DE4110548A1 - Competitive binding assay for herbicides - by competition with quinone aldehyde for photo-system II receptors - Google Patents

Competitive binding assay for herbicides - by competition with quinone aldehyde for photo-system II receptors

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DE4110548A1 DE19914110548 DE4110548A DE4110548A1 DE 4110548 A1 DE4110548 A1 DE 4110548A1 DE 19914110548 DE19914110548 DE 19914110548 DE 4110548 A DE4110548 A DE 4110548A DE 4110548 A1 DE4110548 A1 DE 4110548A1
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Abstract

Detection of herbicides that interfere with the photosystem II of plants is effected by a competitive binding assay in which a quinone aldehyde (I) and the herbicide compete for binding to photosystem II receptors. The source of photosystem II receptors may be (a) reaction centres isolated from photosynthetic bacteria, e.g. Rhodobacter sphaeroides, or (b) thyalkoid prepns. isolated from green plants, e.g. spinach. (I) is a quinone nonanal, e.g. 9-(5,6-dimethoxy-3-methyl- 1,4-benzoquinon-2-yl)nonanal, 9-(1,4-benzoquinon-2-yl)nonanal or 9-(1,4-naphthoquinon-2-yl)nonanal or 9-(3-methyl-1,4-naphthoquinon-2-yl)nonanal. USE - The assay may be used, e.g., to detect contamination of drinking water by herbicides such as triazines or phenylureas.

Description

Die moderne Landwirtschaft stützt sich ganz wesentlich auf den Einsatz von Pestiziden. Von den verschiedenen Pestizidklassen haben die Herbizide den mengenmäßig größten Anteil. Unter den Herbiziden selbst dominieren wiederum die Photosystem-II-Herbi­ zide (PS-II-Herbizide), wie Triazine und Phenylharnstoffe. Durch die häufige Anwendung der PS-II-derbizide treten viele Vertreter dieser Klasse unerwünschterweise im Trinkwasser auf. Es besteht daher ein Bedürfnis, Herbizide in einfacher Weise nachzuweisen.Modern agriculture relies heavily on that Use of pesticides. From the different classes of pesticides herbicides have the largest share in terms of quantity. Among the Herbicides themselves dominate Photosystem II herbi zide (PS-II herbicides) such as triazines and phenylureas. By The frequent use of PS-II derbicides occurs in many representatives this class undesirably in drinking water. It exists hence a need to easily detect herbicides.

Dazu wird nun erfindungsgemäß ein Verfahren vorgeschlagen, bei dem manAccording to the invention, a method is now proposed for this purpose which one

  • a) auf das Photosystem II, an das Chinonaldehyd gekoppelt ist, ein Herbizid einwirken und gekoppelten Chinonaldehyd ver­ drängen läßt, und gegebenenfalls,a) to Photosystem II, to which quinonaldehyde is coupled, act a herbicide and coupled quinonaldehyde ver urges, and if necessary,
  • b) die Menge des Herbizids, das Chinonaldehyd verdrängt hat, auf Basis der Lichtmenge bestimmt, die Luciferase in an sich bekannter Weise in Gegenwart des verdrängten Chinonaldehyds erzeugt.b) the amount of the herbicide that has displaced quinonaldehyde, determined based on the amount of light, the luciferase in itself known manner in the presence of the displaced quinonaldehyde generated.

Erfindungsgemäß werden also Chinonaldehyde eingesetzt, wie sie beispielsweise in der deutschen Patentanmeldung P 40 34 420.7 beschrieben sind. Wenn man erfindungsgemäß Chinonaldehyde ein­ setzt, so macht man sich ihre Eigenschaft zunutze, daß sich die Chinonkomponente des Chinonaldehyds mit dem Photosystem II kop­ peln und wiederum durch Herbizide verdrängen läßt. Andererseits bietet die Verwendung von Chinonaldehyden die Möglichkeit, daß man Chinonaldehyd quantitativ mit Hilfe von Biolumineszenzlicht bestimmen kann, das in an sich bekannter Weise in Gegenwart von Luciferase erzeugt wird. Durch diese quantitative Chinonaldehyd­ bestimmung läßt sich wiederum quantitativ das Herbizid bestim­ men, das den freigesetzten Chinonaldehyd verdrängte.According to the invention, quinonaldehydes are used as they are for example in German patent application P 40 34 420.7 are described. If one according to the invention a quinonaldehydes  sets, one takes advantage of their property that the Quinone component of quinonaldehyde with Photosystem II cop peln and again displaced by herbicides. On the other hand the use of quinonaldehydes offers the possibility that to quinonaldehyde quantitatively using bioluminescent light can determine that in a conventional manner in the presence of Luciferase is generated. Through this quantitative quinonaldehyde determination can again quantitatively determine the herbicide men, which displaced the released quinonaldehyde.

Es ist bekannt, daß bakterielle Luciferasen in Anwesenheit von reduziertem Flavomononukleotid (FMNH2), Sauerstoff und langket­ tigen aliphatischen Aldehyden in der Lage sind, Biolumineszenz­ licht zu erzeugen:It is known that bacterial luciferases in the presence of reduced flavomononucleotide (FMNH 2 ), oxygen and long-chain aliphatic aldehydes are able to produce bioluminescent light:

In vitro spricht die Luciferase auf Aldehyde einer aliphatischen Kette einer Länge von 8 bis 18 Kohlenstoffatomen mit einem Maxi­ mum bei 10 bis 14 Kohlenstoffatomen an. Die sehr effektive Um­ setzung von chemischer Energie in Lichtenergie ermöglicht den Nachweis extrem niedriger Konzentrationen von Aldehyden. Auf diese Tatsache ist es zurückzuführen, daß sich bakterielle Lu­ ciferasen erfindungsgemäß für ein attraktives Nachweisverfahren für Herbizide eignen.In vitro, the luciferase responds to aldehydes of an aliphatic one Chain of 8 to 18 carbon atoms in length with a maxi mum at 10 to 14 carbon atoms. The very effective order The conversion of chemical energy into light energy enables the Detection of extremely low concentrations of aldehydes. On this fact is due to the fact that bacterial Lu ciferases according to the invention for an attractive detection method suitable for herbicides.

Dem Stand der Technik war bisher lediglich zu entnehmen, daß man durch die angesprochene Erzeugung von Biolumineszenzlicht Alde­ hyde, wie n-Decanal, oder FMNH2 oder damit verknüpfte Substanzen nachweisen kann, beispielsweise NAD über eine NADH-FMN-Oxi­ doreduktase. Luciferasen sind im Handel erhältlich, ebenso FMNH2 und n-Decanal.The prior art has so far only been able to show that the aforementioned generation of bioluminescent light can detect alde hyde, such as n-decanal, or FMNH 2 or substances linked to it, for example NAD via a NADH-FMN-oxi-doreductase. Luciferases are commercially available, as are FMNH 2 and n-decanal.

Das Photosystem II liegt in höheren Pflanzen, phototrophen Bak­ terien und Blaualgen (Cyanobakterien) vor. Das Photosystem II läßt sich im erfindungsgemäßen Verfahren auch in Form von Chro­ matophoren, Chloroplasten (Organellen) oder Membranen der Chlo­ roblasten (Thylakoiden) verwenden.Photosystem II is in higher plants, phototrophic Bak teries and blue-green algae (cyanobacteria). The Photosystem II can also be in the form of chro in the process according to the invention  matophores, chloroplasts (organelles) or membranes of the Chlo Use roblasts (thylakoids).

Zum Stand der Technik sei beispielsweise verwiesen auf
Kuwabara & Murata, Plant Gell Physiol., 23 (1982) 533-539 für das Photosystem 11 höherer Pflanzen,
Clayton & Wang, Methods Enzymology, 23 (1971) 696-704 für das Photosystem 11 phototropher Bakterien und ihrer Chromatophoren,
Hirschberg et al., Z. Naturforsch., 42 C (1987) 758-761 für das Photosystem 11 von Blaualgen und
Nelson, J. Biol. Chem., 246 (1970) 3204-3209 für das Photosystem 11 in Form von Chloroplasten und Thylakoiden.With regard to the prior art, reference is made, for example, to
Kuwabara & Murata, Plant Gell Physiol., 23 (1982) 533-539 for the photosystem 11 of higher plants,
Clayton & Wang, Methods Enzymology, 23 (1971) 696-704 for the photosystem 11 phototrophic bacteria and their chromatophores,
Hirschberg et al., Z. Naturforsch., 42 C (1987) 758-761 for photosystem 11 from blue-green algae and
Nelson, J. Biol. Chem., 246 (1970) 3204-3209 for photosystem 11 in the form of chloroplasts and thylakoids.

Grundlage für die Wirkung der PS-II-Herbizide ist die Kompe­ tition mit der Chinonkomponente (Ubichinon) des Chinonaldehyds um eine gemeinsame Bindungsstelle (QB) am Photosystem II. Ein denkbares verallgemeinertes Meßprinzip beider Stufen des erfin­ dungsgemäßen Verfahrens kann somit folgendermaßen beschrieben werden. Eine Rezeptorbindungsstelle (hier: QB-Bindungsstelle des Photosystems II) wird mit einem Chinonaldehyd als Ligand be­ setzt. In Gegenwart einer bestimmten Menge eines Herbizids wird eine äquivalente Menge Chinonaldehyd verdrängt. Freigesetzter Chinonaldehyd ist für die Luciferase verfügbar, wird von der Lu­ ciferase als Aldehyd erkannt und als Aldehydsubstrat umgesetzt. In Abhängigkeit von der Menge an freigesetztem Chinonaldehyd ist Lumineszenzlicht nachweisbar; vgl. Abb. 1. The basis for the action of the PS-II herbicides is the composition with the quinone component (ubiquinone) of the quinonaldehyde around a common binding site (Q B ) on the photosystem II. A conceivable generalized measurement principle of both stages of the process according to the invention can thus be described as follows. A receptor binding site (here: Q B binding site of Photosystem II) is set with a quinonaldehyde as a ligand. In the presence of a certain amount of a herbicide, an equivalent amount of quinonaldehyde is displaced. Released quinonaldehyde is available for the luciferase, is recognized by the luciferase as aldehyde and converted as an aldehyde substrate. Depending on the amount of quinonaldehyde released, luminescent light can be detected; see. Fig. 1.

Charakterisierung der Wechselwirkung zwischen Chinonaldehyden und bakterieller LuciferaseCharacterization of the interaction between quinonaldehydes and bacterial luciferase

Die Wirksamkeit der Chinonaldehyde gegenüber bakterieller Lu­ ciferase konnte an mehreren Luciferasen nachgewiesen werden. Das Aktivitätsmaximum bezüglich der Aldehydkettenlänge und die Sub­ stratspezifität bezüglich des Chinonanteils wurden ebenfalls be­ stimmt; vgl. Abb. 2 und 3. Hier stellte sich heraus, daß die wirksamsten Chinonaldehyde genauso aktiv sind wie der Stan­ dardaldehyd n-Decanal. The effectiveness of quinonaldehydes against bacterial luciferase was demonstrated on several luciferases. The activity maximum with regard to the aldehyde chain length and the substrate specificity with regard to the quinone content were also determined; see. Fig. 2 and 3. Here it turned out that the most effective quinonaldehydes are just as active as the standard daldaldehyde n-decanal.

Bindung der Chinonaldehyde an die QB-Bindungsstelle.
Ein Analogon zum Photosystem II der höheren Pflanzen findet man auch in photosynthetischen Bakterien (beispielsweise Rhodobacter sphaeroides). In beiden Systemen wurde die Bindung der Chinonaldehyde nachgewiesen.Binding of the quinonaldehydes to the Q B binding site.
An analogue to Photosystem II of the higher plants can also be found in photosynthetic bacteria (for example Rhodobacter sphaeroides). The binding of the quinonaldehydes was demonstrated in both systems.

Bei den höheren Pflanzen wurden Bindungsstudien an isolierten Thylakoiden aus Spinatblättern durchgeführt. Eine vorgelegte Menge an radioaktiv markiertem Herbizid wird durch steigende Konzentrationen an Chinonaldehyd verdrängt (s. Abb. 4 u. 5). Eine Kompetition durch die nichtderivatisierten Chinone (Ubichinon, Naphthochinon, Benzochinon und 2-Methyl- naphthochinon) wurde nicht beobachtet. Das heißt, daß die Bindungskonstanten für die Chinonaldehyde aufgrund des Alkylrestes erwartungsgemäß besser sind, als die der nichtderivatisierten Chinone.In the higher plants, binding studies were carried out on isolated thylakoids from spinach leaves. A given amount of radiolabelled herbicide is displaced by increasing concentrations of quinonaldehyde (see Fig. 4 and 5). Competition from the underivatized quinones (ubiquinone, naphthoquinone, benzoquinone and 2-methylnaphthoquinone) was not observed. This means that the binding constants for the quinonaldehydes are expected to be better than those of the non-derivatized quinones due to the alkyl radical.

Für das bakterielle System wurde der zentrale Teil des Photosystems, das Reaktionszentrum, isoliert und der Anteil an internem Ubichinon aus der QB-Bindungsstelle entfernt. Aktivitätsmessungen (s. experimenteller Teil) zeigen, daß die Chinonaldehyde an das Reaktionszentrum binden und darüber hinaus noch photochemisch aktiv sind. Die nichtderivatisierten Chinone sind bis auf Ubichinon (UQ0) alle photochemisch inaktiv (s. Tab. 1).For the bacterial system, the central part of the photosystem, the reaction center, was isolated and the proportion of internal ubiquinone removed from the Q B binding site. Activity measurements (see experimental part) show that the quinonaldehydes bind to the reaction center and are also photochemically active. With the exception of ubiquinone (UQ 0 ), the non-derivatized quinones are all photochemically inactive (see Table 1).

In Hinsicht auf die Verwendung der bakteriellen Luciferase in einem automatisierten Analysesystem konnte die Adaption der Reaktion mittels einer Durchflußlumineszenzküvette auf ein Fieß- Injektions-System (FIA) gezeigt werden (Fließbild s. Abb. 6). Die Abhängigkeit von der Flußrate wurde, wie in Abb. 7 dargestellt, bestimmt. With regard to the use of bacterial luciferase in an automated analysis system, the adaptation of the reaction using a flow-through luminescence cuvette to a flow injection system (FIA) was shown (flow diagram see Fig. 6). The dependence on the flow rate was determined as shown in Fig. 7.

Tabelle 1 Table 1

Aktivitätstest am isolierten Reaktionszentrum von Rhodobacter sphaeroides Activity test on the isolated Rhodobacter sphaeroides reaction center

Abb. 1:
Allgemeines Schema zum Nachweis von Liganden Fig. 1:
General scheme for the detection of ligands

Abb. 2:
Beziehung zwischen der Luciferaseaktivität und der Aldehydkettenlänge von w-(1,4-Chinon-2-yl)alkanolen (NQXA) NQ9A=9-(1,4-Naphthochinon-2-yl)nonanal
Luciferasen aus Photobacterium fischeri (Boehringer) und Vibrio harveyi (selbst isoliert) Fig. 2:
Relationship between the luciferase activity and the aldehyde chain length of w- (1,4-quinon-2-yl) alkanols (NQXA) NQ9A = 9- (1,4-naphthoquinon-2-yl) nonanal
Luciferases from Photobacterium fischeri (Boehringer) and Vibrio harveyi (self-isolated)

Abb. 3:
Konzentrationsabhängigkeit der Luciferaseaktivität von verschiedenen w-(1,4-Chinon-2-yl)nonanalen
UQ9A=9-(5,6-Dimethoxy-3-methyl-1,4-benzochinon-2-yl)nonanal
BQ9A=9-(1,4-Benzochinon-2-yl)-nonanal
NQ9A=9-(1,4-Naphthochinon-2-yl)nonanal
VitK9A=9-(3-Methyl-1,4-naphthochinon-2-yl)nonanal Fig. 3:
Concentration dependence of the luciferase activity of various w- (1,4-quinon-2-yl) nonanal
UQ9A = 9- (5,6-dimethoxy-3-methyl-1,4-benzoquinon-2-yl) nonanal
BQ9A = 9- (1,4-benzoquinon-2-yl) nonanal
NQ9A = 9- (1,4-naphthoquinon-2-yl) nonanal
VitK9A = 9- (3-methyl-1,4-naphthoquinon-2-yl) nonanal

Abb. 4+5
Verdrängung von 14C-Terbutryn (0,2 nmol) durch w-(1,4-Chinon-2-yl)nonanalen Fig. 4 + 5
Displacement of 14C-terbutryn (0.2 nmol) by w- (1,4-quinon-2-yl) nonanal

UQ9A=9-(5,6-Dimethoxy-3-methyl-1,4-benzochinon-2-yl)nonanal
BQ9A=9-(1,4-Benzochinon-2-yl)-nonanal
NQ9A=9-(1,4-Naphthochinon-2-yl)nonanal
VitK9A=9-(3-Methyl-1,4-naphthochinon-2-yl)nonanalUQ9A = 9- (5,6-dimethoxy-3-methyl-1,4-benzoquinon-2-yl) nonanal
BQ9A = 9- (1,4-benzoquinon-2-yl) nonanal
NQ9A = 9- (1,4-naphthoquinon-2-yl) nonanal
VitK9A = 9- (3-methyl-1,4-naphthoquinon-2-yl) nonanal

Abb. 6:
Fließschema der Meßvorrichtung für die Bestimmung der Luciferaseaktivität in einem Fließ-Injektions-System Fig. 6:
Flow diagram of the measuring device for determining the luciferase activity in a flow injection system

Abb. 7:
Abhängigkeit der Luciferaseaktivität von der Flußrate im Fließ-Injektions-System
RLU/ s=Relative Lichteinheiten pro Sekunde Fig. 7:
Dependency of luciferase activity on the flow rate in the flow injection system
RLU / s = Relative light units per second

Experimenteller TeilExperimental part Isolierung der Reaktionszentren aus Rhodobacter sphaeroides ZellaufschlußIsolation of the reaction centers from Rhodobacter sphaeroides Cell disruption

Die Zellen werden in 20 mM Tris pH 8 (Puffer A) mit einem Homogenisator homogenisiert. Die Zellsuspension wird anschließend 45 Minuten bei Raumtemperatur mit Lysozym und DNAse I inkubiert. Danach werden die Zellen durch eine Ultraschallbehandlung im Eisbad aufgeschlossen (60 Minuten Stufe 5 kontinuierlich). Es schließt sich eine 30 minütige Zentrifugation bei 12 000 rpm (Sorvall 5534) zum abtrennen der Zelltrummer an. Die Chromatophoren werden in der Ultrazentrifuge bei 100 000 xg pelletiert (Ti60, 45 000 rpm) und das Pellet anschließend in Puffer A homogenisiert.The cells are in 20 mM Tris pH 8 (buffer A) with a Homogenizer homogenized. The cell suspension will then 45 minutes at room temperature with lysozyme and DNAse I incubated. Then the cells are replaced by a Ultrasound treatment in an ice bath unlocked (60 minutes step 5 continuously). It closes a 30 minute Centrifugation at 12,000 rpm (Sorvall 5534) to separate the Cell drummer. The chromatophores are in the ultracentrifuge pelletized at 100,000 xg (Ti60, 45,000 rpm) and the pellet then homogenized in buffer A.

Fraktionierte ExtraktionFractional extraction

Das Volumen der obigen Suspension wird auf OD868= 50 eingestellt und der ersten Extraktion zugeführt. Hierzu wird die Suspension auf 125 mM NaCl, 0,5 mM PMSF und 0,25% N,N- Dimethyldodecylaminooxid (LDAO) gebracht und 45 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln rühren gelassen. Die Chromatophoren werden erneut wie oben zentrifugiert (2 Stunden, 100 000 xg) und der Überstand verworfen. Das Pellet wird im gleichen Volumen wie bei der ersten Extraktion in Puffer A aufgenommen und homogenisiert. Für die zweite Extraktion werden 125 mM NaCl und 0,25% LDAO dazugegeben und 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln rühren gelassen. Anschließend wird nochmals 2 Stunden bei 45 000 rpm zentrifugiert der Überstand mit dem gleichen Volumen Puffer A versetzt und für die erste Ionenaustauschchromatographie verwendet.The volume of the above suspension is adjusted to OD 868 = 50 and fed to the first extraction. For this purpose, the suspension is brought to 125 mM NaCl, 0.5 mM PMSF and 0.25% N, N-dimethyldodecylaminooxide (LDAO) and left to stir for 45 minutes at room temperature in the dark. The chromatophores are centrifuged again as above (2 hours, 100,000 xg) and the supernatant is discarded. The pellet is taken up in the same volume as in the first extraction in buffer A and homogenized. For the second extraction, 125 mM NaCl and 0.25% LDAO are added and the mixture is stirred for 30 minutes at room temperature in the dark. The supernatant is then centrifuged again at 45,000 rpm for 2 hours with the same volume of buffer A and used for the first ion exchange chromatography.

IonenaustauschchromatographienIon exchange chromatography

Der verdünnte Überstand der zweiten Extraktion wird auf eine DE 52 Säule (DEAE-Cellulose mit Puffer A äquilibriert, 30 × 2 cm) mit ca. 100 ml/Minute geladen. Die Säule muß bei allen Operationen vom Licht abgeschirmt sein und die Isolierung kann bei Raumtemperatur erfolgen. Gewaschen wird die beladene Säule über Nacht mit Puffer A + 0,08% LDAO und 80 mM NaCl. Im zweiten Waschgang wird die Salzkonzentration des Puffers auf 110 mM und im dritten auf 135 mM NaCl erhöht. Die Elution erfolgt mit dem gleichen Puffer aber 205 mM NaCl. Von den Eluaten werden Spektren aufgenommen und die reaktionszentren-enthaltenden Fraktionen über Nacht gegen Puffer A + 0,08% LDAO bei 4°C im Dunkeln dialysiert.The diluted supernatant of the second extraction is made on a DE  52 column (DEAE cellulose equilibrated with buffer A, 30 × 2 cm) charged with approx. 100 ml / minute. The pillar must be with everyone Operations can be shielded from light and the insulation can at room temperature. The loaded column is washed overnight with buffer A + 0.08% LDAO and 80 mM NaCl. In the second Wash cycle, the salt concentration of the buffer to 110 mM and increased to 135 mM NaCl in the third. The elution takes place with the same buffer but 205 mM NaCl. From the eluates Spectra recorded and those containing reaction centers Fractions overnight against buffer A + 0.08% LDAO at 4 ° C in Dark dialyzed.

Der zweite Reinigungsschritt erfolgt mittels einer MONO Q-Säule mit einem FPLC-System unter folgenden Bedingungen: -8 ml Mono Q-Säule von PharmaciaThe second cleaning step is carried out using a MONO Q column with an FPLC system under the following conditions: -8 ml Mono Q pillar from Pharmacia

  • - Puffer A: 10 mM Tris pH8, 0,08% LDAOBuffer A: 10 mM Tris pH8, 0.08% LDAO
  • - Puffer B: Puffer A + 200 mM NaClBuffer B: Buffer A + 200 mM NaCl
  • - Flußrate 3,5 ml/Minute- flow rate 3.5 ml / minute
  • - Säule mit Puffer A + 400 mM NaCl- Column with buffer A + 400 mM NaCl

waschen, mit Puffer A äquilibrieren und mit Protein beladenwash, equilibrate with buffer A and loaded with protein

  • - 20 ml Puffer A- 20 ml of buffer A
  • - 200 ml Gradient von 0 bis 100% Puffer B- 200 ml gradient from 0 to 100% buffer B
  • - 40 ml Puffer B- 40 ml buffer B

Die Elution wird über einen UV-Detektor verfolgt und die reaktionszentrumhaltigen Fraktionen durch Absorptionsspektren identifiziert.The elution is followed by a UV detector and the fractions containing reaction centers by absorption spectra identified.

Entfernen des UQ10 aus der QB-Bindungsstelle und Rekonstitution mit Chinonen
Zu ca. 2 ml DEAE-Cellulose-Ionenaustascher (DE 52 von Whatman) werden ca. 20 ml Reaktionszentrum (RC) (OD804 = 0.92 = 60 nmol) gegeben und unter leichtem Schütteln 10 Minuten inkubiert. Anschließend wird die Suspension in eine Säule gegeben, in der ein kleines Sephadex G-200-Bett vorgelegt wurde. Die Temperatur wird auf 26°C eingestellt und die Säule mit 70 ml 20 mM Tris pH 8/ 3% LDAO/ 1 mM o-Phenanthrolin/ 1 mM DTT gewaschen (Flußrate ca. 1,5 ml/min). Es folgt ein zweiter Waschvorgang mit 20 mM Tris pH 8/ 0,08% LDAO (150 ml) und anschließend die Elution mit 0,5 M NaCl in dem gleichen Puffer. Die vereinigten Eluate werden über Nacht gegen 20 mM Tris pH 8/ 0,08% LDAO dialysiert (1).Remove the UQ 10 from the Q B binding site and reconstitute with quinones
About 20 ml of reaction center (RC) (OD 804 = 0.92 = 60 nmol) are added to about 2 ml of DEAE cellulose ion exchanger (DE 52 from Whatman) and incubated for 10 minutes with gentle shaking. The suspension is then placed in a column in which a small Sephadex G-200 bed has been placed. The temperature is set to 26 ° C. and the column is washed with 70 ml of 20 mM Tris pH 8/3% LDAO / 1 mM o-phenanthroline / 1 mM DTT (flow rate approx. 1.5 ml / min). This is followed by a second washing with 20 mM Tris pH 8 / 0.08% LDAO (150 ml) and then elution with 0.5 M NaCl in the same buffer. The combined eluates are dialyzed overnight against 20 mM Tris pH 8 / 0.08% LDAO (1).

Zur Rekonstitution wird Q-freies RC in konzentrierter Form (OD800 = 20) beider jeweils gewählten Konzentration des jeweils gewählten Chinons 10 Stunden lang bei 4°C im Dunkeln inkubiert.For reconstitution, Q-free RC is incubated in a concentrated form (OD 800 = 20) at the chosen concentration of the chosen quinone for 10 hours at 4 ° C in the dark.

Aktivitätstest des Reaktionszentrums aus R. spaeroidesActivity test of the reaction center from R. spaeroides

Es handelt sich um eine Absorptionsmessung mit Querbelichtung (Eigenbau).
Wellenlänge der Absorptionsmessung 550 nm,
Wellenlänge der Querbelichtung <600 nm.
Um die Aktivität des Reaktionszentrums des Photosystems II sowie die Akzeptoreigenschaften des jeweils gewählten Chinonaldehyds zu testen, nimmt man eine Oxidation von Cytochrom C durch das Reaktionszentrum vor. Die Messung erfolgt unter anaeroben Bedingungen, um eine Oxidation des reduzierten Cytochrom C durch Luftsauerstoff zu verhindern. Es geschieht durch Begasung mit Stickstoff.It is an absorption measurement with cross exposure (self-made).
Wavelength of the absorption measurement 550 nm,
Cross exposure wavelength <600 nm.
In order to test the activity of the reaction center of Photosystem II and the acceptor properties of the chosen quinonaldehyde, an oxidation of cytochrome C is carried out by the reaction center. The measurement is carried out under anaerobic conditions in order to prevent oxidation of the reduced cytochrome C by atmospheric oxygen. It is done by gassing with nitrogen.

1 ml Reaktionsmedium enthält:1 ml reaction medium contains:

980 µl 20 mM Tris pH 7,5
 10 µl  1 mM Chinon in EtOH
 10 µl 10 µM Reaktionszentrum
 12,5 µl 800 µM Cytochrom c980 µl 20 mM Tris pH 7.5
10 µl 1 mM quinone in EtOH
10 µl 10 µM reaction center
12.5 µl 800 µM cytochrome c

Die Bestandteile werden in eine Küvette pipettiert und nach Einschalten der Querbelichtung die Abnahme der Absorption bei 550 nm verfolgt.The components are pipetted into a cuvette and after Turning on the cross exposure will decrease the absorption 550 nm tracked.

Das Cytochrom c wird vorher durch eine kleine Menge an Natrium- Dithionit reduziert. Dabei darf die tiefrote Lösung aber nicht ins Hellrote umschlagen, da unter diese Bedingungen ein Überschuß an Natrium-Dithionit vorliegt und eine Quantifizierung der verbrauchten Cytochrommenge unmöglich wird.The cytochrome c is previously replaced by a small amount of sodium Dithionite reduced. The deep red solution is not allowed  turn into bright red, because under these conditions Excess sodium dithionite is present and a quantification the amount of cytochrome consumed becomes impossible.

Isolierung von Thylakoiden aus Spinatia-BlätternIsolation of thylakoids from spinach leaves

Lösung I:
0,4 M Saccharose
20 mM Tricin pH 8,0
10 mM NaClSolution I:
0.4 M sucrose
20 mM tricine pH 8.0
10 mM NaCl

Lösung II:
5 mM Tricin pH 8,5Solution II:
5mM tricin pH 8.5

1. Kalte, gewaschene Spinatblätter ohne Mittelrippe in Lösung I mit einem Mixer homogenisieren,
2. Homogenat durch zwei Lagen Nylon filtrieren,
3. Filtrat bei 5000 g 10 Minuten zentrifugieren,
4. Pellet mit Lösung I waschen und wie oben zentrifugieren,
5. Pellet in Lösung II resuspendieren (osmotischer Schock) und 2 Minuten bei 17 000 g zentrifugieren,
Werden die Thylakoide bis zum Gebrauch in flüssigem Stickstoff aufbewahrt, dann wird das Pellet in Lösung I mit 10% Glycerin aufgenommen (1 mg Chl/ml).1. Homogenize cold, washed spinach leaves without the center rib in solution I with a mixer,
2. Filter the homogenate through two layers of nylon,
3. Centrifuge the filtrate at 5000 g for 10 minutes,
4. Wash pellet with solution I and centrifuge as above,
5. Resuspend pellet in solution II (osmotic shock) and centrifuge at 17,000 g for 2 minutes,
If the thylakoids are kept in liquid nitrogen until use, the pellet is taken up in solution I with 10% glycerol (1 mg Chl / ml).

Bestimmung des ChlorophyllgehaltesDetermination of the chlorophyll content

10 ml 80%iges Aceton mit 50 µl Thylakoidsuspension mischen, filtrieren und die Extinktion bei 652 nm bestimmen.Mix 10 ml 80% acetone with 50 µl thylakoid suspension, filter and determine the absorbance at 652 nm.

Verdrängungsexperiment an ThylakoidenDisplacement experiment on thylakoids

Zu je zwei ml Thylakoidsuspension (50 ug Chl./ml in 20 mM Tricin, pH 8,0, 20 mM MgCl2) werden jeweils identische Mengen radioaktiv markiertes Herbizid als Hemmstoff zugegeben. Nach 10 Minuten Inkubationszeit erfolgt die Zugabe von unterschiedlichen Konzentrationen eines zweiten Verdrängungspartners, wobei es sich um ein Chinon, einen Chinoaldehyd oder ein weiteres Herbizid handeln kann. Nach nochmaliger 10-minütiger Inkubation wird 10 Minuten lang bei 10 000 g zentrifugiert und die Radioaktivität im Überstand und im Pellet bestimmt.To each two ml of thylakoid suspension (50 µg Chl / ml in 20 mM tricine, pH 8.0, 20 mM MgCl 2 ), identical amounts of radiolabelled herbicide are added as inhibitors. After an incubation time of 10 minutes, different concentrations of a second displacement partner are added, which may be a quinone, a quinoaldehyde or another herbicide. After another 10 minute incubation, centrifugation is carried out at 10,000 g for 10 minutes and the radioactivity in the supernatant and in the pellet is determined.

Aktivitätsbestimmung der LuciferaseActivity determination of luciferase

Der Testansatz hat ein Gesamtvolumen von 1 ml und setzt sich wie folgt zusammen: The test batch has a total volume of 1 ml and continues as follows together:

885 µl Puffer (0,1 M Phosphat pH 6,9/0,2% BSA)
  5 µl Aldehyd in Ethanol
 10 µl Luciferase (0,5 mg/ml)885 µl buffer (0.1 M phosphate pH 6.9 / 0.2% BSA)
5 µl aldehyde in ethanol
10 µl luciferase (0.5 mg / ml)

Reaktionsstart durch Injektion von 100 µl 50 µM FMNH2. Gemessen wird das Integral der entstandenen Lichtquanten innerhalb der ersten Sekunde nach Injektion.Start the reaction by injecting 100 µl 50 µM FMNH 2 . The integral of the resulting light quanta is measured within the first second after injection.

Messung der Lucifersaseaktivität in einem Fließ-Injektions- SystemMeasurement of luciferase activity in a flow-injection system

Der Aufbau ist in Abb. 6 dargestellt. Die Lumineszensküvette hat ein Meßvolumen von ca. 150 µl und ist an einem Ende mit einem Photomultiplier versehen.The structure is shown in Fig. 6. The luminescent cuvette has a measuring volume of approx. 150 µl and is provided with a photomultiplier at one end.

Da FMNH2 durch Reduktion mit Natrium-Dithionit unter Stickstoff erhalten wird, muß der eine der beiden Carrierstränge sauerstoffrei sein (s. Konkurrenzreaktion zwischen reduziertem FMN und O2). Das ganze System kann jedoch nicht sauerstoffrei gehalten werden, weil die Luciferasereaktion selber Sauerstoff benötigt. Hieraus ergibt sich die Notwendigkeit eines sauerstoffreien und -haltigen Carrierstroms. Beide treffen sich unmittelbar in der Küvette. Mit der ersten Injektion durch Ventil 1 gelangen 200 µl einer Sübstratlösung (50 µM FMNH2 + Aldehyd in 0.1 M Phosphatpuffer, 0.2% BSA) in den Carrierstrom 1. Die zweite Injektion durch Ventil 2 von 30 µl Luciferaselösung ist zeitlich so gewählt, daß sie in die Mitte der ersten Injektion fällt. Since FMNH 2 is obtained by reduction with sodium dithionite under nitrogen, one of the two carrier strands must be oxygen-free (see competitive reaction between reduced FMN and O 2 ). However, the whole system cannot be kept oxygen-free because the luciferase reaction itself requires oxygen. This results in the need for an oxygen-free and containing carrier stream. Both meet immediately in the cuvette. With the first injection through valve 1, 200 µl of a substrate solution (50 µM FMNH 2 + aldehyde in 0.1 M phosphate buffer, 0.2% BSA) enters the carrier stream 1. The second injection through valve 2 of 30 µl luciferase solution is chosen in time so that it falls in the middle of the first injection.

Abkürzungen:Abbreviations:

BQ = 1,4-Benzochinon
BQ9A = 9-(1,4-Benzochinon-2-yl)-nonanal
DTT = Dithiothreit
FPLC = Fast Pressure Liquid Chromatography
LDAO = N,N-Dimethyldodecylaminoxid
NQ = 1,4-Naphthochinon
NQXA = X-(1,4-Naphthochinon-2-yl)alkanal
PMSF = Phenylmethylsulfonylfluorid
UQ₀ = 2,3-Dimethoxy-5-methyl-1,4-benzochinon
UQ₆ = 2,3-Dimethoxy-5-methyl-6-all-trans-farnesylfarnesyl- 1,4-benzochinon
UQ9A = 9-(5,6-Dimethoxy-3-methyl-1,4-benzochinon-2-yl)nonanal
UQ₁₀ = Ubichinon 50
VITK9A = 9-(3-Methyl-1,4-naphthochinon-2-yl)nonanalBQ = 1,4-benzoquinone
BQ9A = 9- (1,4-benzoquinon-2-yl) nonanal
DTT = dithiothreit
FPLC = Fast Pressure Liquid Chromatography
LDAO = N, N-dimethyldodecylamine oxide
NQ = 1,4-naphthoquinone
NQXA = X- (1,4-naphthoquinon-2-yl) alkanal
PMSF = phenylmethylsulfonyl fluoride
UQ₀ = 2,3-dimethoxy-5-methyl-1,4-benzoquinone
UQ₆ = 2,3-dimethoxy-5-methyl-6-all-trans-farnesylfarnesyl-1,4-benzoquinone
UQ9A = 9- (5,6-dimethoxy-3-methyl-1,4-benzoquinon-2-yl) nonanal
UQ₁₀ = ubiquinone 50
VITK9A = 9- (3-methyl-1,4-naphthoquinon-2-yl) nonanal

Claims (6)

1. Verfahren zum Nachweis von Substanzen, die sich an das Photosystem II als Liganden koppeln lassen, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Herbizid (gegebenenfalls enthalten in einem Medium) mit Hilfe von Chinonaldehyd mit einem an sich bekannten Nachweisverfahren nachweist, das auf Kompetition beruht, wobei man sich die Kompetition zwischen dem Herbizid und dem Chinonaldehyd gegenüber dem Photosystem II zunutze macht.1. A method for the detection of substances which can be coupled to the photosystem II as ligands, characterized in that a herbicide (optionally contained in a medium) is detected using quinonaldehyde using a detection method known per se which is based on competition, taking advantage of the competition between the herbicide and the quinonaldehyde against Photosystem II. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Chinonaldehydmenge, die der nachzuweisenden Herbizidmenge entspricht, auf Basis der Lichtmenge bestimmt, die Luziferase in an sich bekannter weise in Gegenwart der zur Herbizidmenge korrespondierenden Chinonaldehydmenge erzeugt.2. The method according to claim 1, characterized in that one the amount of quinonaldehyde, that of the amount of herbicide to be detected corresponds to luciferase, determined on the basis of the amount of light in a manner known per se in the presence of the amount of herbicide corresponding amount of quinonaldehyde generated. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man
  • a) auf das Photosystem II, an das Chinonaldehyd gekoppelt ist, ein Herbizid einwirken läßt und gekoppelten Chinonal­ dehyd verdrängen läßt und gegebenenfalls,
  • b) die Menge des Herbizids, der Chinonaldehyd verdrängt hat, auf Basis der Lichtmenge bestimmt, die Luziferase in an sich bekannter Weise in Gegenwart des verdrängten Chinonaldehyds erzeugt.
3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that
  • a) has a herbicide act on photosystem II, to which quinonaldehyde is coupled, and has coupled quinonaldehyde displaced and, if appropriate,
  • b) the amount of the herbicide which has displaced quinonaldehyde is determined on the basis of the amount of light which luciferase produces in a manner known per se in the presence of the displaced quinonaldehyde.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man das Verfahren im Rahmen einer Fließinjektionsanalyse durchführt. 4. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the process within the framework a flow injection analysis.   5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man das Verfahren mit Hilfe eines Biosensors und/oder als Bioassay durchführt.5. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the method with the help a biosensor and / or as a bioassay. 6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man das Verfahren mit Hilfe eines Immunobiosensors und/oder als homogenen oder heterogenen Immunoassay durchführt.6. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the method using a Immunobiosensors and / or as homogeneous or heterogeneous Performs immunoassay.
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4126692A1 (en) * 1991-08-13 1993-02-18 Inst Molekularbiologie Ak Immuno-sensor for sensitive detection of low mol. wt. antigen - uses displacement of enzyme conjugate, reaction with substrate and prod. amplification on bio-sensor, used esp. for drugs, herbicides and explosives
DE4332165A1 (en) * 1993-09-22 1995-03-23 Kolibri Umweltanalytik Und On Method and apparatus for pollutant analysis of water samples
EP0654662A1 (en) * 1993-10-08 1995-05-24 Forschungszentrum Karlsruhe GmbH Instrument for detecting photosystem II herbicides
DE4420093A1 (en) * 1994-03-02 1995-09-07 Biolytik Ges Fuer Bio Sensitiv Process for the rapid detection of herbicidal active substances in water
WO1995023967A1 (en) * 1994-03-02 1995-09-08 Biolytik Gesellschaft Für Bio-Sensitive Analytik Mbh Method of rapidly detecting herbicidal active substances in water
WO2003104572A1 (en) * 2002-06-07 2003-12-18 Marschke Carl R Water supply monitoring for contaminant detection
CN102539732A (en) * 2010-12-20 2012-07-04 科顿集水共同体Crc有限公司 Transverse flowing device

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Chemical Abstracts 100 (1984)7, 351,Zitat 48791u *
Chemical Abstracts 101 (1984)11, 372,Zitat 87600w *
D. MEADOWS, J.S. SCHULTZ, Talanta 35 (1988), 145-150 *
R.D. SCHMID, Nachr. Chem. Techn. Lab. 35 (1987), 910-914 *
S. GIROTTI et al (1986), Analyt. Chimica. Acta 183, 187-196 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4126692A1 (en) * 1991-08-13 1993-02-18 Inst Molekularbiologie Ak Immuno-sensor for sensitive detection of low mol. wt. antigen - uses displacement of enzyme conjugate, reaction with substrate and prod. amplification on bio-sensor, used esp. for drugs, herbicides and explosives
DE4332165A1 (en) * 1993-09-22 1995-03-23 Kolibri Umweltanalytik Und On Method and apparatus for pollutant analysis of water samples
EP0654662A1 (en) * 1993-10-08 1995-05-24 Forschungszentrum Karlsruhe GmbH Instrument for detecting photosystem II herbicides
DE4420093A1 (en) * 1994-03-02 1995-09-07 Biolytik Ges Fuer Bio Sensitiv Process for the rapid detection of herbicidal active substances in water
WO1995023967A1 (en) * 1994-03-02 1995-09-08 Biolytik Gesellschaft Für Bio-Sensitive Analytik Mbh Method of rapidly detecting herbicidal active substances in water
WO2003104572A1 (en) * 2002-06-07 2003-12-18 Marschke Carl R Water supply monitoring for contaminant detection
CN102539732A (en) * 2010-12-20 2012-07-04 科顿集水共同体Crc有限公司 Transverse flowing device
CN102539732B (en) * 2010-12-20 2016-08-17 快速测试技术有限公司 Lateral flow device

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