WO2000008463A2 - Immunadsorber zur entfernung von endotoxinin - Google Patents

Immunadsorber zur entfernung von endotoxinin Download PDF

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Definitions

  • Immunoadsorbents for removing endotoxins from liquids process for their preparation and use
  • Endotoxins are complex lipopolysaccharide molecules (LPS) that occur in the outer cell wall of Gramnegattver bacteria and are released when they decay.
  • LPS lipopolysaccharide molecules
  • the LPS is bound to a serum protein (LBP) and subsequently taken up via LPS receptors (CD 14) of the monocytes / acrophages and dendritic cells, the CD14 + positive cells being activated and massively different cytokines (IL-1, TNFa, Release IL-6, IL-8).
  • LPS-induced cytokine release leads, supported by the bacteria-induced complement activation, to life-threatening fever (therefore the LPS molecules are also called pyrogens), diffuse intravascular blood coagulation with the release of further "shock factors” (PAF, prostaglandins), changes in vascular permeability consequent loss of fluid in the tissues and consecutive drop in blood pressure, circulatory collapse and hemorrhagic necrosis and finally over multiple organ failure to death.
  • Diseases in which bacterial endotoxemia plays a predominant role are gram-negative sepsis, septic shock, acute liver failure, acute pancreatitis and acute respiratory distress syndrome (ARDS), although these diseases are still characterized by an extraordinarily high letai '' are characterized (up to 80%).
  • the endotoxins do not only enter the body through a bacterial invasion, but can also be applied exogenously as "pyrogenic" contamination with infusion solutions, infusion sets, biomaterials and with genetically engineered (bacterial) pharmaceutical products.
  • endotoxin level does not exceed 0.5 ng / ml, if there is no destruction of active substances in solution and if none for endotoxin elimination and or - Inactivating substances remain in solution as bio-incompatible impurities.
  • a decisive disadvantage of all of these methods is the inadequate efficiency and lack of specificity of the elimination, which in part also contains others in the solutions because they act nonspecifically, eliminates substances or at least reduces their solution concentration.
  • the materials previously patented for endotoxin binding are also characterized in that an exchange between free and bound endotoxin cannot be ruled out, so that the elimination cannot fall below a limit value.
  • the inadequate specificity of the endotoxin binding can be overcome by using antibodies against LPS which are directed against the cross-species “core polysaccharides” and / or the lipid A portion of the endotoxin molecules, and are equipped with a sufficiently high avidity, used in a sufficiently high concentration, Efficiently and specifically remove endotoxin from the solutions presented, polyclonal antibodies which can be used for this purpose are usually obtained from mammals, and it is known to the person skilled in the art that this is limited in the case of LPS antibodies, since endotoxins are extremely toxic to mammals, and moreover they are have a low intensity and cross-species anti-LPS antibodies are only induced in traces.
  • Hybridoma cells that synthesize monoclonal anti-LPS antibodies were successfully established. So far, various obstacles have stood in the way of their extensive use. In earlier patents, the expected high specificity was recognized without a doubt (DE 4113602, DE 4209988), but primarily the high costs were criticized as disadvantageous. The large-scale use of monoclonal antibodies, which are obtained as ascites in mice and other small rodents, is also not feasible for animal welfare reasons, although these antibodies are most likely to be present in the necessary concentrations. Antibody production using hybridomas in cell culture primarily causes the high costs, since the antibodies have to be enriched (concentrated) and the cell culture requires absolute sterile conditions either under serum-free conditions or in LPS-free serum.
  • the result of an artificial immunization can be high specific Antibody concentrations in plasma and egg yolk can be achieved. If the antibody production is carried out using SPF chickens, both the required concentrations of antibodies and the necessary amount can also be produced inexpensively for medical use.
  • a disadvantage of a medical application of “mammal” antibodies is that the human complement system is activated in serum or plasma. Activated complement can, under certain circumstances, cause serious diseases. This property is bound to the Fc receptor of the immunoglobulins, so that either these antibodies can only be used as Fab fragments or the Fc part of the antibody is bound to a carrier material and thus biologically inactivated (DE 19653669) .At least the use of Fab fragments makes the process considerably more expensive.
  • the invention was therefore based on the object of developing immunoadsorbents for removing endotoxins from liquids which do not have the disadvantages of the prior art described.
  • An essential component of the immunoadsorbents according to the invention are specific avian immunoglobulins of the IgY type which, in addition to a surprisingly found extraordinary avidity and overall specificity for endotoxins, do not activate the human complement system.
  • the immunoadsorber according to the invention is particularly suitable for removing acid-sensitive and alkali-sensitive, heat-sensitive, radiation-sensitive solutions with or without serum from LPS. Furthermore, it is used in genetically engineered pharmaceuticals or similar products that use gram-negative E. coli strains as a production source and therefore always a potential contamination with LPS may have displayed. In addition, the use in cleaning solutions with low final concentrations of active ingredient should be particularly emphasized because of the high specificity and avidity of the antibodies.
  • the avian antibodies are preferably covalently but also adsorbently coupled to natural or synthetic carrier materials or bound to them via spacers or linkers in such a way that no antibody leakage (diffusion of the antibody after the washout phase) is detectable.
  • the carrier materials can be used as particles for batch-type cleaning, as columns for large-volume cleaning or in the form of membranes (hoses, hollow fibers).
  • LPS 25 ⁇ g / ml LPS (E. coli J5) is added to PBS.
  • 1 ml LPS-PBS is mixed with 1 ml IgY-Sepharose and incubated for 1 h at room temperature with gentle stirring. After this time, the content of LPS in the buffer and bound to the gel is determined after separation using polyacrylamide gel electrophoresis ( Figures 1 and 2). It can be seen that homologous LPS was removed quantitatively from the buffer.
  • LPS of the following species were dissolved in PBS at a concentration of 25 ⁇ g / ml each: E. coli J5, E. coli 0111: B4, Salmonella enteritidis, Shigella fiexnerie and Bordetella bronchiseptica.
  • each of LPS-PBS is mixed with 1 ml of IgY-Sepharose against LPS from E. coli J5 and incubated for 1 h at room temperature with gentle stirring. After this time, the content of LPS in the buffer and bound to the gel is determined after separation by means of polyacrylic gel electrophoresis. LPS of heterologous origin is also removed quantitatively from the buffer.
  • IgY gel 1 ml is placed in a mini column and equiibrated by alternative washing with acidic and neutral PBS.
  • LPS LPS
  • E.coli J5 1 ml of LPS (E.coli J5) was added to 10 ml of donor plasma.
  • the plasma treated in this way was passed 5 times over the column.
  • the LPS content in the plasma was determined with the Limulus test to be ⁇ 50 pg / ml.

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Abstract

Die Erfindung beschreibt einen Immunadsorber zum spezifischen Entfernen bakterieller Endotoxine aus Flüssigkeiten, wäßrigen, kristallinen und/oder kolloidalen Lösungen, Emulsionen und Körperflüssigkeiten (wie beispielsweise, Blut, Plasma, Lymphe, Cerebrospinalflüssigkeit) und/oder aus Körperflüssigkeiten gewonnene Flüssigkeiten (wie beispielsweise Serum, Dialysat). Die Endotoxine werden (in vitro, ex vivo oder in situ) an viäre anti-Endotoxinantikörper gebunden und somit aus der Flüssigkeit eliminiert. Gleichzeitig wird ein Verfahren zur Herstellung des Immunadsorbers beschrieben. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Medizin, Veterinärmedizin, Biomedizin, Biomedizintechnik, Zahnmedizin, Pharmazie, die biologische, pharmazeutische und medizinische Forschung, die Lebensmittelherstellung und gegebenenfalls der Umweltschutz.

Description

Immunadsorber zur Entfernung von Endotoxinen aus Flüssigkeiten, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung
Endotoxine sind komplexe Lipopolysaccharidmoieküle (LPS), die in der äusseren Zθllwand gramnegattver Bakterien vorkommen und bei deren Zerfall freigesetzt werden. In vivo wird das LPS an ein Serumprotein (LBP) gebunden und nachfolgend via LPS-Rezeptoren (CD 14) der Monozyten/ akrophagen und dendritischen Zellen aufgenommen, wobei die CD14+ positiven Zellen aktiviert werden und massiv verschiedene Zytokine (IL-1, TNFa, IL-6, IL-8) freisetzen. Die LPS-induzierte Zytokinfreisetzung führt, unterstützt durch die Bakterien-induzierte Komplementaktivierung zu lebensbedrohendem Fieber (daher werden die LPS- Moleküle auch als Pyrogene bezeoichnet), diffuser intravasaler Blutgerinnung mit Freisetzung weiterer „Schockfaktoren'' (PAF, Prostaglandine), Änderung der Gefäßpermeabilität mit nachfolgendem Flüssigkeitsverlust in die Gewebe und konsekutivem Blutdruckabfall, Kreislaufzusammenbruch und hämorrhagischen Nekrosen und schlußendlich über ein Multiorganversagen zum Tod. Krankheitsbilder, bei denen die bakterielle Endotoxämie eine prädominante Rolle spielt, sind die gramnegative Sepsis, der septische Schock, das akute Leberversageπ, die akute Pankreatitis und das akute respiratorische Distress-Syndrαm (ARDS), wobei diese Erkrankungen auch heute noch durch eine außerordentlich hohe Letai'rtät (bis zu 80%) charakterisiert sind. Die Endotoxine gelangen jedoch nicht nur durch einen bakterielle Invasion in den Körper, sondern können auch als „pyrogene'' Verunreinigung mit Infusionslösungen, Infusionsbestecken, Biomaterialien und mit gentechnisch (bakteriell) erzeugten pharmazeutischen Produkten exogen appliziert werden.
Um Endotoxinverunreinigungen zu entfernen, werden Verfahren, wie die Hitzesterilisation, Dampfsterilisation, Bestrahlen mit γ-Strahlen, die Behandlung mit Säuren oder Laugen (z.B. US 3644175 und US 3659027), die Adsorption an uπspezifisch bindende Substanzen (wie Aktivkohle, lonenaustauschemarze, Polymyxin B, DEAE (US 3897309) oder andere stickstoffhaltige Gruppen (US 4381239), A ine (EP 0308239, EP 0333474, DE 19648954), Polyäthylenimin (DE 4209988), und Surfaktantmoleküle (US 4412985)) angewandt. Der größte Teil dieser Verfahren ist ausreichend, wenn der verbleibende Endotoxinspiegel 0,5 ng/ml nicht überschreitet, wenn keine Zerstörung von in Lösung vorhandenen Wirksubstanzen zu verzeichnen ist, und wenn keine für die Endotoxinelimination und oder - inaktivierung eingesetzten Substanzen als bioinkompatible Verunreinigung in Lösung verbleiben. Ein entscheidender Nachteil aller dieser Verfahren besteht in der unzureichenden Effizienz und fehlenden Spezifität der Elimination, die zum Teil auch andere in den Lösungen enthaltenen, weil unspezifisch wirkend, Substanzen eliminiert oder zumindest deren Lösungskonzentration reduziert. Die bisher für die Endotoxinbindung patentierten Materialien sind ausserdem dadurch charakterisiert, daß ein Austausch zwischen freiem und gebundenem Endotoxin nicht ausgeschlossen werden kann, so daß die Elimination einen Grenzwert nicht unterschreiten kann.
Die unzureichende Spezifität der Endotoxinbindung kann durch den Einsatz von Antikörpern gegen LPS überwunden werden, die gegen die speziesübergreifenden „Core Polysaccharide" und/oder den Lipid A-Anteil der Endotoxinmoleküle gerichtet sind, und mit ausreichend hoher Avidität ausgestattet, in ausreichend hoher Konzentration eingesetzt, Endotoxin effizient und spezifisch aus den vorgelegten Lösungen entfernen. Dafür einsetzbare polyklonale Antikörper werden üblicherweise von Säugetieren gewonnen. Dem Fachmann ist bekannt, daß dies im Falle von LPS- Antikörpern auf Grenzen stößt, da Endotoxine für Säuger außerordentlich toxisch sind, sie darüber hinaus auch nur eine geringe Aπtigenität aufweisen und speziesübergreifende anti-LPS-Antikörper nur in Spuren induziert werden.
Es gelang die Etablierung von Hybridomzellen, die monoklonale anti-LPS-Antikörper synthetisieren. Ihrem umfangreichen Einsatz standen bisher verschiedene Hindemisse im Wege. In früheren Patentschriften wurde zwar die zu erwartende hohe Spezifität zweifelsfrei anerkannt (DE 4113602, DE 4209988) aber vorrangig die hohen Kosten als nachteilig bemängelt. Der großtechnische Einsatz monokloπaler Antikörper, die als Ascites in Mäusen und anderen Kleinnagern gewonnen werden, ist auch aus Gründen des Tierschutzes nicht zu realisieren, obwohl diese Antikörper am ehesten in den notwendigen Konzentrationen vorliegen dürften. Die Antikörperproduktion mittel Hybridoms in Zellkultur bedingt vorrangig die hohen Kosten, da die Antikörper angereichert (konzentriert) werden müssen und die Zellkultur absolute Sterilbedingungen entweder unter serumfreien Bedingungen oder in LPS-freien Serum erfordert.
Erstaunlicherweise vertragen Vögel große Mengen von LPS ohne klinische Reaktion. Im Ergebnis einer künstlichen Immunisierung können hohe spezifische Antiköφerkonzentrationen im Plasma und Eidotter erzielt werden. Wird die Antikörpeφroduktion unter Verwendung von SPF-Hühnern durchgeführt, können sowohl die erforderlichen Konzentrationen an Antikörpern, als auch die notwendige Menge kostengünstig auch für eine medizinische Anwendung hergestellt werden.
Nachteilig für eine medizinische Anwendung von „Säugetier"-Antiköφern ist. daß in Serum oder Plasma die Aktivierung des menschlichen Komplementsystems erfolgt. Aktiviertes Komplement kann unter bestimmten Umständen schwere Erkrankungen hervorrufen. Diese Eigenschaft ist an den Fc-Rezeptor der Immunglobuline gebunden, so daß entweder diese Antikörper nur als Fab-Fragmente eingesetzt werden können oder der Fc-Teil des Antiköφers an ein Trägermaterial gebunden und damit biologisch inaktiviert wird (DE 19653669). Zumindest die Verwendung von Fab-Fragmeπten verteuert das Verfahren beträchtlich.
Der Erfindung lag deshalb die Aufgabe zugrunde, Immunadsorber zur Entfernung von Endotoxinen aus Flüssigkeiten zu entwickeln, die die Nachteile des beschriebenen Standes der Technik nicht aufweisen.
Die Erfindung wird gemäß den Patentansprüchen 1, 7 und 9 realisiert. Die Unteransprüche sind Vorzugswarianten. Wesentlicher Bestandteil der erfindungsgemäßen Immunadsorber sind spezifische aviäre Immunglobuline vom Typ IgY, die neben einer überraschend festgestellten außerordentlichen Avidität und übergreifenden Spezifität zu Endotoxinen das menschliche Komplementsystem nicht aktivieren.
Die beschriebene Serospezifität von monoklonaien Antikörpern gegen LPS, erlauben ausschließlich die sehr selektive Elimination definierter LPS-Moleküle. Durch die Verwendung von Antigenen gegen die speziesübergreifende „Core-Polysaccharide" und/oder den Lipid-A-Anteil des Endotoxinmoleküls bei der Immunisierung der Hühner werden polyklonale Antiköφer erzeugt, die erfind ungsgemäß eine breites Spektrum von LPS-Molekülen erfassen und somit den Nachteil, der für monokloπale Antiköper beschrieben worden ist, überwinden.
Der erfindungsgemäße Immunadsorber ist besonders geeignet, säure- und laugenempfindliche, hitzesensitive, strahlenempfindliche Lösungen mit oder ohne Serum von LPS zu befreien. Weiterhin ist der Einsatz bei gentechnisch hergestellten Pharmaka oder ähnlichen Produkten, die als Produktionsquelle gramnegative E. coli- Stämmβ verwenden und deshalb immer eine potentielle Verunreinigung mit LPS aufweisen können, angezeigt. Außerdem soll der Einsatz beim Reinigen von Lösungen mit schwachen Endkonzentrationen an Wirkstoff wegen der hohen Spezifität und Avidität der Antikörper besonders hervorgehoben werden.
Die aviären Antiköφer werden vorzugsweise kovalent aber auch adsoφtiv an natürliche oder synthetische Trägermaterialien gekoppelt oder über Spacer oder Linker an diese so gebunden, daß kein Antikörperleakage (Abdiffundieren des Antikörpers nach der Auswaschphase) nachweisbar ist. Die Trägermaterialien können als Partikel für batch-type-Reiπiguπg, als Säulen für Größvolumenreinigung oder in Form von Membranen (Schläuche, Hohlfasern) eingesetzt werden.
AUSFÜHRUNGSBEISPIEL 1
Herstellung spezifischer IgY durch Immunisierung von Hühnern mit LPS: 10 Tage nach Aufstauung werden 4 Hühner mit je 100 μg LPS (Escherichia coli J5, Fa. Sigma) immunisiert. Das Antigen ist in 0,5 ml PBS gelöst und wird unmittelbar vor Immunisierung in 0,5 ml kompletten Freundschen Adjuvans dispergiert. Die Immunisierung erfolgt i.m. in 5 Depots. 3 Wochen nach der ersten Immunisierung werden die Hühner mit gleicher Antigendosis unter Verwendung inkompletten Freundschen Adjuvans erneut immunisiert. Nach weiteren 3 Wochen erfolgt eine zweite Boosterung. Ab 8. Woche nach Immunisierungsbeginn werden die Eier für die Gewinnung spezifischer IgY gesammelt. Dazu wird das Eidotter präpariert und die darin enthaltenen Antikörper nach mehreren Gefrier-Tau-Zyklen durch fraktionierte Fällung gewonnen. Pro Dotter können zwischen 20 und 50 mg IgY präpariert werden, 5 - 10 mg sind üblicherweise spezifische Antikörper.
Kopplung an CNBr-Sepharose (Fa. Pharmacia):
10 mg spezifischer Antikörper werden nach Vorschrift des Herstellers an 5 ml CNBr- Sepharose gekoppelt.
Entfernung von LPS aus Puffer (Batch-Verfahreπ):
PBS wird mit 25 μg/ml LPS (E. coli J5) versetzt. 1 ml LPS-PBS wird mit 1 ml IgY- Sepharose gemischt und für 1 h bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren inkubiert. Nach dieser Zeit wird der Gehalt an LPS im Puffer und am Gel gebunden nach Auftrennung mittels Polyacrylamidgel-Elektrophorese bestimmt (Abbildungen 1 und 2). Es ist ersichtlich, daß homologes LPS quantitativ aus dem Puffer entfernt wurde.
AUSFÜHRUNGSBEISPIEL 2
10 mg spezifische Antiköφer wurden nach Vorschrift des Herstellers an 5 ml Affi- Prep Hz Gel (Fa. BIO-RAD) gekoppelt.
LPS folgender Spezies wurden in einer Konzentration von je 25 μg/mi in PBS gelöst: E. coli J5, E. coli 0111:B4, Salmonella enteritidis, Shigella fiexnerie und Bordetella bronchiseptica.
Je 1 ml LPS-PBS wird mit 1 ml IgY-Sepharose gegen LPS von E.coli J5 gemischt und für 1 h bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren inkubiert. Nach dieser Zeit wird der Gehalt an LPS im Puffer und am Gel gebunden nach Auftrennung mittels Polyacryla idgel-Elektrophorese bestimmt. Auch LPS heterologer Herkunft wird quantitativ aus dem Puffer entfernt.
AUSFÜHRUNGSBEISPIeL 3
5 ml ONB-Sepharose 4FF (39 μmol/ml Gel) wird aus Aceton in Wasser übertragen und mit 5 ml IgY-Lösung (22 mg/ml) vermischt. Der pH wird auf 3,0 eingestellt und die Suspension für 1 h bei Raumtemperatur leicht bewegt. Nach dem Koppeln wird das Gel gewaschen und unter Verwendung von 1 M Ethanolamin in 0,1 m Boratpuffer geblockt. Nach erneutem Waschen wird das Gel für 3 d in Boratpuffer (pH 8,3) leicht bewegt. Nach alkalische Hydrolyse konnte eine gekoppelte Proteinkonzentration von 12 mg/ml Gel ermittelt werden.
1 ml IgY-Gel wird in eine Minisäule verbracht und durch alternatives Waschen mit saurem und neutralem PBS equiiibriert.
10 ml Spenderplasma wurden mit 1 μg LPS (E.coli J5) versetzt. Das so behandelte Plasma wurde 5 mal über die Säule geleitet. Nach dieser Behandlung wurde der LPS-Gehait im Plasma mit dem Limulus-Test mit < 50 pg/ml bestimmt.

Claims

Patentansprüche:
1. Immunadsorber zur Entfernung von Endotoxinen aus Flüssigkeiten gekennzeichnet durch Trägermaterialien aus organischen oder synthetischen Polymeren mit gebundenen Antiköφem, die gegen Endotoxine gerichtet sind.
2. Immunadsorber nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Aπtiköφer aviäre Antiköφer des Typs IgY sind.
3. Immunadsorber nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Antiköφer überwiegend gegen die spezies übergreifende „Core Polysaccharide" und/oder den Lipid A-Anteil der Endotoxine gerichtet sind.
4. Imunadsorber nach Anspruch 1 bis 3 dadurch gekennzeichnet, daß die Antiköφer kovaient oder adsorptiv an das Trägermateriaigebunden sind.
5. Immunadsorber nach Anspruch 1 bis 4,dadurch gekennzeichnet, daß die Antiköφer über Spacer oder Linker an das Trägermaterial fixiert sind.
6. Immunadsorber nach Anspruch 1 bis 5/dadurch gekennzeichnet, daß das Trägermaterial aus Membranen oder Partikeln aus z.B. Zellulosederivaten oder Acryiaten besteht.
7. Verfahren zur Herstellung von Immunadsorbern gemäß der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß an Trägermaterialien aus organischen oder synthetischen Polymeren, Antiköφer, die gegen Endotoxine gerichtet sind, kovaient oder adsoφtiv gekoppelt werden.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Antiköφer durch Immunisierung vorzugsweise von Kleinsäugern, wie Mäuse, Ratten oder Kaninchen oder Vögeln, wie z.B. Hühnern, mit dem entsprechenden Antigen hergestellt werden.
9. Verwendung von Immunadsorbern gemäß Ansprüchen 1 bis 6 als wirksamer Bestandteil einer Vorrichtung zur Entfernung von Endotoxinen aus Flüssigkeiten, wie Blutplasma oder pharmazeutischen Zubereitungen.
0. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Immunadsorber für die Plasmapherese bei Patienten mit Endotoxämie und/oder Sepsis eingesetzt werden.
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