DE4024350A1 - Immunologisches multiplex-testsystem - Google Patents

Description

Diese Erfindung betrifft chemische und biochemische Tests, die einen oder mehrere Liganden umfassen, die sich spezi­ fisch an entsprechende reaktive Komponenten binden, und insbesondere Multiplex-Tests dieser Art.

Immunreaktionen, welche die Bildung von Antikörper/Antigen- Komplexen umfassen, sind exemplarisch für bekannte chemische oder biochemische Analyt/Ligand-Reaktionen, in denen ein Komplex durch die Reaktion von Komponenten gebildet wird, die sich hochspezifisch aneinander binden. Eine Reihe von anderen derartigen Reaktionen sind bekannt, zum Beispiel Nukleinsäurehybridisierungen, Enzym/Inhibitor-, Enzym/Coenzym-, Hormon/Rezeptor- und ähnliche substrat­ spezifische Reaktionen. Die Ausdrücke "Komponente" und "Ligand", wie sie hier verwendet werden, beziehen sich im allgemeinen austauschbar auf die reaktiven Teile eines solchen Komplexes, und bezüglich eines Antigen/Antikörper- Komplexes sind diese Ausdrücke zum Beispiel so gedacht, daß sie alle immunologisch reaktiven Teile einschließen, wie etwa Haptene, vollständige Antigene, reaktive Antigen/Anti­ körper-Fragmente und vollständige Antikörper. Der Ausdruck "Analyt" ist so gedacht, daß er sich auf die Komponente oder den Liganden bezieht, der entweder qualitativ, quantitativ oder in beiderlei Hinsicht untersucht werden soll, und der Ausdruck "Fänger" ist so gedacht, daß er sich auf den Liganden oder die Komponente bezieht, der (die) sich spezifisch an den interessierenden Analyten bindet.

Tests, die auf diesen wohlbekannten Immun- und anderen spezifischen Bindungsreaktionen beruhen, umfassen eine große Vielfalt von Techniken. Einige Testverfahren verwenden radioaktive, lumineszierende oder fluoreszierende Mar­ kierungen, die entweder an den Liganden oder an den Analyten gekoppelt sind und durch Messen der Strahlung, die vom Reaktionsprodukt oder Komplex ausgeht, nachgewiesen werden können. Typischerweise kann dort, wo ein Fänger, wie etwa ein auf einem Substrat immobilisierter Antikörper, in einer Lösung zur Reaktion gebracht wird, die eine unbekannte Menge einer reagierenden Komponente oder eines reagierenden Ana­ lyten enthält, wie etwa ein Antigen, das sich an den Fänger binden soll, der Titer des Antigens leicht erhalten werden. Zum Beispiel wird in der wohlbekannten Konkurrenztest­ technik eine Mischung des Analyten und einer bekannten Menge an markiertem Analyten auf die immobilisierte Phase aufgebracht, wobei die einzelnen Komponenten miteinander um die Bindungsstelle konkurrieren. Je größer die Menge an vorhandenen Probenanalyten ist, je geringer wird das Ausmaß sein, in dem sich der markierte Analyt an den Fänger binden wird. Unter Verwendung vorbestimmter Eichkurven und unter Messung der Intensität der Strahlung von demjenigen Antigen, das mit dem gebundenen Fänger komplexiert ist, kann man die Menge an unmarkiertem oder Probenanalyten bestimmen oder testen.

Bei einer anderen üblichen Technik kann man die Testlösung, die Analyten enthält, zu einem Fänger in Lösung hinzufügen. Vorausgesetzt, daß der gebildete Komplex genügend aggre­ gieren wird, um auszufallen oder zu verklumpen, würde die Beobachtung einer derartigen resultierenden Verklumpungs- oder Ausfällungsreaktion anzeigen, ob die Testlösung den Analyten enthalten hat, für den der Fänger spezifisch ist, oder nicht. Im letzteren Fall würde man Strahlung beob­ achten, die entweder von der Verklumpung oder dem Nieder­ schlag reflektiert oder gestreut wird oder deren Trans­ mission von der Verklumpung oder dem Niederschlag abge­ schwächt wird.

In immunologischen Tests, in denen Strahlung (z.B. α-Strah­ lung, Lumineszenzstrahlung oder Fluoreszenzstrahlung) vom Reaktionsprodukt ausgeht, kann man die Strahlung typischer­ weise mit Geiger- oder Szintillationszählern, Autoradio­ graphie, Fluorimetern und dergleichen nachweisen und/oder messen.

Es wird postuliert, daß die Bindungskräfte, die bei Anti­ körper/Antigen-Reaktionen betroffen sind, die kombinierte Wechselwirkung von elektrostatischen, Wasserstoffbrücken­ bindungs- und van der Waals-Kräften darstellen, in vielen Fällen ähnlich zu anderer spezifischer Bindung, wie zum Beispiel derjenigen, die in Enzym/Substrat- und bei der Bildung von Enzym/Coenzym-Komplexen auftritt, wodurch eine sehr starke, spezifische Bindung zur Verfügung gestellt wird. Die Spezifizität solcher Bindungsreaktionen ist jedoch nicht absolut. Da sich Komponenten, insbesondere markierte Antikörper, die bei solchen spezifischen Reaktionen betroffen sind, oft an andere Materialien binden können, kann in Tests, wie etwa immunologischen Tests und Fänger­ tests, die von der Spezifizität der Bindung abhängen, das Auftreten einer solchen nicht-spezifischen Bindung nach­ teilige Effekte auf die Empfindlichkeit und die Wieder­ holbarkeit des Testes haben. Es soll offensichtlich sein, daß der Ausdruck "gebunden", wie hier verwendet, so gedacht ist, daß er sich auf Liganden bezieht, die durch eine be­ liebige Art von Bindung, sei sie spezifisch oder nicht- spezifisch, gebunden sind.

Frühere Versuche, die Effekte nicht-spezifischer Bindungen auf Tests zu überwinden, sind primär chemisch gewesen und auf die Verwendung von Reagenzien gerichtet, die Proteine enthalten, die dazu gedacht sind, nicht-spezifische Bindung zu unterdrücken oder zu blockieren. Solche Reagenzien sind jedoch nicht universell wirksam, was sich in der Tatsache wiederspiegelt, daß viele verschiedene Arten von Blockern (z.B. Kalbsfötenserum, Gelatine, Kasein usw.) in Antikörper/Antigen-Tests verwendet worden sind.

In der folgenden Diskussion werden aus Gründen der Zweck­ dienlichkeit Tests, die spezifische Bindungsreaktionen be­ treffen, am Beispiel von immunologischen Tests veranschau­ licht werden, wobei es jedoch selbstverständlich ist, daß die betroffenen Prinzipien, auch wenn dies nicht besonders angegeben wird, auf andere Arten von Tests, die spezifischen Bindungsreaktionen betreffen, angewendet werden können.

Das Erreichen der höchsten Meßgenauigkeit bei einer spezifischen Bindungsreaktion ist nicht eine Sache des stärksten Signals und der empfindlichsten Instrumente. Eine gewisse Empfindlichkeit kann wegen der durch die Antikörper­ affinität auferlegten Grenzen nicht durch Verbesserungen bei der Markierungssubstanz und bei den Instrumenten erreicht werden.

Betrachten wir zum Beispiel einen immunologischen Einfang- oder nicht-konkurrierenden Test. Im Prinzip besitzt der letztere ein Potential für größere Empfindlichkeit als ein konkurrierender immunologischer Test, weil die Effekte niedriger Antikörperaffinität durch eine Erhöhung in der Konzentration an markiertem Antikörper überwunden werden kann. Der Vorteil der potentiellen Empfindlichkeit eines nicht-konkurrierenden Verfahrens gegenüber einem konkurrierenden Verfahren steigt, bei Verwendung desselben Antikörpers, mit der abnehmenden Affinität des Antikörpers. Bei Verwendung einer Antikörperaffinität von 10¹²M ginge die potentielle Testempfindlichkeit, wenn zum Beispiel der Effekt nicht-spezifischer Bindung von 1% auf 0,01% verringert werden kann, von 10⁵ auf 10³ Moleküle/ml herauf. Die Erhöhung der Menge an markiertem Antikörper wäre jedoch begleitet von einer Erhöhung in der absoluten Menge nicht­ spezifischer Bindung des markierten Antikörpers, was die Möglichkeit verringert, die geringeren Mengen an Antigen zu unterscheiden, und könnte tatsächlich den Empfindlichkeits­ vorteil des nicht-konkurrierenden Verfahrens beseitigen oder verringern.

Für einen konventionellen Ansatz bei Ligandbindungs­ messungen wird nicht-spezifische Bindung üblicherweise dadurch geschätzt, daß man zunächst eine Reihe von externen Messungen (d.h. getrennt von oder vor der tatsächlichen Messung der Bindung) für die Nullreaktion des verwendeten Instrumentensystems durchführt, d.h. eine Messung nicht- spezifischer Bindungen außerhalb des durchzuführenden Tests, die durch den Test einer Probe erzielt wird, von der man weiß, daß sie keinen interessierenden Analyten enthält. Im allgemeinen sind solche Messungen nicht konstant, sondern schwanken um irgendeinen Mittelwert. Aus einer solchen Meß­ reihe kann man eine mittlere Antwort auf für nicht­ spezifische Bindung (NSB) und einen NSB-Rauschpegel definieren, bei dem das quadratisch gemittelte (RMS) Rauschen bei den NSB-Messungen gleich der Standardabweichung der NSB-Antworten ist. In nachfolgenden Tests von unbe­ kannten Analytkonzentrationen, kann die spezifische Antwort als die Systemantwort minus der mittleren NSB-Antwort ange­ nommen werden. Um natürlich sicher zu sein, daß eine vor­ gegebene Probe Analyt enthält, ist es notwendig, daß die spezifische Antwort größer ist als das Rauschen. Bei sehr kleinen Analytgehalten wird die Antwort üblicherweise vom NSB-Rauschen beherrscht.

Demgemäß ist es eine Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung ein Ligandbindungs-Messungssystem zur Verfügung zu stellen, das eine "interne" Bezugsgröße verwendet, die für die Ergänzung "externer" Kontrollmessungen verwendet werden kann, um die Empfindlichkeit des Systems zu verbessern. Eine andere wichtige Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein derartiges System zur Verfügung zu stellen, bei dem die Effekte nicht-spezifischer Bindung markierter Liganden, wie etwa Antikörper, unterdrückt oder minimiert werden, wodurch die Empfindlichkeit des Tests über die gegenwärtig von bekannten immunologischen Testsystemen erreichbare hinaus gesteigert wird.

Andere Aufgaben der vorliegenden Erfindung sind teilweise offensichtlich und werden teilweise im weiteren noch deut­ lich werden.

Die Erfindung umfaßt dementsprechend die Vorrichtung, welche die entsprechende Konstruktion, Elementkombination und Teileanordnung aufweist, und das Verfahren, das die verschiedenen Schritte und die Beziehung eines oder mehrerer solcher Schritte im Bezug auf jeden der anderen umfaßt, was alles in der folgenden detaillierten Offenbarung beispiel­ haft veranschaulicht ist, und wobei der Schutzumfang der Anmeldung in den Ansprüchen angegeben ist.

Für ein vollständigeres Verständnis der Art und der Ziele der vorliegenden Erfindung soll Bezug genommen werden auf die folgende detaillierte Beschreibung, die im Zusammenhang mit der beiliegenden Zeichnung zu sehen ist, in der

• eine idealisierte, teilweise schematische, teilweise im Querschnitt dargestellte Ansicht der Vorrichtung gezeigt ist, welchen die Prinzipien der vorliegenden Erfindung verkörpert.

Das System der vorliegenden Erfindung umfaßt im allgemeinen ein Multiplex-Testsystem, in dem Signale proportional zum Ausmaß der Bindung zweier unterschiedlicher Liganden im System erzeugt und in Echtzeit typischerweise gleichzeitig ausgewertet werden, d.h. entweder im wesentlichen simultan oder in einer Sequenz von Beobachtungen oder Messungen, die innerhalb einer vergleichsweise kurzen Zeit in Bezug auf dieselbe Probe im Test vorgenommen werden. Es ist in den meisten Fällen bevorzugt, die Beobachtungen so simultan wie möglich durchzuführen, um irgendwelche Effekte schneller Veränderungen im Hintergrund zu verringern.

Das Multiplex-System der vorliegenden Erfindung sollte von bekannten Mehrkanaltests unterschieden werden, in denen zwei oder mehr Analyten im wesentlichen simultan unter Verwendung verschiedener markierter Liganden getestet werden, die sich entsprechend einmalig spezifisch an die passenden Analyten binden. Vgl.: A Dual Radioimmunossay for the Detection of Morphine and Cocaine in Urine, A.S. Young, F. Rubio and S.E. Wagner, Clinical Chemistry, Bd. 34, Nr. 6, 1988, S. 1161.

Eine typische Ausführungsform des Multiplex-Testsystems der vorliegenden Erfindung ist jedoch eine, welche die spezifische Bindungsreaktion mit einem spezifischen interes­ sierenden Analyten in einer Probe bestimmt, wobei in diesem System zwei oder mehr unterschiedlich markierte Liganden, jeder mit seinen eigenen unterschiedlichen Bindungseigen­ schaften, gleichzeitig in Bezug auf die Probe im System be­ obachtet werden. Die erhaltenen Reaktionen werden ver­ arbeitet, um die Effekte nicht-spezifischer Bindungen in solch einem Test zu verringern, so daß die spezifische Bindungsreaktion genauer bestimmt werden kann.

Das Verfahren der vorliegenden Erfindung stellt daher einen Test für einen interessierenden Analyten in einer Probe zur Verfügung. Das Verfahren umfaßt den Schritt des Zur-Ver­ fügung-Stellens wenigstens zweier unterschiedlicher Liganden, von denen jeder an eine entsprechend unterschied­ liche Art von Markierungen gebunden ist, die voneinander unterscheidbar sind, und wenigstens ein erster von diesen Liganden in der Lage ist, sich spezifisch mit diesem Ana­ lyten zu binden. Die Liganden und die Probe werden mitein­ ander in Kontakt gebracht, z.B. durch Vermischen, um einen Testkörper zu bilden (der ein flüssiges Volumen sein kann), der einen Komplex einschließt, der wenigstens diesen ersten Liganden und den Analyten umfaßt. Gleichzeitig, quantitativ und getrennt voneinander wird dann die Messung des Teils von jeder Markierung durchgeführt, der ausschließlich an ge­ bundene Liganden im Testkörper gekoppelt, und diese Messungen werden verglichen. Messungen können natürlich dadurch einfacher durchgeführt werden, daß zuerst die ge­ bundenen von den ungebundenen Liganden getrennt werden, z.B. durch Auswaschen der ungebundenen Liganden.

Die vorliegende Erfindung wird in eine Vorrichtung zum Testen auf den Analyten in der Probe durch spezifische Bindung des Analyten an einen immobilisierten Liganden auf einer Reaktionsoberfläche zur Bindung eines Komplexes ver­ körpert. Spezifische Bindung wird durch In-Kontakt-Bringen der Probe mit dem immobilisierten Liganden und einem unter­ schiedlichen und unterschiedlich markierten zweiten Liganden bewirkt. Die zwei unterschiedlichen Liganden liegen in vor­ bestimmtem Anteilsverhältnis zueinander vor und sind nicht immunologisch kreuzweise reaktiv. Vorzugsweise wird sich der zweite Ligand nicht spezifisch an den Analyten oder andere Komponenten in der Probe binden. Die unterschiedlichen Markierungen auf den Liganden können quantitativ gemessen werden. Die relativen nicht-spezifischen Bindungseigen­ schaften dieser Liganden im Bezug auf die Vorrichtung drücken sich in einer bekannten oder vorbestimmten Funktion oder Beziehung aus. Quantitative Messung dieser nur an ge­ bundene Mengen der Liganden gekoppelten Markierungen wird dann im wesentlichen gleichzeitig durchgeführt. Ausgehend vom bekannten Verhältnis von Liganden im Testkörper, der bekannte Beziehung zwischen den nicht-spezifischen Bindungs­ eigenschaften der Liganden zur Vorrichtung und der quantitativen Messung der gebundenen Markierungen kann man relativ genau die spezifische Bindung des ersten Liganden an den Analyten bestimmen.

Insbesondere die unterschiedlichen Markierungen sind so ausgewählt, daß sie entsprechend Signale zur Verfügung stellen können, die leicht voneinander unterscheidbar sind, z.B. bei verschiedenen Wellenlängen fluoreszieren. Die durchgeführten quantitativen Messungen betreffen die Amplitude derjenigen Signale, die von den angeregten Markierungen geliefert werden, die an diejenigen Liganden gekoppelt sind, die sowohl spezifisch als auch nicht- spezifisch im Verlauf des Testes gebunden sind. Weil das relative Verhältnis von Liganden zueinander im Testkörper oder Reagenz bekannt ist und weil auch die Beziehung zwischen den nicht-spezifischen Bindungseigenschaften dieser Liganden bezüglich der Testvorrichtung bekannt oder vorbe­ stimmt ist, ist es dann relativ einfach, in Echtzeit das Ausmaß zu bestimmen, in dem die im Hinblick auf den einzigen Liganden, der spezifisch an den Analyten gebunden ist, ge­ messene Signale auf solche spezifisch gebundenen Liganden zurückzuführen sind.

Man nehme zum Beispiel an, daß der Ligand (L_s), der sich spezifisch an den Analyten bindet, und der Ligand (L_n), der sich nicht spezifisch an den Analyten bindet, in einem Ver­ hältnis (R₁) von 1:1 im Testkörper in Form eines Reagenzes vorliegt. Man nehme weiter an, daß ein Vortesten des Reagenzes in der Testvorrichtung in Abwesenheit von irgend­ einem interessierenden Analyten ergeben hat, daß die Liganden sich nicht-spezifisch im Verhältnis (R₂) von 1:2 (L_s:L_n) binden werden. Der Test erfordert dann, daß die Probe mit dem interessierenden Analyten, falls vorhanden, mit dem Reagenzkörper in Kontakt gebracht wird. Dies wird sowohl zur spezifischen Bindung von Analyten und L_s als auch zur nicht-spezifischen Bindung der Liganden an die Testvor­ richtung führen (wobei dieser Ausdruck in diesem Zusammen­ hang so verstanden werden soll, daß er alle andere auf­ tretenden Bindungsreaktionen neben der spezifischen Bindung des Analyten an L_s einschließt). Simultane Messung der charakteristischen und getrennten Signale (d.h. separate Kanalmessungen) aus den entsprechenden Markierungen auf den gebundenen Liganden wird dann durchgeführt. In einem ideali­ sierten Fall gehen die Signale aus L_n ausschließlich auf den Liganden L_n zurück, der nicht-spezifisch gebunden ist, wohingegen die Signale L_s von einem Liganden stammen werden, der sowohl spezifisch als auch nicht-spezifisch gebunden ist. Weil es bekannt ist, daß die Liganden im Verhältnis R₁ vorlagen und die relativen nicht-spezifischen Bindungseigen­ schaften dieser Liganden im Reagenz R₂ betrug, kann man dann diese Beziehungen verwenden, um das Ausmaß des Signals zu bestimmen, das aus spezifisch gebundenem L_s stammt.

Man nehme zum Beispiel an, daß die Amplituden der Signale zu A_s und A_n gemessen sind, die entsprechend das spezifisch und nicht-spezifisch gebundene L_s und das nicht-spezifisch ge­ bundene L_n repräsentieren, dann kann der Anteil S des Signals A_s, der nur auf das spezifisch gebundene L_s zurück­ geht, ausgedrückt werden als:

(1) S=A_s-A_nf(R₁,R₂),

in der f(R₁,R₂) eine Funktion (nicht notwendigerweise entweder linear oder nicht-linear) der Werte R₁ und R₂ ist.

Eine einfache exemplarische Form der Funktion als ein Produkt ist:

(2) f=k₁R₁k₂R₂,

in der k₁ und k₂ einfach Proportionalitäts- oder Wichtungs­ konstanten sind, die empirisch bestimmt werden.

Eine Variation der vorliegenden Erfindung ist in einer Test­ vorrichtung, wie oben beschrieben, verkörpert, wobei aber zusätzlich noch ein anderer oder dritter Ligand verwendet wird, der mit einer Markierung versehen ist, die quantitativ gemessen und leicht von den Markierungen auf den anderen zwei Liganden unterschieden werden kann und sich entweder an eine unterschiedliche Stelle auf dem interessierenden Analyten oder an einen unterschiedlichen Analyten spezifisch bindet. Alle drei Liganden stehen natürlich in einem vorbe­ stimmten Anteilsverhältnis zueinander, wobei die Liganden nicht immunologisch kreuzweise reaktiv sind. Die relativen nicht-spezifischen Bindungseigenschaften dieser drei Liganden im Bezug auf die Vorrichtung drücken sich in einer bekannten oder vorbestimmten Funktion oder Beziehung aus. Dieses System stellt dann drei Kanäle zur Verfügung, zwei spezifische und einen nicht-spezifischen, wobei aus diesen Kanälen die spezifischen Bindungseigenschaften der zwei sich spezifisch bindenden Liganden bestimmt werden können.

Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann vor­ teilhafterweise im Zusammenhang mit einem immunologischen Fluoreszenzen Testsystem beschrieben werden, das fluores­ zierende Markierungen verwendet, insbesondere mit einem Test, der Zellen mit gedämpfter Totalreflektion (ATR) ver­ wendet, aber selbstverständlich erstrecken sich die Prinzipien der Erfindung sich auch auf andere Arten von Tests die spezifische Bindungsreaktionen umfassen und andere Arten von nachweisbaren Markierungen verwenden.

Die Verwendung einer ATR-Zelle in Form einer Platte aus strahlungsdurchlässigem Material zum beobachten und messen von Fluorezenz, die an einer Zelloberfläche durch die Dämpfungswelle induziert ist und durch die Zelle im wesent­ lichen senkrecht zur Ebene der Zelloberfläche wandert, wurde zuerst von T. Hirschfeld im U.S.-Patent Nr. 36 04 927 vorge­ schlagen. Eine ausgeklügeltere immunologische ATR-Testvor­ richtung ist im Detail im U.S.-Patent Nr. 45 58 014 (erteilt am 10. Dezember 1985) dargestellt und beschrieben, und die Beschreibung und Funktionsweise einer solchen ATR-Zelle wird hier durch Bezugnahme aufgenommen. Ein klarer Vorteil wird dadurch erreicht, wenn solch eine ATR-Zelle bei der vor­ liegenden Erfindung verwendet wird, weil Fluoreszenzsignale, die mit solch einer Zelle nachgewiesen werden, ausschließ­ lich in der Dämpfungszone nahe der Reaktionsoberfläche der Zelle entstehen. Die Zelle trennt somit per se automatisch freie Liganden von denjenigen Liganden, die nicht-spezifisch an die Reaktionsoberfläche gebunden sind und die spezifisch in an der Reaktionsoberfläche gebildeten Komplexen gebunden sind.

Unter Bezugnahme auf die Zeichnung ist dort ein Querschnitt eines Fragments einer völlig nach innen reflektierenden Zelle 10 dargestellt. Eine bevorzugte Ausführungsform der Zelle 10 umfaßt einen zylindrischen Stab oder eine Faser 12, der (die) ein länglicher, im wesentlichen zylindrischer, optisch transparenter Körper ist, der so ausgelegt ist daß, optische Strahlung, die an einem Ende der Faser in einem feststehenden Winkel im wesentlichen drehsymmetrisch zur Längsachse der Faser eintritt, sich entlang seiner Länge durch mehrfache innere Totalreflexionen fortpflanzt. Beispielhaft kann Faser 12 aus irgendeinem aus einer Anzahl von optisch transparenten Materialien sein, wie etwa Glas, Quarz, Saphir, Polypropylen, Polyolefine, Nylon und der­ gleichen, mit einem größeren Brechungsindex als demjenigen der zu testenden flüssigen Probe. Wie im weiteren noch beschrieben wird, ist ein synthetisches Polymer insofern bevorzugt, als die Anbringung einer im weiteren beschriebenen Beschichtung darauf leichter durchgeführt werden kann als auf einem anorganischen Substrat, wie etwa Glas. Vorzugsweise ist die Faser 12 in einem Kapillarrohr 14 eingeschlossen, das aus einem Material gebildet ist, das relativ unlöslich und nicht-reaktiv gegenüber der zu testen­ den Flüssigkeit ist. Faser 12 durchläuft das Kapillarrohr 14 und wird darin typischerweise von einem Stopfen 16 koaxial gehalten, wodurch die Faser mit Ausnahme ihrer Endfläche 18 in ihrer Gesamtheit innerhalb des Rohr 14 angeordnet ist.

Auf einem Teil der Außenfläche von Faser 12 ist eine immo­ bilisierte oder vorgebundene Beschichtung 20 angeordnet, die zum Beispiel aus einem der Reaktanten einer immunartigen Reaktion gebildet sein kann, d.h. einer Komponente eines Antigen/Antikörper-Komplexes. Typischerweise kann die Be­ schichtung so aufgebracht werden, daß die Faseroberfläche oder das Substrat zunächst mit einer Vielzahl von Kopplungs­ stellen versehen wird und dann eine Anzahl der gewünschten Komponenten eines Antikörper/Antigen-Komplexes an diese Stellen gebunden werden kann, vorzugsweise kovalent und in bekannter Art und Weise. Die Kopplungsstellen auf dem Substrat, an denen die ausgewählten Komponenten des Anti­ gen/Antikörper-Komplexes zu Anfang immobilisiert werden, sind so ausgewählt, daß sie die erforderliche Immobili­ sierung zur Verfügung stellen, ohne die Affinität und die Avidität der Komponente gegenüber dem komplementären Teil des Komplexes nennenswert zu beinflussen. Für den Fall, daß Faser 12 aus Glas ist, können geeignete Befestigungsstellen, wie wohlbekannt ist, zum Beispiel dadurch zur Verfügung gestellt werden, daß eine Silylverbindung mit der Glasober­ fläche zur Reaktion gebracht wird. Kopplung anderer geeigneter Silylverbindungen und Verfahren, durch die Carboxyl-, Amino- und andere reaktive Gruppen von Antikörper oder Antigen kovalent an verschiedene anorganische Materialien gebunden werden können, sind bei Weetall im U.S.-Patent Nr. 36 52 761 beschrieben. Die Bindung an Polymere ist oft einfacher, und es gibt ausgiebige Literatur, welche die Immobilisierung von Antikörpern und Antigenen auf der Oberfläche von Polymeren beschreibt. Die Beschichtung 24 kann auch in einigen Fällen durch Adsorption aufgebracht werden, indem die Zelloberfläche mit einem geeigneten Reagenz, das eine geeignet ausgewählte Komponente enthält, einfach benetzt wird.

Zum Beispiel wäre die ausgewählte Komponente, die auf dem ATR-Substrat immobilisiert werden soll, für den wohlbe­ kannten Sandwich-Test, ein Ligand, der sich spezifisch an die interessierenden Analyten binden wird. Solch ein Ligand wird vorzugsweise in genügender Menge zur Verfügung ge­ stellt, um eine Anzahl von Reaktionsstellen zu liefern, die gegenüber der Anzahl der Analytmoleküle oder zu testenden Komponenten deutlich im Überschuß ist, so daß die Reaktions­ stellen anschließend nicht abgesättigt werden. Die be­ schichtete Zelle würde dann sowohl mit der Probe, welche den zu testenden Analyten enthalten kann, als auch mit dem Reagenz, das die zwei markierten Liganden enthält, in Kontakt gebracht. Man würde dann die Reaktanten für einen genügenden Zeitraum inkubieren lassen, um sicherzustellen, daß die Bindungsreaktionen im wesentlichen abgeschlossen sind. Signale, die von den markierten Liganden erhalten werden, die sich an den immobilisierten Analyten gebunden haben und sich nicht-spezifisch an andere Teile der Testvor­ richtung gebunden haben, werden dann gemessen. Das Signal, das vom zweiten gebundenen Liganden (d.h. demjenigen, der nicht in der Lage ist, sich spezifisch an den Analyten zu binden) gemessen wird, kann dann verwendet werden, um (durch ein Nomogramm, eine Tabelle oder eine Formel) vorherzusagen, welche Menge oder welcher Anteil des erhaltenen Signals aus dem ersten gebundenen Liganden von der spezifischen Bindung des letzteren an den Analyten stammt.

Im exemplarisch beschriebenen ATR-System ist eine Licht­ quelle 24 zum Liefern eines Lichtstrahls 22 zur Zelle 10 vorgesehen. Obgleich die Lichtquelle 24 eine Breitbandlicht­ quelle sein kann, wie etwa ein mit Licht von einer Glühlampe beleuchteter Kondensor, eine lichtemittierende Diode, Sonnen­ licht und dergleichen, ist es bevorzugt, daß die Lichtquelle 24 eine Dualquelle darstellt, die Anregungsstrahlung inner­ halb eines Paars enger Wellenlängenbänder liefert. Zu diesem Zweck kann sie geeignete Bandpaßfilter einschließen. Die Mittenwellenlängen der zwei Bänder werden in Übereinstimmung mit den Adsorptionseigenschaften der Fluorophore gewählt, die als Markierungen auf den markierten Liganden verwendet werden, um die letzteren bei Beleuchtung zur Fluoreszenz anzuregen. Lichtquelle 24 kann auch Strahlformungsmittel einschließen, wie diese von den Fachleuten auf diesem Gebiet verstanden werden, um eine Objektivlinse mit einem Strahl geeigneter Begrenzung zu beleuchten, um es der Linse 28 zu ermöglichen, die Lichtquellenblende auf die Endfläche 18 abzubilden, vorzugsweise mit keinem der Strahl, in einem größeren Winkel auf die Fläche 18 auftrifft als demjenigen, welcher der numerischen Apertur der Faser entspricht.

Mittel, wie etwa Strahlenteiler 30 werden zwischen Licht­ quelle 24 und Linse 28 angeordnet. Für eine bevorzugte Aus­ führungsform ist ein Strahlenteiler 30 so ausgebildet, daß dieser die zwei Anregungswellenlängenbänder reflektiert und die entsprechenden Fluoreszenzemissionen von Fläche 18 durchläßt.

Wenn die analythaltige Probe in den Zwischenraum 32 zwischen Faser 12 und Rohr 14 eingeführt ist, wird der Analyt mit dem immobilisierten Liganden in der Beschichtung 20 reagieren, vorausgesetzt, daß der Ligand so ausgewählt worden ist, daß er sich spezifisch an diesen Analyten bindet und etwas Analyt in der Probe vorhanden ist. Wenn man nun, um einen Sandwich-Test durchzuführen, die zwei unterschiedlich mar­ kierten unterschiedlichen Liganden in den Zwischenraum 32 einbringt, wird sich der erste markierte Ligand spezifisch sowohl mit dem freien Analyten und mit dem Analyten, der an die immobilisierten Liganden gebunden worden ist, binden. Der zweite markierte Ligand wird sich nicht spezifisch an den Analyten binden, sondern von ihm kann man erwarten, daß er sich nicht-spezifisch an die Oberfläche der Faser bindet, wie dies ein Teil des ersten markierten Liganden auch tun wird.

Beim Einführen eines Lichtstrahls aus Lichtquelle 24 in einem geeigneten Winkel in Fläche 18 von Faser 12 wird sich der Strahl durch innere Totalreflexion durch die Faser hin­ durch fortpflanzen, wobei er eine Dämpfungwelle in einer Dämpfungszone (nicht gezeigt) erzeugt, die benachbart zur Faseroberfläche verläuft. Die Dämpfungswelle, wird die Markierungen dort, wo sie auf solche gebundenen Liganden auftrifft, zum Fluoreszieren in zwei unterschiedlichen Wellenlängen oder in zwei unterschiedlichen Kanälen veran­ lassen, und ein großer Teil dieser Fluoreszenz wird in das Medium von Faser 12 zurückgerichtet oder -getunnelt werden, ein Teil bei oder oberhalb des kritischen Winkels und ein Teil unterhalb des kritischen Winkels. In die Zelle zurück­ gerichtetes Licht bei oder oberhalb des kritischen Winkels wird durch die Faser 12 hindurch fortgepflanzt, wobei ein Teil aus der Einlaßfläche 18 austritt.

Messung der entsprechenden Amplituden der zwei unterschied­ lichen Wellenlängen von Fluoreszenzlicht, das aus Fläche 18 austritt, durch elektro-optische Nachweismittel 34 wird das entsprechende quantitative Vorhandensein der gebundenen Liganden anzeigen. Zu diesem Zweck können die Mittel 34 zwei elektro-optische Detektoren umfassen, die jeweils gegenüber den entsprechenden Wellenlängen ansprechen. Alternativ dazu kann man anstelle von Lichtquelle 24 und Nachweismitteln 34 ein Fluorimeter mit umschaltbarer Anregung und zur Anregung und zum Emissionsnachweis aus den jeweiligen Markierungen entsprechend passenden Emissionsfiltern verwenden. Solche Messungen der Amplituden der Signale von Markierungen können dann zusammen mit den anderen vorbestimmten Informationen, im Hinblick auf die Werte von R₁ und R₂ in Mittel 36 einge­ geben werden, wie etwa in einen in geeigneter Weise pro­ grammierten digitalen Computer oder eine passende festver­ drahtete Schaltung, um die erwünschte Bestimmung, wie oben beschrieben, des Ausmaßes der erreichten spezifischen Bindung vorzunehmen.

Die Brauchbarkeit eines Multiplex-Systems für die Bestimmung nicht-spezifischer Bindung in Gegenwart von spezifischer Bindung wurde in einem Testsystem gezeigt, daß im folgenden detaillierten Beispiel exemplarisch dargestellt werden soll. Das Testreagenz wurde von Ziegen-anti-Rinder-IgG (als dem ersten Liganden, von dem man erwartet, daß er sich spezi­ fisch an Rinder-IgG bindet), markiert mit Fluorescein in bekannter Weise, und aus Ziegen-anti-Maus-IgG (als dem zweiten Liganden), markiert mit Rhodamin in bekannter Weise, gebildet. Die ATR-Zelle, eine polystyrolbeschichtete Quarz­ faser wurde zumindest in einer Reaktionszone auf ihrer Ober­ fläche mit Rinder-IgG beschichtet. Diese Reagenzien wurden von der Jackson Immunological Corporation erhalten, und die Antikörper waren vom Lieferanten auf kreuzweise Reaktivität vorgescreent.

Eine vorläufige Bestimmung der nicht-spezifischen Bindung beider Antikörper wurde zunächst bezüglich einer Anzahl im wesentlichen identischer nackter polystyrolbeschichteter Quarzfasern durchgeführt, indem man letzteren zunächst in phosphatgepufferter Kochsalzlösung(PBS) (pH 7,4), erhalten von Sigma Chemical, inkubierte. Nach der Inkubation wurde jede der Fasern in einer Durchflußzelle in einem ATR-Fluori­ meter angebracht, der ein Paar Detektorkanäle aufwies, die jeweils auf die Hauptwellenlängen von Fluorescein beziehungsweise Rhodamin (530 nm und 580 nm) ansprachen. Eine bevorzugte Ausführungsform verwendete ein Fluorimeter mit umschaltbarer Anregung und zur Anregung und zum Fluores­ cenznachweis von Floureszein und Rhodamin entsprechend ge­ eignete Emissionsfilter, d.h. Anregungsfilter 480/20 (480 nm Mittenwellenlänge, 20 nm Durchlaßbereich) für Fluorescein und 530/30 für Rhodamin; Fluoreszenzfilter von 530/30 für Fluorescein und 580/20 für Rhodamin.

Jede Faser wurde 2 Minuten in fließender PBS gewaschen. Der Durchfluß wurde gestoppt, Anregungslicht (480 und 530 nm in Sequenz) festgelegter Intensität wurde an einem Ende in die Faser eingeführt und Hintergrundablesungen (in mV) wurden für jeden der zwei Kanäle aufgezeichnet, eine Ablesung für den Hintergrund im Fluorescein-Nachweiskanal und eine im Rhodamin-Nachweiskanal. Dann ließ man die PBS aus der Durch­ flußzelle ausströmen und ersetzte sie durch einen Strom einer Lösung gleicher Volumenteile von 7,5 µg/ml rhodamin­ markiertem anti-Maus-IgG und 7,0 µg/ml fluorescein­ markiertem anti-Rinder-IgG. Der Durchfluß wurde gestoppt, und man ließ die Faser für zwei Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Die Antikörperlösung wurde dann in einem Strom von PBS vier Minuten ausgewaschen. Dasselbe Anregungslicht wurde wieder in die Faser eingeführt, und Ablesungen (in mV), welche die Summe der entsprechenden Hintergründe und der nicht-spezifischen Bindung repräsentierten, wurden vorgenommen um Werte für A_f und A_r für die Flourescein- beziehungsweise Rhodaminkanäle für vier solcher Fasern zu erhalten.

Die Daten sind in der folgenden Tabelle A zusammengefaßt in der A_f und A_r jeweils die Amplitude in mV der Signale sind, die vom gebundenen fluorescein- und rhodaminmarkierten IgG erhalten wurden. Vor- und Nach-ink. bezieht sich auf Signale, die entsprechend vor Inkubation und nach Inkubation und Waschen gemessen wurden. Die Bindungsantwort ist einfach die Differenz zwischen den entsprechenden Vor-Ink.- und Nach-Ink.-Signalen, und das Bindungsverhältnis ist das Verhältnis der Bindungsantworten.

Tabelle A

Es ist anzumerken, daß das mittlere Bindungsverhältnis 1,215 mit einer Standardabweichung von 0,070 und einem C.V. von 5,798% betrug. Die mittlere NSB-Reaktion für A_f betrug 521 mV mit einer Standardabweichung von 172,5 mV (C.V. 33%), was tatsächlich an Maß für das Rauschen bei einem Nullanalyt Pegel ist.

Die vorstehenden Reaktionen wurden natürlich von Oberflächen erzeugt, die keinerlei Antigen aufwiesen. Man wird jedoch einschätzen können, daß man eine ähnliche Meßreihe auf einer Faser durchführen kann, die mit einem Protein oder irgend­ einem anderen Blockierungsmittel, das nicht von irgendeinem der Antikörper spezifisch gebunden wird, blockiert ist. Die Verwendung derartiger Blocker sollte dazu dienen, mögliche ungewollte Effekte aufgrund von Differenzen in den nicht­ spezifischen Bindungseigenschaften der Antikörper im Hin­ blick auf blockierte beziehungsweise nackte Fasern zu ver­ ringern.

Die selbe Antikörpermischung wurde dann mit fünf identischen Fasern, wie zuvor verwendet, zur Reaktion gebracht. Man folgte dabei derselben Vorgehensweise, wie beschrieben, mit der Ausnahme, daß die Fasern durch Inkubation für fünf Minuten in 0,5 µg/ml Rinder-IgG statt durch Inkubation in PBS vorbereitet wurden. Die Ergebnisse des Beispiels sind in Tabelle B dargestellt.

Tabelle B

Aus diesen letzteren Daten kann bestimmt werden, daß die spezifische Reaktion, die vom fluoresceinmarkierten IgG geliefert wird, die gesamte mittlere A_f-Bindungsreaktion minus 1,215 (das aus Tabelle A ermittelte vorbestimmte Bindungsverhältnis) Mal den mittleren A_r betrug. Dies lieferte eine mittlere Bindungsreaktion von 146,2 mV mit einer Standardabweichung von 102 mV.

Die herkömmliche Methode der Datenanalyse aus dem Stand der Technik besteht darin, den mittleren A_f-Wert aus Tabelle B zu nehmen und davon den mittleren A_f-Wert abzuziehen, der nur auf die nicht-spezifische Bindung zurückgeht, darge­ stellt als mittlerer A_f in Tabelle A. Unter Befolgung dieser Methode beträgt die mittlere spezifische Bindungs­ reaktion 284,6 mV und die Standardabweichung beträgt 284,3 mV. Eine passende Vergleichsmethode aus dem Stand der Technik und die Methode nach der vorliegenden Erfindung besteht darin, das mittlere Signal/Rauschen-Verhältnis (S/N) beim verwendeten Analytgehalt zu bestimmen. Nach der Methode aus dem Stand der Technik ist S/N dann 284,6/284,3 oder 1,00, wohingegen die Methode der vorliegenden Erfindung ein S/N von 146,2/102 oder 1,43 ergibt. Dies stellt eine Ver­ besserung in S/N von etwa 1,5 bei dem gewählten Analytgehalt dar und eine Verringerung im Rauschen um einen Faktor von 2,5 in der Nullanalytantwort.

Ein anderes Beispiel einer Multiplex-Vorrichtung der vor­ liegenden Erfindung, die verwendet wird, um NSB zu bestimmen, kann aus dem folgenden ersehen werden. Es ist bekannt, daß ein Virus die Bildung von mehr als einer Art von Antikörper auslösen kann, z.B. zwei unterschiedliche Antikörper, die entsprechend gegenüber der Hülle und dem Kern des Virus spezifisch sind. Für diagnostische Zecke kann man wünschen, eine Probe, zum Beispiel aus Blut, zu testen, von der man vermutet, daß sie die Antikörper gegenüber einer spezifischen Art eines solchen Virus enthält.

Folglich kann man Lysat von diesem Virus zum Beispiel als eine Beschichtung auf der Oberfläche einer optischen Faser, aufgebracht durch Adsorption, immobilisieren. Diese beschichtete Faser wird dann mit der Probe in Kontakt ge­ bracht, wodurch durch spezifische Bindung der Lysatfragmente von Kern und Hülle mit irgendwelchen entsprechenden passenden Antikörpern, die in der Probe vorhanden sein können, Komplexe gebildet werden. Ein Reagenz wird herge­ stellt, das ein bekanntes Verhältnis an einem ersten und einem zweiten synthetischen oder natürlichen Protein ent­ hält, die jeweils zu den Hüllen- und Kernproteinen des Virus passen und jeweils mit fluoreszierenden Markierungen, wie etwa Fluorescein und Rhodamin, in bekannter Weise markiert sind. Das Reagenz wird mit der Probe und der beschichteten Faser vermischt, so daß die Proteine in diesem Reagenz sich ebenfalls spezifisch an die vorher an die Lysatbeschichtung gebundenen Antikörper und nicht-spezifisch irgendwo an der Faser binden können.

Das spezifische Bindungsverhältnis der zwei Proteine wird durch das Verhältnis der Bindungsstellen festgelegt, die durch die relativen Mengen der zwei in der Probe vorhandenen und an die Beschichtung gebundenen Antikörper geliefert werden. Wenn man a priori das Verhältnis solcher Bindungs­ stellen kennt, wird das Reagenz mit einem Proteinverhältnis hergestellt, das deutlich verschieden von dem Verhältnis der Bindungsstellen ist.

Die markierten Proteine, die an die Faser gebunden sind, werden nunmehr getrennt und im wesentlichen gleichzeitig in der erfindungsgemäßen Vorrichtung zu Fluoreszenz angeregt, was Signale liefert, die durch eine Kombination spezifischer und nicht-spezifischer Bindung der markierten Proteine er­ zeugt werden. Es ist jedoch offensichtlich, daß das Verhält­ nis der entsprechenden Signale, die von den Markierungen auf den Proteinen erzeugt werden, die spezifisch gebunden sind, mit dem Verhältnis der Bindungsstellen übereinstimmt, aber das Verhältnis der Signale, die von markierten Proteinen erzeugt werden, die nicht-spezifisch gebunden sind, wird mit dem bekannten Verhältnis übereinstimmen, in dem die entsprechenden Proteine im Reagenz zugeführt werden. Wo das Verhältnis von Bindungsstellen oder Antikörpern ebenfalls bekannt ist, können dann, weil die zwei Verhältnisse beträchtlich voneinander abweichen (wobei dies unter der Kontrolle des Herstellers des Reagenzes steht), die Amplituden der entsprechenden Signale passend eingestellt werden, um den Effekt der nicht-spezifischen Bindung zu beseitigen.

Wenn man a priori keine Kenntnis vom Verhältnis der Bindungsstellen hat, d.h. vom Verhältnis der Antikörper kann man einen Vortest unter Verwendung eines anderen Reagenzes durchführen, in dem die Proteine in einem ersten Verhältnis, z.B. einheitlich, vorliegen. Unter Verwendung der Ergebnisse dieses Tests wird dann ein zweiter Test mit einem zweiten Reagenz durchgeführt, in dem das Verhältnis der Proteine zum Beispiel als das Inverse der Messung der Signale im ersten Test eingestellt worden ist. Die Messung der Signale im zweiten Test liefert genügend Information, aus der heraus man Berechnungen anstellen kann, durch die die Effekte der nicht-spezifischen Bindung ausgesondert werden können.

Die in der vorstehenden Beschreibung, in der Zeichnung sowie in den Ansprüchen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Aus­ führungsformen wesentlich sein.

Claims (16)

1. Verfahren zum Testen auf einen interessierenden Analyten in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens zwei verschiedene Liganden bereitgestellt werden, die mit ent­ sprechenden unterschiedlichen Markierungen gekoppelt ist, die voneinander unterscheidbar sind, wobei wenigstens ein erster der Liganden in der Lage ist, sich spezifisch an den Analyten zu binden; daß die Liganden und die Probe in Kontakt gebracht werden, um einen Körper zu bilden, der einen Komplex einschließt, welcher wenigstens den ersten Liganden und den Analyten umfaßt; daß gleichzeitig quantitativ und getrennt der Teil jeder Markierung gemessen wird, der ausschließlich an gebundene Liganden in besagtem Körper gekoppelt ist; und daß die Messungen der Markierungen verglichen werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Vorrichtung zur Verfügung gestellt wird, in der besagter Test durchgeführt werden soll; daß die zwei unter­ schiedlich markierten unterschiedlichen Liganden in einem vorbestimmten Anteilsverhältnis zueinander bereitgestellt werden, wobei jeder Ligand unterschiedliche spezifische Bindungseigenschaften in Bezug auf den interessierenden Analyten aufweist und die nicht-spezifischen Bindungseigen­ schaften der Liganden im Bezug auf die Vorrichtung in einer bestimmten Korrelation zueinander stehen; daß die Liganden mit der Probe in der Vorrichtung in Kontakt gebracht werden, um die spezifische Bindung zu bewirken und den Komplex zu bilden; und daß die spezifische Bindung des ersten Liganden in Bezug auf den Analyten aus dem Vergleich der Messungen, des bekannten Anteilsverhältnisses und der bekannten Korre­ lation bestimmt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß, nachdem die Liganden mit der Probe in Kontakt gebracht worden sind, im wesentlichen die Gesamtheit des Analyten und der Liganden von denjenigen Liganden, die an den Analyten und an die Vorrichtung gebunden sind, abgetrennt werden.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch ge­ kennzeichnet, daß jede unterschiedliche Markierung, wenn sie angeregt wird, entsprechend voneinander unterscheidbare Signale liefern kann und daß die Messungen die Amplitude der Signale von im wesentlichen ausschließlich gebundenen Liganden betreffen.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die unterschiedlichen Markierungen, wenn sie angeregt werden, Fluoreszenzstrahlung bei Wellenlängen liefern, die voneinander abweichen.

6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der zweite Ligand sich nicht spezifisch an den Analyten oder andere Komponenten in der Probe bindet.

7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der erste Ligand im Überschuß gegenüber der Menge zur Verfügung gestellt wird, von der man erwartet, daß sie sich spezifisch mit dem Analyten in der Probe bindet.

8. Verfahren nach Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die bekannte Korrelation dadurch bestimmt wird, daß vorbereitend die Liganden in der Vorrichtung in Abwesenheit des Analyten getestet werden, um quantitativ die Amplituden der ent­ sprechenden Signale von den markierten Liganden zu messen, die während des Vorbereitungstests nicht-spezifisch gebunden werden; und daß das Verhältnis der gemessenen Signal­ amplituden vom ersten und vom zweiten Liganden bestimmt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Bestimmungsschritt so durchgeführt wird, daß gemäß einer Funktion des bekannten Anteilsverhältnisses und des bekannten Verhältnisses der Wert des Signals vom zweiten Liganden modifiziert wird, um dadurch einen modifizierten Wert zu erhalten, und daß die Amplitude des Signals vom ersten Liganden mit diesem modifizierten Wert verglichen wird.

10. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Bestimmungsschritt so durchgeführt wird, daß von der Amplitude des Signals vom ersten Liganden das Produkt des bekannten Verhältnisses mal den bekannten Anteilsverhältnis mal der Amplitude des Signals aus dem zweiten Liganden sub­ trahiert wird.

11. Vorrichtung zum Testen einer Lösung auf einen interessierenden Analyten, gekennzeichnet durch wenigstens zwei unterschiedlich markierte Liganden, die jeder unter­ schiedlich mit entsprechenden Markierungen markiert sind, wobei das Vorhandensein der Markierungen quantitativ be­ stimmt werden kann und wenigstens ein erster Ligand in der Lage ist, sich spezifisch an den Analyten zu binden; eine Reaktionsoberfläche, an der wenigstens der erste Ligand einen spezifisch gebundenen Komplex mit dem Analyten bilden kann; und Mittel zum gleichzeitigen quantitativen und ge­ trennten Messen des Teils jeder Markierung, der an die Ober­ fläche gebunden sein kann.

12. Vorrichtung nach Anspruch 11 dadurch gekennzeichnet, daß der erste Ligand auf besagter Reaktionsoberfläche immobilisiert ist.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionsoberfläche eine Oberfläche einer Zelle mit gedämpfter Totalreflexion ist.

14. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 13, gekenn­ zeichnet durch Mittel zum Einführen von Strahlung in besagte Zelle bei Wellenlängen, die in der Lage sind, beide Markierungen zum Aussenden entsprechender unterschiedlicher Signale anzuregen.

15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel zum gleichzeitigen quantitativen und getrennten Messen ein Paar Detektoren um­ fassen, die jeweils auf eines der entsprechenden unter­ schiedlichen Signale ansprechen.

16. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel zum gleichzeitigen quantitativen und getrennten Messen ein Fluorimeter mit um­ schaltbarer Anregung und entsprechend zur Anregung und zum Emissionsnachweis der Markierungen geeignete Emissionsfilter umfassen.