DE3886249T2 - Verfahren zur Ultrareinigung von Faktor VIII:C. - Google Patents
Verfahren zur Ultrareinigung von Faktor VIII:C.Info
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Description
- Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Abtrennen und Reinigen eines Polypeptids aus einem komplexen wäßrigen Gemisch. Speziell betrifft die Erfindung ein solches Verfahren, bei dem das das Polypeptid enthaltende Gemisch einem zwei stufigen chromatographischen Adsorptionprozeß unterworfen wird, wobei dieser Prozeß einen Antikörper-Reinigungsschritt und einen Affinitätsbereich-Reinigungsschritt aufweist.
- Seit einigen Jahren richten wissenschaftliche und medizinische Körperschaften verstärktes Augenmerk auf verschiedene Polypeptide, die als therapeutische Stoffe nützlich sind, sowie auf Verfahren zum Isolieren solcher Peptide aus den komplexen Ausgangsmaterialien, in denen sie anwesend sind. Ein Beispiel eines solchen Polypeptids ist ein aus Plasma erhaltener Blutfaktor, der als der antihämophile Faktor bekannt ist. Dieser Blutfaktor wird auch als Faktor VIII, ein die Gerinnungsaktivität förderndes Protein (Faktor VIII:C), bezeichnet. Dieses Protein ist wirksam, um den Gerinnungsdefekt bei Personen mit Hämophilie A zu korrigieren. Es existiert in Plasma, das mit einem anderen Protein einen Komplex bildet, das als Faktor VIII-assoziiertes Protein oder Faktor VIII:RP bekannt ist. Weitere Bezeichnungen für Faktor VIII:RP sind Faktor VIII=R:Ag und v. Willebrand Faktor. Wegen des therapeutischen Werts von Faktor VIII:C als Koagulans wird es als vorteilhaft angesehen, Faktor VIII zu reinigen und Faktor VIII:C aus Faktor VIII:RP zu isolieren. Es wurden verschiedene Vorgehensweisen vorgeschlagen, um Faktor VIII:C und weitere Polypeptide von therapeutischem Wert zu isolieren und zu reinigen. Diese Methoden basieren im allgemeinen auf Verfahren der Immun- Affinitäts-, der Affinitäts- oder der Ionenaustausch-Chromatographie. Beispielsweise verwendet die Methode in einem neueren Patent zur Ultrareinigung von Faktor VIII:C, Zimmerman & Fulcher, US-Reissue-Patent 32011, ein solches Zweistufenverfahren der Affinitäts- und Ionenaustausch- Chromatographie. Im wesentlichen wird ein Faktor-VIII- Präparat durch eine Säule geleitet, die Agarosekügelchen enthält, die mit monoklonalen Maus-Antikörpern gekoppelt sind, die auf Faktor VIII:RP gerichtet sind. Der Faktor VIII:C, der mit dem von Willebrand Faktor komplexiert ist, wird an der Matrix adsorbiert, während nichtkomplexierte Faktor VIII:C-Anteile und Verunreinigungen als ungebundenes Material durch die Säule gehen. Der Faktor VIII:C wird aus dem gebundenen von-Willebrand/Antikörper-Komplex mit einer hochsalzhaltigen Lösung, die Calcium enthält, entfernt. Die Faktor VIII=C-Lösung wird entsalzt und schließlich an einer Ionenaustauschsäule adsorbiert, insbesondere an Agarosekügelchen, die mit positiv geladenen Aminohexylgruppen gekoppelt sind. Der Faktor VIII:C wird aus der Säule mit einer hochsalzhaltigen Lösung desorbiert.
- Diese Methode eignet sich zwar zur Anwendung bei der Ultrareinigung eines Polypeptids, sie weist jedoch einige wichtige Merkmale nicht auf, die die therapeutische Sicherheit des Produkts verbessern und seine großtechnische Erzeugung erleichtern würden. Ein besonderes Merkmal des Reissue- Patents von Zimmerman et al. besteht darin, daß die monoklonalen Antikörper auf ein anderes Polypeptid (auf den von Willebrand Faktor) gerichtet sind, das gewöhnlich im Überschuß vorliegt und als mit dem interessierenden Polypeptid (Faktor VIII:C) assoziiert angesehen wird. Je nach dem Ausgangsmaterial ist es möglich, daß bis zu 50% von Faktor VIII:C in einer Form vorliegt, die mit von Willebrand Faktor nicht assoziiert ist. Siehe Amphlett et al., US-PS 4 508 709. Der nichtassoziierte Faktor VIII:C wird von den monoklonalen Antikörpern, die bei dem oben beschriebenen Immun-Affinitätsschritt eingesetzt werden, nicht gebunden und geht somit im Reinigungsprozeß verloren. Bisher gibt es keinen bewiesenen Vorteil, Faktor VIII:C als ein Produkt nur in der nichtkomplexierten Form zu haben. Es gibt Beweise dafür, daß Faktor VIII:C durch seine Assoziierung mit dem von Willebrand Faktor vor Proteolyse geschützt ist, was ein wichtiger Faktor bei der Isolierung des Polypeptids aus komplexen Ausgangsmaterialien ist. Siehe Weiss et al., J. Clin. Invest., 60, 390-404, 1977. Daher könnte die Assoziierung des von Willebrand Faktors mit Faktor VIII=C, anstatt ein Nachteil zu sein, sogar vorteilhaft sein, insofern sie dem Faktor VIII:C während der Reinigungsschritte Stabilität verleihen und die biologische Halbwertszeit des Polypeptids während seiner therapeutischen Verabreichung verlängern kann.
- Zweitens tendieren monoklonale Antikörper, die kovalent an eine Matrix gekoppelt sind, dazu, aus ihrer Matrix auszulaugen oder sich davon zu trennen und das Polypeptid-enthaltende Endprodukt zu kontaminieren. Das vorstehend und im Stand der Technik beschriebene patentierte Verfahren schützt nicht gegen die Wahrscheinlichkeit, daß von Nichthumanzellen abgeleitete ausgewaschene monoklonale Antikörper aus dem Immun-Affinitätsschritt während des zweiten Ionenaustausch- Schritts den Faktor VIII:C begleiten und sich erneut mit ihm assoziieren. Die Pufferlösung mit hoher Ionenstärke, der bei dem Immun-Affinitätsverfahren eingesetzt wird, um Faktor VIII:C zu eluieren, wird auf niedrige Ionenstärke herabgesetzt, was es monoklonalen Antikörpern, die aus der Immun- Affinitätssäule abgetrennt wurden, erlauben könnte, sich entweder erneut an Faktor VIII:C zu binden oder gemeinsam mit dem Faktor VIII:C an die Ionenaustauschmatrix zu binden und daraus zu desorbieren.
- Drittens wird die Entsalzung, die für die das Polypeptid enthaltende Lösung benötigt wird, bevor sie auf die Ionenaustauschsäule aufgegeben wird, gewöhnlich durch großvolumige Verdünnung, Dialyse oder Ultrafiltrations-Molekularwäsche erreicht. Diese Verfahren sind für großtechnische Herstellungsvolumen nicht nur umständlich, sondern führen unweigerlich auch zu einem Produktverlust.
- Schließlich sind die wäßrigen Ausgangsmaterialien, in denen die interessierenden Polypeptide gefunden werden, häufig mit ein oder mehr Viren kontaminiert. Es gibt Techniken zur Inaktivierung von Viren in Polypeptidgemischen, aber Versuche, solche Techniken mit bekannten Polypeptid-Reinigungsverfahren zu kombinieren, haben zu Methoden mit einer Vielzahl von Schritten geführt, die für die Produktion großer Mengen ungeeignet sind. Die Methoden sind häufig auch nur teilweise erfolgreich bei der Reinigung des Polypeptids. Beispielsweise ist im Stand der Technik eine Reihe von Virus-inaktivierenden Mitteln als wirksam zur Virusinaktivierung aufgezeigt worden. Diese Mittel sind jedoch entweder denaturierend oder schwer von dem interessierenden Polypeptid zu trennen und verlangen einen besonderen Aufbereitungs- oder Abtrennschritt. Weitere herkömmliche Methoden zur Behandlung von Polypeptid enthaltenden Präparaten gegen eine potentielle Kontaminierung durch Viren wie etwa Wärme oder Bestrahlung haben entweder in einer bedeutenden Denaturierung des interessierenden Polypeptids und/oder einer ungenügenden Inaktivierung von Viren resultiert.
- Der hier beschriebene Einsatz von Virusinaktivierungsmitteln kann Viren inaktivieren, ohne die biologische Wirksamkeit des interessierenden Polypeptids zu beeinträchtigen. Die Behandlung der wäßrigen Ausgangsmaterialien mit den Virusinaktivierungsmitteln in Verbindung mit den übrigen Verfahrensschritten der Erfindung führt zu einem Endprodukt, das im wesentlichen frei von Viren sowie von Virusinaktivierungsmitteln ist.
- Es ist eine Hauptaufgabe der Erfindung, einen Reinigungsprozeß für Polypeptide anzugeben, der besonders für die großtechnische Reinigung eines Polypeptids mit nur geringer Denaturierung des Polypeptids geeignet ist. Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein Polypeptid-Reinigungsverfahren anzugeben, das außerdem wirksam ist bei der Herabsetzung der Kontaminierung des gereinigten Produkts durch Antikörper und Viren. Eine zusätzliche Aufgabe der Erfindung ist die Entwicklung eines Verfahrens zum Reinigen eines Polypeptids, das frei ist von kontaminierenden Substanzen wie anderen Proteinen, Viren und Behandlungsmitteln, die in den Reinigungsschritten eingesetzt werden.
- Gemäß der Erfindung wird ein Verfahren angegeben zur Isolierung und Reinigung von Faktor VIII:C aus einem komplexen wäßrigen Gemisch. Als Ergebnis des Verfahrens ist der Faktor VIII:C im wesentlichen frei von anderen kontaminierenden Proteinen und ist ferner im Vergleich mit seiner Reinheit in dem wäßrigen Ausgangsgemisch hochgereinigt. Eine bevorzugte Ausführungsform dieses Verfahrens ist das Einbringen einer Technik in das Verfahren, womit der Anteil an pathogenen Substanzen wie etwa Viren herabgesetzt wird. Das Verfahren weist die Reinigung von Faktor VIII:C in einem Gemisch aus Polypeptiden und anderen Bestandteilen auf, wobei das Verfahren folgendes aufweist: Unterwerfen des Faktors VIII:C in dem Gemisch einem Vielstufen-Reinigungsprozeß:
- (a) Immobilisieren eines Antikörpers, der durch hydrophobe Anziehung an den zu reinigenden Faktor VIII:C bindet, an einem Substrat vor oder nach der Zugabe des Faktors VIII:C zu dem Antikörper, wodurch der Faktor VIII:C in einer Immun-Affinitätsmatrix immobilisiert wird;
- (b) Eluieren des Faktors VIII:C aus dem immobilisierten Antikörper durch Behandeln der Faktor VIII=C-Immun- Affinitätsmatrix mit einer desorbierenden Substanz, um das Polypeptid aus der Matrix zu desorbieren;
- (c) Leiten des zu reinigenden Faktors VIII:C durch einen zweiten Bereich, der fähig ist, an den Faktor VIII:C zu binden, um dadurch den Faktor VIII:C durch hydrophile Anziehung an den zweiten Bereich zu binden, während gleichzeitig zugelassen wird, daß Verunreinigungen den zweiten Bereich passieren, wobei das Gemisch aus Faktor VIII:C und desorbierender Substanz aus der Matrix von Schritt (b) zu dem zweiten Bereich von Schritt (c) ohne weitere Modifikation dieses Gemischs geleitet wird; und
- (d) Eluieren des gereinigten Faktors VIII=C aus dem zweiten Bereich.
- Eine bevorzugte Ausführungsform weist folgendes auf: Einbauen eines virusinaktivierenden Mittels, das ein organisches Lösungsmittel und ein Detergens aufweist, in den obigen Prozeß, gefolgt von Entfernen des Lösungsmittels und des Detergens. Dies erfolgt vorteilhaft durch Reinigen von Faktor VIII:C in einem komplexen wäßrigen Gemisch, das mit lipidumhüllten Viren kontaminiert ist, durch folgende Schritte:
- (a) Vermischen des komplexen wäßrigen Gemischs mit einem virusinaktivierenden Mittel, das ein organisches lipidlösendes oder -spaltendes Lösungsmittel und ein Detergens enthält, in irgendeiner Stufe im Verfahren;
- (b) Leiten des komplexen wäßrigen Gemischs durch eine Immun-Affinitätsmatrix, die aktiven immobilisierten monoklonalen Antikörper enthält, der für Faktor VIII:C spezifisch ist und durch hydrophobe Anziehung daran bindet, wodurch bewirkt wird, daß der Faktor VIII:C an der Immun-Affinitätsmatrix adsorbiert wird;
- (c) Waschen der Immun-Affinitätsmatrix mit einer Pufferlösung, um mindestens einen Teil von Verunreinigungen aus dem komplexen wäßrigen Gemisch zu entfernen, während gleichzeitig der Faktor VIII:C an der Immun-Affinitätsmatrix adsorbiert bleibt;
- (d) Eluieren des Faktors VIII:C aus der Immun-Affinitätsmatrix mit einer Elutionssubstanz, um dadurch ein zu reinigendes Gemisch von Faktor VIII:C und Elutionssubstanz zu bilden;
- (e) Leiten des zu reinigenden Gemischs durch einen zweiten Bereich, der den Faktor VIII:C durch hydrophile Anziehung bindet, um dadurch zu bewirken, daß das Polypeptid daran bindet, während gleichzeitig zugelassen wird, daß etwaige ausgewaschenen monoklonalen Antikörper, Detergenzien und sonstigen Verunreinigungen durch den zweiten Bereich gehen, wobei das zu reinigende Gemisch aus der Matrix von Schritt (c) zu dem Bereich von Schritt
- (e) ohne weitere Modifikation des Gemischs geleitet wird; und
- (f) Eluieren des zweiten Bereichs mit einer Elutionslösung, um das Polypeptid zu desorbieren, um eine Lösung zu bilden, die im wesentlichen frei von Verunreinigungen ist.
- Die Erfindung richtet sich auf ein Verfahren zum Isolieren und Reinigen von Faktor VIII:C aus einem komplexen wäßrigen Gemisch. Nachstehend beziehen sich die Ausdrücke "interessierendes Polypeptid" und "zu reinigendes Polypeptid" auf Faktor VIII:C. Mit dem Verfahren gemäß der Erfindung kann Faktor VIII:C aus komplexen Gemischen wie Blutplasma, Plasmafraktionen, industriellen Konzentraten und Gewebekulturmedien einschließlich solcher Medien, die synthetisch erzeugte Polypeptide sowie natürlich auftretende Polypeptide enthalten, isoliert werden. Das Verfahren nach der Erfindung erzeugt Faktor VIII:C im wesentlichen frei von Verunreinigungen, die in dem Gemisch vor der Aufbereitung anwesend waren, sowie von solchen, die dem Gemisch während der nachstehend angegebenen Aufbereitungsschritte zugefügt wurden. Beispiele von Verunreinigungen umfassen pathogene Viren, sowohl lipidumhüllte als auch nichtumhüllte Viren, Pyrogene, ausgewaschene Antikörper, organische Lösungsmittel, Detergenzien, Desorptionsmittel und andere Proteine, die in dem komplexen Gemisch anwesend sind, aus dem das interessierende Polypeptid isoliert wird.
- Gemäß einer Ausführungsform des Verfahrens nach der Erfindung wird ein komplexes waßriges Gemisch, das Faktor VIII:C enthält, einem Antikörper zugefügt, der an den zu reinigenden Faktor VIII:C bindet. Zu dem Zeitpunkt, zu dem der Antikörper an das Polypeptid (Faktor VIII:C) bindet, kann der Antikörper an keine andere Matrix gebunden sein oder kann vor seiner Bindung an das Polypeptid an eine Matrix gebunden sein, die den Antikörper immobilisiert und ihn innerhalb eines vorbestimmten Bereichs fixiert. Ein bevorzugter Typ von Bereich, in dem der Antikörper fixiert sein kann, ist kugelförmiges Harz in einer Chromatographiesäule oder einer Radialdurchflußpatrone. Ungeachtet dessen, ob der Antikörper vor seiner Bindung an das Polypeptid in einem Bereich immobilisiert ist, ist es wichtig, daß der Antikörper an irgendeinem Punkt nach der Bindung von Antikörper an Polypeptid in einem immobilisierten Zustand ist.
- Der Antikörper kann jeder Antikörper sein, der fähig ist, an einer immobilisierten Matrix fixiert zu sein und an das zu reinigende Polypeptid zu binden. Sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper können verwendet werden wie auch Gemische beider Arten, die bestimmt sind, um an eine Reihe von immobilisierten Substraten oder Polypeptiden oder beide zu binden. Wegen ihrer Spezifität und leichten Verfügbarkeit in großen Mengen werden monoklonale Antikörper bevorzugt. Die Wahl des Antikörpers hängt von dem Polypeptid und dem gewählten immobilisierten Substrat ab. Die hier mit anderen bevorzugten Betriebsbedingungen anzuwendenden Antikörper sind solche, die mit dem Polypeptid durch hydrophobe Wechselwirkung zusammenwirken.
- Ein bevorzugtes Verfahren gemäß der Erfindung umfaßt das Binden des Polypeptids an einen monoklonalen Antikörper, der für das interessierende Polypeptid spezifisch ist, nachdem der Antikörper selbst in einer Immun-Affinitätschromatographiesäule immobilisiert worden ist. Das Gemisch von Polypeptiden wird durch die Immun-Affinitätschromatographiesäule geleitet, an der für das interessierende Polypeptid spezifische monoklonale Antikörper immobilisiert worden sind. Während das Gemisch die Säule oder Patrone durchsetzt, adsorbiert das Polypeptid an den immobilisierten monoklonalen Antikörpern. Die Säule oder Patrone wird mit einer wäßrigen Pufferlösung gewaschen. Die Pufferlösung entfernt einen großen Teil des virusinaktivierenden Mittels sowie weitere Verunreinigungen aus dem komplexen wäßrigen Gemisch, beläßt jedoch den an der Säule oder Patrone adsorbierten Faktor VIII:C.
- Das Polypeptid in der Säule wird mit einem Desorptionsmittel desorbiert und eluiert. Die Wahl von Desorptionsmitteln liegt im Rahmen fachmännischen Handelns. Bevorzugte Desorptionsmittel sind schwach polare gepufferte Lösungen mit geringer Ionenstärke. Geringe Ionenstärke bezieht sich gewöhnlich auf Lösung mit einer Ionenstärke u von weniger als 0,2. Beispiele von Salzlösungen mit geringer Ionenstärke umfassen 0,15 M Natriumchlorid, 1,0 mM Calciumchlorid und 40 mM Calciumchlorid. Beispiele von unpolaren Agenzien, die schwach polare Lösungen liefern, umfassen Ethylenglycol, Dioxan, Propylenglycol und Polyethylenglycol. Die Pufferlösung desorbiert das Polypeptid unter Bildung einer schwach polaren Polypeptidlösung geringer Ionenstärke.
- Die komplexen wäßrigen Gemische, die eine Quelle für Faktor VIII:C sind, sind häufig durch pathogene Viren kontaminiert, insbesondere durch lipidumhüllte Viren wie das Hepatitis-B- Virus, Non-A-non-B-Hepatitis-Virus und HIV-Virus (HTLV-III- Virus). In den umfassendsten Anwendungsfällen der Erfindung, der Immun-Affinitätsreinigung in Kombination mit der Affinitätsreinigung, werden erhebliche Mengen von Virus entfernt. Wenn eine der bevorzugten Ausführungsformen angewandt wird, indem das Polypeptid mit einem organischen Lösungsmittel und Detergens behandelt wird, werden die Anteile von lipidumhüllten Viren gewöhnlich unter einen nachweisbaren Anteil herabgesetzt. Die wirksamen Komponenten dieser Behandlung sind die organischen Lösungsmittel und das Detergens. Organische Lösungsmittel sind solche, die beim Lösen oder Spalten der lipidhaltigen Umhüllung, die viele Viren umgibt, aktiv sind und das zu reinigende Polypeptid nicht denaturieren. Beispiele umfassen Di- und Trialkylphosphate wie etwa Di-(n-propyl)phosphat und Tri-(n-butyl)phosphat, Ether wie Ethylether und Propylether, Ester wie Amylacetat sowie alkylierte und hydroxylierte Materialien wie etwa butyliertes Hydroxyanisol (BHA) und butyliertes Hydroxytoluol (BHT). Gemische der vorstehenden oder anderer organischer Lösungsmittel sind ebenfalls einsetzbar. Ethylalkohol und Ethylether haben sich ebenso wie die Alkylphosphate als besonders akzeptabel erwiesen.
- Hier einsetzbare Detergenzien können aus jeder der anerkannten Gruppen von anionischen, kationischen und nichtionischen Detergenzien ausgewählt werden. Beispiele umfassen eine Reihe von sulfatierten Alkoholen und sauren Natriumsalzen wie sulfatiertes oxyethyliertes Alkylphenol (Triton W-30 und Triton X-100), Natriumdodecylbenzolsulfonat (Nacconol NR), Natrium-2-sulfoethyloleat (Igepon A), Natriumcholat, Natriumdeoxycholat, Natriumdodecylsulfonat, Dodecyldimethylbenzylammoniumchlorid (Triton K-60), oxyethylierte Amine (Ethomeen), N-Dodecylaminoethansulfonsäure, Ethylenoxid- Propylenoxid-Kondensate (Pluronic-Copolymere), polyoxyethylierte Derivate von Estern (Tween 80 und Polysorbat 80), Polyoxyethylenfettalkoholether (Brij 35), Nonidet P-40 und Lubrox PX.
- The Mengen von organischem Lösungsmittel und Detergens, die bei der praktischen Durchführung der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung eingesetzt werden, können in Abhängigkeit von dem aufzubereitenden wäßrigen Gemisch sowie von dem gewählten Lösungsmittel oder Detergens verschieden sein. Wenn Ether oder Alkohole oder Gemische davon eingesetzt werden, kann die Menge von 1-50 Gew.-%, bevorzugt von ca. 5 bis 25 Gew.-% des wäßrigen Gemischs betragen, wenn dieses Gemisch Blutplasma oder Blutzusammensetzungen ist. Die Alkylphosphate werden in Konzentrationen von 0,01 mg/ml aufbereitetem Gemisch bis 1,0 g/ml, bevorzugt zwischen ca. 0,1 mg/ml und 10 mg/ml, eingesetzt. Die Menge des eingesetzten Detergens oder Netzmittels ist nicht kritisch. Seine Funktion besteht darin, den Kontakt zwischen dem organischen Lösungsmittel und dem Virus zu verbessern. Bei vielen der hier einsetzbaren nicht ionischen Materialien kann das Netzmittel 0,001% bis 10%, bevorzugt 0,01-2% des wäßrigen Gemischs betragen, und zwar in Abhängigkeit von der Menge von Fettmaterial in dem aufbereiteten wäßrigen Gemisch. Die Mengen von Lösungsmittel und Detergens ändern sich auch in Abhängigkeit voneinander, von dem aufzubereitenden wäßrigen Gemisch und dem zu reinigenden Polypeptid.
- Der Stand der Technik lehrt die Zugabe von organischen Lösungsmitteln und Detergenzien zu konzentrierten Polypeptidlösungen, um lipidumhüllte Viren zu zerstören und zu inaktivieren, während gleichzeitig die Proteinstruktur des gewünschten Polypeptids bewahrt wird. Siehe US-PS 4 540 573. Organische Lösungsmittel, die entweder Tween-80 oder Triton X-100 enthalten, haben sich als wirkungswolle Reagenzien erwiesen, um Viren zu töten, die in konzentrierten Lösungen bestimmter Proteine gefunden werden, ohne daß sie die Bioaktivität der Proteine nachteilig beeinflussen. Der Einsatz von solchen Lösungemittel/Detergens-Gemischen wird jedoch vermieden, weil das anschließende Entfernen des Gemischs aus dem konzentrierten Protein sich als sehr schwierig erwiesen hat. Siehe beispielsweise A.M. Prince et al., Lancet, 5.706, 29. März 1981. Daher werden andere Detergenzien wie etwa Natriumcholat oder Natriumdeoxycholat häufiger eingesetzt. Diese Detergenzien können von dem interessierenden Polypeptid durch Gel-Ausschlußchromatographie beispielsweise an Sephadex G-25 entfernt werden. Ein Nachteil beim Einsatz dieser Detergenzien ist jedoch, daß sie starke Proteindenaturierungsmittel sind, die die Bioaktivität des Polypeptids nachteilig beeinflussen können. Solche Detergenzien können im vorliegenden Fall in Mengen eingesetzt werden, die das zu reinigende Polypeptid nicht denatuurieren, und zwar entweder in Kombination mit anderen Detergenzien oder mit Proteinstabilisatoren oder mit beiden.
- Die Nachteile der Methoden des Stands der Technik werden durch die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung überwunden. Die Erfindung gibt eine Möglichkeit an zum effektiven Entfernen von virusinaktivierenden Reagenzien aus dem interessierenden Polypeptid, wodurch das Hindernis gegen den Einsatz von Detergenzien wie Tween 80 und Triton X-100 mit einem organischen Lösungsmittel überwunden wird. Bei dem Verfahren nach der Erfindung werden die virusinaktivierenden Mittel dem komplexen wäßrigen Material zugesetzt, das das interessierende Polypeptid enthält. Wie noch im einzelnen beschrieben wird, kann das Gemisch dann direkt auf eine Matrix aufgebracht werden, die für das Polypeptid spezifische, aktive immobilisierte monoklonale Antikörper enthält. Das Polypeptid wird an der Matrix adsorbiert, und die antiviralen Reagenzien können durch gründliches Auswaschen der Matrix entfernt werden.
- Die Matrix kann eine Immun-Affinitätschromatographiesäule sein, die eine feste Trägermatrix enthält, an die aktive monoklonale Antikörper, die fähig sind, spezifisch Faktor VIII:C zu adsorbieren, gekoppelt sind. Der monoklonale Antikörper kann dem Harzträger zugesetzt werden, der häufig mit einem Aktivator wie Bromcyan aktiviert worden ist. Der Träger wird nach herkömmlichen Verfahren hergestellt und kann beispielsweise Agarosekügelchen, Cellulose-, Nylon- oder Polyvinylmembranen aufweisen. Wie oben erwähnt, hat die Immun-Affinitätsmatrix gewöhnlich die Form einer chromatographischen Säule oder Patrone. Die Herstellung solcher Säulen und Patronen liegt im Rahmen des fachmännischen Könnens.
- Solche Säulen oder Patronen, die einen geeigneten Träger enthalten, können mit Wasser ausgespült und dann mit der gleichen Pufferlösung wie das wäßrige Gemisch, das das zu reinigende Polypeptid enthält, äquilibriert werden.
- Die Säule wird dann mit einer wäßrigen Pufferlösung ausgewaschen, um einen großen Anteil des virusinaktivierenden Mittels und weitere Verunreinigungen zu entfernen, die nichtspezifisch an die monoklonale Antikörpermatrix oder an das Polypeptid gebunden sein können, ohne daß das an der Säule adsorbierte Polypeptid eluiert wird.
- Der Stand der Technik, D.M. Livingston, Methods in Enzymology, 34, 723-731 (1974), hat vorgeschlagen, daß die nichtspezifische Bindung von Verunreinigungen an das interessierende Polypeptid oder die feste Trägermatrix durch ionische Wechselwirkung dadurch minimiert werden kann, daß Lösungen oder Detergenzien mit hoher Ionenstärke eingesetzt werden. Das hat sich nicht als praktisch verwertbarer Vorschlag erwiesen, denn die Zugabe von Lösungen und/oder Detergenzien hoher Ionenstärke zu einer herkömmlichen Matrix führt häufig dazu, daß die an die Matrix gebundenen Polypeptide instabil werden, oder bewirkt eine schlechte Adsorptionsrate des Polypeptids an der Matrix.
- Bei dem vorliegenden Verfahren hat sich aber gezeigt, daß Polypeptidlösungen hoher Ionenstärke, die Detergens enthalten, keine nachteiligen Auswirkungen während des Immunadsorptionsschritts hervorrufen, wenn monoklonale Antikörper mit hydrophober Anziehung für das Polypeptid eingesetzt werden. Beispielsweise wurde gefunden, daß das Faktor VIII:C-Polypeptid aus verschiedenen Ausgangsmateriallösungen mit hoher Ionenstärke, z. B. 0,5 bis 1,5 M NaCl, an einer Immun-Affinitätsmatrix mit höherer Rate adsorbiert als im Fall von Polypeptidlösungen mit niedriger Ionenstärke, z. B. 0,15 M NaCl. Faktor VIII:C ist auch in solchen Ausgangslösungen, die ein organisches Lösungsmittel und Detergens enthalten, stabil. Wenn das komplexe wäßrige Gemisch, das das interessierende Polypeptid und die virusinaktivierenden Mittel enthält, der Säule zugegeben wird, wird das Polypeptid an der Säule und ihren Bestandteilen adsorbiert. Andere Elemente des Gemischs gehen durch die Säule.
- Nachdem die Immun-Affinitätschromatographiesäule hinreichend mit der Pufferlösung ausgewaschen wurde, so daß ein Hauptanteil der virusinaktivierenden Mittel und sonstiger Verunreinigungen aus dem an die Säule gebundenen Polypeptid entfernt worden ist, wird die Säule mit einem Agens behandelt, das das gebundene Polypeptid freisetzt. Das Agens ist vorteilhaft ein polaritätsvermindernder Puffer niedriger Ionenstärke. Es wurde gefunden, daß der Einsatz eines schwach polaren Puffers niedriger Ionenstärke zum Eluieren des Polypeptids aus der Immun-Affinitätssäule vorteilhaft ist, weil die resultierende Polypeptidlösung ohne Modifikationen einer Ionenaustausch- oder anderen Affinitätsmatrix zugefügt werden kann.
- Ein ernsthaftes Problem bei der herkömmlichen Immun-Affinitätsreinigung war bisher das Auswaschen von nichthumanen monoklonalen Antikörpern in die Polypeptid-Eluatlösung während des Eluierens. Beim Stand der Technik ist es allgemeine Praxis, den pH, die Polarität oder die Ionenstärke der eluierten Polypeptidlösung zu ändern, so daß eine ordnungsgemäße Adsorption des Polypeptids an einer Matrix eines zweiten Affinitätsbereichs stattfinden kann. Gewöhnlich genügt diese Änderung, um zu bewirken, daß die ausgewaschenen monoklonalen Antikörper entweder mit dem Polypeptid reassoziieren oder an die zweite Affinitätsmatrix gemeinsam mit dem Polypeptid binden und dadurch das Endprodukt kontaminieren. Bei dem vorliegenden Verfahren braucht jedoch die Zusammensetzung der Lösung, die das Polypeptid aus der Immun-Affinitätssäule desorbiert, nicht geändert zu werden, bevor die Ionenaustauschsäule beladen wird. Es ist monoklonalen Antikörpern, die in der Lösung anwesend sein können, daher erschwert, erneut entweder an das interessierende Polypeptid oder die zweite Affinitätsmatrix zu binden.
- Wenn die schwach polare Pufferlösung durch die Affinitätsmatrix geleitet wird, bindet das Polypeptid an die Affinitätsmatrix und die Lösung, während alle ausgewaschenen monoklonalen Antikörper, Detergenzien oder sonstigen Verunreinigungen durch die Säule gehen. Die Affinitätsmatrix ist bevorzugt eine Ionenaustauschsäule, die eine Matrix aufweist, die kovalent mit geladenen chemischen Gruppen gekoppelt ist, die fähig sind, geladene biologische Moleküle unter niedriger Ionenstärke zu binden und sie freizusetzen, wenn sich der pH oder die Ionenstärke ändern. Der Affinitäts-Adsorptionsmittelträger kann einer der gewöhnlich verwendeten Träger sein wie etwa Fasern, Kügelchen, Scheiben oder Plättchen aus vernetztem Cellulosematerial, Agarosekügelchen und dergleichen.
- Die Matrix wird dann ausgewaschen, um restliche Spuren von kontaminierenden Rückständen an dem Polypeptid zu entfernen, Das Auswaschen sollte ausreichend sein, um Verunreinigungen auf einen Anteil herabzusetzen, der für Menschen nichttoxisch ist, sowie auf einen Anteil, bei dem sie die Wirksamkeit des der Reinigung unterliegenden Polypeptids nicht beeinflussen. Die Waschlösung enthält bevorzugt die gleichen Bestandteile wie die Elutionslösung, aber mit höherem pH und/oder geringerer Ionenstärke, wenn eine Anionenaustauschmatrix mit positiv geladenen Gruppen verwendet wird. Als allgemeine Regel sollte die Elutionslösung mit einer Zusammensetzung gepuffert sein, um eine ausreichend hohe Ionenstärke und/oder niedrigen pH zu ergeben, um das Polypeptid aus einer Anionenaustauschmatrix zu desorbieren. Die Lösung muß mit dem Polypeptid kompatibel, nichttoxisch und fähig sein, die Bindung zwischen Polypeptid und Affinitätsmatrix zu zerstören.
- Die das eluierte Polypeptid enthaltende Lösung kann direkt zu einer gepufferten Lösung verdünnt werden, um ein gereinigtes Produkt zu ergeben, das zur therapeutischen Verwendung geeignet ist. Die Lösung weist charakteristisch physiologische Konzentrationen von Salzen und Humanalbumin zusammen mit nichttoxischen Reagenzien wie Aminosäuren, Acetat, Phosphat und Citrat, Imidazol, Trimethamin und dergleichen auf, die eine Pufferkapazität von ca. pH 7 ergeben.
- Das Ausgangsmaterial für das zu reinigende Polypeptid umfaßt Plasma oder aus Plasma abgeleitete Fraktionen, beispielsweise Kryopräzipitat, die zweckmäßig solubilisiert sind und das zu reinigende Polypeptid enthalten. Humanplasma oder Plasma von anderen Tieren kann ebenfalls bei der Erfindung verwendet werden. Weitere bei der Erfindung brauchbare Ausgangsmaterialien sind Human- oder Tiergewebekulturmedien, die ein Polypeptid enthalten, das durch DNA-Rekombinationstechnik erzeugt worden ist.
- Um Kryopräzipitat bei der Erfindung zu verwenden, kann das Kryopräzipitat durch Suspension in einer wäßrigen Lösung gelöst werden, die Komponenten enthält, die notwendig sind, um für die Polypeptidaktivität eine annehmbar stabile Umgebung zu schaffen. Solche Lösungsbestandteile umfassen Salze, um eine geeignete Ionenstärke aufrechtzuerhalten. Nach Suspension und gründlichem Vermischen des Kryopräzipitats in der wäßrigen Lösung ist es häufig erwünscht, unlösliches Material durch physikalische Verfahren wie Zentrifugieren oder Filtration zu entfernen. Einstellungen der Kryopräzipitatlösung, z. B. pH, Salze und PEG-Zugabe, können ebenfalls vorgenommen werden, um das Entfernen von Unlöslichem zu erleichtern. Das Ergebnis ist eine partikelfreie Lösung mit stabiler Polypeptidaktivität. Andere Ausgangsmaterialien benötigen möglicherweise keine Einstellungen.
- Ein zweiter Schritt kann die Zugabe von organischen Lösungsmitteln und Detergenzien zu der Ausgangsmateriallösung umfassen, um die Inaktivierung von lipidumhüllten Viren zu bewirken. Nach Vermischen des organischen Lösungsmittel/Detergens-Gemischs mit Ausgangsmaterial sollten Gemisch und Ausgangsmaterial ausreichend lang stehengelassen werden, um lipidumhüllte Viren zu inaktivieren. Der Zeitraum hängt von der Temperatur der Ausgangsmateriallösung ab. Ein Minimum von drei Minuten wird angewandt, wenn das Ausgangsmaterial eine Kryopräzipitatlösung ist, die 0,3% Tri-n-butylphosphat und 1,0% Triton X-100 bei einer Temperatur von 18ºC oder höher ist.
- Vor der Durchführung des Immun-Affinitätsreinigungsschritts ist es erwünscht, die Lösungsbedingungen zu optimieren, um die Adsorption des Polypeptids an der Immun-Affinitätsmatrix zu verbessern. Solche Bedingungen umfassen die Zugabe von Salzen (z. B. Natriumchlorid, Calciumchlorid) in ausreichender Konzentration, um die Assoziierung von Polypeptid mit anderen Proteinen, falls solche anwesend sind, zu zerstören. Solche Bedingungen können auch eine pH-Justierung umfassen, um die Assoziierung von Polypeptid mit anderen Proteinen zu zerstören. Im allgemeinen kann eine Vielzahl von physikalischen und chemischen Techniken angewandt werden, um die Polypeptidadsorption an der Immun-Affinitätsmatrix zu optimieren. Die jeweils gewählten Techniken sind für den Fachmann auf diesem Gebiet offensichtlich, nachdem die Eigenschaften des Antikörperpräparats und der Immun- Affinitätsmatrix bestimmt worden sind.
- Der Immun-Affinitätsreinigungsschritt des Verfahrens kann auf viele verschiedene Arten durchgeführt werden. Die Ziele dieses Schritts sind folgende: (1) Polypeptid an einer Matrix zu adsorbieren, an die zuerst Antikörper kovalent gebunden wurde, (2) nichtspezifisch gebundenes Material aus der Immun-Affinitätsmatrix auszuwaschen, um dadurch Verunreinigungen aus dem zu reinigenden Polypeptid abzutrennen, und (3) das Polypeptid aus der Immun-Affinitätsmatrix in einer im wesentlichen gereinigten Form zu eluieren. Die Polypeptid-Erkennungsstellen an den Antikörper-Molekülen sind bevorzugt immer gleich der Polypeptidkonzentration oder im Überschuß dazu, so daß eine quantitative Adsorption des Polypeptids aus der Ausgangsmateriallösung möglich ist. Wenn die Immun-Affinitätsmatrix in einer Säule enthalten ist, wird die Rate, mit der das Ausgangsmaterial aufgegeben wird, so eingestellt, daß ausreichend Zeit verfügbar ist, damit eine Polypeptidadsorption stattfindet. Wenn die Immun- Affinitätsmatrix nicht in einer Säule enthalten ist, sondern statt dessen dem Polypeptid-Ausgangsmaterial zugefügt wird, wie etwa bei einer diskontinuierlichen Reaktion, wird das Gemisch ausreichend lang gerührt, damit eine Polypeptid- Adsorption erfolgen kann. Es ist allgemeine Praxis, die Zeitdauer empirisch zu bestimmen, die bis zum Auftreten der Adsorption erforderlich ist, wenn der eine oder der andere Reaktionsablaufangewandt wird.
- Das Polypeptid wird an der Immun-Affinitätsmatrix adsorbiert, und die Immun-Affinitätsmatrix wird mit einer wäßrigen Lösung ausgewaschen, um nichtspezifisch gebundenes oder zurückgehaltenes Material aus der Matrix zu entfernen. Nichtspezifisch gebundenes oder zurückgehaltenes Material umfaßt solche Komponenten des Polypeptit-Ausgangsmaterials wie Proteine, Phospholipide, Salze, organisches Lösungsmittel, Detergens und Pyrogene oder Viruspartikel, falls letztere gegenwärtig sind. Die Zusammensetzung der wäßrigen Waschlösung ist derart, daß sie die Abtrennung des vorgenannten nichtspezifisch gebundenen oder zurückgehaltenen Materials aus der Immun-Affinitätsmatrix bewirkt, um Polypeptid an der Immun-Affinitätsmatrix zurückzuhalten und die Polypeptid-Aktivität beizubehalten. Die Zusammensetzung der wäßrigen Waschlösung, die die genannten Kriterien erfüllt, wird vom Fachmann gewöhnlich empirisch bestimmt ebenso wie die Menge der wäßrigen Waschlösung, die notwendig ist, um die überwiegende Abtrennung von nichtspezifisch gebundenem oder zurückgehaltenem Material aus der Immun-Affinitätsmatrix zu erreichen. Da das Polypeptid Faktor VIII:C ist, kann die Ionenstärke der Waschlösung eine erhebliche Auswirkung auf den erreichten Reinigungsgrad haben, und zwar deshalb, weil eine Waschlösung mit hoher Ionenstärke Faktor VIII:RP (von Willebrand Faktor) aus dem immunoadsorbierten Faktor VIII:C abtrennt. Wenn eine Elution folgt, resultiert die Dissoziierung in einer Faktor VIII:C-Lösung mit hoher spezifischer Aktivität.
- Nach dem Waschen der Immun-Affinitätsmatrix wird das Polypeptid mit einer wäßrigen Lösung eluiert, die Anteile enthält, die die Dissoziierung von Polypeptid von dem Antikörper bewirken. Die Komponenten in der wäßrigen Lösung umfassen polare oder unpolare Materialien, die die nichtkovalenten Bindungen zerstören, die das Polypeptid sonst an den Antikörper gebunden halten. Die wäßrige Lösung kann andere Komponenten enthalten, die dazu dienen, die Polypeptid- Aktivität zu erhalten, beispielsweise Calciumchlorid und Albumin. Die Bestandteile der wäßrigen Lösung und ihre jeweiligen Konzentrationen können bestimmt werden, nachdem die übrigen Parameter des Polypeptid-Typs und des komplexen wäßrigen Gemischs gewählt worden sind.
- Ein zweiter Teil des Verfahrens nach der Erfindung ist die Anwendung einer Affinitätsmatrixreinigung. Einige der besonders beachtenswerten Vorteile des Verfahrens werden durch den Zweistufen-Prozeß realisiert, bei dem die Immun-Affinitätsreinigung der Affinitätsreinigung vorhergeht. Nachdem das Polypeptidgemisch der Affinitätsmatrix zugegeben wurde, wird der anionische Austausch-Affinitätsbereich mit einer Pufferlösung niedriger Ionenstärke ausgewaschen. Der Bereich wird dann mit einer Puffersalzlösung eluiert, die bevorzugt hohe ionische Stärke und/oder niedrigen pH sowie Bestandteile hat, die einer Erhaltung der Polypeptid-Stabilität dienen, z. B. Calciumionen, Polyethylenglycol und Albumin. Das Eluat, das das interessierende Polypeptid enthält, kann in einer Lösung aufgefangen werden, die das Äquivalent der Elutionslösung ist mit der Ausnahme, daß das Elutionssalz entfällt.
- Das Verfahren nach der Erfindung wird durch die folgenden Beispiele verdeutlicht, die nur dem Zweck der Veranschaulichung dienen und keine Einschränkung darstellen.
- Nachstehend folgt eine Liste der Formulierungen für Lösungen, die in den Beispielen 1-4 eingesetzt werden.
- (Immunaffinitäts-Äquilibrierungslösung): 0,05 M Imidazol, 0,8 M Natriumchlorid, 0,05 M Calciumchlorid, 0,3 Vol.-% Tri(n-butyl)phosphat, 1,0% Triton X-100; ph auf 7,4 ± 0,1 eingestellt mit 6 N HCl.
- (Immunaffinitäts-Waschlösung): 0,05 M Imidazol, 0,04 M Calciumchlorid, 5,0 Vol.-% Ethylenglycol; ph auf 6,4 ± 0,1 eingestellt mit 6 N HCl.
- (Immunaffinitäts-Elutionslösung): 0,05 M Imidazol, 0,04 M Calciumchlorid, 40 Vol.-% Ethylenglycol, 0,1% (1,0 mg/ml) Humanalbumin; ph auf 6,4 eingestellt mit 6 N HCl.
- (QAE-ZetaPrep-Waschlösung): 0,05 M Histidin, 0,15 M Natriumchlorid, 1,0 mM Calciumchlorid, 1,0 M Glycin, 0,1% (Gew.-/Vol.) Polyethylenglycol 4000, 0,1% Humanalbumin (U.S.P.); pH auf 6,4 eingestellt mit 6 N HCl.
- (QAE-ZetaPrep-Elutionslösung): 0,05 M Histidin, 0,6 ± 0,1 M Natriumchlorid, 4,0 mM Calciumchlorid, 0,1% (Gew./Vol.) Polyethylenglycol 4000, 1% Humanalbumin (U.S.P.); pH auf 5,5 bis 6,4 eingestellt mit 6 N HCl.
- (Volumenverdünnungslösung): 0,05 M Histidin, 4,0 mM Calciumchlorid, 0,1% (Gew./Vol.) Polyethylenglycol 4000, 1,0% Humanalbumin (U.S.P.); pH auf 8,2 eingestellt mit 6 N HCl.
- 0,05 M Histidin, 0,15 M Natriumchlorid, 4,0 mM Calciumchlorid, 0,1% (Gew./Vol.) Polyethylenglycol 4000, 1,0% Humanalbumin (U.S.P.); pH auf 7,1 ± 0,1 eingestellt mit 6 N HCl.
- Der hier eingesetzte monoklonale Antikörper ist von einem Hybridom erhalten, das unter allgemeiner Befolgung der Methode von Milstein und Köhler präpariert wurde. Nach Immunisierung von weiblichen Balb/c-Mäusen mit Human-Faktor VIII:C wurden die Milzzellen der immunisierten Mäuse mit Myelomzellen P-3Ag 8653 von einem Maus-Myelom verschmolzen, und die resultierenden Hybridome wurden in einem Siebtest auf diejenigen Überstände untersucht, die Antikörper enthalten, die eine selektive Bindung an Human-Faktor VIII:C erlauben. Das gewünschte Hybridom wurde dann kloniert und charakterisiert. Als Ergebnis wurde ein Hybridom mit der Kennummer GI-F8/1.5.6 von Genetics Institute, Cambridge, Massachusetts, erhalten, das Antikörper gegen ein Epitop an dem Human-Faktor VIII:C-Protein erzeugt. Dieser Antikörper reagiert nicht nur mit Human-Faktor VIII:C, der von Plasma erhalten ist, sondern es wurde gefunden, daß er auch mit Human-Faktor VIII:C reagiert, der durch Zellen erzeugt ist, die mittels DNA-Rekombinationscodierung für Human-Faktor VIII:C transformiert sind. Die Herstellung des hier verwendeten monoklonalen Antikörpers wurde wie folgt durchgeführt:
- Weibliche Balb/c-Mäuse (von Jackson Labs) werden intraperitoneal am Tag 0 mit 25-50 Einheiten Faktor VIII immunisiert, der gemäß Beispiel 1 erhalten ist und in 0,4 ml komplettem Freund-Adjuvans emulgiert worden war. Am Tag 21 werden die Mäuse mit dem Faktor VIII, der in inkomplettem Freund Adjuvans emulgiert wurde, reimmunisiert. Weitere Auffrischungs-Immunisierungen werden in Abständen von drei Wochen verabreicht.
- Die Seren der immunisierten Tiere werden drei Tage nach jeder Auffrischung auf Hemmung von Faktor VIII-Gerinnungsaktivität getestet durch Inkubieren von Verdünnungen der Seren mit normalem gepooltem Plasma bei 37ºC für 2 h. Die Faktor-VIII-Restaktivität wird dann mit dem chromogenen Faktor-VIII-Assay gemessen.
- Drei Tage vor der Verschmelzung werden die Mäuse mit einer letzten Injektion (intravenös oder intraperitoneal) von 25-50 Einheiten von Faktor VIII in phosphatgepufferter Kochsalzlösung angeregt.
- Die Verschmelzung erfolgt in Abwesenheit von Serum entsprechend dem von Köhler und Milstein entwickelten Verfahren. Die Milz von zwei immunisierten Mäusen wird durch stumpfe Austrennung entfernt, längsgeschnitten, gefolgt von Herauslösen der Zellen auf eine Platte in 2 ml eiskaltes RPMI- 1640/Glutamin, wobei die Platte einmal mit 2 ml der gleichen Pufferlösung abgespült wird, um restliche Zellen zu erhalten, und Anordnen in 10 ml-Röhrchen. Der Schutt kann sich für ca. 5 min auf Eis absetzen, und die Zellen werden bei 4ºC in 50 ml RPMI-1640/Glutamin gewaschen und danach in 10 ml eiskaltem RPMI-1640/Glutamin suspendiert. Eine Zählung der Zellen ergab insgesamt 2·10&sup8;.
- Myelomzellen des Stamms P3Ag8653, die in 207 FCS/RPMI (Glutamin, 2-Mercaptoethanol, Gentamycin) gehalten werden, werden bei 10ºC in 50 ml RpMI-1640/Glutamin gewaschen und danach in 10 ml RPMI-1640 bei Raumtemperatur suspendiert.
- Die Milz- und Myelomzellen werden in einem Verhältnis von ungefähr vier Milzzellen pro Myelomzelle vermischt und auf 50 ml RPMI-1640/Glutamin gebracht und bei 10ºC gewaschen. Der Überstand wird abgesaugt, und das Pellet wird durch Schwenken des Röhrchens erneut suspendiert. Das Röhrchen wird dann in einen Kochbecher verbracht, der Wasser mit 37ºC enthält. 1 ml von 50 Gew.-% PEG 1500 wird dem Röhrchen allmählich über ½ Minute zugefügt, während das Pellet mit der Spitze einer 1 ml-Pipette gerührt wird. Man läßt das Gemisch für 1 1/1 min bei 37ºC unter gelegentlichem Rühren stehen. 5 ml RPMI-1640/Glutamin mit 37ºC wird über einen Zeitraum von 3 min unter Rühren allmählich zugesetzt. Weitere 14 ml RPMI-1640/Glutamin wird über 1 min zugesetzt, gefolgt von 30 ml 20% FCS RPMI-1640/Glutamin. Die Zellsuspension wird bei 20ºC für 8 min zentrifugiert, und das Pellet wird zu 1,5 · 10&sup5;/ml (1,5 · 10&sup7; Milzzellen/Platte/20 ml) Einsatzmilzzellen/ml in 20% FCS RPMS-1640 + HAT suspendiert. Normale Maus-Feederzellen (2,5 · 10&sup4;/ml) vom gleichen Stamm wie der Milzzellenspender werden zugefügt. Teilmengen von 0,2 ml wurden tropfenweise in 96 Vertiefungen aufweisende Costar-Platten (Dosierung 20 ml/Platte) verbracht. Nach sieben Tagen wird ½ bis 2/3 des Mediums durch HAT + RPMI-1640 + 20% FCS ersetzt. Zwischen den Tagen 12 und 28 wird das Medium periodisch mit HT + RPMI-1640 + 20% FCS ersetzt (das Medium wird ersetzt, wenn die Zellen gelb zu werden beginnen: -2 Tage). Ab dem Tag 30 wird das Medium durch RPMI-1640 + 20% FCS ersetzt.
- Die Stammlösungen sind folgende:
- 1. HT 200X: Hypoxanthin, 136 mg
- Thymidin, 38,8 mg
- D.D.W., 100 ml gelöst bei 70ºC, filtersterilisiert und bei -29ºC für ca. 6 Monate tiefgefroren gelagert
- 2. Aminopterin 1000X: Aminopterin 3,5 mg
- 0,10 N NaOH, 1 ml
- D.D.W. 19 ml filtersterilisiert, dunkel gelagert bei -20ºC für -2 Monate
- 3. HAT IX: HT 100X, 5 ml; Aminopterin 1000X, 0,5 ml;
- RPMI + 20% FCS, 500 ml
- 4. HT IX: HT 100X, 0,5 ml; RPMI + 20% FCS, 500 ml
- 5. Azaguanin 100x: 8-Azaguanin 2,5 mg
- 0,01 N NaOH 10 ml filtersterilisiert, in gleichen Teilen von 1 ml bei 20 ºC gelagert
- Hybridzellkulturen werden auf die Produktion von Anti- Faktor-VIII:C-Antikörpern mach zwei Methoden voruntersucht.
- Mikrotiterplatten (96 Vertiefungen) werden mit Anti-Maus-IgG vom Kaninchen beschichtet durch Inkubation in 0,2 M Carbonatpuffer, pH 9,5, für zwei Stunden bei ca. 37ºC. Die Platten werden dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen, die 0,05% Tween 20 (PBS/Tween 20) enthält. Nichtspezifische Stellen wurden durch Inkubieren der Platten mit PBS, die 3% Gelatine enthielt, beschichtet. Teilmengen von Hybridzellüberstand werden den Vertiefungen zugefügt und bei 37ºC für zwei Stunden inkubiert und danach dreimal mit PBS/Tween 20 gewaschen. Eine aus Plasma erhaltene Fraktion von Human-Faktor VIII:C wird zugefügt und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert und danach dreimal mit PBS/Tween 20 gewaschen. Anti-Faktor VIII ¹²&sup5;I-FAB' (präpariert aus IgG, das aus dem Plasma eines Patienten mit einem Faktor-VIII- Hemmer mit hohem Titer isoliert war) wird zugefügt und bei 37ºC für vier Stunden inkubiert und anschließend dreimal in PBS gewaschen. Die Vertiefungen werden mit einem Glühdrahtschneider durchschnitten, und eine Radioaktivitätszählung wird vorgenommen. Positive Zellen bei diesem Assay bezeichneten Antikörper zu Faktor VIII:C.
- Teilmengen von Hybridzellüberstand werden mit gleichen Volumen von normalem gepooltem Plasma vermischt und bei 37ºC für 2 h inkubiert. Die Proben werden verdünnt, um einen ordnungsgemäßen Assay (chromogenen oder Gerinnungs-Assay) der Bioaktivität von Faktor VIII:C zu erhalten. Eine Verringerung der Faktor VIII:C-Aktivität von normalem gepooltem Plasma zeigt die Anwesenheit eines hemmenden Antikörpers für Faktor VIII:C. Dieser Assay weist nicht die Anwesenheit von nichthemmenden Antikörpern für Faktor VIII:C nach.
- Zellen, die in einem der obigen zwei Assays positiv sind, werden in Weichagar gemäß der nachstehend beschriebenen Technik kloniert und subkloniert. Subklonierte Zellen werden dann in Mäusen als Aszites-Tumoren für die Produktion von Antikörper-reichem Aszitesfluid gezüchtet.
- 1. Präparieren von 0,5% Agar-Medium:
- Für 500 ml:
- 10X Earl's Balanced Salt Solution, 5,5 ml, vermischen und auf 45ºC erwärmen.
- RPMI-1640, 434 ml
- 50 ml 5% Agarlösung auf 100ºC erwärmen und die erwärmte Lösung der RPMI-1640-Lösung zufügen. Inkubieren in 45ºC-Wasserbad.
- 18 ml 0,5% Agar/Platte vorsehen.
- 2. Hybridzellverdünnungen: Man verwende für jede Zellinie 4 Röhrchen, die mit dem Namen der Zellinie versehen und mit 1, 8&supmin;¹, 8&supmin;², 8&supmin;³ markiert sind. Die Verdünnungen können verschieden sein, beispielsweise 83w1, 8&supmin;², 8&supmin;³, Man füge Röhrchen 1 0 ml und den übrigen 0,7 ml RPMI-1640 zu. Hybridzellen sollten gesund und in der logarithmischen Phase sein. Die Zellen werden suspendiert und 0,7 ml in Röhrchen 1 sowie 0,1 ml in Röhrchen 8&supmin;¹ überführt, vermischt, und achtfache Reihenverdünnungen werden vorgenommen durch Verdünnen von 0,1 ml aus Röhrchen 8&supmin;¹ in Röhrchen 8&supmin;², 8&supmin;³, und Entfernen von 0,1 ml aus Röhrchen 8&supmin;³, so daß alle 0,7 ml enthalten. In 37ºC-Bad einbringen. Es wird bevorzugt, daß alle diese Verdünnungen für die erste Klonierung verwendet werden. Die '1'-Verdünnung kann gewöhnlich für die Subklonierung entfallen.
- 3. 100 · 15 mm Petrischalen werden etikettiert, und mit einer 25-ml-Einmalpipette wird 15 ml 0,5% Bacto- Agarmedium in die Schalen pipettiert und für 20 min hartwerden gelassen, bevor die Weichagardeckschicht, die Zellen in 0,33% Agarmedium enthält, zugegeben wird. Es ist wichtig, daß die Platten während dieser Periode nicht gekippt werden. Das restliche 0,5% Bacto-Agarmedium wird auf 45ºC gehalten.
- 4. Weichagar-Deckschicht: Eine Teilmenge von 0,5% Agar wird in ein 50-ml-Kunststoffröhrchen gegossen und in einem Wasserbad von 45ºC in der Haube angeordnet. Zellen enthaltende Röhrchen werden einzeln aus dem Bad von 37ºC entnommen. 1,4 ml Agar wird mit einer 5- oder 10-ml-Einmalpipette zugegeben, in der Pipette auf- und abbewegt zum Vermischen, und der größte Teil des Gemischs (unter Vermeidung von Blasen) wird auf die 0,5% Agarbasis aufgebracht. Es ist während dieses Schritts sehr wichtig, daß weder das Agar noch die Zellen abkühlen, da sonst kein homogenes 0,33% Agargemisch erhalten wird.
- 5. Man läßt die Platten für 30 min ohne Bewegen (außer Einschieben in die Haube) hartwerden, und sie werden bei 37ºC unter 5% CO&sub2; für 7-14 Tage inkubiert.
- 6. Beim Auftreten von diskreten Kolonien werden Klone mit sterilen Pasteurpipetten "aufgenommen" (d. h. die Pipettenspitze wird über der Kolonie angeordnet, und das Ansaugen erfolgt unter Verwendung einer reinen Pipette für jede Kolonie), und die Zellen werden in Costar-Platten mit 96 Vertiefungen in 150 ul von 20% FCS/RPMI-1640 eingebracht.
- 7. Die Platten werden bei 37ºC unter 5% CO&sub2; für 7-14 Tage inkubiert. Wenn der Kulturüberstand gelb wird, werden die Klone mit den definierten Methoden einem Screening unterzogen.
- A. Aszitesfluid von Beispiel IV wird durch einen Glaswollstopfen filtriert, um teilchenförmige Stoffe zu entfernen.
- B. Das Aszitesfluid von (A) wird durch ein 0,45-um-Filter geleitet, mit einem gleichen Volumen von 0,02 M Trispufffer, pH 8,5, verdünnt und durch ein 0,22-um-Filter unmittelbar vor der folgenden Reinigung geleitet.
- C. Die filtrierte Probe wird auf eine TSK DEAE-SPW HPCL- ionenaustauschsäule injiziert, die bei 24ºC in 0,02 M Trispuffer, pH 8,5, äquilibriert wurde. Der Durchsatz wird auf 1,0 ml/min eingestellt, und Fraktionen von 1 ml werden aufgefangen. Gebundendes IgG wird unter Anwendung eines linearen Gradienten von 0% B bis 30% B eluiert (Puffer A ist 0,02 M Trispuffer, pH 8,5; Puffer B ist 0,02 M Trispuffer, pH 7,0, der 1,0 M NaCl enthält).
- D. Fraktionen werden auf Hemmung der Faktor-VIII:C- Bioaktivität analysiert durch Vermischen einer Teilmenge jeder Fraktion mit geeignet verdünntem normalem Poolplasma vor der Analyse in einem Faktor VIII:C-Bioassay (wie oben beschrieben).
- E. Fraktionen, die Anti-VIII:C-Antikörper enthalten, werden zur Verwendung als Immunadsorbens gepoolt.
- Das wie oben beschrieben präparierte Hybridom wurde von Genetics Institute, Inc., Cambridge, Massachusetts, bezogen.
- Monoklonale Antikörper (mAb) für Humanplasma-Faktor VIII:C werden gegen zehn Volumen von 0,1 M Natriumbicarbonat, 0,5 M NaCl, pH 8,5 (Kopplungslösung) für 4 h bei 2-8ºC dialysiert. Die Dialyse wird über Nacht wiederholt. Die Antikörperproteinkonzentration, die durch Adsorption bei 280 nm bestimmt wird, wird auf 1,1 g/l mit der Kopplungslösung eingestellt.
- Der monoklonale Antikörper wird an mit Bromcyan aktivierte Sepharose CL-2B gekoppelt, wie von March et al., Anal Biochem, 60, 149-152 (1974) beschrieben wird. Das Verfahren ist wie folgt. Vorgequellte Sepharose CL-2B wird mit zehn Harzvolumen von entionisiertem Wasser gewaschen und in einem Harzvolumen von kaltem (2-8ºC) entionisiertem Wasser suspendiert. Zwei Harzvolumen von 2,0 M Natriumcarbonat werden dem Harz zugefügt und gerührt. Für jeden Liter Harz werden 60 g Bromcyan in 120 ml Acetonitril gelöst und dem Harz unter kräftigem Rühren zugefügt. Nach 10-30 min Inkubationszeit je nach der Rate und dem Grad der erforderlichen Aktivierung wird die Harzsuspension saugfiltriert und fünfmal mit den zwei Harzvolumen der Kopplungslösung gewaschen. Das Harz wird sofort in einen Kochbecher überführt und der dialysierten monoklonalen Antikörperlösung zugefügt. Die Harzsuspension wird für 2 h bei 21ºC gerührt, was zu einem Kopplungswirkungsgrad von mehr als 90% mit ungefähr 1 g gebundenem monoklonalem Antikörper pro Liter Harz führt. Die Harzsuspension wird über Nacht in der Kälte gelagert, saugfiltriert und viermal mit zwei Harzvolumen von kalter Kopplungslösung gewaschen. Das Harz wird in einen Kochbecher überführt, der drei Harzvolumen von 0,2 M Glycin, pH 8,0, enthält, für 2 h bei 21ºC gerührt, um die verbliebenen reaktiven Stellen an dem Harz zu blockieren, saugfiltriert und fünfmal mit zwei Harzvolumen einer Lösung aus 0,1 M Natriumacetat, 0,5 M NaCl, pH 3,5, gewaschen. Das Antikörper-Harz-Gemisch wird schließlich viermal mit zwei Harzvolumen von 10 mM Essigsäure, pH 3,5, gewaschen und in einem Harzvolumen der gleichen Lösung bei 2-8ºC bis zum Gebrauch aufbewahrt. Es wurde gefunden, daß das Antikörper- Harz-Gemisch bei Lagerung über längere Zeiträume in der Essigsäurelösung funktionsmäßig aktiv ist.
- Ungefähr 3000 l frisches Humanplasma wird mit einem Antikoagulans vermischt und bei -25ºC gelagert. Das tiefgekühlte Humanplasma wird unter Bedingungen aufgetaut, die in der Bildung von 30 kg unlöslichem Material resultieren, das als Kryopräzipitat bezeichnet wird, wie in der US-PS 3 631 018 (1971) von Shanbrom et al. beschrieben ist. Das Kryopräzipitat wird durch Zentrifugieren gesammelt, wobei das Kryopräzipitat von dem löslichen Plasmamaterial getrennt wird. Das Kryopräzipitat, das entweder tiefgekühlt bei -70ºC gelagert wurde oder frisch mit 5ºC erhalten wurde, wird bei 20-30ºC in zwei Volumen von destilliertem Wasser gelöst, das 50 uM CaCl&sub2; enthält. Der pH der Kryosuspension wird langsam auf 6,7 ± 0,2 durch Zugabe von 1 M Essigsäure eingestellt. Die Temperatur wird auf 9ºC gesenkt und auf dieser Temperatur gehalten, bis sich mit der Zeit ein unlösliches Material bildet, das von dem löslichen Material durch Zentrifugieren getrennt wird. Die Temperatur des kalten Überstands (ca. 75 l) wird auf 21ºC erhöht, und der pH wird mit 1 N NaOH auf 7,4 ± 0,2 eingestellt. Natriumchlorid (in fester Form) und Calciumchlorid (5 M Stammlösung) werden der kalten Überstandslösung langsam zugesetzt, um Endkonzentrationen von 0,8 M NaCl bzw. 0,05 M CaCl&sub2; zu erhalten. Schließlich wird ein Gemisch aus Triton X-100 und Tri(nbutyl)phosphat (TNBP) im Verhältnis von 3,33 : 1 der Lösung als Virusinaktivierungsmittel auf eine Endkonzentration von 1,3 Vol.-% zugefügt. Die so erhaltene Lösung wird als Kryo- Detergens-Lösung bezeichnet.
- Ungefähr 2,5 l des Antikörper-Harz-Gemischs wird in eine Säule in Gegenwart von 10 mM Essigsäure, pH 3,5, bei 21ºC gepackt. Die Säule wird bei 21ºC mit 3-4 Harzvolumen von destilliertem Wasser gewaschen, gefolgt von Äquilibrierung mit 3-4 Harzvolumen der Lösung I. Ungefähr 75 l Kryo- Detergens-Lösung wird auf die Säule von oben nach unten mit einem Durchsatz von 2-5 l/h aufgegeben. Die Säule wird mit 18 Harzvolumen der Lösung II mit einem Durchsatz von 10 l/h ausgewaschen. Das Faktor VIII:C-Polypeptid wird aus der Säule in umgekehrter Durchflußrichtung eluiert durch Aufgeben von etwa vier Harzvolumen der Lösung III. Der Durchsatz liegt zwischen 2 und 5 l/h.
- Die Ionenaustauschmatrix, die eine Patrone von verdichteten Cellulosescheiben ist, die quarternäre funktionelle Aminoethylgruppen (QAE ZetaPrep 250) enthält, wird zum Gebrauch konditioniert durch Waschen der Patrone mit den folgenden Lösungen: 500 ml 0,15 M NaCl, 1 Liter 1,0 M Essigsäure, 1 Liter 0,1 M Imidazol, 1,0 M NaCl, pH 8,2, acht Liter 0,15 M NaCl und schließlich zwei Liter der Lösung III. Nach dem Konditionieren wird die mAb-Eluatlösung, die den Faktor VIII:C enthält, auf das QAE ZetaPrep 250 mit einem Durchsatz zwischen 0,4 und 1,0 l/h aufgegeben. Die QAE ZetaPrep- Patrone wird mit zwei Liter von Lösung IV ausgewaschen, und Faktor VIII:C wird mit ca. zwei Liter der Lösung V eluiert.
- Das Eluat wird drei Volumen von physiologisch kompatibler Lösung VI zugefügt und weiter mit Lösung VII verdünnt, um die Endpotenz des Faktors VIII:C einzustellen. Das ultrareine Faktor VIII:C-Material wird durch ein 0,2-um-Filter sterilfiltriert, in Glasfläschen verbracht, tiefgefroren und lyophilisiert, und zwar ohne Wärmebehandlung.
- Ungefähr 86 kg Kryopräzipitat, das wie in Beispiel 1 beschrieben aus Plasma erhalten ist, wird bei -70ºC als eine mit Human-Faktor VIII:C angereicherte Plasmafraktion aufbewahrt, in Wasser mit seinem zweifachen Gewicht gelöst, und Calciumchlorid wird auf eine Endkonzentration von 50 uM zugefügt. Der pH der Kryosuspension (250 l) wird langsam mit 1 M Essigsäure auf 6,7 eingestellt. Die Temperatur der Faktor VIII:C-Lösung wird allmählich auf 9,5ºC heruntergekühlt, während Präzipitation über einen 20-Minuten-Zeitraum mit kontinuierlichem Vermischen erfolgt. Das Präzipitat, das hauptsächlich Fibrinogen und Fibronectin ist, die ca. 50% des Gesamtproteins bilden, wird durch Zentrifugieren bei 3000 · g für 15 min bei 9,5ºC entfernt. Der pH des resultierenden kalten Überstands (225 l) wird mit 1 N NaOH auf 7,4 eingestellt, und er wird durch eine Membran einer Normalporengröße von 0,5-0,8 um filtriert, um alle Partikel unter geringem Verlust von Faktor VIII:C zu entfernen. Dem filtrierten Überstand wird NaCl auf 0,8 M, CaCl&sub2; auf 0,05 M und ein Gemisch aus Triton X-100/Tri-(n-butyl)phosphat (Verhältnis 3,3 : 1) auf 1,3 Vol.-% unter geringem Verlust von Faktor VIII:C (17,9 Einheiten/ml) zugefügt. Dies wird als die Kryo-Detergens-Lösung bezeichnet.
- 230 l der Kryo-Detergens-Lösung werden bei Raumtemperatur von oben nach unten durch eine vertikale Säule, die 5 l Immunadsorbens enthält (die Kapazität ist 1 g mAb pro Liter Harz), mit einem Durchsatz von 8,5 l/h geleitet. Das mAb- Harz wird mit 40 Volumen der Lösung II mit einem Durchsatz von 20 l/hh ausgewaschen, um kontaminierende Proteine, Viren und die Virusinaktivierungsmittel zu entfernen.
- Der harzgebundene Faktor VIII:C wird aus dem Harz mit 19,4 l der Lösung III mit einem Durchsatz von 6 l/h desorbiert.
- Der Faktor VIII:C-mAb-Eluatpool (19,4 l) wird direkt auf eine QAE-ZetaPrep 800 Patrone (LKB, Bromma, Schweden) aus dem Innenkern nach außen zu der äußeren Umfangsmatrix mit einem Durchsatz von 1-5 l/h geleitet. Die QAE-ZetaPrep- Matrix wird mit 8-10 1 der Lösung IV mit einem Durchsatz von 4 l/h ausgewaschen. Der Faktor VIII:C wird aus der QAE- Matrix in umgekehrter Durchflußrichtung mit 3 l der Lösung V mit einem Durchsatz von 3,2 l/h eluiert und 9 l der Lösung VI zugesetzt. Schließlich wird die Potenz der Faktor VIII:C- Volumenlösung mit 6,5 l der Lösung VII eingestellt, um einen hochreinen Faktor VIII:C zu erzeugen, der für den therapeutischen Einsatz geeignet ist.
- Dieses Beispiel zeigt, daß die Erhöhung der Ionenstärke des Faktor-VIII-Präparats die Rate der Adsorption von Faktor VIII:C an Harz erhöht, das mit Anti-Faktor VIII:C monoklonalen Antikörpern gekoppelt ist, die durch hydrophobe Wechselwirkung an Faktor VIII:C binden. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 aufgeführt.
- Bei dem ersten Experiment wurde Kryopräzipitat in einer Lösung so gelöst, daß es 9,5 Einheiten/ml Faktor VIII:C in einer Lösung von 0,03 M Natriumcitrat, 0,12 M NaCl, 0,1 M Glycin und 1 Einheit/ml Heparin aufwies. Teilmengen von 1 ml der Kryopräzipitatlösung, die Faktor VIII:C in Gegenwart von 0,12 bzw. 0,52 bzw. 1,0 M NaCl enthielten, wurden jeweils 0,1 ml monoklonalem Antikörper-Harz und 0,1 ml Kontrollharz, das mit normalem Maus-IgG gekoppelt war, zugefügt. Unter kontinuierlichem Vermischen wurden Teilmengen von 0,1 ml der Harzaufschlämmungen zentrifugiert und zum Zeitpunkt t=0, 0,5, 2,5 und 5 h auf Faktor VIII:C analysiert.
- Bei dem zweiten Experiment wurde Hemofil C (Antihämophilie- Faktor, Baxter-Hyland Division) mit Wasser rekonstituiert, so daß es 28 Einheiten/ml Faktor VIII:C in einer Lösung aus 0,02 M Natriumcitrat, 0,15 M NaCl, 0,10 Glycin, 50 uM CaCl&sub2;, 1% (Gew./Vol.) Polyethylenglycol, 1% Humanalbumin, pH 7,0, aufwies. Teilmengen von 14 ml der Faktor VIII:C-Lösungen, die 0,15 M bzw. 1,0 M NaCl enthielten, wurden jeweils 1 ml mAb-Harz und 1 ml nichtgekoppeltem Kontrollharz zugefügt. Unter kontinuierlichem Vermischen wurden Teilmengen von 0,3 ml der Harzaufschlämmungen zentrifugiert und auf Faktor VIII:C-Aktivität zum Zeitpunkt t=0, 0,08, 0,25, 0,5, 1,0, 1,5 und 2,0 h analysiert.
- Bei dem dritten Experiment wurde lyophilisierter, mAbgereinigter Faktor VIII:C mit Wasser so rekonstituiert, daß er 14 Einheiten/ml Faktor VIII:C in Lösung VII enthielt. Die Rate der Adsorption von Faktor VIII:C an das mAb-Harz wurde bestimmt, wie es im zweiten Experiment dieses Beispiels beschrieben ist. TABELLE 1 AUSWIRKUNG DER IONENSTÄRKE AUF DIE RATE DER ADSORPTION VON FAKTOR VIII:C AN mAb-HARZ Experiment Faktor Präparate Endkonz. von NaCl nach 1 h adsorbierte relative Aktivität von Faktor Kryo-Lösung Hemofil Methode
- * mit monoklonalem Antikörper gereinigter Faktor VIII:C
- Dieses Beispiel zeigt, daß das eluierte Faktor VIII:C- Material aus dem Antikörper-Harz-Verbundmaterial hochrein ist, obwohl es einen signifikanten Anteil von damit assoziiertem Faktor VIII:RP behält.
- Eine Menge von 1,15 kg Kryopräzipitat wurde in Wasser des zweifachen Gewichts in Gegenwart von 50 uM CaCl&sub2; gelöst. Der pH wurde mit Essigsäure auf 6,7 eingestellt unter allmählicher Abkühlung auf 9,5ºC. Das Präzipitat, das sich innerhalb eines Zeitraums von 10 min bildete, wurde durch Zentrifugieren bei 4500 · g für 20 min entfernt. Der pH des kalten Überstands wurde mit 1 M NaOH auf 7,4 eingestellt, gefolgt von der Zugabe von NaCl auf 0,8 M, CaCl&sub2; auf 0,05 M und eines Gemischs aus Triton X-100/Tri-(n-butyl)phosphat im Verhältnis von 3,3 : 1 auf 1,3 Vol.-%. Die Lösung wird nachstehend als Kryo-Detergens-Lösung bezeichnet.
- Ungefähr drei Liter der Kryo-Detergens-Lösung wurden bei Raumtemperatur von oben nach unten durch eine 100-ml-Säule von mAb-Harz (Kapazität: 1 mg mAb pro ml Harz) mit einem Durchsatz von 3 ml/min geschickt. Die Säule wurde mit 1800 ml der Lösung 11 mit einem Durchsatz von 10 ml/min ausgewaschen. Das Faktor VIII:C-Material wurde aus dem mAb- Harz mit 450 ml der Lösung III ohne Humanalbumin mit einem Durchsatz von 5 ml/min eluiert. Die spezifische Aktivität des gereinigten Faktors VIII:C wurde dann mit Einstufen- Gerinnungs-Assays bestimmt, und die Proteinkonzentration wurde aus dem Absorptionsvermögen bei 280 nm und Farbstoffbindungs-Techniken abgeleitet. Die Tabelle 2 zeigt die Aktivität des Faktors VIII:C, der aus dem angegebenen Ausgangsmaterial gewonnen wurde. TABELLE 2 REINIGUNG VON FAKTOR VIII:C NACH DEM IMMUN-AFFINITÄTSVERFAHREN SCHRITT GESAMT-AKTIV. (Einh.) VOLUMEN PROTEIN SPEZIF. AKTIV. (Einh./mg) REINIGUNG GEWINNUNG Human-Plasma Kryopräzipitat-Suspension Kryo-Detergens Immunaffinitäts-Eluat
- a enthält ca. 0,17 Einheiten Faktor VIII:RP pro Einheit Faktor VIII:C
- b enthält ca. 0,010 Einheiten Faktor VIII:RP pro Einheit Faktor VIII:C
Claims (33)
1. Verfahren zur Reinigung von Faktor VIII:C aus einem
Gemisch von Polypeptiden und anderen Bestandteilen umfassend:
(a) Immobilisierung eines Antikörpers, welcher sich durch
hydrophobe Anziehung an den zu reinigenden Antikörper
bindet, an einer Matrix bevor oder nachdem der Faktor
VIII:C dem Antikörper zugesetzt wird, wodurch der Faktor
VIII:C an einer Immunoaffinitätsmatrix immobilisiert
wird;
(b) Eluieren des Faktors VIII:C vom immobilisierten
Antikörper, indem die Faktor VIII:C Immunoaffinitätsmatrix zur
Desorption von Faktor VIII:C von der Matrix mit einer
desorbierenden Substanz behandelt wurde, wodurch ein
Faktor VIII:C desorbierendes Substanzgemisch gebildet wird;
(c) Durchleiten des zu reinigenden Faktor VIII:C durch einen
zweiten Bereich, der fähig ist, den Faktor VIII:C durch
hydrophile Anziehung zu binden; dadurch wird ein Bindung
des Faktor VIII:C an den zweiten Bereich erreicht,
während Verunreinigungen den zweiten Bereich passieren
gelassen werden;
(d) wobei das Faktor VIII:C: desorbierende Substanzgemisch
von der Matrix von Stufe (b) zu dem Bereich von Stufe (c)
ohne eine weitere Veränderung des Gemisches geführt wird;
und
(e) Eluieren des gereinigten Faktor VIII:C aus dem zweiten
Bereich.
2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Gemisch aus
Polypeptiden Blutplasma ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Gemisch aus
Polypeptiden eine Blutplasmafraktion ist, die solubilisiert wurde.
4. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Gemisch aus
Polypeptiden in einem Zellkulturmedium vorliegt, das aus der
Gentechnologie abgeleitet ist.
5. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Gemisch aus
Polypeptiden in einem Endprodukt vorliegt, das wieder zu reinigen
ist.
6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei dem
die Immunoaffinitätsmatrix einen an eine Matrix gebundenen
Antikörper enthält.
7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem der Antikörper
monoklonal ist.
8. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem der monoklonale
Antikörper für Faktor VIII:C spezifisch ist.
9. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem die Matrix ein Harz
oder Agarose-Kügelchen enthält.
10. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei dem
ein Waschen vorgenommen wird, nachdem der zu reinigende Faktor
VIII:C durch die Immunoaffinitätsmatrix adsorbiert worden ist.
11. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem das Waschen mit einer
gepufferten Salzlösung durchgeführt wird.
12. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei dem
die desorbierende Substanz eine gepufferte Salzlösung ist, die
ein nichtpolares Agens enthält.
13. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem die nichtpolare
Substanz Ethylenglykol oder Propylenglykol ist.
14. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei dem
die Immunoaffinitätsmatrix eine senkrechte Säule, eine
Radialflußhülse oder eine freie Mischung aus Matrix und Polypeptid
ist.
15. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der zweite Bereich
unlösliche Teilchen, Harz, Agarose-Kügelchen oder Cellulose
enthält.
16. Verfahren nach Anspruch 19, bei dem der zweite Bereich
eine Ionenaustauschermatrix ist, die als
Anionenaustauschergruppen Aminodiethylaminoethyl- oder quarternäre
Aminoethylgruppen oder als Kationenaustauschergruppen Phospho- oder
Carboxyalkylgruppen enthält.
17. Verfahren nach Anspruch 16, bei dem die Matrix eine
Aminodiethylaminoethyl- oder quarternäre Aminoethylgruppe als
funktionelle Gruppe enthält, die an einer Cellulosematrix in
einer Hülse angelagert ist.
18. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei dem
ein Waschvorgang zwischengeschaltet wird, nachdem das
Polypeptid an den zweiten Bereich gebunden worden ist.
19. Verfahren nach Anspruch 18, bei dem der Waschvorgang mit
gepufferter Salzlösung einer niedrigen Ionenkonzentration
durchgeführt wird.
20. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei dem
die Elution von Faktor VIII:C entweder von der
Immunoaffinitätsmatrix oder von der Matrix des zweiten Bereichs erreicht
wird, indem die eluierende Lösung der Matrix zugesetzt wird,
um eine Strömung in entgegengesetzter Richtung zu der Strömung
der Faktor VIII:C-Mischung oder der Faktor VIII:C-Lösung in
der Matrix zu erzeugen.
21. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei dem
eine virusinaktivierende Stufe eingebaut ist.
22. Verfahren nach Anspruch 21, bei dem die
virusinaktivierende Stufe ein organisches Lösungsmittel und/oder ein
aberflächenaktives Mittel zur Inaktivierung der im
Polypeptidgemisch vorliegenden Viren verwendet.
23. Verfahren nach Anspruch 22, bei dem das organische
Lösungsmittel ein Tri-n-alkylphosphat, Dialkylether oder
Amylacetat ist.
24. Verfahren nach Anspruch 22, bei dem das oberflächenaktive
Mittel Triton X-100, Tween 80, Natriumcholat oder
Natriumdeoxycholat ist.
25. Verfahren nach Anspruch 22, bei dem das organische
Lösungsmittel ein Tri-n-butylphosphat und das
oberfälchenaktive Mittel ein oxyethyliertes Alkylphencl ist.
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 25, bei dem die
virusinaktivierende Stufe vor der
Immunoaffinitäts-Reinigungsstufe oder Stufe (c) durchgeführt wird.
27. Verfahren zur Reinigung von Faktor VIII:C aus einer
komplexen wäßrigen Mischung, die mit lipidumhüllten pathogenen
Viren kontaminiert ist, umfassend:
(a) Vermischen der komplexen wäßrigen Mischung mit einem
virusinaktivierenden Agens, das ein organisches
lipidlösendes oder -spaltendes Lösungsmittel und ein
aberflächenaktives Mittel enthält, in irgendeiner Stufe im
Verfahren
(b) Hindurchleiten der komplexen wäßrigen Mischung durch eine
Immunoaffinitätsmatrix, die einen aktiven immobilisierten
monoklonalen Antikörper enthält, der spezifisch für
Faktor VIII:C ist und der sich durch hydrophobe Anziehung an
den Faktor VIII:C bindet, wodurch bewirkt wird, daß
Faktor VIII:C an der Immunoaffinitätsmatrix adsorbiert wird;
(c) Waschen der Immunoaffinitätsmatrix mit einem wäßrigen
Puffer, um mindestens einen Teil der Verunreinigungen aus
der komplexen wäßrigen Mischung zu entfernen, während der
Faktor VIII:C an der Immunoaffinitätsmatrix adsorbiert
bleibt;
(d) Eluieren des Faktor VIII:C von der Immunoaffinitätsmatrix
mit einer desorbierenden Substanz, dadurch Bildung einer
Faktor VIII:C: desorbierende Substanz-Mischung;
(e) Durchleiten der Faktor VIII:C: desorbierenden Substanz-
Mischung durch einen zweiten Bereich; wodurch bewirkt
wird, daß Faktor VIII:C daran gebunden wird, während
durchgesickerte monoklonale Antikörper, oberflächenaktive
Mittel und andere Verunreinigungen den zweiten Bereich
passieren gelassen werden, wobei die Faktor VIII:C:
desorbierende Substanz-Mischung die Matrix von Stufe (c)
bis Matrix von Stufe (e) ohne weitere Veränderung der
Mischung passiert; und
(f) Eluieren des zweiten Bereichs mit einer eluierenden
Lösung, um den Faktor VIII:C unter Bildung einer im
wesentlichen von Verunreinigungen freien Lösung zu
desorbieren.
28. Verfahren nach Anspruch 27, bei dem das organische
lipidspaltende Lösungsmittel in Stufe (a) Tri (n-butyl)-phosphat
und das oberflächenaktive Mittel Triton X-100 ist.
29. Verfahren nach Anspruch 27, bei dem die komplexe wäßrige
Mischung in Stufe (b) eine hohe Ionenkonzentration hat und
Natriumchlorid in einer 0,5 bis 1,5-molaren Konzentration oder
Calciumchlorid in einer 0,07 bis 0,5-molaren Konzentration
enthält, und bei dem der monoklonale Antibody eine hydrophobe
Anziehung für Faktor VIII:C hat.
30. Verfahren nach Anspruch 27, bei dem der wäßrige Puffer in
Stufe (c) eine gepufferte Salzlösung mit niedriger
Ionenkonzentration ist.
31. Verfahren nach Anspruch 27, bei dem der eluierende Puffer
mit niedriger Polarität in Stufe (d) eine gepufferte
Salzlösung mit niedriger Ionenkonzentration ist, die Ethylenglykol
oder Propylenglykol enthält und einen pH-Wert im Bereich von
6,3 bis 7,2 hat.
32. Verfahren nach Anspruch 27, bei dem der zweite Bereich in
Stufe (e) Aminodiethylaminoethyl- oder quarternäre Aminoethyl-
Gruppen als funktionelle Gruppen enthält, die an einer
Cellulosematrix in einer Hülse angelagert wird.
33. Verfahren nach Anspruch 27, bei dem die eluierende Lösung
für die Affinitätsmatrix in Stufe (f) eine gepufferte
Salzlösung mit niedriger Ionenkonzentration ist, die
Natriumchlorid in 0,6 bis 0,8-molarer Konzentration, menschliches Albumin
in 0,1-1%-Konzentration enthält, und die einen pH-Wert im
Bereich von 5,5 bis 6,4 hat.
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5639624A (en) * | 1989-03-14 | 1997-06-17 | Board Of Regents Of The University Of Nebraska | Monoclonal antibodies specific for metallic cations and method therefor |
CA2047717C (en) * | 1989-03-14 | 2000-08-01 | Fred W. Wagner | Monoclonal antibodies for small moieties, methods therefor |
JPH0327109A (ja) * | 1989-06-24 | 1991-02-05 | Hagiwara Kogyo Kk | 生物分解性フラットヤーンの製造方法 |
AT402153B (de) * | 1989-06-26 | 1997-02-25 | Immuno Ag | Protein-s-hältige pharmazeutische präparation |
US5254532A (en) * | 1989-06-26 | 1993-10-19 | Immuno Aktiengesellschaft Fur Chemisch-Medizinische Produkte | Preparation for treating and preventing thromboses and thromboembolic complications, use of such a preparation and a method of producing the same |
JPH0427865A (ja) * | 1989-12-21 | 1992-01-30 | Kurita Water Ind Ltd | 血液凝固因子用分離剤およびその製造方法 |
FR2662166A1 (fr) * | 1990-05-18 | 1991-11-22 | Fondation Nale Transfusion San | Procede de preparation de facteur viii de tres haute purete comprenant une etape rapide d'immunoadsorption. |
NZ261190A (en) | 1993-01-29 | 1997-12-19 | Bjorn Dahlback | Assaying for functional activity of a blood coagulation component involved in the protein c anticoagulant system (protein c, activated protein c, protein s or anticoagulant factor v) |
DE4337573C1 (de) * | 1993-11-04 | 1995-05-18 | Octapharma Ag | Verfahren zur Herstellung einer virusinaktivierten Faktor VIII enthaltenden Fraktion mittels chromatographischer Methoden |
US5589571A (en) * | 1994-10-28 | 1996-12-31 | Cor Therapeutics, Inc. | Process for production of inhibited forms of activated blood factors |
SE503424C2 (sv) * | 1994-11-14 | 1996-06-10 | Pharmacia Ab | Process för rening av rekombinant koagulationsfaktor VIII |
US6111079A (en) * | 1995-06-05 | 2000-08-29 | Bionebraska, Inc. | Lead binding polypeptides and nucleotides coding therefore |
US5659017A (en) * | 1995-11-07 | 1997-08-19 | Alpha Therapeutic Corporation | Anion exchange process for the purification of Factor VIII |
US6379975B1 (en) | 1996-11-27 | 2002-04-30 | T.A.C. Thrombosis And Coagulation Aktiebolag | Methods and reagents for determining protein S |
ES2287976T3 (es) * | 1997-06-13 | 2007-12-16 | Genentech, Inc. | Recuperacion de proteinas mediante cromatografia seguida de filtracion sobre una capa cargada. |
US7820796B2 (en) * | 1998-03-12 | 2010-10-26 | Genetics Institute, Llc. | Methods for producing Factor VIII proteins |
PT1062244E (pt) * | 1998-03-12 | 2002-12-31 | Inst Genetics Llc | Metodos melhorados para produzir proteinas do factor viii |
SI1308455T1 (sl) * | 1998-05-06 | 2006-08-31 | Genentech Inc | Sestavek, ki obsega protitelesa anti-HER2 |
US6855509B2 (en) | 2000-12-19 | 2005-02-15 | Instrumentation Laboratory Company | Protein S functional assay and kit therefor |
ES2434035T3 (es) | 2004-12-27 | 2013-12-13 | Baxter International Inc. | Conjugados de polímero-factor von Willebrand |
CN1302009C (zh) * | 2005-09-05 | 2007-02-28 | 武汉海特生物制药股份有限公司 | 用有机溶剂病毒灭活法制备鼠神经生长因子的工艺 |
US7645860B2 (en) | 2006-03-31 | 2010-01-12 | Baxter Healthcare S.A. | Factor VIII polymer conjugates |
CA2647314A1 (en) * | 2006-03-31 | 2007-11-08 | Baxter International Inc. | Pegylated factor viii |
KR100791502B1 (ko) | 2006-09-29 | 2008-01-03 | 한스바이오메드 주식회사 | 바이러스 불활화된 무세포 인체 이식재 생산방법 |
KR101839278B1 (ko) * | 2007-12-28 | 2018-03-15 | 박스알타 인코퍼레이티드 | 단백질의 역압 여과 |
TWI472339B (zh) | 2008-01-30 | 2015-02-11 | Genentech Inc | 包含結合至her2結構域ii之抗體及其酸性變異體的組合物 |
US8945895B2 (en) | 2009-07-31 | 2015-02-03 | Baxter International Inc. | Methods of purifying recombinant ADAMTS13 and other proteins and compositions thereof |
KR101879885B1 (ko) | 2010-09-17 | 2018-07-18 | 박스알타 인코퍼레이티드 | 약산성 내지 중성 ph에서 히스티딘을 갖는 수성 제형을 통한 면역글로불린의 안정화 |
WO2012082933A1 (en) | 2010-12-15 | 2012-06-21 | Baxter International, Inc. | Eluate collection using conductivity gradient |
AU2012324020A1 (en) * | 2011-12-30 | 2013-07-18 | Grifols, S.A. | Method for purifying Factor VIII |
US9700486B2 (en) | 2013-04-24 | 2017-07-11 | Corning Incorporated | Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients |
WO2014201400A2 (en) * | 2013-06-13 | 2014-12-18 | Biogen Idec Ma Inc. | Anti-factor viii antibodies or uses thereof |
SI3570884T1 (sl) | 2017-01-17 | 2021-02-26 | Genentech, Inc. | Subkutane formulacije protiteles HER2 |
US11077189B2 (en) | 2017-03-02 | 2021-08-03 | Genentech Inc. | Adjuvant treatment of HER2-positive breast cancer |
WO2022099223A2 (en) | 2020-11-09 | 2022-05-12 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Purification of fviii from plasma using silicon oxide adsorption |
Family Cites Families (37)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3962421A (en) * | 1973-06-18 | 1976-06-08 | American Home Products Corporation | Method for the disruption of lipid-containing viruses |
US4105650A (en) * | 1975-04-11 | 1978-08-08 | Edward Shanbrom, Inc. | Method of preserving blood plasma i |
US4188318A (en) * | 1975-06-16 | 1980-02-12 | Edward Shanbrom | Simplified method for preparation of high yield, high purity Factor VIII concentrate |
DE2550011C2 (de) * | 1975-11-07 | 1982-11-25 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Verfahren zur Herstellung eines antihämophilen Mittels |
US4412985A (en) * | 1980-10-06 | 1983-11-01 | Edward Shanbrom | Depyrogenation process |
US4314997A (en) * | 1980-10-06 | 1982-02-09 | Edward Shanbrom | Purification of plasma protein products |
US4315919A (en) * | 1980-10-06 | 1982-02-16 | Edward Shanbrom | Depyrogenation process |
ATE14269T1 (de) * | 1981-02-26 | 1985-08-15 | Unilever Nv | Verfahren und vorrichtung zur rueckgewinnung von immunoglobulinen. |
US4361509A (en) * | 1981-12-14 | 1982-11-30 | Scripps Clinic And Research Foundation | Ultrapurification of factor VIII using monoclonal antibodies |
USRE32011E (en) * | 1981-12-14 | 1985-10-22 | Scripps Clinic And Research Foundation | Ultrapurification of factor VIII using monoclonal antibodies |
US4481189A (en) * | 1982-04-14 | 1984-11-06 | New York Blood Center Inc. | Process for preparing sterilized plasma and plasma derivatives |
US4591505A (en) * | 1982-04-14 | 1986-05-27 | New York Blood Center, Inc. | Process for inactivating hepatitis B virus |
US4581231A (en) * | 1982-06-10 | 1986-04-08 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Health And Human Services | Inactivation of viruses containing essential lipids |
US4511556A (en) * | 1982-06-10 | 1985-04-16 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Inactivation of a lipid virus |
US4485017A (en) * | 1982-12-22 | 1984-11-27 | Cetus Corporation | Isolation of human interferon by immunosorbent and high performance liquid chromatography |
US4558006A (en) * | 1983-02-04 | 1985-12-10 | Kirin-Amgen, Inc. | A.T.C.C. HB8209 and its monoclonal antibody to erythropoietin |
JPH0686480B2 (ja) * | 1983-02-21 | 1994-11-02 | 雪印乳業株式会社 | エリスロポエチン製造用モノクローナル抗体 |
FI841281A (fi) * | 1983-03-31 | 1984-10-01 | Scripps Clinic Res | Ny faktor foer viii koagulenta polypeptider och deras monoklonala antikroppar. |
US5214033A (en) * | 1983-03-31 | 1993-05-25 | Scripps Clinic & Research Foundation | Factor VIII coagulant polypeptides |
US4657894A (en) * | 1983-03-31 | 1987-04-14 | Scripps Clinic & Research Foundation | New factor VIII coagulant polypeptides |
US4540573A (en) * | 1983-07-14 | 1985-09-10 | New York Blood Center, Inc. | Undenatured virus-free biologically active protein derivatives |
JPS61500226A (ja) * | 1983-10-28 | 1986-02-06 | ニュ−・イングランド・メディカル・センタ−・ホスピタルズ・インコ−ポレ−テッド | コンホメ−ション特異性抗体を用いる血液凝固タンパク質の精製および単離法 |
DE3588242T2 (de) * | 1984-01-12 | 2004-03-11 | Chiron Corp. (N.D.Ges.D. Staates Delaware), Emeryville | Für Faktor-VIIIc kodierende DNA-Sequenzen und verwandte DNA-Konstruktionen |
US4578335A (en) * | 1984-05-21 | 1986-03-25 | Immunex Corporation | Interleukin 2 receptor |
EP0188589A1 (de) * | 1984-07-30 | 1986-07-30 | Celltech Limited | Verfahren zur immunologischen reinigung |
JPS6151000A (ja) * | 1984-08-17 | 1986-03-13 | Toray Ind Inc | ヒト・インタ−フエロンβの精製法 |
DE3432083A1 (de) * | 1984-08-31 | 1986-03-06 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Pasteurisierte, isoagglutininfreie faktor viii-praeparation und verfahren zu ihrer herstellung |
JPS61145200A (ja) * | 1984-12-19 | 1986-07-02 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | ウシラクトフェリンの分離精製法 |
US4613501A (en) * | 1984-12-21 | 1986-09-23 | New York Blood Center, Inc. | Inactivation of viruses in labile blood derivatives |
US4743680A (en) * | 1985-02-01 | 1988-05-10 | New York University | Method for purifying antihemophilic factor |
US4673733A (en) * | 1985-04-11 | 1987-06-16 | Sudhish Chandra | Treatment of biological and pharmaceutical products adsorbed on a solid phase with virus and pyrogen inactivating agents |
JPS61242593A (ja) * | 1985-04-19 | 1986-10-28 | Toray Ind Inc | ヒト・インタ−フエロンβの精製法 |
US4758657A (en) * | 1985-07-11 | 1988-07-19 | Armour Pharmaceutical Company | Method of purifying Factor VIII:C |
US4786726A (en) * | 1986-01-06 | 1988-11-22 | Blood Systems, Inc. | Factor IX therapeutic blood product, means and methods of preparing same |
US4740306A (en) * | 1986-03-17 | 1988-04-26 | Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education | Chromatographic column |
US4774323A (en) * | 1987-06-29 | 1988-09-27 | Rorer Pharmaceutical Corporation | Purification of von Willebrand Factor solutions using gel permeation chromatography |
US4765903A (en) * | 1987-10-06 | 1988-08-23 | Interferon Sciences, Inc. | Purification of monomeric interferon |
-
1988
- 1988-03-30 CA CA000562932A patent/CA1339946C/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-31 DE DE3886249T patent/DE3886249T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-31 ES ES88302905T patent/ES2061642T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-31 EP EP88302905A patent/EP0286323B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-31 JP JP63081160A patent/JP2686766B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-04-05 DK DK198801840A patent/DK174968B1/da not_active IP Right Cessation
-
1993
- 1993-10-21 US US08140695 patent/US5470954C1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
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US5470954A (en) | 1995-11-28 |
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---|---|---|
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DE3640513C2 (de) | ||
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