DE3919169A1 - Verfahren zur ermittlung eines genorts variabler laenge in einer dna-sequenz sowie gegebenenfalls markierte nucleotidsequenzen zur identifizierung eines derartigen genorts - Google Patents

Verfahren zur ermittlung eines genorts variabler laenge in einer dna-sequenz sowie gegebenenfalls markierte nucleotidsequenzen zur identifizierung eines derartigen genorts

Info

Publication number
DE3919169A1
DE3919169A1 DE3919169A DE3919169A DE3919169A1 DE 3919169 A1 DE3919169 A1 DE 3919169A1 DE 3919169 A DE3919169 A DE 3919169A DE 3919169 A DE3919169 A DE 3919169A DE 3919169 A1 DE3919169 A1 DE 3919169A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
dna
mini
location
nucleotide sequence
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE3919169A
Other languages
English (en)
Inventor
Alec John Jeffreys
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Imperial Chemical Industries Ltd
Original Assignee
Imperial Chemical Industries Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB888813781A external-priority patent/GB8813781D0/en
Priority claimed from GB898907653A external-priority patent/GB8907653D0/en
Application filed by Imperial Chemical Industries Ltd filed Critical Imperial Chemical Industries Ltd
Publication of DE3919169A1 publication Critical patent/DE3919169A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C12Q1/683—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism involving restriction enzymes, e.g. restriction fragment length polymorphism [RFLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/172—Haplotypes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Ermittlung der Anwesenheit eines unbekannten Orts (Genorts oder Genlocus) in einer DNA-Sequenz mit wenigstens einem bekannten Ort. Insbesondere kann das Verfahren dazu verwendet werden, informative Orte, beispielsweise Minisatelliten- oder VNTR- Bereiche, nachzuweisen. Die Erfindung betrifft auch neue Orte variabler Länge, die durch das obige Verfahren nachge­ wiesen wurden, sowie entsprechende Hybridisierungssonden. Diese können in genetischen Charakterisierungsverfahren und in der Diagnose und Therapie von genetischen Leiden und Krebs verwendet werden.
Die potentielle Verwendung von hoch variablen Orten als informative Marker zur Herstellung detaillierter Kopplungs­ karten des menschliches Erbguts ist seit Jahren bekannt (1). Der erste beschriebene hypervariable Ort, D14S1 (2, 3), wurde kürzlich als aus einer kurzen Tandemwiederholungssequenz bestehend beschrieben (4). Verschiedene andere hypervariable Minisatellitenorte mit Tandemwiederholung wurden anschließend zufällig in humaner DNA entdeckt, wozu die Minisatelliten 5′ zum Insulingen (5), 3′ zum c-Ha-rasl-Gen (6) und zum Typ II- Collagengen (7) genauso gehören wie drei Minisatelliten innerhalb oder in der Nähe des α-Globingenclusters (8-10). In jüngerer Zeit wurde ein 10 bis 16 bp (Basenpaar) "Rumpf"- sequenz identifiziert, die vielen humanen Minisatelliten gemeinsam ist und die dazu verwendet wurde, Hybridisierungs­ sonden herzustellen, die in der Lage sind, multiple Mini­ satelliten in humaner DNA nachzuweisen (UK-Patent Nr. 21 66 445) (11). Die Poly-Rumpfsonden entdecken 60 hyper­ variable Orte und erzeugen ein für ein Individuum spezifisches DNA-Fingerprintmuster (12). Diese Sonden entdecken ferner 1000 zusätzliche Orte innerhalb des Genoms, was aus dem Reichtum von Klonen geschlossen werden kann, die mit den Poly-Rumpfsonden in humanen Cosmid-Bibliotheken hybri­ disieren (A.J. Jeffreys, nicht-veröffentlichte Ergebnisse). Diese zusätzlichen Minisatelliten sind üblicherweise kurz und tragen nichts zu dem Satz an großen und variablen Minisatelliten bei, die die DNA-Fingerprintmuster bilden.
Die Segregationsanalyse von hypervariablen DNA-Fragmenten, die in humanen DNA-Fingerprints gefunden wurden, ergab, daß die nachgewiesenen Orte zu Autosomen gehören und unabhängige Gruppen bilden (11, 13). Ein weiterer Beweis dafür, daß die Minisatelliten im Genom verteilt sind, sich aus der Analyse der DNA-Fingerprintfragment-Segregation bei rekombi­ nanten Inzucht-Mäusestämmen (14). Von den auf diese Weise ermittelten 13 Maus-Minisatellitenorten konnten 8 bei der Zuordnung zu Bereichen der Mäusechromosomen interstitiellen Chromosomenbereichen zugeordnet werden. Die restlichen 5 Orte zeigten jedoch keine signifikante Kopplung mit irgend­ einem bekannten Mausort und gehören vermutlich zu marken­ armen Bereichen des Mäusegenoms. Das deutet auf die Möglich­ keit hin, daß die Minisatelliten nicht vollständig stati­ stisch im Mäusegenom verteilt sind.
Individuelle Minisatelliten wurden von humanen DNA-Finger­ prints kloniert, um ortsspezifische Sonden für individuelle extrem variable Orte mit Heterozygotien im Bereich von 85 bis 99% herzustellen (EP-Patentanmeldung mit der Veröffent­ lichungs-Nr. 2 38 329) (15, 16). Umfangreichere Sammlungen von Sonden, die variable (VNTR) humane Orte (mittlere Heterozygotie 70%) nachweisen, wurden dadurch erhalten, daß man menschliche Cosmid-Bibliotheken durch Hybridisierung mit Oligonucleotiden, die auf bekannten Minisatelliten- Wiederholungssequenzen beruhen (17), gescreent hat.
Es wurde nunmehr gefunden, daß variable Orte, die durch Poly- Rumpfsonden nachgewiesen werden, eine bevorzugte, wenn auch nicht ausschließliche Anordnung in den terminalen G-Banden humaner Autosomen zeigen, in Bereichen des Genoms, die reich an hypervariablen Orten zu sein scheinen. Eine detaillierte Kartierung und Sequenzanalyse eines Minisatellitenbereichs, der durch eine ortsspezifische Sonde festgestellt wurde, ergab unerwarteterweise zwei eng gekoppelte Minisatelliten­ orte. Diese beiden Minisatellitenorte scheinen trotz ihrer engen Kopplung die Ergebnisse von unabhängigen Vervielfachungs­ ereignissen zu sein. Das führte zu der Entdeckung, daß eine anomale Differenz von Allellängen, beispielsweise der Längen von allelischen DNA-Fragmenten, die nicht auf eine Allel­ längendifferenz an einem bekannten Ort zurückgeführt werden kann, beispielsweise in einem bekannten Minisatelliten­ bereich, dazu verwendet werden kann, neue variable Längenbe­ reiche nachzuweisen.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird somit ein Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit eines Orts variabler Länge in einer DNA-Sequenz mit wenigstens einem bekannten Ort geschaffen, wobei dieses Verfahren das Identifizieren, und zwar bei zwei oder mehr nicht-identischen DNA-Nucleotid­ sequenzen, von äquivalenten Punkten an gegenüberliegenden Enden einer jeden dieser Nucleotidsequenzen, von denen jede Sequenz den nachzuweisenden Ort variabler Länge sowie den bekannten Ort umfaßt, sowie den Nachweis der Anwesenheit oder des Fehlens eines Orts variabler Länge durch Vergleichen der entsprechenden Abstände zwischen äquivalenten Punkten umfaßt.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann somit verwirklicht werden, indem man das Vorliegen oder das Fehlen einer anormalen Differenz bei der Allellänge, beispielsweise der Länge eines allelischen DNA-Fragments, die nicht der Allellängendifferenz an dem bekannten Ort zugeschrieben werden kann, feststellt. Darüber hinaus beinhaltet das erfindungsgemäße Verfahren üblicherweise den Schritt der Charakterisierung dieser DNA- Nucleotidsequenzen, beispielsweise anhand ihrer entsprechenden Molekulargewichte. Eine derartige Charakterisierung kann auf irgendeine übliche geeignete Weise erfolgen, beispielsweise durch Gelelektrophorese.
Der bekannte Ort kann beispielsweise ein Minisatelliten­ bereich sein, gegebenenfalls einer von variabler Länge, bei­ spielsweise ein informativer Ort (in der nachfolgend definierten Bedeutung dieses Begriffs). Wenn der bekannte Ort ein Minisatellitenbereich variabler Länge ist, kann die Anwesenheit eines zusätzlichen gekoppelten Orts variabler Länge dadurch festgestellt werden, daß man eine Differenz der Allellänge feststellt, die nicht der Allellängendifferenz des bekannten Minisatellitenbereichs zugeschrieben werden kann.
Der bekannte Ort und der nachzuweisende Ort variabler Länge können irgendeinen geeigneten Abstand voneinander aufweisen, beispielsweise einen Abstand bis zu 1000 kb, in geeigneter Weise bis zu 100 kb und vorzugsweise bis zu 10 kb.
Das erfindungsgemäße Verfahren schafft ein nützliches Ver­ fahren zum Nachweis eines neuen, vorzugsweise informativen Orts variabler Länge.
In der vorliegenden Beschreibung wird ein "informativer Genort" als ein solcher Genort definiert, an dem wenigstens drei unterschiedliche Allele in einer beliebigen Probe von 100 nicht miteinander verwandten Individuen unterschieden werden können, die keiner Vorauswahl unterzogen wurden. Das kann so ausgedrückt werden, daß man sagt, daß der Ort eine Allelvariation von wenigstens 3 (100) aufweist. Vorzugsweise umfaßt die Probe der nicht miteinander verwandten Individuen 500, noch bevorzugter 1000 Glieder, und die Fähigkeit, wenigstens 3 unterschiedliche Allele in derartigen Proben zu unterscheiden, kann dann ausgedrückt werden als 3 (500) bzw. 3 (1000). Es ist wesentlich, daß die Probe von 100, 500 oder 1000 nicht miteinander verwandten Individuen tatsächlich statistisch ausgewählt ist, da es in normaler Weise möglich sein wird, 100, 500 oder 1000 Individuen zu identifizieren, die weniger als 3 Allele an einem gegebenen informativen Genort aufweisen, wenn man eine ausreichend große Anzahl von Personen der Gesamtbevölkerung screent.
Je höher diese Polymorphie an einem gegebenen informativen Genort ist, desto nützlicher und informativer ist die orts­ spezifische Sonde zur genetischen Charakterisierung, beispielsweise zur individuellen Identifizierung für den Nach­ weis der Vaterschaft oder gerichtsmedizinische Nachweise.
Ein äquivalenter Punkt in einer nicht-identischen DNA-Nucleo­ tidsequenz kann als ein Marker angesehen werden, der sich in einem allen Sequenzen gemeinsamen Bereich befindet. Ein allen Sequenzen gemeinsamer Bereich kann eine Minimallänge von nur zwei benachbarten Nucleotiden aufweisen und ist im Hin­ blick auf seine Gesamtlänge nicht beschränkt, weist jedoch geeigneterweise von vier bis sechs Reste auf. Ein gemein­ samer Punkt kann geeigneterweise dadurch identifiziert werden, daß man Enzyme, Sonden oder Signalgruppen verwendet. Das Schneiden von DNA ist ein geeignetes Mittel zur Erzeugung eines Markers, und das (die) geschnittene(n) Ende(n) der DNA-Sequenz ist (sind) daher der (die) Marker. Das Schneiden wird unter Verwendung irgendeiner geeigneten Technik durch­ geführt, wobei vorzugsweise ein enzymatisches Schneiden verwendet wird, wobei insbesondere die Verwendung von Restriktionsendonukleasen bevorzugt ist. Irgendeine geeignete Restriktionsendonuklease kann verwendet werden. Beispiele für individuelle Restriktionsendonukleasen schließen alle die ein, die im Detail angeführt sind in Nucleic Acids Research, Sequences Supplement, Volume 16, 1988, Seite r271-r313, und in "Current Protocols in Molecular Biology 1987-1988", herausgegeben von Ausubel F.M., Brent R., Kingston R.E., Moore D.D., Smith J.A., Seidman J.G. und Struhl K., Wiley Interscience, Section 3, Tabelle 3.1-1. Spezielle Restriktionsendonukleasen umfassen Nco I, Eco RI und Eco RV. Es ist dabei sofort ohne weitere Erläuterungen verständlich, daß der Schnittpunkt so gewählt wird, daß der bekannte Ort, beispielsweise der bekannte informative Ort, nicht geschnitten oder anderweitig beeinträchtigt wird.
Gemäß einem weiteren Aspekt des erfindungsgemäßen Verfahrens werden daher die Äquivalentpunkte durch Schnittstellen defi­ niert, und eine Proben-DNA wird geschnitten, um die erwähnten nicht-identischen DNA-Nucleotidsequenzen zu erzeugen, und die Anwesenheit oder das Fehlen eines Orts variabler Länge wird dadurch nachgewiesen, daß man die Längen der geschnittenen nicht-identischen DNA-Nucleotidsequenzen ver­ gleicht.
Wie in dem nachfolgenden Text noch genauer ausgeführt werden wird, erlaubt ein Vergleich der Abstände zwischen den äqui­ valenten Punkten die Identifizierung irgendeiner Längen­ differenz. Es ist daher selbstverständlich, daß dann, wenn der bekannte Ort bereits eine variable Länge aufweist, eine derartige Variation berücksichtigt werden muß.
Die Identifizierung der äquivalenten Punkte kann Routine­ experimente erforderlich machen, um festzustellen, ob sie jenseits der gegenüberliegenden Enden der gewünschten Nucleotidsequenz liegen. Wenn beispielsweise äquivalente Punkte, die in der DNA-Polynucleotidsequenz häufig auftreten, ausgewählt werden, kann es nicht möglich sein, dieses Kriterium zu erfüllen, daß sie jenseits der gegenüberliegenden Enden von DNA-Nucleotidsequenzen liegen, die einen gemein­ samen bekannten Bereich oder Ort sowie den nachzuweisenden Bereich variabler Länge enthalten. Wenn jedoch äquivalente Punkte gewählt werden, die einen zu großen Abstand aufweisen, kann es dazu kommen, daß zusätzlich zu dem bekannten, allen Sequenzen gemeinsamen Ort zwischen den gemeinsamen Punkten mehr als ein Bereich variabler Länge oder hypervariabler Ort vorhanden ist. Dann können ein oder mehr äquivalente Punkte identifiziert werden, um variable Bereiche oder Orte, die am engsten mit dem bekannten Ort gekoppelt sind, genauer zu kartieren.
Die DNA kann aus irgendeiner geeigneten Quelle stammen, bei­ spielsweise eine Genom-DNA sein. Beispiele für spezifische DNA-Quellen zur Verwendung in dem beanspruchten Verfahren umfassen humane DNA. Wenn es erforderlich ist, kann die Proben-DNA verstärkt (vervielfacht) werden, beispielsweise unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR), die in den US-PS 46 83 195 und 46 83 202 beschrieben ist, um DNA- Nucleotidsequenzen zu erhalten, die in das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt werden können. Die Verstärkung von Minisatellitenbereichen ist beschrieben in Nucleic Acids Research, 1988, Vol. 16, Seiten 10953-10971, A.J. Jeffreys et al. Aternativ dazu kann die Proben-DNA durch lineare Verstärkung verstärkt werden, wobei eine Proben-DNA-Matrize immer dazu benutzt wird, komplementäre Kopien einer Proben- DNA-Nucleotidsequenz herzustellen. Wenn die DNA-Nucleotid­ sequenzen zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren durch Verstärkung von Proben-DNA hergestellt wurden, können die äquivalenten Punkte gegebenenfalls von den gegenüberliegenden Enden einer jeden DNA-Nucleotidsequenz gebildet werden. Ein Schneiden der DNA ist dann nicht erforderlich.
Es ist daher ein weiterer Aspekt des erfindungsgemäßen Ver­ fahrens, daß die nicht-identischen Nucleotidsequenzen verviel­ facht werden und die Längen der vervielfachten Produke ver­ glichen werden, um die Anwesenheit oder das Fehlen eines Orts variabler Länge festzustellen.
Die miteinander zu vergleichenden nicht-identischen DNA- Nucleotidsequenzen können auch ein kloniertes Material sein, beispielsweise eines, wie es in einer cDNA-Bibliothek zu finden ist. Die zu vergleichenden Sequenzen werden in geeigneter Weise durch Hybridisierung mit einem Polynucleotid identifiziert, das wenigstens einen bekannten Ort aufweist.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung sind daher die nicht-identischen DNA-Nucleotidsequenzen kloniertes Material.
Informative Bereiche oder Orte einer DNA wurden bereits identifiziert, beispielsweise bei einer Genom-DNA gemäß der im Anhang zu dieser Beschreibung aufgeführten Literatur.
Es wird angenommen, daß geeignete Bereiche des Genoms für eine Untersuchung die proterminalen Bereiche von Autosomen, insbesondere humanen Autosomen sind, und insbesondere die terminalen G-Banden humaner Autosomen. Informative Bereiche können auf geeignete herkömmliche Weise durch Hybridisierung mit bekannten Polynucleotidsonden identifiziert werden. Geeignete Bedingungen für die Hybridisierung sind dem Fach­ mann ohne weiteres geläufig. Die Sonden werden nach der Hybridisierung unter Verwendung bekannter Verfahren nachge­ wiesen, beispielsweise anhand eines radioaktiven Markers oder Labels der Sonden, der auf herkömmliche Weise nachge­ wiesen werden kann. Beispiele für geeignete Sonden sind in den oben erwähnten Literaturstellen beschrieben und umfassen die klonierten Minisatellitensonden mit den Bezeichnungen lambda MS31, lambda MS1, lambda MS8, lambda MS32 und p lambda g3. Bevorzugte Minisatellitensonden zur Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfassen lambda MS43 und p lambda g3. Weitere informative Orte können nach dem in der UK- Patentanmeldung mit der Veröffentlichungs-Nr. 21 88 323 beschriebenen Verfahren identifiziert werden.
Es ist ohne weiteres klar, daß dann, wenn DNA von einer Anzahl von Individuen verwendet wird, die erhältliche Information bezüglich einer Polymorphie des variablen Längenbereichs oder Orts um so größer ist.
Wenn ein äquivalenter Punkt durch Schneiden der DNA erzeugt wird, werden Fragmente produziert. Wenn zusätzlich eine Hybridisierungssonde dazu verwendet wird, einen bekannten, beispielsweise informativen Ort zu identifizieren, kann die Umsetzung mit der Sonde durchgeführt werden, bevor oder nach­ dem die DNA geschnitten wird, wobei eine nachträgliche Umsetzung jedoch bevorzugt ist. Das erfindungsgemäße Verfahren wird dadurch verwirklicht, daß man zwei oder mehr nicht- identische DNA-Nucleotidsequenzen kürzt, um von jeder dieser Sequenzen ein Fragment zu erhalten, das den nachzuweisenden Ort variabler Länge sowie den bekannten Ort aufweist, wobei jedes Fragment an äquivalenten Punkten endet, so daß die Anwesenheit eines Orts variabler Länge dadurch festgestellt werden kann, daß man einen Unterschied bei den Allelfrag­ mentlängen feststellt, der nicht einer Allellängendifferenz des bekannten Orts zugeschrieben werden kann.
DNA-Fragmente zur Verwendung in dem obigen Verfahren können durch irgendein geeignetes Verfahren hergestellt werden, beispielsweise wie oben erläutert. Auf diese Weise können DNA-Fragmente, die alle an äquivalenten Punkten enden, erhalten werden, indem man jede nicht-identische DNA-Nucleotid­ sequenz einem Schneiden unter Verwendung der gleichen Restriktionsendonuklease unterwirft.
Der Bereich oder Ort, der unter Verwendung der obigen Methoden nachgewiesen wurde, kann dann dadurch weiter charakterisiert werden, daß man unter Verwendung der dem Fachmann bekannten Verfahren die DNA-Nucleotidsequenz bestimmt. Ein DNA- Nucleotidsequenzanalysator, vorzugsweise ein automatisch arbeitender DNA-Nucleotidsequenzanalysator, kann geeigneter­ weise verwendet werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein neuer DNA-Bereich oder -Ort variabler Länge geschaffen, der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren festgestellt wurde.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wurden bereits neue Bereiche variabler Länge in der Genom-DNA identifiziert. Unter Verwendung der DNA-Sonde mit der Bezeichnung lambda MS43, die in der UK-Patentanmeldung mit der Veröffentlichungs- Nr. 21 88 323 beschrieben und beansprucht wird, wurde ein gekoppelter Minisatellit mit der Bezeichnung lambda MS43B nachgewiesen und einer Sequenzbestimmung unterzogen.
Der obige Minisatellitenbereich kann in geeigneter Weise mit Nucleotidsequenzen identifiziert werden, die in der Lage sind, diesen durch Hybridisierung nachzuweisen, und beispiels­ weise einen Label- oder Markierungsbestandteil aufweisen.
Derartige Nucleotidsequenzen können eine geeignete Anzahl von komplementären Nucleotiden umfassen, vorausgesetzt, daß die Hybridisierung eine Identifizierung des Minisatelliten­ bereichs gestattet. Die Nucleotidsequenz ist geeigneterweise wenigstens 70, 80, 90 oder 95% homolog mit dem entspre­ chenden Minisatellitenbereich.
Gemäß einem weiteren Merkmal der vorliegenden Erfindung wird somit eine Nucleotidsequenz geschaffen, die wenigstens acht aufeinanderfolgende Nucleotide aufweist, die ausge­ wählt sind aus der Sequenz
oder Tandemwiederholungen davon oder dazu komplementären Sequenzen.
Geeigneterweise weist die Nucleotidsequenz wenigstens 10 aufeinanderfolgende Nucleotide und vorzugsweise alle gezeigten Nucleotide auf. Es ist dabei klar, daß die Tandemwieder­ holungen geeigneterweise identisch sind, wobei dieses jedoch kein absolutes Erfordernis ist. Im Falle der isolierten Sequenz lagen 42 Wiederholungen vor. Die Sequenz war mit einer Sequenz gekoppelt, die hier mit MS43A bezeichnet wird, und die in der UK-Patentanmeldung-Nr. 87 06 401 beschrieben und beansprucht wird.
Ein weiterer polymorpher Bereich variabler Länge wurde dadurch identifiziert, daß man die DNA-Sonde mit der Bezeichnung p lambda g3 verwendete, die in der UK-Patentanmeldung mit der Veröffentlichungs-Nr. 21 88 323 beschrieben und beansprucht wird. Der neue hoch variable DNA-Minisatellit ist durch eine Lokalisierung zwischen den Restriktionsendo­ nuklease-Stellen Nco I und Pvu II, die dem p lambda g3-Ort am nächsten liegen, charakterisiert. Die Sequenz dieses Bereichs oder Orts kann nach bekannten Verfahren wie oben erläutert aufgeklärt werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Nucleotidsequenz geschaffen, die in der Lage ist, durch Hybridisierung den oben erwähnten neuen Ort zu identifizieren.
Weitere polymorphe Regionen variabler Länge wurden dadurch identifiziert, daß man die DNA-Sonde verwendete, die nach­ folgend pMS 228 genannt wird (sie ist bisher noch nicht beschrieben). Uner Verwendung dieses erfindungsgemäßen Ver­ fahrens wurde festgestellt, daß der Minisatellit, der diesen polymorphen Bereich variabler Länge enthält, zwei gekoppelte Minisatelliten aufweist, die nachfolgend pMS 228A und pMS 228B genannt werden. Weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung betreffen Nucleotidsequenzen, die in der Lage sind, durch Hybridisierung einen der oben erwähnten neuen Orte zu identifizieren.
Somit wird gemäß einem weiteren Merkmal der vorliegenden Erfindung eine Nucleotidsequenz geschaffen, die wenigstens 8 aufeinanderfolgende Nucleotide aufweist, die ausgewählt sind aus der Sequenz
oder Tandemwiederholungen davon oder dazu komplementäre Sequenzen. Geeigneterweise weist die Nucleotidsequenz wenig­ stens 10 aufeinanderfolgende Nucleotide und vorzugsweise alle gezeigten Nucleotide auf.
Somit wird gemäß einem weiteren Merkmal der vorliegenden Erfindung eine Nucleotidsequenz geschaffen, die wenigstens 8 aufeinanderfolgende Nucleotide aufweist, die ausgewählt sind aus der Sequenz
oder Tandemwiederholungen davon oder dazu komplementäre Sequenzen. Geeigneterweise weist die Nucleotidsequenz wenig­ stens 10 aufeinanderfolgende Nucleotide und vorzugsweise alle gezeigten Nucleotide auf.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden DNA-Sonden geschaffen, die irgendeine Nucleotidsequenz gemäß einem der obigen Aspekte der vorliegenden Erfindung zusammen mit einem Label- oder Markierungsbestandteil umfassen.
Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung anhand der nach­ folgenden detaillierten Beschreibung näher erläutert, ohne daß sie dadurch eingeschränkt wird.
Materialien und Verfahren ³H-Markierung von Sonden
Die flankierende DNA der klonierten Minisatelliten wurde durch Verdauen der Sau3A Inserts von λMS31, λMS1, λMS8, λMS32, λMS43 und pλg3 (15, 16) mit einer oder mehreren der folgenden Restriktionsendonukleasen AluI, HaeIII, HinfI entfernt. Die Minisatelliten-DNA-Fragmente wurden durch Gelelektrophorese (18) gereinigt und in Gegen­ wart von 0,3 nMol ³H-dATP, ³H-dCTP und ³H-DTTP auf 2- 8×10⁷ cpm/µg oligomarkiert (19). Minisatelliten aus den Multilocus-M13-Rekombinantensonden 33.6 und 33.15, bean­ sprucht im UK-Patent Nr. 21 66 445 (Lister Institute of Preventive Medicine), wurden aus M13 RF DNA mit BamHI und KpnI bzw. BamHI und EcoRI herausgeschnitten und wie oben ³H- markiert.
In situ-Hybridisierung
Die markierten Sonden aus λMS31, λMS1, λMS8, λMS32, λMS43 und pλg3 wurden mit Metaphasen von normalen humanen Lymphocyten hybridisiert, die in Gegenwart von 100 µg/ml Brd Urd (20, 21) gezüchtet worden waren, und zwar in Gegenwart von 240 µg/ml einer niedermolekularge­ wichtigen denaturierten Lachs-DNA, wie in der Literatur beschrieben ist (21, 22). Die Multilocus-Sonden 33.6 und 33.15 wurden wie oben hybridisiert, jedoch ohne irgendeine Konkurrenz-DNA. Die Schichtträger wurden bei 4°C 7-14 Tage mit Ilford K2 Nuclear Research Emulsion entwickelt und anschließend nach dem G-Bandverfahren (Hoechst 33258/UV/Giemsa-Ver­ fahren) weiter aufgearbeitet (20).
Humane DNA
DNA wurde aus weißen Blutzellen von nicht mit­ einander verwandten Nordeuropäern erhalten (12). Andere DNA- Proben wurden von dem Centre du Polymorphisme Humain zur Verfügung gestellt.
Southern-Blotting-Hybridisierungen
Genom-DNA-Proben wurden mit Restriktionsendonukleasen verdaut und wie beschrieben (13) elektrophoresiert. DNA wurde auf Hybond-N (Amersham International) übertragen und mit ³²p-markierten DNA-Sonden nach Church und Gilbert (23) hybridisiert.
pMS228
Unter Verwendung von Sau3A1 verdaute Humangenom-DNA wurde nach Größen selektiert und in λL47.1 gebunden. Die erhaltene Bibliothek wurde mit Rumpfsonden 33.6 und 33.15 gescreent; positiv hybridisierende Klone (die λMS-Serie) erkannten hoch variable Orte, wenn sie für die Sondierung von humaner Genom-DNA verwendet wurden. Das gleiche Verfahren wurde verwendet, um λMS228 zu isolieren, von dem der Sau3A1-Insert in die BamHI-Stelle von pUC13 subkloniert wurde, um pMS228 zu erhalten. Eine weitere Charakterisierung von pMS228 ist unter "Ergebnisse" beschrieben und in Tabelle 3 zusammengefaßt. Eine in situ-Hybridi­ sierung wurde wie in (50) beschrieben durchgeführt. Eine DNA-Sequenzanalyse wurde durchgeführt unter Verwendung der Dideoxy-Kettenabschlußmethode (51) mit Klenow-Fragment, modifizierter T7-Polymerase (52) oder DNA-Polymerase aus Thermus aquaticus (53).
Ergebnisse Lokalisierung von humanen Minisatelliten durch in situ-Hybridisierung
Sechs klonierte Minisatelliten mit den Bezeichnungen pλg3, λMS1, λMS8, λMS31, λMS32 und λMS43, von denen jeder einen einzigen hoch variablen Ort entdeckt (Tabelle 1) (15, 16), wurden in situ mit humanen Metaphasen-Chromosomen hybridi­ siert. Wir haben bereits früher gezeigt, daß diese Sonden bei der Southern-Blotting-Analyse sehr empfindlich sind, und zwar vermutlich infolge des Tandemwiederholungs-Charakters von sowohl Sonde als auch Zielort. Wie erwartet, waren die in situ-Hybridisierungssignale stark, wobei die Mehrzahl der Metaphasen ein oder mehr Silberkörner über dem relevanten Ort zeigten (Fig. 1). Eine Lokalisierung konnte auf diese Weise ermöglicht werden, indem man relativ wenig Zellen analysierte (Tabelle 1).
Fig. 2 zeigt die Verteilung von Silberkörnern nach der in situ-Hybridisierung mit jeder der sechs Minisatellitensonden. Jede Sonde weist einen einzigen dominierenden Ort nach, und die regionale Lokalisierung dieser Orte auf den Chromosomen 1, 5, 7 und 12 (Tabelle 1) ist vollständig konsistent mit früheren Chromosomen-Zuordnungen, die durch Somazellen- Hybridanalyse gewonnen wurden (16). Die in situ-Hybridisie­ rungsanalyse mit der Sonde λMS32 zeigte einen relativ hohen Hintergrund von statistisch verteilten Körnern, obwohl die Lokalisierung zu 1q42-43 klar war. Die Verteilung der Silber­ körner nach der Hybridisierung mit λMS8 zeigte einen zweiten kleineren Peak bei 12q24.3-qter zusätzlich zu dem Hauptort bei 5q35-qter. Dieser Sekundärpeak kann einen anderen Ort mit einer wesentlichen Sequenzähnlichkeit zu dem D5S43-Ort bedeuten, der von λMS8 erkannt wird.
4 der 6 Minisatellitenorte, genau wie der zweite von λMS8 erkannte Ort sind in terminalen G-Banden lokalisiert (Tabelle 1). Die restlichen Minisatelliten λMS1 und λMS32 sind beide im Endbereich des Chromosoms 1 lokalisiert, sind jedoch nicht terminal. Diese bevorzugte, wenn auch nicht ausschließliche Lokalisierung in terminalen G-Banden ist statistisch signifikant. In dieser Analyse wurden Metaphasen­ zellen mit etwa 400 G-Banden pro haploides Genom verwendet. Wenn die DNA gleichförmig über die Länge des Chromosoms ver­ teilt ist, dann sollte 11% des Genoms und damit auch 11% von statistisch verteilten Minisatelliten in terminalen G-Banden lokalisiert sein. Die Lokalisierung von 4 von insgesamt 6 Minisatelliten in terminalen G-Banden ist daher signifikant (P=0,002 für eine statistische Verteilung).
Die nicht-statistische Verteilung von Minisatelliten wurde durch in situ-Hybridisierung mit den Multilocus-DNA-Finger­ printsonden 33.6 und 33.15 bestätigt, die zusammen 1000 Orte im humanen Genom entdecken. 26-32% aller Silberkörner über Chromosomen waren über terminale G-Banden (Tabelle 2) lokalisiert, was mit den für eine statistische Kornverteilung zu erwartenden 11% zu vergleichen ist. Da jedoch die Wirk­ samkeit des Nachweises von unterschiedlichen Minisatelliten mit diesen Sonden von Ort zu Ort erheblich variiert, ist es noch nicht möglich, den Anteil aller Minisatelliten abzu­ schätzen oder den Anteil von hypervariablen Orten, die eine proterminale Lokalisierung zeigen.
Proterminale Minisatelliten sind nicht telomer
Das Telomere des kurzen Armes der menschlichen X- und Y- Chromosomen wurde durch die Sonde 29C1 identifiziert, die einen Ort DXYS14 definiert, dessen Kartierung dem Telomeren sehr nahe ist; geeignete Restriktionsfragmente, die DXYS14 und das Telomere umfassen, zeigen eine 14 kb-Längenvariation innerhalb eines Individuums, was von einer Telomerlängen- Heterogenität herrührt und beim Southern-Blotting zur Erzeugung eines "verschmierten" Hybridisierungsbandes führt (25). Ähnliche Experimente mit pλg3, λMS8, gMS31 und λMS43 an Genom-DNA, die mit einer Auswahl von 14 unter­ schiedlichen Restriktionsendonukleasen verdaut worden war, lieferten keinen Hinweis auf "verschmierte" Banden, die eine enge physikalische Kopplung an ein Telomeres bedeuten könnten (Ergebnisse nicht gezeigt). Es erscheint daher als wahr­ scheinlich, daß diese proterminalen Minisatelliten nicht telomer sind und wenigstens 12 kb von Telomeren entfernt lokalisiert sind. Der Maximalabstand von einem Telomeren beträgt 8 mb, die ungefähre Länge der DNA in einem terminalen G-Band.
Assoziierung von anderen hypervariablen Orten mit proterminalen Minisatelliten
Die bevorzugte Lokalisierung von Minisatelliten in terminalen G-Banden legt die Vermutung nahe, daß diese Bereiche reich an hypervariablen Orten sind. Diese Möglichkeit wird durch zwei unterschiedlichen Beweisführungen gestützt.
Für λMS43 war früher gezeigt worden, daß damit ein zweiter variabler Ort zusätzlich zu dem hauptsächlichen hypervariablen Ort nachgewiesen wird (16). Familienstudien zeigten, daß diese beiden Orte eng gekoppelt waren (Ergebnisse sind nicht gezeigt). Eine detaillierte Kartierung und Sequenzanalyse des humanen Sau3A-DNA-Fragment, kloniert in λMS43, führte zur Auffindung eines zweiten Minisatelliten MS43B, der 1,0 kb von dem Haupt-Minisatelliten MS43A entfernt angeordnet ist (Fig. 3A). Dieser zweite Minisatellit besteht aus 43 Wieder­ holungen einer 24 bp G-reichen Sequenz, die einen Bereich enthält, der sehr ähnlich ist sowohl der "Rumpf"-Sequenz als auch der DNA-Fingerprintsonde 33.6, die zur Identifizierung von λMS43 verwendet worden war. Im Gegensatz dazu zeigte der G-reiche Haupt-Minisatellit mit einer Länge der Wieder­ holungseinheiten von 45 bp nur eine geringe Sequenzähnlich­ keit mit dem Rumpf oder 33.6 (16). Nachfolgende Versuche zeigten, daß λMS43 durch Nachweis von MS43B, jedoch nicht MS43B, mit der Sonde 33.6 isoliert wurde (Ergebnisse nicht gezeigt). Es gibt keine signifikante Ähnlichkeit zwischen diesen beiden Minisatelliten, und sie sind hinsichtlich des G-reichen Stangs in entgegengesetzte Richtung orientiert. Diese beiden Minisatelliten scheinen daher trotz ihrer engen Kopplung aus zwei unabhängigen Verstärkungen zu stammen.
Der zweite Minisatellit MS43B wirkt als eine ortsspezifische Sonde (Fig. 3B). Der entdeckte Ort zeigt wenigstens sieben Allele unterschiedlicher Länge, mit Wiederholungskopiezahlen, die im Bereich von 25-50 variieren, und mit einer zugeordneten Heterozygotie von 35% (Fig. 3C). Im Gegensatz dazu zeigt der von λMS43 nachgewiesene Haupt-Minisatellit mehr als 20 Allele unterschiedlicher Länge und eine Heterozygotie von 96% (16).
Um die Suche nach gekoppelten Minisatelliten auszuweiten, wurde jeder klonierte Minisatellit mit humaner DNA hybri­ disiert, die mit einer Auswahl von 14 verschiedenen Restrik­ tionsendonukleasen geschnitten worden war. Die Anwesenheit einer Längen-Heterozygotie bei einem gekoppelten Ort erscheint als anomale Differenz der Allelfragment-Längen, die nicht auf eine Allelfragment-Längendifferenz des durch die Sonde nachgewiesenen Minisatelliten zurückgeführt werden kann. Dieser Ansatz führte zur Ermittlung eines zweiten hoch variablen längenpolymorphen Bereichs in der Nähe des hypervariablen Orts, der durch pλg3 (Fig. 4A) nachgewiesen wurde. Restriktionsendonukleasen, die in der Nähe von pλg3 schneiden, erzeugen allelische Fragmente, deren Längen­ unterschied vollständig der Allelvariation von pλg3 zuge­ schrieben werden kann. Im Gegensatz dazu erzeugen die Restriktionsendonukleasen NcoI, EcoRI oder EcoRV Allelfrag­ mente einer anomalen Größe, was ein Hinweis auf die Anwesen­ heit eines zweiten variablen Bereichs distal zu pλg3 ist. Genomkartierung führt zur Lokalisierung dieses zweiten variablen Bereichs in ein NcoI-PvuII-Intervall 2 kb von pλg3 entfernt (Fig. 4B). Dieses Intervall zeigt multiple Allele, die eine Längenvariation von 4-36 kb bei 21 Allelen zeigten, die Proben von Individuen aus der CEPH-Sammlung waren. Es besteht keine signifikante Korrelation zwischen der Länge eines λg3-Allels und der Länge des zweiten gekoppelten hypervariablen Orts (Fig. 4C).
Spätere Studien zeigten, daß die beiden Orte mit hoher Stringenz von pMS228 nachgewiesen werden. Eine Familien­ analyse zeigte, daß diese Orte eng gekoppelt sind. Eine Restriktionskartierung der klonierten DNA, die später durch Sequenzanalyse bestätigt wurde, zeigte die Anwesenheit von zwei unterschiedlichen Tandemwiederholungsbereichen, die als 228A und 228B bezeichnet wurden (Fig. 4). Eine neuerliche Sondierung humaner DNA mit Subklonen von pMS228 zeigte, daß 228A den größeren, stärker hybridisierenden Ort nachweist, während 228B die kleineren, schwächer hybridisierenden Allele nachweist. Diese Minisatelliten wurden unter Verwendung von Somazellenhybriden und in situ-Hybridisierung im Bereich 17p13-pter lokalisiert. Die Eigenschaften der von pMS51 und pMS228 sowie von den anderen in diesem Report diskutierten Minisatelliten nachgewiesenen Orte sind in Tabelle 1 zusammen­ gefaßt.
Beide Minisatelliten in pMS228 zeigen Heterozygotien von mehr als 80%. Der Minisatellit 228B (Fig. 5, Tabelle 3) kombiniert eine hohe Heterozygotie (85%) mit einem begrenzten Allelgrößenbereich (0,6-5,5 kb); diese Kombination macht ihn zu einem sehr nützlichen Ort für die Analyse von Minisatelliten durch Polymerasekettenreaktion. Im allge­ meinen zeigen die variabelsten Orte einen großen Bereich von Allelgrößen, so daß viele Allele die derzeit nach diesem Verfahren verstärkbare Allelgröße überschreiten, so daß ein unvollständiges Profil erhalten wird. Im Gegensatz dazu zeigte an dem von 228B nachgewiesenen Ort eine Untersuchung von 48 nicht miteinander verwandten Personen, daß 95% der Allele kleiner als 2 kb waren und daß das größte Allel (5,5 kb) deutlich innerhalb des verstärkbaren Bereichs lag (J. Armour und A. Jeffreys, unveröffentlicht). Wir haben damit sogar die Aussicht auf ein vollständiges und daher in nützlicher Weise informatives Profil durch Verstärkung an einem einzigen Ort gezeigt.
In weniger als 6,5 kb der Flankierungssequenz haben wir sieben verteilte Wiederholungselemente gefunden (vier A1u-Elemente, ein L1-(Kpn), ein retrovirales LTR und eine in jüngerer Zeit beschriebene kurze eingeschobene Wiederholung). Obwohl lokale Veränderungen auftreten, würde man das Auf­ treten eines A1u-Elements alle 5-6 kb und ein L1 alle 30 kb in humaner DNA erwarten. Somit suggeriert bereits die Häufig­ keit von A1u- und L1-Elementen einen Überschuß an verteilten Wiederholungen in der Nähe von Minisatelliten. Interessanter­ weise wurde eine ähnlich hohe Häufigkeit von verteilten Wiederholungen in der nicht kodierenden DNA des humanen Gewebeplasminogenaktivator-(t-PA)-Gens beschrieben, bei dem 28 vollständige oder teilweise A1u-Elemente und ein teilweises L1-Element in 36,6 kb zu erkennen war, zusammen mit einem beträchtlichen Block (570 bp) einer 5 pb-Tandem­ wiederholung.
Ähnliche Experimente mit proterminalen Minisatelliten λMS8 und λMS32 sowie mit interstitiellen Sonden λMS1 und λMS31 lieferten keinen Beweis für eine Restriktionsfragmentlängen­ heterozygotie in einer DNA in der Nachbarschaft eines jeden Minisatelliten des einzelnen untersuchten Individuums.
Die Lokalisierung von 4 von 6 hypervariablen Minisatelliten in terminalen G-Banden von humanen Autosomen durch in situ- Hybridisierung ist eine statistisch signifikante Abweichung von einer statistischen Verteilung, die gestützt wird durch die Häufung von 26-32% in Silberkörnern an Telomeren nach der in situ-Hybridisierung mit den Multilocus-Sonnen 33.6 und 33.15. Der exakte Anteil von hypervariablen Minisatelliten, die für proterminale Bereiche kartieren, ist nicht bekannt, genauso wie ihre physikalische Lokalisierung bezüg­ lich Telomerer.
Es gibt andere Beispiele für hypervariable Orte, die in terminalen G-Banden kartieren, wozu der c-HA-ras¹ 3′ hyper­ variable Bereich (HVR) bei 11p15.6 (6) und der kreuz­ hybridisierende Minisatellit VTR4.1 bei 10q26 (30), der Insulin 5′ HVR bei 11p15.5 (5), der durch die Sonde CR1 S194 bei 7q36 (31) nachgewiesene Ort sowie der schwere Immun­ globulinketten-JH 5′-HVR bei 14a32.3 (32) gehören. In ähnlicher Weise wies der einzige hoch variable Ort, der in einer statistischen Sammlung von Chromosom 5-DNA-Segmenten identi­ fiziert wurde, wiederum eine Kartierung in terminalen G-Banden des kurzen Arms auf (33, 34). In jüngerer Zeit hat eine vorläufige Kopplungskarte des menschlichen Genoms ge­ zeigt, daß ein signifikanter Anteil (11/28) von Orten mit Heterozygotien <70% ebenfalls innerhalb der terminalen 5% von autosomalen Kopplungskarten auftreten (35); die cytogenetische Lokalisierung der meisten dieser hyper­ variablen Orte ist jedoch nicht bekannt. Auch wenn es eine bevorzugte terminale Lokalisierung von Minisatelliten gibt, so gibt es doch auch Beispiele für interstitielle Lokali­ sierungen, die D1S7 und D1S8 (dieser Veröffentlichung), D14S1 bei 14q32.1-32.2 (3), die drei HVRs im α-Globingen­ cluster, die bei einer Feinstrukturkartierung bei 16p13.1 (36) liegen, sowie der 3′ HVR für AT-reiches Typ II-Kollagen bei 12q13.1-14.3 (7) umfassen. Im Gegensatz zum Menschen weisen wenigstens 8 von 13 hypervariablen Minisatelliten- Orten, die in Mäuse DNA-Fingerprints nachgewiesen wurden, eine interstitielle Kartierung auf (14). Es ist noch nicht klar, ob das einen signifikanten Unterschied der Minisatelliten­ verteilung zwischen den beiden Arten bedeutet.
Humane Minisatelliten sind nicht nur vorzugsweise in termi­ halen G-Banden lokalisiert, sondern für diese Bereiche besteht auch eine hohe Wahrscheinlichkeit für einen Reichtum an Minisatelliten-Anhäufungen. So enthält der Minisatelli­ tenklon λMS43 zwei eng gekoppelt, jedoch unterschiedliche Minisatelliten, die die Produkte unabhängiger Verstärkungs­ ereignisse zu sein scheinen. In ähnlicher Weise ist ein hoch variabler Bereich 2 kb von dem hypervariablen Ort D7S22 entfernt, der durch pλg3 nachgewiesen wird. Diese proterminale Häufung von autosomalen Minisatelliten erinnert an den proterminalen pseudoautosomalen Paarungsbereich der Geschlechtschromosomen von Menschen und Mäusen, die eben­ falls eine hohe Dichte von hypervariablen DNA-Sequenzen (37-39) enthalten, von denen wenigstens einige Tandemwieder­ holungs-Minisatelliten (38) sind und von denen eines, DXYS14, sehr nahe an dem Telomeren (25) angeordnet ist. Das sugge­ riert eine gewisse Ähnlichkeit der Organisation der Protermini von autosomalen und Geschlechtschromosomen.
Es wurde vorgeschlagen, daß die Rumpfsequenzen, die von vielen humanen GC-reichen Minisatelliten geteilt werden, daran beteiligt sein könnten, ein ungleiches Crossing­ over an hypervariablen Orten (11) zu fördern, eine Ansicht, die durch die Anwesenheit einer rumpfverwandten Sequenz am oder in der Nähe eines meiotischen Rekombinations-Hotspots im Maus E β-MHC-Gen unterstützt wird (40). Es ist daher interessant, daß bei der männlichen Meiose des Menschen die Verteilung sowohl von Chiasmen (41, 42) als auch der Rekombinationsknoten, die mit den Synaptinemal-Komplexen (43) assoziiert sind, eine ähnliche bevorzugte Lokalisierung in proterminalen Bereichen von humanen Autosmomen zeigt. Ein noch direkterer Beweis für die Rekombinations- Tüchtigkeit von proterminalen Bereichen ergibt sich aus der Beobachtung einer Kopplungskarten­ ausdehnung über den pseudoautosomalen Bereich der mensch­ lichen Geschlechtschromosomen bei der männlichen, jedoch nicht weiblichen Meiose (37), sowie der terminalen Kopp­ lungskartenausdehnung, die evident ist bei der Nematode Caenorhabditis elegans (44), bei Drosophila melanogaster (45, 46) und vorläufig den humanen Chromosomen 10 und 21 (35). Beim Menschen gibt es auch Beispiele für eine autosomale terminale Kopplungskartenausdehnung, die vorzugsweise bei der männlichen Meiose auftritt (35, 47), die vermutlich einen Unterschied in der Häufigkeit der terminalen Rekombi­ nationsereignisse bei der männlichen und weiblichen Meiose widerspiegelt, analog zu der, die im pseudoautosomalen Paarungsbereich der Geschlechtschromosomen zu sehen ist. Hyper­ variable Minisatelliten können eine sehr hohe Mutationsrate zu Allelen mit einer neuen Länge (48) zeigen, was mit dem Vorschlag konsistent ist, daß Minisatelliten Rekombinations- Hotspots darstellen (11). Die Versuchung ist daher groß, die Rekombinationstüchtigkeit der proterminalen Bereiche mensch­ licher Chromosomen mit der hohen Dichte von Minisatelliten in diesen Bereichen zu assoziieren. Hoch instabile Mini­ satelliten sind jedoch nicht ausschließlich in terminalen G-Banden lokalisiert, und in der Tat zeigen die beiden instabilsten humanen Minisatelliten, die bisher identifiziert werden konnten, D1S7 und D1S8 (48, I. Patel und A. Jeffreys, unveröffentlichte Ergebnisse) beide eine interstitielle Lokalisierung. Die Beziehung zwischen Minisatelliten und proterminaler Rekombination bleibt daher unklar, mit der Möglichkeit, daß proterminale Minisatelliten als ein Neben­ produkt einer generell verstärkten Rekombination in der Nähe der Chromosomentermini entstehen, statt daß sie direkt an der Rekombination und/oder Synapsis in diesen Bereichen beteiligt sind.
Hoch informative und regional lokalisierte Markerorte, wie die in dieser Veröffentlichung beschriebenen, stellen wesent­ liche Ankerorte für die Konstruktion von genauen mensch­ lichen Kopplungskarten dar, die zu cytogenetischen Karten in Beziehung gesetzt werden können. Darüber hinaus gewähr­ leistet die proterminale Anordnung vieler Minisatelliten, daß eine terminale Kartenausdehnung nicht zu markerarmen Bereichen der menschlichen Kopplungskarte führt, wie das bei C. elegans (44) zu sehen ist. Terminale hypervariable Marker sind auch ideal geeignet, den Markerverlust in Tumoren nachzuweisen, insbesondere wenn dieser durch mitotische Rekombination entsteht, die zu einer Homozygotisierung aller Marker distal zu dem Rekombinationspunkt führt (49). Es bleibt abzuwarten, ob auch ausreichend hoch informative interstitielle Orte existieren, die die Konstruktion von hoch auflösenden Kopplungskarten auf Minisatelliten­ basis des humanen Genoms zu einer gangbaren Möglichkeit machen.
Literaturliste
1. Botstein, D., Skolnick M., White R.L. & Davis, R.W. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32, 314-331.
2. Wyman, A.R. & White, R. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77, 6754-6758.
3. Balazs, I., Purrello, M., Rubinstein, P., Alhadeff. B. & Siniscalco, M. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 79, 7395-7399.
4. Mulholland, J. & Botstein, D. (1986) A. J. Hum. Genet. 39, A226 abstract.
5. Bell, G.I., Selby, M.J. & Rutter, W.J. (1982) Nature (London) 295, 31-35.
6. Capon, D.J., Chen, E.Y., Levinson, A.D., Seeburg, P.H. & Goedel, D.V. (1983) Nature (London) 302, 33-37.
7. Stoker, N.G., Cheah, K.S.E., Griffin, J.R., Pope, F.M. & Solomon, E. (1985) Nucl. Acid Res. 13, 4613-4622.
8. Proudfoot, N.J., Gil, A & Maniatis, T. (1982) Cell 31, 553-563.
9. Goodbourn, S.E.Y., Higgs, D.R., Clegg, J.B. & Weatherall, D.J. (1983) Proc. Natl. Acad Sci. USA. 80, 5022-5026.
10. Jarman, A.P., Nicholls, R.D., Weatherall, D.J., Clegg, J.B. & Higgs, D.R. (1986) EMBO J. 5, 1857-1863.
11. Jeffreys, A.J., Wilson, V. & Thein, S.L. (1985) Nature (London) 314, 67-73.
12. Jeffreys, A.J. Wilson, V. & Thein, S.L. (1985) Nature (London) 316, 76-79.
13. Jeffreys, A.J., Wilson, V., Thein, S.L. Weatherall, D.J. & Ponder, B.A.J. (1986) Am. J. Hum. Genet. 39, 11-24.
14. Jeffreys, A.J., Wilson, V., Kelly, R., Taylor, B.A. & Bulfield, G. (1987) Nucl. Acid Res. 15, 2823-2836.
15. Wong. Z., Wilson, V., Jeffreys, A.J. & Thein. S.L. (1986) Nucl. Acid Res. 14, 4605-4616.
16. Wong, Z., Wilson, V., Patel, I., Povey, S. & Jeffreys, A.J. (1987) Ann. Hum. Genet. 51, 269-288.
17. Nakamura, Y., Leppert, M., O′Connell, P., Wolff, R., Holm, T., Culver, M., Martin, C., Fujimoto, E., Hoff, M., Kumlin, E & White, R. (1987) Science 235, 1616-1622.
18. Yang, R.C. - A., Lis, J. & Wu, R. (1979) Meth. Enzymol. 68, 176-182.
19. Feinberg, A.P. & Vogelstein, B. (1984) Anal. Biochem. 137, 266, 267.
20. Lin, C.C., Draper, P.N. & DeBrackeleer, M. (1985) Cytogenet. Cell Genet. 39, 269-274.
21. Royle, N.J., Irwin, D.M. Koschinsky, M.O., MacGillivray, R.T.A. & Hamerton, J.L. (1987) Som. Cell Mol. Genet. 13, 285-292.
22. Harper, M.A. & Saunders, G.F. (1981) Chromosoma 83, 431- 439.
23. Church, G.M. & Gilbert, W. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81, 1991-1995.
24. Vassart, G., Georges, M., Monsieur, R., Brocas, H., Lequarre, A.S. & Christophe, D. (1986) Science 235, 683-684.
25. Cooke, H.J., Brown, W.R.A. & Rappold, G.A. (1985) Nature (London) 317, 687-692.
26. Vieira, J. & Messing, J. (1982) Gene 19, 259-268.
27. Yanis-Perron, C., Vieira, J. & Messing, J. (1985) Gene 33, 103-119.
28. Sanger, F., Nicklen, S. & Coulson, A.R. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 74, 5463-5467.
29. Biggin, M.D., Gibson, T.J. & Hong, H.F. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80, 3963-3965.
30. Colb. M., Yang-Feng. T., Franke, U., Mermer, B., Parkinson, D.R. & Krontiris, G. (1986) Nucl. Acid Res. 14, 7929-7937.
31. Barber, D., Green, P., Knowlton, R., Schumm, J., Lander, E., Oliphant, A., Willard, H., Akots, G., Brown, V., Gravius, T., Helms, C., Nelson, C., Parker, C., Rediker, K., Rising, M., Watt, D., Weiffenbach, B. & Donis-Keller, H. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84, 8006-8010.
32. Silva, A.J., Johnson, J.P. & White, R.L. (1987) Nucl. Acid Res. 15, 3845-3857.
33. Overhauser, J., McMahan, J. & Wasmuth, J.J. (1987) Nucl. Acid. Res. 15, 4617-4627.
34. Overhauser, J., Beaudet, A.L. & Wasmuth, J.J. (1987) Nucl. Acid. Res. 15. 1345.
35. Donis-Keller, H., Green, P. Helms, C., Cartinhour, S., Weiffenbach, B., Stephens, K., Keith, T.P. Bowden, D.W. Smith, D.R. Lander, E.S., Botstein, D., Akots, G., Rediker, K.S., Gravius, T., Brown, V.A., Rising, M.B., Parker, C., Powers, J.A. Watt, D.E., Kauffman, E.R., Bricker, A., Phipps, P., Muller-Kahle, H., Fulton, T.R., Ng, S., Schumm, J.W., Braman, J.C., Knowlton, R.G., Barker, D.F., Crooks, S.M., Lincoln, S.E., Daly, M.J. & Abrahamson, J. (1987) Cell 51, 319-337.
36. Nicholls, R.D., Jonasson, J.A., McGee, J.O., Patil, S., Ionasescus, V.V., Weatherall, D.J. & Higgs, D.R. (1987) J. Med. Genet. 24, 39-46.
37. Rouyer, F., Simmler, M.C. Johnsson, C., Vergnaud, G., Cooke, H.J. & Weissenbach, J. (1986) Nature (London) 319, 291-295.
38. Simmler, M.C., Johnson, C., Petit, C., Rouyer, F., Vergnaud, G. & Weissenbach, J. (1987) EMBO J. 6, 963-969.
39. Gartler, S.M. & Jaenisch, R. (1987) Mouse Newsletter 79, 69 abstract.
40. Steinmetz, M., Stephan, D. & Lindahai, K.F. (1986) Cell 44, 895-904.
41. Hulten, M. (1974) Hereditas 76, 55-78.
42. Laurie, D.A. & Hulten, M.A. (1985) Ann. Hum. Genet. 49, 203- 214.
43. Solari, A.J. (1980) Chromosoma 81, 307-314.
44. Herman, R.K. (1987) Genetics. In the Nematode Caenorhabditis elegans, ed. W.B. Woods (Cold Spring Harbor, New York) in press.
45. Morton, N.E. Rao, D.C. & Yee, S. (1976) Heredity 37, 405-411.
46. Lindsley, D.L. & Sandler, L. (1977) Phil. Trans. Roy. Soc. Ser. B. 277, 295-312.
47. White, R., Leppert, M., Bishop, D.T., Baker, D., Berkowitz, J. Brown, C., Callahan, P., Holm, T. & Jeromiuski, L. (1985) Nature (London) 313, 101-105.
48. Jeffreys, A.J., Royle, N.J., Wilson, V. & Wong, Z. (1987) Nature (London) in press.
49. Cavenee, W.K., Dryja, T.P., Phillips, R.A., Benedict, W.F., Godbout, R., Gallie, B.L., Murphee, A.L., Strong, L.C. & White, R.L. (1983) Nature (London) 305, 779-784.
50. Royle, N.J., Clarkson, R.E., Wong, Z. and Jeffreys, A.J. (1988) Genomics 3, 352-360.
51. Gill, P., Jeffreys, A.J. and Werrett, D.J. (1985) Nature 318, 577-579.
52. Tabor, S. and Richardson, C.C. (1987) Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 84, 4767-4771.
53. Peterson, M.G. (1988) Nucleic Acids Res. 16, 10915.
Tabelle 1
Lokalisierung von hypervariablen Minisatelliten durch in situ-Hybridisierung
Tabelle 2
Verteilung von Silberkörnern über menschliche Chromosomen im Anschluß an die in situ-Hybridisierung mit Multilocus-DNA-Fingerprintsonden
Tabelle 3
Eigenschaften von Minisatellitenorten, die von ortsspezifischen Klonen nachgewiesen wurden
Erläuterungen zu den Figuren
Es zeigen:
Fig. 1: Zwei Metaphasenzellen mit Silberkörnern nach der in situ-Hybridisierung mit λMS43 und λMS31. Pfeile bezeichnen Silberkörner bei 12q24.3-qter und 7p22-pter nach in situ-Hybridisierung von λMS43 mit D12S11 bzw. λMS32 mit D7S21.
Fig. 2: Histogramme der Silberkornverteilung über G-Banden­ humanen Chromosomen nach der in situ-Hybridisierung mit den Sonden λMS1, λMS32, λMS31, pλg3, λMS43 und λMS8, was zu Lokalisierungen zu 1p33-p35, 1q42-q43, 7p22-pter, 7q36-qter, 12q24.3-qter und 5q35-qter führt.
Fig. 3. Der humane Minisatellitenklon MS43 enthält zwei variable Minisatelliten. A. Der 8,3 kb Sau3A-Einschub in λMS43 (16) in die BamHI-Stelle von pUC13 (26) wurde subkloniert, und durch detaillierte Restriktionskartierung analysiert; Minisatelliten (ausführliche Rechtecke) und AluI- Schnittstellen   sind gezeigt. Ein 1,5 kb AluI-Fragment, das den zweiten Minisatelliten MS43B enthielt, wurde in die SmaI-Stelle von M13mp19 (27) subkloniert, und die Minisatelliten- Wiederholungseinheit durch Dideoxynucleotidsequenzierung (28, 29) ermittelt. Die Wiederholungseinheiten des überwiegenden hypervariablen Minisatelliten MS43A wurden bereits berichtet (16). B. ³²p-markiertes AluI-Fragment, das MS43B enthielt, dient als ortsspezifische Sonde, wenn es mit AluI-Verdauungsbruchstücken von humaner DNA hybridisiert wird. Der nachgewiesene Minisatellitenort zeigt eine Variabilität bei den 8 nicht miteinander verwandten untersuchten Individuen. C. Die Häufigkeitsverteilung von Minisatelliten- MS43B-Allelen bei Nordeuropäern, bestimmt anhand von 29 nicht miteinander verwandten Individuen.
Fig. 4: Ein zweiter hoch variabler Ort ist in der Nähe des hypervariablen Orts D7S22, nachgewiesen durch pλg3, lokali­ siert. A. DNA-Proben von CEPH-Individuen 136201 (1) und 136202 (2) wurden mit HinfI (H), PvuII (P), BcII (B), NcoI (N) oder EcoRV (E) verdaut, über ein 0,6% Agarosegel elektrophoresiert und zum Southern-Blotting hybridisiert mit Minisatellit pλg3. Allelfragmente (0,0) in jedem Ver­ dauungsprodukt wurden durch anschließende Auftrennung des Ergebnisses von 136201 und 136202 identifiziert (nicht gezeigt). Es ist darauf hinzuweisen. daß die Allelgrößen­ unterschiede bei den P- und B-Verdauungsprodukten konsistent sind mit dem Größenunterschied von H, das nahe am Minisatelliten D7S22 (pλg3) schneidet, und daher von einer Allel­ variation bei D7S22 herrühren. Im Gegensatz dazu führt die Zunahme der Allelgröße bei den N- und E-Verdauungsprodukten zu Variationen von Allel zu Allel, was auf die Anwesenheit eines zweiten längenpolymorphen Bereichs hinweist, der bei diesen DNA-Fragmenten auftritt. B. Haplotyp-Genom-Restrik­ tionskarten für die vier Allele von 136201 und 136202, ermittelt aus den DNA-Fragmenten, die von pgg3 in dem P-, B-, N-, E- und R-(EcoRI)-Restriktionsverdauungsprodukten nach­ gewiesen wurden. Der zweite variable Ort     ist in einem P-N-Intervall lokalisiert, das 2 kb von dem pλg3-Minisatelliten (ausgefülltes Rechteck) lokalisiert ist. C. Größen­ beziehung zwischen der Größe des zweiten variablen Ortes, definiert durch die Länge des P-N-Intervalls, und der Länge des pλg3-Minisatelliten, wie anhand von 21 statistisch aus­ gewählten kaukasischen Haplotypen ermittelt wurde.
Fig. 5: Charakterisierung von pMS228. (A) DNA von einer Familiengruppe [F=Vater, M=Mutter, S=Sohn, D=Tochter], verdaut mit AluI und sondiert mit pMA228. Beide stark und schwach hybridisierenden Allele sind zu erkennen; die starken und schwachen Allele, die bei den Kindern gemeinsam als gekoppelte Paare konsegregiert werden, sind bei den Eltern in Klammern gezeigt. (B) AluI Allelgrößenverteilungen von 228A und 48 (228B) nicht miteinander verwandten Individuen von CEPH-Verwandten. In den Histogrammen werden die Allele der 0,25 kb-Größenklasse zugeordnet; da jede Größenklasse viele auflösbare Allele enthalten kann, beträgt die Anzahl der Allele an jedem Ort sehr viel mehr als die Anzahl der gezeigten Klassen. (C) Die Struktur des Plasmidklons pMS228. Rechteckige Bereiche stellen die Minisatellitenbereiche dar, unter denen die entsprechenden Wiederholungseinheits­ sequenzen gezeigt werden. 228A weist die stärker hybridi­ sierenden Banden nach, 228B die schwächeren Banden bei der hoch stringenten Hybridisierung von humaner DNA. R steht dabei für A oder G.

Claims (15)

1. Verfahren zur Ermittlung der Anwesenheit eines Gen­ orts variabler Länge in einer DNA-Sequenz mit wenigstens einem bekannten Genort, wobei das Verfahren umfaßt
das Identifizieren von äquivalenten Punkten an gegenüberliegenden Enden einer jeden derartigen Nucleotid- Sequenz bei zwei oder mehr nicht-identischen DNA-Nucleotid­ sequenzen, wobei jede dieser Sequenzen den zu ermittelnden Genort variabler Länge sowie den bekannten Genort umfaßt, sowie
Feststellen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Genorts variabler Länge durch Vergleich der jeweiligen Abstände zwischen den äquivalenten Punkten.
2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der bekannte Ort ein Minisatellitenbereich ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem der Ort variabler Länge ein informativer Ort in der in dieser Anmeldung definierten Bedeutung dieses Begriffs ist.
4. Verfahren nach irgendeinem der vorausgehenden Ansprüche, bei dem die nicht-identischen DNA-Nucleotidsequenzen kloniertes Material sind.
5. Verfahren nach irgendeinem der vorausgehenden Ansprüche, bei dem die nicht-identischen DNA-Nucleotidsequenzen vervielfacht werden und die Längen der vervielfachten Produkte verglichen werden, um dadurch das Vorliegen oder das Fehlen eines Orts variabler Länge festzustellen.
6. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die äquivalenten Punkte durch Schnittstellen definiert sind und bei dem eine Proben-DNA unter Bildung der nicht-identischen DNA-Nucleotidsequenzen geschnitten wird und bei dem dann die Anwesenheit oder das Fehlen eines Orts variabler Länge dadurch festgestellt wird, daß man die Längen der geschnittenen nicht-identischen DNA-Nucleotidsequenzen vergleicht.
7. Eine Nucleotidsequenz, die in der Lage ist, durch Hybridisierung einen DNA-Bereich oder -Ort zu identifizieren, der durch das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6 ermittelt wird.
8. Nucleotidsequenz nach Anspruch 7, die zu wenigstens 70% zu dem DNA-Bereich oder -Ort komplementäre Nucleotide aufweist.
9. Nucleotidsequenz, die in der Lage ist, durch Hybri­ disieren einen der DNA-Minisatelliten pMS228A, pMS228B, MS43B oder denjenigen DNA-Minisatelliten zu identifizieren, der dadurch gekennzeichnet ist, daß er zwischen den dem Ort des Minisatelliten pλg3 nächsten Restriktionsendonuclease- Stellen NcoI und PvuII angeordnet ist.
10. Nucleotidsequenz mit wenigstens acht aufeinander­ folgenden Nucleotiden, die aus der Sequenz ausgewählt sind oder Tandemwiederholungen davon oder dazu komplementäre Sequenzen.
11. Nucleotidsequenz mit wenigstens acht aufeinander­ folgenden Nucleotiden, die aus der Sequenz ausgewählt sind, wobei R für A oder G steht.
12. Nucleotidsequenz mit wenigstens acht aufeinander­ folgenden Nucleotiden, die aus der Sequenz ausgewählt sind oder Tandemwiederholungen davon oder dazu komplementäre Sequenzen.
13. Eine Polynucleotidsonde, die eine Nucleotidsequenz nach irgendeinem der Ansprüche 7 bis 12 in Verbindung mit einem Label- oder Markierungsbestandteil aufweist.
14. Die Verwendung einer Nucleotidsequenz nach irgend­ einem der Ansprüche 7 bis 12 oder einer Sonde nach Anspruch 13 zur Diagnose eines genetisch vererbten Leidens oder Krebses.
15. Verwendung einer Nucleotidsequenz nach irgendeinem der Ansprüche 7 bis 12 oder einer Sonde nach Anspruch 13 zur genetischen Charakterisierung.
DE3919169A 1988-06-10 1989-06-12 Verfahren zur ermittlung eines genorts variabler laenge in einer dna-sequenz sowie gegebenenfalls markierte nucleotidsequenzen zur identifizierung eines derartigen genorts Withdrawn DE3919169A1 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB888813781A GB8813781D0 (en) 1988-06-10 1988-06-10 Nucleotide sequences
GB898907653A GB8907653D0 (en) 1989-04-05 1989-04-05 Polynucleotides

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE3919169A1 true DE3919169A1 (de) 1989-12-21

Family

ID=26294001

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE3919169A Withdrawn DE3919169A1 (de) 1988-06-10 1989-06-12 Verfahren zur ermittlung eines genorts variabler laenge in einer dna-sequenz sowie gegebenenfalls markierte nucleotidsequenzen zur identifizierung eines derartigen genorts

Country Status (5)

Country Link
JP (1) JPH02107200A (de)
DE (1) DE3919169A1 (de)
FR (1) FR2632656A1 (de)
GB (1) GB2222252A (de)
IT (1) IT1230152B (de)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5698686A (en) * 1994-10-20 1997-12-16 Arch Development Corporation Yeast telomerase compositions

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2680520B1 (fr) * 1991-08-22 1995-09-22 France Etat Armement Procede de detection de nouvelles regions hypervariables dans une sequence d'adn, sequences de nucleotides constituant des sondes d'hybridation et leur application biologique.

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IS1355B6 (is) * 1984-11-12 1989-04-19 Lister Institute Of Preventive Medicine Fjölkjarna kannar
GB8606719D0 (en) * 1986-03-19 1986-04-23 Lister Preventive Med Genetic probes
WO1989010414A1 (en) * 1988-04-28 1989-11-02 Robert Bruce Wallace AMPLIFIED SEQUENCE POLYMORPHISMS (ASPs)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5698686A (en) * 1994-10-20 1997-12-16 Arch Development Corporation Yeast telomerase compositions
US5916752A (en) * 1994-10-20 1999-06-29 Arch Development Corporation Telomerase screening methods
US6387619B1 (en) 1994-10-20 2002-05-14 Arch Development Telomerase compositions and methods

Also Published As

Publication number Publication date
IT8920827A0 (it) 1989-06-08
GB2222252A (en) 1990-02-28
JPH02107200A (ja) 1990-04-19
GB8913350D0 (en) 1989-07-26
FR2632656A1 (fr) 1989-12-15
IT1230152B (it) 1991-10-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE3789679T2 (de) Genetische Sonden.
DE69233719T2 (de) Primer, Sätze und Restriktionsfragmente und deren Benutzung in selektiver Restriktionsfragmentenamplifikation
DE69432225T2 (de) Molekulare diagnose von familiärer adenomatöser polyposis
DE69727064T3 (de) Verfahren zum nachweis von polynucleotid-sequenzen mittels massenspektrometrie
DE68916693T2 (de) Molekular-Diagnose von Alzheimer-Krankheit.
DE69022760T2 (de) Allgemeinverfahren für die Bestätigung von Krebs.
DE69833758T2 (de) Verfahren zur erkennung von genpolymorphismen und allelexpression unter verwendung von sondenchips
DE69008179T2 (de) Bestimmung eines mutationsspektrums.
DE69535428T2 (de) Verfahren zum Auffinden von differentiel exprimierte Gene
DE69531831T2 (de) Verfahren mit einer hohen umsatzrate für das auffinden von sequenzen oder genetischen veränderungen in nukleinsäuren
DE69011101T2 (de) Methoden zur in vitro-dna-amplifikation, zum genomischen klonieren und zur genkartierung.
EP0925373B1 (de) Verfahren zum nachweis von nukleinsäuren unter ermittlung der masse
DE68909514T2 (de) Verfahren zur gleichzeitigen Bestimmung von DNS-Sequenzvariationen von zahlreichen Stellen und ein Satz dafür.
DE68909266T2 (de) Markierung durch gleichzeitige Ligation und Restriktion.
EP0438512B2 (de) Verfahren zur analyse von längenpolymorphismen in dna-bereichen
DE69219627T2 (de) Verfahren zur Bestimmung von einer Nukleinsäuresequenz
DE69003477T2 (de) Verfahren zum Nachweis von Nucleinsäuren.
DE3629190A1 (de) Verfahren zum nachweis und zur reinigung einer einzelne basenfehlpaarungen aufweisenden dna
DE3904270A1 (de) Verfahren zur markierung bestimmter chromosomen unter verwendung repetetiver rekombinations dns
DE69029113T2 (de) Verfahren zur Bestimmung von Allelen für zystische Fibrose
EP0597076A1 (de) Simultane sequenzierung von nukleinsäuren
DE3485834T2 (de) Verfahren zum bestimmen von nukleinsaeuresequenzen.
DE69022167T2 (de) Nukleinsäuresonden zum nachweis von staphylococcus aureus.
DE3879208T2 (de) Verfahren zur feststellung eines retinoblastoma-gen-defekts in tumoren, unter verwendung einer retinoblastoma-gen-probe.
EP0093948B1 (de) Doppelstrangiger Vektor und ihn verwendendes Verfahren

Legal Events

Date Code Title Description
8139 Disposal/non-payment of the annual fee