DE3853656T2

DE3853656T2 - Verfahren zur Umesterung von Ölen und Fetten in Anwesenheit einer Fettsäure, eines Fettsäureesters oder eines anderen Öls oder Fettes mittels einer alkalischen hoch-molekularen Lipase.

Info

Publication number: DE3853656T2
Application number: DE3853656T
Authority: DE
Inventors: Shinjiro Iwasaki; Yoshitaka Kokusho; Akio Oshima; Akira Tsunoda
Original assignee: Meito Sangyo KK
Current assignee: Meito Sangyo KK
Priority date: 1987-08-31
Filing date: 1988-08-25
Publication date: 1996-01-18
Anticipated expiration: 2008-08-26
Also published as: DE3853656D1; JPH01137988A; JP2719667B2; EP0305901A3; EP0305901B1; EP0305901A2

Description

Titel der Erfindung

Verfahren zur Umesterung von Öl oder Fett in Gegenwart einer Fettsäure, einem Fettsäureester oder eines anderen Öls oder Fetts unter Verwendung einer alkalischen hochmolekulargewichtigten Lipase.

Hintergrund der Erfindung

Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von umgeestertem Glyceridöl oder -fett von hohem zusätzlichen Nutzen bei niedrigen Kosten durch die kontinuierliche oumesterung von Glyceridöl oder -fett in Gegenwart einer Fettsäure, einem Fettsäureester oder einem anderen Glyceridöl oder -fett.
Insbesondere betrifft die Erfindung ein effizientes Verfahren zur Umesterung von Glyceridöl oder -fett, wobei die Reaktion kontinuierlich, ohne daß eine Dehydratation erforderlich ist, in einer Reaktorsäule durchgeführt wird, welche aus einem alkalischen hochmolekulargewichtigten Lipasepräparat aufgebaut ist, welches die Umesterung von Glyceridöl oder -fett in Gegenwart einer Fettsäure, einem Fettsäureester oder einem anderen Glyceridöl oder -fett bei einem so geringen Feuchtigkeitsgehalt, bei dem bis jetzt keine Reaktion dieser Art möglich schien, kontinuierlich und stark katalysieren kann.

Beschreibung des Stands der Technik

Die Umesterung von Glyceridölen und -fetten ist ein wirksames Mittel, um die chemische Zusammensetzung und die physikalischen Eigenschaften dieser Öle und Fette zur Qualitätsverbesserung zu modifizieren.
Für die Umesterung sind sowohl chemische als auch enzymatische Verfahren bekannt. Das chemische Umesterungsverfahren wird bei hohen Temperaturen in Gegenwart eines anorganischen Katalysators, wie Natriummetall oder Natriummethylat, ausgeführt und zur Herstellung von Margarine, Backfett oder anderen verarbeiteten Ölen und Fetten angewendet.
Im Vergleich zum enzymatischen Verfahren erfordert das chemische Umesterungsverfahren jedoch nicht nur striktere Reaktionsbedingungen sondern es wirkt auch auf die Positionen des Triglyceridmoleküls unspezifisch ein und ist deshalb nur zur Randomisierung anwendbar. Demgemäß ist die Qualität und der zusätzliche Nutzen der auf diese Weise hergestellten urngeesterten Öle und Fette sehr gering. Im Gegensatz dazu läuft die Reaktion beim enzymatischen Umesterungsverfahren bei milden Bedingungen ab und die Verwendung einer positionsspezifischen Lipase kann die Umesterung auf eine oder mehrere ausgewählte Glyceridpositionen begrenzen, so daß man bei der Umesterung von Ölen und Fetten ein größeren zusätzlichen Nutzen erwarten kann.
Folglich wurden auf diesem Gebiet viele Studien durchgeführt.
Die Japanische Patentoffenlegung 52-104506 (Unilever) und andere schlagen eine Anzahl von Batchverfahren vor, wobei bei jedem eine saure oder neutrale niedermolekulargewichtige Lipase verwendet wird, die von Rhizopus, Aspergillus oder Mucor stammt. Jedoch wird bei vielen dieser vorgeschlagenen Batchverfahren eine Methode angewendet, bei der die Lipase nur aktiviert werden kann, wenn eine wäßrige Lösung dieses Enzyms z.B, durch einen porösen Träger, wie aktivierten Kohlenstoff oder Celit, konzentriert getragen wird. Wasser ist neben dem wäßrigen Lösungsmittel aus der spezifischen Substratlösung praktisch im Reaktionssystem dieser vorgeschlagenen Verfahren eingeschlossen, wahrend Wasser, welches aus dem Enzymträger sickert, praktisch eine überschüssige zusätzliche Wasserzufuhr zum Reaktionssystem beiträgt. Außerdem wird die vorstehend erwähnte zusätzliche Wasserzufuhr mit einer großen Menge des bei jeder Reaktionsfüllung verwendeten Trägers zugesetzt und diese zusätzliche Wassermenge steigert die gewünschte Reaktion. Das durch die vorliegende Erfindung vorgeschlagene Verfahren unterscheidet sich in diesem Punkt von diesen Offenbarungen wesentlich.
Kontinuierliche Verfahren der enzymatischen Umesterung werden in der Europäischen Patentveröffentlichung 0140542, in der Japanischen Patentoffenlegung 61-202688 (Novo), in der Europäischen Patentveröffentlichung 0170431 und in der Europäischen Patentveröffentlichung 0069599 (Unilever) offenbart. Bei den durch diese Patente offenbarten Verfahren wird eine saure oder neutrale niedermolekulargewichtige Lipase verwendet, welche von Mucor, Aspergillus oder Rhizopus stammt. Das vorstehende Enzym wird als Enzympräparat verwendet, das in Form einer wäßrigen Enzymlösung durch einen Träger, wie Celit, getragen wird. Oder das Enzym wird alternativ durch Adsorption an ein Adsorptionsharz oder ein Ionenaustauscherharz immobilisiert und das resultierende immobilisierte Enzympräparat wird auf einen spezifizierten Feuchtigkeitsgehalt eingestellt. Im Unterschied zu dem durch die vorliegende Erfindung spezifizierten sehr engen Feuchtigkeitsgehaltbereich der Substratlösung sind die vorstehenden Verfahren durch die kontinuierliche Reaktion gekennzeichnet, welche in Gegenwart eines Überschusses des wäßrigen Lösungsmittels erfolgt. Von den vorstehenden Offenlegungen beschreibt nur die Japanische Patentoffenlegung 61-202688 den Feuchtigkeitsgehalt des Substrats ausdrücklich, obwohl nur Daten für den Feuchtigkeitsgehalt des Substrats am Ausläß der Reaktorsäule angegeben werden. Dieses Patent legt eine Feuchtigkeit von 3600 bis 5000 ppm bzw. eine Feuchtigkeit von 2800 bis 3100 ppm für das aus der Reaktorsäule ausströmende Substrat für das erste Stadium der Reaktion bzw. nach einer Umsetzung von 400 Stunden fest. So unterscheidet sich die vorliegende Erfindung eindeutig von der vorstehenden Offenbarung im folgenden Punkt. Während die alkalische hochmolekulargewichtige Lipase die Umesterung in einem kontinuierlichen Verfahren während eines langen Zeitraums in einem geringen Feuchtigkeitsbereich, wie er durch die diese Erfindung spezifiziert wird, stark katalysiert, kann die in der obigen Offenbarung beschriebene niedermolekulargewichtige Lipase praktisch keine Umesterung in einem solch geringen Feuchtigkeitsbereich bewirken. Obwohl die niedermolekulargewichtige Lipase in dem für die kontinuierliche Umsetzung in der obigen Offenbarung spezifizierten Feuchtigkeitsbereich eine vollständige Umesterung bewirken kann, ist die Feuchtigkeit für die alkalische hochmolekulargewichtige Lipase zu hoch, um das kontinuierliche Umesterungsverfahren effizient und ausreichend zu katalysieren.
Die EP-A-35 883 betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Umesterung eines Lipids und umfäßt ein kontinuierliches Verfahren zur Umesterung von Öl oder Fett durch die Behandlung des Öls oder Fetts in Gegenwart einer Fettsäure oder eines Fettsäureesters oder eines anderen Öls oder Fetts in einer Reaktorsäule, welche mit einem 0 bis 5% Feuchtigkeit enthaltenden Enzympräparat gepackt ist. Die Verwendung eines Enzympräparats, das aus einer alkalischen hochmolekulargewichtigen Lipase aufgebaut ist, welche ein Molekulargewicht von 100 000 oder mehr und einen optimalen pH von 8,0 oder mehr besitzt und 1,3-Positionsspezifität aufweist, wird darin nicht offenbart.

Ziele und Zusammenfassung der Erfindung

Die hier genannten Autoren entdeckten bereits ein efflzientes Verfahren zur Umesterung von Öl oder Fett in Gegenwart einer Fettsäure, einem Fettsäureester oder einem anderen Öl oder Fett, wobei eine alkalische hochmolekulargewichtige Lipase, die durch Alcaligenes-, Achromobacter- oder Pseudomonasbakterien produziert wird, verwendet wird, um eine Reaktion zu katalysieren, die in Gegenwart eines Feuchtigkeit enthaltenden organischen Lösungsmittels beginnt, wobei nach der Anhäufiing von Diglyceriden bis zu einer vorgegebenen Menge eine graduelle Dehydratation bewirkt wird (Japanische Patentanmeldung 62-45302). Das obige Verfahren wurde mit Bezug auf ein Batchverfahren der Umesterung beschrieben, aber dabei wurde kein kontinuierliches Umesterungsverfahren angegeben.
Damit die Reaktion des Batchverfahrens der Umesterung, welches durch das vorstehende Patent offenbart wird, voranschreitet, ist es notwendig, das zu Beginn zugesetzte Wasser ab dem mittleren Stadium bis zum Endstadium der Reaktion langsam aus dem Reaktionssystem zu entfernen. Dies erfordert zum Beispiel das Durchsprudeln des Reaktionssystems mit wasserfreiem Stickstoffgas. Für die Verwirmichung einer solchen Behandlung im industriellen Maßstab müssen jedoch viele maschinelle Probleme gelöst werden. Ferner verursacht eine solche Dehydratation zusätzliche Kosten. Unter anderem ist es unvermeidbar, eine Apparatur von komplizierterem Bau und in einem größeren Maßstab zu verwenden. Folglich wird erwartet, daß, sogar wenn man nur den Reaktortank berücksichtigt, die Apparatur im Vergleich zum kontinuierlichen Verfahren einen etwa hundertmal größeren oder noch größeren Umfang erfordern würde. Folglich ist das vorstehende Batchverfahren ziemlich unökonomisch und nicht immer für die Massenproduktion geeignet. Ein anderer Schwachpunkt des Batchverfahrens der Umesterung ist eine langsamere Reaktionsgeschwindigkeit. Der Hauptgrund für diesen Schwachpunkt ist ein beim Batchverfahren erforderlicher verhältnismäßig hoher Feuchtigkeitsgehalt, der eine Dehydratation erforderlich macht. Folglich ist zur Umesterung eine lange Reaktionsdauer unvermeidbar wobei die Geschwindigkeit der mechanischen Dehydratation die Geschwindigkeit der Umesterung bestimmt. Außerdem ist zur Beschleunigung der Reaktionsgeschwindigkeit im Batchverfahren nicht nur die Verwendung einer ausreichenden Menge des Enzyms erforderlich sondern auch das engere Inkontaktbringen des Substrats mit dem Enzym durch Rühren. Mit dem mechanischen Rührverfahren, welches in seiner Wirksamkeit begrenzt ist, kann die Geschwindigkeit der Reaktion jedoch nicht ausreichend genug erhöht werden. Außerdem zerbrechen die zum Rühren angewendeten Kräfte allmählich den Träger des immobilisierten Enzyms was das Problem der Kurzlebigkeit des Trägers selbst aufwirft.
Demgemäß führten die Autoren umfassende Studien zur Entwicklung eines kontinuierlichen Umesterungsverfahrens durch, welches für die Massenproduktion von umgeesterten Ölen und Fetten geeignet ist. Überraschenderweise wurde festgestellt, daß die gleichen alkalischen hochmolekulargewichügen Lipasen, welche im vorstehenden Batchverfahren der Umesterung verwendet wurden, Enzyme sind, die für die Verwendung im kontinuierlichen Umesterungsverfahren sehr geeignet sind. Es wurde die Entdeckung gemacht, däß wenn ein Substratstoff kontinuierlich zusammen mit einer konstanten Zufuhr von Spurenwasser welches für die Reaktion über einen Reaktor erforderlich ist, über einen Reaktor geleitet wird der mit einem alkalischen hochmolekulargewichtigen Lipasepräparat gepackt ist, die Umesterung während eines längeren Zeitraums mit einer höheren Geschwindigkeit voranschreitet, ohne das eine Dehydratation erforderlich ist. Im Vergleich zum vorstehend erwähnten Batchverfahren der Umesterung weist das obige kontinuierliche Umesterungsverfahren viele Vorteile auf, zum Beispiel eine viel schnellere Reaktionsgeschwindigkeit und daß für die Reaktion nur eine Spur Wasser erforderlich ist, ohne däß sowohl eine Dehydratation oder Rühren notwendig ist, Behandlungen, die den Träger des immobilisierten Enzyms zerbrechen würden.
Auf Grundlage der vorstehenden neuen Erkenntnis verwendeten die Autoren die vorstehend erwähnte alkalische hochmolekulargewichüge Lipase, die als Umesterungsenzym dadurch gekennzeichnet ist, däß sie solche überlegene Eigenschaften besitzt, welche vorher noch nie bei der immobilisierten Form beobachtet wurden, zur Entwicklung eines sehr effizienten kontinuierlichen Umesterungsverfahrens in Gegenwart einer so geringen Feuchtigkeitsmenge, welche sogar geringer ist als der vorstehend vorgeschlagene niedrige Feuchtigkeitsbereich. Dies führte zur Vervollständigung der Erfindung.
Die Erfindung stellt ein kontinuierliches Verfahren zur Umesterung von Öl oder Fett durch Behandlung des Öls oder Fetts in Gegenwart einer Fettsäure mit 6 bis 22 Kohlenstoffatomen oder eines von einer Fettsäure mit 6 bis 22 Kohlenstoffatomen abgeleiteten Fettsäureesters oder eines anderen Öls oder Fetts in einer Reaktorsäule bereit, welche mit einem 0 bis 5% Feuchtigkeit enthaltenden Enzympräparat gepackt ist, das dadurch gekennzeichnet ist, daß das Enzympräparat aus einer alkalischen hochmolekulargewichtigen Lipase aufgebaut ist, welche ein Molekulargewicht von 100 000 oder mehr und einen optimalen pH von 8,0 oder mehr besitzt und 1,3-Positionsspezifität aufweist, und mit einer Substratlösung, welche sich aus Öl oder Fett und der Fettsäure oder dem Fettsäureester oder einem anderen Öl oder Fett zusammensetzt, zum Zwecke einer kontinuierlichen Reaktion in der Weise beschickt wird, daß der Feuchtigkeitsgehalt der Substratlösung so eingestellt wird, daß sie 100 bis 1800 ppm Feuchtigkeit bzw. 50 bis 800 ppm Feuchtigkeit am Einläß bzw. Auslaß der Säule enthält.
Obwohl in der vorstehenden Beschreibung das hochmolekulargewichtige Lipasepräparat theoretisch einen Feuchtigkeitsgehalt von so wenig wie 0% enthalten kann, beträgt die unter Grenze des Feuchtigkeitsgehalts eigentlich etwa 0,1% oder mehr, da eine Spur Wasser, die im Enzympräparat enthalten ist, unvermeidbar ist.
Die vorstehende alkalische hochmolekulargewichtige Lipase ist ein Enzym mikrobieller Herkunft, welches durch 1,3-Positionsspezifität, ein Molekulargewicht von 100 000 oder mehr und einen optimalen pH von 8,0 oder mehr gekennzeichnet ist. Die alkalische hochmolekulargewichtige Lipase wird entweder in ungebundener Form oder in immobilisierter Form, gebunden an ein Ionenaustauscherharz, an Proteine, Zucker oder an Mineralton, verwendet. Ein bevorzugtes Beispiel des Ionenaustauscherharzes ist das schwach saure Methacrylat-Ionenaustauscherharz. Als Mittel zur Einstellung des Feuchtigkeitsgehalts des alkalischen hochmolekulargewichtigen Lipasepräparats zwischen 0 und 5% wird Gefriertrocknung bevorzugt. Die Umesterung läuft normalerweise bei Temperaturen ab, die nicht höher sind als 80ºC.
Die Isolierung und Reinigung des Reaktionsprodukts wird vorzugsweise wie folgt ausgeführt.
Das durch das kontinuierliche Umesterungsverfahren umgeesterte Öl oder Fett wird entfernt und durch eine Kombination von Methoden, wie Präzipitation durch Kühlung, Destillation, Neutralisation, Filtration über eine Membran, Lösungsmittelfraktionierung, etc, aus der Reaktionslösung gewonnen. Als allgemeines Verfahren wird die aus der Reaktorsäule ausströmende Reaktionslösung so wie sie ist oder nach einer Neutralisation abgekühlt, um Komponenten mit höheren Schmelzpunkten während einer einfachen Fraktionierung auszuffällen. Das Lösungsmittel kann, falls erforderlich, vorher aus der Reaktionslösung entfernt werden, zum Beispiel durch Destillation oder Filtration über eine Membran, um die vorstehenden Behandlungen mit dem lösungsmittelfreien Öl- oder Fettrückstand so wie er ist durchzuführen oder nachdem er erneut in einem neuen Lösungsmittel gelöst wurde. Die das umgeesterte Öl oder Fett enthaltende Reaktionslösung wird abgekühlt, um Komponenten mit höheren Schmelzpunkten daraus auszufällen und zu entfernen. Oder das für die Reaktion verwendete Lösungsmittel wird aus der Reaktionslösung unter verringertem Druck oder durch Filtration über eine Membran entfernt, wobei das lösungsmittelfreie umgeesterte Öl oder Fett gewonnen wird, welches zur Isolation des gereinigten umgeesterten Öls oder Fetts erneut in einem organischen Lösungsmittel gelöst und abgekühlt werden kann. Wenn die Reaktionslösung, welche das umgeesterte Öl oder Fett enthält, Fettsäureverunreinigungen aufweist, wird der Lösung ein Alkalimittel zugegeben, um die Fettsäuren zum Entfernen in Seife umzuwandeln. Oder die vorstehende lösungsmittelfreie Öl- oder Fettfraktion kann destilliert werden, um ein fettsäurefreies Öl oder Fett zu erhalten. Außerdem kann das fettsäurefreie Öl oder Fett zum Ausfällen und Fraktionieren in einem organischen Lösungsmittel gelöst und abgekühlt werden, wobei das gereinigte Produkt erhalten wird. Die umgeesterte Öl- oder Fettfraktion, welche entweder aus der Lösung ausfällt oder in Lösung bleibt, wird, falls erforderlich destilliert oder einer Lösungsmittelfraktionierung unterzogen, um die Verunreinigungen zu entfernen, wobei das gewünschte Öl oder Fett in gereinigter Form erhalten wird.
Im Vergleich zum in der Japanischen Patentanmeldung 62-45302 offenbarten Batchverfahren erfordert das erfindungsgemäße kontinuierliche Verfahren zur kontinuierlichen Herstellung von umgeesterten Ölen und Fetten auch weniger Wasser für das Reaktionssystem, das keinen zusätzlichen Kontrollmechanismus zur Dehydratation benötigt, um den Feuchtigkeitsgehalt während der Reaktion einzustellen. Dies bedeutet eine einfachere Ausführung der Apparatur. Daneben weist das vorstehende kontinuierliche Verfahren den Vorteil auf daß die Reaktion schneller und nahezu ohne Hydrolyse abläuft, welche Nebenprodukte wie Diglyceride erzeugt. Da der Aktivitätsverlust eines Enzyms im allgemeinen proportional ist zum verwendeten Feuchtigkeitsgehalt kann das Verfahren, bei dem die Reaktion vom Anfang bis zum Ende in Gegenwart von nur einer Spur Wasser voranschreitet, das Enzym zum längeren Gebrauch stabil halten.
Das erfindungsgemäße kontinuierliche Verfahren ist aufgrund der schnelleren Reaktion und der geringen Apparaturanforderung vom ökonomischen Gesichtspunkt sehr vorteilhaft.
Andere Ziele, Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden ausführlichen Beschreibung in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen deutlich.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Figur 1 stellt den in Beispiel 1 beobachteten zeitlichen Verlauf der prozentualen Umesterung dar.
Figur 2 ist ein Flußdiagramm eines bevorzugten Beispiels des erfindungsgemäßen kontinuierlichen Umesterungsverfahrens.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Beim erfindungsgemäßen Umesterungsverfahren kann natürliches oder verarbeitetes Öl oder Fett pflanzlicher oder tierischer Herkunft oder ein Bruchstück einer Komponente eines solchen Öls oder Fetts, welches durch Fraktionierung abgetrennt wurde, oder ein Öl- oder Fettgemisch ähnlicher Art als Glyceridrohstoff verwendet werden.
Beispiele verwendbarer Öle und Fette sind Sojabohnenöl, Baumwollsamenöl, Rapsöl, Olivenöl, Maisöl, Kokosnußöl, Färberdistelöl, Sonnenblumenöl, Kamelienöl, Sasanquaöl (Öl der stumpfblättrigen Kamelie), Palmsamenöl, Palmöl, mittlere Fraktion des Palmöls, Salöl, Illip-Fett, Garcinia Indica-Fett, Schifett, Mowrah-Öl, Phulwara-Butter, Borneo- Talg, Rindertalg, Schmalz, Milchfett, Fischöl sowie fraktionierte Produkte und aus den obigen hergestellte verarbeitete Öle und Fette. Weitere Beispiele sind Dilaurin, Dipalmitin, Diolein, Distearin, Trilaurin, Tripalmitin, Triolein, Tristearin, etc. Je höher der Anteil der Glyceride ist, die den gleichen Fettsäurerest an der 2-Position aufweisen, desto stärker bevorzugt ist das als Rohstoff verwendete Öl oder Fett für eine Reaktion zur Herstellung von symmetrisch umgeestertem Öl oder Fett.
Für die erfindungsgemäße Umesterung können gesättigte oder ungesättigte Fettsäuren mit 6 bis 22 Kohlenstoffatomen verwendet werden. Beispiele dieser Fettsäuren sind Capronsäure, Caprylsäure, Caprinsäure, Laurinsäure, Myristinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, Oleinsäure, Linolinsäure, Rizinolsäure, Arachidonsäure und Eicosapentaensäure. Anstelle der vorstehenden Fettsäuren können die entsprechenden Ester mit Alkoholen mit bis zu 20 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise bis zu 4 Kohlenstoffatomen, verwendet werden. Bevorzugte Beispiele solcher Alkohole sind Methanol, Ethanol, 1-Propanol und 1-Butanol.
Diese Rohstoffe können, falls erforderlich, vor der Verwendung gereinlgt werden. Alternativ kann stromaufwärts der Reaktorsäule eine Reinigungssäule angeordnet sein, welche mit einem Öl- und Fettreinigungsmittel gepackt ist, zum Beispiel einem geeigneten Ionenaustauscherharz, Aktivkohle, aktivierter Ton, saurer Ton oder Tonerde, so daß das Öl oder Fett vor dem Eintritt in die Reaktorsaule durch den Lauf uber die Vorsaule gereinigt wird. Durch eine solche Reinigung kann die Lebensdauer des Enzyms verlangert und die Reaktionsausbeute verbessert werden.
Die vorstehenden Öle oder Fette und Fettsäuren oder Ester können in jeder beliebigen Kombination verwendet werden. Die Auswahl und Kombination dieser Stoffe ist nicht begrenzt.
Nur die alkalische hochmolekulargewichtige Lipase wird effektiv als Enzym zum Katalysieren der erfindungsgemäßen Reaktion verwendet, während die herkömmliche niedermolekulargewichtige saure oder neutrale Lipase kaum wirksam ist. Mit einer solchen herkömmlichen Lipase schreitet das erfindungsgemäße kontinuierliche Umesterungsverfahrens welches in Gegenwart einer Spur Wasser erfolgt, praktisch nicht voran. Für den erfindungsgemäßen Gebrauch kann jede alkalische hochmolekulargewichtige Lipase mikrobieller Herkunft, wie vorstehend spezifiziert, welche eine 1,3-Positionsspezifität besitzt, beliebig gewählt werden. Beispiele solcher Lipasen sind Alcaligenes-, Achromobacter- und Pseudomonas-Lipasen.
Aktuelle Beispiele des verwendbaren Enzyms sind die Lipase PL-266 (Japanische Patentveröffentlichung 58-36953), hergestellt durch Alcaligenes sp. PL-266 (Fermentation Research Institute Stocknr. 3187), Lipase PL-679 (Japanische Patentveröffentlichung 60-15312), hergestellt durch Alcaligenes sp. PL-679 (Fermentation Research Institute Stocknr. 3783. Die gleiche Art ist bei der American Type Culture Collection, USA, unter der Hinterlegungsnummer ATCC 31371 hinterlegt und auch bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen, Deutschland, unter der Hinterlegungsnummer DSM 1239), Lipase AL (Japanische Patentveröffentlichung 49-32080), hergestellt durch Achromobacter sp. AL-865 (Fermentation Research Institute Stocknr. 1213) und Lipase PS (Japanische Patentveröffentlichung 56-28516), hergestellt durch Pseudomonas nitroreducens, Var. thermotolerans (Fermentation Research Institute Stocknr. 1338). Dies sind wirksame Lipasen, welche die Umesterung mit einer Positionsspezifität insbesondere in Gegenwart einer Spur Wasser ausreichend katalysieren, bei dieser Bedingung können die nach dem Stand der Technik vorgeschlagenen Lipasen die Umesterung nicht induzieren. Diese wirksamen Lipasen sind alle extrazelluläre Enzyme.
Die Tabelle 1 vergleicht das Molekulargewicht und das pH-Optimum von Lipasen nach dem Stand der Technik und von erfindungsgemäß verwendbaren Lipasen. Die in der Tabelle aufgeführten Lipasen PL-266, PL-679, AL und PS sind alle alkalische hochmolekulargewichtige Lipasen, deren pH-Optimum bzw. Molekulargewicht größer ist als 8,0 bzw. 100 000.
Enzyme mit einer monomolekularen Proteinstruktur besitzen Molekulargewichte von bis zu 100 000, meistens ein Molekulargewicht zwischen 10 000 und 50 000, während größere Enzyme mit Molekulargewichten nicht unter 100 000 entweder eine Untereinheitstruktur mit oder ohne eine Glykoprotein oder Lipoproteinbindung aufweisen. Lipasen bakterieller Herkunft gehoren bisweilen zum letzteren Typ. Diese Lipasen mit Molekulargewichten von 100 000 oder mehr werden hier als hochmolekulargewichtige Lipase bezeichnet, um sie von den niedermolekulargewichtigen Lipasen zu unterscheiden, deren Molekulargewicht kleiner ist als 100 000 und die sich in der katalytischen Leistung bei der Umesterung unterscheiden. Anhand der Tabelle 1 stellt man fest, däß gemäß der obigen Klassifizierung der Lipasen durch das Molekulargewicht hochmolekulargewichtige Lipase durch optimale pH-Werte höher als 8,0 gekennzeichnet sind, während niedermolekulargewichtige Lipasen pH-Werte aufweisen, die kleiner sind als 8,0.
Die vorstehende Klassifizierung der Lipasen durch das Molekulargewicht beruht auf der Molekulargewichtsbestimmung durch Fraktionierung auf einer Säule von Sephadex G200 (Pharmacia) und dem anschließenden Vergleich der erhaltenen Daten mit der Kalibrierungskurve, welche mit Rinderserumalbumin mit einem Molekulargewicht von 68 000, Kaninchenmuskelaldolase mit einem Molekulargewicht von 158 000 und Rinderleberkatalase mit einem Molekulargewicht von 240 000 als Referenzproteine erstellt wurde. Tabelle 1 Lipase (Herkunft) Referenzen Stand der Technik Rhizopus delemar Aspergillus niger Geotrichuin candidum Rhizopus arrhizus Mucorjavanicus Mucor miehei (NOVO sp. 225) Erfindung Lipase PL-266 Lipase PL-679 Lipase AL Lipase PS Yukagaku 13(10) 136 (1982) Jozo Kyokai-shi 73(8) 601(1978) NOVO-Enzym information, 1B-Nummer 299a-GB-a (Sept. 1983) Zusammenfassung der Veröffentlichungen für 1976, Conference of Japan Society of Agricultural Chemistry, 334; (PH) Agric. Biol. Chem. 41 (1977), 1353. * Das Molekulargewicht der von Mucor miehei stammenden Lipase wurde durch Chromatographie auf einer Sephadex G-100-Säule von 20 x 600 mm in 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,5) und bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 30 ml/Stunde bestimmt.
Der Grund, warum die erfindungsgemäß verwendeten alkalischen hochmolekulargewichtigen Lipasen im Vergleich zu den herkömmlichen vorgeschlagenen Lipasen bessere katalytische Aktivitäten bei der Umesterung insbesondere in Gegenwart einer Spur Wasser zeigen, könnte dieser sein, daß bei diesen alkalischen hochmolekulargewichtigen Lipasen die Untereinheitsstruktur und das gebundene Proteinmolekül nicht nur die aktive Stelle der Lipase schützen, sondern reichlich intramolekular gebundene Feuchtigkeit tragen, welche bei der Entwicklung der Enzymaktivität im Spurenwasserreaktionssystem eine fördernde Rolle spielen kann.
Das folgende Experlment wurde durchgeführt, um eine Vorstellung von den Unterschieden zwischen der hochmolekulargewichtigen Lipase und der niedermolekulargewichtigen Lipase bei der Veresterung in einem Spurenwasserreaktionssystem zu bekommen.

Experiment 1: Vergleich der Veresterungsaktivität von Lipasen in einem Spurenwasserreaktionssystem

In diesem Experiment wurden die Lipase PL-679 (Lieferant: Meito Sangyo, spezifische Aktivität: 87 000), die Lipase PL-266 (Meito Sangyo Co., Ltd., 11 000 U/g), die Lipase AL (Meito Sangyo Co., Ltd., 15 000 U/g), die Lipase PS (Sappro Breweries Co., Ltd., 16 000 U/g), die Talipase oder Rhizopus delemar-Lipase (Tanabe Seiyaku Co., Ltd., 10 000 U/g), die Lipase AP oder Aspergillus niger-Lipase (Amano Seiyaku Co., Ltd., 37 000 U/g) und die Lipase NOVO sp. 225 oder Mucor miehei-Lipase (NOVO, nominal 210 000 U/g) getestet. Proben von 100 mg des pulverigen Lipasepräparats wurden gefriergetrocknet und jeder Probe wurden 5 ml Lösungsmittel, ausgewählt aus n-Hexan, t-Butanol oder Aceton, zugegeben. Zusammen mit 0,163 g Glycerin und 0,5 g Oleinsäure wurden ferner 0,5 g Molekularsiebe 3A (Lieferant: Wako Pure Chemical Industries) als Dehydratationsmittel zugegeben. Das Gemisch wurde zur Umsetzung unter Dehydratation 48 Stunden bei 37ºC geschüttelt.
Für die Aktivitätsmessungen wurden die Lipasen PL-266 und PL-679 mit einer Methode von Kokusho et al. (Agric. Biol. Chem. 45 (5) (1982), 1159), die Lipase AL mit einer anderen Methode von Kokusho et al. (Yukagaku 23 (2) (1974), 98), die Lipase PS mit einer Methode von Watanabe et al. (Agric. Biol. Chem. 41 (1977), 1353) und die anderen Lipasen mit einer Methode von Fukumoto et al. (J. Gen. Appl. Microbiol. 9 (1963), 353) getestet, mit Ausnahme der Mucor miehei-Lipase von NOVO, für diese wurden die von der Firma zur Verfügung stehenden nominalen Lipaseaktivitätsdaten unverändert verwendet.
Die Menge der freien Fettsäure wurde alkalimetrisch bestimmt, um die Menge der Fettsäure abzuschätzen, welche für die Umesterung verbraucht wurde. Diese wurde mit der zugegebenen Menge der Fettsäure verglichen, um die prozentuale Abnahme der Fettsäure zu berechnen. Um den Feuchtigkeitsgehalt der Reaktionslösung zu messen, wurde für die coulombmetrische Titration (Karl Fischer-Methode) ein Feuchtigkeitsmeßgerat von Mitsubishl Chemical Industries, Modell CA-05, verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt. Tabelle 2 Prozentuale Abnahme der Fettsäure durch die Umsetzung in n-Hexan (50 ppm H&sub2;O) t-Butanol (100 ppm H&sub2;O) Aceton (200 ppm H&sub2;O) Lipase Lipase PL-679 Lipase PL-266 Lipase AL Lipase PS Talipase Lipase AP Mucor miehei-Lipase (NOVO sp. 225)
Die Tabelle 2 zeigt, daß die alkalischen hochmolekulargewichtigen Lipasen eindeutig genügend hohe Aktivitäten in einer Spurenwasserumgebung aufweisen, während die niedermolekulargewichtigen Lipasen bei dieser Bedingung keine oder praktisch keine Aktivitäten besitzen.
Demgemäß könnte in der Erfindung jede andere alkalische hochmolekulargewichtige Lipase mikrobieller Herkunft als die hier aufgeführten ohne Einschränkung verwendet werden und Arten davon, solange das betreffende Enzyme, das die vorstehende Definition erfüllt, ein Molekulargewicht von 100 000 oder mehr aufweist und, wie vorstehend erwähnt, hohe Aktivitäten bei der Umesterung zeigt.
Bei der Erfindung kann eine alkalische hochmolekulargewichtige Lipase entweder in Form des gereinigten Präparats oder in immobilisierter roher Form verwendet werden und sie wird, falls erforderlich, vor der Anwendung getrocknet. Das Ionenaustauscherharz, das als Träger des immobilisierten Enzyms verwendet werden kann, ist ein schwach basisches Ionenaustauscherharz auf Polmethacrylatbasis. Beispiele sind DEAE-Toyopearl (Lieferant: Toso Co., Ltd.), Sepabeads (Mitsubishi Chemical), etc. Unter diesen wird insbesondere DEAE-Toyopearl 650, dessen Korngröße zwischen 50 und 150 um liegt, bevorzugt verwendet.
Zur Immobilisierung wird das vorstehend erwähnte Harz einer Kulturbrühe oder einer wäßrigen Lösung entweder des rohen Enzyms oder des teilweise durch Lösungsmittelfraktionierung gereinigten Enzyms zugegeben, mit Ammoniumsulfat und/oder ähnlichem ausgesalzt oder weiter durch Reinigungsmittel gereinigt, zum Beispiel durch eine Behandlung auf einem Ionenaustauscherharz, durch Gelfiltration und/oder Ultrafiltration. Nach Rühren wahrend eines Zeitraums, der für die Adsorption des Enzyms lang genug ist, wird die Lösung zentrifugiert und filtriert, wobei der Träger mit dem darauf immobilisierten Enzym gewonnen wird.
Wenn ein Ionenadsorptionsmittel als Träger für das immobilisierte Enzym verwendet wird, wird die Enzymlösung, falls erforderlich, bevor die Behandlung zur Adsorption für die Immobilisierung gestartet wird, zum Beispiel durch Ultrafiltration entsalzt und auf den richtigen pH-Wert eingestellt, der abhängig ist vom isoelektrischen Punkt des verwendeten Enzyms. Bei den obigen Beispielen der alkalischen hochmolekulargewichtigen Lipase kann zum Beispiel 1 g Harz 100 000 bis 300 000 U/g (hydrolytische Aktivitätseinheiten) des Enzyms nach 10 bis 60 Minuten Rühren bei pH 6 bis 11 adsorbieren, wobei mindestens 80 bis 90% der Lipaseaktivität aus der Lipaselösung entfernt werden können.
Neben der vorstehend erwähnten Immobilisierung kann das Enzymmaterial so wie es ist verwendet werden oder das Enzym kann mit einem geeigneten Verdünnungsmittel und Bindemittel fixiert werden. Beispiele des vorstehenden Verdünnungsmittels und des Bindemittels sind Proteine, wie Milchalbumin, Sojabohnenproteine und Weizenproteine, Saccharide, wie Lactose Saccharose, Stärke, Chitosan und Celluloseacetat, Tonmineralien, wie Bentonit und Celit, etc. Zur Fixierung des vorstehenden Verdünnungsmittels und des Bindemittels wird ein Gemisch aus einem pulverlgen Enzym und den Verdünnungsund Bindemittelstoffen zur Formgebung mit einem kleinen Volumenteil Wasser oder einem organischen Lösungsmittel gemischt.
Das isolierte immobilisierte Enzym oder das vorstehend erwähnte fixierte Enzym wird vor dem Gebrauch bis zu einem Feuchtigkeitsgehalt von vorzugsweise 5% oder weniger, stärker bevorzugt 2% oder weniger und besonders bevorzugt etwa 1% oder weniger, getrocknet. Anwendbare Trockhungsverfahren sind das Lufttrocknen unter Erwärmen, das Eintauchen in ein wasserfreies organisches Lösungsmittel zur Dehydratation, gefolgt von Lösungsmittelevaporation, Geftiertrocknung oder eine Kombination davon. Von diesen Methoden wird die Gefriertrocknung bevorzugt.
Obwohl der erfindungsgemäß bevorzugte Feuchtigkeitsgehalt des Enzympräparats auf 5% oder weniger festgelegt ist, bedeutet dies nicht, däß ein Enzympräparat mit einem höheren Feuchtigkeitsgehalt die Umesterungsreaktion nicht katalysiert. Um die Substratlösung in einem kontinuierlichen Verfahren über eine mit Lipase gefüllte Säule zu leiten, ist es eigentlich notwendig, einen Druck von mehreren Kilogramm bis etwas über 10 Kilogramm pro Quadratzentimeter anzuwenden. Auch wenn das Lipasepräparat zunächst einen hohen Feuchtigkeitsgehalt aufweist, wird die überschüssige Feuchtigkeit unter dem vorstehenden Druck bald physikalisch aus dem Enzympräparat gepreßt, bis der Feuchtigkeitsgehalt davon zum Beispiel auf etwa 10% verringert wird. Wenn Öl oder Fett als nur Spurenwasser enthaltendes Substrat, wie hier spezifiziert, über die Säule zu laufen beginnt, verbraucht die enzymatische Hydrolyse des Substrats das im Enzympraparat vorhandene überschüssige Wasser, wobei der Feuchtigkeitsgehalt davon nach einer bestimmten Zeitspanne auf 5% oder weniger verringert wird. Außerdem verringert der Kontakt des Enzympräparats mit dem Substrat oder der Substratlösung, welches bzw. welche nur Spurenwasser enthält, den Feuchtigkeitsgehalt des Enzympräparats bis der Feuchtigkeitsgehalt die Gleichgewichtsmenge von etwa 1 bis 2% erreicht. Es wurde festgestellt, daß, wenn ein in n-Hexan gelöstes Substrat kontinuierlich über eine Säule läuft, welche mit einem DEAE-Toyopearl immobilisienen Lipasepräparat gepackt ist, das vorzugsweise 0,1 bis 5,0% Feuchtigkeit enthält, der Säulendruck unter 98 kPa (1 kg/cm²) bleibt.
Trotz dem Vorstehenden sollte man die Reaktion bei dem anfänglichen Feuchtigkeitsgehalt des Enzympräparats von über 5% nicht starten, da sie dann zuviel Zeit in Anspruch nimmt, um die Gleichgewichtsmenge des Feuchtigkeitsgehalts zu erreichen und während diesem Zeitraum erfolgt eine größere Hydrolyse als notwendig, was eine überschüssige Produktion von unerwünschten Diglyceriden zur Folge hat, welche die Ausbeute des umgeesterten Öls oder Fetts verringern. Dieser Punkt wird im Experiment 2 veranschaulicht.
Ein höherer Feuchtigkeitsgehalt des Enzympräparats hat noch ein anderes Problem zur Folge. Da das über die Reaktorsäule fließende Substrats einen größeren Widerstand aufweist, wird es schwieriger eine Durchflußgeschwindigkeit zu erreichen, die für die effiziente Reaktion hoch genug ist.

Experiment 2:

Man ließ 2,5 g gefriergetrocknetes, DEAE-Toyopearl -immobilisiertes Lipase PL-679- Präparat (15 000 U/g Träger) in 25 mg destilliertem Wasser einweichen (entspricht 1 Gew.-% des immobilisierten Enzympräparats) und suspendierte es dann in 50 ml n-Hexan. Die Suspension wurde zum Packen in eine ummantelte 150 mm lange Säule mit einem Innendurchmesser von 10 mm gegossen.
Das gleiche Verfahren wurde wiederholt, mit der Ausnahme, däß die Einweichmenge des destillierten Wassers auf 0, 50, 100, 138 und 250 mg (entspricht 0, 2, 4, 5,5 bzw. 10 Gew.-% des immobilisierten Erizympräparats) geändert wurde, um immobilisierte Enzymsäulen herzustellen, die sich voneinander im Feuchtigkeitsgehalt unterscheiden.
354,4 g Palmöl, mittlere Fraktion (POMF), und 283,6 Stearinsäure wurden mit 0,4 ml destilliertem Wasser in 1600 g n-Hexan gelöst. Die Lösung wurde über eine unmantelte 150 mm lange Säule mit einem Innendurchmesser von 10 mm geleitet, welche mit 6 g granuliertem Celit gepackt war, das 2 g destilliertes Einweichwasser enthielt, um den Feuchtigkeitsgehalt der Substratlösung auf 700 ppm einzustellen.
Die obigen immobilisierten Enzymsäulen welche sich voneinander im Feuchtigkeitsgehalt unterscheiden, wurden von unten mit der Substratlösung bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 5,5 ml/Stunde beschickt, während das Reaktionssystem bei 45ºC gehalten wurde. Die aus den einzelnen immobilisierten Enzymsäulen ausströmenden Reaktionslösungen wurden mit Methoden, die nachstehend in Beispiel 1 erwähnt werden, auf Feuchtigkeitsgehalt, Fettsäurezusammensetzung der Triglyceride und Glyceridzusammensetzung untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 aufgeführt. Tabelle 3: Wirkung der Wasserzugabe zum immobilisierten Enzympräparat auf die Umesterung Wasserzusatz (%) zum immobilisierten Enzym Tage Stearinsäure (%) in Triglyceriden Triglyceride (%) in der Glyceridzusammensetzung Feuchtigkeitsgehalt (ppm) des Säulenauslaßes Abtrennung von Wassertröpfchen
Anmerkung: Das als Rohstoff verwendete Palmöl, mittlere Fraktion (POMF), enthielt vor der Reaktion 3,6% Stearinsäure.
Die Tabelle 3 zeigt, däß, wenn dem immobilisierten Enzympräparat über 5% Wasser zugegeben wird, der Anteil der Triglyceride in der Glyceridzusammensetzung des Reaktionsprodukts abnimmt. Dies bedeutet eine geringere Ausbeute des gewünschten umgeesterten Öls oder Fetts. Es wurde ebenfalls festgestellt, daß 10% Wasser die Feuchtigkeitsaufhahmekapazität des immobilisierten Enzympräparats übersteigt, so däß sich überschüssiges Wasser abtrennt und in die Reaktionslösung freigesetzt wird.
Das bei dieser Erfindung verwendete Enzym, welches in der Spurenwasserumgebung aktiv ist, ist insbesondere in organischen Lösungsmitteln stabil, so daß dem Reaktionssystem, falls erforderlich, ein organisches Lösungsmittel zugegeben werden kann.
Für diesen Zweck ist jedes organisches Lösungsmittel geeignet, das bei der Reaktionstemperatur flüssig ist, das Substrat ausreichend löst und dennoch die Umesterung nicht stört. Beispiele solcher organischer Lösungsmittel sind aliphatische Kohlenwasserstoffe, wie n-Hexan, Isooktan, n-Heptan, n-Pentan und Petrolether, tertiärer Butylalkohol, Aceton, etc. Insbesondere werden aliphatische Kohlenwasserstoffe bevorzugt, zum Beispiel n-Hexan. Diese Lösungsmittel können unabhängig voneinander oder in Kombination verwendet werden. Bei dieser Erfindung kann die Umesterung unter den nachstehend beschriebenen Bedingungen ausgeführt werden.
Bei der Erfindung wird das als Substrat verwendete Öl oder Fett in Gegenwart einer Fettsäure, einem Fettsäureester oder einem anderen Öl oder Fett umgeestert, das in jedem beliebigen Molverhältnis zu dem als Substrat verwendeten Öl oder Fett vorliegen kann, welches den besonderen Zweck der Reaktion erfüllt. In dieser Hinsicht gibt es keine besondere Beschränkung. Außerdem kann die vorstehende Kombination für die Reaktion, falls erforderlich, drei oder mehr reaktive Stoffe enthalten.
Das immobilisierte alkalische hochmolekulargewichtige Lipasepräparat besitzt für eine effizlentere Reaktion vorzugsweise eine höhere spezifische Aktivität. Folglich weist das Lipasepräparat eine Aktivität von vorzugsweise 3000 bis 300 000 U/g und zweckmäßigerweise 10 000 bis 100 000 U/g auf.
Um die Reaktorsäule zu packen, wird das Enzympräparat im Reaktionslösungsmittel oder im Öl oder Fett suspendiert und vorsichtig in die Säule gegossen, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden. Beim kontinuierlichen Umesterungsverfahren kann die Beschickungsgeschwindigkeit des Substrats abhängig von der Füllmenge des Enzympräparats eingestellt werden, so daß es hinsichtlich der Füllmenge des Enzyms keine besondere Beschränkung gibt. Falls ein organisches Lösungsmittel verwendet wird, kann es dem Reaktionssystem in einer Konzentration von 10 bis 90% (Gew./Gew.), vorzugsweise in einer Konzentration von 20 bis 80% (Gew./Gew.), zugegeben werden.
Die Substratlösung, die kontinuierlich in die Reaktorsäule eingeleitet wird, muß vorher auf einen Feuchtigkeitsgehalt zwischen 100 und 1800 ppm, vorzugsweise zwischen 100 und 1500 ppm und stärker bevorzugt zwischen 200 und 1000 ppm, eingestellt werden.
Zur Einstellung des Feuchtigkeitsgehalts der Substratlösung kann die notwendige Wassermenge der Substratlösung zugegeben werden oder die überflüssige Wassermenge kann durch Feuchtigkeitsentzug entfernt werden.
Zur Erhöhung des Feuchtigkeitsgehalts kann die benötigte Wassermenge zum Beispiel berechnet und direkt zugegeben werden. Da nur eine sehr kleine Wassermenge erforderlich ist, sind einfachere Einstellmöglicnkeiten das Durchsprudeln der Substratlösung mit Dampf, die Luftbefeuchtung oder ähnliches oder das Leiten der Lösung über eine Vorsäule, welche mit einem hygroskopischen Feststoff gepackt ist, der vorher befeuchtet wird.
Für den Feuchtigkeitsentzug kann die Substratlösung zum Beispiel mit einem inerten wassertreien Gas, wie Stickstoff, durchsprudelt werden, um die gewünschten Einstellungen zu erzielen. Alternativ kann ein Teil der Substratlösung über eine Vorsäule geleitet werden, welche mit einem Dehydratisierungsmittel, zum Beispiel Molekularsiebe, gepackt ist.
Wenn die Feuchtigkeitssättigungsmenge der Substratlösung zu gering ist, um den gewünschten Feuchtigkeitsgehalt zu erreichen, löst eine Veränderung der Substratkonzentration der Lösung oder eine Änderung der Lösungsmittelzusammensetzung durch die Zugabe eines hydrophilen Lösungsmittels, wie Aceton, Methanol, Ethanol oder t-Butanol, das Problem.
Normalerweise enthält die erfindungsgemäß verwendete Substratlösung eine Feuchtigkeitsmenge von 10 bis 100 ppm. Daher muß nur der Gesamtfeuchtigkeitsgehalt der Substratlösung auf den gewünschten Bereich eingestellt werden.
Die aus der Reaktorsäule für das kontinuierliche Verfahren ausströmende Reaktionslösung weist einen Feuchtigkeitsgehalt im Bereich von 50 bis 800 ppm auf, der immer geringer ist als der Feuchtigkeitsgehalt der Substratlösung, welche in die Säule eingeleitet wird, da eine sehr kleine Wassermenge für die Umesterung verbraucht wird. Wenn der Feuchtigkeitsgehalt der eingeleiteten Substratlösung gemäß dem gewünschten umgeesterten Öl- oder Fettprodukt und unter Berücksichtigung der Durchflußgeschwindigkeit der Substratlösung eingestellt wird, wird eine Umesterung erzielt, bei welcher der Feuchtigkeitsgehalt der ausströmenden Reaktionslösung praktisch automatisch die vorstehende Anforderung erfüllt. Dieser Punkt wird im nächsten Experiment veranschaulicht.

Experiment 3:

2,5 g gefriergetrocknetes, DEAE-Toyopearl -immobilisiertes Lipase PL-679-Präparat (100 000 U/g Träger) wurden in 50 ml n-Hexan suspendiert und zum Packen in eine 150 mm lange Säule mit einem Innendurchmesser von 10 mm gegossen.
354,4 g POMF und 283,6 g Stearinsäure wurden in einem Lösungsmittelgemisch aus 1440 g n-Hexan und 193 g Aceton gelöst. Es wurde festgestellt, daß die vorstehende Substratlösung 90 ppm Feuchtigkeit enthielt. Die immobilisierte Enzymsäule wurde von unten mit der vorstehenden Substratlösung bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 27,5 ml/Stunde beschickt. Die aus der Säule ausströmende Reaktionslösung wurde gesammelt und mit einem Feuchtigkeitsmeßgerät nach Karl Fischer (Mitsubishi Chemical Industries Modell CA-05) auf den Feuchügkeitsgehalt, mit Iatroscan und Gaschromatographie (gemäß den später in Beispiel 1 beschriebenen analytischen Methoden) auf die Glyceridzusaminensetzung bzw. Fettsäurezusammensetzung der Triglyceride untersucht. Das Reaktionssystem wurde bei 45ºC gehalten.
Ferner wurden den Substratlösungen der gleichen Zusammensetzung unabhängig voneinander 0,14; 0,36; 1,04; 1,50; 1,95; 2,75; 3,32; 3,66 und 4,79 ml destilliertes Wasser zugegeben, um Substratlösungen mit 150, 250, 550, 750, 950, 1300, 1550, 1700 und 2240 ppm Feuchtigkeit herzustellen. Daneben wurden 354,4 g POMF und 283,6 g Stearinsäure in 1589 g n-Hexan gelöst und dem Gemisch wurden 16,8 ml Ethanol und 0,43 g destilliertes Wasser zugegeben, um eine Substratlösung mit 280 ppm Feuchtigkeit herzustellen.
Jede der vorstehenden Substratlösungen wurde über eine immobilisierte Enzymsäule geleitet, welche wie vorstehend hergestellt wurde. Alle Reaktionslösungen wurden auf Feuchtigkeitsgehalt, Glyceridzusammensetzung und Fettsäurezusammensetzung der Triglyceride untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 aufgeführt. Tabelle 4 Enzym Feuchtigkeitsgehalt der Substratlösung (ppm) Stearinsäure (%) in Triglyceriden Triglyceride (%) in der Glyceridzusammensetzung Feuchtigkeitsgehalt (ppm) des Säulenauslaßes Lipase Anmerkung: Die vorstehenden Daten beziehen sich auf Analysen, die 4 Tage nach dem Start der Reaktion durchgeführt wurden. Bei dem mit einem Stern versehenen Ergebnis erfolgte die Einstellung der Feuchtigkeit durch Zugabe von 0,6% (Gew./Gew.) Ethanol anstelle von 8,5% (Gew./Gew.) Aceton.
2 ml Rhizopus delemar-Lipase-Suspension (Boehringer 50 000 U/ml) wurden gegen destilliertes Wasser dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde mit 10 ml destilliertem Wasser verdünnt und dann ließ man sie an 10 g Celit adsorbieren. Das Celit wurde dann unter verringertem Druck gefriergetrocknet, um Feuchtigkeit zu entfernen, wobei ein immobilisiertes Lipasepräparat erhalten wurde. Eine Suspension aus 10 g des vorstehenden immobilisierten Enzympräparats in 50 ml n-Hexan wurde zum Packen in eine 150 mm lange Säule mit einem Innendurchmesser von 10 mm gegossen. Zwei Substratlösungen mit 750 bzw. 2800 ppm Feuchtigkeit, die gemäß dem vorstehend erwähnten Verfahren hergestellt wurden, wurden von unten bei einer Geschwindigkeit von 27,5 ml/Std, in einzelne immobilisierte Enzymsäulen eingeleitet und die ausströmende Reaktionslösung wurden mit Verfahren, welche später in Beispiel 1 erwähnt werden, auf Feuchtigkeitsgehalt, Glyceridzusarnmensetzung und Fettsäurezusammensetzung der Triglyceride untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 aufgeführt.
Außerdem wurden 2,5 g Lipase 3A (NOVO, Mucor miehei-Lipase sp. 225, immobilisiert auf Duolit 5761) unter verringertem Druck gefriergetrocknet und zum Packen zweier Reaktorsäulen, wie in dem vorhergehenden Absatz, in 50 ml n-Hexan suspendiert. Die zwei Substratlösung (mit 750 bzw. 2800 ppm Feuchtigkeit) wurden von unten bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 27,5 ml/Std, in einzelne Säulen eingeleitet. Die aus den einzelnen Säulen ausströmenden Reaktionslösungen wurden gesammelt und in entsprechender Weise auf Feuchtigkeitsgehalt, Glyceridzusammensetzung und Fettsäurezusammensetzung der Triglyceride untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 aufgeführt. Tabelle 5 Enzym Feuchtigkeitsgehalt der Substratlösung (ppm) Stearinsäure (%) in Triglyceriden Triglyceride (%) in der Glyceridzusammensetzung Feuchtigkeitsgehalt (ppm) des Säulenauslaßes Rhizopus-Lipase Mucor-Lipase Anmerkung: Die vorstehenden Daten beziehen sich auf Analysen, die 4 Tage nach dem Start der Reaktion durchgeführt wurden.
Die Tabelle 4 zeigt, daß kaum eine Umesterung erfolgte, wenn eine Substratlösung mit weniger als etwa 100 ppm Feuchtigkeit in die Reaktorsäule eingeleitet wurde und eine Reaktionslösung mit weniger als 50 ppm Feuchtigkeit daraus ausströmte, wie durch den geringen Prozentsatz der Stearinsäurezusammensetzung der Triglyceride bewiesen wird, der anhand der Stearinsäure ermittelt wurde. Im Gegensatz dazu schritt die Umesterung gleichmäßig voran, wenn eine Substratlösung mit einer Feuchtigkeit zwischen 100 und 1800 ppm Feuchtigkeit eingeleitet wurde und eine Reaktionslösung mit einer Feuchtigkeit zwischen 50 und 800 ppm ausfloß, wobei Triglyceride in einer hohen Ausbeute erhalten wurden. Wenn eine Substratlösung mit mehr als 1800 ppm Feuchtigkeit eingeleitet wurde und eine Reaktionslösung mit mehr als 800 ppm Feuchtigkeit ausströmte, wurden jedoch die Triglyceride in einer geringeren Ausbeute hergestellt. Im Gegensatz dazu stellt man anhand der Tabelle 5 fest, daß im Fall der Rhizopus- oder Mucor-Lipase die Umesterung nicht vollständig abläuft, wenn die Substratlösung bis zu 2800 ppm Feuchtigkeit enthielt, d.h., daß eine weitere Erhöhung des Feuchtigkeitsgehalts der Substratlösung erforderlich war.
Es ist wunschenswert unter Berücksichtigung des Substratmaterials, des Siedepunkts des Lösungsmittels, der Enzymarten, etc, eine richtige Reaktionstemperatur zu wählen. Normalerweise schreitet die Reaktion bei einer Temperatur unter 80ºC, vorzugsweise in einem Bereich von 30 bis 70ºC, voran. Übermäßig hohe Temperaturen sind nicht vorzuziehen, da die 1,2-Diglycerid-Reaktionszwischenprodukte zu Umlagerungen der Fettsäure an der 2-Position neigen.
Der Zeitraum, wahrend dem das Substrat für eine effiziente Reaktion in der Reaktorsäule verweilen muß, ist nicht besonders begrenzt, da dieser Parameter abhängig vom gewünschten Prozentsatz der Umesterung bestimmt wird. Beispielsweise ist zum Einführen von Stearinsäure in Glyceridmoleküle von POMF, wie später in Beispiel 5 veranschaulicht wird, eine Verweildauer von etwa 7 oder 26 Minuten lang genug, um einen Umesterungsprozentsatz von 67% bzw. 94% zu erhalten.
Die erfindungsgemäß verwendete alkalische hochmolekulargewichtige Lipase kann die Umesterung über einen langen Zeitraum stabil und effizient katalysieren, so kann die Reaktorsäule, wenn sie mit dem Präparat des obigen Enzyms gepackt wurde, einem längeren Gebrauch standhalten. Beispielsweise wurde POMF in dem später erwähnten Beispiel 5 zur Durchesterung mit Stearinsäure bei einer Reaktionstemperatur von 45ºC in Gegenwart des DEAE-Toyopearl -immobilisiertes Lipase PL-679-Präparats umgesetzt, wobei der Feuchtigkeitsgehalt der Substratlösung auf 700 ppm eingestellt wurde. Es wurde festgestellt, daß das immobilisierte Enzympräparat eine Halbwertszeit von etwa 190 Tagen besitzt. Nimmt man für den Prozentsatz der Umesterung 67% an, bedeutet dies, daß für zwei Halbwertszeiten etwa 20 Tonnen des als Rohstoff verwendeten Glyceridöls pro Kilogramm des immobilisierten Enzyms verarbeitet werden könnten.
Im nächsten Experiment wird das erfindungsgemäße kontinuierliche Umesterungsverfahren mit dem in der Japanischen Patentanmeldung 62-45302 offenbarten Batchverfahren der Umesterung in Hinsicht auf die Wirksamkeit der Reaktion verglichen.

Experiment 4

2,5 g DEAE-Toyopearl -immobilisiertes Lipase PL-679-Präparat (20 000 U/g), unter verringertem Druck gefriergetrocknet, wurden in 50 ml n-Hexan suspendiert und zum Packen in eine ummantelte 150 mm lange Säule mit einem Innendurchmesser von 10 mm gegossen. Eine andere ummantelte 150 mm lange Säule mit einem Innendurchmesser von 10 mm wurde mit 6 g in 2 ml destilliertes Wasser eingeweichtes Celit gepackt, um eine Vorsäule zur Einstellung des Feuchtigkeitsgehalts der Substratlösung bereitzustellen.
In 1600 g n-Hexan wurden 354,4 g POMF und 283,6 g Stearinsäure gelöst. Nach Zugabe von 5 ml destilliertem Wasser wurde die Lösung geschüttelt und dann ließ man sie 30 Minuten stehen, um den Überstand zu erhalten. Dieser wurde als 200 ppm Feuchtigkeit enthaltende Substratlösung verwendet.
Die obige Substratlösung wurde mit einer Mikropumpe von unten bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 170 ml/Stunde in die Vorsäule eingeleitet, wobei der Feuchtigkeitsgehalt der Substratlösung auf 700 ppm eingestellt wurde. Nach dem Lauf über die Vorsäule wurde die Substratlösung zur Umsetzung 10 Tage kontinuierlich von unten bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 24,0 ml/Stunde (37ºC) in die immobilisierte Enzymsäule eingeleitet. Die während dieses Zeitraums aus der Reaktorsäule ausströmende Reaktionslösung wurde mit den gleichen in Beispiel 1 erwähnten Methoden untersucht. Es wurden etwa 6,4 kg umgeestertes Glyceridöl bei einem Umesterungsprozentsatz von 95% hergestellt.
Im Gegensatz dazu wurden in einem Batchverfahren der Umesterung, wie in Beispiel 3 der Japanischen Patentanmeldung 62-45302 vorgeschlagen, etwa 0,66 kg umgeestertes Glyceridöl bei einem Umesterungsprozentsatz von 95% und einer Betriebsdauer von 10 Tagen hergestellt. Dies bedeutet, daß das erfindungsgemäße kontinuierliche Verfahren etwa 1,8mal wirksamer ist als das obige Batchverfahren, wenn man beide Verfahren auf der Basis der Enzymeinheit vergleicht.
Zur Gewinnung des umgeesterten Öls oder Fetts aus der Reaktorsäule ausströmenden Reaktionslösung, kann die Reaktionslösung bei der vorliegenden Erfindung entweder so wie sie ist oder unter Zusatz eines Lösungsmittels, zum Beispiel Hexan, Aceton, Ethanol oder ähnlichem, zur Ausfällung des Öls oder Fetts daraus unter den Schmelzpunkt des gewünschten Öls oder Fetts abgekühlt werden. Das ausgefällte Öl oder Fett wird durch Zentrifügieren oder Filtrieren gewonnen. Das vorstehende Verfahren ist auch zum Entfernen von unerwünschtem Öl, Fett und/oder unerwünschten Fettsäuren aus der Reaktionslösung anwendbar. Es ist ebenfalls möglich, der Reaktionslösung eine alkoholische oder wäßrige Lösung von Ammoniak, Ätznatron, Calciumhydroxid oder ähnlichem zuzugeben. Auf diese Weise können unerwünschte freie Fettsäuren als Seife entfernt werden.
Vor der Anwendung des vorstehenden Verfahrens zur Gewinnung von umgeesterten Öl oder Fett kann die Reaktionslösung destilliert oder über eine Membran gefiltert werden, wobei das Reaktionslösungsmittel zur Gewinnung der lösungsmittelfreien Öl- oder Fettfraktion entfernt wird, welche erneut in einem Lösungsmittel, wie n-Hexan, Aceton Ethanol, Propanol oder t-Butanol oder einem Gemisch aus zwei oder mehrerer dieser Lösungsmittel, gelöst wird. Das gewünschte umgeesterte Öl oder Fett kann dann, wie im vorangegangenen Absatz erwähnt, zur Gewinnung isoliert werden. Alternativ kann nach der vorstehenden Lösungsmittelentfernung der zurückbleibende Rückstand destilliert werden, wobei freie Fettsäuren aus dem Öl oder Fett abgetrennt werden. Das Öl oder Fett wird dann zur weiteren Reinigung für eine Lösungsmittelfraktionierung, Präzipitation, etc., wie vorstehend erwähnt, erneut in einem Lösungsmittel, wie Aceton, n-Hexan, Ethanol oder ähnlichem,gelöst.
Die auf diese Weise hergestellten umgeesterten Öl- oder Fettprodukte finden Anwendung in Industrien betreffend Lebensmittelverarbeitung, Kosmetika, Arzneimittel, Agrarchemie, Farben, Druckereien, etc.
Ein Resultat der Erfindung ist folglich die effiziente Herstellung von umgeesterten Ölen und Fetten in hoher Ausbeute durch ein kontinuierliches Verfahren, wobei das als Substrat verwendete Öl oder Fett in einer Spurenwasserumgebung in Gegenwart einer Fettsäure, einem Fettsäureester oder einem anderen Öl oder Fett unter direkter Wirkung der alkalischen hochmolekulargewichtigen Lipase umgeestert wird. Ein Vorteil eines solchen kontinuierlichen Umesterungsverfahrens ist, daß, da das Reaktionssystem nur eine Spur Wasser erfordert, kein Feuchtigkeitskontrollmechanismus zur Einstellungen des Feuchtkeitsgehalts durch Dehydratation während der Reaktion benötigt wird, während die unerwünschte Hydrolyse unterdrückt wird, und daß Diglyceridnebenprodukte, welche die Ausbeute des umgeesterten Öls oder Fetts verringern, praktisch nicht entstehen. Da keine Einstellung des Feuchtigkeitsgehalts während der Reaktion erforderlich ist, können Behandlungen zur Wasserzugabe und Dehydratation welche die Inaktivierung des Enzyms bewirken können vermieden werden so daß das Enzym länger für den Gebrauch zur Verfügung steht. Außerdem schreitet das erfindungsgemäße Verfahren bei einer schnelleren Reaktionsgeschwindigkeit voran und erfordert keine große Apparatur, so daß das Verfahren eine Methode mit einem großen ökonomischen Vorteil bereitstellt, welches auf die Herstellung von umgeesterten Ölen und Fetten im industriellen Maßstab geeignet angewendet werden kann.
So können mit der Erfindung durch ein kontinuierliches Verfahren billige Öle und Fette unter einfachen Reaktionsbedingungen einfach und rentabel qualitätsmäßig verbessert und in teuere umgeesterte Öle und Fette von großem zusätzlichen Wert umgewandelt werden. Beispieisweise kann das Verfahren zur Modifikation von verschiedenen eßbaren Ölen und Fetten angewendet werden. zum Beispiel zur Umwandlung von billigem Palmöl in einen teueren Kakaobutterersatz.
Die in den erfindungsgemäßen Beispielen verwendeten immobilisierten Enzympräparate wurden mit den folgenden Verfahren hergestellt:

Herstellung von immobilisierten Lipasepräparaten - Verfahren 1:

Alcaligenesbakterien sp. PL-679 wurden gemäß einer in der Japanischen Patentveröffentlichung 60-15312 offenbarten Methode gezüchtet, um 15 Liter der Kultur zu erhalten, welche 10 Minuten bei 10 000 x g zentrifugiert wurde. Dem Überstand wurden 450 g Bentonit zugegeben und das Gemisch wurde I Stunde unter Kühlen geschüttelt und dann zentrifugiert, um das Bentonit zu gewinnen, welches Lipase PL-679 adsorbiert hatte. Durch Zugabe von 10 l einer 1%igen Polyethylenglykol 4000-Lösung zu dem Bentonit wurde das Enzym Lipase PL-679 aus dem Bentonit extrahiert. Die Entfernung des Bentonits durch Zentrifugation ergab 10 l bentonitfreie Lipase PL-679-Lösung.
100 g (bezogen auf das Trockengewicht) DEAE-Toyopearl (Toso Co., Ltd.) wurden 4 Stunden in 5 l wäßriger 1 N NaOH-Lösung eingetaucht. Durch Filtration unter Absaugen wurde das DEAE-Toyopearl auf Filterpapier Nr. 1 gewonnen. Das DEAE-Toyopearl auf dem Filterpapier wurde mit destilliertem Wasser gewaschen bis der pH des Filtrats auf 8,0 erniedrigt wurde. Auf diese Weise wurde das DEAE-Toyopearl aktiviert.
Zur Immobilisierung wurden 10 l der obigen bentonitfreien Lipase PL-679-Lösung eine Stunde bei 4ºC mit dem vorstehenden aktivierten DEAE-Toyopearl geschüttelt, um die Adsorption des Enzyms an das letztere zu ermöglichen. Nach dem Waschen mit Wasser zur Entfernung des Polyethylenglykols 4000 und einer Filtration unter Absaugen wurde ein DEAE-Toyopearl -immobilisiertes Lipase PL-679-Präparat auf Filterpapier Nr. 1 gewonnen. Das immobilisierte Enzympräparat wurde 48 Stunden gefriergetrocknet. Auf diese Weise wurde ein wasserfreies DEAE-Toyopearl -immobilisiertes Lipase PL-679- Präparat hergestellt, welches in den folgenden Beispielen verwendet wurde.
Das obige immobilisierte Enzympräparat wies eine Aktivität von 100 000 U/g Träger auf. Ferner wurde das gleiche vorstehende Verfahren wiederholt, mit der Ausnahme, daß 500 g DEAE-Toyopearl verwendet wurden, um ein anderes Präparat des wasserfreien DEAE-Toyopearl -immobilisiertes Lipase PL-679-Präparats (20 000 U/g Träger) zu erhalten.
Außerdem wurden Alcaligenesbakterien sp. PL-266 gemäß einer in der Japanischen Patentveröffentlichung 58-36953 offenbarten Methode gezüchtet, um 15 l der Kultur zu erhalten. Durch Anwendung des gleichen vorstehend erwähnten Verfahrens wurde aus der vorstehenden Kultur ein DEAE-Toyopearl -immobilisiertes Lipase PL-266-Präparat hergestellt, welches eine Aktivität von 10 000 U/g Träger aufwies.
Weiter wurden Achromobacterbakterien sp. AL-865 gemäß einer in der Japanischen Patentveröffentlichung 49-32080 offenbarten Methode gezüchtet, um 15 l der Kultur zu erhalten, aus welcher durch Anwendung des gleichen vorstehenden Verfahrens ein DEAE-Toyopearl -immobilisiertes Lipase AL-Präparat hergestellt wurde. Dieses Enzympräparat wies eine Aktivität von 10 000 U/g auf.
Ferner wurden 5 g Lipase PS-Pulver (Sapporo Breweries, 16 000 U/g Träger) in 500 ml Wasser gelöst und die Lösung wurde zentrifügiert, um den Überstand zu erhalten, dem 15 g Bentonit zugegeben wurden. Mit dem extrahierten Enzym wurde das vorstehende Verfahren in einem kleineren Maßstab von 1/30 wiederholt, wobei ein DEAEDEAE-Toyopearl -immobilisiertes Lipase PL-679-t erhalten wurde das eine Aktivität von 10 000 U/g aufwies.

Herstellung von immobilisierten Lipasepräparaten - Verfahren 2:

Alcaligenesbakterien sp. PL-679 wurden gemäß einer in der Japanischen Patentveröffentlichung 60-15312 offenbarten Methode gezüchtet, um 15 l der Kultur zu erhalten, welche mit der gleichen auf Verfahren 1 angewendeten Enzymimmobilisierungsmethode verarbeitet wurde wobei 10 l bentonitfreie Lipase PL-679-Lösung erhalten wurden. Dieser Lipaselösung wurden zur Adsorption des Enzyms 31 DEAE-Cellulose, vollständig äquilibriert in 0,01 M Phosphatpuffer von pH 9,0, zugegeben. Nach dem Waschen mit dem gleichen Puffer zur Entfernung des Polyethylenglykols wurden 5 l 0,2 M NaCl-Lösung zugegeben, um die Lipase PL-679 von der DEAE-Cellulose abzulösen. Nach dem Abfiltrieren der DEAE-Cellulose wurde die Enzymlösung bis zur zehnfachen Konzentration ultrafiltriert und anschließend bis zu einen Salzgehalt von 1% oder weniger entsalzt. Auf diese Weise wurden 500 ml gereinigte Lipase PL-679-Lösung hergestellt.
Das einstündige Schütteln von 50 ml der vorstehenden gereinigten Lipaselösung bei 4ºC mit 50 g Prolacto , abgeleitet von Milchalbumin (Lieferant: Toyo Jozo), gefolgt von einer 4Bstündigen Gefriertrocknung, ergab 50 g wasserfreies Prolacto -immobilisiertes Lipase PL-679-Präparat, welches eine Aktivität von 10 000 U/g aufwies.
Ferner ergab das einstündige Schütteln von 50 ml der vorstehenden gereinigten Lipase PL-679-Lösung bei 4ºC mit 50 g Chitosan, gefolgt von einer 4Bstündigen Gefriertrocknung, 50 g wasserfreies immobilisiertes Lipase PL-679-Präparat, welches eine Aktivität von 10 000 U/g Träger aufwies.
Außerdem wurden 9 g Celluloseacetat in 100 ml Aceton gelöst. Die Lösung wurde mit 1 g Lipase PL-679-Pulver geschüttelt und das Aceton wurde unter verringertem Druck abgedampft, wobei ein Celluloseacetat-immobilisierte Lipase PL-679-Präparat hergestellt wurde, das eine Aktivität von 10 000 U/g aufwies. Dieses Enzympräparat wurde für den Gebrauch in 1 mm große Würfel geschnitten.
Die folgenden Beispiele sind zur weiteren Veranschaulichung und nicht zur Begrenzung dieser Erfindung aufgeführt.

Beispiel

2,5 g wasserfreies DEAE-Toyopearl -immobilisiertes Lipase PL-679-Präparat (100 000 U/g Träger, Feuchtigkeitsgehalt: 0,1%) wurden in 50 ml n-Hexan suspendiert und mit der erhaltenen Suspension wurde eine ummantelte 150 mm lange Säule mit einem Innendurchmesser von 10 mm gepackt.
Andererseits ließ man 6 g granuliertes Celit in 2 ml destilliertem Wasser einweichen und verwendete diese Suspension dann zum Packen einer anderen ummantelten 150 mm langen Säule mit einem Innendurchmesser von 10 mm, welche als Vorsäule zur Einstellung des Feuchtigkeitsgehalts der Substratlösung verwendet wurde.
354,4 g POMF und 283,6 g Stearinsäure wurden in 1600 g n-Hexan gelöst und die Lösung wurde mit 5 ml destilliertem Wasser geschüttelt. Man ließ die Lösung 30 Minuten stehen und der 200 ppm Feuchtigkeit enthaltende Überstand wurde als Substratlösung verwendet.
Die Substratlösung wurde mit einer Mikropumpe gepumpt, um die Vorsäule von unten bei einer Geschwindigkeit von 170 ml/Stunde oder weniger zu beschicken, wobei der Feuchtigkeitsgehalt davon auf 700 ppm eingestellt wurde.
Die aus der Vorsäule ausströmende Substratlösung wurde von unten bei einer Geschwindigkeit von 27,5 ml/Stunde (SV = 2,3 Std.&supmin;¹)in die mit dem DEAE-Toyopearl -immobilisierten Lipase PL-679-Präparat gepackte Säule eingeleitet. Das Reaktionssystem wurde bei 45ºC gehalten. Während der kontinuierlichen Beschickung der Säule für 35 Tage wurde die Reaktionslösung in Intervallen von 24 Stunden gesammelt und auf den Anteil der Stearinsäure (C18.0) in den Triglyceriden, den Anteil der Oleinsäure (C18:1) an der 2-Position der Triglyceride, den Anteil der Triglyceride in der Glyceridzusammensetzung, den Prozentsatz der Umesterung und den Feuchtigkeitsgehalt der aus der Reaktorsäule ausströmenden Reaktionslösung untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 und in Figur 1 dargestellt.
Bei den vorstehenden Analysen wurde der Anteil der Stearinsäure in den Triglyceriden durch folgendes Verfahren abgeschätzt. Die Reaktionslösung wurde mit einem gleichen Volumenteil Methylenchlorid verdünnt und 50 ul der Verdünnung wurden bandförmig auf eine 1 mm dicke Silicagelplatte aufgetragen, welche ein fluoreszierendes Reagens (Merck) enthielt. Nach der Entwicklung von 10 cm mit einem Lösungsmittelgemisch aus Petrolether, Ether und Essigsäure (70 : 30 : 1, Vol./Vol.) wurde die Platte UV-Licht von 254 nm ausgesetzt, um den Triglycerid-Spot nachzuweisen. Dieser wurde aus der Platte ausgeschabt und in ein mit einem Stopfen versehenes Teströhrchen überführt. Die Triglyceride wurden in Übereinstimmung mit dem Abschnitt 2.4.20.2-77 und dem Abschnitt 2.4.21-71 eines Buches mit dem Titel "Kijun Yushi Bunseki-ho" (Standardmethoden der Fett/Ölanalyse zusammengestellt von Nihon Yukagaku Kyokai) auf ihre Fettsäurezusammensetzung untersucht. Diese Abschnitte beschreiben die Herstellung eines Methylesters aus Fettsäuren (Bortrifluoridmethanolverfahren) bzw. einer Fettsäurezusammensetzung (Gaschromatographie). Die Fettsäurezusammensetzung an der 2-Position der Triglyceride wurde mit der folgenden Analyse bestimmt. Die vorstehende Methode der Triglyceridisolierung wurde in einem fünffachen Maßstab wiederholt. Der ausgeschabte Triglycerid-Spot wurde in 50 ml eines Lösungsmittelgemisches aus Chloroform und Methanol (2 : 1 Vol./Vol.) überführt, um die Glyceride aus dem Silicagel zu extrahieren. Der Extrakt wurde bis zur Trockene eingedampft und der Rückstand wurde mit 6 ml 1 M Tris- Salzsäurepuffer (pH 8,0), welcher 50 Eiriheiten Lipase PL-679, 1,5 ml wäßrige 0,1%ige Natriumcolatlösung und 0,6 ml wäßrige 2,2%ige Calciumchloridlösung enthielt, zur Umsetzung während 3 Minuten bei 40ºC geschüttelt. Nach der Zugabe von 2 ml 6 N Salzsäure um die Reaktion zu stoppen, wurde die ölige Fraktion mit 2 ml Ethanol und 10 ml Petrolether extrahiert. Die extrahierte ölige Fraktion wurde, wie vorstehend erwähnt, auf einer Silicagelplatte entwickelt, um die Monoglyceridfraktion abzutrennen, welche aus der Platte ausgeschabt und in ein mit einem Stopfen versehenes Teströhrchen überführt wurde. Die Fettsäurezusammensetzung der Monoglyceride wurde durch die gleiche auf die Fettsäurezusammensetzung der Triglyceride angewendeten Analyse bestimmt. Die Glyceridzusammensetzung der Reaktionslösung wurde mit Iatroscan bestimmt. Und 20 zwar wurde die Reaktionslösung mit 2 Volumenteilen Methylenchlorid verdünnt und 0,2 ul der verdünnten Lösung wurden auf Chromarod SII aufgetragen und 10 cm davon wurden mit einem Lösungsmittelsystem aus Benzol, Chloroform und Essigsäure (50 20 : 1, Vol./Vol.) entwickelt. Die relativen Bereiche der einzelnen Peaks wurden mit Iatroscan TH10 bestimmt. Die Feuchtigkeitsgehalte der Substratlösung und der aus der Reaktorsäule ausströmenden Reaktionslösung wurde mit einem Feuchtigkeitsmeßgerät nach Karl Fischer bestimmt.
Der mit einer bestimmten Lipase erzielte Prozentsatz der Umesterung wurde wie folgt abgeschatzt. Aus den für die Fettsaurezusammensetzung der Triglyceride und für die Fettsaurezusammensetzung insbesondere an der 2 Position davon verfügbaren POMF Daten wurde diefettsäurezusainrnensetzung an den 1,3-Positionen der Triglyceride mit der folgenden Formel annahernd berechnet.
Fettsäuren an den 1,3-Positionen = [(Fettsäuren der Triglyceride) x 3 - Fettsauren an der 2-Position]/ 2. (1)
Unter Berücksichtigung der Fettsäurezusammensetzurig der Triglyceride von POMF wurde das mittlere Molekulargewicht solcher Triglyceride als etwa 840 angenommen. Aus diesem numerischen Wert wurde die Molaritat der Fettsaurezusammensetzung an der 1,3-Posiüon der Triglyceride annähernd berechnet und aus dem Molverhältnis von C18:0, das POMF zu einer solchen Fettsäurezusammensetzung an den 1,3-Positionen zugegeben wurde, wurde die zu erreichende Fettsäurezusammensetzimg an der 1,3-Position der Triglyceride abgeschätzt, wenn sich die Reaktion im Gleichgewicht befand. Es ist bekannt, daß Lipase PL-679 an 1,3-Positionen eine hohe Spezifität besitzt und die Umesterung nur an der 1 3-Posiflon der Triglyceride katalysieren kann.
Aus der Summe der Palmitinsäure (C16:0), Oleinsäure (C18:1) und Linolensäure (C18:2) wurde für die Fettsäurereste, weiche die 1,3-Positionen der Triglyceride von POMF einnehmen, ein Prozentsatz von 94,6% (Gew./Gew.) berechnet. Nachdem die Reaktion den 10 Gleichgewichtszustand erreicht, verringert sich dieser Prozentsatz auf 42,7% (Gew./Gew.). Der Prozentsatz der Umesterung wird mit der folgenden Gleichung annähernd berechnet:
Prozentsatz der Umesterung = {[(C16:0 + C18:1 + C18:2)Sustrat-(C16:0 + C18:1 + C18:2)Reaktionlösung] / [(C16:0 + C18:1 + C18:2)Substrat-(C16:0 + C18:1 + C18:2)Gleichgewicht]} x 100. (2) Tabelle 6 Tage C18:0 (%) in der Fettsäurezusammensetzsetzung und der TGs C18:0 (%) an der 2-Position der TGs TG (%) in der Glyceridzusammensetzung Umesterungsprozentsatz (%) Feuchtigkeitsgehalt (%) des Säulenauslaßes TG = Triglyceride
Die Tabelle 6 und die Figur 1 zeigen, daß das DEAE-Toyopearl -immobilisierte Lipase PL-679-Präparat im kontinuierlichen Umesterungsverfahren zur Herstellung von umgeesterten Ölen und Fetten wirksam verwendet werden kann. Das vorstehende Enzympräparat wies eine Halbwertszeit von etwa 190 Tagen auf, wenn diese nach der folgenden Gleichung berechnet wurde:
Halbwertszeit (Tage) = 1n (2/kd) (3),
worin kd= [1n (Prozentsatz der Umesterung zu Beginn / Prozentsatz der Umesterung nach t Tagen)] / t.
Daraus folgt, daß etwa 5,7 Tonnen POMF pro kg immobilisiertem Enzympräparat während zwei Halbwertszeiten bei einem Umesterungsprozentsatz von 94% verarbeitet werden können.

Beispiel 2

Man ließ 2,5 l der aus einer DEAE-Toyopearl -immobilisierten Lipase PL-679-Säule ausströmenden Reaktionslösung (die Substratlösung wurde während 0 bis 80 Stunden eingeleitet), gemäß dem Verfahren von Beispiel 1, 12 Stunden bei 20ºC stehen und zentrifugierte die Lösung dann bei 5000 x g, wobei 2,2 l Überstand erhalten wurden. Die Suspension des Präzipitats in 0,5 l n-Hexan wurde ebenfalls, wie vorstehend, zentrifügiert, wobei 0,4 l Überstand erhalten wurden. Die zwei Überstandfraktionen wurden vereinigt man ließ sie 12 Stunden bei 5ºC stehen und zentrifügierte sie, wie vorstehend, wobei 2,4 Überstand erhalten wurden. Dieser Überstand wurde vollständig mit 0,51 einer 25%igen wäßrigen Ammoniumlösung und 2 l Ethanol in einem Trenntrichter geschüttelt und dann 1 Stunde stehen gelassen. Nach dem Ablassen der unteren Ethanolscnicht, wurden der zurückbleibenden oberen Schicht 0,5 l destilliertes Wasser und 2 l Ethanol zugegeben und der Trichter wurde gründlich geschüttelt. Man ließ den Trichter 1 Stunde stehen und die obere n-Hexanschicht wurde gewonnen, welche auf einem Rotationsverdampfer unter einem verringerten Druck von 2,670 Pa (20 nunHg) bei 40ºC konzentriert wurde. Durch weiteres Eindampfen während einer Stunde bei 60ºC unter einem verringerten Druck von 667 Pa (5 mmHg) wurde das n-Hexan entfernt, wobei 249 g der öligen Fraktion zurückblieben, welche in 560 ml Aceton gelöst wurde. Nachdem man die Lösung 24 Stunden bei 5ºC stehen ließ, wurde das gebildete Präzipitat durch Filtration unter Absaugen auf einem G4-Glasfilter gewonnen. 194 g des vorstehenden Präzipitats wurden in 480 ml Aceton gelöst und man ließ die Lösung 24 Stunden bei 5ºC stehen. Das sich bildende Präzipitat wurde durch Filtration unter Absaugen auf einem G4-Glasfilter gewonnen. 127 g des Präzipitats wurden in 300 ml Aceton gelöst und man ließ die Lösung 24 Stunden bei 5ºC stehen. Das gebildete Präzipitat wurde durch Filtration unter Absaugen auf einem G4-Glasfilter gewonnen. Das Präzipitat wurde 24 Stunden unter einem verringerten Druck von 667 Pa (5 mmHg) behandelt, um das verbliebene Aceton abzudampfen, wobei 106 g des Fettprodukts erhalten wurden. 100 mg des vorstehenden Fetts wurden in 0,1 ml Methylenchlorld gelöst und durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographle (HPLC) auf einer ODS-Säule (YMC-Pack A312, 6 x 150 mm, Lieferant: Yamamura Kagaku Kenkyusho) analysiert. Zur Elution wurde ein Lösungsmittelgemisch aus Acetonitril, Tetrahydrofüran und Methylenchlorid (20 : 8 : 1, Vol./Vol.) bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 2 ml/Minute über die Säule geleitet während Peaks der einzelnen Fettkomponenten mit einem RI Detektor (Waters R401) ermittelt wurden. Ein im Handel erhaltliches Kakaobutterprodukt wurde mit den gleichen Methoden analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 aufgeführt. Tabelle 7 Zusammensetzung - Peakbereich (%) TG-Molekülarten Umgeestertes & fraktioniertes Fett Im Handel erhältliche Kakaobutter Anmerkung: DGs = Diglyceride, TG = Triglycerid, P = Palmitinsäure, O = Oleinsäure, S = Stearinsäure.
Die Tabelle 7 zeigt, daß POMF, wenn es qualitätsmäßig durch Umesterung verbessert wurde, gefolgt von Kühlen, Entfernen der freien Säuren als Ammoniumsalze und Fraktionierung, Kakaobutter in der Triglyceridzusammensetzung sehr ähnlich ist.

Beispiel 3

50 ml der aus einer DEAE-Toyopearl -immobilisierten Lipase PL-679-Säule ausströmenden Reaktionslösung wurde, gemäß dem Verfahren von Beispiel 1, 1 Stunde bei 60ºC auf einem Rotatationsverdampfer unter einem verringerten Druck von 6,670 Pa (50 mmHg) eingedampft, um das n-Hexan zu entfernen, wobei 9 g einer öligen Fraktion zurückblieben. 8,5 g der vorstehenden Fraktion wurden für eine Vakuumdestillation in einen 20 ml-Destillierkolben gefüllt, um-die freien Fettsäuren durch Erhitzen des Kolbens während 20 Minuten in einem Ölbad auf 240ºC zu entfernen, wobei der Innendruck durch Pumpen unter Durchsprudeln einer sehr kleinen Menge N&sub2;-Gas anhaltend auf 400 Pa (3 mmHg) verringert wurde. Nach der Destillation wurde der Rückstand unmittelbar mit Wasser gekühlt, wobei 4,3 g einer öligen Fraktion erhalten wurden, welche mit den gleichen in Beispiel 1 angewendeten Methoden auf Glyceridzusammensetzung, Fettsäurezusammensetzung der Triglyceride und Fettsäurezusammensetzurig an der 2-Position der Triglyceride untersucht wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 aufgeführt. Tabelle 8 : Fettsäureentfernung durch Destillation Glyceridzusammensetzung (%) Fettsäurezusammensetzung der TGs (%) Fettsäurezusammensetzung (%) an der 2-Position der TGs Vor der Destillation Nach der Destillation Anmerkung: TG = Triglyceride, DG = Diglyceride, FFA = Freie Fettsäuren.
Die Tabelle 8 zeigt, daß freie Fettsäuren praktisch ohne Umlagerungen der Fettsäurereste durch Destillation entfernt werden können.
Daneben wurden 40 g der, wie vorstehend durch Destillation hergestellten, öligen Fraktion in 90 ml Aceton gelöst und man ließ die Lösung 24 Stunden bei 5ºC stehen. Das sich bildende Präzipitat wurde auf einem G4-Glasfilter gewonnen und erneut in 90 ml Aceton gelöst, wobei die gleiche Behandlung insgesamt dreimal wiederholt wurde. Schließlich ergab das Abdampfen des Acetons unter einem verringerten Druck von 667 Pa (5 mmHg) bei Raumtemperatur 15,5 g Fett, welches durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) unter den gleichen Bedingungen, wie in Beispiel 2 erwähnt, analysiert wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 aufgeführt. Tabelle 9 : Molekülarten des umgeesterten Fettprodukts Zusammensetzung - Peakbereich (%) TG-Molekülarten Umgeestertes & fraktioniertes Fett Im Handel erhältliche Kakaobutter Anmerkung: DGs = Diglyceride, FFA = Freie Fettsäuren, TG = Triglycerid, P = Palmitinsäure, O = Oleinsäure S = Stearinsäure.
Die Tabelle 9 zeigt, daß POMF, wenn es qualitätsmäßig durch Umesterung verbessert wurde, gefolgt von Destillation, Entfernung der freien Fettsäuren und Fraktionierung, Kakaobutter in der Glyceridzusammensetzung sehr ähnlich ist.

Beispiel 4

Das gleiche kontinuierliche Verfahren, wie in Beispiel 1, wurde während 3 Tagen durchgeführt, wobei man 2 l der Reaktionslösung erhielt. Nach Zugabe von 14,8 g Calciumhydroxid und 400 ml destilliertem Wasser wurde die Lösung 12 Stunden bei 40ºC geschüttelt. Der durch Zentrifugation bei 1000 x g ausgefällte feste Rückstand wurde entfernt und der Überstand wurde neunmal der obigen Behandlung zur Entfernung der freien Fettsäuren unterzogen. Der zum Schluß erhaltene Überstand wurde auf einem Rotationsverdampfer konzentriert und weitere 24 Stunden unter einem verringerten Druck von 667 Pa (5 mmHg) getrocknet, wobei man 178 g der öligen Fraktion erhielt. Die vorstehende ölige Fraktion wurde in 400 ml Aceton gelöst, auf 40ºC erwärmt und 24 Stunden bei 30ºC gehalten. Das Präzipitat wurde auf einem G4-Glasfilter entfernt. Nachdem das Filtrat weitere 24 Stunden bei 5ºC gehalten wurde, wurde das Präzipitat auf einem G4-Glasfilter gewonnen. Das Präzipitat wurde erneut in 400 ml Aceton gelöst. Man hielt die Lösung 24 Stunden bei 5ºC und das Präzipitat wurde auf einem G4-Glasfilter gewonnen und mit 100 ml Aceton auf dem gleichen Glasfilter gewaschen. Das Abdampfen des verbliebenen Acetons unter einem verringerten Druck von 667 Pa (5 mniHg) ergab 54 g des gereinigten umgeesterten Fetts, welches, wie in Beispiel 2, durch HPLC analysiert wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 aufgeführt. Tabelle 10 Zusammensetzung - Peakbereich (%) TG-Molekülarten Andere Palmsamenöl Umgeestertes Fett Nach Säureentfernung Gereinigtes Fett Anmerkung: DGs = Diglyceride, FFA = Freie Fettsäuren, TG = Triglycerid, P = Palmitinsäure, O = Oleinsäure, S = Stearinsäure.

Kontrolle 1

2,5 g Lipase 3A (Lipase sp. 255 aus Mucor miehei, immobilisiert auf Duolit S76l, bezogen von Novo) wurden in 50 ml n-Hexan gelöst und die erhaltene Suspension wurde zum Packen in eine ummantelte 150 mm lange Säule mit einem Innendurchmesser von 10 mm gegossen.
Man ließ 6 g granuliertes Celit in 2 ml destilliertem Wasser einweichen und mit dieser Suspension wurde eine andere ummantelte 150 mm lange Säule mit einem Innendurchmesser von 10 mm als Vorsäule zur Einstellung des Feuchtigkeitsgehalts der Substratlösung gepackt. Die gleiche in Beispiel 1 verwendete Substratlösung wurde von unten bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 49,5 ml/Stunde in die obige Vorsäule geleitet und die daraus ausströmende Substratlösung wurde von unten in die obige immobilisierte Lipasesäule geleitet. Das Reaktionssystem wurde bei 45ºC gehalten. Die Reaktionslösung wurde mit den gleichen Methoden wie in Beispiel 1 auf die Fettsäurezusammensetzung der Triglyceride und die Glyceridzusammensetzung untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 aufgeführt. Tabelle 11: Umesterung durch Lipase 3A Tage C18:0 (%) in der Fettsäurezusammensetzsetzung der TGs TG (%) in der Glyceridzusammensetzung
Die Tabelle 11 zeigt, däß während des kontinuierlichen Verfahrens, welches durch die Lipase 3A unter der gleichen Bedingung katalysiert wurde, wie wenn das DEAE- Toyopearl -immobilisierte Lipase PL-679-Präparat verwendet wurde, das Enzym seine Aktivität zu schnell verliert, um umgeestertes Öl oder Fett kontinuierlich herzustellen, was durch die schnelle Abnahme des Fettsäureanteils von C&sub1;&sub8;:&sub0; in der Fettsäurezusammensetzung der Triglyceride angezeigt wird.

Beispiel 5

Das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß die Durchflußgeschwindigkeit der Substratlösung auf 40,9 ml/Stunde (SV = 3,5 Std&supmin;¹), 55,2 ml/Stunde (SV = 4,7 Std&supmin;¹), 97,2 ml/Stunde (SV = 8,3 Std&supmin;¹) oder 150,5 ml/Stunde (SV = 12,8 Std&supmin;¹) verändert wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 aufgeführt. Der Feuchtigkeitsgehalt der aus der immobilisierten Enzymsäule ausströmenden Reaktionslösung betrug unabhängig von der Durchflußgeschwindigkeit 200 ppm. Tabelle 12 : Umesterung bei unterschledlichen Durchflußgeschwindigkeiten Durchflußgeschwindigkeit ml/Stunde Tage SA (%) in der FS-Zusammensetzung der TGs OA (%) in der FS-Zusammensetzung an der 2-Position TGs (%) in der gesampten Zusammensetzung Prozentsatz der Umesterung Anmerkung: SA = Stearinsäure, OA = Oleinsäure, TG = Triglyceride, FS = Fettsäure.
Die Tabelle 12 zeigt, daß durch die Veränderung der Durchflußgeschwindigkeit der Substratlösung ein beliebiger Umesterungsprozentsatz ausgewählt werden kann. Die Halbwertszeit der Enzymaktivität bei der Umesterung betrug unabhängig von der Durchflußgeschwindigkeit der Substratlösung immer etwa 190 Tage. Die POMF-Menge, die 1 kg immobilisiertes Enzym während 380 Tagen, der doppelten Halbwertszeit dieses Enzympräparats, verarbeiten kann, wurde berechnet, indem der Prozentsatz der Umesterung nach diesem Beispiel auf 90%, 84%, 67% und 57% bzw. auf 94% gemäß Beispiel 1 festgesetzt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 13 aufgeführt. Tabelle 13: Prozentsatz der Umesterung im Vergleich zur Menge des als Rohstoff verwendeten Öls, das pro kg Enzympräparat verarbeitet wurde. Prozentsatz der Umesterung SV (Std&supmin;¹) Verarbeitetes Öl t/kg des immobilisierten Enzyms * * Immobilisiertes Enzym: DEAE-Toyopearl -immobilisierte Lipase PL-679 mit einer Aktivität von 100 000 U/g Träger.

Beispiel 6

Das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß die Temperatur des Reaktionssystems bei 50ºC gehalten wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 14 aufgeführt. Die aus der Reaktorsäule ausströmende Reaktionslösung wies einen konstanten Feuchtigkeitsgehalt von 310 ppm auf. Tabelle 14: Umesterung bei 50ºC Tage C18:0 (%) in der FS-Zusammensetzung der TGs C18:1 (%) an der 2-Position der TGs TGs (%) in der gesamten Zusammensetzung Prozentsatz der Umesterung Annierkung: FS = Fettsäure, TG = Triglyceride.
Die Tabelle 14 zeigt, daß, auch wenn die Temperatur des Reaktionssystems auf 50ºC erhöht wurde, die Umesterung so zufriedenstellend wie in Beispiel 1 ablief, wo die Temperatur des Reaktionssystems auf 45ºc eingestellt wurde.

Beispiel 7

2,5 g wasserfreies DEAE-Toyopearl -immobilisiertes Lipase PL-679-Präparat (100 000 U/g Träger) wurden in 50 ml n-Hexan suspendiert und die Suspension wurde zum Packen in eine uriunantelte 150 mm lange Säule mit einem Innendurchmesser von 10 mm gegossen. Daneben wurden 272,2 g Triolein und 200 g Trilaurin in 660 g n-Hexan gelöst. Das Gemisch wurde mit 1,59 g destilliertem Wasser geschüttelt. Die so hergestellte Substratlösung wies einen Feuchtigkeitsgehalt von 1400 ppm auf. Die mit dem DEAE- Toyopearl -immobilisierten Lipase PL-679-Präparat gepackte Reaktorsäule wurde mit der vorstehenden Substratlösung von unten bei einer Durchfiußgeschwindigkeit von 17,5 ml/Stunde beschickt, während die Temperatur des Reaktionssystems bei 45ºC gehalten wurde. Während der kontinuierlichen Beschickung der Säule während 9 aufeinanderfolgenden Tagen wurde die Reaktionslösung in Intervallen von 24 Stunden gesammelt und durch HPLC gemäß dem gleichen in Beispiel 2 angewendeten Verfahren auf ihre Triglyceridmolekülarten untersucht. Der Feuchtigkeitsgehalt der aus der Säule ausströmenden Reaktionslösung blieb konstant bei 450 ppm. Die Ergebnisse sind in Tabelle 15 aufgeführt. Tabelle 15: Triglyceridmolekülarten des umgeesterten Öls Relativer Peakbereich (%) TG-Molekülarten Substratlösung Tag Andere Anmerkung: L = Laurinsäure, O = Oleinsäure; Andere: Diglyceride, freie Fettsäuren, etc.
Die Tabelle 15 zeigt, daß zwischen den unterschiedlichen Triglyceriden Triolein und Trilaurin in einem kontinuierlichen Verfahren eine sehr zufriedenstellende Umesterung erfolgte.

Beispiel 8

Eine mit DEAE-Toyopearl -immobilisiertem Lipase PL-679-Präparat gepackte Reaktorsäule und eine Vorsäule zur Einstellung des Feuchtigkeitsgehalts der Substratlösung wurden gemäß dem in Beispiel 1 erwähnten Verfahren hergestellt.
177,2 g (5,6% Gew./Vol.) POMF und 141,8 g Stearinsäure (Stearinsäure/POMF = 0,8 Gew./Gew.) wurden in 1850 g n-Hexan gelöst und das Gemisch wurde mit 5 ml destilliertem Wasser geschüttelt. Man ließ das Gemisch 30 Minuten stehen und der Überstand wurde als Substratlösung verwendet. Die immobilisierte Enzymsäule wurde kontinuierlich während 9 aufeinanderfolgenden Tagen von unten bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 27,5 ml/Stunde mit der vorstehenden Substratlösung nach dem Lauf über die Vorsäule beschickt, wobei der Feuchtigkeitsgehalt der Lösung auf etwa 700 ppm eingestellt wurde. Wie in Beispiel 1 wurde der Prozentsatz der Umesterung bestimmt. Die Reaktionstemperatur betrug 45ºC. Die Ergebnisse sind in Tabelle 16 aufgeführt (Lauf Nr. 1).
Die gleiche Reaktion, wie vorstehend, wurde mit 265,8 g (8,4% Gew./Vol.) POMF und 212,7 g Stearinsäure, gelöst in 1735 g n-Hexan, wiederholt, um den dadurch erzielten Umesterungsprozentsatz annähernd zu berechnen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 16 aufgeführt (Lauf Nr. 2).
Ferner wurde die gleiche Reaktion mit 443 g (14,0% Gew./Vol.) POMF und 354,5 g Stearinsäure, gelöst in 1500 g n-Hexan, wiederholt, um den auf diese Weise erzielten Umesterungsprozentsatz annähernd zu berechnen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 16 aufgeführt (Lauf Nr. 4).
Außerdem wurde die gleiche Reaktion mit 354,5 g POMF und 212,7 g Stearinsäure (Stearinsäure/POMF = 0,6 Gew./Gew.), gelöst in 1670 g n-Hexan, wiederholt, um den auf diese Weise erzielten Umesterungsprozentsatz annähernd zu berechnen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 16 aufgeführt (Lauf Nr. 5).
Desweiteren wurde die gleiche Reaktion mit 354,4 g POMF und 141,8 g Stearinsäure (Stearinsäure/POMF = 0,4 Gew./Gew.), gelöst in 1720 g n-Hexan, wiederholt, wobei der auf diese Weise erzielte Umesterungsprozentsatz annähernd berechnet wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 16 aufgeführt (Lauf Nr. 6). Der Feuchtigkeitsgehalt der aus der Säule ausströmenden Reaktionslösung wurde immer bei einer konstanten Menge von 200 ppm gehalten. Tabelle 16: Prozentsatz der Umesterung Lauf Nr. POMF-Konzentration % (Gew./Vol.) Verhältnis von SS* zu POMF Gew. Prozentsatz der Umesterung * SS: Stearinsäure. Anmerkung: Bei Lauf Nr. 3 stimmte das Verfahren mit Beispiel 1 überein.
Die Tabelle 16 zeigt, daß, sogar wenn sowohl die POMF-Konzentration als auch das Verhältnis von Stearinsäure zu POMF unterschiedlich verändert wird, bei einem kontinuierlichen Verfahren eine sehr gleichmäßige Umesterung praktisch ohne Veränderung des Umesterungsprozentsatzes erfolgt.

Beispiel 9

50 g Sepabead FP-DA05 (Mitsubishi Chemical Industries Co., Ltd.) wurden zur Aktivierung 6 Stunden in 500 ml wäßrige 0,1 N NaOH-Lösung eingetaucht. Durch Filtration unter Absaugen wurden das aktivierte Sepabead auf Filterpapier Nr. 1 gesammelt und mit 2 l destilliertem Wasser gewaschen.
Ein Liter wäßrige 5%ige Lipase PL-679-Pulverlösung wurde 4 Stunden bei 4ºC unter Zugabe von 50 g des vorstehend aktivierten Sepaheads zur Immobiiisierung des Enzyms geschüttelt. Durch Filtration unter Absaugen wurde das immobilisierte Lipasepräparat auf Filterpapier Nr. 1 gesammelt und mit 2 l destilliertem Wasser gewaschen. Der Feuchtigkeitsentzug durch Gefriertrocknung unter verringertem Druck ergab 40 g wassertreies Sepabead FP-DA05-immobilisiertes Lipase PL-679-Präparat, das eine Aktivität von 14 000 U/g Träger aufwies.
10 g des obigen wasserfreien immobilisierten Lipase PL-679-Präparats wurden in 100 ml n-Hexan suspendiert und die Suspension wurden zum Packen in eine 150 mm lange Säule mit einem Innendurchmesser von 20 mm gegossen.
Außerdem wurden 7 g granuliertes Celit, welches man in 2,5 ml destilliertem Wasser einweichen ließ, in eine 150 mm lange Säule mit einem Innendurchmesser von 10 mm gegossen, um eine Vorsäule zur Einstellung des Feuchtigkeitsgehalts der Substratlösung bereitzustellen. Die gleiche wie in Beispiel 1 verwendete Substratlösung wurde dann über die Vorsäule geleitet und anschließend mit der gleichen Durchflußgeschwindigkeit von 27,5 ml/Stunde von unten über die immobilisierte Enzymsäule. Der Feuchtigkeitsgehalt der Substratlösung betrug 700 ppm bzw. 200 ppm am Einlaß bzw. Ausläß der immobili-5 sierten Enzymsäule. Das vorstehende Reaktionssystem wurde für eine kontinuierliche Umsetzung von 9 Tagen bei 45ºC gehalten. Die aus der Enzymsäule ausströmende Reaktionslösung wurde am ersten, vierten, siebten und neunten Tag gesammelt und mit den Methoden von Beispiel 1 auf die Glyceridzusammensetzung und die Fettsäurezusammensetzung der Triglyceride untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 17 aufgeführt. Tabelle 17 Tag Stearinsäure (%) in der Fettsäurezusammensetzung der TGs TG-Anteil (%) in der Glyceridzusammensetzung
Die Tabelle 17 zeigt, daß das Sepabead FP-DA05-immobilisierte Lipase PL-679-Präparat in einem kontinuierlichen Verfahren die Umesterung katalysieren kann.

Beispiel 10

15 g Duolit S761 wurden in 500 ml wäßrige 1 N NaOH-Lösung eingetaucht. Durch Filtration unter Absaugen wurde das Harz dann auf Filterpapier Nr. 1 gewonnen und mit 1 l destilliertem Wasser gewaschen bis der pH-Wert des Filtrates 6,0 erreichte. Die Filtration unter Absaugen wurde fortgesetzt bis das überschüssige Wasser aus dem Harz entfernt war. Das Harz wurde zu 300 ml einer wäßrigen 1%igen Lipase PL-679-Pulverlösung (welche eine Enzymaktivität von 300 000 U aufwies) gegeben. Die Lösung wurde anschließend 1 Stunde bei 4ºC geschüttelt und man ließ sie dann 12 Stunden stehen. Das gewonnene Harz war ein Duolit S761-immobiiisiertes Lipase PL-679-Präparat. Anhand der im Überstand verbliebenen Lipaseaktivität wurde festgestellt, daß das vorstehende immobilisierte Lipasepräparat eine Enzymaktivität von 1940 U/g wasserfreiem Harz besitzt.
Die Wiederholung des vorstehenden Verfahrens unter Verwendung von Duolft A587 anstelle von Duolit S761 ergab ein anderes immobilisiertes Lipase PL-679-Präparat mit einer Enzymaktivität von 1710 U/g wasserfreiem Harz.
Die Reaktion von Beispiel 1 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß entweder anstelle des DEAE-Toyopearl -immobilisierten Lipase PL-679-Präparats 2,5 g des einen oder des anderen vorstehenden immobilisierten Lipase PL-679-Präparats verwendet wurden, wobei der Prozentsatz der Umesterung annähernd berechnet wurde.
Ferner wurden 240 mg Lipase PL-679-Pulver und 2 g Celit zur Enzymimmobilisierung gleichmäßig vermischt. Die Reaktion von Beispiel 1 wurde unter Verwendung des vorstehenden immobilisierten Lipase PL-679-Präparats anstelle des DEAE-Toyopearl - Lipase PL-679-Präparats und unter Veränderung der Durchflußgeschwindigkeit auf 3,0 ml/Stunde (SV = 0,52 Std&supmin;¹) durchgeführt. Der auf diese Weise erzielte Umesterungsprozentsatz wurde annähernd berechnet. Die Reaktion von Beispiel 1 wurde außerdem unter Verwendung von 2,5 g Chitosan-immobilisiertem Lipase PL-679-Präparat, Prolacto - immobilisiertem Lipase PL-679-Präparat oder Celluloseacetat-immobilisiertem Lipase PL-679-Präparat, welche durch das vorstehend erwähnte Verfahren 2 hergestellt wurden, anstelle des DEAE-Toyopearl -immobilisierten Lipase PL-679-Präparats und unter Veränderung der Durchflußgeschwindigkeit auf 3,0 ml/Stunde (SV = 0,52 Std&supmin;¹) durchgeführt, wobei der Prozentsatz der Umesterung abgeschätzt wurde. Die Reaktion von Beispiel 1 wurde noch einmal unter Verwendung von 1 g Lipase PL-679-Pulver so wie es war durchgeführt, um den gleichen Parameter abzuschätzen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 18 aufgeführt. Tabelle 18 Träger Matrix Aktivität U/g Träger Prozentsatz der Umesterung Tag Duolit S761 Celit Chitosan Prolacto Celluloseacetat PL-679-Pulver allein Phenolformaldehyd
Die Tabelle 18 zeigt, daß die Celit-, Chitosan-, Prolacto - und Celluloseacetat-immobilisierten Lipase PL-679-Präparate sowie das Lipase PL-679-Pulver die Umesterung zufriedenstellend katalysieren.

Beispiel 11

Die Reaktion von Beispiel 1 wurde unter Verwendung von immobilisiertem Lipase PL-266-Präparat (10 000 U/g Träger), immobilisiertem Lipase AL-Präparat (10 000 U/g Träger) bzw. immobilisiertem Lipase PS-Präparat (10 000 U/g Träger), alle von DEAE- Toyopearl getragen, anstelle des DEAE-Toyopearl -immobilisierten Lipase PL-679- Präparats durchgeführt, wobei der in jedem Fall erzielte Prozentsatz der Umesterung annähernd berechnet wurde. Die gleiche Reaktion wie in Beispiel 1 wurde auch mit einem anderen DEAE-Toyopearl -immobilisierten Lipase PL-679-Präparat (100 000 U/g Träger) durchgeführt, um den vorstehenden Parameter abzuschätzen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 19 aufgeführt. Unabhängig davon, welche der vier vorstehenden immobilisierten Lipasepräparate verwendet wurde, wurde die Substratlösung bei einer gleichmäßigen Durchfiußgeschwindigkeit von 3,0 ml/Stunde eingeleitet und die aus der Säule ausströmende Reaktionslösung wies einen gleichmäßigen und konstanten Feuchtigkeitsgehalt von 210 ppm auf. Tabelle 19 Tage Prozentsatz der Umesterung Lipasetyp
Die Tabelle 19 zeigt, daß die Lipasen PL-266, AL und PS für die Umesterung in einem kontinuierlichen Verfahren anwendbar sind, wenn sie auf DEAE-Toyopearl -immobilisiert sind.

Beispiel 12

2,5 g DEAE-Toyopearl -immobilisiertes Lipase PL-679-Präparat (100 000 U/g Träger) wurden in 50 ml Olivenöl suspendiert und die Suspension wurden zum Packen in eine ummantelte 150 mm lange Säule mit einem Innendurchrnesser von 10 mm gegossen. Inzwischen wurden 250 g Olivenöl mit 100 g Caprinsäure auf 45ºC erwänt, um eine einheitliche Lösung zu erhalten, der für die Verwendung als Substratlösung außerdem 0,29 ml destilliertes Wasser zugegeben wurden (enthielt 1040 ppm Feuchtigkeit). Während das Reaktionssystem bei 40ºC gehalten wurde, wurde die vorstehende Substratlösung zur Beschickung der immobilisierten Enzymsäule mit einer Mikropumpe von unten bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 4,1 ml/Stunde in die Säule gepumpt. Die Reaktionslösung wurde in Intervallen von 24 Stunden gesammelt und unter Anwendung der gleichen in Beispiel 2 beschriebenen Methode mit HPLC auf die Molekülarten der Triglyceride untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 20 aufgeführt. Es wurde festgestellt, daß die aus der Säule ausströmende Reaktionslösung einen konstanten Feuchtigkeitsgehalt von 470 ppm aufwies. Tabelle 20 Tage TG-Molekülarten in der Reaktionslösung (%-Bereich) Substrat Anmerkung: O = Oleinsäure, C = Caprinsäure, Substrät = Olivenöl.
Die Tabelle 20 zeigt, daß das DEAE-Toyopearl -immobilisierte Lipase PL-679-Präparat für die Umesterung verwendbar ist, ohne daß ein organisches Lösungsmittel benötigt wird.

Beispiel 13

Die DEAE-Toyopearl -immobilisierte Lipase PL-679-Säule und die Vorsäule zur Einstellung des Feuchtigkeitsgehalts der Substratlösung wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt.
354,4 g POMF und 297,6 g Methylstearat wurden in 1600 g n-Hexan gelöst. Die Lösung wurde mit 5 ml destilliertem Wasser geschüttelt und dann ließ man die Lösung stehen, um den Überstand zu erhalten, welcher als Substratlösung verwendet wurde. Die Substratlösung wurde über die Vorsäuie geleitet, um den Feuchtigkeitsgehalt auf etwa 700 ppm einzustellen, und die Lösung wurde dann von unten bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 27,5 ml/Stunde während 9 aufeinanderfolgenden Tagen in die immobilisierte Säule eingeleitet. Alle nachfolgende Schritte wurden in Übereinstimmung mit Beispiel 1 ausgeführt und der Prozentsatz der Umesterung wurde annähernd berechnet. Die Reaktionstemperatur betrug 45ºC. Die Ergebnisse sind in Tabelle 21 aufgeführt.
Das gleiche vorstehende Verfahren wurde erneut durchgeführt, mit der Ausnahme, daß anstelle von 297,6 g Methylstearat entweder 311,5 g Ethylstearat oder 339,6 g Butylstearat verwendet wurden, um den erzielten Prozentsatz der Umesterung einzeln abzuschätzen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 21 aufgeführt. Die aus der Säule ausströmende Reaktionslösung wies einen konstanten Feuchtigkeitsgehalt von 260 ppm auf. Tabelle 21: Umesterung in Gegenwart eines Fettsäureesters Prozentsatz der Umesterung Tage Methylstearat Ethylstearat Butylstearat
Die Tabelle 21 zeigt, daß das DEAE-Toyopearl -immobilisierte Lipase PL-679-Präparat die Durchesterung von POMF mit einem Fettsäureester, wie Methylstearat, Ethylstearat oder Butylstearat, in einem kontinuierlichen Verfahren zufriedenstellend katalysieren kann.

Beispiel 14

Die DEAE-Toyopearl -immobilisierte Lipase PL-679-Säule und die Vorsäule zur Einstellung des Feuchtigkeitsgehalts der Substratlösung wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt.
350 g Olivenöl und 350 g Kokosnußöl wurden in 1600 g n-Hexan gelöst. Die Lösung wurde mit 5 ml destilliertem Wasser geschüttelt und anschließend ließ man die Lösung 30 Minuten stehen. Der Überstand, dessen Feuchtigkeitsgehalt 200 ppm betrug, wurde als Substratlösung verwendet. Nach dem Lauf über die Vorsäule erhöhte sich der Feuchtigkeitsgehalt der Substratlösung auf 550 ppm.
Die vorstehende immobilisierte Lipase PL-679-Säule wurde mit der aus der Vorsäule ausströmenden Substratlösung von unten bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 27,5 ml/Stunde (SV = 2,3 Std&supmin;¹) beschickt. Die Temperatur des Reaktionssystems wurde bei 45ºC gehalten. Die kontinuierliche Beschickung der Säule während 7 Tagen ergab 4,6 l der Reaktionslösung.
Die Triglyceridmolekülarten der Reaktionslösung wurden unter Anwendung der gleichen in Beispiel 2 beschriebenen Methode durch HPLC analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 20 aufgeführt. Die aus der Säule ausströmende Reaktionslösurig wies einen konstanten Feuchtigkeitsgehalt von 130 ppm auf. Tabelle 22: Triglyceridmolekülarten des umgeesterten Öls %-Bereich TG-Kohlenstoffatome Umgeestertes Öl Substrat (Olivenöl + Kokosnußöl) Zwischensumme
Die Tabelle 22 zeigt, daß das DEAE-Toyopearl -immobilisierte Lipase PL-679-Präparat die Umesterung eines Gemisches aus Olivenöl und Kokosnußöl in einem kontinuierlichen Verfahren katalysieren kann.

Beispiel 15

Eine DEAE-Toyopearl -immobilisierte Lipase PL-679-Säule und eine Vorsäule zur Einstellung des Feuchtigkeitsgehalts der Substratlösung wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt.
560 g Palmöl und 840 g Sojabohnenöl wurden in 3200 g n-Hexan gelöst. Die Lösung wurde mit 10 ml destilliertem Wasser geschüttelt und man ließ die Lösung anschließend 30 Minuten stehen. Der Überstand wurde als Substratlösung verwendet. Nach dem Lauf über die Vorsäule wies die Substratlösung einen Feuchtigkeitsgehalt von 500 ppm auf.
In Übereinstimmung mit Beispiel 14 wurde die Säule mit der vorstehenden Substratlösung während 7 Tagen kontinuierlich beschickt, wobei 4,6 l der Reaktionslösung erhalten wurden. Das Abdampfen von n-Hexan aus der Reaktionslösung auf einem Rotationsverdampfer unter einem verringerten Druck von 2,670 Pa (20 mmHg) ergab 1000 g des umgeesterten Öls, das sehr langsam innerhalb von 48 Stunden auf 5ºC abgekühlt wurde. Die sich bildenden Kristalle wurden bei der gleichen Temperatur abfiltriert. Das flüssige Öl wurde in einer Ausbeute von 85% hergestellt. In einem 24-Stunden-Kühltest in Eiswasser von 0ºC zeigte das vorstehende Öl kein Anzeichen einer Trübung. Dies bedeutet die Herstellung eines kälteresistenten umgeesterten Öls.
Außerdem wurden 560 g Palmöl und 840 g Rapsöl in 3200 g n-Hexan gelöst und der Lösung wurden 10 ml destilliertes Wasser zugegeben. Unter Verwendung des Überstandes wurde das obige Umesterungsverfahren erneut durchgeführt, wobei 1000 g eines umgeesterten Glyceridöls erhalten wurden. Der Feuchtigkeitsgehalt der Lösung betrug 500 bzw. 150 ppm am Einlaß bzw. am Auslaß der Säule. Das vorstehende umgeesterte Öl wurde sehr langsam innerhalb von 48 Stunden auf 5ºC abgekühlt. Die auf diese Weise gebildeten Kristalle wurden bei der gleichen Temperatur abfiltriert. Das flüssige Öl, welches einen 24-Stunden-Kühltest bestand, wurde in einer Ausbeute von 88% hergestellt. Auf diese Weise wurde ein umgeestertes Glyceridöl hergestellt, das eine zufriedenstellende Kälteresistenz aufwies.
Ferner wurden 700 g Rindertalg und 700 g Olivenöl in 3200 g n-Hexan gelöst und der Lösung wurden 10 ml destilliertes Wasser zugegeben. Unter Verwendung des Überstandes wurde das obige Umesterungsverfahren erneut durchgeführt, wobei 1000 g eines umgeesterten Glyceridöls erhalten wurden. Auch in diesem Fall betrug der Feuchtigkeitsgehalt der Lösung 500 bzw. 150 ppm am Einlaß bzw. am Ausläß der Säule. Das vorstehende umgeesterte Glyceridfett wies in einem Differential-Scanningkalorimeter (Metler) einen Schmelzpunkt von 23 bis 27ºC auf. Auf diese Weise könnte durch die Umesterung eines Gemisches aus Rindertalg (Schmelzpunkt 40 bis 50ºC) und Olivenöl (Schmelzpunkt -6ºC) ein neues Fett hergestellt worden sein.
Außerdem wurden 1400 g Schiolein (fraktioniertes Öl aus Schifett) in 3200 g n-Hexan gelöst und der Lösung wurden 10 ml destilliertes Wasser zugegeben. Unter Verwendung des Überstandes wurde das obige Umesterungsverfahren erneut durchgeführt, wobei 1000 g eines umgeesterten Fetts erhalten wurden. Auch in diesem Fall betrug der Feuchtigkeitsgehalt der Lösung 500 bzw. 150 ppm am Einlaß bzw. Ausläß der Säule. Die Triglyceridmolekülarten des vorstehenden umgeesterten Fetts wurden mit dem gleichen in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren durch HPLC analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 23 aufgeführt. Tabelle 23: Triglyceridmolekülarten TG-Molekülarten (%-Bereich) Andere Umgeestertes Schiolein Rohstoff Schiolein Aumerkung: S = Stearinsäure, O = Oleinsäure, Ln = Linolinsäure.
Die Tabelle 23 zeigt, däß Schiolein in einem kontinuierlichen Verfahren erfolgreich umgeestert wurde.

Beispiel 16

Eine DEAE-Toyopearl -immobilisierte Lipase PL-679-Säule und eine Vorsäule zur Einstellung des Feuchtigkeitsgehalts der Substratlösung wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt.
354,4 g Olivenöl und 204,8 g Palmitinsäure wurden in 1600 g n-Hexan gelöst. Die Lösung wurde mit 5 ml destilliertem Wasser geschüttelt und anschließend ließ man die 15 Lösung 30 Minuten stehen. Der Überstand wurde als Substratlösung verwendet. Die Substratlösung, deren Feuchtigkeitsgehalt durch den Lauf über die Vorsäule auf 700 ppm eingestellt wurde, wurde von unten bei einer Geschwindigkeit von 27,5 ml/Stunde in die vorstehende immobilisierte Lipasesäule eingeleitet. Die Reaktionslösung wurde in Intervallen von 24 Stunden gesammelt und unter Anwendung des gleichen wie in Beispiel 2 beschriebenen Verfahrens auf die Molekülarten der Triglyceride untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 24 aufgeführt. Die aus der Säule ausströmende Reaktionslösung wies einen konstanten Feuchtigkeitsgehalt von 200 ppm auf. Tabelle 24 TG-Molekülarten (%-Bereich) in der Reaktionslösung Tage Substrat Anmerkung: O = Oleinsäure, P = Palmitinsäure, Substrat = Olivenöl.
Anstelle von 204,8 g Palmitinsäure wurden bei der Wiederholung des obigen Verfahrens und der Analyse der Triglyceridmolekülarten 160 g Laurinsäure verwendet. Die aus der Säule ausströmende Reaktionslösung wies einen konstanten Feuchtigkeitsgehalt von 200 ppm auf. Die Ergebnisse sind in Tabelle 25 aufgeführt. Tabelle 25 TG-Molekülarten (%-Bereich) Tage Substrat Anmerkung: O = Oleinsäure, L = Laurinsäure, Substrat = Olivenöl.
Die Tabellen 24 und 25 zeigen, daß das DEAE-Toyopearl -immobilisierte Lipase PL-679-Präparat die Umesterung von Olivenöl mit einer Fettsäure, wie Palmitinsäure oder Laurinsäure, in einem kontinuierlichen Verfahren zufriedenstellend katalysieren kann.

Beispiel 17

30,2 g Kokosnußöl und 14,9 g Oleinsäure wurden in 144 g n-Hexan gelöst und der Lösung wurden weitere 0, 11 ml destilliertes Wasser zum vollständigen Durchschütteln zugegeben. Auf diese Weise wurde eine 600 ppm Feuchtigkeit enthaltende Substratlösung hergestellt.
Eine immobilisierte Enzymsäule, die, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt wurde, wurde dann mit der vorstehenden Substratlösung von unten bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 20 ml/Stunde beschlckt. Die Reaktion wurde 5 Tage bei 40ºC fortgesetzt. Aus dem Gesamtvolumen der Reaktionslösung wurde eine Probe von 0,1 ml entnommen und unter einem Strom von N&sub2;-Gas getrocknet. Nach Zugabe von 0,2 ml TMS1-H (Lieferant: Gaschro Kogyo) wurde der feste Rückstand zur Trimethylsilylierung 15 Minuten bei 60ºC erhltzt. Die trimethylsilylisierte Probe wurde durch Gaschromatographle analysiert. Die vorstehende Probe wurde auf einer 1 m langen Säule mit einem Innendurchniesser von 3 mm, gepackt mit einem JXR-Silikon-3%-Packmaterial (Träger: Chromosorb WAW.DMCS, bezogen von Gaschro Kogyo), bei einer Säulentemperatur von 350ºC mit einem Trägergas (N2) chromatographlert, welches mit einer Geschwindigkeit von 40 ml/Stunde eingeleitet wurde, um die einzeinen Komponenten für den Nachweis mit einem Wasserstofflammen-Ionisierungsdetektor zu isolieren. Die Ergebnisse sind in Tabelle 26 aufgeführt. Tabelle 26 Triglyceridzusanimensetzung (% Gew./Gew.) Anzanl der Kohlenstoffatome Andere Umgeestertes Öl Kokosnußöl

Beispiel 18

42,2 g Rindertalg und 6,4 g Arachidonsäure wurden in 211 g n-Hexan als Substratlösung gelöst.
Gemäß Beispiel 1 wurde die vorstehende Substratlösung über die Vorsäule geleitet und anschließend von unten bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 15 ml/Stunde in eine immobilisierte Enzymsäule eingeleitet. Die Reaktion wurde 3 Tage bei 40ºC fortgesetzt. Gemäß Beispiel 1 wurde die Reaktionslösung gesammelt und zwar jeweils 1 ml in Intervallen von 24 Stunden. Diese Proben wurden mit Gaschromatog?aphie auf die Fettsäurezusammensetzung der Triglyceride untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 27 aufgeführt. Tabelle 27 Fettsäurezusammensetzung (% Gew./Gew.) der Triglyceride Anmerkung: PA = Palmitinsäure, SA = Stearinsäure, OA = Oleinsäure, AA = Arachidonsäure.
Die Tabelle 27 zeigt, daß es möglich ist, gemäß dem effindungsgemäßen kontinuierlichen Umesterungsverfahren stark ungesättigte Fettsäuren in Glyceridmoleküle einzufüren.

Beispiel 19

302,4 g Kokosnußöl, 144,2 g Caprylsäure und 86,1 g Capronsäure wurden in 407 g 30 n-Hexan gelöst und zur Herstellung einer 600 ppm Feuchtigkeit enthaltenden Substratlösung wurden außerdem 0,55 ml destilliertes Wasser zugegeben.
Gemäß Beispiel 1 wurde eine immobilisierte Enzymsäule mit der vorstehenden Substratlösung von unten bei einer Geschwindigkeit von 10 ml/Stunde beschickt. Die Reaktion wurde 3 Tage bei 40ºC fortgesetzt. Aus dem Gesamtvolumen der Reaktionslösung wurde für die gleiche in Beispiel 17 durchgeführte Analyse eine Probe von 0,1 ml entnommen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 28 aufgeführt. Tabelle 28 Triglyceridzusammensetzung (% Gew./Gew.) Anzahl der Kohlenstoffatome und mehr Durchgeestertes Kokosnußöl Rohes Kokosnußöl

Beispiel 20

40 g DEAE-Toyopearl -immobilisiertes Lipase PL-679-Präparat (100 000 U/g Träger, Feuchtigkeitsgehalt: 0,5%) wurde in n-Hexan suspendiert und zum Packen in eine ummantelte 500 mm lange Säule mit einem Innendurchniesser von 15 mm gegossen. Inzwischen wurden 38 g granuliertes Celit, nachdem man es in 30 g destilliertem Wasser einweichen ließ, in eine andere ummantelte Säule mit den gleichen Maßen gegossen, welche als Vorsäule zur Einstellung des Feuchtigkeitsgehalts der Substratlösung verwendet wurde.
Zur Herstellung der Substratlösung wurden 1140 g POMF und 911 g Stearinsäure in 7800 ml n-Hexan gelöst. Es wurde festgestellt, daß die Substratlösung 120 ppm Feuchtigkeit enthielt. Ein Teil der Substratlösung wurde mit einer Mikropumpe bei einer Geschwindigkeit von 155 ml/Stunde von unten in die Vorsäule gepumpt, um den Feuchtigkeitsgehalt davon vor dem Eintreten in eine 50 nun lange Säule mit einem Innendurchmesser von 10 mm auf 750 ppm einzustellen, welche mit Glasperlen von 1 mm Durchrnesser gepackt war, um die den Rest der Substratlösung, der mit einer Mikropumpe bei einer Durchfiußgeschwindigkeit von 135 ml/Stunde gepumpt wurde, direkt in die vorstehende Glasperlensäule einzuleiten. Eine 400 ppm Feuchtigkeit enthaltende Substratlösung, welche aus der vorstehenden Glasperlensäule ausfloß, wurde zur Reaktion bei 50ºC von oben in die immobilisierte Lipasesäule gegossen. Auf diese Weise wurde das kontinuierliche Umesterungsverfahren gestartet.
In den ersten 3 Tagen, während denen die Durchflußgeschwindigkeit der Substratlösung bei 290 ml/Stunde gehalten wurden, wurde die Reaktionslösung in Intervallen von 24 Stunden gesammelt, um den erzielten Prozentsatz der Umesterung durch das gleiche in Beispiel 1 angewendete Verfahren zu bestimmen. Für den Prozentsatz der Umesterung wurde ein Durchschnitt von 98% abgeschätzt. Ab dem vierten Tag wurde die Durchflußgeschwindigkeit langsam von 290 ml/Stunde am Ende einer weiteren Umsetzung von 90 Tagen auf 206 ml/Stunde verringert. Es wurde festgestellt, daß sich der Prozentsatz der Umesterung während diesem Zeitraum von 90 Tagen in einem Bereich von 97,5 bis 98,5% bewegte. Ab dem vierten Tag wurde die Reaktionslösung für die gleiche vorstehende Analyse in Intervallen von 3 Tagen gesammelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 29 aufgeführt.
Die Figur 2 ist ein Flußdiagramm des Verfahrens dieses Beispiels, worin bedeuten: A - Substratlösungstank, B und C = Miktopumpen, D = Vorsäule zur Einstellung des Feuchtigkeitsgehalts der Substratlösung, E = regulierbares Mischgerät, F = Reaktorsäule, 10 gepackt mit immobilisierter Lipase, und G = Produkttank. Die Mikropumpe B wird eingesetzt, um die ursprüngliche Substratlösung der Lösung zuzugeben, deren Feuchtigkeitsgehalt durch den Lauf über die Vorsäule eingestellt wird, um den Feuchtigkeitsgehalt der Substratlösung wieder auf ein beliebiges Niveau einzustellen. Tabelle 29 Tage Durchflußgeschwindigkeit der Substratlösung (ml/Std.) % Umesterung TG-Anteil (%) Feuchtigkeit (ppm) der Substratlösung am Säulenauslaß

Beispiel 21

10 g DEAE-Toyopearl -immobilisiertes Lipase PL-679-Präparat (100 000 U/g Träger) wurden in 100 ml Olivenöl suspendiert und die Suspension wurde in eine 200 mm lange Säule mit einem Innendurchmesser von 15 mm gegossen. 120 g Stearinsäure wurden mit 0,18 g destilliertem Wasser in 150 g Olivenöl gelöst, um eine 970 ppm Feuchtigkeit enthaltende Substratlösung zu erhalten. Die immobilisierte Enzymsäule wurde mit der vorstehenden Substratlösung von oben bei einer Durchflußgeschwindigkejt von 12 g/Stunde beschlckt, während das gesamte Reaktionssystem bei 75ºC gehalten wurde. Die Reaktionsiösung wurde in Intervallen von 24 Stunden gesanrnelt und auf die Molekülarten der Triglyceride wurden mit dem gleichen in Beispiel 2 angewandten Verfahren durch HPLC untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 30 aufgeführt. Die aus der Säule ausströmende Reaktionslösung wies einen konstanten Feuchtigkeitsgehalt von 180 ppm auf. Tabelle 30 TG-Molekülarten (%-Bereich) in der Reaktionslösung Tage Substrat Anmerkung: O = Oleinsäure, S = Stearinsäure, Substrat = Olivenöl.

Claims

1. Kontinulerllches Verfahren zur Umesterung von Öl oder Fett durch Behandlung des Öls oder Fetts in Gegenwart einer Fettsäure mit 6 bis 22 Kohlenstoffatomen oder eines von einer Fettsäure mit 6 bis 22 Kohlenstoffatomen abgeleiteten Fettsäureesters oder eines anderen Öls oder Fetts in einer Reaktorsäule, welche mit einem 0 bis 5 % Feuchtigkeit enthaltenden Enzympräparat gepackt ist. dadurch gekennzeichnet, daß das Enzympräparat aus einer alkalischen hochmolekulargewichtlgen Lipase aufgebaut ist, welche ein Molekulargewlcht von 100 000 oder mehr und einen optimalen pH von 8,0 odermehrbesltzt und 1,3-Positionsspezifltät aufweist, und mit einer Substratlösung, welche sich aus dem Öl oder Fett und der Fettsäure oder dem Fettsäureester oder anderen Öl oder Fett zusammensetzt, zum Zwecke einer kontinuierlichen Reaktion In der Weise beschickt wird, daß der Feuchtigkeitsgehalt der Substratlösung so eingestellt wird, daß sie 100 bis 1800 ppm Feuchtigkeit bzw. 50 bis 800 ppm Feuchtigkeit am Einlaß bzw. Auslaß der Säule enthält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Reaktion ohne eine Behandlung zur Dehydratatlon voranschreitet.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das alkallsche hochmolekulargewichtige Lipasepräparat entweder ein alkalisch es hochmolekulargewichtiges Lipaseprodukt selbst oder ein immobllisiertes alkalisches hochmolekulargewichtiges Lipasepräparat ist, welches durch Binden an ein Ionenaustauscherharz oder durch Vermischen mit Proteinen. Zuckern und/oder Mineralton und Trocknen hergestellt worden ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Ionenaustauscherharz strukturell auf einem schwach sauren Methacrylionenaustauscherharz basiert.

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die alkallsche hochmolekulargewichtige Lipase ein durch Alcaligenes, Achromobacter oder Pseudomonasbakterien produziertes Enzym ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die kontinuierliche Reaktion bei Temperaturen bis zu 80ºC stattfindet.

7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Feuchtigkeitsgehalt des Lipasepräparats durch Gefriertrocknung eingestellt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei eine durch die Reaktion gebildete Lösung eines umgeesterten Öls oder Fetts abgekühlt wird, um Komponenten mit höheren Schmelzpunkten zur Entfernung oder Isolation auszufällen.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei ein Alkalimittel zu der Lösung des umgeesterten Öls oder Fetts gegeben wird, um freie Fettsäuren als Seife zu entfernen.

10. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Lösung des umgeesterten Öls oder Fetts unter verringertem Druck destilliert oder über eine Membran filtriert wird, um zur Gewinnung einer lösungsmittelfreien umgeesterten Öl- oder Fettfraktion Lösungsmittel zu entfernen.

11. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die lösungsmittelfrele umgeesterte Öloder Fettfraktion zur Reinigung erneut in einem organischen Lösungsmittel gelöst und gekühlt wird, um umgeestertes Öl oder Fett auszufällen.

12. Verfahren nach Anspruch 1 oder 10, wobei die lösungsmittelfreie umgeesterte Öl- oder Fettfraktion destilllert wird, um freie Fettsäuren zu entfernen und ein gereinigtes umgeestertes Öl oder Fett zurückzulassen.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei das gereinigte Öl oder Fett zur weiteren Fraktlonierung und Reinigung erneut in einem organischen Lösungsmittel gelöst und durch Kühlen ausgefällt wird.