DE3856580T2

DE3856580T2 - Verfahren und Desoxyribonukleinsäure zur Herstellung von Gewebefaktor-Protein

Info

Publication number: DE3856580T2
Application number: DE3856580T
Authority: DE
Inventors: Richard Mark Lawn; Karen Lynne Wion; Gorden Allen Vehar
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1987-02-12
Filing date: 1988-02-12
Publication date: 2006-05-24
Anticipated expiration: 2008-02-13
Also published as: DE3855921T3; AU1170588A; ES2068791T1; JPS63301797A; DE3855921T2; IE880380L; JP2869920B2; DE3856580D1; AU617302B2; ATE153696T1; DE3855921D1; IL85411A0; ES2244989T3; EP0278776B1; GR3024263T3; DE278776T1; EP0278776A2; IE81149B1; EP0787802A2; ES2068791T5

Description

Diese Erfindung betrifft Gewebefaktorproteinvarianten oder -fragmente oder -fusionspolypeptide, die die Blutgerinnung induzieren, zur Verwendung als Medikament.
Blutungen stellen eine der ernsthaftesten und signifikantesten Manifestationen von Krankheit dar. Sie können von einer räumlich festgelegten Stelle ausgehen oder generalisiert auftreten. Die primäre Hämostase besteht hauptsächlich aus 2 Komponenten: der Vasokonstriktion und der Plättchenpfropfbildung. Die Plättchenpfropfbildung läßt sich in mehrere Stadien unterteilen: die Plättchenadhäsion an durch ein Trauma freigelegte Subendothelflächen; die Plättchenaktivierungsfreisetzungsreaktion; die Plättchenaggregation, die zur Sequestrierung weiterer Plättchen an der Stelle führt, und die Bindung von Fibrinogen und den Koagulationsproteinen an die Plättchenoberfläche, die zur Bildung von Thrombin führt; und die Fusion, die aus der Verschmelzung von Fibrin und vereinigten Plättchen unter Bildung eines stabilen Hämostasepfropfs besteht.
Die Blutgerinnung erfüllt zwei Funktionen; die Erzeugung des die Plättchenaggregation induzierenden Thrombins und die Bildung von Fibrin, das den Plättchen stabilisiert. Eine Zahl diskreter Proenzyme und Prokofaktoren, die mit dem Ausdruck "Gerinnungsfaktoren" bezeichnet werden, sind am Gerinnungsprozeß beteiligt. Der Prozeß besteht aus mehreren Stufen und endet mit der Bildung von Fibrin. Fibrinogen wird durch die Wirkung von Thrombin in Fibrin umgewandelt. Thrombin wird durch begrenzte Proteolyse eines Proenzyms, Prothrombin, gebildet. Diese Proteolyse wird durch den aktivierten Faktor X (als Faktor X_a bezeichnet), der sich an die Oberfläche aktivierter Plättchen bindet und in Gegenwart von Faktor Va und Calciumionen Prothrombin spaltet, bewirkt.
Die Aktivierung von Faktor X kann auf einem von zwei getrennten Wegen, dem extrinsischen oder dem intrinsischen, (1) erfolgen. Die intrinsische Kaskade besteht aus einer Reaktionsfolge, bei der ein Proteinvorläufer zur Bildung einer aktiven Protease gespalten wird. In jeder Stufe katalysiert die neu gebildete Protease die Aktivierung der Vorläuferprotease auf der nachfolgenden Stufe der Kaskade. Ein Mangel an einem der Proteine auf diesem Weg blockiert den Aktivierungsprozeß auf dieser Stufe, wodurch die Gerinnselbildung verhindert und typischerweise eine Neigung zu Hämorrhagie ausgelöst wird. Ein Mangel an Faktor VIII oder Faktor IX verursacht beispielsweise die starken Blutungssyndrome Hämophilie A bzw. B. Auf dem extrinsischen Weg der Blutgerinnung wird Gewebefaktor, der auch als Gewebethromboplastin bezeichnet wird, aus geschädigten Zellen freigesetzt und dieser aktiviert in Gegenwart von Faktor VII und Calcium Faktor X. Obwohl man ursprünglich der Meinung war, daß die Aktivierung von Faktor X die einzige durch Gewebefaktor und Faktor VII katalysierte Reaktion darstellt, ist nun bekannt, daß zwischen Faktor X, Faktor VII und Faktor IX eine Verstärkungsschleife existiert (Osterud, B., S. I. Rapaport, Proc. Natl. Acad. Sci. [USA] 74: 5260–5264 [1977]; Zur, M. et al., Blood 52: 198 [1978]). Jede der Serinproteasen in diesem Schema ist zur Umwandlung der anderen beiden in die aktivierte Form durch Proteolyse fähig, wodurch das Signal in dieser Stufe des Gerinnungsprozesses verstärkt wird (1). Man hält nun tatsächlich den extrinsischen Weg für den physiologischen Hauptweg der normalen Blutgerinnung (Haemostasis 13: 150–155 [1983]). Da sich Gewebefaktor normalerweise nicht im Blut findet, erfolgt keine kontinuierliche Verklumpung bzw. Gerinnselbildung des Systems; der Auslöser der Gerinnung sollte daher die Freisetzung von Gewebefaktor aus geschädigtem Gewebe sein.
Gewebefaktor ist vermutlich ein integrales Membranglykoprotein, das nach der obigen Diskussion die Blutgerinnung über den extrinsischen Weg auslösen kann (Bach, R. et al., J. Biol Chem. 256[16]: 8324–8331 [1981]). Der Gewebefaktor besteht aus einer Proteinkomponente (früher als Gewebefaktorapoprotein-III bezeichnet) und einem Phospholipid (B. Osterud, S. I. Rapaport, Proc. Natl. Acad. Sci. 74, 5260–5264 [1977]). Der Komplex wurde auf den Membranen von Monocyten und verschiedenen Zellen der Blutgefäßwände gefunden (B. Osterud, Scand. J. Haematol. 32: 337–345 [1984]). Für Gewebefaktor aus verschiedenen Organen und Arten wurde eine relative Molekülmasse von 42.000 bis 53.000 berichtet. Humangewebethromboplastin wurde als aus in eine Phospholipiddoppelschicht mit einem optimalen Verhältnis von Gewebefaktorprotein:Phospholipid von etwa 1:80 eingefügtem Gewebefaktorprotein bestehend beschrieben (Lyberg, T., Prydz, H., Nouv. Rev. Fr. Hematol. 25(5): 291–293 [1983]). Über die Reinigung von Gewebefaktor aus verschiedenen Geweben, wie Menschenhirn (Guha, A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 299–302 [1986], und Broze, G. H. et al., J. Biol. Chem. 260[20]: 10917–10920 [1985]); Rinderhirn (Bach, R. et al., J. Biol. Chem. 256: 8324–8331 [1981]); Humanplazenta (Bom, V. J. J. et al., Thrombosis Res. 42: 635–643 [1986]; und Andoh, K. et al., Thrombosis Res. 43: 275–286 [1986]); Schafshirn (Carlsen E. et al., Thromb. Haemostas 48[3], 315–319 [1982]); und Lunge (Glas, P., Astrup, T., Am. J. Physiol. 219, 1140–1146 [1970]), wurde berichtet. Es wurde gezeigt, daß Rinder- und Humangewebethromboplastin bezüglich Größe und Funktion identisch sind (vergleiche Broze, G. H. et al., J. Biol. Chem. 260[20], 10917–10920 [1985]). Es wird gemeinhin akzeptiert, daß zwischen den Spezies Unterschiede in der Struktur von Gewebefaktorprotein bestehen, nach der Messung von in vitro Gerinnungsansätzen jedoch keine funktionellen Unterschiede bestehen (Guha et al., s.o.). Ferner zeigte sich, daß aus verschiedenen Geweben eines Tieres, zum Beispiel Hundehirn, -lunge, -arterien und -venen, isolierter Gewebefaktor in mancher Hinsicht, z.B. bezüglich des Extinktionskoeffizienten, des Gehalts an Stickstoff und Phosphor und des optimalen Phospholipid/Lipid-Verhältnisses, ähnlich war, jedoch bezüglich der Molekülgröße, des Aminosäuregehalts, der Reaktivität gegenüber Antikörpern und der Plasmahalbwertszeit geringe Unterschiede aufwies (Gonmori, H., Takeda, Y., J. Physiol. 229[3], 618–626 [1975]). Alle Gewebefaktoren der verschie denen Hundeorgane zeigten in Gegenwart von Lipid Verklumpungsaktivität. Es wurde in großem Umfang akzeptiert, daß Gewebefaktor zur Entfaltung biologischer Aktivität mit Phospholipiden in vitro assoziiert sein muß (Pitlick, F. A., Nemerson, Y., Biochemistry 9: 5105–5111 [1970) und Bach, R. et al., s. oben 8324). Es wurde gezeigt, daß die Entfernung der Phospholipid-Komponente von Gewebefaktor durch beispielsweise Verwendung einer Phospholipase zu einem Verlust von dessen biologischer Aktivität in vitro führt (Y. Nemerson, J. C. I. 47: 72–80 [1968]). Eine Relipidierung kann die Aktivität von Gewebefaktor in vitro wiederherstellen Pitlick, F. A., Nemerson Y., s. oben, Freyssinet, J. M. et al., Thrombosis and Haemostasis 55: 112–118 [1986]). Es wurden aminoterminale Sequenzen von Gewebefaktor (Bach, R. et al., Am. Heart Assoc. [Nov. 1986], Morrissey J. H. et al., Am. Heart Assoc. [Nov. 1986]) und ein CNBr-Peptidfragment (R. Bach, et al. s. oben) bestimmt.
Es wurde lange geglaubt, daß die Infusion von Gewebefaktor die normale Hämostase beeinträchtigt. Im Jahr 1834 stellte der französische Physiologe De Blainville zum ersten Mal fest, daß Gewebefaktor direkt zur Blutgerinnung beiträgt (H. De Blainville, Gazette Medicale Paris, Series 2, 524 [1834]). De Blainville beobachtete ferner, daß die intravenöse Infusion einer Hirngewebesuspension unmittelbar zum Tod führte, wobei dies nach seiner Beobachtung mit einem Hyperkoagulationszustand, der zu extensiv disseminierten Blutgerinnseln, die man bei der Autopsie fand, führte, korreliert war. Es ist nun allgemein akzeptiert, daß die intravenöse Infusion von Gewebethromboplastin eine intravaskuläre Koagulation induziert und bei verschiedensten Tieren Tod verursachen kann (Hunde: Lewis, J., Szeto I. F., J. Lab. Clin. Med 60: 261–273 [1962]; Kaninchen: Fedder, G. et al., Thromb. Diath. Haemorrh. 27: 365–376 [1972]; Ratten: Giercksky, K. E. et al., Scand. J. Haematol. 17: 305–311 [1976]; und Schafe: Carlsen, E. et al., Thromb. Haemostas. 48: 315–319 [1982]).
Trotz der Beschreibung der Isolierung von Gewebefaktor in der Literatur, wie oben geschildert ist, wurde die genaue Struktur von Gewebefaktorprotein bisher nicht festgestellt. Zwar stand bisher eine gewisse Menge an "gereinigtem" Gewebefaktorprotein entsprechend der Gewinnung aus verschiedensten Geweben zur Verfügung, es bleibt jedoch wegen der geringen Konzentration von Gewebefaktorprotein in Blut und Geweben und der sowohl in wirtschaftlicher als auch in arbeitsmäßiger Hinsicht hohen Kosten zur Reinigung des Proteins aus Geweben ein seltenes Material. Die Beschreibung lehrt die Isolierung von DNA mit Kodierung für Gewebefaktorprotein und die Herstellung geeigneter Mengen an Humangewebefaktorprotein unter Verwendung von Rekombinationstechniken. Die Beschreibung lehrt ferner die Herstellung neuer Formen von Gewebefaktorprotein. Diese und andere Aufgaben der Erfindung werden aus der Beschreibung als Ganzes ersichtlich.
Die Gewebefaktorproteinvarianten und -fragmente und Fusionspolypeptide, die in der Erfindung verwendbar sind, können durch ein Verfahren, umfassend: Identifizieren und Klonieren der cDNA mit Kodierung für Humangewebefaktorprotein; Einführen dieser cDNA in einen rekombinanten DNA-Vektor; Transformation eines geeigneten Wirts mit dem diese DNA enthaltenden Vektor; Exprimieren der Humangewebefaktorprotein-DNA in einem derartigen Wirt und Gewinnung des hergestellten Humangewebefaktorproteins, erreicht werden. In ähnlicher Weise ermöglicht die Beschreibung die Erzeugung von Humangewebefaktorprotein und/oder Derivaten hiervon durch Rekombinationstechniken sowie die Bereitstellung von auf eine derartige Produktion von Humangewebefaktorprotein gerichteten Produkten und Verfahren. Die Isolierung und Identifizierung und Sequenzierung der Gewebefaktorprotein-DNA war problematisch. Die mRNA war relativ selten und es war bisher keine vollständige Aminosäuresequenz für Gewebefaktorprotein bekannt.
Die vorliegende Erfindung ist auf den Gegenstand der beigefügten Ansprüche gerichtet. Die Beschreibung lehrt Zusammensetzungen und Verfahren zur Erzeugung von Humangewebefaktorprotein mittels rekombinanter DNA-Technologie, umfassend: 1) die Isolierung und Identifizierung der gesamten DNA-Sequenz des Proteins und des diese 5'- und 3'-flankierenden Bereichs; 2) den Aufbau von diese DNA-Sequenz enthaltenden Klonierungs- und Expressionsvehikeln wodurch die Expression von Humangewebefaktorprotein möglich wird, sowie Methionin-, Fusions- oder N-Terminus- Signal-Konjugaten hiervon; und 3) Lebendzellkulturen, die durch das Enthalten derartiger Vehikel genetisch verändert und zur Erzeugung von Humangewebefaktorprotein fähig sind. Diese Beschreibung lehrt ferner DNA-Zusammensetzungen und Verfahren zur Erzeugung von DNA mit Kodierung für die Zellproduktion von Humangewebefaktorprotein, und sie lehrt neue Verbindungen, umfassend DNA-Sequenzen, die zur Bildung von für Gewebefaktorprotein kodierenden Klonen verwendet werden. Diese Erfindung richtet sich ferner auf die Verwendung von neuen Gewebefaktorproteinderivaten, insbesondere Derivaten, denen die Signalsequenz und der hydrophobe Bereich des Proteins in der Nähe des C-terminalen Proteinendes, der die die Gewebefaktorproteintransmembran- oder membranbindende Domäne bildende Aminosäuresequenz umfaßt, fehlen.
Die Nützlichkeit des Humangewebefaktorproteins und von dessen Derivaten, die in dieser Erfindung verwendet werden, beruht zum Teil auf der neuen und unerwarteten Beobachtung, daß die Infusion von Gewebefaktorprotein, d.h. dem Proteinbereich von Gewebefaktor, dem das natürlicherweise vorkommende Phospholipid fehlt, was bisher als Gewebefaktorapoprotein III bezeichnet und für inaktiv gehalten wurde, bei hämophilen Hunden den hämostatischen Mangelzustand ausglich. Es zeigte sich zum ersten Mal, daß Gewebefaktorprotein die mit einem in vivo-Mangel an Faktor VIII verbundene Blutungsdiathese, d.h. eine Neigung zu Hämorrhagie, ausgleichen kann. Im Hinblick auf Veröffentlichungen des Standes der Technik, nach denen für Gewebefaktor Phospholipid absolut erforderlich ist, erwartete man, daß die Infusion von Gewebefaktorprotein unwirksam ist. Im Gegensatz zur Arbeit von De Blainville und den in den nächsten einhundertzweiundfünfzig (152) Jahren folgenden Forschern erwies sich Gewebefaktorprotein ferner bei intravenöser Infusion in Hunde als nicht toxisch.
Das Humangewebefaktorprotein und dessen Derivate, die in dieser Erfindung verwendet werden, können ferner zur Behandlung verschiedenster chronischer Blutungsstörungen, die durch eine sowohl ererbte als auch erworbene Neigung zu Hämorrhagie charakterisiert sind, eingesetzt werden. Beispiele für derartige chronische Blutungsstörungen sind Mangelzustände der Faktoren VIII, IX oder XI. Beispiele für erworbene Störungen umfassen: erworbene Hemmung gegenüber Blutkoagulationsfaktoren, z.B. Faktor VIII, von-Willebrand-Faktor, Faktor IX, V, XI, XII und XIII; eine Haemostasestörung als Folge einer die Abnahme der Synthese von Koagulationsfaktoren und DIC umfassenden Leberkrankheit; mit einen Mangel an Koagulationsfaktor und DIC umfassenden akuten und chronischen Nierenkrankheiten in Verbindung stehende Blutungsneigung; Haemostase nach Trauma oder chirurgischem Eingriff; Patienten mit sich bei DIC mit einer Zunahme von Faktor VIII, von-Willebrand-Faktor und Fibrinogen manifestierender disseminierender Bösartigkeit; und Haemostase während eines chirurgischen Herz-Lungen-Eingriffs und massiver Bluttransfusion. Das Humangewebefaktorprotein und dessen Derivate dieser Beschreibung können ferner zur Induzierung der Gerinnung bei akuten Blutungsproblemen bei normalen Patienten und bei Patienten mit chronischen Blutungsstörungen eingesetzt werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 Darstellung der Aktivierung der Blutgerinnung auf dem intrinsischen Weg in einem Diagramm.
2 Nucleotid- und Aminosäuresequenz von Humangewebefaktorprotein. Die Nucleotidsequenz von Humangewebefaktorprotein wurde durch DNA-Sequenzanalyse eines Fettgewebeklons bestimmt und zum Teil durch die Sequenzierung anderer Klone bestätigt. Die vorhergesagten Aminosäuren für das Gewebefaktorprotein sind unter der DNA-Sequenz angegeben und vom ersten Rest des Amino-Terminus der Proteinsequenz ausgehend numeriert. Negative Aminosäurezahlen beziehen sich auf die angenommene Führungssignalsequenz oder das Prä- Protein, während sich positive Zahlen auf das reife Protein beziehen.
3a–3c (Hier zusammengenommen als 3 bezeichnet): Humangewebefaktorprotein-cDNA und Restriktionsenzymstellen.
4 Aufbau eines Expressionsvektors pCISTF mit Kodierung für Gewebefaktorprotein in voller Länge zum Einsatz in Säugetierwirtszellen.
4a Veranschaulichung eines Teils des Aufbaus der hier verwendeten Vektoren der pCIS2.8c-Serie.
5 Hydropathie-Profil von Gewebefaktor. Die translatierte DNA-Sequenz von Humangewebefaktor wurde unter Verwendung des Algorithmus von Kyte und Doolittle, J. Mol. Biol., 157: 105 (1982) aufgetragen. Die Abszisse gibt die am reifen Amino-Terminus beginnende Aminosäuresequenz an. Positive Punkte auf der Ordinate bezeichnen hydrophobe Bereiche des Proteins; die einzelnen Punkte stellen die mittlere Hydropathie von sechs aufeinanderfolgenden Aminosäuren dar. Unten bezeichnet N die Lage der vorhergesagten Asparagin-gebundenen Glykosylierungsstellen und O den Cluster von Serin- und Threoninresten bei den Aminosäuren 160–172. Der vorhergesagte die hydrophobe Membran durchspannende Bereich umfaßt die Reste 220–243 und wird durch einen gefüllten Balken angezeigt.
6 Aufbau eines Expressionsvektors pTF 2A12 mit Kodierung für Gewebefaktorprotein der vollen Länge.
7a–c (7a–c werden hier zusammengenommen als 7 bezeichnet): Aufbau einer Gewebefaktorprotein-Mutante, bei der ein Cystein an Position 245 durch ein Serin substituiert ist.
8a–b (Die 8a–8b sind hier zusammengenommen als 8 bezeichnet): Aufbau bzw. Konstruktion eines Expressionsvektors für Humangewebefaktor-Fusionsprotein.
9 Ergebnisse eines chromogenen Tests der transienten Expression von Gewebefaktorprotein in Cos-Zellen.
10 Aufbau eines Expressionsvektors für Gewebefaktorprotein mit deletierter cytoplasmatischer Domäne.
Detaillierte Beschreibung
Der hier verwendete Ausdruck "Gewebefaktorprotein" bezieht sich auf ein Protein, das beispielsweise durch Induzieren der Gerinnung verschiedene Blutungsstörungen, insbesondere mit Mangel an Gerinnungsfaktoren in Zusammenhang stehende Störungen beseitigen kann. Das Gewebefaktorprotein unterscheidet sich von Gewebefaktor oder Gewebethromboplastin des Standes der Technik darin, daß ihm der natürlicherweise vorkommende Lipidbereich des Moleküls fehlt. Das Gewebefaktorprotein umfaßt auch mit Phospholipid verbundenes Gewebefaktorprotein, wobei sich dieses Lipid vom natürlicherweise vorkommenden, mit Gewebethromboplastin in Verbindung stehenden Lipid unterscheidet und die Fähigkeit zur Induktion von Gerinnung ohne die beim lipidierten Protein beobachtete hiermit einhergehende Toxizität aufweist. Die Infusion von Gewebefaktorprotein nach der hier gegebenen Definition führt nicht zu einer disseminierten intravasalen Koagulation. Die Fähigkeit von Gewebefaktorprotein zur Beseitigung verschiedener Blutungsstörungen läßt sich ohne Probleme unter Verwendung verschiedener in-vivo-Blutungsmodelle, z.B. der Auslösung von Gerinnung in haemophilen Hunden unter Verwendung der Bestimmung der Cuticulablutungszeit (CBT) (Giles, A. R. et al., Blood 60: 727–730 [1982]) bestimmen.
Die Aminosäuresequenz von 2 stellt die Sequenz des Prä-Gewebefaktorproteins dar. Das Prä-Gewebefaktorprotein kann beispielsweise in Prokaryoten, die kein Processing durchführen und sezernieren, durch Transformation mit einem DNA mit Kodierung für Prä-Gewebefaktorprotein umfassenden Expressionsvektor exprimiert werden. Vorzugsweise werden Wirtszellen mit der Eignung zur Durchführung eines derartigen Processing zur Bildung von reifem Gewebefaktorprotein im Kulturmedium oder Periplasma der Wirtszelle transformiert. Typischerweise sind Wirtszellen aus höheren Eukaryo ten, wie Säugetierzellen, zum Processing von Prä-Gewebefaktorprotein und zur Sezernierung von reifem Gewebefaktorprotein bei Transformation mit DNA mit Kodierung für Prä-Gewebefaktorprotein fähig.
Alternativ kann sezerniertes reifes Gewebefaktorprotein durch Verbinden bzw. Ligieren des 5'-Endes der DNA mit Kodierung für reifes Gewebefaktorprotein mit dem 3'-Ende von DNA mit Kodierung für eine von der Wirtszelle erkannte Signalsequenz erhalten werden. Ein die ligierten DNA-Sequenzen umfassender Expressionsvektor wird zur Transformation der Wirtszellen verwendet. Die Wirtszelle verarbeitet das exprimierte Fusionsprotein, indem sie proteolytisch die Peptidbindung zwischen der Signalsequenz und der ersten Aminosäure des Gewebefaktorproteins spaltet und das reife Gewebefaktorprotein in das Periplasma der Wirtszelle oder in das Medium, entsprechend der in Frage kommenden Wirtszelle, sezerniert. Beispielsweise wird zum Aufbau eines prokaryotischen Expressionsvektors der Humangewebefaktorprotein-Sezernierungsleitabschnitt bzw. -leader, d.h. die Aminosäuren –32 bis –1, durch die Bakterien-Alkaliphosphatase- oder die wärmestabilen Enterotoxin-II-Leitabschnitte ersetzt und bei Hefe der Gewebefaktorprotein-Leitabschnitt durch Hefeinvertase-, alpha-Faktor- oder saure Phosphatase-Leitabschnitte ersetzt. Mit einer homologes Signal/Gewebefaktorprotein-Fusion transformierte gramnegative Organismen sezernieren reifes Gewebefaktorprotein in das Zellperiplasma, während Hefe oder Bazillus sp. reifes Gewebefaktorprotein in das Kulturmedium sezernieren.
Unter den Umfang der vorliegenden Erfindung fallen deglykosylierte oder unglykosylierte Derivate dieser Gewebefaktorproteine und biologisch aktive Aminosäuresequenzvarianten von Gewebefaktorprotein, umfassend Allele, und in vitro erzeugte kovalente Derivate von Gewebefaktorproteinen, die Gewebefaktorproteinaktivität aufweisen.
Aminosäuresequenzvarianten von Gewebefaktorprotein gehören einer oder mehreren von drei Klassen an: Substitutions-, Insertions- oder Deletionsvarianten. Insertionen umfassen amino- und/oder carboxylterminale Fusionen sowie intrasequenzielle Insertionen von Resten aus einzelnen oder mehreren Aminosäuren. Gewebefaktorfusionsproteine umfassen beispielsweise Hybride von reifem Gewebefaktorprotein mit zu Gewebefaktorprotein homologen Polypeptiden, beispielsweise im Falle von Humangewebefaktorprotein, Sekretionsleadern anderer sezernierter Humanproteine. Gewebefaktorfusionsproteine umfassen ferner Hybride von Gewebefaktorprotein mit zur Wirtszelle, jedoch nicht zu Gewebefaktorprotein homologen Polypeptiden sowie zu sowohl der Wirtszelle als auch Gewebefaktorprotein heterologen Polypeptiden. Ein Beispiel für ein derartiges Gewebefaktorfusionsprotein ist die Herpes-gD-Signalsequenz mit dem reifen Gewebefaktorprotein. Bevorzugte Fusionen im Rahmen dieser Erfindung sind aminoterminale Fusionen mit entweder prokaryotischen Peptiden oder Signalpeptiden von Prokaryoten-, Hefe-, Virus- oder Wirtszellsignalsequenzen. Es ist nicht wesentlich, daß die Signalsequenz von jeglicher reifer Restsequenz des Proteins, dessen Sezernierung sie üblicherweise steuert, frei ist, doch ist dies zur Vermeidung der Sekretion eines Gewebefaktorfusionsproteins bevorzugt.
Insertionen können ferner innerhalb der reifen Kodierungssequenz von Gewebefaktorprotein eingeführt werden. Hierbei handelt es sich jedoch gewöhnlich um kleinere Insertionen als bei den amino- oder carboxylterminalen Fusionen in der Größenordnung von 1 bis 4 Resten. Ein repräsentatives Beispiel hierfür ist das [Arg₁₃₅Arg₁₃₆ → Arg₁₃₅ProArg_l37]-Gewebefaktorprotein, eine wegen ihrer Beständigkeit gegenüber Trypsin-Hydrolyse am Arg₁₃₅-Rest ausgewählte Variante. Falls nicht anders angegeben, sind die hier beschriebenen speziellen Gewebefaktorprotein-Variationen Variationen in der Sequenz des reifen Gewebefaktorproteins; es handelt sich nicht um Prä-Gewebefaktorprotein-Varianten.
Bei Insertionsaminosäuresequenzvarianten von Gewebefaktorproteinen handelt es sich um solche, bei denen ein oder mehrere Aminosäurerest(e) an einer vorgegebenen Stelle in das Zielgewebefaktorprotein eingeführt sind. Üblicherweise handelt es sich bei Insertionsvarianten um Fusionen von he terologen Proteinen oder Polypeptiden am Amino- oder Carboxyl-Terminus von Gewebefaktorprotein. Immunogene Gewebefaktorproteinderivate werden durch Fusion eines zur Verleihung von Immunogenität an die Zielsequenz ausreichend großen Polypeptids durch in-vitro-Vernetzung oder durch mit für das Fusionsprotein kodierender DNA transformierte rekombinante Zellkultur hergestellt. Derartige immunogene Polypeptide können Bakterienpolypeptide, wie trpLE, Beta-Galactosidase und dergleichen sein.
Deletionsvarianten sind durch die Entfernung von einem oder mehreren Aminosäurerest(en) aus der Gewebefaktorproteinsequenz charakterisiert. Typischerweise werden nicht mehr als etwa 2–6 Reste an einer beliebigen Stelle im Gewebefaktorproteinmolekül deletiert, obwohl zur Gewinnung von met-Gewebefaktorprotein, einer zur intrazellulären direkten Expression von reifem met-Gewebefaktorprotein geeigneten Variante, eine Deletion der Reste –31 bis einschließlich –1 durchgeführt wird. Eine weitere Deletionsvariante besteht aus der an etwa den Resten 220 bis 242 des Gewebefaktorproteinmoleküls lokalisierten Transmembrandömäne.
Diese Varianten werden gewöhnlich durch ortsspezifische Mutagenese von Nucleotiden in der DNA mit Kodierung für das Gewebefaktorprotein, wobei DNA mit Kodierung für die Variante produziert wird und anschließende Expression der DNA in einer rekombinanten Zellkultur hergestellt. Gewebefaktorproteinfragmentvarianten mit bis zu etwa 100–150 Resten können jedoch bequem durch in-vitro-Synthese hergestellt werden. Die Varianten weisen typischerweise die gleiche qualitative biologische Aktivität wie das natürlich vorkommende Analogon auf, obwohl auch Varianten zur Modifizierung der Eigenschaften von Gewebefaktorprotein, wie dies im folgenden detaillierter beschrieben wird, ausgewählt werden.
Die Stelle zur Einführung einer Aminosäuresequenzvariation ist zwar vorgegeben, doch muß die Mutation an sich nicht vorgegeben sein. Zur Optimierung der Leistung einer Mutation an einer bestimmten Stelle können wir beispielsweise am Zielcodon oder -bereich eine willkürliche Mutagenese durch führen und die exprimierten Gewebefaktorproteinvarianten bezüglich der optimalen Kombination an gewünschter Aktivität screenen. Techniken zur Durchführung von Substitutionsmutationen an bestimmten Stellen in DNA mit bekannter Sequenz, beispielsweise die M13-Primer-Mutagenese, sind bekannt.
Bei Aminosäuresubstitutionen handelt es sich typischerweise um einzelne Reste; bei Insertionen handelt es sich gewöhnlich um die Größenordnung von etwa 1–10 Aminosäureresten; und bei Deletionen handelt es sich um einen Bereich von 1–30 Resten. Deletionen oder Insertionen erfolgen vorzugsweise in benachbarten Paaren, d.h. als eine Deletion von 2 Resten oder Insertion von 2 Resten. Substitutionen, Deletionen, Insertionen oder eine Kombination hiervon können zur Bildung eines endgültigen Konstrukts kombiniert werden. Naheliegenderweise dürfen die in der DNA mit Kodierung für die Gewebefaktorproteinvariante durchgeführten Mutationen die Sequenz nicht aus dem Leseraster herausbringen und vorzugsweise keine Komplementärbereiche, die eine sekundäre mRNA-Struktur erzeugen könnten, schaffen. (EP-A-75 444).

Bei Substitutionsvarianten handelt es sich um solche, bei denen mindestens einer der Reste in der Sequenz in 2 entfernt und ein unterschiedlicher Rest an dessen Stelle insertiert wurde. Derartige Substitutionen werden im allgemeinen entsprechend der folgenden Tabelle 1 zum Zwecke einer feinen Modulierung der Eigenschaften von Gewebefaktorprotein durchgeführt. TABELLE 1

Originalrest	Substitutionsbeispiele
Ala	ser
Arg	lys
Asn	gln; his
Asp	glu
Cys	ser
Gln	asn
Glu	asp
Gly	pro
His	asn; gln
Ile	leu; val
Lau	ile; val
Lys	arg; gln; glu
Met	leu; ile
Phe	met; leu; tyr
Ser	thr
Thr	ser
Trp	tyr
Tyr	trp; phe
Val	ile; leu

Wesentliche Veränderungen der Funktion oder immunologischen Identität werden durch die Auswahl von weniger konservativen Substitutionen als in Tabelle 1, d.h. die Auswahl von Resten, die sich bezüglich ihrer Wirkung zur Beibehaltung von (a) der Struktur des Polypeptidgerüsts im Gebiet der Substitution, z.B. als Blatt- oder Helixkonformation, (b) der Ladung oder Hydrophobie des Moleküls an der Zielstelle oder (c) der Sperrigkeit der Seitenkette signifikanter unterscheiden, erreicht. Bei den Substitutionen, bei denen im allgemeinen die größten Veränderungen der Eigenschaften von Gewebefaktorprotein erwartet werden, handelt es sich um Substitutionen, bei denen (a) ein hydrophiler Rest, z.B. Seryl oder Threonyl, durch einen hydrophoben Rest, z.B. Leucyl, Isoleucyl, Phenylalanyl, Valyl oder Alanyl; (b) ein Cystein oder Prolin durch einen anderen Rest; (c) ein Rest mit einer elektropositiven Seitenkette, z.B. Lysyl, Arginyl oder Histidyl, durch einen elektronegativen Rest, z.B. Glutamyl oder Aspartyl; oder (d) ein Rest mit einer sperrigen Seitenkette, z.B. Phenylalanin, durch einen keine Seitenkette enthaltenden Rest, z.B. Glycin, ersetzt wird oder einen solchen ersetzt.
Eine Hauptklasse der Substitutions- oder Deletionsvarianten bilden die den Transmembranabschnitt, d.h. den hydrophoben oder lipophilen Abschnitt, von Gewebefaktorprotein umfassenden Varianten. Der Transmembranabschnitt von Gewebefaktorprotein befindet sich etwa an den Resten 220–242 des Proteins, das durch die DNA aus Humanfettgeweben kodiert wird. Bei diesem Abschnitt handelt es sich um eine stark hydrophobe oder lipophile Domäne der geeigneten Größe zum Durchführen der Lipiddoppelschicht der Zellmembran. Vermutlich dient er zur Verankerung von Gewebefaktorprotein in der Zellmembran.
Eine Deletion oder Substitution der Transmembrandomänen kann die Gewinnung von rekombinantem Gewebefaktorprotein erleichtern und dieses in einer löslichen Form bereitstellen, indem die Zell- oder Membranlipidaffinität verringert und die Wasserlöslichkeit erhöht wird, so daß zum Verbleiben von Gewebefaktorprotein in wäßriger Lösung keine Netzmittel erforderlich sind. Vorzugsweise wird die Transmembrandomäne eher deletiert als substituiert, um die Einführung möglicherweise immunogener Epitope zu vermeiden. Ein Vorteil von Gewebefaktorprotein mit deletierter Transmembran besteht darin, daß es mit weniger Schwierigkeiten in das Kulturmedium sezerniert wird. Diese Variante ist wasserlöslich und hat keine merkliche Affinität zu Zellmembranlipiden, wodurch deren Gewinnung aus rekombinanter Zellkultur beträchtlich vereinfacht wird.
Substitutions- oder Deletionsmutagenese kann zur Eliminierung von N- oder O-verbundenen Glykosylierungsstellen (z.B. durch Deletion oder Substitution von Asparaginylresten an Asn-X-Thr-Glykosylierungsstellen), Verbesserung der Expression von Gewebefaktorprotein oder Veränderung der Halbwertszeit des Proteins verwendet werden. Alternativ kann nichtglykosyliertes Gewebefaktorprotein in einer rekombinanten prokaryotischen Zellkultur erzeugt werden. Deletionen oder Substitutionen von Cystein oder anderen labilen Resten können ebenfalls, beispielsweise zur Steigerung der Oxidationsstabilität oder Wahl der gewünschten Disulfidbindungsanordnung des Gewebefaktorproteins, erwünscht sein. Ein derartiges Beispiel für eine Cystein-substitution ist die Substitution des Cysteins an Position 245 durch ein Serin. Deletionen oder Substitutionen möglicher Proteolysestellen, z.B. Arg Arg, erfolgen beispielsweise durch Deletion eines der Basenreste oder Substitution eines Glutaminyl- oder Histidylrests.
Der Ausdruck "isolierte DNA" bedeutet chemisch synthetisierte DNA, cDNA oder Genom-DNA mit oder ohne die 3'- und/oder 5'-Flankierungsabschnitte. DNA mit Kodierung für Gewebefaktorprotein erhält man abgesehen von menschlichen Quellen durch a) Herstellen einer cDNA-Bibliothek aus der Plazenta, dem Fettgewebe oder anderen Gewebefaktorprotein-mRNA enthaltenden Geweben, wie Hirn, des speziellen Tiers, b) Durchführen einer Hybridisierungsanalyse mit markierter DNA mit Kodierung für Humangewebefaktorprotein oder dessen Fragmente (üblicherweise mehr als 100 bp) zum Nachweis von Klonen in der homologe Sequenzen enthaltenden cDNA-Bibliothek und c) Analysieren der Klone durch Restriktionsenzymanalyse und Nukleinsäurensequenzierung zur Identifizierung der die volle Länge aufweisenden Klone. Sind Klone voller Länge in der Bibliothek nicht vorhanden, können geeignete Fragmente aus den verschiedenen Klonen unter Verwendung der zum ersten Mal in der vorliegenden Erfindung offenbarten Nucleinsäuresequenz gewonnen und zur Bildung eines Klons voller Länge mit Kodierung für Gewebefaktorprotein an den kloneneigenen Restriktionsstellen verknüpft werden.
Die Verwendung des Gewebefaktorproteinmoleküls mit kovalenten Modifikationen fällt unter den Umfang dieser Erfindung. Derartige Modifikationen werden durch Umsetzen der Zielaminosäurereste des gewonnenen Proteins mit einem organischen derivatbildenden Mittel, das mit ausgewählten Seitenketten oder terminalen Resten reagieren kann, hergestellt. Alternativ kann eine posttranslationale Modifizierung in ausgewählten rekombinanten Wirtszellen zur Modifizierung des Proteins verwendet werden. Die hierbei entstehenden kovalenten Derivate sind als Immunogene oder zur Identifizierung von für die biologische Aktivität sowie die Änderung der pharmakologischen Eigenschaften des Moleküls, wie Halbwertszeit, Bindungsaffinität und dergleichen, wie dies dem Fachmann bekannt ist, wichtigen Resten geeignet.
Bestimmte posttranslationale Derivatbildungen ergeben sich aus der Einwirkung rekombinanter Wirtszellen auf das exprimierte Polypeptid. Glutaminyl- und Asparaginylreste werden häufig posttranslational zu den entsprechenden Glutamyl- bzw. Aspartylresten deamidiert. Alternativ werden diese Reste unter schwach sauren Bedingungen deamidiert. Beide Formen dieser Reste fallen unter den Umfang dieser Erfindung.
Weitere posttranslationale Modifizierungen umfassen die Hydroxylierung von Prolin und Lysin, die Phosphorylierung von Hydroxylgruppen von Seryl- oder Threonylresten, die Methylierung der α-Aminogruppen von Lysin-, Arginin- und Histidinseitenketten (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, S. 79–86 [1983]), die Acetylierung des N-terminalen Amins und in einigen Fällen die Amidierung des C-terminalen Carboxyls.
Die zur Beschreibung des Zustands von zur Verwendung in der Erfindung produziertem Gewebefaktorprotein verwendeten Ausdrücke "praktisch frei von" oder "praktisch rein" bedeuten frei von Protein oder anderen Materialien, die normalerweise mit Gewebefaktorprotein im physiologischen in vivo Milieu, z.B. bei Gewinnung von Gewebefaktorprotein aus Blut und/oder Geweben durch Extraktion und Reinigung, verbunden sind. Andere Materialien umfassen infektiöse Organismen, beispielsweise den Verursacher des erworbenen Schwächesyndroms (AIDS). Das durch das erfindungsgemäße Verfahren erzeugte Gewebefaktorprotein weist eine Reinheit von größer als oder gleich 95% auf.
Im allgemeinen werden Prokaryoten zum Klonieren von DNA-Sequenzen zur Konstruktion der erfindungsgemäß geeigneten Vektoren verwendet. Beispielsweise ist E. coli K12 Stamm 294 (ATCC Nr. 31446) besonders geeignet. Andere einsetzbare Mikroorganismenstämme umfassen E. coli B und E. coli X1776 (ATCC Nr. 31537). Diese Beispiele dienen eher der Erläuterung als der Einschränkung.
Prokaryoten können ferner zur Expression verwendet werden. Es können die genannten Stämme sowie E. coli W3110 (F^–, λ^–, prototroph, ATCC Nr. 27325), Bazillen wie Bacillus subtilis, und andere Enterobakterien, wie Salmonella typhimurium oder Serratia marcescans, und verschiedene Pseudomonas-Spezies verwendet werden.
Im allgemeinen werden bei diesen Wirten Promotoren und Kontrollsequenzen enthaltende Plasmidvektoren, die aus mit der Wirtszelle kompatiblen Spezies abgeleitet sind, verwendet. Der Vektor trägt üblicherweise eine Replikationsstelle sowie eine oder mehrere Markersequenz(en), wodurch eine Phenotyp-Selektion hinsichtlich transformierter Zellen möglich wird. Beispielsweise wird E. coli typischerweise unter Verwendung eines Derivats von pBR322, einem von einer E. coli-Spezies abgeleiteten Plasmid (Bolivar, et al., Gene 2: 95 [1977]), transformiert. pBR322 enthält Gene für Ampicillin- und Tetracyclinresistenz und liefert so auf einfache Weise Mittel zur Identifizierung transformierter Zellen. Das pBR322-Plasmid oder ein anderes Mikroorganismenplasmid muß ferner Promotoren sowie andere üblicherweise zur rekombinanten DNA-Konstruktion verwendete Steuerelemente enthalten oder so modifiziert sein, daß es diese enthält.
Zur Verwendung bei prokaryotischen Wirten geeignete Promotoren umfassen beispielsweise die β-Lactamase- und Lactose- Promotorsysteme (Chang et al., "Nature", 275: 615 [1978]; und Goeddel et al., "Nature" 281: 544 [1979]), Alkaliphosphatase, das Tryptophan (trp)-Promotorsystem (Goeddel "Nucleic Acids Res." 8: 4057 [1980] und EPO Appln. Publ. Nr. 36,776) sowie Hybridpromotoren, wie den tac-Promotor (H. de Boer et al., "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 80: 21–25 [1983]). Es sind jedoch (auch) andere funktionelle Bakterienpromotoren geeignet. Ihre Nucleotidsequenzen sind im allgemeinen bekannt, wodurch es einem Fachmann auf dem einschlägigen Fachgebiet möglich ist, diese operabel unter Verwendung von Linkern oder Adaptoren zur Einführung von beliebigen gewünschte Restriktionsstellen mit DNA mit Kodierung für Gewebefaktorprotein zu verknüpfen. (Siebenlist et al., "Cell" 20: 269 [1980]). Promotoren zur Verwendung in Bakteriensystemen können ferner eine arbeitsfähig bzw. operabel mit der für Gewebefaktorprotein kodierenden DNA verbundene Shine-Dalgarno (S. D.)-Sequenz enthalten.
Zusätzlich zu Prokaryoten können auch eukaryotische Mikroben, wie Hefekulturen verwendet werden. Saccharomyces cerevisiae oder gewöhnliche Bäckerhefe ist der am häufigsten verwendete eukaryotische Mikroorganismus, wenngleich eine Anzahl anderer Stämme üblicherweise verfügbar ist. Zur Expression in Saccharomyces wird beispielsweise das Plasmid YRp7 (Stinchcomb, et al., Nature 282: 39 [1979]; Kingsman et al., Gene 7: 141 [1979]; Tschemper et al., Gene 10: 157 [1980]) üblicherweise verwendet. Dieses Plasmid enthält bereits das trp1-Gen, das einen Selektionsmarker für einen Mutantenstamm von Hefe, dem die Fähigkeit zum Wachstum in Tryptophan fehlt, z.B. ATCC Nr. 44076 oder PEP4–1 (Jones, Genetics 85: 12 [1977]), enthält. Das Vorhandensein der trp1-Läsion als charakteristische Eigenschaft des Hefewirtszellengenoms liefert dann ein effektives Mittel zur Selektion durch Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan.
Geeignete Promotorensequenzen zum Einsatz bei Hefewirten umfassen die Promotoren für 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., "J. Biol. Chem." 255: 2073 [1980]) oder andere glykolytische Enzyme (Hess et al., "J. Adv. Enzyme Reg." 7: 149 [1968]; und Holland, "Biochemistry" 17: 4900 [1978]), wie Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase.
Andere Hefepromotoren, die als induzierbare Promotoren den zusätzlichen Vorteil einer durch die Wachstumsbedingungen gesteuerten Transkription aufweisen, sind die Promotorregionen für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, saure Phosphatase, mit dem Stickstoffstoffwechsel assoziierte Abbauenzyme, Metallothionein, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase und für den Einsatz von Maltose und Galactose verantwortliche Enzyme. Zum Einsatz bei der Hefeexpression geeignete Vektoren und Promotoren sind ferner in R. Hitzeman et al., Europäische Patentveröffentlichung Nr. 73657A, beschrieben. Hefe-Enhancer werden ebenfalls vorteilhaft zusammen mit Hefepromotoren eingesetzt.
Die Transkription von Vektoren in Säugetierwirtszellen steuernde bevorzugte Promotoren können aus verschiedenen Quellen, beispielsweise den Genomen von Viren, wie Polyoma, Simian Virus 40 (SV40), Adenovirus, Retroviren, Hepatitis-B-Virus und vorzugsweise Cytomegalovirus oder aus heterologen Säugetierpromotoren, z.B. beta-Aktin-promotor, erhalten werden. Der early- und late-Promotor des SV40-Virus werden bequemerweise als SV40-Restriktionsfragment, das ferner den SV40-Virus-Replikationsursprung enthält, gewonnen (Fiers et al., Nature, 273: 113 [1978]). Der immediate-early-Promotor des Human-Cytomegalovirus wird in geeigneter Weise als HindIII-E-Restriktionsfragment erhalten. (P. J. Greenaway et al., Gene 18: 355–360 [1982]). Natürlich sind hier Promotoren aus der Wirtszelle oder verwandten Spezies ebenfalls geeignet.
Die Transkription von DNA mit Kodierung für Gewebefaktorprotein durch höhere Eukaryoten wird durch Insertion einer Enhancersequenz in den Vektor gesteigert. Enhancer stellen cis-agierende Elemente aus DNA mit üblicherweise etwa 10–300 bp dar, die auf einen Promotor hinsichtlich einer Stei gerung von dessen Fähigkeit zur Initiation der Transkription einwirken. Enhancer sind bezüglich Orientierung und Position relativ unabhängig. Sie wurden 5' (Laimins, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 993 [1981]) und 3' (Lusky, M. L. et al., Mol. Cell Bio. 3: 1108 [1983]) zur Transkriptionseinheit, innerhalb eines Introns (Banerji, J. L. et al., Cell 33: 729 [1983]) sowie innerhalb der Kodierungssequenz selbst (Osborne, T. F. et al., Mol. Cell Bio. 4: 1293 [1984]) gefunden. Viele Enhancersequenzen sind heute aus Säugetiergenen (Globin, Elastase, Albumin, α-Fetoprotein und Insulin) bekannt. Typischerweise möchte man jedoch einen Enhancer aus einem Virus eukaryotischen Zellen verwenden. Beispiele umfassen den SV40-Enhancer auf der late-Seite des Replikationsursprungs (bp 100–270), den Cytomegalovirus-early-Promotor-Enhancer, den Polyom-Enhancer auf der late-Seite des Replikationsursprungs und Adenovirenenhancer.
In eukaryotischen Wirtszellen (Hefe-, Pilz-, Insekten-, Pflanzen-, Tier-, Human- oder kernhaltigen Zellen) verwendete Expressionsvektoren können ferner zur Termination der Transkription nötige Sequenzen enthalten, wodurch die mRNA-Expression beeinflußt wird. Diese Regionen werden als polyadenylierte Segmente im nichttranslatierten Abschnitt der mRNA mit Kodierung für Gewebefaktorprotein transkribiert. Die nichttranslatierten 3'-Regionen umfassen ferner Transkriptionsterminationsstellen.
Expressionsvektoren können ein Selektionsgen, das auch als Selektionsmarker bezeichnet wird, enthalten. Beispiele für geeignete Selektionsmarker für Säugetierzellen sind Dihydrofolatreductase (DHFR), Thymidinkinase oder Neomycin. Bei erfolgreicher Übertragung derartiger Selektionsmarker in eine Säugetierwirtszelle kann die transformierte Säugetierwirtszelle, wenn sie einem Selektionsdruck ausgesetzt wird, überleben. Es gibt zwei in weitem Umfang verwendete unterschiedliche Kategorien an Selektionsabläufen. Die erste Kategorie beruht auf dem Metabolismus einer Zelle und der Verwendung einer Zellinienmutante, der die Fähigkeit, unabhängig von einem ergänzten Medium zu wachsen, fehlt. Zwei Beispiele hierfür sind CHO-DHFR^–-Zellen und Mäuse-LTK^–-Zellen. Diesen Zellen fehlt die Fähigkeit, ohne die Zugabe von Nährstoffen wie Thymidin oder Hypoxanthin zu wachsen. Da diesen Zellen bestimmte für einen vollständigen Nucleotidsyntheseweg notwendige Gene fehlen, können sie nur überleben, wenn die fehlenden Nucleotide in einem ergänzten Medium bereitgestellt werden. Eine Alternative zur Ergänzung der Medien besteht in der Einführung eines intakten DHFR- oder TK-Gens in Zellen mit einem Mangel an den jeweiligen Genen, wodurch ihre Wachstumsbedürfnisse geändert werden. Individuelle Zellen, die mit dem DHFR- oder TK-Gen nicht transformiert wurden, können in einem nicht ergänzten Medium nicht überleben.
Bei der zweiten Kategorie handelt es sich um dominante Selektion, die sich auf ein bei einem beliebigen Zelltyp verwendetes Selektionsschema bezieht und bei der die Verwendung einer Zelllinienmutante nicht erforderlich ist. In diesen Schemas wird typischerweise ein Wirkstoff zur Blokkierung des Wachstums einer Wirtszelle verwendet. Zellen mit einem neuartigen Gen können ein Wirkstoffresistenz verleihendes Protein exprimieren und die Selektion überleben. Beispiele für eine derartige dominante Selektion verwenden die Wirkstoffe Neomycin (Southern P., Berg, P., J. Molec. Appl. Genet. 1: 327 [1982]), Mycophenolsäure (Mulligan, R. C., Berg, P., Science 209: 1422 [1980]) oder Hygromycin (Sugden, B. et al., Mol. Cell. Biol. 5: 410–413 [1985]). In den genannten drei Beispielen werden Bakteriengene mit eukaryotischer Steuerung zur Verleihung von Resistenz gegenüber dem geeigneten Wirkstoff G418 oder Neomycin (Geneticin), xgpt (Mycophenolsäure) bzw. Hygromycin verwendet.
Der Ausdruck "Amplifikation" bezieht sich auf das Anwachsen oder die Replikation einer isolierten Region innerhalb der Chromosomen-DNA einer Zelle. Die Amplifikation wird unter Verwendung eines Selektionsmittels, z.B. Methotrexat (MTX), das DHFR inaktiviert, erreicht. Bei der Amplifikation oder der Herstellung aufeinanderfolgender Kopien des DHFR-Gens ergeben sich bei Anwesenheit größerer Mengen an MTX größere Mengen an erzeugtem DHFR. Ein Amplifikationsdruck wird un geachtet der Anwesenheit von endogener DHFR durch Zugabe noch größerer Mengen an MTX zu den Medien ausgeübt. Die Amplifikation eines gewünschten Gens kann durch Kotransfektion einer Säugetierwirtszelle mit einem Plasmid mit einer DNA mit Kodierung für ein gewünschtes Protein und dem DHFR- oder Amplifikationsgen, das die Kointegration ermöglicht, erreicht werden. Zur Sicherstellung eines größeren Bedarfs der Zelle an DHFR, der durch Replikation des Selektionsgens befriedigt wird, wird nur auf Zellen, die in Anwesenheit einer noch größeren MTX-Konzentration wachsen können, selektiert. Solange das Gen mit Kodierung für ein gewünschtes heterologes Protein mit dem Selektionsgen kointegriert ist, ergibt die Replikation dieses Gens eine Replikation des Gens mit Kodierung für das gewünschte Protein. Hieraus ergibt sich die Expression einer größeren Menge des gewünschten heterologen Proteins durch Zunahme der Genkopien, d.h. ein amplifiziertes Gen, mit Kodierung für das gewünschte heterologe Protein.
Bevorzugte geeignete Wirtszellen zur Expression der erfindungsgemäßen Vektoren mit Kodierung für Gewebefaktorprotein in höheren Eukaryoten umfassen: durch SV40 transformierte Affennieren-CV1-Linie (COS-7, ATCC CRL 1651); Humanembryonieren-Linie (293, Graham, F. L. et al., J. Gen Virol. 36: 59 [1977]); Babyhamsternierenzellen (BHK, ATCC CCL 10); Chinese-hamster-ovary-Zellen-DHFR (CHO, Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77: 4216, [1980]); Mäuse-Sertoli-Zellen (TM4, Mather, J. P., Biol. Reprod. 23: 243–251 [1980]); Affennierenzellen (CV1 ATCC CCL 70); afrikanische Grünaffen-Nierenzellen (VERO-76, ATCC CRL-1587); Humancervicalcarcinomzellen (HELA, ATCC CCL 2); Hundenierenzellen (MDCK, ATCC CCL 34); Buffalo-rattenleberzellen (BRL 3A, ATCC CRL 1442); Humanlungenzellen (W138, ATCC CCL 75); Humanleberzellen (Hep G2, HB 8065); Mäusemammatumor (MMT 060562, ATCC CCL51); und TRI-Zellen (Mather, J. P. et al., Annals N. Y. Acad. Sci. 383: 44–68 [1982]).
Der Ausdruck "Transformation" bedeutet die Einführung von DNA in einen Organismus entweder als extrachromosomales Element oder durch chromosomale Integration, so daß die DNA replizierbar ist. Falls nicht anders angegeben, wird hier zur Transformation der Wirtszellen die von F. Graham, A. van der Eb, Virology 52: 456–457 (1973) angegebene Methode verwendet. Es können jedoch auch andere Verfahren zur Einführung von DNA in Zellen, z.B. die Einführung durch Nuklearinjektion oder Protoplastenfusion, verwendet werden. Bei Verwendung von prokaryotischen Zellen oder wesentliche Zellwandbauteile enthaltenden Zellen besteht das bevorzugte Transfektionsverfahren in einer Calciumbehandlung unter Verwendung von Calciumchlorid nach der Beschreibung von F. N. Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 69: 2110 (1972).
Die Bildung bzw. Konstruktion von geeigneten, die gewünschten Kodierungs- und Steuersequenzen enthaltenden Vektoren bedient sich Standard-Ligationstechniken. Isolierte Plasmide oder DNA-Fragmente werden geschnitten, zurechtgeschnitten und in der gewünschten Form zur Bildung des erforderlichen Plasmids wieder verknüpft.
Für die Analyse zur Bestätigung der richtigen Sequenzen in den gebildeten bzw. konstruierten Plasmiden werden die Ligationsgemische zur Transformation von E. coli K12 Stamm 294 (ATCC 31446) verwendet und erfolgreiche Transformanten bei Eignung mittels Ampicillin- oder Tetracyclinresistenz selektiert. Die Plasmide aus den Transformanten werden nach dem Verfahren von Messing et al., Nucleic Acids Res. 9: 309 (1981) oder dem Verfahren von Maxam et al., Methods in Enzymology 65: 499 (1980) präpariert, durch Restriktion analysiert und/oder sequenziert.
Die Wirtszellen können mit den erfindungsgemäßen Expressionsvektoren transformiert und in üblichen Nährmedien, die zur Einführung von Promotoren, Selektion von Transformanten oder Amplifikation von Genen entsprechend modifiziert wurden, kultiviert werden. Die Kulturbedingungen, wie Temperatur, pH-Wert und dergleichen, entsprechen den früher bei der zur Expression ausgewählten Wirtszelle verwendeten. Sie sind dem Fachmann auf dem einschlägigen Fachgebiet bekannt.
Der Ausdruck "Transfektion" bezieht sich auf die Aufnahme eines Expressionsvektors durch eine Wirtszelle unabhängig davon, ob Kodierungssequenzen in der Tat exprimiert werden. Dem Fachmann sind zahlreiche Verfahren der Transfektion bekannt, beispielsweise CaPO₄ und Elektroporation. Eine erfolgreiche Transfektion wird im allgemeinen dadurch erkannt, daß in der Wirtszelle irgendeine Anzeige der Wirkungsweise dieses Vektors erfolgt.
Zur Erleichterung des Verständnisses der folgenden Beispiele werden bestimmte häufig vorkommende Verfahren und/oder Begriffe beschrieben.
"Plasmide" werden durch ein vorangestelltes kleines p und/oder sich anschließende Großbuchstaben und/oder Zahlen bezeichnet. Die hier verwendeten Ausgangsplasmide sind entweder kommerziell erhältlich, auf nicht eingeschränkter Basis öffentlich verfügbar oder können nach veröffentlichten Verfahren aus verfügbaren Plasmiden gebildet werden. Ferner sind zu den beschriebenen äquivalente Plasmide auf dem einschlägigen Fachgebiet bekannt und dem Fachmann ersichtlich.
Der Ausdruck "Verdauung" von DNA bezieht sich auf die katalytische Spaltung von DNA mit einem nur auf bestimmte Sequenzen in der DNA wirkenden Restriktionsenzym. Die hier verwendeten verschiedenen Restriktionsenzyme sind kommerziell erhältlich. Sie wurden unter Reaktionsbedingungen, mit Kofaktoren und anderen Erfordernissen entsprechend dem Wissen eines Fachmanns eingesetzt. Zu analytischen Zwecken wird typischerweise 1 μg des Plasmids oder DNA-Fragments mit etwa 2 Enzymeinheiten in etwa 20 μl Pufferlösung verwendet. Zum Zwecke der Isolierung von DNA-Fragmenten zur Plasmidkonstruktion werden typischerweise 5–50 μg DNA mit 20 bis 250 Enzymeinheiten in einem größeren Volumen verdaut. Die geeigneten Pufferlösungen und Substratmengen für spezielle Restriktionsenzyme sind durch den Hersteller spezifiziert. Üblicherweise werden Inkubationszeiten von etwa 1 h bei 37°C verwendet. Sie können jedoch gemäß den Lieferantenvorschriften variiert werden. Nach der Verdauung wird das Reaktionsgemisch direkt auf einem Polyacrylamidgel zur Isolierung des gewünschten Fragments der Elektrophorese unterzogen.
Der Ausdruck "Gewinnung" oder "Isolierung" eines gegebenen DNA-Fragments aus einem Restriktions- bzw. Verdauungsgemisch bedeutet die Auftrennung des Verdauungsgemischs auf Polyacrylamid- oder Agarosegel durch Elektrophorese, die Identifizierung des interessierenden Fragments durch Vergleich von dessen Beweglichkeit gegenüber Marker-DNA-Fragmenten bekannten Molekulargewichts, die Entfernung des das gewünschte Fragment enthaltenden Gelabschnitts und die Abtrennung des Gels von DNA. Dieses Verfahren ist allgemein bekannt (Lawn, R. et al., Nucleic Acids Res. 9: 6103–6114 [1981], und Goeddel, D. et al., Nucleic Acids Res. 8: 4057 [1980]).
Der Ausdruck "Dephosphorylierung" bezieht sich auf die Entfernung der terminalen 5'-Phosphate durch Behandeln mit bakterieller Alkaliphosphatase (BAP). Dieses Vorgehen hindert die beiden Restriktionsschnittenden eines DNA-Fragments an einer "Zirkularisierung" oder der Bildung einer geschlossenen Schleife, die eine Insertion eines weiteren DNA-Fragments an der Restriktionsstelle blockieren. Zur Dephosphorylierung werden übliche Verfahren und Mittel verwendet (Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, 133–134, Cold Spring Harbor, [1982]). Die Reaktionen unter Verwendung von BAP werden in 50 mM Tris bei 68°C zur Unterdrückung der Aktivität von möglicherweise in den Enzymzubereitungen vorhandenen Exonucleasen durchgeführt. Die Reaktionsdauer beträgt 1 h. Anschließend an diese Reaktion wird das DNA-Fragment einer Gel-Reinigung unterzogen.
Der Ausdruck "Ligation" bezieht sich auf den Prozeß der Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen zwei doppelsträngigen Nucleinsäurefragmenten (T. Maniatis et al., id., S. 146). Falls nicht anders angegeben, kann eine Ligation unter Verwendung bekannter Pufferlösungen und Bedingungen mit 10 Einheiten T4-DNA-Ligase ("Ligase") pro 0,5 μg nahezu equimolarer Mengen der zu verknüpfenden DNA-Fragmente durchgeführt werden.
Der Ausdruck "Filling" oder "Blunting" bezieht sich auf die Verfahren, durch die das einsträngige Ende am kohäsiven Ende einer durch ein Restriktionsenzym geschnittenen Nucleinsäure in einen Doppelstrang umgewandelt wird. Dadurch wird das kohäsive Ende eliminiert und zu einem glatten Ende umgebildet. Dieser Prozeß stellt ein vielseitiges Werkzeug zur Umwandlung eines möglicherweise mit den durch nur ein oder einige andere(s) Restriktionsenzym(e) erzeugten Enden kohäsiven Restriktionsschnittendes in ein mit einer beliebigen glattendig schneidenden Restriktionsendonuklease kompatibles Ende oder ein anderes aufgefülltes kohäsives Ende dar. Typischerweise wird das Blunting durch Inkubation von 2–15 μg der Ziel-DNA in 10 mM MgCl₂, 1 mM Dithiothreitol, 50 mM NaCl, 10 mM Tris-Puffer (pH-Wert 7,5) bei etwa 37°C in Anwesenheit von 8 Einheiten Klenow-Fragment von DNA-Polymerase-I und jeweils 250 μM der vier Desoxynucleosidtriphosphate durchgeführt. Die Inkubation wird im allgemeinen nach 30 min. durch Phenol- und Chloroform-Extraktion und Ethanol-Fällung beendet.
Humangewebefaktorprotein sowie dessen rekombinantes Expressionsprodukt wird nach dem folgenden Protokoll erhalten:

1. Dem aminoterminalen Abschnitt von Gewebefaktorprotein entsprechende Oligonucleotidsonden, die für die einzelnen Aminosäuren eine einzelne Codonwahl darstellen, und das CNBr-Peptidfragment wurden auf chemischem Wege synthetisiert.
2. Zwei zu Codons für Aminosäuresequenzen von Gewebefaktorprotein komplementäre Desoxyoligonucleotide gemäß der folgenden Beschreibung wurden synthetisiert und mit γ-³²P-ATP radioaktiv markiert.
3. Durch Oligo(dT)-Primer initiierte cDNA-Bibliotheken wurden in λgt10 hergestellt.
4. Eine Humanplazenta-cDNA-Bibliothek wurde unter Verwendung der chemisch synthetisierten Oligonucleotidsonden gescreent. Bei Einsatz der 60-mer-Sonde (a) wurden keine positiven Plaques erhalten. Bei Einsatz der 81-mer-Sonde (b) wurden zweiundzwanzig (22) positive Plaques erhalten, wobei die Hälfte sehr schwach positiv war. Die elf (11) besten wurden für ein Rescreening zur Plaque-reinigung ausgewählt. Beim zweiten Screening wurden 5 positive Plaques erhalten. Die DNA von diesen beiden wurde jeweils präpariert.
5. Klone mit einer Gesamt-cDNA von etwa 2.800 bp insertierter DNA wurden isoliert. Es wurde eine Sequenzierung und Charakterisierung der Plazenta-Klone durchgeführt. Da die Größe der mRNA auf einem Northern-Blot etwa 2,35 kb betrug, enthielten diese Klone möglicherweise nicht herausgeschnittene Introns. Daher wurde eine Humanfett(gewebe)-Bibliothek gescreent.
6. Eine durch Oligo(dT)-Primer initiierte Humanfett(gewebe)-Bibliothek wurde unter Einsatz eines 1400 bp-EcoRI-Fragments aus einem der Plazenta-Klone gescreent.
7. Klone mit einer Gesamt-cDNA von etwa 2350 bp (umfassend 150 bis 200 bp für das polyA-Ende) und 1800 bp Insert-DNA wurden isoliert. Diese Klone mit 2350 bp und vermutlich der gesamten Gewebefaktor-mRNA wurden sequenziert.
8. Die die volle Länge aufweisende cDNA mit Kodierung für Humangewebefaktorprotein wird in einem Plasmid konstruiert. Es sollte registriert werden, daß die Kenntnis der vollständigen DNA-Sequenz in 2 die Herstellung extrem langer Sonden mit perfekter Homologie zu Humangewebefaktorprotein-cDNA ermöglicht, wodurch die Sondierung von cDNA oder von Genombibliotheken anderer Spezies in beträchtlicher Weise vereinfacht und deren Effizienz erhöht wird und eine Einsparung von Gewebefaktorproteinreinigung, Sequenzierung und der Herstellung von Sondenpools möglich wird.
9. Die cDNA mit Kodierung für Humangewebefaktorprotein wird dann in ein Expressionsvehikel eingebaut, welches wiederum zur Transformation einer geeigneten Wirtszelle verwendet wird. Diese wird anschließend zur Produktion des gewünschten Gewebefaktorproteins in einer Kultur wachsen gelassen.
10. Das gemäß dem vorstehenden Verfahren erzeugte biologisch aktive Gewebefaktorprotein weist 263 Aminosäuren auf.

Die folgenden Beispiele erläutern das zur Zeit als das Beste angesehene Verfahren zur praktischen Umsetzung der Erfindung, sollen diese jedoch nicht beschränken.
BEISPIEL 1
Klonieren von cDNA
DNA mit Kodierung für Gewebefaktorprotein kann durch chemische Synthese bei Kenntnis der vollständigen DNA-Sequenz, durch Screenen reverser Transkripte von mRNA aus verschiedenen Geweben oder durch Screenen von Genombibliotheken aus einer beliebigen Zelle erhalten werden. Da zum Zeitpunkt dieser Erfindung weder die vollständige Aminosäure- noch DNA-Sequenz von Gewebefaktorprotein bekannt waren, war die chemische Synthese der vollständigen DNA-Sequenz mit Kodierung für Gewebefaktorprotein nicht möglich.
Eine Humanplazenta-cDNA-Bibliothek wurde nach einer früheren Beschreibung (A. Ullrich et al., Nature 309: 418–425 [1984]) hergestellt. Doppelsträngige cDNA wurde aus Humanfett(gewebe)-RNA unter Verwendung von reverser Transkriptase in bekannter Weise hergestellt. Nach E. coli-RNase-H-Behandlung wurde DNA-Polymerase-I zur Synthetisierung des zweiten Strangs verwendet und anschließend eine Ligation an synthetische Oligonucleotide mit Restriktionsstellen für SalI, SstI, XhoI und einem überhängenden EcoRI-Ende nach einer früheren Beschreibung (Gubler, U. und Hoffman, B. J., Gene 25: 263 [1983]) durchgeführt. Diese DNA wurde in die EcoRI-Stelle von λgt10 insertiert (Huynh, T. et al., DNA Cloning Techniques [ed. Grover, D] [1984]).
Zwei Oligonucleotidsonden, die eine mögliche Codon-Wahl für die einzelnen Aminosäuren der N-terminalen Aminosäurensequenz (60 Nucleotide) und der internen Aminosäuresequenz in der Nähe des C-Endes (81 Nucleotide) darstellen, wurden auf der Basis der folgenden beim genannten American Heart Association Meeting vorgestellten Aminosäuresequenzen designed und synthetisiert:
Aminoterminus
C-Terminus-Umgebung
Die cDNA-Klone von Humangewebefaktorprotein wurden unter Verwendung von DNA-Sonden, die zuerst zum Screenen einer Humanplazenta-cDNA-Bibliothek verwendet wurden, erhalten. Ein EcoRI-Fragment aus einem Plazenta-Klon mit 1400 bp wurde zum Screenen einer Humanfett(gewebe)-cDNA-Bibliothek verwendet.
Etwa eine Million Phagen der durch Oligo(dT)-Primer initiierten Humanplazenta-cDNA-Bibliothek in λgt10 wurden auf fünfundzwanzig (25) 15-cm-Petriplatten wachsen gelassen, von denen Dreifachnitrozellulosefilter abgehoben wurden. Die Filter wurden mit jeder der ³²P-endmarkierten Oligonucleotidsonden in 0,75 M NaCl, 75 mM Trinatriumcitrat, 50 mM Natriumphosphat (pH 6,8), 5X Denhardtscher Lösung, 20%igem Formamid, 10%igem Dextransulfat und 0,2 g/l gekochter ultraschallbehandelter Lachssperma-DNA bei 42°C über Nacht hybridisiert und dann 2 h in 0,30 M NaCl, 30 mM Trinatriumcitrat, 0,1%igem NaDodSO₄ bei 42°C gewaschen. Zweiundzwanzig (22) hybridisierende Positivduplikate wurden bei Filtern, die mit der C-Terminusumgebungssonde von Gewebefaktorprotein hybridisiert wurden, beobachtet. Die elf (11) besten wurden zur Plaque-Reinigung ausgewählt. Die aminoterminale Sonde von Gewebefaktorprotein hybridisierte nicht. Fünf Klone erwiesen sich bei der Plaque-Reinigung als positiv. Die DNA wurde aus diesen jeweils präpariert und anschließend durch Verdauung mit EcoRI analysiert. Ein Klon war kürzer und schien ein partieller Klon zu sein. Vier Klone, die sich, bezogen auf die EcoRI-Verdauung, als identisch erwiesen, stellten die besten Kandidaten für cDNA-Klone voller Länge dar. EcoRI-Fragmente von drei dieser Klone, der partielle Klon und zwei der vermuteten Klone voller Länge wurden zur DNA-Sequenzierung nach dem Didesoxykettenabbruchverfahren (J. Messing et al., Nucleic Acids Res. 9: 309–321 [1981]) in M13-Phagenvektoren subkloniert.
Ein EcoRI-Fragment mit 1400 bp aus einem Plazenta-cDNA-Klon wurde mit einem Northern-Blot, an den mRNA gebunden war, hybridisiert. Die Größe der Gewebefaktorprotein-mRNA in den als positiv getesteten Plazentaproben wurde zu etwa 2,35 kb bestimmt. Die Länge der Plazenta-cDNA-Klone einschließlich der dem polyA-Schwanz auf der mRNA entsprechenden Nucleotide betrug etwa 2800 bp. Diese Klone waren etwa 450 bp länger als die beobachtete Länge der mRNA auf dem Northern-Blot. Unmittelbar strangaufwärts der für den Aminoterminus des Proteins kodierenden DNA wurden in allen drei Leseras tern Stop-Codons und Methionin-Codons beobachtet, wodurch das Fehlen einer Signalsequenz nahegelegt wird. Das Fehlen einer Signalsequenz unmittelbar 5' der Sequenz, die den NH₂-Terminus des reifen Proteins in den Plazenta-Klonen darstellt, wurde durch Vergleich mit den im folgenden beschriebenen Fett(gewebe)-Klonen bestätigt. Durch Vergleich der Plazenta- und Fett(gewebe)Sequenzen wurde ferner bestimmt, daß die Plazenta-Klone eine in dem Fett(gewebe)-Klon nicht vorhandene dazwischenliegende Sequenz oder ein Intron enthielten. Das Vorhandensein des Introns im Plazenta-Klon läßt auf einen schlechten Spleißmechanismus in der Plazenta schließen, wodurch die Isolierung und Klonierung der Prä-Gewebefaktorprotein-DNA ein sehr schwieriges Unterfangen wird.
Wegen der Diskrepanz in der Länge zwischen den isolierten Plazenta-Klonen und der durch Northern-Blotting bestimmten mRNA wurde Gewebefaktorprotein-cDNA auch aus einer Fett(gewebe)-Bibliothek isoliert. Eine in λgt10 konstruierte Fett(gewebe)-cDNA-Bibliothek wurde gewählt, da Fettgewebe mit Plazentagewebe vergleichbare Mengen an Gewebefaktor-mRNA aufweist. Die Bibliothek wurde unter Verwendung eines EcoRI-Fragments mit 1400 bp eines mit γ-³²P-ATP radioaktiv markierten Plazenta-Klons unter stringenteren als den zum Screening der Plazenta-Bibliothek verwendeten Bedingungen gescreent (Die genannten Bedingungen wurden so modifiziert, daß bei der Hybridisierung 50% Formamid und beim Waschen 0,03 M NaCl, 3 mM Trinatriumcitrat, 0,1% NaDodSO₄ bei 60°C verwendet wurden). Es wurden vierzehn Positivdoppel positive unterschiedlicher Intensitäten erhalten. Zwölf hiervon wurden zur Plaque-Reinigung ausgewählt. Beim Rescreenen zur Plaque-Reinigung wurden acht starke Positivdoppel erhalten. Die DNA wurde aus den einzelnen dieser positiven Proben präpariert. Vier hiervon, die sich bei Verdauung mit EcoRI als identisch erwiesen, stellten die besten Kandidaten für cDNA-Klone voller Länge dar. Eine hiervon wurde zur Analyse durch DNA-Sequenzierung ausgewählt und als λTF14 bezeichnet. Die Größe dieser Klone betrug etwa 2350 bp einschließlich der Länge des polyA-Schwanzes. Dies war die gleiche Größe wie die beim genannten Northern-Blot beobachtete Grö ße. Ein fünfter Klon war kürzer als die genannten 2350-bp-Klone.
Zwei der Fett(gewebe)-cDNA-Klone waren kürzer als die mRNA voller Länge (etwa 1800 bp) und wiesen EcoRI-Verdauungsmuster auf, die sich von den Klonen von mutmaßlich voller Länge deutlich unterschieden. Aus der Analyse dieser Klone ergibt sich, daß es sich um partielle Klone dahingehend handelt, daß diese eine einem Abschnitt der Gewebefaktorprotein-mRNA entsprechende DNA umfassen. Der achte Klon wies nur etwa 850 bp auf und wurde zur weiteren Analyse nicht ausgewählt.
BEISPIEL 2
DNA-Sequenz von Gewebefaktorprotein-cDNA
Die Nucleotidsequenz von Gewebefaktorprotein-cDNA ist in 2 angegeben. Von den vier Fett(gewebe)-Klonen mit einem identischen EcoRI-Verdauungsmuster wurde ein Klon vollständig sequenziert und er entsprach der in 2 angegebenen Sequenz. Der Klon λTF14 enthält etwa 2217 bp eines Inserts, das etwa 90 Nucleotide des poly(A)-Schwanzes (der in 2 nicht angegeben ist) umfaßt. Die cDNA-Sequenz enthält 99 bp einer 5'-nichttranslatierten Sequenz. Das EcoRI-Verdauungsmuster des Klons von mutmaßlich voller Länge umfaßte drei Fragmente mit etwa 900, 750 und 650 bp. Ein fünfter Klon schien sich bezüglich des EcoRI-Verdauungsmusters im Fragment am 5'-Ende zu unterscheiden. Zwei der Fett(gewebe)-Klone wiesen ein EcoRI-Verdauungsmuster auf, das darauf hinwies, daß sie kürzer als die Klone voller Länge waren. Sie enthielten jedoch ein EcoRI-Fragment, das länger als jedes Fragment in den Klonen voller Länge war. Dies kann auf EcoRI-Polymorphie oder das Vorhandensein eines Introns zurückzuführen sein. Der längste Klon wurde vollständig sequenziert. Die Vollständigkeit der Kodierungssequenz wurde durch die Anwesenheit eines mit einem Startcodon, ATG, beginnenden langen offenen Leserasters festgestellt. Auf das ATG-Initiator-Codon folgen Codons für eine hydrophobe Leader- oder Signalsequenz.
Das 5'-Ende der cDNA enthält ein ATG-Startcodon für die Aminosäure Methionin, auf das ein kontinuierliches offenes Leseraster, welches für ein Polypeptid aus 295 Aminosäuren kodiert, folgt. Bei den ersten 32 Aminosäureresten handelt es sich meist um hydrophobe Aminosäuren, die vermutlich ein aminoterminales Signalpeptid darstellen. Die anschließende aminoterminale Sequenz entspricht der Sequenz von Gewebefaktorprotein, die aus Gewebe gereinigt wurde. Die cDNA-Sequenz sagt voraus, daß das reife Gewebefaktorprotein 263 Aminosäuren mit einem berechneten Molekulargewicht von etwa 29.500 enthält. Gewebefaktorprotein ist bekanntlich ein Membranglykoprotein mit einer relativen Molekülmasse von 42.000 bis 53.000 auf SDS-Polyacrylamidgelen. Die translatierte DNA-Sequenz sagt vier (4) Asparagin-verbundene Glykosylierungsstellen vorher. Ein Hydropathie-Profil des Proteins (5) zeigt, daß die ersten drei dieser Stellen in hydrophilen Abschnitten lokalisiert sind, wodurch die Wahrscheinlichkeit zunimmt, daß sie auf der Oberfläche des Proteins liegen und tatsächlich glykosyliert sind. In ähnlicher Weise liegt ein Cluster aus sieben von dreizehn Resten (Aminosäuren 160–172), bei denen es sich entweder um Serin oder Threonin handelt (was auf mögliche Stellen für O-verbundene Glykosylierung hinweist) ebenfalls in einem als hydrophil vorhergesagten Abschnitt. Das Hydropathie-Profil zeigt ferner einen auffallenden Cluster von hydrophoben Resten in der Nähe des Carboxyterminus (5). Dieser die Aminosäuren 220–243 umfassende Abschnitt umfaßt wahrscheinlich die Membranankerdomäne von Gewebefaktor. Eine Suche in Sequenz-Datenbanken zeigte keine signifikante Homologie von Gewebefaktor mit verfügbaren Proteinsequenzen. Es ist anzumerken, daß keine deutliche Homologie zu Faktor VIII, einem Protein-Kofaktor des Gerinnungsproteasefaktors IX, bestand. Dies ist unerwartet, da sowohl der Faktor-VIII-Faktor-IX- als auch der Gewebefaktor-Faktor-VII-Komplex die Aktivierung von Faktor X katalysieren und die Proteasen der einzelnen Komplexe (Faktor IX und VII) stark homolog sind (F. S. Hagen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 2412 [1986] und S. Yoshitake et al., Biochemistry 24: 3736 [1985]). Nun läßt sich erkennen, daß diese Wechselwirkungen sich nicht in einer Ähnlichkeit der primären Proteinsequenz der beiden Kofaktoren widerspiegeln.
Die cDNA-Sequenz impliziert, daß reifer Gewebefaktor durch Signal-Peptidase-Spaltung eines Prä-Peptids ohne weitere Propeptid-Verarbeitung freigesetzt wird. Die 32 Aminosäuren vom Anfangs-Methionin bis zum reifen Aminoterminus beginnen mit einem geladenen Abschnitt, auf den eine hydrophobe "Core"-Sequenz von 14 Resten folgt. Das Präpeptid endet mit ala-gly-ala; ala-X-ala ist die häufigste Sequenz, die vor einer Signal-Peptidase-Spaltung liegt (O. Perlman et al., Mol. Biol. 167: 391 [1983]).
Das Methionin-Codon bei Nucleotid 100–102 (2) initiiert vermutlich die Translation von Prä-Gewebefaktorprotein. Die fünf diesem ATG vorangehenden Nucleotide und das eine diesem ATG folgende Nucleotid sind bei Nucleotiden, die Translationsinitiationsstellen in eukaryotischer mRNA umgeben, üblich. Sie sind jedoch nicht vollständig mit der von M. Kozak, Nucl. Acids Res. 12: 857 [1984] beschriebenen Konsensussequenz identisch. Die charakterisierten cDNA-Klone scheinen praktisch den gesamten 5'-nichttranslatierten Abschnitt der Information zu enthalten.
Die cDNA enthält einen 3'-nichttranslatierten Abschnitt mit 1139 Nucleotiden, in dem 23 Nucleotide vor dem poly(A)-Schwanz das übliche Polyadenylierungssignal AATAAA liegt. Eine bemerkenswerte Eigenschaft des nicht-translatierten Abschnitts ist das Vorhandensein einer Repeatsequenz der Alu-Familie mit 300 bp. Im Humangenom sind etwa 300.000 Kopien des Alu-Repeats vorhanden und es gibt zahllose Beispiele ihres Vorhandenseins in den Introns von Genen, wo sie während der Reifung der mRNA durch Spleißen entfernt werden (C. W. Schmid et al., Science 216: 1065 [1982] und P. A. Sharp, Nature 301: 471 [1983]). Obwohl cytoplasmatische poly(A)⁺-mRNA ebenfalls Alu-Sequenzen enthält, gab es bisher nur zwei spezielle Berichte über Alu-ähnliche Sequenzen in der 3'-nichttranslatierten Sequenz von mRNAs: In den Histokompatibilitätsantigenen der Klasse 1 bei Maus und Ratte und beim menschlichen low-density-Lipoprotein-Rezeptor (L. Hood et al., Ann. Rev. Immunol. 1: 529 [1983]; B. Majello et al., Nature 314: 457 [1985] und T. Yamamoto et al., Cell 39: 27 [1984]). Alu-Sequenzen werden oft von kurzen direkten Repeats flankiert, wahrscheinlich eine Folge ihrer Insertion in das Genom an versetzten Doppelstrangbrüchen. Die Alu-Sequenz im 3'-Abschnitt von Gewebefaktor-cDNA ist von einem direkten Repeat aus 11 Nucleotiden flankiert, wie dies in 2 durch Pfeile angedeutet ist.
BEISPIEL 3
Expression von Humangewebefaktorprotein
Eukaryotenwirt
Die Humangewebefaktorprotein-cDNA voller Länge war im cDNA-Klon λTF14 enthalten. Die cDNA voller Länge wurde in ein Expressionsplasmid, umfassend den Cytomegalovirusenhancer und -promotor, die (das) Cytomegalovirusspleißdonorstelle und -intron, das(die) Ig-variable-Region-Intron und -Spleißakzeptorstelle, die SV40-Polyadenylierungs- und Transkriptionsterminationsstelle, insertiert. Die in 4 angegebene Herstellung des Expressionsvektors wurde wie folgt unternommen.
Der als pCIS2.8c26D bezeichnete, hier verwendete Grundvektor basiert auf dem in der Europäischen Anmeldung Nr. 87308060.0 (US-A-07/071674, eingereicht am 9. Juli 1987, und 06/907185, eingereicht am 12. September 1986, Docket Nr. 373P1) beschriebenen pF8CIS.
Entsprechend 4a wurde ein einziges Nucleotid, das in pF8CIS vor der ClaI-Stelle liegt, von Guanosin zu Thymidin geändert, so daß ein dam^–-Stamm von E. coli zum Schneiden der ClaI-Stelle nicht erforderlich ist.
Es wurde eine Ligation mit 3 Teilen durchgeführt, umfassend die folgenden Fragmente: a) das ClaI-SstII-Fragment von pF8CIS mit 12617 bp (aus einem dam^–-Stamm isoliert und BAP-behandelt); das SstII-PstI-Fragment von pF8CIS mit 216 bp; und c) ein kurzes synthetisches PstI-ClaI-Oligonucleotid, das mit Kinase behandelt wurde (s. 4a, ein Stern kenn zeichnet das geänderte Nucleotid). Diese 3-Teile-Ligation erzeugt den Expressionsvektor pCIS2.8c24D, der in den zur Expression von Gewebefaktor verwendeten Abschnitten mit pCIS2.8c26D und pCIS2.8c28D identisch ist.
Dieser Vektor wurde zur Entfernung der Faktor VIII-Kodierungssequenz durch einen ClaI-HpaI-Verdau modifiziert.
Dieser Abschnitt wurde durch einen Polylinker zur Gewährleistung weiterer möglicher Klonierungsstellen ersetzt. Die Sequenz des verwendeten Polylinkers ist im folgenden angegeben.
Die ClaI- und HpaI-Stellen des ursprünglichen Vektors werden regeneriert und Stellen für die Enzyme XbaI, XhoI, NotI wurden eingeführt. Dieser Vektor wird als pCIS2.CXXNH bezeichnet. Die Kodierungsregion für Gewebefaktor wurde aus λTF14 unter Verwendung der an der 5'-Verbindung des λ-Vektors und der cDNA befindlichen SalI-Stelle und einer 3' der Kodierungsregion im nichtkodierenden Bereich der cDNA gelegenen NcoI-Stelle subkloniert. Zunächst wurde durch Verdauung mit NcoI ein stumpfes 3'-Ende erzeugt und anschließend eine Auffüllreaktion mit der Klenow-Fragment-DNA-Polymerase und 4dNTPs durchgeführt. Beim anschließenden Schneiden der λTF14-DNA mit SalI wurde ein Fragment mit etwa 1232 bp mit der am 5'-Ende überhängenden Sequenz TCGA und einem stumpfen 3'-Ende, das die Gewebefaktorkodierungsregion enthielt, erzeugt. Dieses wurde in den mit XhoI (Bildung eines überhängenden TCGA) und HpI (stumpfes Ende) geschnittenen Vektor pCIS2.CXXNH durch Ligation eingeführt. Der neue Vektor wurde als pCIS.TF oder alternativ als pCISTF1 bezeichnet.
Humanembryonierenzellen (293 Zellen) und Affennierenzellen (Cos-Zellen) wurden mit dem Gewebefaktorprotein-cDNA enthaltenden Expressionsvektor pCIS.TF transfiziert. 48 h nach der Transfektion wurden die Zellen geerntet und bezüglich der Gewebefaktorproteinaktivität durch den im folgenden beschriebenen Chromogen-Assay getestet. Die Zellen wurden von den 100 mm-Platten durch Suspendieren in 1 ml 0,01 M Natriumphosphatpuffer des pH-Werts 7,0, der 0,15 M NaCl enthielt, entfernt. Die Extinktion bei 550 nm wurde zur Einstellung auf die unterschiedliche Zelldichte auf den Platten auf 0,750 eingestellt. Die Zellen wurden 1 min ultraschallbehandelt. Triton X-100 wurde entsprechend einer Endkonzentration von 0,1% zugesetzt. Die Proben wurden 90 min bei Raumtemperatur rotieren gelassen und der Zellabfall wurde durch Zentrifugieren mit 10.000 × g entfernt. Die durch Detergentien aufgeschlossenen bzw. löslich gemachten Extrakte wurden durch Verdünnen von 2 μl der Probe in 0,8 ml 0,05 M Tris-HCl, pH 7,5, worin 0,1 M NaCl, 0,1% Rinderserumalbumin (TBS-Puffer) enthalten waren, relipidisiert. Die Lösung wurde mit 50 μl einer 5 mg/ml-Lösung von Phosphatidylcholin (Lecithin) in 0,25% Desoxycholsäure und 25 μl CdCl₂ versetzt und 30 min bei 37°C inkubiert.
Das rekombinante Gewebefaktorprotein wurde bezüglich der Funktionsfähigkeit in einem speziellen farberzeugenden Test (Chromogen-Assay) getestet. Die Ergebnisse sind in 9 angegeben. Wie erwartet zeigte sich, daß verschiedene Konzentrationen von Kaninchenhirn-Thromboplastin (roher Gewebefaktor) in diesem Test reagierten. Kontroll-COS-7-Zellen (die den Stamm-Expressionsvektor ohne Gewebefaktor-cDNA enthielten) wiesen eine nur schwach über dem Leerversuch (nur mit Zugabe des Relipidisierungsgemischs) liegende Aktivität auf (9). Die mit dem Gewebefaktorexpressionsplasmid transfizierten Zellen zeigten dagegen in diesem Test eine stark positive Reaktion, wodurch aufgezeigt wurde, daß die cDNA für Gewebefaktor kodiert.
BEISPIEL 4
Expression von Humangewebefaktorprotein Prokaryotenwirt
Das Plasmid pTF2Al2 wurde unter Verwendung des Alkaliphosphatase-Promotors und der STII-Leadersequenz zur Expression von reifem Gewebefaktorprotein in E. coli gestaltet (US-A-4680262). Dieses Plasmid wurde durch Ligation von 4 DNA- Fragmenten konstruiert (vergl. 6). Das erste bestand aus dem synthetischen DNA-Doppelstrang:
Das genannte Fragment kodiert für die ersten 12 Aminosäuren von reifem Gewebefaktorprotein. Das zweite war ein für die Aminosäuren 13–216 kodierendes BbvI-EcoRI-Restriktionsfragent des im vorhergehenden genannten pCISTF mit 624 Basenpaaren. Das dritte war ein für die letzten 47 Aminosäuren von Gewebefaktorprotein kodierendes EcoRI-BamHI-Fragment von pCISTF mit 518 Basenpaaren. Das Plasmid pAPSTII HGH-1 (US-A-4680262) wurde mit NsiI-amHI zu 30 bp unter Erzeugung eines Fragments verdaut.
Die vier Fragmente wurden zur Bildung des Plasmids pTF2A12 gemäß 6 durch Ligation miteinander verknüpft und zur Transformation von E. coli-K12-Stamm-294-Zellen verwendet. Die Transformanten wurden durch Ampicillinresistenz selektiert. Das Plasmid pTF2Al2 wurde durch Restriktionsanalyse und Didesoxy-Sequenzierung selektiert.
Expressionsvektoren enthaltende E. coli-K12-Stamm-294-Zellen wurden bei 29°C in 50 μg/ml Carbenicillin enthaltenden armen Phosphatmedien über Nacht wachsen gelassen. Zellpellets aus 1 ml Kulturlösung mit einer Extinktion von 1 bei 600 nm wurden in 200 μl 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1 mg/ml Lysozym resuspendiert. Die Suspensionen wurden 1 min pulsbeschallt und anschließend zur Entfernung von Zellabfall mit 10.000 × g zentrifugiert. Die mit Detergentien aufgeschlossenen Extrakte wurden durch Verdünnen von 10 μl der Probe in 0,8 ml 0,05 M Tris-HCl, pH-Wert 7,5, worin 0,1 M NaCl, 0,1% Rinderserumalbumin (TBS-Puffer) enthalten waren, relipidisiert. Die Lösung wurde mit 50 μl einer 5 mg/ml-Lösung von Phosphatidylcholin in 0,25% Desoxycholsäure und 25 μl CdCl2 versetzt und 30 min bei 37°C inkubiert.
Die Gewebefaktoraktivität wurde durch den im folgenden beschriebenen Chromogentest nachgewiesen.
BEISPIEL 5
Expression einer Humangewebefaktorproteinmutante
Das Plasmid pTFIII ist zur Expression einer reifen Mutantenform von Gewebefaktorprotein in E. coli konstruiert. Diese Mutation wandelt Cystein an Position 245 von reifem Gewebefaktorprotein in Serin um. Die Regulationselemente für die Expression, der Alkaliphosphatase-Promotor und die STII-Leadersequenz sind mit den beim Aufbau des Plasmids pTF2A12 verwendeten identisch.
Das Plasmid TFIII wurde in drei Stufen hergestellt, wobei die ersten beiden das Carboxyl-Ende des Gens wieder aufbauen. Die Plasmide pTF100-1 und pTR80-3 sind die Ergebnisse der ersten beiden Stufen.
Das Plasmid pTF100-1 wurde aus drei DNA-Fragmenten aufgebaut (s. 7a). Das erste besteht aus dem Klonierungsvektor pTrp14 (US-A-4663283), in dem ein nicht essentielles EcoRI-XbaI-Fragment entfernt ist (7). Das zweite bestand aus einem für die Aminosäuren 217 bis 228 von reifem Gewebefaktorprotein kodierenden EcoRI-FokI-Fragment mit 32 Basenpaaren. Das dritte, für die Aminosäuren 229–245 kodierende Fragment bestand aus einem chemisch synthetisierten DNA-Doppelstrang, in dem das Codon an Position 245 von TGT zu TCT (unterstrichen) verändert war.
Die drei Fragmente wurden unter Bildung des Plasmids pTF100-1 durch Ligation miteinander verbunden und in E. coli K12 Stamm 294 transformiert. Die Transformanten wurden durch Ampicillinresistenz selektiert. Das Plasmid pTF100-1 wurde durch Restriktionsanalyse und Didesoxy-Sequenzierung selektiert.
Das Plasmid pTF80-3 wurde aus zwei DNA-Fragmenten aufgebaut (7b). Das erste bestand aus dem Plasmid-Vektor pHGH207 (US-A-4663283), in dem das XbaI-BamHI-Fragment mit 930 Basenpaaren entfernt war. Das zweite bestand aus dem chemisch synthetisierten 68-mer-DNA-Doppelstrang:
Die beiden Fragmente wurden unter Bildung des Plasmids pTF80-3 durch Ligation miteinander verbunden und in E. coli K12 Stamm 294 transfiziert. Die Transformanten wurden über Ampicillinresistenz selektiert. Das Plasmid pTF80-3 wurde durch Restriktionsanalyse und Didesoxy-Sequenzierung selektiert.
Das Plasmid pTFIII wurde aus 4 DNA-Fragmenten aufgebaut (7c). Das erste bestand aus dem Vektor pAPSTIIHGH (US-A-4680262), in dem das NsiI-BamHI-Fragment mit 930 Basenpaaren entfernt war. Das zweite bestand aus dem für die Aminosäuren 1–217 von reifem Gewebefaktorprotein kodierenden NsiI-EcoRI-Restriktionsfragment von pTF2A12 (s. Beispiel 4 oben) mit 650 Basenpaaren. Das dritte bestand aus einem für die Aminosäuren 218–245 der reifen Gewebefaktorproteinmutante kodierenden EcoRI-XbaI-Fragment von pTF100-1 mit 80 Basenpaaren. Das vierte bestand aus einem für die letzten 18 Aminosäuren kodierenden XbaI-BamHI-Fragment von pTF80-3 mit 60 Basenpaaren. Die vier Fragmente wurden durch Ligation miteinander verbunden und in E. coli K12 Stamm 294 transformiert. Die Transformanten wurden über die Ampicillinresistenz selektiert. Das Plasmid pTFIII wurde durch Restriktionsanalyse selektiert.
BEISPIEL 6
Expression eines Humangewebefaktorfusionsproteins
Ein Fusionselement mit der Herpes-gD-Signalsequenz (EP-Veröffentlichung Nr. 0139416, veröffentlicht am 2. Mai 1985) und dem reifen Abschnitt von Humangewebefaktor-cDNA wurde unter Verwendung der Steuerungselemente von Vektor pRK7 hergestellt. pRK7 und pRK5 (siehe im folgenden) wurden wie folgt konstruiert.
Aufbau von pRK5 und pRK7
Das Ausgangsplasmid war das bereits geschilderte pCIS2.8c28D. Die Basenzahlen in den Abschnitten 1–6 beziehen sich auf pCIS2.8c28D, wobei die Base 1 auf dem ersten T der vor dem CMV-Promotor liegenden EcoRI-Stelle liegt. Der(das) Cytomegalovirus-early-Promotor und -Intron und der SV40-Ursprung und das polyA-Signal waren auf getrennten Plasmiden plaziert.

1. Der Cytomegalovirus-early-Promotor wurde als EcoRI-Fragment von pCIS2.8c28D (9999-12-1) in die EcoRI-Stelle von pUC118 (Yanish-Perron et al., Gene 33: 103 [1985] kloniert. Zwölf Kolonien wurden aufgenommen und bezüglich der Orientierung, in der eine aus pUC118 hergestellte einzelsträngige DNA eine Sequenzierung von der EcoRI-Stelle bei 1201 zur EcoRI-Stelle bei 9999 ermöglichen würde, gescreent. Dieser Klon wurde als pCMVE/P bezeichnet.
2. Einzelsträngige DNA wurde aus pCMVE/P zur Insertion eines SP6-Promotors (M. R. Green et al., Cell 32: 681–694 [1983]) durch ortsspezifische Mutagenese hergestellt. Ein synthetisches, den SP6-Promotor enthaltendes 110-mer (s. Nucleic Acids Res. 12: 7041 [1984] 1); Sequenzen des SP6-Promotors von –69 bis +5 wurden zusammen mit Fragmenten von 18 bp an beiden Enden des Oligomers entsprechend CMVE/P-Sequenzen verwendet. Die Mutagenese erfolgte nach Standardtechniken. Sie wurde unter Verwendung eines markierten 110-mers mit hoher und ge ringer Stringenz gescreent. Sechs mögliche Klone wurden herausgenommen und sequenziert. Ein positiver wurde identifiziert und als pCMVE/PSP6 bezeichnet.
3. Der SP6-Promotor wurde geprüft und erwies sich beispielsweise bei Zugabe von SP6-RNA-Polymerase und Prüfen bezüglich RNA geeigneter Größe als aktiv.
4. Ein Cla-NotI-Sma-Adapter wurde zur Insertion von der ClI-Stelle (912) zur SmaI-Stelle von pUC118 in pCMVE/P (Stufe 1) und pCMVE/PSP6 (Stufe 2) hergestellt. Dieser Adapter wurde in die ClaI-SmaI-Stelle von pUC118 durch Ligation eingeführt und bezüglich der korrekten Klone gescreent. Der Linker wurde bei beiden sequenziert. Die Klone wurden mit pCMVE/PSP6-L und pCMVE/P-L bezeichnet.
5. pCMVE/PSP6-L wurde mit SmaI (an der Linker/pUC118-Verbindung) und HindIII (in pUC118) geschnitten. Ein HpaI (5573)-HindIII (6136)-Fragment des im folgenden angegebenen pSVORAAΔRI 11 wurde in SmaI-HindIII von pCMVE/PSP6-L insertiert. Diese Ligation wurde gescreent. Ein Klon wurde isoliert und mit pCMVE/PSP6-L-SVORAAΔRI bezeichnet.
a) Der SV40-Ursprung und das polyA-Signal wurden als XmnI (5475) – HindIII (6136)-Fragment von pCIS2.8c28D isoliert und in die HindIII-SmaI-Stellen von pUC119 kloniert. Dieser Klon wurde als pSVORAA bezeichnet.
b) Die EcoRI-Stelle bei 5716 wurde durch partielle Verdauung mit EcoRI und Auffüllen mit Klenow entfernt. Die durch Eigenligation nach Auffüllen erhaltenen Kolonien wurden gescreent. Der richtige Klon wurde isoliert und mit pSVORAAΔRI 11 bezeichnet. Die deletierte EcoRI-Stelle wurde durch Sequenzieren geprüft und als korrekt nachgewiesen.
c) Das HpaI (5573)-HindIII (6136)-Fragment von psVORAAΔRI 11 wurde isoliert und in pCMVE/PSP6-L insertiert (s. 4 oben).
6. pCMVE/PSP6-L-SVORAAΔRI (Stufe 5) wurde mit EcoRI bei 9999 geschnitten, geglättet und eigenligiert. Es wurde ein Klon ohne eine EcoRI-Stelle identifiziert und mit pRK bezeichnet.
7. pRK wurde mit SmaI und BamHI geschnitten. Dieses wurde mit Klenow aufgefüllt und durch Ligation wieder verbunden. Die Kolonien wurden gescreent. Eine positive Probe wurde identifiziert und mit pRKΔBam/Sma 3 bezeichnet.
8. Die HindIII-Stelle wurde unter Verwendung eines Konverters in eine HpaI-Stelle umgewandelt. (Ein Konverter ist ein zur Änderung einer Restriktionsstelle in eine andere verwendetes Stück DNA. In diesem Fall könnte ein Ende zu einem HindIII-klebrigen-Ende komplementär sein und am anderen Ende eine Erkennungsstelle für HpaI tragen). Es wurde eine positive Probe identifiziert und mit pRKΔBam/Sma, HIII-HpaI 1 bezeichnet.
9. pRKΔBam/Sma, HIII-HpaI 1 wurde mit PstI und NotI geschnitten und ein RI-HIII-Linker und HIII-RI-Linker wurden durch Ligation eingefügt. Es wurden Klone für die beiden Linker gefunden. Es wurde jedoch auch festgestellt, daß zu viele der HpaI-Konverter eingebaut worden waren (zwei oder mehr Konverter erzeugen eine PvuII-Stelle). Diese Klone mußten daher mit HpaI geschnitten und eigenligiert werden.
10. RI-HIII-Klon 3 und HIII-RI-Klon 5 wurden mit HpaI geschnitten verdünnt und eigenligiert. Positive Proben wurden identifiziert. Der RI-III-Klon wurde mit pRK5 bezeichnet. Ein HIII-RI-Klon wurde mit HpaI geschnitten, verdünnt und eigenligiert. Nach dem Screenen wurde eine positive Probe identifiziert und mit pRK7 bezeichnet.

Der Vektor pRK7 enthält den CMV-Promotor und -Enhancer und -Spleißdonor, das IgG-Intron und den -Spleißakzeptor, den SP6-Promotor, das SV40-polyA-Signal und den SV40-Replikationsursprung; er weist kein DHFR-Gen auf. Der Aufbau des Gewebefaktorproteinexpressionsvektors wurde wie folgt unternommen: die Gewebefaktorprotein-cDNA von λTF14 wurde in die SalI-Stelle von pSP64 kloniert und als pSP64TF (Promega Corporation, 1987) bezeichnet. Das Gewebefaktor-cDNA enthaltende pSP64 wurde mit NcoI geschnitten. Ein nicht kinasebehandelter 18-mer-Konverter wurde mit dem NcoI-Ende zur Änderung der NcoI-Stelle in eine XbaI-Stelle ligiert. Die verwendete Linker-Sequenz war folgende:
NcoI-XbaI-Linker
pSP64 wurde anschließend mit BbvI verdaut. Ein Fragment mit 1030 bp wurde gel-isoliert. Ein nicht kinasebehandelter PvuII-BbvI-DNA-Doppelstrang mit etwa 100 bp enthielt die Sequenzen für die erste Thrombinaktivierungsstelle in Faktor VIII und die ersten 12 Aminosäuren von reifem Humangewebefaktorprotein. Die Sequenzen der etwa 100 bp waren wie folgt:
Gewebefaktor/Thrombin-Fusion
Das PvuII-BbvI-Fragment wurde an das Fragment mit etwa 1030 bp ligiert. Ein Fragment mit etwa 1130 bp wurde gelisoliert. Dieses PvuII-XbaI-Fragment wurde anschließend in einen als pSP64ThTF bezeichneten pSP64-Vektor ligiert. Es wurde ein Klon erhalten. Dieser wurde über den das synthetische 100-mer umfassenden Bereich sequenziert. Dieses Plasmid wurde mit PvuII und XbaI in einem Versuch zu einer Isolierung einer großen Menge des Inserts verdaut. Die XbaI-Stelle wurde jedoch nicht verdaut. Daher wurde das Insert durch Schneiden mit PvuII und SalI gel-isoliert. Die SalI-Stelle befindet sich im verbleibenden Teil des pSP64-Polylinkers und ist nahe der XbaI-Stelle lokalisiert. Das zweite Fragment, das die Herpes-gD-Signalsequenz plus einen Teil der nicht translatierten 5'-Region enthält, umfaßte ein aus pgD-DHFR (EP-Veröffentlichung 0139417, veröffentlicht am 2. Mai 1985), welches mit PstI-SacII verdaut wird, erhaltenes Fragment mit 275 bp und ein synthetisches SacII-PvuII-Fragment mit 103 bp der folgenden Sequenz:
Synthetisches SacII-PvuII-Fragment (HSVgD-Leader)
Das dritte Segment wurde durch Verdauen von pRK7 mit PstI-SalI und Gel-Isolation eines Fragments von etwa 4700 bp erhalten. Bei der endgültigen Ligation von 3 Teilen wurden verwendet: a) ein PvuII-SalI-Fragment mit der ersten 5' zu der für Gewebefaktorprotein kodierenden cDNA gelegenen Thrombinaktivierungsstelle; b) ein PstI-PvuII-Fragment mit der Herpes-gD-Signalsequenz und c) das die Steuerungselemente enthaltende pRK-Fragment. Die genannten drei Teile und die Klone wurden durch Restriktionsenzymverdauung und Sequenzieren hergestellt und als korrekt identifiziert.
Humanembryonierenzellen (2935) wurden mit dem das Gewebefaktor-Herpes-gD-Fusionsprotein enthaltenden Expressionsvektor transfiziert. Die Human-293-Zellen werden 15 h nach einer transienten Transfektion geerntet. Das Kulturmedium wird entfernt und es werden 2 ml Extraktionspuffer (5 mM Tris HCl), 150 mM NaCl: pH 7,5 [TBS] mit 0,1% Triton X-100) pro 100-mm-Gewebekulturplatte zugegeben. Die Zellen werden suspendiert und (Ende-über-Ende) 45–60 min bei 4°C rotiert. Der Extrakt wird 20 min mit 8000 × g zentrifugiert und anschließend direkt auf die monoklonale-Antikörper-Säule (3,5 mg 5B6/ml CNBr-aktivierte Sepharose) mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,8 ml/min aufgetragen. Die Herstellung eines Antikörpers zu Herpes-gD ist in der EP-Veröffentlichung Nr. 1139416, veröffentlicht am 2. Mai 1985, beschrieben. Die Antikörpersäule wird mit 10 ml Extraktionspuffer zur Rückführung der Extinktion (280 nm) auf die Grundlinie gewaschen. Die Säule wird anschließend mit 50 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, 0,1% Triton X-100, pH 7,5, gewaschen und mit 0,1 M Glycin, 150 mM NaCl, 0,1 Triton X-100, pH 2, eluiert. Der pH-Wert wird mit 1 M Tris-HCl, pH 8,5 auf einen neutralen Wert eingestellt.
Der gD-Abschnitt des gD-Gewebefaktorfusionsproteins wurde vom Fusionsprotein unter Verwendung von Thrombin abgespalten. 1110 Einheiten Thrombin (0,33 mg Protein) wurden kovalent an 0,5 ml CNBr-aktivierte Sepharose entsprechend den Herstellervorschriften gebunden. 5000 Einheiten gDTF-Fusionsprotein werden mit etwa 150 μl Thrombin-Sepharose 90 min bei 37°C inkubiert (Ende-über-Ende-Rotation). Thrombin-Sepharose wird anschließend durch Zentrifugation entfernt.
Die Gewebefaktoraktivität wurde durch den im folgenden chromogenen Test nachgewiesen.
BEISPIEL 7
Expression von Gewebefaktorprotein mit deletierter Cytoplasmadomäne
Der Vektor pRKTFΔ244 wurde entsprechend 10 zur Expression von Gewebefaktorprotein ohne die Cytoplasmadomäne, die Aminosäuren 244–263, konstruiert. Der Vektor wurde durch die Ligation von 3 Teilen hergestellt. Der erste Teil bestand aus einem durch Verdauen von pCISTF1 mit EcoRI und ClaI erhaltenen Fragment mit 859 bp. Das Fragment mit 859 bp wurde gel-isoliert. Der zweite Teil wurde nach der ClaI-BamHI-Verdauung des vorhergenannten pRK5 gemäß der obigen Beschreibung gel-isoliert. Der dritte Teil bestand aus einem chemisch sythetisierten EcoRI-BamHI-87-mer mit der folgenden Sequenz:
87-mer
Bei der Ligation von 3 Teilen wurden verwendet: a) das für die Aminosäuren 1–216 kodierende Fragment mit 859 bp; b) das Fragment von pRK5 mit 4700 bp und c) das für die Aminosäuren 217–243 kodierende 87-mer. Dieser neue Vektor wurde mit pRKTFΔ244 bezeichnet (s. 10).
Humanembryonierenzellen (293) wurden mit dem Expressionsvektor pRKTFΔ244 transfiziert. Nach drei Tagen wurde Gewebefaktorprotein mit deletierter Cytoplasmadomäne gemäß der vorherigen Beschreibung gereinigt und mit dem im folgenden angegebenen chromogenen Test getestet. Der Gewebefaktor mit deletierter Cytoplasmadomäne zeigte in dem Test eine starke positive Reaktion, wodurch gezeigt wird, daß das Gewebefaktorprotein mit deletierter Cytoplasmadomäne in diesem in vitro-Koagulationsversuch wirksam war.
BEISPIEL 8
Reinigung von Gewebefaktorprotein
Gewebefaktorprotein wurde mittels Immunoaffinitätsreinigung unter Verwendung eines Humangewebefaktorprotein bindenden monoklonalen IgG-Antikörpers gereinigt.
Humangewebefaktorprotein wurde in der im vorherigen beschriebenen rekombinanten Kultur synthetisiert. Die folgenden Immunogene wurden gemäß dem folgenden Schema einer BALB/c-Maus (29.1.C.) injiziert: rekombinantes Humangewebefaktorprotein (rTF) (0,07 mg/ml mit einer spezifischen Aktivität von 17040 U/mg); rekombinantes Gewebefaktorprotein, das aus einem durch Thrombin zur Entfernung der Herpes-gD-Sequenzen vom aminoterminalen Ende gespaltenen Gewebefaktor-gD-Fusionsprodukt erhalten wurde (rTF:gDThr) (0,72 mg/ml mit einer spezifischen Aktivität von 4687 U/mg) und rekombinantes Gewebefaktor-Herpes-gD-Fusionsprodukt (rTF-gD) (etwa 150.000 U/mg) nach dem folgenden Immunisierungsschema:

** 10–40 μg/ml

Der durch Radioimmunfällung (RIP) und ELISA bestimmte Anti-TF-Titer nahm während der Immunisierungen bis zum Tag 85 schrittweise zu.
Beim RIP-Test wurden 0,005 ml der Seren von immunisierten und nicht immunisierten Mäusen, die mit 0,495 ml PBSTA (PBS mit 0,5% Rinderserumalbumin [BSA] und 0,1% Triton X-100) verdünnt worden waren, verwendet. 50.000 cpm ¹²⁵I-rTF wurden zugesetzt. Das Gemisch wurde 2 h bei Raumtemperatur in kubiert. Der mit Antikörper komplexierte ¹²⁵I-rTF wurde durch Inkubation bei Raumtemperatur während 1 h mit 0,05 ml SPA-Perlen gefällt. Die SPA-Perlen bestanden aus an Sepharose-CL-4B-Perlen gebundenem Staphylokokkenprotein A, wobei diese mit Kaninchen-Anti-Maus-IgG vorinkubiert und in 50 mM Tris, pH 8, 10 mM MgCl₂, 0,1% BSA und 0,02% NaN₃ aufbewahrt worden waren. Die Perlen wurden pelletiert, dreimal mit PBSTA gewaschen und in einem gamma-Zähler gezählt.
Der ELISA bestand aus 0,1 ml rTF (0,5 μg/ml) in Carbonatpuffer eines pH-Werts von 9,6, der 2 h bei 37°C an Mikrotiter-Vertiefungen adsorbiert wurde. Eine weitere nichtspezifische Adsorption an die Vertiefungen wurde 1 h bei 37°C mit PBSA (PBS mit 5% BSA) blockiert. Die Vertiefungen wurden dreimal mit PBST (PBS mit 0,1% Tween 80) gewaschen. Die in PBS verdünnten Serumproben wurden zugegeben und über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Vertiefungen wurden dreimal mit PBST gewaschen. Jede Vertiefung wurde mit 0,1 ml von mit Meerrettichperoxidase konjugiertem Ziegen-Anti-Maus-Immunglobulin versetzt und 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Vertiefungen wurden wiederum gewaschen. O-Phenylendiamin wurde als Substrat zugesetzt und das Ganze wurde 25 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wurde mit 2,5 M H₂SO₄ abgebrochen. Die Extinktion der einzelnen Vertiefungen wurde bei 492 min abgelesen.
Am 89 Tag wurden die Milz der Maus 29.1.C entnommen, zerkleinert und die Milzzellen mit P3 X63-Ag8.653 (ATCC CRL 1580) nicht sezernierenden Mausmyelomzellen unter Verwendung des PEG-Fusionsverfahrens von S. Fazakas de St. Groth et al., J. Immun. Meth., 35: 1–21 (1980) fusioniert. Die Fusionskultur wurde auf 4 Platten mit jeweils 96 Mikrotiter-Vertiefungen überimpft und in HAT (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin)-Medien mittels üblicher Techniken kultiviert (Mishell, Shiigi, Selected Methods in Cellular Immunology, W. H. Freeman & Co., San Francisco, S. 357–363 [1980]). Die anti-TF-Aktivität der Kultur-Überstände wurde mittels ELISA und RIP bestimmt. Es wurden 20 positive Proben mit anti-TF-Aktivität gefunden. Von diesen wurden 12 stabile Fusionsprodukte, die anti-TF sezernierten, vermehrt und durch Grenzwert-Verdünnung unter Verwendung veröffentlichter Verfahren (Oi, V. J. T. & Herzenberg, L. A., "Immunoglobulin Producing Hybrid Cell Lines" in Selected Methods in Cellular Immunology, S. 351–372, Mishell, B. B. und Shiigi, S. M. [Hrsg.], W. H. Freeman & Co. [1980]) kloniert. Die Selektion der Klone beruhte auf: makroskopischer Beobachtung einzelner Klone, ELISA und RIP. Die Isotypisierung des Antikörpers erfolgte unter Verwendung eines Zymed-Isotypisierungskits gemäß der beiliegenden Anleitung (Zymed Corp.). Große Mengen spezifischer monoklonaler Antikörper wurden durch Injektion von klonierten Hybridomzellen in "Pristan-primed" Mäuse zur Erzeugung von Ascites-Tumoren produziert. Ascites wurde anschließend gesammelt und über eine Protein-A-Sepharosesäule gereinigt.
Etwa 5 ml Ascitesflüssigkeit wurde mit 3000 min^–1 in einer Sorvall 6000 10 min bei 4°C zentrifugiert. Die durchsichtige Pristanschicht und die Lipidschicht wurden mit einer Pasteurpipette entfernt. Die Ascitesflüssigkeit wurde in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen überführt. Die Ascitesflüssigkeit wurde über ein 0,45-M-Filter sterilfiltriert. Zum Ascites wurden 1,11 g KCl zugesetzt, wobei eine Endkonzentration von 3 M KCl erhalten wurde.
Der Ascites wurde auf eine 10-ml-Säule mit SPA-Sepharose (Fermentech) gegeben. Die Säule wurde mit 3 M KCl gewaschen. Das Maus-IgG wurde mit 3 bis 4 Säulenvolumina 0,1 M Essigsäure in 0,15 M NaCl eines pH-Werts von 2,8 eluiert.
Der Antikörper D3 wurde entsprechend den Herstellervorschriften mit 3 mg IgG pro ml Sepharose an CNBr-Sepharose gekoppelt (s. Pharmacia Co. Anleitungshandbuch). Die transfizierten 293S-Zellen wurden in einem 1:1-Gemisch von Ham-F-12 (w/o Glycin, Hypoxanthin und Thymidin) und DMEM (w/o Glycin) wachsen gelassen. Zusatzstoffe zum Grundmedium sind: 10%iges dialysiertes oder diafiltriertes Fötenkalbsserum, 50 nM Methotrexat, 2,0 mM L-Glutamin und 10 mM HEPES-Puffer.
Eine gefrorene Phiole mit 2935 (63/2S CISTF) wird in einem das beschriebene Medium enthaltenden Gewebekulturkolben aufgetaut. Sobald die Kultur zusammenfließt, wird sie mit einem Trypsin/EDTA-Gemisch trypsinisiert und ein kleiner Teil der Zellpopulation zur Beimpfung größerer Kolben verwendet. Die Kulturen werden täglich durch Phasenmikroskopie zur Bestimmung des Wachstums (prozentuales Zusammenfließen), der Morphologie und der allgemeinen Gesundheit überwacht. Sobald die Rollflaschenkulturen zusammenflossen (üblicherweise innerhalb von 5–7 d), wurden die Zellen trypsinisiert und gezählt. Die Zahl der Zellen wurde ermittelt und ihre Lebensfähigkeit mittels der Trypanblau-Ausschlusstechnik bestimmt. Typische Zellzahlen bei einer Rollflasche von 850 cm² beim Zusammenfließen betrugen 1 bis 4 × 10⁸ Zellen. Die Zellen wurden in 0,01 M Natriumphosphat, 0,15 M NaCl suspendiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren mit 5000 min^–1 gesammelt. Die Zellen wurden in 50 ml TBS mit 1% Triton X pro Kolben resuspendiert. Die Kulturen wurden 1 h bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend 20 min mit 8000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde auf die im vorherigen beschriebene D3-Sepharosesäule aufgetragen. Die Säule wurde mit 0,1 M Essigsäure, 150 mM NaCl und 0,05% Tween 80 gewaschen und eluiert.
BESPIEL 9
Test auf Gewebefaktorprotein
1. Chromogener Gewebefaktortest.
Sämtliche aus dem Kulturmedium extrahierten Proben wurden vor dem Test relipidisiert. Wie im vorherigen diskutiert, ist für Gewebefaktor zur Entwicklung von Aktivität in in vitro-Testsystemen Phospholipid absolut erforderlich (Pitlick und Nemerson, aao). Lecithingranulat wurde in 0,05 M Tris, 0,1 M NaCl, pH 7,4 (TBS), worin 0,25% Natriumdesoxycholat enthalten war, bis zu einer Konzentration von 1 mg/ml homogenisiert. Diese Lösung (PC/DOC) wurde zur Relipidisierung von Gewebefaktor wie folgt verwendet. Gewebefaktorprotein wurde in 0,1% Rinderserumalbumin enthaltendem TBS (TBSA) verdünnt. 50 μl wurden in ein 12 × 75-mm Polystyrolteströhrchen gegeben und mit 50 μl PC/DOC-Lösung versetzt. Anschließend wurden 350 μl TBSA zusammen mit 25 μl 100 mM CdCl₂ zugegeben. Dieses Relipidisierungsgemisch wurde 30 min bei 37°C inkubieren gelassen.
Für den Chromogenen Test wurden relipidisierte Gewebefaktorproteinproben in TBSA verdünnt. 10 μl wurden in ein Teströhrchen mit 50 μl des Faktor-IX_a/Faktor-X-Reagens und 2 μl einer Lösung von gereinigtem Faktor VII, 30 U/ml, gegeben. Die Röhrchen wurden auf 37°C erwärmt und mit 100 μl 25 mM CaCl₂ versetzt. Die Proben wurden 5 min bei 37°C inkubiert, bevor sie mit 50 μl von einem für Faktor Xa spezifischen chromogenen Substrat 52222, das auch den synthetischen Thrombininhibitor I2581 enthielt, versetzt wurden. Die Reaktion wurde 10 min ablaufen gelassen und durch die Zugabe von 100 μl 50%iger Eisessiglösung gestoppt. Die Extinktion wurde bei 405 nm erfasst. Unter Verwendung von Kaninchenhirn-Thromboplastin (kommerziell erhältlich bei Sigma, St. Louis, MO.-Katalog #TO263) wurde eine Standardkurve erstellt, bei der diesem Reagens willkürlich 100 Gewebefaktoreinheiten/ml zugeordnet wurden. Die Verdünnungen erfolgten von 1:10 bis 1:1000. Die Extinktion wurde auf der Abszisse eines halblogarithmischen Kurvenpapiers mit der Standardverdünnung auf der Ordinate aufgetragen.
2. Einstufiger Test bezüglich Gewebefaktoraktivität.
10 μl von relipidisiertem oder lipidfreiem Gewebefaktorprotein oder TBSA als Kontrolle wurden in einem zur Verhinderung einer nichtspezifischen Aktivierung der Gerinnung durch die Kontaktphase silikonisierten Glasröhrchen mit 100 μl hämophilem Plasma versetzt. Die Reaktanden wurden auf 37°C erwärmt. Es wurden 100 μl 25 mM CaCl₂ zugegeben und die Zeit der Gerinnselbildung bestimmt (Hvatum, Y., Prydz, H., Thromb. Diath. Haemorrh. 21, 217–222 [1969]).
BEISPIEL 10
Wirksamkeit und fehlende Toxizität von Gewebefaktorprotein in einem Hundehämophiliemodell
Gewebefaktorprotein wurde hämophilen Hunden unter Verwendung des Verfahrens von Giles, A. R. et al. (Blood 60, 727–730 [1982]) infundiert.
Fehlende Gewebefaktorproteintoxizität wurde zuerst bei einem normalen Hund bei Bolusinjektion von Dosen von etwa 50 Gewebefaktorproteineinheiten/kg und 100 Gewebefaktorproteineinheiten/kg bestimmt. Eine Cuticulablutungszeit (CBT) wurde vor der Infusion und 30 min nach den einzelnen Injektionen ermittelt (Giles supra). Blutproben wurden zu verschiedenen Zeitpunkten während des Experiments abgezogen und für Gerinnungsversuche antikoaguliert. Zum Nachweis der in-vivo-Faktor-VIII-Bypassaktivität von Gewebefaktorprotein wurden Experimente unter Verwendung von hämophilen Hunden durchgeführt. Tiere, die keine Nahrung erhalten hatten, wurden anästhesiert und die CBT vor jeglicher Infusion ermittelt. Dann wurde Gewebefaktorprotein durch Bolusinjektion verabreicht und zu verschiedenen Zeitpunkten bis 90 min nach der Infusion CBTs ermittelt. Es wurden mehrere Dosen von Gewebefaktorprotein verabreicht. Die Blutproben wurden während der gesamten Dauer der einzelnen Experimente gezogen und bezüglich Faktor V, Prothrombin und partieller Thromboplastinzeiten untersucht. CBTs von mehr als 12 min wurden als stark abnormal betrachtet. Diese Nägel wurden kauterisiert, um exzessiven Blutverlust zu vermeiden.
Einem normalen anästhesierten Hund wurden Dosen von Gewebefaktorprotein, die 100 U/kg Gewebefaktorprotein bei der Relipidisierung im Chromogenen Test entsprachen, verabreicht. Die CBT in diesem Tier vor einer Infusion lag etwa bei 3 min. Nach 5 min ergab sich eine gewisse Reduktion der WBCT, während diese nach 15 min wieder normal war. Die Konzentrationen von Faktor V waren 30 min nach jeder Infusion normal. Die Prothrombin- und partiellen Thromboplastin-Zeiten waren am Ende des Experiments unverändert und ebenso die CBTs im normalen Bereich. Die Infusion von Gewebefaktorpro tein wurde daher in normalen Hunden gut vertragen und es zeigte sich kein Auftreten einer disseminierten intravasalen Gerinnung.
Einem hämophilen Hund mit der Eigenschaft einer verlängerten CBT von Hämophilie A wurden 100 U/kg Gewebefaktorprotein verabreicht. Die CBT normalisierte sich 5 min und 20 min nach dieser Infusion. Ein zweites Experiment unter Verwendung von 100 U/kg Gewebefaktorprotein ergab nach 20 min normales CGR und nach 90 min eine geringe Verkürzung von CBT. Der Prokoagulanseffekt blieb 90 min nach der Infusion nicht erhalten, die der CBT-Effekt zu diesem Zeitpunkt abermals verlängert war.
Pharmazeutische Zusammensetzungen
Die Gewebefaktorvarianten oder -fragmente oder -fusionspolypeptide können nach bekannten Verfahren zur Herstellung pharmazeutisch geeigneter Zusammensetzungen formuliert werden, wobei hierbei das Gewebefaktorproteinprodukt mit einem pharmazeutisch akzeptablem Trägervehikel kombiniert wird. Geeignete Vehikel sowie deren Formulierung einschließlich anderer Humanproteine z.B. Humanserumalbumin, sind beispielsweise in Remington's Pharmaceutical Sciences von E. W. Martin, das hier durch Inbezugnahme mit aufgenommen sei, beschrieben. Derartige Zusammensetzungen enthalten eine wirksame Menge dieses Proteins zusammen mit einer geeigneten Menge eines Vehikels zur Herstellung pharmazeutisch akzeptabler Zusammensetzungen, die zur effektiven Verabreichung an den Empfänger geeignet sind. Derartige Zusammensetzungen sollten für entsprechende Zeiträume stabil, zur Verabreichung an Menschen akzeptabel und ohne Schwierigkeiten herstellbar sein. Ein Beispiel für eine derartige Zusammensetzung könnte eine zur parenteralen Verabreichung bestimmte Lösung sein. Obwohl pharmazeutische Lösungszubereitungen in zum sofortigen Gebrauch geeigneter flüssiger Form bereitgestellt werden, können derartige parenterale Zubereitungen auch in gefrorener oder in lyophilisierter Form bereitgestellt werden. In ersterem Fall muß die Zusammensetzung vor Gebrauch aufgetaut werden. Die letztere Form wird häufig zur Erhöhung der Stabilität des in der Zusammensetzung enthaltenen medizinischen Mittels in einem weiten Bereich von Lagerungsbedingungen verwendet. Derartige lyophilisierte Zubereitungen werden vor Gebrauch durch die Zugabe von geeigneten pharmazeutisch akzeptablen Verdünnungsmitteln, wie sterilem Wasser oder steriler physiologischer Kochsalzlösung, hergestellt. Das erfindungsgemäße Gewebefaktorprotein wird zur Bereitstellung einer die Gerinnung induzierenden therapeutischen Zusammensetzung für verschiedene chronische Blutungsstörungen, die durch eine Tendenz zu Hämorrhagie, sowohl ererbter als auch erworbener, gekennzeichnet sind, verabreicht. Beispiele für derartige chronische Blutungsstörungen sind ein Mangel an Faktor VIII, IX oder XI. Beispiele für erworbene Störungen umfassen: erworbene Hemmung gegenüber Blutgerinnungsfaktoren, z.B. Faktor VIII, von-Willebrand-Faktor, Faktor IX, V, XI, XII und XIII; Hämostasestörungen als Folge einer Lebererkrankung, die eine Abnahme der Synthese von Gerinnungsfaktoren und DIC umfassen; mit einer akuten und chronischen Nierenerkrankung einhergehende Blutungsneigung, die Mangel an Koagulationsfaktor und DIC umfaßt; Hämostase nach Trauma oder chirurgischem Eingriff; Patienten mit disseminierender Malignität, die sich in DIC mit einem Anwachsen von Faktor VIII, von-Willebrand-Faktor und Fibrinogen äußert; und Hämostase während Herz-Lungen-Eingriffen und bei massiver Bluttransfusion.

Claims

Biologisch aktive Variante oder biologisch aktives Fragment des Gewebefaktorproteins, dessen Sequenz in 2 angegeben ist, worin mindestens eine Aminosäure selektiv insertiert, deletiert oder ersetzt wurde, wobei diese Variante oder dieses Fragment die Blutgerinnung induziert, zur Verwendung als Medikament.
Biologisch aktives Gewebefaktorprotein, dessen Sequenz in 2 angegeben ist, oder eine biologisch aktive Variante oder ein biologisch aktives Fragment des Gewebefaktorproteins, worin mindestens eine Aminosäure selektiv insertiert, deletiert oder ersetzt wurde, wobei diese Variante oder dieses Fragment die Blutgerinnung induziert, wobei das Gewebefaktorprotein oder die Variante oder das Fragment desselben entweder keine Glykosylierung aufweist oder eine Nicht-Säugetierglykosylierung aufweist, zur Verwendung als Medikament.
Biologisch aktive Gewebefaktorproteinvariante gemäß Anspruch 1, worin im Vergleich zu nativem Gewebefaktorprotein eine ausgewählte Aminosäure derart ersetzt ist, dass (a) ein hydrophiler Rest durch einen hydrophoben Rest oder (b) ein Cystein- oder Prolinrest durch einen anderen Aminosäurerest oder (c) ein Rest mit einer elektropositiven Seitenkette durch einen elektronegativen Rest oder (d) ein Rest mit einer sperrigen Seitenkette durch einen Rest mit einer kleinen Seitenkette oder Glycin ersetzt ist, zur Verwendung als Medikament.
Biologisch aktive Gewebefaktorproteinvariante gemäß Anspruch 1, worin die Transmembrandomäne von nativem Gewebefaktorprotein nicht vorhanden ist, zur Verwendung als Medikament.
Biologisch aktive Gewebefaktorproteinvariante gemäß Anspruch 1, worin eine ausgewählte Stelle, die in nativem Gewebefaktorprotein eine potentielle Proteolysestelle ist, proteolysebeständig ist, zur Verwendung als Medikament.
Biologisch aktive Gewebefaktorproteinvariante gemäß Anspruch 5, worin eine ein Arginin umfassende potentielle Proteolysestelle in nativem Gewebefaktorprotein durch eine andere Aminosäure ersetzt ist oder nicht vorhanden ist, zur Verwendung als Medikament.
Biologisch aktive Gewebefaktorproteinvariante gemäß Anspruch 6, worin das Arginin durch Glutamin oder Histidin ersetzt ist, zur Verwendung als Medikament.
Biologisch aktive Gewebefaktorproteinvariante gemäß Anspruch 1, worin ein Cysteinrest von nativem humanem Gewebefaktorprotein durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt ist, zur Verwendung als Medikament.
Biologisch aktive Gewebefaktorproteinvariante gemäß Anspruch 8, worin der Cysteinrest das Cystein 245 ist und der andere Aminosäurerest Serin ist, zur Verwendung als Medikament.
Biologisch aktive Gewebefaktorproteinvariante gemäß Anspruch 1, worin eine N-verbundene oder eine O-verbundene Glykosylierungsstelle von nativem Gewebefaktorprotein nicht vorhanden ist, zur Verwendung als Medikament.
Fusionspolypeptid, das ein biologisch aktives Gewebefaktorprotein, dessen Sequenz in 2 angegeben ist, oder eine biologisch aktive Variante oder ein biologisch aktives Fragment des Gewebefaktorproteins, worin mindestens eine Aminosäure selektiv insertiert, deletiert oder ersetzt wurde, wobei diese Variante oder dieses Fragment die Blutgerinnung induziert, und ein weiteres, daran fusioniertes Polypeptid umfasst, zur Verwendung als Medikament.
Verwendung eines Gewebefaktorproteins oder einer Variante oder eines Fragments desselben gemäß der Definition in den Ansprüchen 1 bis 10 oder eines Fusionspolypeptids gemäß der Definition in Anspruch 11 bei der Herstellung eines Medikaments zur Induktion der Blutgerinnung bei einem Patienten.
Verwendung gemäß Anspruch 12, wobei das Medikament zur Behandlung einer chronischen Blutungsstörung dient.
Verwendung gemäß Anspruch 12, wobei das Medikament zur Behandlung eines akuten Blutungsproblems dient.
Ex-vivo-Verfahren zur Induktion der Gerinnung von Blut, das die Stufe der Zugabe eines Gewebefaktorproteins oder einer Variante oder eines Fragments desselben gemäß der Definition in den Ansprüchen 1 bis 10 oder eines Fusionspolypeptids gemäß der Definition in Anspruch 11 zu dem Blut umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Gewebefaktorprotein oder eine Variante oder ein Fragment desselben gemäß der Definition in den Ansprüchen 1 bis 10 oder ein Fusionspolypeptid gemäß der Definition in Anspruch 11 und ein pharmazeutisch akzeptables Trägervehikel umfasst.