DE3875850T2 - Verfahren zur gewinnung von polyosiden aus staphylokokken-kapseln sowie verwendungen dieser polyoside und staemme fuer die durchfuehrung dieses verfahrens. - Google Patents

Verfahren zur gewinnung von polyosiden aus staphylokokken-kapseln sowie verwendungen dieser polyoside und staemme fuer die durchfuehrung dieses verfahrens.

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Kapselpolyosiden von Staphylokokken und insbesondere ein Verfahren zur Gewinnung von Kapselpolyosiden, die für Staphylococcus aureus charakteristisch sind.
  • S. aureus bildet eine große Vielzahl von extrazellulären und intrazellulären Antigenen, darunter eine Vielzahl von Toxinen und Enzymen. Der Einfluß dieser Stoffwechselprodukte auf Lebensmittelvergiftungen oder bei der Bildung von Abszessen ist wohlbekannt. Anderseits konnte keine Korrelation zwischen der Anwesenheit dieser Antigene und invasiven Eigenschaften von S. aureus festgestellt werden, d. h. seine Fähigkeit, eine Blutvergiftung zu verursachen.
  • Kapselpolyoslde sind Faktoren gut bekannter Pathogenität für Bakterien, wie Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae und Neisseria meningitidis. Dies ist der Grund dafür, daß eine Vielzahl von Versuchen der Isolierung von gekapselten Staphylokokkenstämmen durchgeführt worden ist. Einige verkapselte Stämme wurden in der Literatur beschrieben (Stämme Smith, M und T). Andererseits hat die Tatsache, daß die aus Kranken isolierten Stämme von S. aureus bei der Untersuchung der Kolonien auf Gelose oder bei der mikroskopischen Untersuchung von Keimen frei von Kapseln zu sein scheinen, dazu geführt, daß die Mehrzahl der Autoren zu dem Schluß gekommen ist, daß diese Bakterie im allgemeinen keine Kapseln aufweist.
  • Jedoch hat Walter W. Karakawa in seit 1970 erschienenen Veröffentlichungen einerseits in mehreren klinischen Isolaten von Staphylokokken die Anwesenheit von Kapselpolyosiden nachgewiesen und andererseits gezeigt, daß Kapselantlgene die Bakterie gegen die Phagocytose durch mehrkernige Organismen schützt. 1980 haben Walter Karakawa und Willie Vann (Capsular Polysaccharides of Staphylococcus aureus, Seite 285-293 in J.B. Robbins, J.C. Hill und J.C. Sadoff (Hrsg.), Seminars in Infectious Disease, Vol. 4, Bacterial Vaccines. Thieme Stratton, Inc., New York) durch im wesentlichen immunologische Kriterien die Existenz von mindestens acht Kapseltypen von S. aureus nachgewiesen.
  • Die Reinigung und die biochemische und immunologische Charakterisierung des Kapselpolyoslds des Typs 8 wurde 1984 realisiert (J.M. Fournier et al., Infect. Immun. 45:87-93) und im Jahre 1985 wurde eine Methode zur Typisierung der Kapseln von S. aureus beschrieben (W.W. Karakawa et al., J. Clin, Microbiol. 22: 445-447).
  • Epidemiologische Untersuchungen, die an einer großen Vielzahl von aus Kranken Isolierten Stämmen von S. aureus durchgeführt worden sind, haben gezeigt, daß 70 bis 80 % diese Stämme das eine oder das andere der Kapselpolyoside 5 und 8 aufweisen (siehe beispielsweise R.D. Arbeit et al., Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2: 85-91 (1984)).
  • Es wurden auch für die Kapselpolyoside 5 und 8 spezifische monoklonale Antikörper hergestellt (H.K. Hochkeppel et al., J. Clin. Microbiol. 25: 526-530 (1987) und M.J. Nelles et al., Infect. Immun. 49: 14-18 (1985)).
  • Karakawa et al. (J. Clin. Microbiol. (1985), 22: 445-447) haben darüber hinaus eine Methode zur Identifizierung der Kapselpolysaccharide des Typs 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 und 8 von Staphylococcus aureus mit Hilfe einer Agglutinationsreaktion und einer Immunopräzipitationsreaktion mit Hilfe von monospezifischen Antisera beschrieben.
  • Neben Staphylococcus aureus, der ein Koagulase-positiver Staphylokokkenstamm ist, d. h. der freie Koagulase bildet (siehe Bergeys Manual), kennt man eine Vielzahl von Staphylokokkenarten, die Koagulase-negative Staphylokokken sind, d. h. die keine freie Koagulase bilden. Diese Koagulase-negativen Arten wurden von Kloos und Schleifer (Int. J. Syst. Bacteriol.: 25, Seite 50-61; Seite 62-79) klassifiziert.
  • Als Koagulase-negative Arten kann man nennen:
  • Staphylococcus simulans
  • Staphylococcus xylosus
  • Staphylococcus cohnii
  • Staphylococcus saprophiticus
  • Staphylococcus haemolyticus
  • Staphylococcus warneri
  • Staphylococcus hominis
  • Staphylococcus epidermidis
  • Staphylococcus capitis
  • Diese Koagulase-negativen Staphylokokken sind im allgemeinen für Mensch und Tier nicht pathogen. Es konnte in Koagulase-negativen Staphylokokkenstämmen kein Kapselpolyosid identifiziert werden, welches mit jenen für S. aureus beschriebenen identisch wäre. Im Gegenteil haben M.J. Nelles et al. (loc. cit.) gezeigt daß drei Stämme von S. epidermidis kein Kapselpolyosid des Typs 5 oder des Typs 8 bilden.
  • Die Anmelderin hat nunmehr gefunden, daß bestimmte Koagulase-negative Staphylokokkenstämme Kapselpolyoside bilden, die identisch mit jenen von Staphylococcus aureus sind, und dies im allgemeinen in größeren Mengen als Staphylococcus aureus. Die Frequenz der Isolierung dieser Stämme beim Menschen beträgt etwa 2 %.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft demzufolge ein Verfahren zur Gewinnung von für Staphylococcus aureus charakteristischen Kapselpolyosiden durch Züchten von Staphylokokkenstämmen, Extrahieren des Kapselpolyosids und Reinigen dieses Kapselpolyosids, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Staphylokokkenstamm einen Koagulase-negativen Staphylokokkenstamm verwendet, der aus dieses Polyosid bildenden Stämmen ausgewählt bzw. selektioniert worden ist.
  • Gegenstand der Erfindung ist weiterhin die Verwendung dieser Polyoside und insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von Impfstoffen gegen Staphylococcus aureus und diagnostische Produkte sowie isolierte und selektionierte oder ausgewählte Stämme, die Kapselpolyoside produzieren, welche für Staphylococcus aureus charakteristisch sind.
  • Die Auswahl oder Selektion eines Stammes, der ein für Staphylococcus aureus charakteristisches Kapselpolyosid produziert, kann in einfacher Weise erreicht werden
  • - entweder ausgehend von der Intakten Bakterie durch Agglutination einer Bakteriensuspension mit Hilfe von Antikörpern, die für Kapselpolyoside von Staphylococcus aureus spezifisch sind, insbesondere monoklonalen Antikörpern, wie sie bereits beschrieben worden sind, welche in Lösung verwendet werden oder nach der Fixierung an einem Träger, wie Latexteilchen,
  • - oder durch Nachweis des Kapselpolyosids in Bakterienextrakten, die erhalten worden sind, beispielsweise
  • - durch Waschen von Bakterien oder
  • - nach der Lyse der Bakterien, die durch Behandlung im Autoklaven oder durch Verwendung eines für Staphylokokken spezifischen Enzyms, wie Lysostaphin, erreicht worden ist.
  • Das Kapselpolyosid kann durch immunologische Methoden oder physicochemische Methoden in diesen Bakterienextrakten nachgewiesen werden.
  • Als Immunologische Methoden kann man nennen:
  • - Die Immunopräzipitation in einem Agarosegel (doppelte Diffusion),
  • - die Immunoelektrophorese in der Schmelze (siehe insbesondere J.M. Fournler et al. und Hochkeppel et al., loc. cit.).
  • Der für das Kapselpolyosid spezifische Antikörper wird in ein Agarosegel eingebracht, welches mit einem Puffer mit einem pH-Wert von 8,6 (einem pH-Wert, bei dem der Antikörper nicht wandert) ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Der Bakterienextrakt wird in ein Näpfchen in dem Gel eingebracht, wonach man ein elektrisches Feld anlegt, welches das gegebenenfalls in dem Extrakt enthaltene Kapselpolyosid wandern läßt. In Abhängigkeit von seiner Wanderung vereinigt sich das Kapselpolyosid mit dem Antikörper und bildet einen Niederschlag, dessen Front sich verschiebt, bis kein freies Kapselpolyosid mehr vorhanden ist. Nach dem Trocknen, dem Fixieren und der Anfärbung des Gels ermöglicht die Messung der Höhe derbeobachteten Verschiebung die Bestimmung der Menge des in dem Bakterienextrakt vorhandenen Kapselpolyosids.
  • - Immunoenzymatische Reaktionen des Typs ELISA.
  • Als physico-chemische Methoden kann man Methoden erwähnen, welche den Nachweis eines oder mehrerer Bestandteile des Kapselpolyosids ermöglichen:
  • - Gasphasenchromatographie,
  • - Hochdruckflüssigkeitschromatographie,
  • - Ionenaustauschchromatographie,
  • - Gelfiltration,
  • - Affinitätschromatographie,
  • - chemische Bestimmung der Aminozucker.
  • Ausgehend von den ausgewählten Stämmen erhält man das Kapselpolyosid in drei Stufen:
  • - Züchten der Bakterien,
  • - Extraktion des Kapselpolyosids,
  • - Reinigung des Kapselpolyosids.
    • 1) Züchten der Bakterien:
  • Als Kulturmedium kann man insbesondere das Columbia-Medium (Difco) in flüssigem oder festem Zustand (wobei man eine bessere Bildung des Kapselpolyosids durch Bakterien erhält, die auf festem Medium gezüchtet werden) verwenden, bei einer Züchtungsdauer von beispielsweise einer Nacht bei 37ºC.
    • 2) Extraktion des Kapselpolyosids:
  • Man kann zwei Verfahren anwenden:
  • - Behandlung im Autoklaven,
  • - Lyse der Bakterien mit Lysostaphin.
    • a) Extraktion durch Behandeln im Autoklaven:
  • Die auf festem Medium gezüchteten Bakterien werden in gepuffertem physiologischem Wasser (EPT) (5 ml für eine Petrischale mit einem Durchmesser von 9 cm) in Suspension gebracht und dann während 1 Stunde bei 121ºC im Autoklaven behandelt. Nach dem Zentrifugieren während 20 Minuten bei 25000 g wird die überstehende Flüssigkeit aufbewahrt und der Zentrifugenrückstand erneut unter den gleichen Bedingungen extrahiert. Nach dem Zentrifugieren während 20 Minuten bei 25000 g werden die beiden überstehenden Flüssigkeiten vereinigt, gegen destilliertes Wasser dialysiert und gefriergetrocknet. Man erhält in dieser Weise den rohen Extrakt (EB).
  • Aus 100 Petrischalen erhält man etwa 10 g des feuchten Bakterienrückstands und 2 g des rohen Extrakts (EB).
  • Die in flüssigem Medium gezüchteten Bakterien werden durch Zugabe von Phenol und Ethanol (1.5 %, 24 h bei Raumtemperatur) abgetötet, dann durch Zentrifugieren während 20 Minuten bei 25000 g oder durch Ultrafiltration beispielsweise mit Hilfe eines Filters (Durapore Typ HV 0,45 um der Firma Millipore) gewonnen. Der Bakterienrückstand wird erneut in gepuffertem physiologischem Wasser (EPT) suspendiert (0, 1 g des feuchten Bakterienrückstands/ml EPT) und dann durch Behandeln im Autoklaven bei den oben beschriebenen Bedingungen extrahiert.
    • b) Extraktion mit Lysostaphin:
  • Man suspendiert den Bakterienrückstand in gepuffertem physiologischem Wasser (EPT) (0,5 g/ml), das 25 mg Lysostaphin pro Liter enthält. Man rührt die Suspension während einer Nacht bei 37ºC und zentrifugiert dann während 20 Minuten bei 25000 g. Die überstehende Flüssigkeit wird gegen destilliertes Wasser dialysiert und dann gefriergetrocknet.
    • 3) Reinigung des Kapselpolyosids:
  • Eine vorteilhafte Methode zur Reinigung ist die folgende:
    • a) Enzymatische Behandlung des rohen Extrakts (EB):
  • Man nimmt den rohen Extrakt (EB) in gepuffertem physiologischem Wasser (EPT, 10 mg/ml) auf, behandelt mit DNase und RNase (0. 1 mg/ml, 6 h bei 37ºC) und dann mit Protease (1 mg/ml über Nacht bei 37ºC). Das Produkt wird anschließend gegen destilliertes Wasser dialysiert und gefriergetrocknet. 2 g des rohen Extrakts (EB) ergeben etwa 0,7g des mit Enzymen behandelten Extrakts (ETE). Diese Behandlung ermöglicht die Beseitigung des Großteils der Proteine und der Nucleinsäuren.
    • b) Ionenaustauschchromatographie:
  • Der mit Enzymen behandelte Extrakt (ETE) wird mit einem Natriumacetat- Puffer (0,05 M, pH = 6) aufgenommen, der Natriumchlorid (0,1 M) enthält und dann auf einen Ionenaustauscher (beispielsweise DEAE-Cellulose) aufgebracht, der mit dem gleichen Puffer ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Die Hauptmenge der in dem mit Enzymen behandelten Extrakt (ETE) enthaltenen Proteine wird nicht von dem Ionenaustauscher absorbiert und wird daher durch Waschen des Ionenaustauschers mit dem Äquilibrierungspuffer beseitigt. Andererseits bleiben das Kapselpolyosid, die Teichonsäure und die Nucleinsäuren an den Ionenaustauscher gebunden.
  • Das Kapselpolyosid wird eluiert, indem man einen Puffer, der eine höhere Natriumchloridkonzentration aufweist, durch den Ionenaustauscher führt. Beispielsweise wird das Kapselpolyosid des Typs 5 mit einem Natriumacetat-Puffer (0,05 M, pH = 6), der Natriumchlorid mit einer Konzentration von 0,15 M enthält, eluiert. Zur Elution des Kapselpolyosids des Typs 8 muß die Natriumchloridkonzentratlon 0.18 M betragen. Die Eluate werden in einem Fraktionssammler aufgefangen, wonach die Fraktionen, welche das Kapselpolyosid enthalten (welches durch eine immunologische Reaktion unter Verwendung von spezifischen Antikörpern nachgewiesen wird) vereinigt, gegen destilliertes Wasser dialysiert und dann gefriergetrocknet werden.
  • Man erhält ausgehend von 0,7 g des mit Enzymen behandelten Extrakts (ETE) etwa 20 mg des durch Ionenaustausch gereinigten Extrakts (EEI). Diese Ionaustauschchromatographie ermöglicht die Beseitigung des größten Anteils der Proteine, der Nucleinsäuren und der Teichonsäure.
    • c) Gelfiltration:
  • Der durch Ionenaustausch gereinigte Extrakt (EEI) wird in einer Natriumchloridlösung (0,2 M) gelöst und über Sepharosegel 4B-CL filtriert. Die Fraktionen, welche das Kapselpolyosid enthalten und die durch immunologische Reaktion nachgewiesen worden sind, werden vereinigt, gegen destilliertes Wasser dialysiert und gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Produkt besteht aus gereinigtem Kapselpolyosid.
  • Dieses Kapselpolyosid ist mit weniger als 1 % Proteinen, weniger als 0,5 % Nucleinsäuren und weniger als 0.05 % Teichosäure verunreinigt. Ausgehend von 20 mg des durch Ionenaustausch gereinigten Extrakts (EEI) erhält man etwa 10 mg des gereinigten Kapselpolyosids. Schließlich erhält man ausgehend von 10 g des feuchten Bakterienrückstands, den man von 100 Petrischalten gewonnen hat, etwa 10 mg des gereinigten Kapselpolyosids.
  • Beispielsweise wurden die folgenden Koagulase-negativen Staphylokokkenstämme isoliert, die Kapselpolyosid produzieren, welches identisch ist mit dem von Staphylococcus aureus: Nummer des Stammes Hinterlegungsnummer beim CNCM Hinterlegungsdatum: Morphologie gram-positive Kokken Katalase Fermentierung im MEVAG-Medium DNAse Koagulase Kapseltyp
  • Zur Auswahl der Stämme, die Kapselpolyoside produzieren, die für Staphylococcus aureus charakteristisch sind, bringt man die Bakteriensuspension mit einer bestimmten Menge der für Kapselpolyoside spezifischen Antikörper in Kontakt. Der Nachweis der nach der Bakterienlyse erhaltenen Kapselpolyoside erfolgt durch Schmelzimmunoelektrophorese (nach der Methode von J.M. Fournier, loc. cit.) oder nach der ELISA-Mathode.
  • Jeder Stamm, der in starkem Maße Kapselpolyoside produziert, wurde mit diesen beiden Methoden charakterisiert.
  • Diese Stämme besitzen die folgenden biochemischen Identifizierungscharakteristiken nach dem System Api Staph: Nummer des Stammes D-Glucose D-Fructose D-Mannose Maltose Lactose D-Trehalose D-Mannit Xylit D-Melibiose Kaliumnitrat α-Naphthylphosphat Natriumpyruvat Raffinose Xylose Saccharose α-Methyl-D-Glucosid N-Acetylglucosamin Arginin Harnstoff Art* Staphylococcus haemolyticus Staphylococcus hominis * Nach der Klassifizierng von Kloos und Schleifer
  • Das Antibiogramm dieser Stämme ist das folgende: Nummer des Stammes Penicillin G Oxacillin Tobramycin Gentamicin Tetracyclin Erythromycin Clindamycin Pristinamycin Trimethoprim + Sulfamide Rifampicin Fusidinsäure Vancomycin R = Beständig S = Empfindlich
  • Beispielsweise wurden bei dem Verfahren zur Gewinnung der Kaposelpolyoside, die durch Behandeln von 10&sup9; Bakterien im Autoklaven extrahiert worden sind, die in der folgenden Tabelle angegebenen Mengen erhalten. Diese Werte geben nur einen Anhaltspunkt, da die Bildung des Kapselpolyosids von einer Kultur zur anderen stark variiert. Nummer des Stammes Art Kapseltyp Bildung von Kapselpolyosid (ug) S. haemolyticus S. hominis
  • Die ausgehend von Koagulase-negativen Staphylokokkenstämmen erhaltenen Kapselpolyoside können verwendet werden für:
  • a) die Herstellung von Impfstoffen gegen Staphylococcus aureus, die in der Humanmedizin oder der Veterinärmedizin zur Erzielung eines individuellen Schutzes verwendet werden können oder
  • - zur Herstellung von Immunseren, die für die Herstellung von Anti-Kapselpolyosid-Antikörpern verwendet werden können, die in der passiven Immuntherapie oder zur Diagnose durch Agglutinations-, ELISA-, RIA- oder Western Blot- Methoden in an sich bekannter Weise verwendet werden können;
  • b) die Herstellung von Diagnoseprodukten zur Diagnose am Menschen, am Tier oder für landwirtschaftliche Nahrungsmittelprodukte und insbesondere für:
  • - den Nachweis von für Kapselpolyoside spezifische Antikörper in biologischen Produkten oder
  • - den Nachweis von Kapselpolyosid in klinisch isolierten Präparaten von Koagulase-positiven oder Koagulase-negativen Staphylokokken.

Claims (8)

1. Verfahren zur Gewinnung eines für Staphylococcus aureus charakteristischen Kapselpolyosids durch Züchten von Staphylokokkenstämmen, Extrahieren des Kapselpolyosids und Reinigen dieses Kapselpolyosids, dadurch gekennzeichnet, daß man als Staphylokokkenstamm einen Koagulase-negativen Staphylokokkenstamm verwendet, der aus dieses Polyosid bildenden Stämmen ausgewählt worden ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Koagulase-negativen Staphylokokkenstamm, der ein für Staphylococcus aureus charakteristisches Kapselpolyosid bildet, durch Agglutinationsreaktion mit Hilfe von für Kapselpolyoside von Staphylococcus aureus spezifischen Antikörpern auswählt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Koagulase-negativen Staphylokokkenstamm, der ein Kapselpolyosid bildet, das von einem Stamm von Staphylococcus aureus gebildet wird, durch Nachweis des Kapselpolyosids in einem Bakterienextrakt des Stammes auswählt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Bakterienextrakt ein durch Waschen der Bakterien erhaltener Extrakt ist.
5. Verfahren nach Anspruch 3. dadurch gekennzeichnet, daß der Bakterienextrakt ein durch Lyse der Bakterien erhaltener Extrakt ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man das Kapselpolyosid nach der Behandlung im Autoklaven extrahiert.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man das Kapselpolyosid nach der Lyse der Bakterien mit einem Lysemittel extrahiert.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man das extrahierte Kapselpolyosid durch enzymatische Behandlung, gefolgt von einer Ionenaustauschchromatographie und einer Gelfiltration, reinigt.
DE8888401996T 1987-08-03 1988-07-29 Verfahren zur gewinnung von polyosiden aus staphylokokken-kapseln sowie verwendungen dieser polyoside und staemme fuer die durchfuehrung dieses verfahrens. Expired - Fee Related DE3875850T2 (de)

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