DE3875396T2

DE3875396T2 - Mikrotraegermaterial fuer die zellkultur.

Info

Publication number: DE3875396T2
Application number: DE8888110568T
Authority: DE
Inventors: Tsuyoshi Ito; Hirohisa Kubota; Hiroshi Kusano
Original assignee: Mitsubishi Kasei Corp
Current assignee: Mitsubishi Kasei Corp
Priority date: 1987-07-03
Filing date: 1988-07-01
Publication date: 1993-03-04
Anticipated expiration: 2008-07-02
Also published as: EP0297605B1; EP0297605A3; DE3875396D1; EP0297605A2; US5006467A; JPS6410979A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

1. Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft Zellkultur-Mikroträger zur Verwendung bei der Kultivierung haftungsabhängiger Zellen, insbesondere Zellkultur-Mikroträger, welche geeignet sind zur Verwendung bei der hochdichten Kultivierung haftungsabhängiger Zellen, welche an den suspendierten oder stationären Mikroträgern anhaften.

2. Beschreibung des Standes der Technik

In den letzten Jahren ist bei der Kultivierung haftungsabhängiger Zellen ein rascher Fortschritt erzielt worden. Eine der früheren, hierfür eingesetzten Verfahrenstechniken besteht aus einem Mikroträgersystem. Die Mikroträger, welche bis heute bekannt geworden sind, sind beispielsweise diejenigen, welche aus einer vernetzten Dextranmatrix gebildet worden sind, wie etwa Cytodex® (im Handel erhältlich von Pharmacia Fine Chemicals, Inc.) und Superbeads (im Handel erhältlich von Flow Labs, Inc.) sowie diejenigen, welche aus Celluloseteilchen gebildet worden sind, wie etwa DE-52 und DE-53 (im Handel erhältlich von Whatman, Inc.). Diese Mikroträger besitzen jedoch den Nachteil, daß die Rückgewinnung der erwünschten biologisch aktiven Substanzen sehr gering ist aufgrund einer extrem hydrophoben Interaktion mit Proteinen von Diethylaminoethyl-(DEAE)-Gruppen, welche darin als funktionelle Gruppen verwendet werden.
Obwohl Mikroträger auf Basis von Polystyrol ebenso verfügbar sind, weisen diese den gleichen Nachteil, wie oben erwähnt, auf, da Polystyrol selbst eine stark hydrophobe Substanz ist.
Wenn Grundpolymere oder funktionelle Gruppen mit höherer Hydrophobizität verwendet würden, würden die Ausdehnungsfähigkeit oder die Wachstumsfähigkelt von Zellen bei niedrigen Serumbedingungen schädlich beeinflußt, was sogar zum Absterben der Zellen führen kann.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist es, Zellkultur-Mikroträger vorzusehen, die in wirtschaftlicher Weise hergestellt werden können.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht darin, Zellkultur-Mikroträger vorzusehen, die eine geringe unspezifische Adsorptionseigenschaft für Proteine besitzen und in der Lage sind, erwünschte biologisch aktive Substanzen, welche durch tierische Zellen produziert werden, in wirksamer Weise rückzugewinnen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht darin, Zellkultur-Mikroträger vorzusehen, die unter einer niedrigen Serumbedingung verwendet werden können.
Die Zellkultur-Mikroträger gemäß der vorliegenden Erfindung bestehen somit aus wasserunlöslichen Polymerteilchen, die aus (Meth)acrylester zusammengesetzt sind, wobei die Teilchen einen durchschnittlichen Durchmesser von 100-1000 um und eine Dichte von 1,00-1,20 g/ml in einem Kulturmedium sowie positiv ladbare chemische Bestandteile aufweisen, die wenigstens auf deren Oberflächen verteilt sind, wobei diese Bestandteile durch die Umsetzung zwischen dem Ester und Ammoniak oder einem Amin mit 5 oder weniger Kohlenstoffatomen in die Teilchen eingeführt worden sind.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die wesentlichen Vorteile der vorliegenden Erfindung können von den Eigenschaften abgeleitet werden, daß die Grundmatrix der erlindungsgemäßen Mikroträger aus den wasserunlöslichen Teilchen besteht, welche durch Polymerisation von (Meth)acrylester erhalten worden sind und daß die positiv ladbaren chemischen Bestandteile durch Umsetzung zwischen dem Ester und Ammoniak oder einem Amin mit S oder weniger Kohlenstoffatomen in die Teilchen eingeführt worden sind.
Die erfindungsgemäßen Mikroträger können hergestellt werden durch Herstellen der wasserunlöslichen Polymerteilchen durch eine Suspensionspolymerisation vom O/W- oder W/O/W-Typ unter Verwendung von (Meth)acrylester als Monomer und nachfolgende Behandlung der resultierenden Polymerteilchen mit Ammoniak oder einem Amin mit 5 oder weniger Kohlenstoffatomen.
Als bei der vorliegenden Erfindung geeigneter (Meth)acrylester können beispielhaft 2-Hydroxyethyl(meth)acrylat, Diethylenglykol(meth)acrylat, Octaethylenglykol(meth)acrylat, Polyethylenglykol(meth)acrylat, Methyl(meth)acrylat, Ethyl- (meth)acrylat und Glycidyl(meth)acrylat genannt werden. Jedes geeignete Vernetzungsmittel kann wahlweise den oben genannten Estermonomeren zugegeben werden. Die aus Polyethylenglykol(meth)acrylat und/oder Glycidyl(meth)acrylat zusammengesetzten Polymerteilchen enthalten vorzugsweise das Vernetzungsmittel, um einen Leckverlust des (Meth)acrylesters aus den hergestellten Teilchen zu verhindern, sofern diese nicht wasserunlöslich sind. Jede Verbindung, die mit Polyethylenglykol(meth)acrylat und/oder Glycidyl(meth)acrylat copolymerisiert werden kann, kann als Vernetzungsmittel verwendet werden, wobei Ethylenglykoldimethacrylat, Diethylenglykoldimethacrylat, Polyethylenglykoldimethacrylat, Glycerindimethacrylat und Glycerintrimethacrylat Beispiele hierfür sind.
Obwohl die Zugabe des Vernetzungsmittels angesichts der obigen Ausführungen bevorzugt ist, würde ein hoher Gehalt an diesem den Quellungsgrad der Polymerteilchen reduzieren und es unmöglich machen, eine bevorzugte Dichte zu erzielen. Daher liegt der Gehalt des Vernetzungsmittels vorzugsweise im Bereich von 0 bis 100%, weiter bevorzugt von 0 bis 40 Gew.-%.
2-Hydro-ethyl(meth)acrylat, Polyethylenglykol(meth)acrylat, Glycidyl(meth)acrylat und dergleichen können bei der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise verwendet werden, da diese die hydrophilen Polymerteilchen in wirtschaftlicher Weise erzeugen können.
Die Suspensionspolymerisation vom O/W- oder W/O/W-Typ gemäß der vorliegenden Erfindung kann in herkömmlicher Weise in Gegenwart eines organischen Verdünnungsmittels und eines Polymerisationsinitiators durchgeführt werden.
Jedes organische Verdünnungsmittel, welches gegenüber funktionellen Gruppen, wie etwa Glycidyl und Hydroxyl, inaktiv ist, kann für die Polymerisation eingesetzt werden. Beispiele geeigneter organischer Verdünnungsmittel umfassen Pentanol, Hexanol, Heptanol, Octanol, Cyclohexanol, Toluol, Chlorbenzol, Dibutylether, Diamylether, Propylacetat, Butylacetat, Methylisobutylketon und Cyclohexanon. Die organischen Verdünnungsmittel können vorzugsweise in einer Menge von dem 0- bis 10,0-fachen des Gewichts der Gesamtmenge der Monomeren zugegeben werden.
Beispiele geeigneter Polymerisationsinitiatoren umfassen Benzoylperoxid, Lauroylperoxid und Azobisisovaleronitril, welche üblicherweise in einer Menge von 0,01 bis 5 %, vorzugsweise von 0,05 bis 1,0 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Monomeren, verwendet werden können.
Der durchschnittliche Durchmesser und die Dichte der erfindungsgemäßen Zellkultur-Mikroträger können von der Zusammensetzung der Monomeren und dem Verhältnis der verwendeten Vernetzungsmittel und organischen Verdünnungsmittel, dem Typ der positiv ladbaren chemischen Bestandteile, der Rührgeschwindigkelt während der Polymerisation und der Form oder Gestalt des Rührpropellers abhängen. Ersterer und letztere sollten jedoch vorzugsweise auf die Bereiche von 100 bis 1000 um und von 1,00 bis 1,20 g/ml eingestellt werden, um die Mikroträger beim Rühren oder einem Strömungszustand (pneumatische Förderung oder Aufstrom-Typ) während der Kultivierung in homogener Weise suspendiert zu halten. Weiterhin weisen die Mikroträger vorzugsweise eine enge Durchmesserverteilung auf zum Zwecke der Bewirkung des homogenen Anhaftens und Wachsens der Zellen sowie der homogenen Suspension der Mikroträger.
Nach Vervollständigung der Suspensionspolymerisation werden die resultierenden Polymerteilchen filtriert und gewaschen.
Das Vorliegen der positiv ladbaren chemischen Bestandteile zumindest auf der Oberfläche der Mikroträger ist unbedingt erforderlich, so daß die haftungsabhängigen Zellen in vorteilhafter Weise an den Mikroträgern haften und darauf wachsen können. Die Erfinder haben bereits Zellkultur-Mikroträger vorgeschlagen, welche positiv ladbare chemische Bestandteile besitzen (siehe japanische Patentanmeldung Nr. 217610/86).
Wie vorangehend beschrieben, hat sich nun gezeigt, daß Ammoniak und ein Amin mit 5 oder weniger Kohlenstoffatomen in vorteilhafter Weise als positiv ladbare chemische Bestandteile angesichts der folgenden Gründe verwendet werden können: Diese können in wirksamer Weise haftungsabhängige Zellen an den Mikroträgern anhaften und diese selbst bei geringer Serumkonzentration anwachsen lassen. Sie adsorbieren kaum die erwünschten biologisch aktiven Substanzen, welche durch tierische Zellen produziert werden oder sie können alternativ dazu in wirksamer Weise die erwünschten Substanzen, die einmal darauf adsorbiert wurden, eluieren.
So wie die Anzahl der Kohlenstoffatome beim Amin (hydrophober Parameter) höher wird, wird die Interaktion zwischen den Zellen und den Mikroträgern stärker, was üblicherweise in einer Zunahme der Anzahl der angehafteten Zellen an den Mikroträgern resultiert, was es aber ebenso schwierig macht, die einmal an den Mikroträgern adsorbierten, biologisch aktiven Substanzen zu eluieren. Zu viele Kohlenstoffatome beim Amin würden sogar das Wachstum und die Ausbreitung der Zellen inhibieren.
Beispiele bevorzugter positiv ladbarer chemischer Bestandteile gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen Ammoniak, Methylamin, Dimethylamin, Trimethylamin, Ethylamin, Diethylamin, Butylamin, Dimethylhydrazin, Ethylendiamin, 1,3-Propandiamin, 1,4-Butandiamin, N,N-Dimethylethylendiamin, Ethanolamin, N-Methylethanolamin, 2-Hydroxypropylamin, 3-Amino-1,2-propandiol, Methoxyethylamin, Glykolamin (NH&sub2;-CH&sub2;-CH&sub2;-O-CH&sub2;-CH&sub2;-OH), 2-(2-Aminoethylamino)-ethanol (NH&sub2;-CH&sub2;-CH&sub2;-NH-CH&sub2;-CH&sub2;-OH), 3-Methoxypropylamin, 2-Ethoxyethylamin, 2-Amino-2-methyl-1-propanol, Dimethylethanolamin, 2-Methyl-2-amino-1,3-propandiol, N-Methyldiethanolamin, 2-(2-Aminoethylamino)-ethanol, Aminoethanthiol, Piperazin, Pyrrolidin, Imidazolidin, Pyrazolidin, Morpholin, Thiamorpholin, Diethylentriamin, Dimethylaminoethylhalogenid und Dimethylaminoethanol.
Die oben genannten chemischen Bestandteile können mit einer funktionellen Gruppe, wie etwa der endständigen Hydroxygruppe von Ethylenglykol(meth)acrylat, Diethylenglykol(meth)acrylat und Polyethylenglykol(meth)acrylat, welche vorausgehend durch Bromcyan, Carbonylimidazol oder 2,2,2-Trifluorethansulfonylchlorid aktiviert worden sind, umgesetzt werden. Alkylamin, Alkylendiamin und Alkanolamin können leicht in die Polymerteilchen aus Glycidyl(meth)acrylat durch die Umsetzung in Gegenwart eines geeigneten Lösungsmittels, wie etwa Wasser, Ethanol und Dioxan, über wenige Stunden bei einer Temperatur im Bereich von Raumtemperatur bis zur Rückflußtemperatur, mit der daraus durch Hydrolyse gebildeten Epoxy- oder Glycerylgruppe eingeführt werden. Die positiv ladbaren chemischen Bestandteile können ebenso durch die Umsetzung von Hydroxygruppen der Polymerteilchen mit Dialkylaminoalkylchlorid, Dialkylaminoalkylbromid, Trialkylaminoalkylchlorid und Trialkylaminoalkylbromid gebildet werden.
Angesichts der Aspekte der vorliegenden Erfindung ist es zumindest erforderlich, daß die positiv ladbaren chemischen Bestandteile auf den Teilchenoberflächen (etwa 10 nm in der Tiefe), welche in Kontakt mit Zellen kommen können, verteilt sein sollten. Die chemischen Bestandteile können jedoch innerhalb oder in den gesamten Polymerteilchen vorliegen, ohne schädliche Wirkungen zu verursachen.
Der Gehalt an positiv ladbaren chemischen Bestandteilen kann mit solchen Faktoren, wie den Zellen und den chemischen Bestandteilen selbst, der Konzentration der Mikroträger im Kulturmedium und den Kulturbedingungen, variieren. Die als geeignet gefundene Ladungskapazität liegt im Bereich zwischen 0,5 und 2,5 mÄq. pro 1 Gramm trockener Mikroträger.
Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele näher erläutert, die nicht als beschränkend bezüglich des Umfangs der Erfindung angesehen werden können.

Beispiel 1

In einen mit einem Thermometer, einer N&sub2;-Leitung, einem Kondensator und Rührblättern ausgerüsteten Vierhals-Kolben (300 ml) wurden 30 g CaCl&sub2;-Dihydrat, 50 ml einer wäßrigen Polyvinylalkohollösung und 85 ml Ionenausgetauschtes Wasser gegeben und vermischt. Die nachfolgenden Umsetzungen wurden alle in N&sub2;-Atmosphäre durchgeführt. Zu der resultierenden Lösung wurden 30 g 1-Hexanol, 30 g Cyclohexanol, 15 g 1-Octanol, 13 g Polyethylenglykolmethacrylat (PE-350: Handelsbezeichnung, im Handel erhältlich von Nippon Oil and Fats Co., Ltd.). 6,0 g Glycidylmethacrylat, 1,00 g Glycerindimethacrylat und 200 mg Azobisisovaleronitril (V-65, Handelsbezeichnung) zugegeben. Nach stufenweisem Erwärmen auf 70ºC wurde die Polymerisationsreaktion während 5 Stunden unter Beibehaltung dieser Temperatur durchgeführt. Nach Vervollständigung der Umsetzung wurde das resultierende Polymer auf einem Büchner-Trichter abfiltriert und gewaschen. Das gewaschene Polymer wurde erneut in den Kolben gegeben, worauf eine bestimmte Menge Methanol zugegeben und unter Rühren 20 Minuten gekocht wurde, um das Polymer zu waschen. Die obigen Waschbehandlungen wurden sechsmal wiederholt. Das Polymer wurde erneut mit Wasser auf einem Büchner-Trichter gewaschen und dann in dem Kolben unter Rühren während etwa 30 Minuten bei etwa 90ºC behandelt, wobei das Waschverfahren erneut wiederholt wurde.
Die so in einer Ausbeute von 84% hergestellten farblosen und transparenten Teilchen mit kugelförmigem Körper wurden durch ein Standardsieb geführt, um die Teilchen von 210 bis 250 um Durchmesser auszuwählen, die nachfolgend als "Polymer 1" bezeichnet werden.
Polymer 1 (30 ml nach Absetzen in einem Meßzylinder) wurde gründlich gewaschen und mit 1,4-Dioxan quellen gelassen. Das gequollene Polymer 1 und 30 ml 1,4-Dioxan wurden in einen 300 ml-Kolben gegeben. Hierzu wurden tropfenweise 15 ml einer 5.0 g Methoxyethanolamin enthaltenden Dioxanlösung gegeben und 4 Stunden bei 70ºC umgesetzt. Die so hergestellten Polymerteilchen wurden ausreichend mit Wasser und darauffolgend mit 10%-iger wäßriger Schwefelsäurelösung gewaschen. Die gewaschenen Teilchen und 50 ml frische 10%-ige wäßrige Schwefelsäurelösung wurden erneut in den Kolben gegeben und 4 Stunden bei 70ºC erhitzt, um nichtreagierte Epoxygruppen zu hydrolysieren, wonach sorgfältig gewaschen wurde. Die resultierenden Polymerteilchen werden als "Micro Carrier-1 (MC-1)" bezeichnet. Die Elementaranalyse von MC-1 ist wie folgt:
C 53,26% H 8,23 % N 1,94%
Auf der Grundlage der obigen Analyse wurde die Ladungskapazität von MC-1 mit 1,54 mÄq. pro Gramm Trockengewicht charakterisiert. Der Quellungsgrad in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), der durchschnittliche Durchmesser und die Dichte von MC-1 wurden mit 12,5 ml/g Gel, 210 um und 1,05 g/ml bestimmt.

Beispiel 2

Polymer 1 (30 ml nach Absetzen in einem Meßzylinder) wurden gründlich gewaschen und mit 1,4-Dioxan quellen gelassen. Das gequollene Polymer 1 und 30 ml 1,4-Dioxan wurden in einen 300 ml-Kolben gegeben. Hierzu wurden tropfenweise 15 ml einer 5,0 g Ethanolamin enthaltenden Dioxanlösung gegeben. Es wurden die gleichen Behandlungen wie in Beispiel 1 durchgeführt, um "Micro Carrier-2 (MC-2)" zu erhalten, deren Elementaranalyse wie folgt ist:
C 47,26% H 8,00% N 21,4%
Auf Basis der obigen Analyse wurde die Ladungskapazität von MC-2 mit 1,69 mÄq. pro Gramm Trockengewicht charakterisiert. Der Quellungsgrad in PBS, der durchschnittliche Durchmesser und die Dichte von MC-2 wurden mit 23,3 ml/g Gel, 210 um und 1,03 g/ml bestimmt.

Beispiel 3

Polymer 1 (30 ml nach Absetzen in einem Meßzylinder) wurde gründlich gewaschen und mit 1,4-Dioxan quellen gelassen. Das gequollene Polymer 1 und 30 ml 1,4-Dioxan wurden in einen 300 ml-Kolben gegeben. Hierzu wurden tropfenweise 15 ml einer 5,0 g Aminoethanthiol enthaltenden Dioxanlösung gegeben. Es wurden die gleichen Behandlungen wie in Beispiel 1 durchgeführt, um "Micro Carrier-3 (MC-3)" zu erhalten, deren Elementaranalyse wie folgt ist:
C 52,71% H 8,10% N 2,23%
Auf der Grundlage der obigen Analyse wurde die Ladungskapazität von MC-3 mit 1,52 mÄq. pro Gramm Trockengewicht charakterisiert. Der Quellungsgrad in PBS, der durchschnittliche Durchmesser und die Dichte von MC-3 wurden mit 17,9 ml/g Gel, 190 um und 1,04 g/ml bestimmt.

Beispiel 4

Polymer 1 (30 ml nach Absetzen in einem Meßzylinder) wurde gründlich gewaschen und mit 1,4-Dioxan quellen gelassen. Das gequollene Polymer 1 und 30 ml 1,4-Dioxan wurden in einen 300 ml-Kolben gegeben. Hierzu wurden tropfenweise 15 ml einer 7,5 g Diglykolamin enthaltenden Dioxanlösung gegeben. Es wurden die gleichen Behandlungen wie in Beispiel 1 durchgeführt, um "Micro Carrier-4 (MC-4)" zu erhalten, deren Elementaranalyse wie folgt ist:
C 47,26% H 8,00% N 2,14%
Auf der Grundlage der obigen Analyse wurde die Ladungskapazität von MC-4 mit 1,52 mÄq. pro Gramm Trockengewicht charakterisiert. Der Quellungsgrad in PBS, der durchschnittliche Durchmesser und die Dichte von MC-4 wurden mit 22,6 ml/g Gel, 215 um und 1,03 g/ml bestimmt.

Beispiel 5

Polymer 1 (30 ml nach Absetzen in einem Meßzylinder) wurde gründlich gewaschen und mit 1,4-Dioxan quellen gelassen. Das gequollene Polymer 1 und 30 ml 1,4-Dioxan wurden in einen 300 ml-Kolben gegeben. Hierzu wurden tropfenweise 15 ml einer 5,0 g 2,3-Dihydroxypropylamin enthaltenden 50%-igen Dioxanlösung gegeben. Es wurden die gleichen Behandlungen wie in Beispiel 1 durchgeführt, um "Micro Carrier-5 (MC-5)" zu erhalten, deren Elementaranalyse wie folgt ist:
C 51,48% H 8,03% N 1,80%
Auf der Grundlage der obigen Analyse wurde die Ladungskapazität von MC-5 mit 1,45 mÄq. pro Gramm Trockengewicht charakterisiert. Der Quellungsgrad in PBS, der durchschnittliche Durchmesser und die Dichte von MC-5 wurden mit 21,3 ml/g Gel, 210 um und 1,03 g/ml bestimmt.

Beispiel 6

Polymer 1 (30 ml nach Absetzen in einem Meßzylinder) wurde gründlich gewaschen und mit 1,4-Dioxan quellen gelassen. Das gequollene Polymer 1 und 30 ml 1,4-Dioxan wurden in einen 300 ml-Kolben gegeben. Hierzu wurden tropfenweise 5,0 ml einer 28%-igen wäßrigen Ammoniaklösung gegeben und die Reaktionsmischung stufenweise auf 40ºC erwärmt und bei dieser Temperatur während der Umsetzung gehalten. Die Umsetzung wurde 4 Stunden unter Zugabe von 3,0 ml 28%-igem Ammoniak in Abständen von 1 Stunde fortgeführt. Es wurden die gleichen Behandlungen wie in Beispiel 1 durchgeführt, um "Micro Carrier-6 (MC-6)" zu erhalten, deren Elementaranalyse wie folgt ist:
C 52,12% H 8,24% N 1,36%
Auf der Grundlage der obigen Analyse wurde die Ladungskapazität von MC-6 mit 1,62 mÄq. pro Gramm Trockengewicht charakterisiert. Der Quellungsgrad in PBS, der durchschnittliche Durchmesser und die Dichte von MC-6 wurden mit 21,5 ml/g Gel, 210 um und 1,03 g/ml bestimmt.

Bezugsbeispiel

Polymer 1 (30 ml nach Absetzen in einem Meßzylinder) wurde gründlich gewaschen und mit 1,4-Dioxan quellen gelassen. Das gequollene Polymer 1 und 30 ml 1,4-Dioxan wurden in einen 300 ml-Kolben gegeben. Hierzu wurden tropfenweise 15 ml einer 10,0 g 1,6-Hexandiamin enthaltenden Dioxanlösung gegeben. Es wurden die gleichen Behandlungen wie in Beispiel 1 durchgeführt, um "Micro Carrier-7 (MC-7)" zu erhalten, deren Elementaranalyse wie folgt ist:
C 51,34% H 8,51% N 3,47%
Auf der Grundlage der obigen Analyse wurde die Ladungskapazität von MC-7 mit 1,45 mÄq. pro Gramm Trockengewicht charakterisiert. Der Quellungsgrad in PBS, der durchschnittliche Durchmesser und die Dichte von MC-7 wurden mit 18,1 ml/g Gel, 205 um und 1,04 g/ml bestimmt.

Beispiel 7

Die Adsorptionseigenschaften der in den obigen Beispielen hergestellten Mikroträger wurden unter Verwendung von Rinder-Serumalbumin (BSA) als Standardproteinprobe bestimmt.
Die Mikroträger wurden in PBS bei pH 7,40 quellen gelassen, um 10,0 ml zu ergeben. Die gequollenen Mikroträger wurden entwässert und zu 100 ml PBS, enthalten 0,10% BSA, gegeben, woraufhin 6 Stunden bei 37ºC gerührt wurde. Die Adsorptionseigenschaften wurden durch Messung der Extinktion (280 nm) jeder PBS-Suspension bestimmt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 Beispiel Nr. Mikroträger Adsorptionsverhältnis (%) Beispiel Referenzbeispiel Cytodex® (Pharmacia)

Beispiel 8

Vero-Zellen (Nierenzellen afrikanischer Grünaffen), CHO-K&sub1;-Zellen (Chinese Hamster Ovary)-Zellen und L-929-Zellen (Maus-Cellulofibroblast) wurden unter Verwendung der Zellkultur-Mikroträger gemäß der vorliegenden Erfindung der Kultivierung unterzogen.
MC-1, MC-2, MC-3, MC-4, MC-5, MC-6 und Cytodex-1 wurden gründlich nacheinander mit Wasser und Dulbecco's Modified Eagle's Medium gewaschen. Die resultierenden Mikroträger (30 ml) wurden 20 Minuten bei 120ºC im Autoklaven behandelt. Die so sterilisierten Mikroträger und 15 ml Fetalkälberserum wurden in einen Spinner-Kolben gegeben und TS-2-Medium wurde bis zu einem Gesamtvolumen von 300 ml ergänzt. Die Mikroträgerkulturen wurden durch Zugabe einer 3,0-5,0·10&sup7; trypsinierte Zellen enthaltenden Suspension zu der obigen Mikroträger-Suspension initiiert. L-929-Zellen und Vero-Zellen erreichten einen Zusammenflußzustand in etwa 6 bis 8 Tagen, während CHO-K&sub1;-Zellen etwa 8 bis 11 Tage zur Erreichung des Zusammenflußzustands benötigten. Die Kulturen dieser Zellen wurden danach in einem serumfreien Zustand weitergeführt.

Claims

1. Zellkultur-Mikroträger, bestehend aus wasserunlöslichen Polymerteilchen, die aus (Meth)acrylester aufgebaut sind, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilchen einen durchschnittlichen Durchmesser von 100-1000 um und eine Dichte von 1,00-1,20 g/ml in einem Kulturmedium sowie positiv geladene chemische Bestandteile aufweisen, die wenigstens auf deren Oberflächen verteilt sind, wobei diese Bestandteile durch die Umsetzung zwischen dem Ester und Ammoniak oder einem Amin mit 5 oder weniger Kohlenstoffatomen in die Teilchen eingeführt worden sind.

2. Zellkultur-Mikroträger nach Anspruch 1, worin die Ladungskapazität auf einen Bereich zwischen 0,5 und 2,5 mÄq. pro Gramm Trockengewicht eingestellt ist.