DE4041411A1

DE4041411A1 - Chromatographieverfahren zum analysieren biologischer proben und mit einem solchen verfahren arbeitender fluessigphasenchromatographie-anlaysator

Info

Publication number: DE4041411A1
Application number: DE4041411A
Authority: DE
Inventors: Junkichi Miura; Masahito Ito; Yoshio Fujii; Hiroshi Satake; Kasumi Yoshida
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1990-01-08
Filing date: 1990-12-21
Publication date: 1991-07-11
Also published as: JPH087202B2; JPH03205559A; US5308774A

Description

Die Erfindung betrifft ein Chromatographieverfahren und einen Flüssigphasenchromatographie-Analysator zum Analysie ren einer biologischen Probe, insbesondere ein Analysever fahren und einen Analysator, die dazu geeignet sind, physio logisch aktive Substanzen in Blut oder Hirn/Rückenmarks- Flüssigkeit (im folgenden CSF genannt; CSF = Cerebrospinale Flüssigkeit) vorzumarkieren, um einzelne Bestandteile der physiologisch aktiven Substanz qualitativ und quantitativ zu erfassen.

Physiologisch aktive Substanzen (z. B. Hormone) in Körper flüssigkeiten (z. B. Blut, CSF) kommen dort nur in kleinen Mengen vor, üben jedoch einen starken Einfluß auf die Phy siologie des lebenden Körpers aus. Daher ist es weitverbrei tete Praxis, einzelne Bestandteile physiologisch aktiver Substanzen zu analysieren und zu untersuchen, um die Ergeb nisse in pathologischen Untersuchen oder Forschungen zu ver wenden.

Von den physiologisch aktiven Substanzen sind lokale Hormo ne wie Catecholamine, Prostaglandine und dergleichen z. B. in Blut nur in einer Menge der Größenordnung Picogramm (10^-12 g/ml) vorhanden. Daher wird die Analyse dieser phy siologisch aktiven Substanzen leicht durch andere Bestand teile beeinflußt, die in der Probe in weit überwiegender Menge vorhanden sind. Um dies zu vermeiden, wird die Analyse der physiologisch aktiven Substanzen dadurch ausgeführt, daß diese durch Flüssigphasenchromatographie in ihre einzelnen Bestandteile aufgetrennt werden oder daß die physiologisch aktiven Substanzen mit einem Fluoreszenzmarkiermittel zur Reaktion gebracht werden und dann die markierten Substanzen mit einem Fluoreszenzphotometer gemessen werden.

Als Stand der Technik zum Markieren (Umwandeln in Derivate) von Catecholaminen durch ein Vormarkierverfahren und zum Ausführen von Chromatographie mit den markierten Catechol aminen sind Verfahren bekannt, wie sie in JP-A-61-88 148 und 60-1 43 766 beschrieben sind.

Gemäß dem Verfahren von JP-A-61-88 148 wird Aluminiumoxid einer Testprobe hinzugefügt, um die Catecholamine in der Probe am Aluminiumoxid zu adsorbieren, während Dansylchlorid im Verlauf der Adsorption zur Reaktion gebracht wird, um die Catecholamine in Derivate umzuwandeln. Es werden dann die Derivate vom Aluminiumoxid desorbiert, und die Konzentration der Lösung mit den Derivaten wird durch Verdampfen erhöht. Das so hergestellte Konzentrat wird in das Durchlaufrohr eines Flüssigphasenchromatographen injiziert, um das Konzen trat in die einzelnen Bestandteile der Catecholaminderivate aufzutrennen. Die Fluoreszenz der einzelnen Bestandteile wird ermittelt.

Beim Verfahren gemäß JP-A-60-1 43 766 wird eine biologische Probe wie Plasma, Urin oder dergleichen in ein Durchlaufrohr injiziert, und dann werden aufeinanderfolgend drei Arten von Reaktionsreagenzien in den Durchlaufweg eingeführt, und die Catecholamine in der Probe werden während ihres Durchlaufs durch die Reaktionsschlange markiert (in Derivate umgewan delt). Die so hergestellten Catecholamine werden aufgefangen und in einer Konzentrationssäule konzentriert und dann in eine Trennsäule überführt, um die einzelnen Bestandteile der markierten Catecholamine voneinander zu trennen. Die Fluo reszenz der einzelnen Bestandteile wird ermittelt.

Bekannte Verfahren zum Markieren von Prostaglandinen durch Vormarkieren und zum Ausführen von Chromatographie mit den markierten Prostaglandinen sind in JP-A-61-92 599 und 58-1 08 457 beschrieben.

JP-A-61-92 599 schlägt ein Verfahren zum Analysieren von Pro staglandinen mit hohem Wirkungsgrad durch Flüssigphasenchro matographie vor, bei dem eine Probe markiert wird, um die physiologisch aktiven Substanzen in der Probe in fluoreszie rende Substanzen umzuwandeln. Dann werden die fluoreszieren den Substanzen in die einzelnen Bestandteile aufgetrennt und diese werden durch einen Fluoreszenzdetektor gemessen. Das Dokument beschreibt jedoch keine näheren Einzelheiten.

Beim Verfahren gemäß JP-A-58-1 08 457 wird eine biologische Probe umgekehrter Phasen(Verteilungs-)-Chromatographie un terzogen, um eine Lösung zu erhalten, die Prostaglandin ent hält. Die Lösung wird konzentriert, und das Konzentrat wird verdünnt und dann mit einem Fluoreszenzmarkieragens zur Reaktion gebracht, das mit der Carboxilgruppe von Prosta glandin reagieren kann, um dieses in einen Ester umzuwan deln. Der so hergestellte Ester wird in den Durchlauf eines Flüssigphasenchromatographen gegeben, um die einzelnen Be standteile voneinander zu trennen. Jeder Bestandteil wird mit einem Fluoreszenzdetektor gemessen.

In JP-A-61-92 599 wird nur die Möglichkeit des Vormarkierens einer Probe vorgeschlagen, jedoch wird kein spezielles Ver fahren zur Prostaglandinanalyse offenbart, das vom Fachmann effektiv ausgeführt werden könnte. Bei den Verfahren gemäß JP-A-61-88 148 und JP-A-58-1 08 457 ist eine verhältnismäßig lange Zeitspanne erforderlich, um eine Testlösung herzustel len, die in den Durchlauf eines Flüssigphasenchromatographen zu geben ist. Darüber hinaus ist die Automation des gesamten Analyseablaufs schwierig. Daher sind diese Verfahren für Routinearbeiten wie klinische Untersuchungen nicht geeignet.

Im Hinblick auf Brauchbarkeit ist das Verfahren gemäß JP-A-60-1 43 766 von Vorteil, daß bei ihm die physiologisch aktiven Substanzen in der Probe vormarkiert werden, dann die vormarkierten Substanzen in einzelne Bestandteile aufge trennt werden und jeder Bestandteil durch Fluoreszenzphoto metrie gemessen wird.

Die Erfinder versuchten, physiologisch aktive Substanzen in Blut- und CSF-Proben durch Chromatographie unter Verwendung eines Vormarkierverfahrens zu analysieren. Es wurde jedoch keine ausreichende Meßgenauigkeit erzielt. Es stellte sich heraus, daß diese geringe analytische Genauigkeit durch Proteine verursacht wurde, die in den Proben vorhanden wa ren. Die Erfinder gelangten zu der Erkenntnis, daß es zum Erzielen eines hochgenauen Analyseergebnisse für physiolo gisch aktive Substanzen in einer biologischen Probe erfor derlich ist, eine Vorbehandlung auszuführen, bei der die Proteine aus der Probe entfernt werden. Wenn die Probe durch Vorfällen und Trennen, Ultrafiltrieren oder dergleichen be handelt wird, ist ein mehrstufiger Ablauf erforderlich, der das Analyseverfahren insgesamt komplex gestaltet. Darüber hinaus fördert die für das Entfernen der Proteine erforder liche Behandlung das Zersetzen und/oder den Verlust von zu analysierenden Bestandteilen während des Ablaufs.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Analysieren einer biologischen Probe anzugeben, mit der zu messende physiologisch aktive Substanzen in einer Probe wir kungsvoll in einem Zustand, in dem die Probe Proteine ent hält, in Derivate umgewandelt werden können. Weiterhin liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, einen Analysator anzu geben, der ein solches Verfahren nutzt.

Eine andere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zum Analysieren einer biologischen Probe anzugeben, bei dem zu messende physiologisch aktive Substanzen in einer Probe nur in geringem Ausmaß während des Analyseablaufs sich zersetzen oder verlorengehen. Ebenfalls besteht hier die Aufgabe, einen Analysator anzugeben, der ein solches Verfahren nutzt.

Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum Analysieren einer biologischen Probe anzu geben, mit dem zu messende physiologisch aktive Substanzen in der Probe mit einfachen Maßnahmen in Derivate umgewandelt werden können und die Derivate ebenfalls mit einfachen Maß nahmen in einzelne Bestandteile aufgetrennt werden können. Erneut besteht ebenfalls die Aufgabe, einen Analysator anzu geben, der ein solches Verfahren nutzt.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird eine Blut- oder CSF- Probe, aus der Proteine nicht entfernt sind, ein Reagens und ein Verdünnungsmittel in ein Reaktionsgefäß gegeben, wobei die zu messenden physiologisch aktiven Substanzen in der Probe mit dem Reagens zur Reaktion gebracht werden, wobei sie in Derivate umgewandelt werden. Diese Reaktion zum Um wandeln der physiologisch aktiven Substanzen in Derivate wird bis zum ihrem Abschluß im Reaktionsgefäß ausgeführt, oder sie wird teilweise noch in einem vorgegebenen Abschnitt eines nach dem Reaktionsgefäß angeordneten Durchlaufs ausge führt.

Die Reaktionsmischung wird dann einer Trennsäule zugeführt, um die Derivate in einzelne Bestandteile aufzutrennen. Jeder Bestandteil wird durch sinen optischen Detektor ermittelt. Die Reaktionsmischung wird vor dem Übertragen in die Trenn säule entweder einer Behandlung zum Entfernen von Proteinen unterzogen, oder dies erfolgt nicht. Wenn die Behandlung zum Entfernen von Proteinen ausgeführt wird, wird die Reaktions mischung in eine Säule zum Abtrennen von Proteinen gegeben, in der die Derivate der physiologisch aktiven Substanzen ab getrennt werden. Gleichzeitig werden die in der Probe ent haltenen Proteine aus der Säule zum Abtrennen von Proteinen ausgegeben. Wenn die Behandlung zum Abtrennen der Proteine nicht ausgeführt wird, wird eine Trennsäule mit einer Fül lung verwendet, bei der die Proteine im wesentlichen keinen Schaden hervorrufen.

Vor der oben genannten Reaktion zum Umwandeln der physiolo gisch aktiven Substanzen in Derivate wird die biologische Probe mit den physiologisch aktiven Substanzen 8- bis 20fach durch das Verdünnungsmittel verdünnt, wobei die Konzen tration der Proteine in der verdünnten Probe (der Mischung) auf 1% oder weniger fällt. Die Reaktion zum Umwandeln der physiologisch aktiven Substanzen in Derivate erfolgt bei etwa 30-60°C.

Die Erfindung wird im folgenden anhand von durch Figuren veranschaulichten Ausführungsbeispielen näher erläutert.

Fig. 1 ist eine schematische Ansicht des Aufbaus eines Aus führungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Analysators; Fig. 2 ist ein Flußdiagramm zum Erläutern des Analyseablaufs im Analysator gemäß Fig. 1; Fig. 3A und 3B sind Diagramme zum Veranschaulichen des zeitlichen Ablaufs in einzelnen Ab schnitten oder Einheiten des Analysators von Fig. 1; Fig. 4 ist eine Draufsicht auf einen Abschnitt mit einem automati schen Probennehmer im Analysator von Fig. 1; Fig. 5A ist eine Frontansicht eines Analysators mit einem Funktionsab lauf gemäß Fig. 1; Fig. 5B ist eine Seitenansicht des Analy sators gemäß Fig. 5A; Fig. 6 ist ein Diagramm, das die Be ziehung zwischen der relativen Fluoreszenzintensität einer Blutprobe und deren Verdünnung (-fach) zeigt; Fig. 7 ist ein gemessenes Fluoreszenzintensitätsdiagramm für Catecholamine, wenn solche durch den Analysator von Fig. 1 analysiert wer den; Fig. 8 ist eine schematische Darstellung für ein ande res Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Analysators; und Fig. 9 ist eine schematische Darstellung von Hauptbe standteilen in einer weiteren Ausführungsform eines erfin dungsgemäßen Analysators.

Die folgenden Bezugszeichen in den vorstehend angegebenen Figuren beziehen sich auf die folgenden Abschnitte, Einhei ten oder Teile des Analysators:
26: automatischer Probennehmer, 29: Probengefäß, 30: Rea genzgefäß, 33: Reaktionsgefäß, 36: Einspritzöffnung, 38: Einspritzdüse, 42: Verdünnungsmitteltank, 47: Mischungs-Zu führventil, 48: Säule zum Abtrennen von Proteinen, 49: Do sierröhre, 52: Durchlaufweg-Wechselventil, 53 und 100: Trennsäule, 54: Fluoreszenzphotometer, 56: Steuereinheit, 82: Mischgefäß.

Bei einer biologischen Probe wie Blut oder CSF mit Proteinen in einem Anteil von 5-10% führt das Hinzufügen eines Rea gens zur Probe kaum zu einem Ansteigen der Umwandlung der physiologisch aktiven Substanzen (z. B. Catecholamine, Pro staglandine) in der Probe in Derivate, wenn die Probe nicht zuvor einer Vorbehandlung unterworfen wurde, bei der Pro teine entfernt wurden. Die von den Erfindern ausgeführten Versuche zeigten, daß dieses Phänomen dadurch verursacht ist, daß Proteine in hoher Konzentration dazu führen, daß das Reagens und ein Reaktionsbeschleuniger an den Protein bestandteilen adsorbieren.

Die Erfinder fanden außerdem heraus, daß dann, wenn die Pro teinkonzentration in der Mischung mit dem Reagens und der biologischen Probe 1% oder weniger ist, der Einfluß der Proteine auf die Reaktion zum Umwandeln der physiologisch aktiven Substanzen in Derivate vernachlässigbar klein ist, und daß dann die Reaktion sehr effizient ausgeführt werden kann.

Ausgehend von diesen Erkenntnissen wird beim erfindungsgemä ßen Verfahren eine Blut- oder CSF-Probe geeignet durch ein Verdünnungsmittel verdünnt, vorzugsweise etwa 8-20fach, und zwar vor der Reaktion zum Umwandeln der physiologisch aktiven Substanzen in der Probe in Derivate. Der mit dem Verdünnungsmittel eingestellte Verdünnungsgrad wird auf einen gewünschten Wert eingestellt, der von der Art der Pro be oder der Art des verwendeten Reagens abhängt. Das Ein stellen des Verdünnungsgrades auf einen vorgegebenen Wert ermöglicht die Automation eines Analysegeräts, was von Nut zen ist, wenn eine große Anzahl ähnlicher Proben zu analy sieren ist, wie bei klinischen Untersuchungen.

Der Verdünnungsgrad der biologischen Probe ist vorzugsweise 20fach oder weniger. Ein zu großer Verdünnungsgrad er schwert hochgenaue Messungen, d. h. hochempfindliches Fest stellen sehr geringer Mengen physiologisch aktiver Substan zen in einer Probe. Außerdem wird bei zu starker Verdünnung das Gesamtvolumen der zu behandelnden Lösung zu groß.

Die Reaktion zum Umwandeln der physiologisch aktiven Sub stanzen (z. B. Catecholamine, Prostaglandin) in Derivate wird vorzugsweise in erwärmtem Zustand bei etwa 30-60°C ausgeführt. Eine Temperatur von 30°C oder darüber ist von Vorteil, da eine Reaktionstemperatur oberhalb von Zimmertem peratur einfach eingeregelt werden kann und da sie die Reak tion beschleunigt. Eine Temperatur von 60°C oder weniger ist von Vorteil, da sie verhindert, daß Proteine in der Probe in relativ kurzer Zeit bei zu hohen Temperaturen denaturiert werden. Das Denaturieren von Proteinen führt in unerwünsch ter Weise zu ihrem Ausfällen zusammen mit anderen Bestand teilen, was die Mengen der zu messenden Bestandteile unter ihren eigentlichen Wert erniedrigt. Es sei angemerkt, daß selbst bei einer Temperatur von 60°C kein Denaturieren von Proteinen innerhalb von drei Minuten festgestellt wurde.

Das Auftrennen von Catecholaminen in einzelne Bestandteile durch Chromatographie ermöglicht das Feststellen solcher Be standteile wie Epinephrin, Norepinephrin, Dopamin und der gleichen. Das Auftrennen von Prostaglandin ein einzelne Be standteile durch Chromatographie ermöglicht das Ermitteln von Bestandteilen wie Thromboxan B₂, Prostaglandin E₂, 6- Ketoprostaglandin F₁ _α, Prostaglandin E₁ und dergleichen. Durch Umwandeln dieser physiologisch aktiven Substanzen in Derivate und Unterziehen der Derivate einer fluoreszenzme trischen Analyse, einer adsorptionsmetrischen Analyse oder einer Leitfähigkeitsanalyse kann jeder Bestandteil physiolo gisch aktiver Substanzen in einer biologischen Probe in sehr geringen Mengen mit hoher Empfindlichkeit festgestellt wer den.

Wenn die physiologisch aktiven Substanzen in Derivate umge wandelt sind, weisen sie ein höheres Molekulargewicht als vor der Umwandlung auf. Demgemäß verfügen sie über höhere chemische Stabilität und werden einfacher von einer Füllung in einer Trennsäule adsorbiert. Diese Erhöhung der Adsor bierbarkeit ist dann besonders effektiv, wenn eine Säule zum Entfernen von Proteinen vor der Trennsäule verwendet wird, um die Proteine aus den Derivaten der physiologisch aktiven Substanzen abzutrennen. Wenn die Reaktionsmischung mit den Derivaten und den Proteinen kontinuierlich in die Säule zum Entfernen der Proteine in solcher Weise eingeleitet wird, daß die Reaktionsmischung zwischen einer Transportlösung eingeschlossen wird, werden die Derivate in der Säule zum Entfernen der Proteine adsorbiert, während die Proteine di rekt nach ihrem Einführen in die Säule aus dieser wieder ausgegeben werden. Die Füllung in der Säule zum Entfernen der Proteine ist vorzugsweise eine solche vom intern umge kehrten Phasentyp oder eine solche mit einem Polymeren für Ionenaustausch. Die Säule zum Entfernen der Proteine hat die Funktion, die Proteine von den Derivaten der physiologisch aktiven Substanzen abzutrennen, wie auch die verdünnten De rivate zu konzentrieren.

Wenn eine Trennsäule mit einer Füllung von einem Typ verwen det wird, die keine Proteine adsorbiert, ist es nicht erfor derlich, die Säule zum Entfernen der Proteine vor der Trenn säule einzusetzen. Als Füllung kann dieselbe verwendet wer den wie in einer Säule zum Entfernen von Proteinen. In die sem Fall kann der vorstehend erwähnte Effekt dank des größe ren Molekulargewichts der physiologisch aktiven Substanzen nach deren Umwandlung in Derivate erzielt werden. Das heißt, daß die in der Reaktionsmischung zusammen mit den Derivaten der physiologisch aktiven Substanzen vorhandenen Proteine direkt nach dem Einführen in die Trennsäule wieder ausgege ben werden, wodurch die Trennung der Proteine von den Deri vaten verbessert ist.

Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung wird ein automatischer Probennehmer zum Herstellen von Probenlö sungen verwendet, die in einen Analyseabschnitt einzusprit zen sind. Dieser automatische Probennehmer weist eine Ver dünnungsmittelzuführung mit einer beweglichen Düse auf. Die bewegliche Düse kann sich zu den Orten des Probengefäßes, des Reagenzgefäßes, eines Gefäßes mit einer Standardlösung, eines Mischgefäßes, einer Düsenreinigungsöffnung, einer Ein spritzöffnung für Mischlösung usw. bewegen. Die Düse hat verschiedene Funktionen, wie Einspritzen einer Probe in ein Mischgefäß, Einspritzen eines Reagens in das Mischgefäß, Einspritzen des Verdünnungsmittels in das Mischgefäß, über tragen der Mischungslösung vom Mischgefäß in einen Trenn und Analyseabschnitt und dergleichen. Sie wird zum Ausführen dieser Funktionen gesteuert.

Das Ausführungsbeispiel ist so ausgestaltet, daß bei ihm die Reaktion zum Umwandeln der physiologisch aktiven Substanzen in einer biologischen Probe in Derivate vor dem Entfernen von Proteinen erfolgt. Wenn die Reaktion unter Verwendung von z. B. 1,2-Diphenylethylendiamin (DPE) als Reagens zum Umwandeln von Catecholaminen in Derivate verwendet wird, werden Catecholamine in Moleküle mit vier zyklischen Teilen umgewandelt, im Vergleich zu Catecholmolekülen mit einem zyklischen Teil. Dementsprechend sind die Catecholaminderi vate hydrophober und können in einer kleinen Vorsäule leicht von den Proteinen in der Probe getrennt werden.

Als Fluoreszenzmarkieragens, das als Reagens zum Umwandeln von Catecholaminen in Derivate verwendet wird, kann z. B. 1,2-Diphenylethylendiamin (DPE) verwendet werden. Das Fluo reszenzmarkieragens wird als Lösung mit 60 mM DPE, 2 mM Ca liumferricyanid, 40% Acetonitril usw. hergestellt. Als Eluierlösung, die in die Trennsäule gegeben wird, um die Catecholaminderivate in einzelne Bestandteile aufzutrennen, wird z. B. eine Lösung mit Acetonitril, Methanol und einer wäßrigen Lösung von 50 mM von Lithiumnitrat und 10 mM von Natriumdodecylsulfat in einem Verhältnis von 5 : 2 : 4 ver wendet.

Als Fluoreszenzmarkieragens, das als Reagens zum Umwandeln von Prostaglandin in Derivate verwendet wird, kann Monodan sylcadaverin (MDC) eingesetzt werden. Das Fluoreszenzmar kieragens wird als Lösung mit 6 mM MDC, 86 mM Diethylphos phorocyanitat (DEPC) usw. hergestellt. Als Eluierlösung, die zum Trennen der Prostaglandinderivate verwendet wird, kann eine Lösung von Wasser, Tetrahydrofuran und Acetonitril ein gesetzt werden. Die Anregungswellenlänge und Fluoreszenz wellenlänge, wie sie im Fluoreszenzdetektor verwendet wer den, sind vorzugsweise 340 nm bzw. 520 nm.

Nachfolgend werden Ausführungsbeispiele der Erfindung mit einer einzelnen Trennsäule beschrieben. Das Verwenden einer einzelnen Trennsäule vereinfacht den analytischen Mechanis mus im Vergleich zum Fall, wenn mehrere Trennsäulen verwen det werden. Die biologischen Proben, auf die die Erfindung vorzugsweise angewandt werden kann, sind Plasma, Serum, CSF usw.

Ausführungsbeispiele eines automatischen Catecholaminanaly sators, der die Erfindung nutzt, werden nun unter Bezugnahme auf beigefügte Zeichnungen beschrieben.

Fig. 1 ist eine schematische Darstellung des Gesamtaufbaus eine automatischen Catecholaminanalysators gemäß der Erfin dung. Dieser Analysator weist einen Probenzuführabschnitt 26 mit mehreren Gefäßen und einem Einspritzmechanismus und einen Konzentrier- und Trennabschnitt 44 auf, zum Ausführen von Konzentrier- und Trennabläufen in einem Durchlaufsystem. Im folgenden wird der Probenzuführabschnitt 26 als automati scher Probennehmer bezeichnet, und der Abschnitt 44 zum Kon zentrieren und Trennen wird als als Analyseabschnitt be zeichnet.

Der automatische Probennehmer 26 weist einen nichtbewegli chen oder Reaktionsbereich 90 und ein abnehmbares Probenge stell 27 auf. Das Probengestell 27 steht auf einem Proben tisch 28, und es hält mehrere Probengefäße, von denen jedes eine Plasmaprobe enthält. Im Probengestell 27 sind auch ein Reagenzgefäß 30 (für ein Fluoreszenzmarkieragens), ein Gefäß 31 für eine interne Standardlösung und ein Standardproben gefäß 32 vorhanden. Im automatischen Probennehmer 26 sind ein Reaktionsgefäß 23, ein Düsenreinigungstank 34, eine Ab lauföffnung 35 und eine Einspritzöffnung 36 an festgelegten Stellen dicht beim Probentisch 28 vorhanden.

Die Injektionsdüse 38 hat die Aufgabe, Probenflüssigkeit und ein Reagens in das Reaktionsgefäß zu injizieren, indem sie die entsprechende Flüssigkeit pipettiert, und sie überträgt die resultierende Reaktionsmischung zur Injektionsmischung 36. Ein Antriebsmechanismus 37 dient dazu, die Düse 38 ent lang rechtwinklig zueinander stehender X-, Y- bzw. Z-Achsen zu bewegen. Der Mechanismus kann die Düse 38 frei in drei Dimensionen (quer und vertikal) bewegen, so daß diese an jedem Gefäß oder jeder Öffnung des automatischen Probenneh mers positioniert werden kann. Das obere Ende der Düse 38 ist mit einer Injektionspumpe 41 und einem Tank 42 für Ver dünnung (auch Reinigungslösung) über einen dünnen Schlauch 39 (z. B. Kunststoffschlauch) und ein Dreiwegeventil 40 ver bunden. Als Injektionspumpe 41 wird eine Spritzpumpe verwen det, die von einem Pulsmotor angetrieben wird. Ein thermo statischer Block 80 dient dazu, die Temperatur des Reak tionsgefäßes 33 auf einem vorgegebenen Wert zu halten. Im Probentisch 28 ist auch eine Kühleinrichtung vorhanden, die die Probe und das Reagens im Probengestell 27 während der Analyse auf niedriger Temperatur hält.

Der Analyseabschnitt 44 weist ein Vorsäulen-Durchlaufsystem auf, in dem die zu messenden Substanzen konzentriert und überflüssige Substanzen entfernt werden. Weiterhin weist er ein Trennsäulen-Durchlaufsystem auf, in dem die zu messenden Substanzen in einzelne Bestandteile aufgetrennt werden. Schließlich verfügt er über einen Meß- und Bedienbereich.

Im Vorsäulen-Durchlaufsystem wird eine Transport- und Reini gungslösung aus einem Vorratstank 45 mit konstanter Förder rate durch eine Pumpe 46 gefördert und über ein Ventil 47 in eine Säule 48 zum Entfernen von Proteinen gegeben. Mit dem Ventil 47 ist auch das Dosierrohr 49 verbunden, mit Hilfe dessen der Fluß der von der Injizieröffnung 36 injizierten Reaktionsmischung so eingestellt wird, daß eine vorgegebene Menge der Mischung in den Analyseabschnitt eingeführt wird.

Im Trennsäulen-Durchlaufsystem wird eine Eluierlösung aus einem Vorratstank 50 mit konstanter Förderrade durch eine Pumpe 51 gefördert und über ein Säulenumschaltventil 52 in eine einzige Trennsäule 53 gegeben. Dieses Säulenumschalt ventil 52 kann so umgeschaltet werden, daß die Eluierlösung durch die Säule 48 zum Entfernen von Proteinen fließt, um die in dieser Säule adsorbierten Derivate physiologisch ak tiver Substanzen in die Trennsäule 53 zu übertragen.

Der Meß- und Bedienbereich weist folgende Funktionsgruppen auf: ein Fluoreszenzphotometer 54 zum Messen der Fluores zenzintensität von Substanzen, die aus der Trennsäule 53 eluiert wurden, einen A/D-Wandler 55, der zur Steuerung und zum Darstellen der Meßergebnisse dient, eine Steuereinheit 56, einen Drucker 57, eine Kathodenstrahlröhre 58 usw. Das Fluoreszenzmeter 54 weist eine Durchflußzelle 59 auf. Um schaltventile 60 und 61 dienen dazu, Lösungen aus den Pumpen 46 und 51 abzulassen, falls erforderlich.

Als Lösungsmittel, das in das Mischgefäß oder Reaktionsgefäß 33 beim Ausführen der Reaktion zum Umwandeln der physiolo gisch aktiven Substanzen in einer biologischen Probe in De rivate injiziert wird, wird ein solches verwendet, das die Reaktion nicht nachteilig beeinflußt und das nicht zu einem Denaturieren der Proteine in der Probe führt. Das im Tank 42 gespeicherte und über die Düse 38 injizierte Lösungsmittel ist z. B. Wasser, eine wäßrige Salzlösung (z. B. eine wäß rige Lösung von 0,1 M Natriumchlorid), eine Pufferlösung (pH etwa 7) mit etwa 0,1 M Phosphat usw. Die Reihenfolge des Zu führens der Probe und des Reagens in das Gefäß 33 muß nicht wie bei diesem Ausführungsbeispiel beschrieben erfolgen, sondern sie kann abhängig vom Aufbau des Analysegeräts ge wählt werden. Die Reihenfolge kann beliebig sein, solange die Reaktion zum Umwandeln der physiologisch aktiven Sub stanzen in ihre Derivate in verdünntem Zustand der Probe ausgeführt wird.

Die im Tank 45 gespeicherte Transportlösung dient dazu, die Reaktionsmischung in das Dosierrohr 49 zu schieben und sie in die Säule 48 zum Entfernen von Proteinen zu übertragen. Als Transportlösung wird eine wäßrige Lösung mit etwa 0,1 M Natriumchlorid verwendet. In der Säule 48 zum Entfernen von Proteinen erhöht die Transportlösung, zusammen mit der Fül lung der Säule die Adsorptionsfähigkeit der Derivate der physiologisch aktiven Substanzen, und sie vereinfacht das Herausleiten der Proteine.

Wenn die Säule 48 zum Entfernen von Proteinen in einer An ordnung wie in Fig. 1 verwendet wird, ist ihre Füllung vor zugsweise eine solche vom Kieselerdetyp mit gerader Alkyl gruppe oder eine solche mit umgekehrter Phase (z. B eine Polymergelpackung von Styrol, Divinylbenzol, Polyvinylalko hol, Methacrylat oder dergleichen). In diesem Fall wird als Eluierlösung, die in die Trennsäule 53 gegeben wird, eine Lösung mit Acetonitril (CH₃CN), Methanol (CH₃OH) und Wasser verwendet. Die im Tank 50 gespeicherte Eluierlösung dient auch dazu, die in der Säule zum Entfernen von Proteinen ad sorbierten Derivate physiologisch aktiver Substanzen zu de sorbieren.

Der Analyseablauf unter Verwendung des Analysators von Fig. 1 weist eine Reihenfolge auf, gemäß der (a) im automatischen Probennehmer physiologisch aktive Substanzen in einer biolo gischen Probe in Derivate umgewandelt werden, (b) in der Säule zum Entfernen von Proteinen in der Probe vorhandene Proteine entfernt werden und die Derivate konzentriert wer den, und (c) in der Trennsäule die Derivate in einzelne Be standteile aufgetrennt werden und die einzelnen Bestandteile dann gemessen werden.

Die analytische Vorgehensweise unter Verwendung des chroma tographischen Catecholaminkatalysators gemäß Fig. 1 wird nun unter Bezugnahme auf das Flußdiagramm von Fig. 2 beschrie ben.

Reinigen des Reaktionsgefäßes

Nach Start des Analyseablaufs in einem Schritt 101 wird in einem Schritt 102 das Reaktionsgefäß 33 gereinigt. In diesem Schritt wird die Düse 38 zum Ort des Reaktionsgefäßes 33 be wegt, und die Pumpe 41 wird betätigt, um Reinigungslösung aus dem Speichertank 42 in das Reaktiongefäß zu injizieren. Die Reinigungslösung wird in einer Menge injiziert, die grö ßer ist als das Fassungsvermögen des Reaktionsgefäßes 33, wobei überschüssige Reinigungslösung durch die Ablauföffnung 35 in Ablaufrohr 43 läuft. Dann wird die Düse 38 bis zum Bo den des Reaktionsgefäßes 33 abgesenkt, um die verschmutzte Reinigungslösung aus dem Gefäß anzusaugen. Schließlich wird sie zum Ort der Abflußöffnung 35 bewegt, um dort die aufge saugte Lösung auszugeben. Vor diesem Ablauf (Ansaugen der verschmutzten Reinigungslösung) ist es erforderlich, eine kleine Menge Luft in die Spitze der Düse 38 einzusaugen und dort zu erhalten, damit die von der Düse angesaugte ver schmutzte Lösung nicht in frische Reinigungslösung in der Düse diffundiert. (Der Ablauf des Ansaugens von Luft zum Bilden einer Grenze vor dem Ansaugen verschmutzter Reini gungslösung ist auch erforderlich, wenn gemäß späteren Schritten die Probenlösung und das Reagens angesaugt werden, jedoch wird dann dieser Vorgang nicht mehr beschrieben, um die Beschreibung nicht unnötig zu verkomplizieren.) Die oben beschriebene Reihenfolge von Funktionsschritten wird mehr fach wiederholt (z. B. dreimal), um den Reinigungsvorgang des Reaktionsgefäßes 33 abzuschließen.

Injizieren und Verdünnen der Probe

Die Probe (Blut) wird in einem Schritt 103 in das Reaktions gefäß 33 injiziert und verdünnt. Die Düse 38 wird hierzu zunächst an den Ort des Gefäßes 31 für die interne Standard lösung bewegt und dann dort abgesenkt, um eine vorgegebene Menge der Lösung anzusaugen. Nach dem Hochheben aus dem Ge fäß 31 wird sie zum Ort des Probengefäßes 29 bewegt, um dort eine vorgegebene Menge der zu analysierenden Probe anzusau gen. Schließlich wird sie weiter zum Ort des Reaktionsgefä ßes 32 bewegt, in das dann die von der Düse aufgenommene Probe und die interne Standardlösung injiziert werden. Die interne Standardlösung ist eine solche, wie sie verwendet wird, um z. B. Änderungen in der prozentualen Ausbeute aus der Säule zu korrigieren. Das Hinzufügen der internen Stan dardlösung ist nicht immer erforderlich.

Anschließend wird das Dreiwegeventil 40 so verstellt, daß Verdünnungsmittel aus dem Tank 42 in vorgegebener Menge in die Injektionspumpe 41 gesaugt wird. Erneut wird das Drei wegeventil 40 verstellt, und der Spritzkolben der Injek tionspumpe 41 wird in das Innere des Pumpenzylinders ver schoben, um eine solche Menge an Verdünnungsmittel auszuge ben, die dem zehnfachen Volumen der im Reaktionsgefäß 33 aufgenommenen Probe entspricht. Das Ausgeben erfolgt aus der Düse 38 in das Reaktionsgefäß 33. Die Funktionen der Injek tionspumpe 41 und des Antriebsmechanismus 37 werden durch die Steuereinheit 56 gesteuert. Beim Ausführungsbeispiel beträgt die Probenmenge 0,1 ml und die Menge an hinzugefüg tem Verdünnungsmittel 1,0 ml. Die Probe wird durch Hinzufü gen des Verdünnungsmittels im Reaktionsgefäß 33 verdünnt.

Reinigen der Düse

Die Düse 38 wird in einem Schritt 104 gereinigt. Hierzu wird sie zum Ort der Ablauföffnung 35 bewegt, und Reinigungslö sung wird aus der Düse ausgegeben, um Verunreinigungen auf grund der internen Standardlösung und der Probe von ihrer Innenwand abzuwaschen. Dann wird die Düse weiter zum Ort des Düsenreinigungstanks 34 bewegt und in diesen abgesenkt, da mit die Reinigungslösung das Äußere der Spitze der Düse 38 reinigt.

Injizieren des Reagens und Vermischen

Das Reagens wird in einem Schritt 105 in das Reaktionsgefäß 33 injiziert. Hierzu wird die Düse 38 zum Ort des Reagenz gefäßes 30 bewegt und eine vorgegebene Menge des Reagens zum Umwandeln der physiologisch aktiven Substanzen in der Probe in Derivate wird in die Düse eingesaugt. Das angesaugte Rea gens wird anschießend in das Reaktionsgefäß 33 injiziert und mit der Probe und der internen Standardlösung vermischt, die zuvor in das Reaktionsgefäß injiziert wurden. Das Mischen kann wahlweise auch durch andere Verfahren erfolgen, z. B. dadurch, daß Luft in die Düse eingesaugt wird, die Düse dann in das Reaktionsgefäß eingeführt wird und die Luft in der Düse in das Gefäß entladen wird. Auch kann ein Verfahren verwendet werden, gemäß dem das Reaktionsgefäß durch äußere mechanische Kräfte oder durch eine elektrische Einrichtung geschüttelt oder in Schwingung versetzt wird. Wenn das Rea gens mit der Probe und der internen Standardlösung leicht mischbar ist und in relativ großer Menge zugegeben wird, kann ausreichendes Durchmischen auch lediglich dadurch er folgen, daß das Reagens mit großer Geschwindigkeit entladen wird.

Reaktion

In einem Schritt 106 startet die Markierreaktion durch die Fluoreszenzsubstanz (Reagens) zum Umwandeln der Catechol amine in der Probe in fluoreszierende Derivate. Die Mi schungslösung der Probe, des Reagens und des Verdünnungs mittels im Reaktionsgefäß 33 verbleibt in diesem für eine vorgegebene Zeitspanne bei vorgegebener Temperatur, um das Fortschreiten der Reaktion zu ermöglichen, wodurch das Mar kieren mit dem fluoreszierenden Reagens bewirkt wird.

Einführen des Reaktionsgemischs in das Dosierrohr

Das Reaktionsgemisch wird in einem Schritt 107 aus dem Reak tionsgefäß 33 in das Dosierrohr 49 eingeführt. Hierzu wird das Reaktionsgemisch mit den Catecholaminen, die im wesent lichen durch die Markierreaktion in Derivate umgewandelt wurden, aus dem Reaktionsgefäß 33 in die Düse 38 eingesaugt.

Die Düse wird dann zum Ort der Injizieröffnung 36 bewegt und in diese eingeführt. Das Zuführventil 47 für das Reaktions gemisch wird in die in Fig. 1 eingezeichnete Stellung ge stellt, und das Reaktionsgemisch wird in das Dosierrohr 49 injiziert. Wenn das Ventil 47 nach dem Füllen des Dosier rohrs 49 mit dem Reaktionsgefäß verstellt wird, ist das mit dem Anschluß des Umschaltventils 47 verbundene Dosierrohr zwischen den Durchlaufweg 62 und den Durchlaufweg 63 ge schaltet, und eine vorgegebene Menge des Reaktionsgemischs wird durch den Fluß der Transportlösung in die Säule 48 übertragen.

Konzentrieren und Entfernen von Proteinen

In einem Schritt 108 wird das Festhalten der Catecholamin derivate in der Säule 48 zum Entfernen von Proteinen ausge führt, wie auch das Entfernen von Proteinen und von über schüssigem Reagens. Gleichzeitig werden die Catecholamin derivate konzentriert. Wenn das Reaktionsgemisch durch den Fluß der Transport- und Reinigungslösung in die Säule 48 zum Entfernen von Proteinen übertragen wird, werden die Cate cholaminderivate durch Adsorption in der Säule 48 zum Ent fernen von Proteinen festgehalten und dort angesammelt. Ver unreinigungen, die die später auszuführende Messung stören können, wie Proteine und überschüssiges Reagens, laufen durch die Säule zum Entfernen von Proteinen und werden am Ausgangsanschluß 64 ausgegeben.

Übertragen der Derivate

In einem Schritt 109 werden die von Verunreinigungen ge trennten und in der Säule 48 zum Entfernen von Proteinen festgehaltenen Catecholaminderivate desorbiert und in die Trennsäule 53 eingeführt. Wenn das Säulenumschaltventil 52 von dem in Fig. 1 mit durchgezogenen Linien eingezeichneten Zustand in den mit gestrichelten Linien eingezeichneten Zu stand verstellt wird, wird die Säule 48 zum Entfernen von Proteinen zwischen die Durchlaufwege 65 und 66 geschaltet, wodurch der Fluß der Eluierlösung durch die Säule 48 zum Entfernen von Proteinen ermöglicht ist, was dazu führt, daß die in der Säule 48 zum Entfernen von Proteinen vorhandenen Catecholaminderivate desorbiert werden und in die Trennsäule 53 übertragen werden, in der die Derivate in einzelne Be standteile aufgetrennt werden sollen. Wenn das Umschaltven til dann, wenn alle Derivate in den Durchlaufweg 66 über tragen wurden, wieder verstellt wird (in die mit durchgezo genen Linien in der Zeichnung dargestellte Stellung), kann die Eluierlösung direkt in die Trennsäule 53 ohne Durchlauf durch die Säule 48 zum Entfernen von Proteinen fließen, und Übertragungs- und Reinigungslösung beginnt, in die Säule 48 zum Entfernen von Proteinen zu fließen.

Trennung

In einem Schritt 110 wird dafür gesorgt, daß Eluierlösung durch die Trennsäule 53 fließt, wodurch Catecholaminderivate in Bestandteile aufgetrennt werden. Norepinephrin (NE), Epinephrin (E) und Dopamin (DA) werden eluiert und aus der Trennsäule in jeweiligen Bändern ausgegeben.

Regenerieren der Säule zum Entfernen von Proteinen

In einem Schritt 111 fließt Übertragungs- und Reingiungs flüssigkeit in die Säule 48 zum Entfernen von Proteinen, gleichzeitig mit dem Trennen der Catecholaminderivate in einzelne Bestandteile in Schritt 110. Die Säule 48 zum Ent fernen von Proteinen wird dadurch bis in einen Zustand rege neriert, in dem sie zum Empfangen der nächsten Menge an Reaktionsgemisch bereit ist.

Messung

In einem Schritt 112 wird das Eluat von der Trennsäule 53 durch das Fluoreszenzphotometer 54 gemessen. Die aufgetrenn ten, eluierten und aus der Trennsäule 53 ausgegebenen Deri vatbestandteile fließen aufeinanderfolgend durch die Durch flußzelle 59 des Fluoreszenzphotometers 54. Die Fluoreszenz intensität jedes abgetrennten Bestandteils wird gemessen, und die Messung wird einem Bearbeitungsablauf unterzogen, um die Konzentration jeder Komponente zu bestimmen.

Darstellen und Ausgeben von Daten

In einem Schritt 113 werden die in Schritt 112 erhaltenen Daten dargestellt und mit Hilfe des Druckers 57, der Katho denstrahlröhre 58 usw. ausgegeben. In einem Schritt 114 wird untersucht, ob alle Proben vom automatischen Probennehmer dem kurz beschriebenen Ablauf unterworfen wurden. Wenn noch Proben vorhanden sind, die noch nicht bearbeitet wurden, kehrt der Analyseablauf zum Schritt 102 zurück, um eine neue Analyse zu beginnen. Wenn sichergestellt ist, daß alle Pro ben behandelt wurden, geht die Funktion zu einem Schritt 115 über, in dem der vom Analysator von Fig. 1 ausgeführte Ana lyseablauf beendet wird.

Vorstehend wurde der Analyseablauf für den Fall erläutert, daß eine einzige Probe in erfindungsgemäßer Weise analysiert wird. Im folgenden wird der Analyseablauf für den Fall der kontinuierlichen Analyse bei mehreren Proben beschrieben. Die Fig. 3A und 3B veranschaulichen ein Analyseprogramm für kontinuierliche Analyse.

Entlang der vertikalen Achse in Fig. 3A sind die einzelnen Funktionsschritte des Flußdiagramms von Fig. 2 dargestellt, jedoch unterteilt in drei Schrittbereiche 1, 2 und 3. Zum ersten Schrittbereich gehören die Funktionen zum Umwandeln der Catecholamine in Derivate im automatischen Probennehmer. Der zweite Schrittbereich umfaßt die Funktionen zum Konzen trieren der Catecholaminderivate in der Säule zum Entfernen von Proteinen und zum Entfernen von Proteinen. Der dritte Schrittbereich umfaßt die Funktionen zum Auftrennen der Ca techolaminderivate in einzelne Bestandteile in der Trennsäu le und des Messens jedes Bestandteils. Jeder Schrittbereich ist so ausgestaltet, daß die Gesamtzeit für jeden Schritt bereich in das gesamte Funktionsprogramm paßt. Entlang der horizontalen Achse ist die Zykluszahl und die im Ablauf des Analyseprogramms verstrichene Zeit dargestellt. Das Programm ist so ausgebildet, daß alle Funktionsschritte im ersten bis zum dritten Schrittbereich in einem Zyklus abgeschlossen werden.

Fig. 3A veranschaulicht ein Analyseprogramm, bei dem die Analyse einer Probe n im Vordergrund steht (mit dicken durchgezogenen Linien dargestellt). Dünne durchgezogene Li nien kennzeichnen die Analyse für eine Probe n+1 und eine Probe n-1, während gestrichelte Linien die Analysen für Proben n-2 bzw. n+2 veranschaulichen. Fig. 3B veranschau licht die Betätigungen der Wechselventile. Die Dosierstel lung a des Zuführventils 47 für das Reaktionsgemisch ist eine Stellung, in der das Reaktionsgemisch von der Injizier öffnung 36 in das Dosierrohr 49 gegeben werden kann, also den Zustand, wie er in Fig. 1 eingezeichnet ist. Die Zuführ stellung b bezeichnet eine Stellung, in der das Ventil so verstellt wurde, daß das Dosierrohr 49 mit dem Durchlaufweg der Säule zum Entfernen von Proteinen verbunden ist. Die Verbindungsstellung c des Säulenumschaltventils 52 ist die Stellung, in der die Vorsäule 48 mit dem Durchlaufweg der Trennsäule verbunden ist. Die Synchronbehandlungsstellung d ist die Stellung, in der die Vorsäule 48 von der Trennsäule abgetrennt ist und die Übertragungs- und Reinigungslösung fließt. Diese Stellung d ist die mit durchgezogenen Linien bei 52 in Fig. 1 eingezeichnete Stellung. Das Verstellen je des Umschaltventils wird mit jedem Zyklus wiederholt.

Beim Ausführen des Analyseablaufs beginnt die Analyse der ersten Probe (d. h. der zuerst analysierten Probe) im ersten Zyklus. Anschließend beginnen die Analysen der zweiten und weiterer Proben vom automatischen Probennehmer im zweiten Zyklus bzw. späteren Zyklen. Fig. 3A zeigt das Funktionspro gramm für die Zyklen n bis n+2. Es ist dargestellt, daß im Zyklus n die Analyse der Probe n (Probe, die an n-ter Stelle analysiert wird) beginnt, und daß die Funktionen des ersten Schrittbereichs ausgeführt werden. Dies wird mit den zuvor gestarteten Abläufen für den zweiten Schrittbereich der Pro be n-1 und den Abläufen im dritten Schrittbereich der Probe n-2 synchronisiert. Anschließend erreicht im Zyklus n+1 die Probe n den Ablauf im zweiten Schrittbereich, und die fol gende Probe n+1 unterläuft die Funktionen im ersten Schritt bereich. Dies ist mit den Funktionen im dritten Schrittbe reich für die Probe n+1 synchronisiert. Weiterhin erreicht im Zyklus n+2 die Probe n den dritten Schrittbereich der Funktionsabläufe, während die Probe n+1 die Funktionen im zweiten Schrittbereich durchläuft. Gleichzeitig laufen die Funktionen im ersten Schrittbereich für die Probe n+2 ab.

Wenn nur eine Probe analysiert wird, entspricht die für eine Analyse mit dem vorliegenden Analysator erforderliche Zeit spanne der Summe der Zeitspannen, die für den ersten, zwei ten und dritten Schrittbereich erforderlich sind, also der Gesamtzeitspanne für drei Zyklen. Wenn jedoch mehrere Proben kontinuierlich analysiert werden, ist es möglich, eine Probe pro Zyklus zu analysieren. Beim Ausführungsbeispiel beträgt die Analysezeit für eine Probe 5 Minuten, da die Zeitspanne für einen Zyklus 5 Minuten beträgt.

Beim Chromatographieren von Catecholaminderivaten ist es wünschenswert, mindestens 10 Proben pro Stunde zu analysie ren. Demgemäß beträgt die für einen Zyklus zulässige Zeit maximal 6 Minuten.

Fig. 4 ist eine Draufsicht auf den automatischen Probenneh mer 26 im Analysator von Fig. 1. Das Probengestell 27 ist abnehmbar am Probentisch 28 befestigt. Es weist eingeformte Haltelöcher 70 für Probengefäße auf, die in zehn Spalten und fünf Zeilen (insgesamt 50 Löcher) in Form einer Matrix ange ordnet sind. In diesen Löchern 70 sind Probengefäße angeord net, von denen jedes eine zu analysierende Probe enthält. Am Probengestell sind auch folgende Funktionseinheiten vorhan den: Aufnahmeöffnungen für eine Reagens 30, eine interene Standardlösung 31 und eine Standardprobe 32, wie auch Löcher 71a, 71b und 71c zum Aufnehmen von Gefäßen für Notfallpro ben, um es zu ermöglichen, Notfallmessungen in den Analyse ablauf einzuschieben. Auf einer Seite des Probengestells 27 sind das Reaktionsgefäß 33, der Düsenreinigungstank 34, die Ablauföffnung 35 und die zum Dosierrohr 49 führende Inji zieröffnung 36 jeweils an festgelegter Stelle vorhanden. Die Injizierdüse 39 ist an einem Halter 5 befestigt, der ver schiebbar auf der Welle eines Verstellblocks 3 befestigt ist. Angetrieben durch einen Verstellmechanismus 37 kann sich die Düse 38 in drei Dimensionen (Richtungen der X-, Y- und Z-Achsen) bewegen, so daß sie zum Ort eines jeden Gefä ßes oder einer jeden Öffnung bewegt werden kann, um die er forderlichen Funktionen auszuüben.

Der Analyseablauf beginnt damit, daß eine Bedienperson einen Schalter für den Analysebeginn betätigt, der an einer Be dienkonsole 27 vorhanden ist, nachdem sie das Probengestell 27 mit den zu analysierenden Proben und dem Reagens am Pro bentisch 28 des automatischen Probennehmers 26 angebracht hat.

Die Fig. 5A und 5B veranschaulichen den Aufbau des Analysa tors von Fig. 1. Dieser Catecholaminanalysator ist vom ver tikalen Typ, und er enthält alle für die Analyse erforderli chen Einheiten.

Der Analysator ist in zwei Bereiche unterteilt. Im oberen Bereich sind der automatische Probennehmer 26, das Fluores zenzphotometer 54 und eine Säulenkonsole 72 vorhanden. Auf der Säulenkonsole 72 sind die Säule 48 zum Entfernen von Proteinen, die Trennsäule 53, das Zuführventil 47 für Reak tionsgemisch und das Säulenumschaltventil 52 angeordnet. Die Temperatur der Trennsäule 53 wird durch einen thermostati schen Block 73 während der Analyse auf eine konstante Tempe ratur mit vorgegebenem Pegel geregelt. Das Anbringen und Wegnehmen des Probengestells 27 auf dem automatischen Pro bennehmer 26 bzw. von diesem erfolgt durch Öffnen und Schließen eines Deckels 74. Ein Diskettenlaufwerk 75 zum Speichern von Meßdaten auf Diskette ist oberhalb des Fluo reszenzphotometers 74 angeordnet.

Im unteren Bereich des Analysators sind folgende Teile vor handen: der Tank 42 für Reinigungsmittellösung, der Tank 45 für Übertragungs- und Reinigungslösung, der Eluierlösungs tank 50, die Injektionspumpe 41, die Pumpe 46 zum Fördern der Übertragungs- und Reinigungslösung und die Pumpe 51 zum Fördern der Eluierlösung. Die für die Analyseeinheiten im oberen Bereich des Analysators erforderlichen Lösungen wer den aus dem unteren Bereich geliefert. Im hinteren Teil des unteren Bereichs des Analysators ist eine elektrische Ein heit 76 mit einer Spannungsversorgung, Leiterplatten und dergleichen angeordnet. Oben auf dem Analysator sind ein Drucker 57, eine Kathodenstrahlröhre 58 und eine Bedienkon sole 77 vorhanden, über die Information zum Ausführen der Analyse durch den Analysator eingegeben wird.

Anschließend wird das erfindungsgemäße Analyseverfahren mit Hilfe des Analysators von Fig. 1 unter Bezugnahme auf die Figuren beschrieben. Der Einfachheit halber wird ein Ausfüh rungsbeispiel beschrieben, bei dem die zu analysierenden Substanzen Catecholamine sind. Jedoch ist das erfindungsge mäße Verfahren in keiner Weise auf dieses Ausführungsbei spiel beschränkt.

Als Probe wird Plasma oder Serum mit Catecholaminen verwen det. Als Verdünnungsmittel kommen Wasser, verschiedene Puf ferlösungen und wäßrige Lösungen mit kleinen Mengen orga nischer Lösungsmittel in Frage. Wasser oder niedrig konzen trierte Pufferlösungen sind bevorzugt. Die Anwesenheit eines organischen Lösungsmittels in hoher Konzentration in einer wäßrigen Lösung als Verdünnungsmittel kann zu Denaturie rung, Agglomeration und Ausfällen der Proteine führen. Fig. 6 zeigt ein Diagramm, in dem der Umwandlungsgrad von Cate cholaminen in Derivate, ausgedrückt als Fluoreszenzintensi tät der Derivate, über dem Verdünnungsgrad (-fach) aufgetra gen ist. Entlang der vertikalen Achse ist die relative Fluo reszenzintensität aufgetragen (die Fluoreszenzintensitäten von Catecholaminderivaten in der Probe relativ zu den Inten sitäten von Catecholaminderivaten in einer Catecholaminstan dardlösung). Als Verdünnungsmittel wurde Wasser verwendet. Nach der Reaktion zum Umwandeln der Catecholamine in Deriva te wurde eine Behandlung zum Entfernen von Proteinen mit einer Ultrafiltermembran ausgeführt.

Aus Fig. 6 ist ersichtlich, daß man dann, wenn man ein Rea gens direkt zu einer Probe mit Catecholaminen und Proteinen gibt, um die Catecholamine in jeweilige Derivate umzuwan deln, nur geringe Fluoreszenzintensität im Vergleich zu dem jenigen Fall erhält, bei dem man Catecholaminderivate da durch erhält, daß dasselbe Reagens zu einer Standardprobe gegeben wird, die dieselben Mengen an Catecholaminen ent hält, jedoch keine Proteine. Im Fall von Dopaminderivaten beträgt das Fluoreszenzverhältnis für die genannten Proben 1 : 10, was besonders niedrig ist. Wenn die Probe jedoch mit zunehmend mehr Wasser verdünnt wurde, stieg die Fluoreszenz intensität der Probe an; bei 8facher Verdünnung war die Fluoreszenzintensität der Probe auf einen solchen Wert ange stiegen, daß die Anwesenheit von Proteinen im wesentlichen keinen nachteiligen Effekt auf die Genauigkeit der Messung der Catecholaminderivate gab. Der normale Bereich der Pro teinkonzentration in Blut ist 6,6-8,6%. Als Verdünnungs mittel können neben Wasser auch Pufferlösungen und Lösungen mit einem Salz, EDTA oder einer geringen Menge eines organi schen Lösungsmittels verwendet werden. Diese Lösungen zeigen denselben Effekt wie Wasser.

Es wird nun ein Beispiel der Analyse von Catelcholaminen in Plasma beschrieben, wobei der Analysator gemäß Fig. 1 ver wendet wird. Die Analysebedingungen sind diejenigen, wie sie in Tabelle 1 dargestellt sind.

Tabelle 1

Mehrere Proben mit Plasma und Proteinen wurden in Probenge fäße 29 eingefüllt. Die Probengefäße wurden auf dem Proben gestell 27 angeordnet. Die Übertragungs- und Reinigungslö sung 45 und die Eluierlösung 50 wurden in die Säule 48 zum Entfernen von Proteinen und in die Trennsäule 53 mit einer Menge von 1 ml/min durch die Förderpumpen 46 bzw. 51 geför dert. Das Eluat von der Trennsäule 53 wurde durch das Fluo reszenzphotometer 54 gemessen, und dann, wenn für die Grund linie ein stabiles Signal erhalten wurden, wurde die Funk tion des automatischen Probennehmers 26 gestartet. Durch die Injektionsdüse 38 wurden 50 µl Probe aus dem Probengefäß an gesaugt und dann in das Reaktionsgefäß 33 entladen. Darüber hinaus wurden 450 µl Reinigungslösung 42 angesaugt und in das Reaktionsgefäß 33 gegeben, wodurch Verdünnung und Durch mischung bewirkt wurden. Zum Inhalt des Reaktionsgefäßes 33 wurden 400 µl des Reagens 30 und 50 µl der internen Stan dardlösung 31 gegeben, und durch Mischung wurde durch mehr faches Einsaugen und Wiederausstoßen bewirkt. Das Gemisch blieb für drei Minuten stehen. In diesem Zeitraum wurde die Temperatur des Reaktionsgefäßes auf 50°C gehalten. Anschlie ßend wurden 500 µl des Reaktionsgemischs mit in Derivate um gewandelten Catecholaminen durch die Injizierdüse 38 einge saugt und über die Injizieröffnung 36 in das Dosierrohr 49 injiziert. Das Zuführventil 47 für Reaktionsgemisch wurde so eingestellt, daß Durchlauf der Übertragungslösung 45 durch das Dosierrohr 49 ermöglicht war, wodurch das Reaktionsge misch mit den Catecholaminderivaten und den Proteinen in die Säule 48 zum Entfernen von Proteinen übertragen wurde. Dabei wurden die Catecholamine im Reaktionsgemisch adsorbiert und verblieben in der Säule 48, wohingegen die Proteine über den Ausgangsanschluß 64 ausgegeben wurden. Anschließend wurde für etwa drei Minuten Übertragungs- und Reingungslösung 45 durch die Säule 48 zum Entfernen von Proteinen geleitet. Da nach wurde das Durchlaufweg-Umschaltventil 52 so umgeschal tet, daß Eluierlösung 50 über die Säule 48 zum Entfernen von Proteinen in die Trennsäule 53 fließen konnte. Gleichzeitig wurde der Drucker in Gang gesetzt.

Ein Chromatogramm, wie es dabei erhalten wurde, ist in Fig. 7 dargestellt. Die Probe enthielt 50-150 pg Catecholamine, und es bestand praktisch kein Problem für die entsprechende Empfindlichkeit bei der Analyse. Die zum Auftrennen der Ca techolaminderivate in einzelne Bestandteile erforderliche Zeit betrug weniger als vier Minuten, was zu keinem Problem bei Hochgeschwindigkeitstrennung bei synchroner Behandlung führte. In der Säule zum Entfernen von Proteinen wurden min destens 95% der Proteine entfernt, was nur einen kleinen Effekt auf die Lebensdauer der Trennsäule hatte.

Von den drei Catecholaminkomponenten und einer internen Standardsubstanz wurden jeweils mindestens 98% rückgewon nen.

Ein anderes Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Ana lysators ist in Fig. 8 dargestellt. Dieses Ausführungsbei spiel unterscheidet sich von dem gemäß Fig. 1 dadurch, daß es weder eine Säule 48 zum Entfernen von Proteinen noch einen Säulenumschaltmechanismus, wie das Durchflußweg-Um schaltventil 52, aufweist. Einheiten mit denselben Funktio nen, wie sie für das Ausführungsbeispiel von Fig. 1 erläu tert wurden, tragen jeweils dasselbe Bezugszeichen wie dort.

Beim Analysator gemäß Fig. 8 wird eine Probe in verdünntem Zustand in einem Reaktionsgefäß 33 einer Reaktion zum Umwan deln physiologisch aktiver Substanzen in Derivate unterwor fen. Das Reaktionsgemisch im Reaktionsgefäß 33 wird durch eine Düse 38 zu einer Injizieröffnung 36 übertragen und mit Hilfe einer Pumpe 41 in das Durchlaufsystem eines Analyseab schnitts 44 ausgegeben. Das Reaktionsgemisch wird in vorge gebener Menge, d. h. einer Menge, die ein Dosierrohr 49 füllt in eine Trennsäule 100 ausgegeben. Da bei diesem Aus führungsbeispiel keine Säule zum Entfernen von Proteinen verwendet wird, unterscheidet sich die Füllung der Trennsäu le 100 von derjenigen der Trennsäule des Analysators von Fig. 1.

Als Füllung für die Trennsäule 100 wird eine solche verwen det, die es ermöglicht, daß Bestandteile mit sehr hohem Mo lekulargewicht (z. B. Proteine) durch die Trennsäule 100 durchlaufen können, die aber sehr hydrophobe Bestandteile mit kleinem Molekulargewicht (z. B. Catecholaminderivate) adsorbiert. Ein Beispiel für eine solche Füllung ist eine vom intern umgekehrten Phasentyp (internally reversed phase type column), wie sie unter der Bezeichnung GFF-S5-80 Packed Column von Regis Chemical Company erhältlich ist. Die in dieser Säule verwendete Füllung weist eine Teilchengröße von 5 µm bei einem Innendurchmesser von 4,6 mm und einer Länge von 15 cm auf. Ein anderes Beispiel für eine verwendbare Trennsäule 100 ist eine solche mit einer hydrophoben Poly merfüllung, wie sie unter dem Handelsnamen Hisep von der Firma Supelco vertrieben wird. Diese Säule enthält eine netzwerkgeschützte Füllung auf Kieselerdebasis mit einer Teilchengröße von 5 µm.

Ein weiteres Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Analysators ist in Fig. 9 dargestellt. Der Catecholaminana lysator gemäß diesem Ausführungsbeispiel verwendet im we sentlichen denselben Durchflußweg wie derjenige von Fig. 1, jedoch sind in Fig. 9 weder das Durchlaufsystem für die Säule 48 zum Entfernen von Proteinen noch für die Trennsäule 53 eingezeichnet. Beim Analysator von Fig. 9 ist der Funk tionsablauf für das Gemischzuführventil 47 und für die Zeit punkte des Ansaugens und Ausgebens von Lösungen durch die Injizierdüse 38 unterschiedlich von den Abläufen beim Ana lysator gemäß Fig. 1 Die Steuereinheit 56 steuert die Funk tionen des Antriebsmechanismus 37, einer Injizierpumpe 51 und des Gemischzuführventils 47 gemäß einem Programm zum Ausführen von Abläufen, wie im folgenden beschrieben.

Beim Analysator gemäß Fig. 9 wird ein Mischgefäß 82 statt dem Reaktionsgefäß 33 von Fig. 1 verwendet. Ein Dosierrohr 49 und eine Trennsäule 53 sind in einem thermostatischen Luftbad 95 angeordnet, und sie werden auf einer Temperatur von 30 bis 60°C gehalten. Falls erforderlich, kann auch das Gemischzuführventil 47 im thermostatischen Luftbad 95 ange ordnet sein. Um das Bad 95 auf konstanter Temperatur zu hal ten, sind in ihm ein Heizer 90 und ein Temperatursensor 91 angeordnet. Der Heizer 90 wird abhängig vom Signal vom Tem peratursensor 91 ein- oder ausgeschaltet.

Im Analysator von Fig. 9 wirkt das Dosierrohr 49 als Reak tionsort. Die im Dosierrohr 49 gespeicherte Lösung wird da durch von den anderen Durchlaufsystemen getrennt, daß das Gemischzuführventil 47 in den mit durchgezogenen Linien dar gestellten Zustand verstellt wird und in diesem gehalten wird, während ein Sperrventil 85 in geschlossenem Zustand gehalten wird, um den Ablauf der Markierreaktion zu ermögli chen (der Reaktion, bei der die Catecholamine in der Probe in Derivate umgewandelt werden). Zunächst werden eine Blut probe 29, aus der Proteine nicht entfernt wurden, ein Rea gens 30 und ein Verdünnungsmittel 42 mit Hilfe der Injizier düse 38 in das Mischgefäß 32 übertragen, und sie werden ver mischt. Direkt anschließend beginnt die Umwandlung von Cate choaminen in der Probe in Derivate. Die Mischung wird von der Düse 38 angesaugt und dann mit Hilfe der Injizierpumpe 41 durch die Injizieröffnung 36 in das Dosierrohr 49 einge geben, um dieses mit der Mischung zu füllen. Zu diesem Zeit punkt befindet sich das Mischungszuführventil 47 in der mit gestrichelten Linien dargestellten Stellung. Daher wird die im Dosierrohr und dem vorderen Teil des Gemischzuführventils 47 vorhandene Übertragungslösung über das Sperrventil 85 in einen Abfluß 86 gegeben. Dann wird das Sperrventil 85 wieder geschlossen, damit die Mischung im Dosierrohr 49 verbleibt und dort die Reaktion zum Umwandeln der Catecholamine in der Probe in Derivate bei der genannten konstanten Temperatur von 30 bis 60°C ablaufen kann.

Nach Abschluß der genannten Reaktion wird das Gemischzuführ ventil 47 in die mit gestrichelten Linien eingezeichnete Stellung verstellt, und das Reaktionsgemisch wird durch eine Übertragungslösung 47 in solcher Weise in die Säule zum Ent fernen von Proteinen übertragen, daß das Reaktionsgemisch zwischen Abschnitten der Übertragungslösung eingeschlossen ist. Die anschließenden Behandlungsabläufe sind dieselben wie diejenigen, die anhand des Analysators von Fig. 1 be schrieben wurden. Im Ausführungsbeispiel von Fig. 9 ist es nicht erforderlich, das Mischgefäß 82 zu beheizen. Daher kann der Analysator einfacher aufgebaut sein als der von Fig. 1.

Gemäß der Erfindung können zu analysierende physiologisch aktive Substanzen in einer biologischen Probe, aus der Pro teine nicht entfernt wurden, wirkungsvoll in Derivate ohne negativen Einfluß der ebenfalls in der Probe vorhandenen Proteine umgewandelt werden. Dementsprechend können Substan zen in einer solchen Probe mit hoher Genauigkeit analysiert werden. Die Erfindung ist demgemäß von sehr großem Vorteil für praktische Anwendung.

Claims

1. Chromatographieverfahren zum Analysieren einer biologi schen Probe, gekennzeichnet durch folgende Schritte:

- Vermischen der biologischen Probe, eines Verdünnungsmit tels und eines Reagens zum Umwandeln physiologisch aktiver Substanzen in der Probe in Derivate,
- Übertragen des Reaktionsgemischs in eine Säulenanordnung zum Auftrennen der Derivate in einzelne Bestandteile und zum Wegleiten von Proteinen,
- und Analysieren der voneinander getrennten Bestandteile.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Säule zum Wegleiten der Proteine und eine Trennsäule zum Trennen der Derivate in die einzelnen Bestandteile ver wendet werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine einzelne Säulenfüllung verwendet wird, die keine Pro teine adsorbiert, jedoch das Trennen in die Bestandteile vornimmt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch ge kennzeichnet, daß die Reaktion zum Umwandeln der physiolo gisch aktiven Substanzen in Derivate in einem Reaktionsgefäß vor dem Übertragen des Reaktionsgemischs in die Säulenanord nung erfolgt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch ge kennzeichnet, daß die Reaktion zum Umwandeln der physiolo gisch aktiven Substanzen in Derivate in einem Durchlauf aus geführt wird, der zur Säulenanordnung führt, wobei die Mi schung in den Durchlauf transportiert wird und dort der Fluß der Flüssigkeit für eine vorgegebene Zeitspanne angehalten wird.

6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Packung eine solche mit intern umgekehrter Phase (inter nally reversed phase type packing) oder eine solche mit netzwerkgeschützter Füllung auf Kieselerdebasis (network protected silica-based packing) verwendet wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch ge kennzeichnet, daß die Reaktion zum Umwandeln der physiolo gisch aktiven Substanzen in Derivate bei etwa 30 bis 60°C erfolgt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch ge kennzeichnet, daß die Reaktion zum Umwandeln der physiolo gisch aktiven Substanzen in Derivate bei 8- bis 20facher Verdünnung der Probe erfolgt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch ge kennzeichnet, daß die Probe so weit verdünnt wird, daß die Proteinkonzentration höchstens noch 1% beträgt.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch ge kennzeichnet, daß es an Catecholaminen als physiologisch ak tiven Substanzen ausgeführt wird und 1,2-Diphenylethylen diamin als Reagens verwendet wird.

11. Flüssigphasenchromatographie-Analysator, gekennzeichnet durch:

- einen Trenn- und Analyseabschnitt mit einer Trennsäule (53, 100) zum Auftrennen einer biologischen Probe in ihre Bestandteile und einem Detektor (54) zum Feststellen der Be standteile,
- und einem Abschnitt mit einem automatischen Probennehmer (27, 28) zum Zuführen der biologischen Probe zum Trenn- und Analysierabschnitt, mit einem Probengefäß (29), einem Reak tiongsgefäß (30), einem Probenmischgefäß (33), einer Verdün nungsmittelzuführung mit einer beweglichen Düse (48) zum Zu führen von Verdünnungsmittel in der 8- bis 20fachen Menge des Probenvolumens zum Probenmischgefäß und einer Steuerein heit (56) zum Steuern der Funktion des Abschnitts mit dem automatischen Probennehmer in solcher Weise, daß die beweg liche Düse das Injizieren der Probe aus dem Probengefäß in das Probenmischgefäß, das Injizieren des Reagens aus dem Reagenzgefäß in das Probenmischgefäß und das Übertragen des im Probenmischgefäß hergestellten Gemischs in den Trenn- und Analyseabschnitt ausführt.

12. Analysator nach Anspruch 11, gekennzeichnet durch eine Säule (48) zum Abtrennen von Proteinen vor der Trennsäule (53, 100), die die Derivate der physiologisch aktiven Sub stanzen in der Probe adsorbiert, jedoch Proteine durchläßt.

13. Analysator nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Säule (48) zum Entfernen von Proteinen eine Füllung vom intern umgekehrten Phasentype (internally reversed phase type packing) oder eine solche mit einem ionenaustauschenden Polymeren aufweist.

14. Analysator nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Trennsäule (53, 100) eine Packung für umgekehrte Phase (reversed phase packing) aufweist.

15. Analysator nach einem der Ansprüche 11 bis 14, gekenn zeichnet durch eine thermostatische Einheit zum Aufrechter halten der Temperatur des Probenmischgefäßes auf 30 bis 60°C.

16. Chromatographieanalysator, gekennzeichnet durch:

- einen Reaktionsabschnitt (49) zum Ausführen einer Reaktion zu analysierender physiologisch aktiver Substanzen in einer Probe mit einem Reagens,
- und eine Trennsäule (53) zum Trennen der vom Reaktionsab schnitt übertragenen Reaktionsprodukte in einzelne Bestand teile,
- wobei der Reaktionsabschnitt und die Trennsäule durch einen thermostatischen Abschnitt (95) auf einer Temperatur von 30 bis 60°C gehalten werden.

17. Analysator nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Reaktionsabschnitt ein Durchlaufabschnitt zwischen dem Anfang des Flüssigkeitswegs und der Trennsäule (53) ist, in dem die eingeführte Flüssigkeit in Ruhe gehalten werden kann.

18. Analysator nach einem der Ansprüche 16 oder 17, gekenn zeichnet durch eine Einheit zum Übertragen des Gemischs mit der Probe, dem Reagens und dem Verdünnungsmittel zum Reak tionsabschnitt (49).