DE4138712A1 - Verfahren zur schnelloptimierung und gezielten qualitaetskontrolle von immunoassays aller provenienzen sowie vorrichtung zur durchfuehrung des verfahrens - Google Patents
Verfahren zur schnelloptimierung und gezielten qualitaetskontrolle von immunoassays aller provenienzen sowie vorrichtung zur durchfuehrung des verfahrensInfo
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Description
Die Erfindung bezieht sich auf die Optimierung und die Qualitätskontrolle
von Radioimmunoassays (RIA) und Immunoradiometrischen
Assays (IRMA) sowohl in flüssiger als auch an fester
Phase. Sie ist bei Einbeziehung des durchschnittlichen, relativen
Meßfehlers des nichtradioaktiven Indikators (anstelle
des Zählfehlers) auf alle nichtradioaktiven kompetitiven und
nichtkompetitiven Immunoassays und auf Bindungsstudien mit
Antikörpern übertragbar. Sie betrifft gleichermaßen Vorrichtungen
zur Durchführung des Verfahrens.
Anwendungsgebiete der Erfindung sind die medizinische und veterinärmedizinische
Diagnostik, die Nahrungs- und Umweltanalytik,
die immunologische und pharmakologische Forschung.
Bisher bekannt ist folgender Stand der Technik:
Das bisher generell verwendete Verfahren zur Optimierung
eines Immunoassays geht auf Hales und Randle (Hales C. N.,
Randle P. J., Biochem. J., 88 (1963), 137) zurück.
Danach werden für eine degressive, aliquote Verdünnungsreihe
eines Antiserums (bzw. Antikörpers) die Bindungswerte
eines Tracers in Abwesenheit und Anwesenheit des mit
dem Antiserum zu bestimmenden Antigens ermittelt. Der dabei
verwendete Tracer ist eine mit dem Antigen identische
bzw. verwandte markierte Verbindung (ein Konjugat des Antigens).
Im Falle eines IRMA ist der Tracer ein markierter
Antikörper.
Die graphische Darstellung der Bindungswerte des Antigen-Antikörper-Komplexes
in Abhängigkeit von der Antiserumverdünnung
(Antikörperkonzentration) bei fixer Antigenkonzentration
wird Titerkurve genannt, wobei in der einen Titerkurve
kein unmarkiertes Antigen enthalten ist. In einer
zweiten Titerkurve wird als fixe Antigenkonzentration in
der Regel die in einer künftigen Standardkurve des RIA
oder IRMA zu bestimmende höchste Antigenkonzentration gewählt.
Als Standardkurve ist dabei die graphische Darstellung
der Bindungswerte des Antigen-Antikörper-Komplexes in
Abhängigkeit von bekannten Antigenkonzentrationen bei fixer
Antikörperkonzentration zu verstehen, mit deren Hilfe
künftig unbekannte Antigenkonzentrationen möglichst präzise
und reproduzierbar bestimmt werden sollen.
Als optimale Antiserumverdünnung bzw. Antikörperkonzentration
einer künftigen Standardkurve gilt diejenige, bei der
die Differenz der Bindungswerte bei Abwesenheit im Vergleich
zur Anwesenheit des unmarkierten Antigens am größten
ist.
Die bisherigen aus der Literatur bekannten Verfahren beruhen
auf rein statistischen Vergleichen (Wiederfindeexperimente
und Kreuzreaktionsstudien) und sind nur sehr unvollkommen
zur gezielten Qualitätskontrolle verwendbar (G. E.
Abraham (Ed.): Handbook of Radioimmunoassay, New York,
1978, R. P. Ekins: Basic Concepts in Quality Control in
Radioimmunoassays and Related Produres in Medicine,
Vol. 2, 6-20, IAEA, Wien 1978).
Sie sind in der Regel nicht geeignet, um gezielte Maßnahmen
zur Beseitigung von Qualitätsmängeln, zur Neuanpassung
eines Assays oder zur Kalibrierung eines Standards zu unternehmen.
Die bisher verwendeten physikochemischen Modelle (Scatchard-,
Sips- bzw. Hill-Modell, H. A. Feldman: Analyt.
Biochem. 48 (1972), 317) konnten meist nur als reine Eichfunktion
in der Qualitätskontrolle Verwendung finden.
Die mit ihrer Hilfe ermittelten physikochemischen Parameter,
wie Gleichgewichtskonstanten und Bindekapazitäten
waren nur in einem sehr begrenzten Rahmen für die Optimierung
eines Immunoassays verwendbar.
Das Ziel der Erfindung besteht zum einen in der Zeitersparnis
und in der Reduzierung des experimentellen Aufwandes bei der
Optimierung, Anpassung und Qualitätskontrolle eines Immunoassays
und zum anderen in einer Erhöhung der Übersichtlichkeit
und Vergleichbarkeit der Immunoassay-Experimente.
Weiterhin soll im Zusammenhang mit automatischen Pipettier-
und Verdünnungsschritten eine bequem zu handhabende und damit
nutzerfreundliche Optimierung, Anpassung der Standards und
gezielte Qualitätskontrolle und -steuerung von Immunoassays
in Immunoassay-Meßgeräte (Gamma-Counter, LSC, Spektralphotometer,
Luminiszensmeßplätzen, Fluoreszensmeßgeräten u. a. m.)
erreicht werden.
Die Erfindung fußt zum einen auf der Entdeckung eines vereinfachten,
allgemein gültigen und konsistenten physikochemischen
Grundmodells der Antigen-Antikörper-Reaktion und zum
anderen auf der selektiven Konzipierung und Auswertung dreidimensionaler
Bindungsexperimente.
Sie ist dadurch gekennzeichnet, daß die Bindungsraten eines
bestimmten Antigen-Antikörper-Komplexes, gegebenenfalls unter
Zufügung eines oder mehrerer weiterer Stoffe oder nach Verdünnung,
bestimmt werden, die Daten mathematisch erfaßt und
in den dreidimensionalen Versuch überführt werden und nachfolgend
eine mathematische Auswertung für die Anpassung und
Optimierung des Assays erfolgt.
Die Auswertung erfolgt mit Hilfe von PC-Computerprogrammen,
die auf der Grundlage von Varianten des physikochemischen
Grundmodells und eines Algorithmus der nichtlineare Regression
(J. G. Reich, Curve Fitting with the Personal Computer,
New York, Mc Grawhill, 1991) geschaffen wurden.
Zu den Modellvorstellungen:
- 1. Das den Berechnungen zugrunde liegende Grundmodell geht davon aus, daß Antikörper sich sowohl untereinander als auch an Antigen binden.
- 2. Kreuzreaktive Fremdsubstanzen und unspezifisch bindendes
Heteroprotein im Reaktionsmilieu wirken sich wie eine zusätzliche
Antigen- bzw. Antikörpermenge aus bzw. führen
entsprechend ihrem Mengenverhältnis zum Antigen bzw. Antikörper
zu einer apparenten Affinitätserniedrigung des Antikörpers.
Beide Modellhypothesen haben in mathematischen Formulierungen Eingang in die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Programme RIAOPT und IRMAOPT gefunden.
Zum Verfahren der Schnelloptimierung eines Immunoassays
Voraussetzung für die Optimierung ist eine dreidimensionale
Versuchsführung. Man bestimmt die Bindungsraten des Antigen-Antikörper-Komplexes
bei gleichzeitiger Variation sowohl der
Antigen- als auch der Antikörperkonzentration.
Zur Einsparung von experimenteller Arbeit ist es ausreichend,
wenn entweder 2-3 Titerkurven bei 2-3 deutlich verschiedenen,
fixen Antigenkonzentrationen oder wenn 2-3 Standardkurven
bei 2-3 deutlich verschiedenen, fixen Antikörperverdünnungen
(-konzentrationen) aufgestellt werden.
Als Trennmethode des antikörpergebundenen vom freien Antigen
können alle effektiven Methoden, ob Doppelantikörpertechnik,
einfache Antikörperpräzipitation, Dextrankohletrennung, Solid
Phase Techniken (z. B. Coated Tube) oder auch trennungsfreie
Bestimmungen des gebundenen Antigens verwendet werden.
Die Daten der 2-3 Titer- bzw. Standardkurven werden entweder
mit dem Programm EINGABE je Titer- bzw. Standardkurve erfaßt
oder liegen in der Feldfolge: Antikörper- bzw. Antigenkonzentration,
B/T-Werte als Response, Variationskoeffizient
(VK) der Replikate der B/T-Werte bereits vor.
Mit dem Programm ZUSAM erfolgt die Überführung des zweidimensionalen
(Antigen- oder Antikörperkonzentration, B/T-Werte)
in einen dreidimensionalen Versuch (Antigenkonzentration, Antikörperkonzentration,
B/T-Werte).
Die für die Auswertung erforderliche Feldfolge des Versuchs:
1. Antigenkonzentration, 2. Antikörperkonzentration, 3. B/T-Werte,
4. VK der Replikate der B/T-Werte.
Sollten Antikörperkonzentration und Antigenkonzentration in
ihrer Feldfolge vertauscht sein, muß mit dem Programm VARIABLE
ein Austausch der Feldfolge vorgenommen werden.
Mit dem Programm RIAOPT erfolgt die Auswertung, Optimierung
sowie die Beschreibung eines standardisierten Präzisionsprofils
(=Steuerung der Antigenkonzentration in Abhängigkeit von
der Antigenkonzentration) des optimierten kompetitiven Immunoassays.
Mit dem Programm IRMAOPT erfolgt die Auswertung, Optimierung
sowie die Beschreibung eines standardisierten Präzisionsprofils
des optimierten nichtkompetitiven Immunoassays
(Sandwichmethode).
Als standardisiert wird dasjenige Präzisionsprofil bezeichnet,
das bei einem experimentellen Fehler (VK der Responsewerte)
von 2% entsteht.
Im Programm RIAOPT werden folgende Fälle eines kompetitiven
Immunoassays unterschieden:
1. Modell:
Modifiziertes MWG (Massenwirkungsgesetz), unbeeinflußt
2. Modell:
Modifiziertes MWG, beeinflußt sowohl durch eine unbekannte, kreuzreaktive Verbindung, die sich auf die Affinität als auch auf die Antigenkonzentration auswirkt
3. Modell:
Modifiziertes MWG, beeinflußt durch eine unbekannte, mit dem Antigen kreuzreagierende Substanz
4. Modell:
Modifiziertes MWG bei kalter Vorinkubation, beeinflußt durch eine unbekannte, mit dem Antigen kreuzreagierende Substanz.
Modifiziertes MWG (Massenwirkungsgesetz), unbeeinflußt
2. Modell:
Modifiziertes MWG, beeinflußt sowohl durch eine unbekannte, kreuzreaktive Verbindung, die sich auf die Affinität als auch auf die Antigenkonzentration auswirkt
3. Modell:
Modifiziertes MWG, beeinflußt durch eine unbekannte, mit dem Antigen kreuzreagierende Substanz
4. Modell:
Modifiziertes MWG bei kalter Vorinkubation, beeinflußt durch eine unbekannte, mit dem Antigen kreuzreagierende Substanz.
Im Programm IRMAOPT werden folgende Fälle eines nichtkompetitiven
Immunoassays unterschieden:
1. Modell:
Modifiziertes MWG, unbeeinflußt
2. Modell:
Modifiziertes MWG, beeinflußt durch eine unbekannte, mit dem Antikörper kreuzreagierende Substanz
3. Modell:
Modifiziertes MWG, beeinflußt durch eine unbekannte, mit dem Antigen kreuzreagierende Substanz.
Modifiziertes MWG, unbeeinflußt
2. Modell:
Modifiziertes MWG, beeinflußt durch eine unbekannte, mit dem Antikörper kreuzreagierende Substanz
3. Modell:
Modifiziertes MWG, beeinflußt durch eine unbekannte, mit dem Antigen kreuzreagierende Substanz.
Mittels nichtlinearer Regression werden auf der Grundlage der
Modelle physikochemische Konstanten des Antigen-Antikörper-Bindungsassays
(RIA, IRMA) geschätzt.
Es sind dies beim kompetitiven Immunoassay:
bei 1. Modell:
a) Affinitäts- bzw. Gleichgewichtskonstante K
b) Bindungsfaktor n, der die Bindungsrelation zwischen Antigen und Antikörper zum Ausdruck bringt und sich als summarische Größe aus Stöchiometriefaktor, der Reinheit des Antigens bzw. des spezifischen Antikörpers und aus sterischen Bindungseffekten ergibt.
c) Unspezifische Bindung nsb
bei 1. Modell:
a) Affinitäts- bzw. Gleichgewichtskonstante K
b) Bindungsfaktor n, der die Bindungsrelation zwischen Antigen und Antikörper zum Ausdruck bringt und sich als summarische Größe aus Stöchiometriefaktor, der Reinheit des Antigens bzw. des spezifischen Antikörpers und aus sterischen Bindungseffekten ergibt.
c) Unspezifische Bindung nsb
bei 2. Modell:
a), b) und c) wie im 1. Modell sowie
d) Affinitätskonstante der unbekannten, kreuzreaktiven Substanz
e) kreuzreaktives Äquivalent der unbekannten Substanz, ausgedrückt als Antigenkonzentration
a), b) und c) wie im 1. Modell sowie
d) Affinitätskonstante der unbekannten, kreuzreaktiven Substanz
e) kreuzreaktives Äquivalent der unbekannten Substanz, ausgedrückt als Antigenkonzentration
bei 3. Modell:
a), b) und c) wie im 1. Modell sowie
d) kreuzreaktives Äquivalent der unbekannten Substanz, ausgedrückt als Antigenkonzentration
a), b) und c) wie im 1. Modell sowie
d) kreuzreaktives Äquivalent der unbekannten Substanz, ausgedrückt als Antigenkonzentration
bei 4. Modell:
a), b) und c) wie im 1. Modell sowie
d) kreuzreaktives Äquivalent der unbekannten Substanz, ausgedrückt als Antigenkonzentration
a), b) und c) wie im 1. Modell sowie
d) kreuzreaktives Äquivalent der unbekannten Substanz, ausgedrückt als Antigenkonzentration
Beim nichtkompetitiven Immunoassay:
bei 1. Modell:
a) Affinitäts- bzw. Gleichgewichtskonstante K
b) Bindungsfaktor n, der die Bindungsrelation zwischen Antigen und Antikörper zum Ausdruck bringt und sich als summarische Größe aus Stöchiometriefaktor, der Reinheit des Antigens bzw. des spezifischen Antikörpers und aus sterischen Bindungseffekten ergibt.
c) Unspezifische Bindung nsb
bei 1. Modell:
a) Affinitäts- bzw. Gleichgewichtskonstante K
b) Bindungsfaktor n, der die Bindungsrelation zwischen Antigen und Antikörper zum Ausdruck bringt und sich als summarische Größe aus Stöchiometriefaktor, der Reinheit des Antigens bzw. des spezifischen Antikörpers und aus sterischen Bindungseffekten ergibt.
c) Unspezifische Bindung nsb
bei 2. Modell:
a), b) und c) wie im 1. Modell sowie
d) kreuzreaktives Äquivalent der unbekannten Substanz, ausgedrückt als zusätzliche Bindungskapazität für das Antigen
a), b) und c) wie im 1. Modell sowie
d) kreuzreaktives Äquivalent der unbekannten Substanz, ausgedrückt als zusätzliche Bindungskapazität für das Antigen
bei 3. Modell:
a), b) und c) wie im 1. Modell sowie
d) kreuzreaktives Äquivalent der unbekannten Substanz, ausgedrückt als Antigenkonzentration
a), b) und c) wie im 1. Modell sowie
d) kreuzreaktives Äquivalent der unbekannten Substanz, ausgedrückt als Antigenkonzentration
Bei Aufruf der Programme RIAOPT und IRMAOPT werden dem Nutzer
Vorschläge für Startwerte für die nichtlineare Regression
unterbreitet. Der Nutzer hat die Möglichkeit, die Startwerte
zu verändern oder einfach die vorgeschlagenen Startwerte zu
übernehmen.
Das Programm wertet den 3-dimensionalen Immunoassay mit den
vorhandenen Modellen aus und wählt das geeignetste für das
Ausgabeprotokoll.
Das Ausgabeprotokoll enthält die geschätzten physikochemischen
Konstanten und zeigt die Güte der Wiedergabe der experimentellen
Werte durch das gewählte Modell. Des weiteren
gibt es die optimale Antikörperkonzentration bzw. -verdünnung
für ein vom Nutzer vorgewählten Antigenkonzentration an und
stellt ein standardisiertes Präszionsprofil für die optimale
Antikörperkonzentration auf.
Zum Verfahren der Qualitätskontrolle eines Immunoassays:
Bereits bei den Auswertungen mit RIAOPT und IRMAOPT werden
unbekannte kreuzreaktive Substanzen als Konzentrationsäquivalente
zum Antigen ausgewiesen. Um genauere Hinweise
zum kreuzreaktiven Verhalten der im Reaktionsmilieu des
Assays vorhandenen Stoffe zu finden, ist gemäß der Erfindung
folgende dreidimensionale Versuchsanordnung erforderlich:
Man bestimmt die Bindungsraten des Antigen-Antikörper-Komplexes von Standardkurven (bei einer fixen Antikörperkonzentration) bei einer Variation der Verdünnung (z. B. Serumverdünnung) oder Aufstockung (z. B. Aufstockung des beigefügten Heteroproteins) des Reaktionsmilieus der Standardkurven.
Man bestimmt die Bindungsraten des Antigen-Antikörper-Komplexes von Standardkurven (bei einer fixen Antikörperkonzentration) bei einer Variation der Verdünnung (z. B. Serumverdünnung) oder Aufstockung (z. B. Aufstockung des beigefügten Heteroproteins) des Reaktionsmilieus der Standardkurven.
Zur Einsparung von experimenteller Arbeit ist es ausreichend,
wenn Experimente für 2-3 Standardkurven bei 2-3
deutlich verschiedenen Verdünnungs- bzw. Aufstockungsstufen
des Reaktionsmilieus durchgeführt werden.
Um die Einwirkung möglicher kreuzreaktiver (chemisch verwandter
Antigene) zu ermitteln, ist gemäß der Erfindung
folgende dreidimensionale Versuchsanordnung erforderlich:
Man bestimmt die Bindungsraten des Antigen-Antikörper-Komplexes von Standardkurven (bei einer fixen Antikörperkonzentration) bei Variation der in den Standardkurven enthaltenen Konzentration des mutmaßlich, kreuzreaktiven Antigens.
Man bestimmt die Bindungsraten des Antigen-Antikörper-Komplexes von Standardkurven (bei einer fixen Antikörperkonzentration) bei Variation der in den Standardkurven enthaltenen Konzentration des mutmaßlich, kreuzreaktiven Antigens.
Zur Einsparung von experimenteller Arbeit ist es ausreichend,
wenn Experimente für 2-3 Standardkurven bei 2-3
deutlich verschiedenen Konzentrationen des mutmaßlich
kreuzreaktiven Antigens durchgeführt werden.
Die Daten der 2-3 Standardkurven werden entweder mit dem
Programm EINGABE als Standardkurven erfaßt oder liegen in der
Feldfolge: Antigenkonzentration, B/T-Werte als Response,
Variationskoeffizient (VK) der Replikate der B/T-Werte bereits
vor.
Mit dem Programm ZUSAM erfolgt die Überführung des zweidimensionalen
Versuches (Antigenkonzentration, B/T-Werte) in
einen dreidimensionalen Versuch (Antigenkonzentration,
Konzentration des kreuzreaktiven Antigen bzw. Verdünnungs-
oder Aufstockungsfaktoren des Reaktionsmilieus, B/T-Werte).
Die für die Auswertung erforderliche Feldfolge des Versuchs:
1. Antigenkonzentration, 2. Konzentration des
kreuzreaktiven Antigens bzw. Verdünnungs- oder Aufstockungsfaktoren
des Reaktionsmilieus, 3. B/T-Werte, 4. VK
der Replikate der B/T-Werte. Sollten Feld 1 und und Feld 2 in
ihrer Feldfolge vertauscht sein, muß mit dem Programm
VARIABLE ein Austausch der Feldfolge vorgenommen werden.
Mit dem Programm RIAKREUZ erfolgt die Auswertung und Beschreibung
der Auswirkung der kreuzreaktiven Substanz auf
das standardisierte Präzisionsprofil (= Streuung der Antigenkonzentration
in Abhängigkeit von der Antigenkonzentration)
eines kompetitiven Immunoassays.
Mit dem Programm IRMKREUZ erfolgt die Auswertung und Beschreibung
der Auswirkung der kreuzreaktiven Substanz auf
das standardisierte Präzisionsprofils eines nichtkompetitiven
Immunoassays (Sandwich-Methode).
Als standardisiert wird dasjenige Präzionsprofil bezeichnet,
das bei einem experimentellen Fehler (VK der
Responsewerte) von 2% entsteht.
Im Programm RIAKREUZ werden folgende Fälle eines kompetitiven
Immunoassays unterschieden:
1. Modell:
Modifiziertes MWG für zwei Antigene ohne Affinitätsbeeinflussung, aber mit Auswirkungen auf die Gesamtantigenkonzentration
2. Modell:
Modifiziertes MWG für zwei Antigene mit Affinitätsbeeinflussung und mit Auswirkungen auf die Gesamtantigenkonzentration.
1. Modell:
Modifiziertes MWG für zwei Antigene ohne Affinitätsbeeinflussung, aber mit Auswirkungen auf die Gesamtantigenkonzentration
2. Modell:
Modifiziertes MWG für zwei Antigene mit Affinitätsbeeinflussung und mit Auswirkungen auf die Gesamtantigenkonzentration.
Im Programm IRMKREUZ werden folgende Fälle eines nichtkompetitiven
Immunoassays unterschieden:
1. Modell:
Modifiziertes MWG für zwei Antigene ohne Affinitätsbeeinflussung, aber mit Auswirkungen auf die Gesamtantigenkonzentration
2. Modell:
Modifiziertes MWG für zwei Antigene mit Affinitätsbeeinflussung und mit Auswirkungen auf die Gesamtantigenkonzentration
3. Modell:
Modifiziertes MWG für zwei Antikörper ohne Affinitätsbeeinflussung, aber mit Auswirkungen auf die Gesamtbindungskapazität des markierten Antikörpers.
1. Modell:
Modifiziertes MWG für zwei Antigene ohne Affinitätsbeeinflussung, aber mit Auswirkungen auf die Gesamtantigenkonzentration
2. Modell:
Modifiziertes MWG für zwei Antigene mit Affinitätsbeeinflussung und mit Auswirkungen auf die Gesamtantigenkonzentration
3. Modell:
Modifiziertes MWG für zwei Antikörper ohne Affinitätsbeeinflussung, aber mit Auswirkungen auf die Gesamtbindungskapazität des markierten Antikörpers.
Mittels nichtlinearer Regression werden auf der Grundlage
der Modelle physikochemische Konstanten des Antigen-Antikörper-Bindungsassays
(RIA, IRMA) geschätzt.
Es sind dies beim kompetitiven Immunoassay:
bei 1. Modell:
a) Affinitäts- bzw. Gleichgewichtskonstante K
b) Bindungskapazität des Antikörpers für den 1. Antigenen
c) Unspezifische Bindung nsb
d) Der Faktor der Kreuzreaktivität zwischen dem 1. und dem 2. (kreuzreaktiven) Antigen bzw. der Verdünungs- oder Aufstockungsstufe des Reaktionsmilieus
bei 1. Modell:
a) Affinitäts- bzw. Gleichgewichtskonstante K
b) Bindungskapazität des Antikörpers für den 1. Antigenen
c) Unspezifische Bindung nsb
d) Der Faktor der Kreuzreaktivität zwischen dem 1. und dem 2. (kreuzreaktiven) Antigen bzw. der Verdünungs- oder Aufstockungsstufe des Reaktionsmilieus
bei 2. Modell:
a), b) und c) wie im 1. Modell sowie
d) Affinitätskonstante der kreuzreaktiven Substanz
e) Der Faktor der Kreuzreaktivität zwischen dem 1. und dem 2. (kreuzreaktiven) Antigen bzw. der Verdünnungs- oder Aufstockungsstufe des Reaktionsmilieus.
a), b) und c) wie im 1. Modell sowie
d) Affinitätskonstante der kreuzreaktiven Substanz
e) Der Faktor der Kreuzreaktivität zwischen dem 1. und dem 2. (kreuzreaktiven) Antigen bzw. der Verdünnungs- oder Aufstockungsstufe des Reaktionsmilieus.
Beim nichtkompetitiven Immunoassay:
bei 1. Modell:
a) Affinitäts- bzw. Gleichgewichtskonstante K
b) Bindungskapazität des markierten Antikörpers für den 1. Antigenen
c) Unspezifische Bindung nsb
d) Der Faktor der Kreuzreaktivität zwischen dem 1. und dem 2. (kreuzreaktiven) Antigen bzw. der Verdünnungs- oder Aufstockungsstufe des Reaktionsmilieus
bei 1. Modell:
a) Affinitäts- bzw. Gleichgewichtskonstante K
b) Bindungskapazität des markierten Antikörpers für den 1. Antigenen
c) Unspezifische Bindung nsb
d) Der Faktor der Kreuzreaktivität zwischen dem 1. und dem 2. (kreuzreaktiven) Antigen bzw. der Verdünnungs- oder Aufstockungsstufe des Reaktionsmilieus
bei 2. Modell:
a), b) und c) wie im 1. Modell sowie d) Affinitätskonstante der kreuzreaktiven Substanz
e) Der Faktor der Kreuzreaktivität zwischen dem 1. und dem 2. (kreuzreaktiven) Antigen bzw. der Verdünnungs- oder Aufstockungsstufe des Reaktionsmilieus
a), b) und c) wie im 1. Modell sowie d) Affinitätskonstante der kreuzreaktiven Substanz
e) Der Faktor der Kreuzreaktivität zwischen dem 1. und dem 2. (kreuzreaktiven) Antigen bzw. der Verdünnungs- oder Aufstockungsstufe des Reaktionsmilieus
bei 3. Modell:
a), b) und c) wie im 1. Modell sowie
d) der Faktor der Kreuzreaktivität zwischen dem 1. markierten und dem 2. unmarkierten Antikörper bzw. der Verdünnungs- oder Aufstockungsstufe des Reaktionsmilieus
a), b) und c) wie im 1. Modell sowie
d) der Faktor der Kreuzreaktivität zwischen dem 1. markierten und dem 2. unmarkierten Antikörper bzw. der Verdünnungs- oder Aufstockungsstufe des Reaktionsmilieus
Bei Aufruf der Programme RIAKREUZ und IRMKREUZ werden dem
Nutzer Vorschläge für Startwerte für die nichtlineare Regression
unterbreitet. Der Nutzer hat die Möglichkeit, die
Startwerte zu verändern oder einfach die vorgeschlagenen
Startwerte zu übernehmen.
Das Programm wertet den 3-dimensionalen Immunassay mit
den vorhandenen Modellen aus und wählt das geeignetste für
das Ausgabeprotokoll.
Das Ausgabeprotokoll enthält die geschätzten physikochemischen
Konstanten und zeigt die Güte der Wiedergabe der experimentellen
Werte durch das gewählte Modell. Des weiteren
zeigt es den systematischen Fehler, den eine vom Nutzer
vorgegebenen Konzentration der kreuzreaktiven Substanz
im Immunoassay verursacht.
Die Erfindung erstreckt sich auch auf Vorrichtungen, die
zur Durchführung des Verfahrens dienen. Von besonderer Bedeutung
sind dabei Vorrichtungen, die automatisch Pipettier-
und Verdünnungseinrichtungen aufweisen und auf der
Basis der erfindungsgemäßen Programme RIAOPT, IRMAOPT,
RIAKREUZ und IRMKREUZ selbständig programmieren und auswerten.
Die Erfindung eröffnet ganz neue Perspektiven für die Optimierung,
die Anpassung der Standards und die gezielte
Qualitätskontrolle und -steuerung von Immunoassays. Erstmalig
wird auch eine exakte funktionelle Charakterisierung
von Antikörpern bei minimalem Aufwand ermöglicht. Das neue
Verfahren bildet die Basis für eine neue Generation von
Meßgeräten.
Die Erfindung soll an folgenden Ausführungsbeispielen näher
erläutert werden:
Beispiel 1:
T3-RIA mit polyklonalen, gereinigten Antikörpern, B/F-Trennung mit Gleichgewichtsdialyse
Beispiel 2:
β-HCG-RIA mit polyklonalen, gereinigten Antikörpern, B/F-Trennung mit Coated-Tube-Technik
Beispiel 3:
Estradiol-RIA mit monoklonalen Antikörpern, B/F-Trennung mit Dextrankohletechnik
Beispiel 4:
bLH-RIA mit ungereinigtem Antiserum, kalte Vorinkubation, B/F-Trennung mit Doppelantikörpertechnik
T3-RIA mit polyklonalen, gereinigten Antikörpern, B/F-Trennung mit Gleichgewichtsdialyse
Beispiel 2:
β-HCG-RIA mit polyklonalen, gereinigten Antikörpern, B/F-Trennung mit Coated-Tube-Technik
Beispiel 3:
Estradiol-RIA mit monoklonalen Antikörpern, B/F-Trennung mit Dextrankohletechnik
Beispiel 4:
bLH-RIA mit ungereinigtem Antiserum, kalte Vorinkubation, B/F-Trennung mit Doppelantikörpertechnik
Beispiel 5:
TSH-IRMA mit einem I-125-monoklonalen Antikörper, einem unmarkierten polyklonalen Antikörper, B/F-Trennung mit Doppelantikörpertechnik
Beispiel 6:
TSH-IRMA mit zwei monoklonalen Antikörpern, B/F-Trennung mit Coated-Tube-Technik
TSH-IRMA mit einem I-125-monoklonalen Antikörper, einem unmarkierten polyklonalen Antikörper, B/F-Trennung mit Doppelantikörpertechnik
Beispiel 6:
TSH-IRMA mit zwei monoklonalen Antikörpern, B/F-Trennung mit Coated-Tube-Technik
Beispiel 7:
Estron-Kreuzreaktivität im Estradiol-RIA Estradiol-RIA mit ungereinigtem Antiserum, B/F-Trennung mit Dextrankohletechnik
Beispiel 8:
Serumeinfluß auf den β-HCG-RIA
β-HCG-RIA mit gereinigten, polyklonalen Antikörpern, B/F-Trennung mit Doppelantikörpertechnik
Beispiel 9:
Albumineinfluß auf den T3-RIA
T3-RIA mit gereinigten, polyklonalen Antikörpern, B/F-Trennung mit Doppelantikörpertechnik
Beispiel 10:
Einfluß von Rindergammaglobulin auf die Bindungskapazität im TSH-IRMA mit Doppelantikörpertechnik
Estron-Kreuzreaktivität im Estradiol-RIA Estradiol-RIA mit ungereinigtem Antiserum, B/F-Trennung mit Dextrankohletechnik
Beispiel 8:
Serumeinfluß auf den β-HCG-RIA
β-HCG-RIA mit gereinigten, polyklonalen Antikörpern, B/F-Trennung mit Doppelantikörpertechnik
Beispiel 9:
Albumineinfluß auf den T3-RIA
T3-RIA mit gereinigten, polyklonalen Antikörpern, B/F-Trennung mit Doppelantikörpertechnik
Beispiel 10:
Einfluß von Rindergammaglobulin auf die Bindungskapazität im TSH-IRMA mit Doppelantikörpertechnik
- 0.1 m Tris-Puffer bei pH 7.7 mit 0.05% Humanserumalbumin von SERVA
- als Antigen Triiodthyronine (T3 von Henning, Berlin) in den Konzentrationen 0.157, 0.312, 0.625, 1.125, 2.501, 4.992 und 10 nmol/l
- als Antikörper Protein-A-gereinigter polyklonaler anti-T3-Antikörper in den Konzentrationen 11.25, 2.813 und 0.704 nmol/l
- als Tracer I-125-T3 (0.215 nmol/l)
- als Antigen Triiodthyronine (T3 von Henning, Berlin) in den Konzentrationen 0.157, 0.312, 0.625, 1.125, 2.501, 4.992 und 10 nmol/l
- als Antikörper Protein-A-gereinigter polyklonaler anti-T3-Antikörper in den Konzentrationen 11.25, 2.813 und 0.704 nmol/l
- als Tracer I-125-T3 (0.215 nmol/l)
Es werden speziell gebaute Versuchsapparaturen benutzt. Sie enthalten 7 Kammern
a 1 ml Volumen. Jede Kammer ist durch eine SERVAPOR Dialyse-Membran
in zwei Zellen T und P a 0.5 ml geteilt.
In die Zelle T werden 0.1 ml Puffer, 0.1 ml Antikörper, 0.1 ml Standard
und 0.1 ml Tracer, in die Zelle P werden 0.4 ml Puffer gegeben.
Es werden je Antikörperkonzentration Standardkurven a 7 Antigenkonzentrationen
in einer Apparatur ausgeführt. Jeder Versuch wird doppelt
ausgeführt. Die Zellen werden verschlossen und es erfolgt eine Über-Kopf-Rotation
der 2 Versuchsapparaturen über 6 Stunden.
Als Totalwert (T) werden 0.1 ml des Tracers im Gammacounter gemessen.
Aus Zelle T und Zelle P werden 0.2 ml entnommen und ebenfalls im Gammacounter
gemessen und auf 0.4 ml umgerechnet. Die Zelle T enthält sowohl das
antikörpergebundene Antigen (B) als auch die Hälfte des freien Antigens (F).
Die Zelle P enthält die Hälfte des freien Antigens (F). Die Adsorption des
Tracers (A) errechnet sich als A=T-B-F. Der Totalwert des Tracers (T)
wird um die Adsorption reduziert und die Bindungsrate B/T je Zelle berechnet.
Eingaben und Berechnungen für eine Standardkurve können für den speziellen Fall
der Gleichgewichtsdialyse mit dem Programm DIAINPUT (Sonderfall des Programms
EINGABE) vorgenommen werden.
Mit dem Programm ZUSAM wird aus den zweidimensionalen Versuchen (Standardkurven)
ein dreidimensionaler Versuch mit dem Namen s150389s zusammengestellt.
Dieser Versuch wird mit dem Programm RIAOPT ausgewertet. Das Auswerteergebnis
ist dem nachfolgenden Ausgabeprotokoll zu entnehmen.
Ausgewertet wurde mit Modell 3
Tracerkonzentration: 0.215 nmol/l | |
Affinitätskonstante K | 4.30205±0.24247 |
Bindungsfaktor p1/q | 0.43801±0.02190 |
unspezifische Bindung nsb | 0.11952±0.00940 |
Antigenäquivalent der Fremdsubstanz p2 | 0.41496±0.05031 pmol/l |
Erläuterungen:
- Bindungsfaktor: 0.43 nmol T3 binden 1 nmol IgG, theoretisch zu erwarten wäre: 2 nmol T3 binden 1 nmol IgG, Ursache: Das Protein-A-gereinigte IgG enthält IgG, das T3 nicht bindet.
- Antigenäquivalent der Fremdsubstanz: Im Reaktionsmilieu ist eine Fremdsubstanz vorhanden, die wie eine T3-Konzentration von 0.415 nmol/l wirkt (HSA!).)
Summe der Abweichungsquadrate: 5.2788809877E-03
Modellfehler: 0.0317 Versuchsfehler: 0.0528
- Bindungsfaktor: 0.43 nmol T3 binden 1 nmol IgG, theoretisch zu erwarten wäre: 2 nmol T3 binden 1 nmol IgG, Ursache: Das Protein-A-gereinigte IgG enthält IgG, das T3 nicht bindet.
- Antigenäquivalent der Fremdsubstanz: Im Reaktionsmilieu ist eine Fremdsubstanz vorhanden, die wie eine T3-Konzentration von 0.415 nmol/l wirkt (HSA!).)
Summe der Abweichungsquadrate: 5.2788809877E-03
Modellfehler: 0.0317 Versuchsfehler: 0.0528
Güte der Modellberechnungen:
B/Tberechnet=0.9977[±0.0137]*B/Tbeobachtet+0.0013[±0.0085]
r²=0.0064
Erläuterungen zu der Modellprüfung:
Das Modell ist zutreffenden, wenn die lineare Regression von berechneten zu beobachteten B/T-Werten im Anstieg 1 und im absoluten Glied 0 ergibt. Wobei als statistisch zulässige Abweichung der 3*S-Bereich gilt. Die Angaben in den Klammern [ ] hinter Anstieg und absolutem Glied stellen den 1*S-Bereich dar.
B/Tberechnet=0.9977[±0.0137]*B/Tbeobachtet+0.0013[±0.0085]
r²=0.0064
Erläuterungen zu der Modellprüfung:
Das Modell ist zutreffenden, wenn die lineare Regression von berechneten zu beobachteten B/T-Werten im Anstieg 1 und im absoluten Glied 0 ergibt. Wobei als statistisch zulässige Abweichung der 3*S-Bereich gilt. Die Angaben in den Klammern [ ] hinter Anstieg und absolutem Glied stellen den 1*S-Bereich dar.
Diskriminationsprofil für p=2.000 pmol/l T3 | |
IgG-Konz. nmol/l | |
Delta-B/T | |
9.132 | |
0.0910 | |
7.306 | 0.1221 |
5.845 | 0.1630 |
4.676 | 0.2128 |
3.741 | 0.2674 |
2.992 | 0.3196 |
2.394 | 0.3623 |
1.915 | 0.3896 |
1.532 | 0.3981 |
1.226 | 0.3866 |
0.981 | 0.3578 |
0.784 | 0.3179 |
0.628 | 0.2736 |
0.502 | 0.2304 |
0.402 | 0.1910 |
0.321 | 0.1568 |
0.257 | 0.1278 |
0.206 | 0.1037 |
0.165 | 0.0838 |
0.132 | 0.0676 |
0.105 | 0.0544 |
Antikörperkonzentration mit höchster Diskrimination=1.532 pmol/l
für Antigenkonzentration=2.000 pmol/l T3
Das standardisierte Präzisionsprofil ergibt sich als Streuung (1×S-Bereich)
des zu bestimmenden Antigens (Antigenen) bei einem durchschnittlichen Fehler der
experimentellen Werte von 2% und einer vom Nutzer angegebenen Impulsrate des
Totalwertes.
- 0.01 m Phosphatpuffer mit pH 7.4 und 0.01% Rinderserumalbumin (Merck)
- adsorptiv beschichtete NUNC-Röhrchen (NUNC, Dänemark), über Nacht beschichtet mit 0.3 ml Protein-A gereinigten polyklonalen Antikörpern (IgG) folgender Konzentrationen:
106.3, 53.13, 26.56, 13.28, 6.64, 3.32 und 1.66 nmol/l, zweimal mit 0.1 m NaCl-Lösung und danach mit Humanserumalbumin(0.5%)-NaCl(0.1 m)-Lösung 6-8 h bei Raumtemperatur gewaschen.
- β-HCG (Calbiochem) als Antigen in den Konzentrationen 0.033, 0.267 und 0.5 nmol/l
- I-125-β-HCG als Tracer (0.067 nmol/l)
- adsorptiv beschichtete NUNC-Röhrchen (NUNC, Dänemark), über Nacht beschichtet mit 0.3 ml Protein-A gereinigten polyklonalen Antikörpern (IgG) folgender Konzentrationen:
106.3, 53.13, 26.56, 13.28, 6.64, 3.32 und 1.66 nmol/l, zweimal mit 0.1 m NaCl-Lösung und danach mit Humanserumalbumin(0.5%)-NaCl(0.1 m)-Lösung 6-8 h bei Raumtemperatur gewaschen.
- β-HCG (Calbiochem) als Antigen in den Konzentrationen 0.033, 0.267 und 0.5 nmol/l
- I-125-β-HCG als Tracer (0.067 nmol/l)
In die antikörperbeschichteten Röhrchen werden 0.1 ml β-HCG-Standard, 0.1 ml I-125-β-HCG
als Tracer und 0.1 ml bzw. 0.2 ml (Standard 0) Puffer gegeben.
Reaktion über Nacht. 0.5 ml H₂O dazu, Röhrchen absaugen und im Gammacounter
messen. 0.1 ml Tracer werden als Totalwert messen.
Eingaben und Umrechnungen auf B/T und VK-Werte für Titerkurven können mit dem
Programm EINGABE vorgenommen werden.
Mit dem Programm ZUSAM wird aus den zweidimensionalen Versuchen (Titerkurven)
ein dreidimensionaler Versuch mit dem Namen s251091t zusammengestellt. Mit dem
Programm VARIABLE wird die Feldfolge 1. Antikörperkonzentration, 2- Antigenkonzentration
in die für die Auswertung erforderliche Feldfolge 1. Antigenkonzentration,
2. Antikörperkonzentration getauscht.
Dieser Versuch wird mit dem Programm RIAOPT ausgewertet. Das Auswerteergebnis
ist dem nachfolgenden Ausgabeprotokoll zu entnehmen.
ausgewertet wurde mit Modell 3
Affinitätskonstante K | |
2.19837±0.10422 | |
Bindungsfaktor p1/g | 0.00587±0.00055 |
unspezifische Bindung nsb | 0.03774±0.00564 |
Antigenäquivalent der Fremdsubstanz p2 | 0.10021±0.01776 pmol/l |
Erläuterungen:
- Bindungsfaktor:
a) Die Beschichtungsausbeute für IgG beträgt im Vergleich zur Doppelantikörpertechnik ca. 10-16%.
b) Im Protein-A-gereinigtem Antikörper-Pool ist eine sehr große Fraktion nicht β-HCG-bindenden IgGs enthalten
- Antigenäquivalent (Fremdsubstanz): Es ist im Reaktionsmilieu eine Fremdsubstanz enthalten, die wie 0.1 nmol/l β-HCG wirkt (HSA!).
Summe der Abweichungsquadrate: 6.1058965933E-03
Modellfehler: 0.1499 Versuchsfehler: 0.0729
- Bindungsfaktor:
a) Die Beschichtungsausbeute für IgG beträgt im Vergleich zur Doppelantikörpertechnik ca. 10-16%.
b) Im Protein-A-gereinigtem Antikörper-Pool ist eine sehr große Fraktion nicht β-HCG-bindenden IgGs enthalten
- Antigenäquivalent (Fremdsubstanz): Es ist im Reaktionsmilieu eine Fremdsubstanz enthalten, die wie 0.1 nmol/l β-HCG wirkt (HSA!).
Summe der Abweichungsquadrate: 6.1058965933E-03
Modellfehler: 0.1499 Versuchsfehler: 0.0729
Güte der Modellberechnungen:
B/Tberechnet=0.948[±0.029]*B/Tbeobachtet+0.0023[±0.011]
r²=0.9767
B/Tberechnet=0.948[±0.029]*B/Tbeobachtet+0.0023[±0.011]
r²=0.9767
Diskriminationsprofil für p=0.500 pmol/l β-HCG | |
IgG-Konz. nmol/l | |
Delta-B/T | |
170.458 | |
0.0848 | |
136.366 | 0.1080 |
109.093 | 0.1367 |
87.275 | 0.1710 |
69.820 | 0.2098 |
55.856 | 0.2505 |
44.685 | 0.2897 |
35.748 | 0.3233 |
28.598 | 0.3484 |
22.879 | 0.3625 |
18.303 | 0.3644 |
14.642 | 0.3539 |
11.714 | 0.3322 |
9.371 | 0.3018 |
7.497 | 0.2665 |
5.997 | 0.2299 |
4.798 | 0.1946 |
3.838 | 0.1624 |
3.071 | 0.1342 |
2.457 | 0.1100 |
1.965 | 0.0896 |
Antikörperkonzentration mit höchster Diskrimination=18.303 nmol/l
für Antigenkonzentration=0.500 nmol/l β-HCG
- 0.01 m Phosphatpuffer mit pH 7.4 und 0.05% Humanserumalbumin (Serva)
- Monoklonaler Antikörper (IgG 2a) von Biogenesis in den Konzentrationen 2.0, 0.25 und 0.031 nmol/l
- Estradiol (E2) als Antigen in den Konzentrationen 0, 0.05, 0.15, 0.5, 5, 10 und 15 nmol/l
- I-125-6-Histamin-Estradiol als Tracer (0.2 nmol/l)
- Dextrankohlesuspension mit 5 mg/ml Aktivkohle (Norit A) und mit 0.5 mg/ml Dextran T 500
- Monoklonaler Antikörper (IgG 2a) von Biogenesis in den Konzentrationen 2.0, 0.25 und 0.031 nmol/l
- Estradiol (E2) als Antigen in den Konzentrationen 0, 0.05, 0.15, 0.5, 5, 10 und 15 nmol/l
- I-125-6-Histamin-Estradiol als Tracer (0.2 nmol/l)
- Dextrankohlesuspension mit 5 mg/ml Aktivkohle (Norit A) und mit 0.5 mg/ml Dextran T 500
Gabe von 0.05 ml E2, 0.1 ml Antikörper und 0.1 ml Tracer in ein Glasröhrchen.
Inkubation über eine Stunde. Zugabe von 1 ml Dextrankohlesuspension.
Zentrifugation der Proben. Dekantieren des Überstandes in Plaströhrchen.
Messen des Überstands im Gammacounter. Messen von 0.1 ml Tracer als
Totalwert. Eingaben und Umrechnungen auf B/T und VK-Werte für Standardkurven
können mit dem Programm EINGABE vorgenommen werden.
Mit dem Programm ZUSAM wird aus den zweidimensionalen Versuchen (Standardkurven)
ein dreidimensionaler Versuch mit dem Namen a250491s zusammengestellt.
Dieser Versuch wird mit dem Programm RIAOPT ausgewertet. Das Auswerteergebnis
ist dem nachfolgenden Ausgabeprotokoll zu entnehmen.
ausgewertet wurde mit Modell 1
Tracerkonzentration: 0.20 nmol/l | |
Affinitätskonstante K | 1.42253±0.05311 |
Bindungsfaktor p/q | 1.00405±0.05742 |
unspezifische Bindung nsb | 0.01964±0.00603 |
Erläuterungen:
- Bindungsfaktor: Bindung von E2 zu monoklonalem Antikörper im Verhältnis 1 : 1.
- Im Reaktionsmilieu ist keine nennenswerte kreuzreaktive Substanz enthalten.
Summe der Abweichungsquadrate: 5.4239827750E-03
Modellfehler: 0.1040 Versuchsfehler: 0.0622
- Bindungsfaktor: Bindung von E2 zu monoklonalem Antikörper im Verhältnis 1 : 1.
- Im Reaktionsmilieu ist keine nennenswerte kreuzreaktive Substanz enthalten.
Summe der Abweichungsquadrate: 5.4239827750E-03
Modellfehler: 0.1040 Versuchsfehler: 0.0622
Güte der Modellberechnungen:
B/Tberechnet=0.995[±0.016]*B/Tbeobachtet+0.0013[±0.0051]
r²=0.9946
B/Tberechnet=0.995[±0.016]*B/Tbeobachtet+0.0013[±0.0051]
r²=0.9946
Diskriminationsprofil für p=5.000 pmol/l E2 | |
IgG-Konz. nmol/l | |
Delta-B/T | |
9.960 | |
0.0734 | |
7.968 | 0.0918 |
6.374 | 0.1143 |
5.099 | 0.1414 |
4.079 | 0.1730 |
3.264 | 0.2085 |
2.611 | 0.2465 |
2.089 | 0.2851 |
1.671 | 0.3222 |
1.337 | 0.3558 |
1.069 | 0.3847 |
0.856 | 0.4080 |
0.684 | 0.4253 |
0.548 | 0.4364 |
0.438 | 0.4411 |
0.350 | 0.4394 |
0.280 | 0.4310 |
0.224 | 0.4158 |
0.179 | 0.3938 |
0.144 | 0.3657 |
0.115 | 0.3324 |
Antikörperkonzentration mit höchster Diskrimination=0.438 nmol/l
für Antigenkonzentration=5.000 nmol/l E2
- 0.01 m Phosphatpuffer mit pH 7.4 0.1% HSA
- Antiserum gegen bovines luteinisierendes Hormon (bLH) vom Kaninchen in den Verdünnungen 1 : 500, 1 : 1000, 1 : 2000, 1 : 4000, 1 : 8000, 1 : 16 000, 1 : 32 000, 1 : 64 000, 1 : 128 000, 1 : 256 000 (Für die Auswertung: 1 : 1000=1)
- bLH (Präparation 2026, IWF) als Antigen in der Konzentration 64 µg/l
- I-125-bLH als Tracer (2 µg/l)
- optimierte Doppelantikörpertechnik mit 1 : 20 verdünntem 2. Antikörper von der Ziege gegen Kaninchen-Gammaglobulin, 1 : 300 verdünntem Normalkaninchenserum (NKS) sowie einem Präzipitationshilfsmittel (Latex in Aqua dest.) für die Ausfällung des antikörpergebundenen bLH.
- Antiserum gegen bovines luteinisierendes Hormon (bLH) vom Kaninchen in den Verdünnungen 1 : 500, 1 : 1000, 1 : 2000, 1 : 4000, 1 : 8000, 1 : 16 000, 1 : 32 000, 1 : 64 000, 1 : 128 000, 1 : 256 000 (Für die Auswertung: 1 : 1000=1)
- bLH (Präparation 2026, IWF) als Antigen in der Konzentration 64 µg/l
- I-125-bLH als Tracer (2 µg/l)
- optimierte Doppelantikörpertechnik mit 1 : 20 verdünntem 2. Antikörper von der Ziege gegen Kaninchen-Gammaglobulin, 1 : 300 verdünntem Normalkaninchenserum (NKS) sowie einem Präzipitationshilfsmittel (Latex in Aqua dest.) für die Ausfällung des antikörpergebundenen bLH.
0.1 ml Antiserum, 0.1 ml bLH und 0.1 ml 0.2 ml (Standard 0) Puffer in
Plaströhrchen zusammengeben. Über Nacht inkubieren lassen. Dazu 0.1 ml Tracer
geben und nach 3 h Zugabe von 0.1 ml NKS und 0.1 ml 2. Antikörper. Reaktion über
Nacht. Stoppen mit 1 ml Latex-Lösung. Zentrifugieren, Überstand absaugen und
Röhrchen im Gammacounter messen. Messen von 0.1 ml Tracer als Totalwert.
Eingaben und Umrechnungen auf B/T und VK-Werte für Standardkurven können mit dem
Programm EINGABE vorgenommen werden.
Mit dem Programm ZUSAM wird aus den zweidimensionalen Versuchen (Standardkurven)
ein dreidimensionaler Versuch mit dem Namen t250184t zusammengestellt.
Dieser Versuch wird mit dem Programm RIAOPT ausgewertet. Das Auswerteergebnis
ist dem nachfolgenden Ausgabeprotokoll zu entnehmen.
ausgewertet wurde mit Modell 4
Tracerkonzentration: 2.000 µg/l | |
Affinitätskonstante K1 | 2.32291±0.04526 |
Bindungsfaktor p/q1 | 38.29413±0.96095 |
unspezifische Bindung nsb | 0.04345±0.00370 |
Antigenäquivalent der Fremdsubstanz p2 | 0.78202±0.02068 µg/l |
Erläuterungen:
Eine Antiserumverdünnung von 1 : 1000 hat eine Bindungskapazität für 38.3 µg/l bLH.
Im Reaktionsmedium befindet sich eine Fremdsubstanz, die wie 0.78 µg/l bLH wirkt.
Summe der Abweichungsquadrate: 7.7951355217E-04
Modellfehler: 0.0403 Versuchsfehler: 0.0216
Eine Antiserumverdünnung von 1 : 1000 hat eine Bindungskapazität für 38.3 µg/l bLH.
Im Reaktionsmedium befindet sich eine Fremdsubstanz, die wie 0.78 µg/l bLH wirkt.
Summe der Abweichungsquadrate: 7.7951355217E-04
Modellfehler: 0.0403 Versuchsfehler: 0.0216
Güte der Modellberechnungen:
B/Tberechnet=0.9978[±0.006]*B/Tbeobachtet+0.001[±0.0032]
r²=0.9994
B/Tberechnet=0.9978[±0.006]*B/Tbeobachtet+0.001[±0.0032]
r²=0.9994
Diskriminationsprofil für p=16.000 µg/l | |
IgG-Konz. | |
Delta-B/T | |
0.836 | |
0.0846 | |
0.669 | 0.1081 |
0.535 | 0.1375 |
0.428 | 0.1734 |
0.342 | 0.2151 |
0.274 | 0.2606 |
0.219 | 0.3063 |
0.175 | 0.3487 |
0.140 | 0.3845 |
0.112 | 0.4114 |
0.090 | 0.4279 |
0.072 | 0.4329 |
0.057 | 0.4259 |
0.046 | 0.4070 |
0.037 | 0.3775 |
0.029 | 0.3400 |
0.024 | 0.2983 |
0.019 | 0.2560 |
0.015 | 0.2159 |
0.012 | 0.1797 |
Antikörperkonzentration mit höchster Diskrimination=0.072
(=Antiserumverdünnung von 1 : 13 890)
für Antigenkonzentration=16.000 µg/l
- TSH (eigener Sekundärstandard in Serumverdünnung) in den Konzentrationen:
0, 0.16, 0.31, 1.25, 5, 20 und mU/l
- I-125-monoklonaler Antikörper (I-125-MAK) a 40, 20 und 10 KBq/ml als Tracer
- Normales humanes Männerserum in 1 : 400 Verdünnung un 1% Tween 80 als Reaktionsmilieu
- gereinigtes polyklonale Anti-TSH-Antikörper (1 : 2000) vom Kaninchen
- Normalkaninichenserum (NKS; 1 : 100-Verdünnung)
- Fällungsgemisch: Präzipitationsantikörper von der Ziege gegen Kaninchen-Gammaglobulin zusammen mit NKS und PEG (Polyethylenglykol) 6000-Verdünnung.
- I-125-monoklonaler Antikörper (I-125-MAK) a 40, 20 und 10 KBq/ml als Tracer
- Normales humanes Männerserum in 1 : 400 Verdünnung un 1% Tween 80 als Reaktionsmilieu
- gereinigtes polyklonale Anti-TSH-Antikörper (1 : 2000) vom Kaninchen
- Normalkaninichenserum (NKS; 1 : 100-Verdünnung)
- Fällungsgemisch: Präzipitationsantikörper von der Ziege gegen Kaninchen-Gammaglobulin zusammen mit NKS und PEG (Polyethylenglykol) 6000-Verdünnung.
0.2 ml TSH und 0.1 ml Tracer in ein Plaströhrchen geben. Über Nacht inkubieren
lassen. 0.1 ml polyklonaler Antikörper und NKS dazu. Nach einer Stunde
Fällungsgemisch dazu und inkubieren lassen. Nach einer weiteren Stunde waschen,
zentrifugieren, absaugen und Röhrchen im Gammacounter messen. Messen von 0.1 ml
Tracer als Totalwert. Eingaben und Umrechnungen auf B/T und VK-Werte für
Standardkurven können mit dem Programm EINGABE vorgenommen werden.
Mit dem Programm ZUSAM wird aus den zweidimensionalen Versuchen (Standardkurven)
ein dreidimensionaler Versuch mit dem Namen s270788t zusammengestellt.
Dieser Versuch wird mit dem Programm IRMAOPT ausgewertet. Das Auswerteergebnis
ist dem nachfolgenden Ausgabeprotokoll zu entnehmen.
ausgewertet wurde mit Modell 2
Affinitätskonstante, k1 | |
1.44601±0.02135 | |
Bindungsfaktor, p/q | 0.21994±0.00366 |
unspezifische Bindung nsb | 0.00340±0.00011 |
Antigenäquivalent (Fremdprotein) q2 | 8.62739±0.50975 mU/l |
Erläuterungen:
Angaben für den I-125-MAK in 1000 cpm (counts per minute).
- Bindungsfaktor: 1000 cpm des I-125-MAK haben eine TSH-Bindungskapazität von 0.22 mU TSH.
- unspezifische Bindung: in Abwesenheit von TSH beträgt die Bindungsrate 0.34%.
- Neben der gemeinsamen Sandwich-Bindung des I-125-MAK und des polyklonalen Antikörpers existiert eine zusätzliche, nicht mit dem I-125-MAK gemeinsam reagierende IgG- oder Proteinbindungskapazität für 8.63 mU/l TSH.
Summe der Abweichungsquadrate: 3.2043247356E-06
Modellfehler: 0.0599 Versuchsfehler: 0.0559
Angaben für den I-125-MAK in 1000 cpm (counts per minute).
- Bindungsfaktor: 1000 cpm des I-125-MAK haben eine TSH-Bindungskapazität von 0.22 mU TSH.
- unspezifische Bindung: in Abwesenheit von TSH beträgt die Bindungsrate 0.34%.
- Neben der gemeinsamen Sandwich-Bindung des I-125-MAK und des polyklonalen Antikörpers existiert eine zusätzliche, nicht mit dem I-125-MAK gemeinsam reagierende IgG- oder Proteinbindungskapazität für 8.63 mU/l TSH.
Summe der Abweichungsquadrate: 3.2043247356E-06
Modellfehler: 0.0599 Versuchsfehler: 0.0559
Güte der Modellberechnungen:
B/Tberechnet=1.007[±0.011]*B/Tbeobachtet-0.00026[±0.0027]
r²=0.9978
B/Tberechnet=1.007[±0.011]*B/Tbeobachtet-0.00026[±0.0027]
r²=0.9978
Diskriminationsprofil für p=10.00 mU/l TSH | |
IgG-Konz. 1000 cpm | |
Delta-B/T | |
227.337 | |
0.1329 | |
181.870 | 0.1551 |
145.496 | 0.1786 |
116.397 | 0.2027 |
93.117 | 0.2265 |
74.494 | 0.2491 |
59.595 | 0.2697 |
47.676 | 0.2879 |
38.141 | 0.3032 |
30.513 | 0.3158 |
24.410 | 0.3258 |
19.528 | 0.3337 |
15.622 | 0.3397 |
12.498 | 0.3442 |
9.998 | 0.3476 |
7.999 | 0.3502 |
6.399 | 0.3521 |
5.119 | 0.3535 |
optimale Antikörperkonzentration=12 498 cpm
für Antigenkonzentration=10.000 mU/l TSH
Das standardisierte Präzisionsprofil ergibt sich aus einem durchschnittlichen
experimentellen Fehler von 2% und aus dem Zählfehler der optimierten
Konzentration des I-125-MAK.
- Mit MAK beschichtete Röhrchen (IRE, Belgien)
- THS-Standards von IRE a 0, 0.15, 0.5, 1.5, 5, 15, 50 und 150 mU/l
- THS-Standards von Henning, Berlin (Dyno-Test) a 0, 0.16, 0.31, 1.25, 5, 20 und 80 mU/l
- I-125-MAK a 126 807 cpm (Dyno) und 32 122 cpm (IRE) als Tracer
- THS-Standards von IRE a 0, 0.15, 0.5, 1.5, 5, 15, 50 und 150 mU/l
- THS-Standards von Henning, Berlin (Dyno-Test) a 0, 0.16, 0.31, 1.25, 5, 20 und 80 mU/l
- I-125-MAK a 126 807 cpm (Dyno) und 32 122 cpm (IRE) als Tracer
0.2 ml Standard und 0.1 ml Tracer in die beschichteten Röhrchen geben. Über
Nacht inkubieren lassen. Absaugen, waschen und Röhrchen im Gammacounter messen.
Messen von 0.1 ml Tracer als Totalwert. Eingaben und Umrechnungen auf B/T und
VK-Werte für Standardkurven können mit dem Programm EINGABE vorgenommen werden.
Mit dem Programm ZUSAM wird aus den zweidimensionalen Versuchen (Standardkurven)
ein dreidimensionaler Versuch mit dem Namen s290688t zusammengestellt.
Dieser Versuch wird mit dem Programm IRMAOPT ausgewertet. Das Auswerteergebnis
ist dem nachfolgenden Ausgabeprotokoll zu entnehmen.
ausgewertet wurde mit Modell 3
Affinitätskonstante K1 | |
1.88349±0.04877 | |
Bindungsfaktor p/q | 0.99937±0.00494 |
unspezifische Bindung nsb | 0.00002±0.00002 |
Antigenäquivalent (Fremdsubstanz) p2 | 0.02810±0.00266 mU/l |
Erläuterung:
Im Reaktionsmedium oder an der Wandung befindet sich eine kreuzreaktive Substanz, die wie 0.028 mU/l TSH wirkt.
Summe der Abweichungsquadrate: 9.2666388420E-09
Modellfehler: 0.0797 Versuchsfehler: 0.2167
Im Reaktionsmedium oder an der Wandung befindet sich eine kreuzreaktive Substanz, die wie 0.028 mU/l TSH wirkt.
Summe der Abweichungsquadrate: 9.2666388420E-09
Modellfehler: 0.0797 Versuchsfehler: 0.2167
Güte der Modellberechnungen:
B/Tberechnet=1.019[±0.010]*B/Tbeobachtet-0.00075[±0.0026]
r²=0.9987
B/Tberechnet=1.019[±0.010]*B/Tbeobachtet-0.00075[±0.0026]
r²=0.9987
Diskriminationsprofil für p=10.000 mU/l | |
IgG-Konz. 1000 cpm | |
Delta-B/T | |
50.032 | |
0.1572 | |
40.025 | 0.1890 |
32.020 | 0.2245 |
25.616 | 0.2625 |
20.493 | 0.3010 |
16.394 | 0.3370 |
13.115 | 0.3675 |
10.492 | 0.3899 |
8.394 | 0.4026 |
6.715 | 0.4048 |
5.372 | 0.3968 |
4.298 | 0.3790 |
3.438 | 0.3524 |
2.751 | 0.3185 |
2.200 | 0.2797 |
1.760 | 0.2385 |
1.408 | 0.1983 |
1.127 | 0.1614 |
0.901 | 0.1295 |
0.721 | 0.1030 |
0.577 | 0.0815 |
0.461 | 0.0644 |
optimale Antikörperkonzentration=6715 cpm
für Antigenkonzentration=10.000 mU/l
- 0.01 m Phosphatpuffer mit pH 7.4 und 0.05% Humanserumalbumin (Serva)
- Anti-E2-Antiserum (3-E2-(3)D), 1 : 20 000
- Estradiol (E2) in den Konzentrationen 0, 0.043, 0.143, 0.429, 1.429, 2.857 und 5.714 nmol/l
- I-125-6-Histamin-Estradiol als Tracer (0.014 nmol/l)
- Estron in den Konzentrationen 0, 0.429 und 5.71 nmol/l
- Dextrankohlesuspension mit 5 mg/ml Aktivkohle (Norit A) und mit 0.5 mg/ml Dextran T 500
- Anti-E2-Antiserum (3-E2-(3)D), 1 : 20 000
- Estradiol (E2) in den Konzentrationen 0, 0.043, 0.143, 0.429, 1.429, 2.857 und 5.714 nmol/l
- I-125-6-Histamin-Estradiol als Tracer (0.014 nmol/l)
- Estron in den Konzentrationen 0, 0.429 und 5.71 nmol/l
- Dextrankohlesuspension mit 5 mg/ml Aktivkohle (Norit A) und mit 0.5 mg/ml Dextran T 500
Es werden 0.5 ml Puffer, der alle Varianten der aufgeführten Estradiol- und
Estronkonzentrationen enthält, zusammen mit 0.1 ml Tracer und 0.1 ml Antiserum
in ein Plaströhrchen gegeben und über Nacht inkubiert. Zugabe von 1 ml
Dextrankohlesuspension. Zentrifugation der Proben. Dekantieren des Überstands
in Plaströhrchen. Messen des Überstands und von 0.1 ml Tracer als Totalwert im
Gammacounter.
Eingaben und Umrechnungen auf B/T und VK-Werte für Standardkurven können mit dem
Programm EINGABE vorgenommen werden. Mit dem Programm ZUSAM wird aus den
zweidimensionalen Versuchen (Standardkurven) ein dreidimensionaler Versuch mit
dem Namen s161091t zusammengestellt. Dieser Versuch wird mit dem Programm
RIAKREUZ ausgewertet. Das Auswerteergebnis ist dem nachfolgenden
Ausgabeprotokoll zu entnehmen.
ausgewertet wurde mit Modell 1
Tracerkonzentration: 0.01400 nmol/l | |
Affinitätskonstante K1 | 0.81216±0.01441 |
Bindungskapazität q | 0.16775±0.00781 nmol/l |
unspezifische Bindung nsb | 0.03365±0.00415 |
Kreuzreaktivität p1/p2 | 0.06076±0.00284 |
Erläuterungen:
- Die verwendete Antiserumverdünnung (1 : 20 000) hat eine Bindungskapazität für 0.168 nmol E2
- Die Kreuzreaktivität Estron(p2) zu Estradiol(p1) beträgt 6.08%.
Summe der Abweichungsquadrate: 5.8483566241E-04
Modellfehler: 0.0249 Versuchsfehler: 0.0355
- Die verwendete Antiserumverdünnung (1 : 20 000) hat eine Bindungskapazität für 0.168 nmol E2
- Die Kreuzreaktivität Estron(p2) zu Estradiol(p1) beträgt 6.08%.
Summe der Abweichungsquadrate: 5.8483566241E-04
Modellfehler: 0.0249 Versuchsfehler: 0.0355
Güte der Modellberechnungen:
B/Tberechnet=0.998[±0.009]*B/Tbeobachtet-0.00041[±0.0028]
r²=0.9987
B/Tberechnet=0.998[±0.009]*B/Tbeobachtet-0.00041[±0.0028]
r²=0.9987
- 0.01 m Phosphatpuffer mit pH 7.4 und 0.05% Humanserumalbumin (Serva)
- β-HCG (Calbiochem) in den Konzentrationen 0, 0.021, 0.042, 0.083, 0.167,
0.333, 0.667 und 1.333 nmol/l
- Protein-A gereinigter polyklonaler Anti-β-HCG Antikörper (4 nmol/l)
- Poolserum in den Verdünnungen 1 (unverdünnt) und 1 : 4
- I-125-β-HCG (0.067 nmol/l) als Tracer
- Protein-A gereinigter polyklonaler Anti-β-HCG Antikörper (4 nmol/l)
- Poolserum in den Verdünnungen 1 (unverdünnt) und 1 : 4
- I-125-β-HCG (0.067 nmol/l) als Tracer
0.1 ml β-HCG, 0.1 ml Antikörper und 0.1 ml Tracer werden zu 0.3 ml Pufferlösung,
zu 0.3 ml 1 : 4 verdünntem Serum und zu 0.3 ml Vollserum gegeben in ein
Plaströhrchen gegeben. Inkubation über Nacht. Zugabe von einer
Präzititationslösung, bestehend aus 1 : 10 verdünnten 2. Antikörper gegen
Kaninchengammaglobulin, Normalkaninchenserum 1 : 100 und 4% PEG 6000.
Nach 15 Minuten unter Zusatz von 1 ml Latex-Wasser zentrifugieren und Überstand
absaugen. Messen der Röhrchen im Gammacounter. Messen von 0.1 ml Tracer als
Totalwert.
Eingaben und Umrechnungen auf B/T und VK-Werte für Standardkurven können mit dem
Programm EINGABE vorgenommen werden. Mit dem Programm ZUSAM wird aus den
zweidimensionalen Versuchen (Standardkurven) ein dreidimensionaler Versuch mit
dem Namen s081289s zusammengestellt. Dieser Versuch wird mit dem Programm
RIAKREUZ ausgewertet. Das Auswerteergebnis ist dem nachfolgenden
Ausgabeprotokoll zu entnehmen.
ausgewertet wurde mit Modell 1
Tracerkonzentration: 0.06700 nmol/l | |
Affinitätskonstante K1 | 1.76139±0.20004 |
Bindungsfaktor q | 0.05535±0.00494 |
unspezifische Bindung nsb | 0.03339±0.00874 |
Kreuzreaktivität p1/p2 | 0.08098±0.00915 |
Erläuterungen:
- Die verwendete Antikörperverdünnung hat eine Bindungskapazität für 0.055 nmol/l β-HCG
- Das Vollserum hat zum β-HCG eine Kreuzreaktivität von 8.1%. Da das Gesamtmilieu bei 0.3 ml Serum zu 0.3 ml Puffer maximal ein Halbserum ist, ist in einem Vollserummilieu mit störenden, unbekannten kreuzreaktiven Substanzen von 0.162 nmol β-HCG-Äquivalent zu rechnen.
Summe der Abweichungsquadrate: 4.2555375171E-03
Modellfehler: 0.0817 Versuchsfehler: 0.0189
- Die verwendete Antikörperverdünnung hat eine Bindungskapazität für 0.055 nmol/l β-HCG
- Das Vollserum hat zum β-HCG eine Kreuzreaktivität von 8.1%. Da das Gesamtmilieu bei 0.3 ml Serum zu 0.3 ml Puffer maximal ein Halbserum ist, ist in einem Vollserummilieu mit störenden, unbekannten kreuzreaktiven Substanzen von 0.162 nmol β-HCG-Äquivalent zu rechnen.
Summe der Abweichungsquadrate: 4.2555375171E-03
Modellfehler: 0.0817 Versuchsfehler: 0.0189
Güte der Modellberechnungen:
B/Tberechnet=0.988[±0.022]*B/Tbeobachtet-0.0029[±0.0061]
r²=0.9887
B/Tberechnet=0.988[±0.022]*B/Tbeobachtet-0.0029[±0.0061]
r²=0.9887
- 0.02 m Tris-Puffer mit pH 8.7 und 0.5% Humanserumalbumin (HSA; Serva)
- Protein-A gereinigtes anti-T3-IgG (1.406 nmol/l) als Antikörper.
- Triiodthyronin (T3; Henning, Berlin) als Antigen in den Konzentrationen 0, 0.157, 0.312, 0.624, 1.249, 2.498, 4.992 und 10 nmol/l
- HSA in den Konzentrationen 8.33, 30.0 und 103.3 µmol/l
- I-125-T3 (0.215 nmol/l) als Tracer
- Protein-A gereinigtes anti-T3-IgG (1.406 nmol/l) als Antikörper.
- Triiodthyronin (T3; Henning, Berlin) als Antigen in den Konzentrationen 0, 0.157, 0.312, 0.624, 1.249, 2.498, 4.992 und 10 nmol/l
- HSA in den Konzentrationen 8.33, 30.0 und 103.3 µmol/l
- I-125-T3 (0.215 nmol/l) als Tracer
0.1 ml T3, 0.1 ml Antikörper und 0.1 ml Tracer werden zu 0.2 ml Puffer
unterschiedlicher HSA-Konzentration in ein Plaströhrchen gegeben. Nach 2 h
Inkubation Zugabe von einer Präzititationslösung, bestehend aus 1 : 20 verdünnten
2. Antikörper gegen Kaninchengammaglobulin, Normalkaninchenserum 1 : 100 und 4%
PEG 6000.
Nach 15 Minuten mit 1 ml Latex-Lösung zentrifugieren und Überstand absaugen.
Messen der Röhrchen im Gammacounter. Messen von 0.1 ml Tracer als Totalwert.
Eingaben und Umrechnungen auf B/T und VK-Werte für Standardkurven können mit dem
Programm EINGABE vorgenommen werden. Mit dem Programm ZUSAM wird aus den
zweidimensionalen Versuchen (Standardkurven) ein dreidimensionaler Versuch mit
dem Namen s170589s zusammengestellt. Dieser Versuch wird mit dem Programm
RIAKREUZ ausgewertet. Das Auswerteergebnis ist dem nachfolgenden
Ausgabeprotokoll zu entnehmen.
ausgewertet wurde mit Modell 1
Tracerkonzentration: 0.21500 nmol/l | |
Affinitätskonstante K1 | 1.54015±0.05858 |
Bindungskapazität q | 0.80873±0.06008 nmol/l |
unspezifische Bindung nsb | 0.01135±0.00917 |
Kreuzreaktivität p1/p2 | 0.02209±0.00138 |
Erläuterungen:
- Die 1.406 nmol/l anti-T3-IgG haben eine Bindungsskapazität für 0.809 nmol/l T3
- HSA in µmol-Mengen ist 2.2% kreuzreaktiv zu T3 in nmol-Mengen. Die Kreuzreaktivität des HSA zu T3 ist somit 0.0022%
Summe der Abweichungsquadrate: 3.0584606053E-03
Modellfehler: 0.0825 Versuchsfehler: 0.0513
- Die 1.406 nmol/l anti-T3-IgG haben eine Bindungsskapazität für 0.809 nmol/l T3
- HSA in µmol-Mengen ist 2.2% kreuzreaktiv zu T3 in nmol-Mengen. Die Kreuzreaktivität des HSA zu T3 ist somit 0.0022%
Summe der Abweichungsquadrate: 3.0584606053E-03
Modellfehler: 0.0825 Versuchsfehler: 0.0513
Güte der Modellberechnungen:
B/Tberechnet=0.995[±0.017]*B/Tbeobachtet-0.0013[±0.0053]
r²=0.9938
B/Tberechnet=0.995[±0.017]*B/Tbeobachtet-0.0013[±0.0053]
r²=0.9938
- TSH (eigener Sekundärstandard in Serumverdünnung) in den Konzentrationen:
0, 0.16, 0.31, 1.25, 5, 20 und mU/l
- I-125-monoklonaler Antikörper (I-125-MAK; ZIM, Micheel) a 20 KBq/ml als Tracer
- Normales humanes Männerserum in 1 : 400 Verdünnung und 1% Tween 80 mit und ohne 46.9 µmol/l Rindergammaglobulin als Reaktionsmilieu
- gereinigte polyklonale anti-TSH-Antikörper (1 : 2000) vom Kaninchen
- Normalkaninchenserum (NKS; 1 : 100-Verdünnung)
- Präzipitationsantikörper von der Ziege gegen Kaninchen-Gammaglobulin in einem Fällungsgemisch zusammen mit NKS und PEG 6000-Verdünnung.
- I-125-monoklonaler Antikörper (I-125-MAK; ZIM, Micheel) a 20 KBq/ml als Tracer
- Normales humanes Männerserum in 1 : 400 Verdünnung und 1% Tween 80 mit und ohne 46.9 µmol/l Rindergammaglobulin als Reaktionsmilieu
- gereinigte polyklonale anti-TSH-Antikörper (1 : 2000) vom Kaninchen
- Normalkaninchenserum (NKS; 1 : 100-Verdünnung)
- Präzipitationsantikörper von der Ziege gegen Kaninchen-Gammaglobulin in einem Fällungsgemisch zusammen mit NKS und PEG 6000-Verdünnung.
0.2 ml TSH und 0.1 ml Tracer in ein Plaströhrchen geben. Über Nacht inkubieren
lassen. 0.1 ml polyklonaler Antikörper mit NKS dazu. Nach einer Stunde
Fällungsgemisch dazu und nach einer weiteren Stunde waschen, zentrifigieren,
absaugen und Röhrchen im Gammacounter messen. Messen von 0,1 ml Tracer als
Totalwert. Eingaben und Umrechnungen auf B/T und VK-Werte für Standardkurven
können mit dem Programm EINGABE vorgenommen werden.
Mit dem Programm ZUSAM wird aus den zweidimensionalen Versuchen (Standardkurven)
ein dreidimensionaler Versuch mit dem Namen s270788t zusammengestellt.
Dieser Versuch wird mit dem Programm IRMKREUZ ausgewertet. Das Auswerteergebnis
ist dem nachfolgenden Ausgabeprotokoll zu entnehmen.
ausgewertet wurde mit Modell 3
Affinitätskonstante K1 | |
1.02286±0.01064 | |
Bindungskapazität q | 19.67130±0.48317 mU/l |
unspezifische Bindung nsb | 0.00337±0.00017 |
Erhöhungsfaktor der Bindungskapazität | 0.02999±0.01311 |
Erläuterungen:
- Die beiden verwendeten Antikörper (markierter und unmarkierter Antikörper) haben eine gemeinsame Bindungskapazität für 19.67 mU/l TSH
- Durch das Rindergammaglobulin wird diese Bindungskapazität noch um 0.03× Gammaglobulinkonzentration erhöht. Die 46.9 µmol/l Gammaglobulin wirken wie eine zusätzliche Bindungskapazität von 1.407 mU/l.
- Die beiden verwendeten Antikörper (markierter und unmarkierter Antikörper) haben eine gemeinsame Bindungskapazität für 19.67 mU/l TSH
- Durch das Rindergammaglobulin wird diese Bindungskapazität noch um 0.03× Gammaglobulinkonzentration erhöht. Die 46.9 µmol/l Gammaglobulin wirken wie eine zusätzliche Bindungskapazität von 1.407 mU/l.
Summe der Abweichungsquadrate: 3.2190517302E-06
Modellfehler: 0.0538 Versuchsfehler: 0.0486
Modellfehler: 0.0538 Versuchsfehler: 0.0486
Güte der Modellberechnungen:
B/Tberechnet=0.9963[±0.0042]*B/Tbeobachtet-0.00023[±0.0010]
r²=0.9998
B/Tberechnet=0.9963[±0.0042]*B/Tbeobachtet-0.00023[±0.0010]
r²=0.9998
Verwendete Abkürzungen:
Abweich.: (B/Tbeobachtet-B/Tberechnet)/B/Tbeobachtet absolut, ohne Vorzeichen
B/F-Trennung: Trennung des gebundenen Antigen (B=bound) vom freien Antigen (F=free)
B/T: Bevorzugte Angabe der Response als antikörpergebundenes Antigen (B) geteilt durch das Gesamtantigen (T=total)
Delta-B/T: Differenz der B/T-Werte zwischen niedriger und hoher Antigenkonzentration in Titerkurven
bLH: bovines luteinisierendes Hormon
cpm: counts per minute (Zählrate bei der Aktivitätsmessung)
K: Affinitätskonstante
I-125: radioaktives Isotop des Iod mit der Massenzahl 125
MAK: Monoklonaler Antikörper
MWG: Massenwirkungsgesetz
NKS: Normales Kaninchenserum
p: Antigenkonzentration bzw. Antikörperbindungskapazität des Antigen
PEG 6000: Polyethylenglykol mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 6000
q: Antikörperkonzentration bzw. Antigenbindungskapazität des Antikörper
VK: Variationskoeffizient der Reponse oder der Antigenkonzentration
β-HCG: Beta-Kette des humanen Chorion Gonadotropins
r²: Bestimmtheitsmaß, Quadrat des Korrelationskoeffizienten
Abweich.: (B/Tbeobachtet-B/Tberechnet)/B/Tbeobachtet absolut, ohne Vorzeichen
B/F-Trennung: Trennung des gebundenen Antigen (B=bound) vom freien Antigen (F=free)
B/T: Bevorzugte Angabe der Response als antikörpergebundenes Antigen (B) geteilt durch das Gesamtantigen (T=total)
Delta-B/T: Differenz der B/T-Werte zwischen niedriger und hoher Antigenkonzentration in Titerkurven
bLH: bovines luteinisierendes Hormon
cpm: counts per minute (Zählrate bei der Aktivitätsmessung)
K: Affinitätskonstante
I-125: radioaktives Isotop des Iod mit der Massenzahl 125
MAK: Monoklonaler Antikörper
MWG: Massenwirkungsgesetz
NKS: Normales Kaninchenserum
p: Antigenkonzentration bzw. Antikörperbindungskapazität des Antigen
PEG 6000: Polyethylenglykol mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 6000
q: Antikörperkonzentration bzw. Antigenbindungskapazität des Antikörper
VK: Variationskoeffizient der Reponse oder der Antigenkonzentration
β-HCG: Beta-Kette des humanen Chorion Gonadotropins
r²: Bestimmtheitsmaß, Quadrat des Korrelationskoeffizienten
Claims (5)
1. Verfahren zur Schnelloptimierung und gezielten Qualitätskontrolle
von Immunoassays aller Provenienzen,
dadurch gekennzeichnet, daß die Bindungsraten
eines bestimmten Antigen-Antikörper-Komplexes,
gegebenenfalls unter Zufügung eines oder mehrerer weiterer
Stoffe oder nach Verdünnung, bestimmt werden, die Daten
mathematisch erfaßt und in den dreidimensionalen Versuch
überführt werden und nachfolgend die mathematische Auswertung
für die Anpassung und Optimierung des Assays erfolgt.
2. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß die Bindungsraten an 2-3
Standardkurven bzw. 2-3 Titerkurven mit 2-3 deutlich verschiedenen
Konzentrationen des jeweils anderen Reaktionspartners
bestimmt werden.
3. Verfahren zur Schnelloptimierung von Immunoassays aller
Provenienzen nach Anspruch 1 und 2,
dadurch gekennzeichnet, daß die Bindungsraten eines bestimmten
Antigen-Antikörper-Komplexes bei gleichzeitiger
Variation sowohl der Antigen- als auch der Antikörper-
Konzentration bestimmt werden, die Daten optional erfaßt
und mit dem Programm ZUSAM in den dreidimensionalen Versuch
überführt werden, wobei erforderlichenfalls, eine Vertauschung
der Feldfolge mit dem Programm VARIABLE erfolgt,
und nachfolgend mit den Programmen RIAOPT bzw. IRMAOPT die
Auswertung und Optimierung des Assays für eine vorgewählte
Antigenkonzentration erfolgt.
4. Verfahren zur gezielten Qualitätskontrolle von Immunoassays
aller Provenienzen nach Anspruch 1 und 2,
dadurch gekennzeichnet, daß die Bindungsraten eines bestimmten
Antigen-Antikörper-Komplexes bei fixer Antikörper-
Konzentration durch gleichzeitige Variation der Antigen-Konzentration
und eines zugefügten Fremdantigens und/oder der
Variation des Reaktionsgemisches durch seine Verdünnung
oder Aufstockung bestimmt werden, die Daten erfaßt und mit
dem Programm ZUSAM in den dreidimensionalen Versuch überführt
werden, wobei erforderlichenfalls eine Vertauschung
der Feldfolge mit dem Programm VARIABLE erfolgt und nachfolgend
mit den Programmen RIAKREUZ bzw. IRMKREUZ eine
Auswertung und die Beschreibung der Auswirkung einer vorgegebenen
Konzentration von Fremdantigenen und einer Mediumkonzentration
auf die Richtigkeit des Assays erfolgt.
5. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach den Ansprüchen
1-4,
dadurch gekennzeichnet, daß sie automatische Pipettier-
und Verdünnungseinrichtungen enthält, welche Verdünnungs-
und Aufstockungsschritte des Reaktionsmediums vornehmen
und dadurch den 2-dimensionalen Immunoassayversuch programmtechnisch
in einen dreidimensionalen Versuch überführen
und nachfolgend mit den mathematischen Programmen verbinden.
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19914138712 DE4138712A1 (de) | 1991-11-20 | 1991-11-20 | Verfahren zur schnelloptimierung und gezielten qualitaetskontrolle von immunoassays aller provenienzen sowie vorrichtung zur durchfuehrung des verfahrens |
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