DE3927061A1 - Uricase-codierende dna-sequenzen und verfahren zur herstellung von uricase - Google Patents
Uricase-codierende dna-sequenzen und verfahren zur herstellung von uricaseInfo
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Description
Die Erfindung betrifft DNA-Sequenzen, die ein Protein mit
der biologischen Aktivität von Uricase codieren. Ferner betrifft
die Erfindung rekombinante Plasmide, die die genannten
DNA-Sequenzen enthalten, Transformanten, die die genannten
rekombinanten Plasmide enthalten, und gentechnologische
Verfahren zur Herstellung von Uricase.
Uricase (EC 1, 7, 3, 3) ist ein Enzym, das die hydrolytische
Umsetzung von Harnsäure in Allantoin, Wasserstoffperoxid und
Kohlendioxid katalysiert. Es wird beim Nachweis von Harnsäure
in Blut oder Urin verwendet.
Bisher wurde Uricase durch Züchtung eines Uricase-bildenden
Mikroorganismus in einem Kulturmedium, beispielsweise von
Mikroorganismen der Gattung Candida in Gegenwart von Harnsäure,
und Isolierung der Uricase aus dem Kulturmedium hergestellt;
vgl. JP-PS 5 192/1 967. Dieses Verfahren weist jedoch
den Nachteil auf, daß das Enzym nur mit niedriger Ausbeute
erhalten wird.
Somit liegt der Erfindung das technische Problem zugrunde,
ein Verfahren zur kostengünstigen Herstellung von Uricase in
hohen Ausbeuten und die darin zu verwendenden Werkzeuge bereitzustellen.
Die Lösung des der Erfindung zugrunde liegenden technischen
Problems wird durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen
gekennzeichneten Ausführungsformen erzielt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung wird somit DNA-Sequenzen,
die ein Uricase-codierendes Gen enthalten.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ferner DNA-Sequenzen
aus Bacillus sp. TB-90 (FERM BP-795, JP-A 61-2 80 272),
die eine Uricase mit der folgenden Aminosäure-Sequenz
codieren:
Der vorstehend genannte Stamm von Bacillis sp. bildet eine
Temperatur-beständige Uricase und wurde von den Erfindern
aus der Natur isoliert. Er ist bei der bezeichneten japanischen
Hinterlegungsstelle nach den Vorschriften des Budapester
Vertrages hinterlegt.
Ein rekombinantes Plasmid, das die vorstehend genannte DNA-Sequenz
enthält, ist erhältlich durch Herstellung einer
Genbank mit der chromosomalen DNA von Bacillus sp. TB-90,
Absuchen der Genbank mit Kaninchen-anti-Uricase-Antikörpern,
Isolierung eines rekombinanten Phagen, der die bezeichnete
DNA-Sequenz enthält, Isolierung eines DNA-Fragments aus dem
Phagen, der die bezeichnete DNA-Sequenz enthält, und Einbau
des genannten DNA-Fragments in ein Plasmid.
Bekannterweise werden Aminosäuren in der Regel von mehr als
einem Codon codiert. Dies wird als "Degeneration des genetischen
Codes" bezeichnet. Gegenstand der vorliegenden Erfindung
sind somit auch alle durch die Degeneration des genetischen
Codes verwendeten DNA-Sequenzen, die eine Uricase mit
der vorstehend angegebenen Aminosäure-Sequenz codieren. Da
diese DNA-Sequenzen auch synthetischer Herkunft sein können,
ist die vorliegende Erfindung nicht auf natürlich vorkommende
DNA-Sequenzen beschränkt.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße
DNA-Sequenz die folgende:
Die vorstehend genannte DNA-Sequenz kann aus Bacillus sp.
TB-90 (FERM BP-795) wie vorstehend angegeben erhalten werden.
Die Erfindung betrifft ferner DNA-Sequenzen, die unter üblichen
Bedingungen mit einer der vorstehend genannten DNA-Sequenzen
hybridisieren und ein Protein mit der biologischen
Aktivität von Uricase codieren. Übliche Hybridisierungsbedingungen
sind solche, bei denen der T m -Wert zwischen etwa
T m -20 und T m -27 liegt. Stringente Hybridisierungsbedingungen
werden bevorzugt.
Durch DNA-Rekombinationsverfahren lassen sich beliebige
künstliche Variationen an bestimmten Stellen einer Ausgangs-DNA-Sequenz
einführen, ohne dabei die grundsätzlichen Eigenschaften
des von der DNA-Sequenz codierten Proteins zu verändern.
Andererseits können solche Variationen eingefügt
werden, um die Eigenschaften des codierten Proteins zu verbessern.
Somit betrifft die Erfindung auch Modifikationen
der vorstehend genannten DNA-Sequenzen, die künstliche Insertionen,
Deletionen oder Substitutionen aufweisen und somit
Gene repräsentieren, die zum natürlich vorkommenden Gen
äquivalente oder sogar verbesserte Eigenschaften besitzen.
DNA-Sequenzen, die wie angegeben unter üblichen Bedingungen
mit einer der vorstehend genannten DNA-Sequenzen hybridisieren,
können in üblicher Weise nicht nur aus Bacillus sp. TB-90,
sondern auch aus anderen Mikroorganismen isoliert werden.
Erfindungsgemäß lassen sich die bezeichneten DNA-Sequenzen
durch DNA-Rekombinations-Verfahren isolieren. Auf diese
Weise lassen sich auch DNA-Sequenzen isolieren, die eine
Uricase codieren, die stabiler ist als die bisher hergestellte
Uricase.
In einer erfindungsgemäß bevorzugten Ausführungsform stammen
die vorstehend bezeichneten DNA-Sequenzen aus einem Mikroorganismus.
In einer weiteren erfindungsgemäß bevorzugten Ausführungsform
weisen die vorstehend genannten DNA-Sequenzen die mit
ihnen natürlicherweise assoziierten regulatorischen Elemente
der 5′-Flanke und 3′-Flanke auf.
Ferner betrifft die Erfindung rekombinante Plasmide, die die
vorstehend genannten DNA-Sequenzen enthalten.
Expressionsvektoren, mit denen die Bacillus sp. TB-90-Uricase
in Escherichia coli-Zellen hergestellt werden kann,
können durch Ligierung des Bacillus sp. TB-90-Uricase-Gens
mit einem für E. coli geeigneten Expressionsvektor hergestellt
werden. Beispiele solcher Expressionsvektoren sind
pUC18 (Toyobo), der den lac-Promotor enthält, pKK223-3
(Pharmacia), der einen wirkungsvollen E. coli-Promotor enthält,
nämlich den natürlichen trp-Promotor und den Terminator
der ribosomalen rrnB-RNA, pDR720 (Pharmacia), der den
tac-Promotor enthält, oder der induzierbare pPL-lambda-Expressionsvektor
(Pharmacia). Ferner betrifft die Erfindung
rekombinante Plasmide, mit denen die Bacillus sp. TB-90-Uricase
in Bacillus subtilis-Zellen oder im entsprechenden Kulturmedium
hergestellt werden kann. Dazu wird eine der vorstehend
bezeichneten DNA-Sequenzen beispielsweise mit dem
Shuttle-Vektor pHY300PLK (Toyobo) (geeignet für Bacillus
subtilis oder Escherichia coli) oder mit dem Plasmid-Vektor
pUB110 (J. Bacteriol. 134 (1978), 318-329) ligiert.
Die Erfindung betrifft außerdem Transformanten, die mindestens
eines der vorstehenden rekombinanten Plasmide enthalten.
Transformanten, die Uricase intrazellulär oder extrazellulär
bilden können, lassen sich durch Einführen der vorstehend
beschriebenen rekombinanten Plasmide in Mikroorganismen,
vorzugsweise in Wirtszellen, wie Escherichia coli oder Bacillus
subtilis, herstellen.
Außerdem sind nicht nur Escherichia coli- oder Bacillus subtilis-Wirts/Vektor-Systeme
verfügbar, sondern auch Saccharomyces sp.-
Pseudomonas sp.- oder Streptomyces sp.-Wirts/Vektor-Systeme.
Erfindungsgemäß wird somit die Herstellung
von Uricase unter Berücksichtigung der jeweiligen Vorteile
der genannten Wirts/Vektor-Systeme durchgeführt.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße
Transformante ein transformierter Mikroorganismus, der
zur Art Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces sp.,
Pseudomonas sp. oder Streptomyces sp. gehört und mindestens
eines der vorstehend erläuterten Plasmide enthält,
das oder die für die Transformante heterologe DNA-Sequenzen
enthalten, die ebenfalls vorstehend beschrieben wurden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße
Transformante ein Mikroorganismus, der zur Art
Escherichia coli oder Bacillus subtilis gehört.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße
Transformante der Mikroorganismus E. coli
JM109 (pUOD316), E. coli JM109 (pKU1), Bacillus subtilis
ISW1214 (pEB2) oder eine Variante dieser Mikroorganismen.
Diese Mikroorganismen sind beim "Fermentation Research
Institute, Agency of Industrial Science and Technology,
Ministry of International Trade and Industry" unter den Hinterlegungsnummern
FERM BP-1979, FERM BP-1980 bzw. FERM BP-1981
nach den Vorschriften des Budapester Vertrages hinterlegt
worden.
Schließlich betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung
von Uricase, bei dem man eine der erfindungsgemäßen
Transformanten in einem Medium unter zur Expression der Uricase-codierenden
DNA-Sequenz geeigneten Bedingungen züchtet
und die bei der Expression der DNA-Sequenz anfallende Uricase
aus der Kultur isoliert. Beispielsweise läßt sich Uricase
in einem solchen Verfahren in guter Ausbeute durch
Zugabe des Induktors Isopropylthiogalaktosid (IPTG) in einem
frühen Stadium der Züchtung der Transformante herstellen.
Nach der Züchtung der Transformante läßt sich die Uricase
beispielsweise durch Behandlung der Zellen mit Lysozym oder
durch Lysieren der Zellen durch eine Ultraschallbehandlung,
oder durch Extraktion, Trennung und Reinigung des Kulturmediums
isolieren.
Die Figuren zeigen
Fig. 1 zeigt die Uricase-codierende DNA-Sequenz aus Bacillus sp.
TB-90 und die entsprechende Aminosäure-Sequenz.
Fig. 2 zeigt die Konstruktion der Expressionsplasmide
pUOD316 und pKU1 aus dem rekombinanten E. coli-Plasmid
pUOD31, das eine Uricase-codierende DNA-Sequenz
aus Bacillus sp. TB-90 enthält. Die schwarzen
und weißen Kästchen stellen ein das Uricase-Gen
enthaltendes DNA-Fragment bzw. den Bereich des lac-
oder trp-Promotors dar. Der Begriff "Ligierung" bedeutet
eine Ligierungsreaktion von DNA-Fragmenten
mit T4 DNA-Ligase.
Fig. 3 zeigt die Konstruktion des rekombinanten Bacillus
subtilis-Plasmids pEB2, das eine Uricase-codierende
DNA-Sequenz aus Bacillus sp. TB-90 enthält. Die
schwarzen und weißen Kästchen und der Begriff "Ligierung"
haben dieselbe Bedeutung wie in Fig. 2.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Zur Herstellung von Kaninchen-anti-Uricase-Antikörpern (Antiseren)
wurde ein Kaninchen mit durch Extraktion und Reinigung
eines Kulturmediums von Bacillus sp. TB-90 (FERM BP-795)
erhaltener Uricase immunisiert. Der Titer des Antiserums
betrug 10² bis 10³, gemessen nach dem ELISA-Verfahren,
bzw. Faktor 16, gemessen nach dem Ouchterlony-Verfahren. Sodann
wurde das Antiserum gereinigt. Dabei wurden 10 ml Antiserum
einer Säulenchromatographie mit Protein A-Sepharose (4 ml)
unterworfen. Es wurden 8,9 ml anti-Uricase-Antikörper
vom Typ IgG erhalten.
Bacillus sp. TB-90 wurde in Fleischbrühe-Medium (flüssiges
Medium (pH 7,2), 5 g Fleischextrakt, 10 g Pepton und 5 g
NaCl auf ein Gesamtvolumen von 1 Liter) gezüchtet. Sodann
wurde chromosomale DNA aus 2,5 g der Zellen isoliert; vgl.
R. H. Doi, "Recombinant Techniques", Herausgeber Rodriquez et al.,
Addison-Wesley Publishing Company, 1983, Seite 162 oder
J. Koizumi et al., Biotech. Bioeng. 27 (1985), Seiten 721-728.
Dabei wurden 900 µg gereinigte chromosomale DNA erhalten
(OD₂₆₀/OD280 = etwa 1,8). Sodann wurde die erhaltene chromosomale
DNA mit dem Restriktionsenzym Sau3AI in üblicher
Weise partiell gespalten und einer Dichtegradienten-Zentrifugation
(5 bis 20% Saccharose) unterzogen, wobei DNA-Fraktionen
mit 2 bis 20 kb erhalten wurden.
1 µg Arme des λ-Phagen-Clonierungsvektors EMBL3 (Toyobo)
wurden mit 0,4 µg der vorstehend erhaltenen, mit Sau3AI partiell
gespaltenen chromosomalen DNA vermischt, mit 1 Einheit
T4 DNA-Ligase (Toyobo) ligiert und mit einem in vitro-"Packaging-kit"
(Gigapack Gold, Toyobo) verpackt. Mit den
erhaltenen Phagen wurde E. coli Q 359 (Toyobo) infiziert und
so ausplattiert, daß 2000 Plaques pro Platte erhalten wurden.
Das in Schritt 1 erhaltene, gereinigte IgG wurde mit Meerrettich-Peroxidase
(HRPO) vermischt, um ein IgG-HRPO-Konjugat
zu erhalten. Mit diesem Konjugat wurde unter Verwendung
eines Gen-Expressions-Kit (Boehringer Mannheim) ein Clon mit
einem Uricase-Gen isoliert. Die Nachweisempfindlichkeit betrug
dabei 100 pg DNA. Beim Absuchen der Phagen-Genbank ergaben
positive Clone eine blaugrüne Farbe. Es wurden stark
gefärbte Clone selektiert und die entsprechenden Phagen
gereinigt, bis bei einer Infektion alle Plaques gefärbt waren.
Somit wurden die Phagen 1 und 3 isoliert. Mit diesen
Phagen wurde E. coli Q359 infiziert und der Überstand des
jeweiligen Kulturmediums wurde auf Uricase-Aktivität geprüft.
Es wurden 7 mU/ml bzw. 9 mU/ml erhalten.
Aus den vorstehend erhaltenen positiven Clonen 1 und 3 wurde
in üblicher Weise Phagen-DNA isoliert; vgl. "Molecular Cloning",
Herausgeber Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory,
U.S.A, 1982, Seite 85. Sodann wurden die Phagen-DNA's
mit den Restriktionsenzymen BamHI und SalI gespalten
und einer Elektrophorese in einem 0,8%igen Agarosegel unterzogen.
Die Analyse ergab, daß in den Phagen 1 und 3 ein
18 kb bzw. ein 15 kb SalI-DNA-Fragment inseriert ist.
Außerdem wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI, SphI und
KpnI eine Restriktionskarte der in die Phagen 1 und 3 inserierten
DNA erstellt. Sodann wurde DNA des Phagen 1 mit dem
Restriktionsenzym SalI gespalten und das inserierte 18 kb
DNA-Fragment aus einem Agarosegel extrahiert (Yoshiyuki
Sakaki, "Vektor DNA", Kohdansha, Seite 67). In einer Hybridisierungsanalyse
nach Southern mit dem 18 kb Fragment als
Sondenmolekül (J. Mol. Biol., 98 (1975), Seiten 503-517)
wurde gezeigt, daß das 18 kb DNA-Fragment des Phagen 1 nicht
nur mit dem 15 kb DNA-Fragment des Phagen 3, sondern auch mit
chromosomaler DNA von Bacillus sp. TB-90 hybridisiert. Daraus
folgte, daß die DNA der eine Uricase-Aktivität induzierenden
Phagen 1 und 3 einen gemeinsamen Bereich enthält, und
weiter, daß in die DNA der beiden Phagen ein von der chromosomalen
DNA von Bacillus sp. TB-90 abgeleitetes DNA-Fragment
inseriert ist.
Sodann wurde aus DNA des Phagen 3 nach dem vorstehend beschriebenen
Verfahren das 15 kb DNA-Fragment isoliert, mit
SalI-gespaltenem Plasmid-Vektor pUC18 ligiert und subcloniert.
Auf diese Weise konnte die Lage des Uricase-Gens in
der Insertion des Phagen 3 ermittelt und einem 4,8 kb BamHI-SphI-Fragment
zugeordnet werden, das im Plasmid pUOD31 enthalten
ist. Die Restriktionskarte dieses Plasmids ist in
Fig. 2 oben in der Mitte abgebildet.
Sodann wurde die DNA-Sequenz des Uricase-Gens ermittelt.
Dazu wurde das vorstehend genannte DNA-Fragment mit verschiedenen
Restriktionsenzymen gespalten und in die Vektoren
pUC18 und 19 subcloniert. Danach wurden Plasmid-DNA's nach
Birnboim und Doly hergestellt; vgl. Nucleic Acids Res. 7
(1979), Seiten 1513-1523. Die so erhaltene DNA wurde in 18 µl
TE-Puffer (10 mM Tris-Salzsäure, pH 7,4, 1 mM EDTA) suspendiert,
mit 2 µl 2 N NaOH vermischt, 5 Minuten bei Raumtemperatur
stehengelassen, mit 8 µl 5 M Ammoniumacetat gemischt
und zur Äthanolfällung mit 100 µl kaltem Äthanol vermischt.
Die DNA-Sequenz der Insertionen der so erhaltenen Plasmid-DNAs
wurde mit einem M13-Sequenzierungs-Kit (Toyobo) und α³²P dCTP
(400 Ci/mMol, Amersham Japan) ermittelt.
Die so bestimmte DNA-Sequenz des Uricase-Gens von Bacillus sp.
TB-90 weist einen codierenden Bereich von 999 Nucleotiden
auf, der bei einem ATG als Startcodon beginnt und mit
einem TGA als Stopcodon endet. Von diesem codierenden Bereich
werden somit 332 Aminosäuren codiert; vgl. Fig. 1.
10 µg des das Uricase-Gen enthaltenden rekombinanten Plasmids
pUOD 31 wurden mit EcoRI und HincII in 30 µl M-Puffer
(10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl₂, 1 mM Dithiothreitol
und 50 mM NaCl) 2 Stunden bei 37°C gespalten und das Reaktionsgemisch
einer Elektrophorese in 0,8%igem Agarosegel
enthaltend 0,1 µg/ml Äthidiumbromid unterworfen. Dann wurde
das 1,4 kb EcoRI-HincII-DNA-Fragment isoliert.
Sodann wurde 1 µg DNA der Expressionsvektoren pUC18 (Toyobo)
oder pKK223-3 (Pharmacia) mit EcoRI und HincII bzw. mit
EcoRI und SmaI gespalten und DNA-Fragmente einer Größe von
2,7 kb bzw. 4,6 kb wie vorstehend beschrieben isoliert.
Sodann wurde 1 µg des wie vorstehend hergestellten 1,4 kb
EcoRI-HincII-DNA-Fragments mit jeweils 1 µg des wie vorstehend
beschrieben hergestellten Fragments der Expressions-Vektoren
pUC18 oder pKK223-3 vermischt und mit 5 Einheiten
T4 DNA-Ligase (Toyobo) in 45 µl Ligase-Reaktions-Puffer (66 mM
Tris-HCl (pH 7,6), 6,6 mM MgCl₂, 10 mM Dithiothreitol und
1,0 mM ATP) 6 Stunden bei 16°C ligiert.
Mit den erhaltenen Ligierungsprodukten wurde Escherichia
coli JM109 (Takara Shuzo) nach dem Verfahren von Hanahan
transformiert; vgl. J. Mol. Biol. 166 (1983), S. 557. Die
Transformanten wurden auf L-Medium-Agar ausplattiert (10 g
Trypton (Difco), 5 g Hefeextrakt (Difco), 5 g NaCl, 15 g
pulverförmiger Agar in 1 Liter destilliertem Wasser (pH 7,2)),
der mit 50 µg/ml Ampicillin versetzt war. Es wurde
auf Ampicillin-Resistenz selektiert. Plasmid-DNA wurde nach
dem Verfahren von Birnboim und Doly hergestellt und mit
unterschiedlichen Restriktionsenzymen gespalten. Die Restriktionsfragment-Analyse
mit einer Agarosegel-Elektrophorese
zeigte eine richtige Insertion eines 1,4 kb EcoRI-HincII-DNA-Fragments
in den entsprechenden Expressions-Vektoren.
Der auf pUC18 basierende rekombinante Expressions-Vektor
wurde als pUOD316 und der auf pKU1 basierende als
pKK223-3 bezeichnet. Fig. 2 zeigt das Konstruktionsschema
der Expressions-Vektoren pUOD316 und pKU1 aus dem rekombinanten
Plasmid pUOD31.
Die wie vorstehend konstruierten Expressions-Plasmide
pUOD316 und pKU1 wurden jeweils in Escherichia coli JM109
nach dem Verfahren von Hanahan eingeführt. Die von den erhaltenen
Transformanten E. coli JM109/pUOD316 und JM109/pKUl
hergestellte Uricase wurde jeweils identifiziert und wie
nachstehend angegeben untersucht.
Jede der Transformanten von E. coli wurde in flüssigem L-Medium
über Nacht bei 37°C gezüchtet. Sodann wurden 0,1 ml der
Kultur entnommen und 10 ml L-Medium wurden damit angeimpft
und bei 37°C gezüchtet. Sobald der OD₆₆₀ einen Wert von 0,2
erreicht hatte, wurde Isopropylthiogalactosid (IPTG) bis zu
einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben. Nachdem die Anzucht
dann weitere 16 Stunden durchgeführt wurde, wurden 1,0 ml
des Kulturmediums entnommen, mit 0,5 ml Extraktionspuffer
(50 mM Borat-Puffer (pH 8,0), 10 mM EDTA · 3 Na, 0,3% Triton
X-100 und 0,3% Lysozym) vermischt, 10 Minuten bei 37°C inkubiert
und 10 Minuten bei 12 000 UpM zentrifugiert, so daß
ein Bakterienlysat (Überstand) erhalten wurde. 20 µl des so
erhaltenen Lysats wurden in derselben Menge Probenauftragungs-Puffer
(62,5 mM Tris-HCl (pH 6,8), 2% SDS, 10% Glycerin,
5% 2-Mercaptoäthanol und 0,001% BPB) suspendiert, 5
Minuten auf 100°C erhitzt und einer SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese
nach Laemmli et al. unterzogen; vgl. Nature,
227 (1970), Seiten 680-685. Nach der Elektrophorese wurde
das Gel mit Coomassie-Brillantblau gefärbt, entfärbt, getrocknet
und auf einem Filterpapier befestigt. Es wurde eine
Uricase-Bande mit einem Molekulargewicht von etwa 35 000 bei
E. coli JM109 nachgewiesen, die ein Expressions-Plasmid
enthielten. Diese Protein-Bande reagierte spezifisch mit
anti-Uricase-Antikörpern (IgG). Durch Messung der Protein-Bande
auf dem Gel mit einem Densitometer wurde festgestellt,
daß E. coli JM109/pUOD316 und JM109/pKUl Uricase in einer
Menge von jeweils 1% bzw. 3% des intrazellulären Gesamtproteins
bilden. Diese Ergebnisse zeigen, daß die E. coli-Transformanten
die Uricase von Bacillus sp. TB-90 wirksam
herstellten. E. coli JM109/pUOD316 wurde beim Fermentation
Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology,
Ministry of International Trade and Industry, unter
der Hinterlegungsnummer FERM BP-1979 und E. coli JM109/pKUl
unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-1980 hinterlegt.
Die wie vorstehend beschrieben erhaltene Uricase weist die
folgenden Merkmale auf:
- (1) Biologische Aktivität:
Sie katalysiert die Umsetzung, bei der Harnsäure oxidativ abgebaut wird, so daß Wasserstoffperoxid freigesetzt wird. - (2) pH-Optimum: 5-10.
- (3) pH-Stabilitätsbereich: 5-9.
- (4) Temperatur-Optimum: 45-50°C.
- (5) Temperatur-Stabilitätsbereich:
Durch eine 10minütige Behandlung bei 50°C vermindert sich die Uricase-Aktivität nicht. - (6) Substrat-Spezifität:
Die Uricase weist eine Substrat-Spezifität für Harnsäure auf.
Nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren wurde das das
Uricase-Gen enthaltende 3,0 kb BamHI-BglII-Fragment aus dem
rekombinanten E. coli-Plasmid pUOD31 isoliert. Sodann wurden
2 µg des E. coli-Bacillus subtilis "shuttle"-Vektors pHY300 PLK
(Toyobo) mit dem Restriktionsenzym BamHI gespalten, mit
2 µg des das Uricase-Gen enthaltenden 3,0 kb BamHI-BglII-Fragments
unter Verwendung von 2 Einheiten T4 DNA-Ligase ligiert
und E. coli C600 wurde nach dem Verfahren von Hanahan
mit den Ligierungsprodukten transformiert. Ampicillin-resistente
Stämme wurden auf L-Agar selektiert. Aus einem der
transformierten E. coli C600-Stämme, der eine Uricase-Aktivität
aufwies, wurde nach dem Verfahren von Birnboim et al.
das Plasmid pEB2 isoliert. Fig. 3 zeigt ein Konstruktionsschema
dieses Plasmids. Sodann wurden kompetente Zellen von
Bacillus subtilis ISW 1214 (Toyobo) mit diesem Plasmid nach
Rodriguez et al., (Herausgeber, Recombinant DNA Techniques,
Addison-Wesley Publishing Company, 1983, Seiten 184-186)
transformiert. Die Zellen wurden auf L-Agar enthaltend 15 µg/ml
Tetracyclin und 0,2% Glucose ausplattiert und über
Nacht bei 37°C inkubiert. Durch Selektion Tetracyclin-resistenter
Kolonien wurde ein mit dem rekombinanten Plasmid
pEB2 transformierter Stamm von Bacillus subtilis isoliert.
Diese Transformante wurde in L-Medium, enthaltend 15 µg/ml
Tetracyclin und 0,2% Glucose über Nacht bei 37°C gezüchtet
und das Plasmid wurde isoliert und nach Rodriguez et al.,
(Herausgeber, Recombinant DNA Techniques, Addison-Wesley
Publishing Company, 1983, Seiten 164-165) isoliert und extrahiert.
Das Plasmid dieser Transformante wurde mit unterschiedlichen
Restriktionsenzymen gespalten und einer Elektrophorese
auf einem Agarosegel unterzogen. Dadurch wurde
bestätigt, daß es das Uricase-Gen enthaltende 3,0 kb BamHI-BglII-Fragment
trägt. Eine Bacillus-subtilis-Transformante,
nämlich die Transformante Bacillus-subtilis ISW1214/pEB2
wurde beim Fermentation Research Institute, Agency of
Industrial Science and Technology, Ministry of International
Trade and Industry, unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-1981
hinterlegt.
Bacillus subtilis ISW1214/pEB2 (FERM BP-1981) wurde in L-Medium
enthaltend 15 µg/ml Tetracyclin und 0,2% Glucose über
Nacht bei 37°C gezüchtet. Sodann wurden 1,0 ml des Kulturmediums
entnommen und 5 Minuten bei 8000 UpM zentrifugiert, um
den Überstand von den Zellen abzutrennen. Die Zellen wurden
in 1,0 ml Extraktions-Puffer suspendiert, 10 Minuten bei
37°C inkubiert und 10 Minuten bei 12 000 UpM zentrifugiert,
um ein Zellysat zu erhalten. Sodann wurden jeweils 20 µl des
Kultur-Überstandes und des Zell-Lysats mit jeweils 20 µl des
vorstehend genannten Proben-Auftrags-Puffers vermischt, 5
Minuten auf 100°C erhitzt und einer SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese
nach dem Verfahren von Laemmli et al. unterzogen.
Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit Coomassie-Brillantblau
gefärbt, entfärbt, getrocknet und auf einem
Filterpapier befestigt. Dabei wurde sowohl für den Kulturüberstand
als auch das Zellysat von Bacillus subtilis ISW1214/pEB2
eine Uricase-Bande mit einem Molekulargewicht von
etwa 35 000 ermittelt. Diese Protein-Bande zeigte eine spezifische
Kreuzreaktion mit anti-Uricase-Antikörpern (IgG).
Durch Untersuchung der Protein-Bande mit einem Densitometer
wurde ferner festgestellt, daß Bacillus subtilis ISW1214/pEB2
0,6% Uricase pro intrazellulärem Gesamt-Protein
hergestellt. Außerdem wurden 40% der von den Zellen hergestellten
Uricase in den Kultur-Überstand sezerniert, also
extrazellulär hergestellt. Somit wurde gefunden, daß die
Transformante Bacillus subtilis ISW1214/pEB2 Uricase sowohl
intrazellulär als auch extrazellulär herstellt.
Claims (12)
1. DNA-Sequenz, die ein Uricase-codierendes Gen enthält.
2. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, die aus Bacillus sp. TB-90
(FERM BP-795) abgeleitet ist und eine Uricase mit der
folgenden Aminosäure-Sequenz codiert:
3. DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2, die die folgende
DNA-Sequenz ist:
4. DNA-Sequenz, die komplementär zu einer DNA-Sequenz ist,
die unter üblichen Bedingungen mit einer DNA-Sequenz
nach Anspruch 2 oder 3 hybridisiert, und ein Protein mit
der biologischen Aktivität von Uricase codiert.
5. DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 oder 4, die aus
einem Mikroorganismus stammt.
6. DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 5, die zusätzlich
die natürlicherweise damit assoziierten regulatorischen
Elemente der 5′- und 3′-Flanke aufweist.
7. Rekombinantes Plasmid, das eine DNA-Sequenz nach einem
der Ansprüche 1 bis 6 enthält.
8. Transformante, die ein rekombinantes Plasmid nach Anspruch
7 enthält.
9. Transformante nach Anspruch 8, die zur Art Escherichia
coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces sp., Pseudomonas sp.
oder Streptomyces sp. gehört und ein Plasmid nach
Anspruch 7 enthält, das eine für ihn heterologe DNA-Sequenz
nach einem der Ansprüche 1 bis 6 enthält.
10. Transformante nach Anspruch 8, die zur Art Escherichia
coli oder Bacillus subtilis gehört.
11. Transformante nach einem der Ansprüche 8 bis 10, die der
Mikroorganismus Escherichia coli JM109 (pUOD316), Escherichia
coli JM109 (pKU1), Bacillus subtilis ISW1214
(pEB2) oder eine Variante davon ist.
12. Verfahren zur Herstellung von Uricase, bei dem man eine
Transformante nach einem der Ansprüche 8 bis 11 in einem
Medium unter zur Expression der Uricase-codierenden DNA-Sequenz
geeigneten Bedingungen züchtet und die bei der
Expression der DNA-Sequenz anfallende Uricase aus der
Kultur isoliert.
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