträgt und der Adsorber 50 bis 95%, vorzugsweise 80 bis 90%, Wasser enthält.

7. Verfahren zur Herstellung eines Endotoxinadsorbers nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß poröse, perlförmige Celluloseprodukte mit einer 0,1 bis 20masse-%igen Lösung von Polyethylenimin eine Minute bis sechs Stunden bei 0 bis 50°C behandelt werden und anschließend ungebundenes Polyethylenimin durch Absaugen und Auswaschen mit Wasser und/oder 0,5 bis 5masse-%iger Kochsalzlösung entfernt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß als perlförmiges Celluloseprodukt makroporöse Regenerationscelluloseperlen mit einer Teilchengröße von 0,1 bis 5 mm und einem Wassergehalt von 50 bis 95 Masse-% eingesetzt werden.

9. Verfahren nach Anspruch 7 und 8, dadurch gekennzeichnet, daß als perlförmiges Celluloseprodukt anionische Perlcellulosederivate mit Carboxyl-, Sulfat- oder Phosphatgruppen eingesetzt werden.

10. Verfahren nach Anspruch 7 und 8, dadurch gekennzeichnet, daß als perlförmiges Celluloseprodukt Celluloseperlen verwendet werden, die reaktionsfähige Aldehyd- oder Epoxigruppen aufweisen.