DE3851325T2 - Mutant resistant to the cell membrane synthesis inhibitor and process for its preparation. - Google Patents
Mutant resistant to the cell membrane synthesis inhibitor and process for its preparation.Info
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Description
Die Erfindung betrifft eine Mutante, die gegen einen Zellmembransynthese-Inhibitor resistent ist, und insbesondere eine gegen den Zellmembransynthese-Inhibitor resistente Mutante eines zur Gattung Bacillus gehörenden, extrazellulares Enzym erzeugenden Mikroorganismus, wie beispielsweise Cellulase-, Protease- oder Amylase-erzeugenden Mikroorganismus der Gattung Bacillus. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung einer derartigen Mutanten.The invention relates to a mutant resistant to a cell membrane synthesis inhibitor, and in particular to a mutant resistant to the cell membrane synthesis inhibitor of an extracellular enzyme-producing microorganism belonging to the genus Bacillus, such as a cellulase-, protease- or amylase-producing microorganism of the genus Bacillus. The invention also relates to a method for producing such a mutant.
Unter Cellulase wird eine Gruppe von komplizierten Enzymen verstanden, welche enzymatische Reaktionen katalysieren, wodurch die Cellulose in Glucose, Cellobiose oder sogar in Cello- Oligosaccharide zersetzt wird. Je nach den Funktionen umfaßt der Begriff Enzyme, wie beispielsweise Cx-Cellulase (CMC-Ase oder Endo-β-1,4-Glucanase), C&sub1;-Cellulase (Cellobiohydrolase oder Exo-β-1,4-Glucanase) und β-Glucosidase (Cellobiose β-1,4- Glucosidase) und dergl.Cellulase refers to a group of complex enzymes that catalyze enzymatic reactions, breaking down cellulose into glucose, cellobiose or even cello-oligosaccharides. Depending on their functions, the term includes enzymes such as Cx-cellulase (CMC-ase or endo-β-1,4-glucanase), C1-cellulase (cellobiohydrolase or exo-β-1,4-glucanase) and β-glucosidase (cellobiose β-1,4-glucosidase) and the like.
Die konventionellen Untersuchungen an Cellulase wurden hauptsächlich auf die effektive Nutzung von Biomassen-Vorräten gerichtet. Aus diesem Grund waren bisher die Hauptquellen von Cellulase Pilze, die beispielsweise zu Gattungen wie Trichoderma, Aspergillus, Acremonium, Humichola und dergl. gehören.Conventional research on cellulase has been mainly focused on the effective use of biomass resources. For this reason, the main sources of cellulase have been fungi belonging to genera such as Trichoderma, Aspergillus, Acremonium, Humichola and the like.
Jüngste Entwicklungen einer neuen Anwendung von Cellulase als Additiv zu Detergentien zum Waschen von Wäsche haben die Versorgung mit alkalischen Cellulasen erforderlich gemacht, welche eine bessere Stabilität und ein Maximum der Aktivität bei einem pH auf der alkalischen Seite zeigen, auf der das Waschen von Wäsche mit besserer Effizienz durchgeführt wird.Recent developments in a new application of cellulase as an additive to laundry detergents have increased the supply with alkaline cellulases, which show better stability and a maximum of activity at a pH on the alkaline side, where the washing of laundry is carried out with better efficiency.
Man kennt verschiedene Verfahren zur Erzeugung von alkalischer Cellulase. Bis vor kurzem waren typische derartige Verfahren ein Verfahren zur Sammlung von Cellulase A aus einer Kulturbrühe eines alkalophilen Mikroorganismus der Gattung Bacillus (japanische Patentoffenlegung Nr. 28515/1985), ein Verfahren zur Erzeugung alkalischer Cellulase 301-A durch Kultivierung eines Mikroorganismus der Gattung Cellulomonas (japanische Patentoffenlegung Nr. 224686/1983) ein Verfahren zur Erzeugung von Carboxymethylcellulase durch Kultivierung eines alkalophilen Stamms Bacillus sp. Nr. 1139 [Fukumori F., Kudo T., und Horikoshi K.; J. Gen. Microbiol., 131, 3339 (1985)], ein Verfahren zur Erzeugung von alkalischer Cellulase unter Verwendung eines Mikroorganismus, der zu Streptomyces gehört (japanische Patentoffenlegung Nr. 19483/1986). Die bei diesen Verfahren verwendeten Mikroorganismen hatten nur eine geringe Produktivität für alkalische Cellulase und die Verfahren sind somit nicht für industrielle Anwendung geeignet.Various methods for producing alkaline cellulase are known. Until recently, typical such methods were a method for collecting cellulase A from a culture broth of an alkalophilic microorganism of the genus Bacillus (Japanese Patent Laid-Open No. 28515/1985), a method for producing alkaline cellulase 301-A by culturing a microorganism of the genus Cellulomonas (Japanese Patent Laid-Open No. 224686/1983), a method for producing carboxymethyl cellulase by culturing an alkalophilic strain Bacillus sp. No. 1139 [Fukumori F., Kudo T., and Horikoshi K.; J. Gen. Microbiol., 131, 3339 (1985)], a process for producing alkaline cellulase using a microorganism belonging to Streptomyces (Japanese Patent Laid-Open No. 19483/1986). The microorganisms used in these processes had only a low productivity for alkaline cellulase and the processes are thus not suitable for industrial application.
Im Hinblick auf diese Situation haben die Erfinder umfangreiche Untersuchungen durchgeführt mit dem Ziel, einen Mikroorganismus zu erhalten, der eine bessere Produktivität für alkalische Cellulase aufweist. Dabei wurden von den Erfindern bereits früher verschiedene neue Mikroorganismen mit überlegener Fähigkeit zur Erzeugung von alkalischer Cellulase entdeckt, einschließlich Bacillus sp. KSM-635 (Ferm 8872). Es wurden Patentanmeldungen auf diese Mikroorganismen gerichtet (japanische Patentanmeldung Nr. 257775/1986 und andere).In view of this situation, the inventors have conducted extensive studies with the aim of obtaining a microorganism having superior productivity for alkaline cellulase. Various new microorganisms having superior ability to produce alkaline cellulase, including Bacillus sp. KSM-635 (Ferm 8872), have previously been discovered by the inventors. Patent applications have been directed to these microorganisms (Japanese Patent Application No. 257775/1986 and others).
Die Formulierung von Protease zu Waschmitteln wird seit langem praktiziert. Frühere Praxis war es, in Waschmitteln Protease mit einem optimalen pH nahe dem neutralen Bereich zu formulieren, beispielsweise Papain, Pancreas Trypsin oder dergl. Ähnlich wie bei Cellulase wird jedoch für die Waschmittelverwendung eine Protease gewünscht, deren optimaler pH auf der alkalischen Seite liegt und die in oberflächenaktiven Mitteln stabil ist. Die Entwicklung einer derartigen Protease wurde in Angriff genommen.The formulation of protease in detergents has been practiced for a long time. Previous practice was to add protease with an optimum pH close to neutral, for example papain, pancreatic trypsin or the like. However, similar to cellulase, a protease is desired for detergent use whose optimum pH is on the alkaline side and which is stable in surfactants. The development of such a protease has been initiated.
Typische alkalische Proteasen, die für Waschmittelzwecke verwendet werden, sind Alkalase, Savinase, Esperase (hergestellt von Novo Industries Co.), Maxatase (hergestellt von Gist Brocades Co.), und dergl. Die optimale Reaktionstemperatur für diese Enzyme liegt in der Nähe von 60ºC und somit in Übereinstimmung mit der Waschpraxis in einigen Gebieten wie beispielsweise in europäischen Ländern und den USA.Typical alkaline proteases used for detergent purposes are Alkalase, Savinase, Esperase (manufactured by Novo Industries Co.), Maxatase (manufactured by Gist Brocades Co.), and the like. The optimum reaction temperature for these enzymes is near 60ºC, which is in accordance with the washing practice in some areas such as European countries and the United States.
In anderen Regionen wird jedoch das Waschen in der Nähe von Zimmertemperatur durchgeführt und es wird eine Versorgung mit Protease gewünscht, welche eine starke Aktivität bei einer Temperatur hat, die unterhalb derjenigen liegt, bei der herkömmliche Protease aktiv ist. Ferner besteht im Hinblick auf das Allgemeinwissen, daß eine Protease mit einer überlegenen Fähigkeit zur Zersetzung von unlöslichen Proteinen, wie beispielsweise Keratin, zur Waschwirkung beitragen kann [Minagawa M; Sensho-shi (J. Jpn. Res. Assn. Text. End-Uses, 26, 322 (1985)], der Wunsch, eine Protease mit überlegener Fähigkeit zur Zersetzung von unlöslichem Protein zu entwickeln.In other regions, however, washing is carried out near room temperature and a supply of protease having strong activity at a temperature lower than that at which conventional protease is active is desired. Furthermore, in view of the general knowledge that a protease having superior ability to decompose insoluble proteins such as keratin can contribute to the washing effect [Minagawa M; Sensho-shi (J. Jpn. Res. Assn. Text. End-Uses, 26, 322 (1985)], it is desired to develop a protease having superior ability to decompose insoluble protein.
Die Erfinder haben umfangreiche Untersuchungen durchgeführt mit dem Ziel, eine alkalische Protease mit Fähigkeit zur Keratinzersetzung zu erhalten, die eine niedrige optimale Temperatur hat, d. h. eine hoher Aktivität bei niedrigen Temperaturen zeigt. Dabei wurde eine Gruppe von Mikroorganismen einschließlich Bacillus sp. KSM-2001 (Ferm P-9449) entdeckt, welche diese Anforderung erfüllt. Die Erfinder haben auf diese Untersuchungsergebnisse bereits eine Patentanmeldung gerichtet (japanische Patentanmeldung Nr. 261487/1987).The inventors have conducted extensive research with the aim of obtaining an alkaline protease with keratin decomposition capability having a low optimum temperature, i.e. showing high activity at low temperatures. A group of microorganisms including Bacillus sp. KSM-2001 (Ferm P-9449) has been discovered which meets this requirement. The inventors have based their A patent application has already been filed based on the results of the investigation (Japanese Patent Application No. 261487/1987).
Man hat auch Amylase, welche Fähigkeit zur Hydrolyse von Stärke hat, als Waschmittelkomponente in Betracht gezogen, da Stärke in dem Schmutz von Nahrungsmitteln und dergl. im Überfluß vorkommt. Beispiele bekannter Amylasen sind neutrale Amylase, die beispielsweise von Bacillus amyloliquefaciens erzeugt wird [N. E. Welker and L. L. Cambell; J. Bacteriol., 94, 1124, (1967)], hitzeresistente Amylase, die beispielsweise von Bacillus licheniformis erzeugt wird (japanische offengelegte Patentanmeldung Nr. 37094/1986), alkalische Amylase, die beispielsweise von Bacillus ohbensis erzeugt wird (japanische Patentpublikation Nr. 31949/1977), und dergl. Die Entwicklung der neuen, oben erwähnten Mikroorganismen hat es möglich gemacht, extrazellulare Enzyme für die praktische Anwendung zu erzeugen. Für den Zweck der industriellen Produktion besteht jedoch nach wie vor ein Bedarf nach der weiteren Entwicklung von anderen als den oben erwähnten Mikroorganismen, welche extrazellulares Enzym erzeugen können, sowie hinsichtlich der Verbesserung bei der Produktivität von extrazellularem Enzym durch Mikroorganismen.Amylase, which has the ability to hydrolyze starch, has also been considered as a detergent component, since starch is found in abundance in the soil of foodstuffs, etc. Examples of known amylases are neutral amylase, which is produced, for example, by Bacillus amyloliquefaciens [N. E. Welker and L. L. Cambell; J. Bacteriol., 94, 1124, (1967)], heat-resistant amylase produced by, for example, Bacillus licheniformis (Japanese Patent Application Laid-Open No. 37094/1986), alkaline amylase produced by, for example, Bacillus ohbensis (Japanese Patent Publication No. 31949/1977), and the like. The development of the new microorganisms mentioned above has made it possible to produce extracellular enzymes for practical use. However, for the purpose of industrial production, there is still a need for further development of microorganisms other than those mentioned above which can produce extracellular enzyme, as well as for improvement in productivity of extracellular enzyme by microorganisms.
Die Produktion von extrazellularer α-Amylase in Bacillus subtilis wurde untersucht von Hitotsyanagi, K. et al, (1979) Agric. Biol. Chem. 43(11) pp. 2343-2349. Dieses Dokument beschreibt Mutanten, die gegen D-Cycloserin und Ampicillinstämme resistent sind.The production of extracellular α-amylase in Bacillus subtilis was studied by Hitotsyanagi, K. et al, (1979) Agric. Biol. Chem. 43(11) pp. 2343-2349. This paper describes mutants resistant to D-cycloserine and ampicillin strains.
Bei diesem Sachverhalt haben die Erfinder umfangreiche Untersuchungen zur Verbesserung der Produktivität von extrazellularen Enzymen, insbesondere mittels Mutation, unternommen und haben dabei festgestellt, daß eine bemerkenswerte Produktivitätsverbesserung erhalten wird, indem man extrazellulares Enzym erzeugende Mikroorganismen, die zur Gattung Bacillus gehören, mit Resistenz gegenüber Zellmembransynthese-Inhibitor- Antibiotika ausstattet. Dieses Ergebnis hat zur vorliegenden Erfindung geführt.In this situation, the inventors have made extensive studies on improving the productivity of extracellular enzymes, particularly by means of mutation, and have found that a remarkable improvement in productivity is obtained by using extracellular enzyme-producing microorganisms belonging to the genus Bacillus with resistance to cell membrane synthesis inhibitor antibiotics. This result has led to the present invention.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist somit die Schaffung einer Mutanten eines extrazellulares Enzym erzeugenden Mikroorganismus der Gattung Bacillus, die gegen einen Zellmembransynthese-Inhibitor resistent ist, wie in Anspruch 1 definiert.The object of the present invention is therefore to create a mutant of an extracellular enzyme-producing microorganism of the genus Bacillus which is resistant to a cell membrane synthesis inhibitor as defined in claim 1.
Weiteres Ziel der Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens zur Erzeugung einer gegen den Zellmembransynthese-Inhibitor resistenten Mutante eines extrazellulares Enzym erzeugenden Mikroorganismus der Gattung Bacillus, wie in Anspruch 1 definiert, umfassend die Durchführung einer Mutationsbehandlung bei einem extrazellulares Enzym erzeugenden Mikroorganismus und Kultivierung dieses Mikroorganismus in einem Kulturmedium, das Vancomycin oder Ristocetin als einen Zellmembransynthese- Inhibitor enthält.Another object of the invention is to provide a method for producing a mutant of an extracellular enzyme-producing microorganism of the genus Bacillus resistant to the cell membrane synthesis inhibitor as defined in claim 1, comprising subjecting an extracellular enzyme-producing microorganism to a mutation treatment and culturing said microorganism in a culture medium containing vancomycin or ristocetin as a cell membrane synthesis inhibitor.
Ein Zellmembransynthese-Inhibitor, wie er bei dieser Erfindung verwendet wird, ist als eine Substanz definiert, welche den Lipidzyklus, der bei der Zellmembransynthese in einem Mikroorganismus involviert ist, inhibiert. Die folgenden Antibiotika seien als Beispiele für derartige Substanzen angegeben:A cell membrane synthesis inhibitor as used in this invention is defined as a substance which inhibits the lipid cycle involved in cell membrane synthesis in a microorganism. The following antibiotics are given as examples of such substances:
Vancomycin, Ristocetin: Diese Substanzen inhibieren die Polymerisationsreaktion von Undecaprenol-PP-MurNAc(-GlcNAc)-Peptid, einem Lipidzwischenprodukt zur Erzeugung eines linearen Glycopeptids [Anderson, J.S. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 53 881 (1965); Lugtenberg, E.J.J. et al, J. Bacteriol., 108, 20 (1971)].Vancomycin, ristocetin: These substances inhibit the polymerization reaction of undecaprenol-PP-MurNAc(-GlcNAc)-peptide, a lipid intermediate for the production of a linear glycopeptide [Anderson, J.S. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 53 881 (1965); Lugtenberg, E.J.J. et al, J. Bacteriol., 108, 20 (1971)].
Die gegen den Zellmembransynthese-Inhibitor resistente Mutante eines Enzym-erzeugenden Mikroorganismus der Gattung Bacillus der vorliegenden Erfindung (eine derartige Mutante wird im folgenden einfach als "Inhibitor-resistente Mutante" bezeichnet) kann erzeugt werden durch Induzierung von Mutation in einem extrazellulares Enzym erzeugenden Mikroorganismus der Gattung Bacillus (im folgenden als "Elternstamm" bezeichnet), und zwar durch herkömmliche Methoden, wie beispielsweise Einwirkung eines mutagenen Mittels auf den Elternstamm oder Bestrahlung mit UV-Strahlen oder radioaktiven Strahlen, Kultivierung der so erzeugten Mutante in einem Kulturmedium, das den Zellmembransynthese-Inhibitor Vancomycin oder Ristocetin mit einer hohen Konzentration enthält, und Sammlung der Zellen, die gegen den Zellmembransynthese-Inhibitor resistent sind.The cell membrane synthesis inhibitor-resistant mutant of an enzyme-producing microorganism of the genus Bacillus of the present invention (such a mutant is described in An inhibitor-resistant mutant (hereinafter referred to simply as "inhibitor-resistant mutant") can be produced by inducing mutation in an extracellular enzyme-producing microorganism of the genus Bacillus (hereinafter referred to as "parent strain") by conventional methods such as subjecting the parent strain to a mutagenic agent or irradiating it with ultraviolet rays or radioactive rays, culturing the mutant thus produced in a culture medium containing the cell membrane synthesis inhibitor vancomycin or ristocetin at a high concentration, and collecting the cells resistant to the cell membrane synthesis inhibitor.
Als Elternstamm können beliebige Mikroorganismen der Gattung Bacillus mit der Fähigkeit zur Erzeugung von extrazellularem Enzym verwendet werden. Bevorzugte Elternstämme sind Cellulase- Protease- oder Amylase-erzeugende Mikroorganismen und speziell umfaßt sind als Cellulase-erzeugende Elternstämme Bacillus sp. KSM-635 (japanische Patentanmeldung Nr. 257775 /1986), Bacillus sp. KSM-425 (japanische Patentanmeldung Nr. 283742 /1986), Bacillus sp. KSM-521 (japanische Patentanmeldung Nr. 57644/1987), und Bacillus sp. KSM-580 (japanische Patentanmeldung Nr. 68597/1987), die sämtlich von den vorliegenden Erfindern im Erdboden in Haga-gun, Tochigi-ken, Japan entdeckt worden sind; als Protease-erzeugende Elternstämme Bacillus sp. KSM-2001, Bacillus sp. KSM-2002, Bacillus sp. KSM-2003, und Bacillus sp. KSM-2005, die sämtlich von den vorliegenden Erfindern im Erdboden in Haga-gun, Tochigi-ken, Japan entdeckt wurden und für die eine Patentanmeldung eingereicht wurde (japanische Patentanmeldung Nr. 261487/1987); und als Amylaseerzeugende Mikroorganismen Bacillus amyloliquefaciens KSM-21 (ATCC 23844), Bacillus Amyloliquefaciens KSM-22 (ATCC 23845), und Bacillus licheniformis KSM-23 (ATCC 27811).As the parent strain, any microorganism of the genus Bacillus having the ability to produce extracellular enzyme can be used. Preferred parent strains are cellulase-, protease- or amylase-producing microorganisms, and specifically included as cellulase-producing parent strains are Bacillus sp. KSM-635 (Japanese Patent Application No. 257775/1986), Bacillus sp. KSM-425 (Japanese Patent Application No. 283742/1986), Bacillus sp. KSM-521 (Japanese Patent Application No. 57644/1987), and Bacillus sp. KSM-580 (Japanese Patent Application No. 68597/1987), all of which were discovered by the present inventors in the soil in Haga-gun, Tochigi-ken, Japan; as protease-producing parent strains, Bacillus sp. KSM-2001, Bacillus sp. KSM-2002, Bacillus sp. KSM-2003, and Bacillus sp. KSM-2005, all of which were discovered by the present inventors in the soil in Haga-gun, Tochigi-ken, Japan and for which a patent application was filed (Japanese Patent Application No. 261487/1987); and as amylase-producing microorganisms, Bacillus amyloliquefaciens KSM-21 (ATCC 23844), Bacillus amyloliquefaciens KSM-22 (ATCC 23845), and Bacillus licheniformis KSM-23 (ATCC 27811).
Als Beispiele von Chemikalien zur Induzierung von Mutation seien genannt Basen oder basenartige Substanzen, einschließlich 5-Bromuracil, Bromdesoxyuridin und dergl., Acridin, salpetrige Säure, Hydroxylamine, Alkylierungsmittel, wie beispielsweise Ethylmethansulfonat (EMS), N-Methyl-N'-nitrosoguanidin (NTG), Senfgas und dergl . . Ionisierende Strahlung und Ultraviolettstrahlung seien als Beispiele für Strahlung genannt.Examples of chemicals that can induce mutation include bases or base-like substances, including 5-Bromouracil, bromodeoxyuridine and the like, acridine, nitrous acid, hydroxylamines, alkylating agents such as ethyl methanesulfonate (EMS), N-methyl-N'-nitrosoguanidine (NTG), mustard gas and the like. Ionizing radiation and ultraviolet radiation are examples of radiation.
Der Ausdruck "Inhibitor-resistent", wie in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, bedeutet einen Zustand, bei dem ein Mikroorganismus die Fähigkeit hat, unter Bedingungen zu wachsen, bei denen ein Zellmembransynthese-Inhibitor mit einer Konzentration von mindestens der minimalen Hemmkonzentration (MIC) des Elternstammes anwesend ist. Um die Inhibitor-resistenten Stämme unter den Mutanten zu selektieren, wird daher zunächst der MIC des Elternstamms gemessen, eine Mutante wird in einem Medium kultiviert, das den Zellmembransynthese-Inhibitor mit einer Konzentration oberhalb der MIC enthält, und Kolonien, welche Zellen bilden, werden gesammelt. Typische Beispiele von Inhibitor-resistenten Stämmen von Cellulase-erzeugenden Mikroorganismen sind Vancomycin-resistentes Bacillus sp. KSM-635v und Ristocetin-resistentes Bacillus sp. KSM-635r, die beide induziert wurden aus Bacillus sp. KSM-635 als der Elternstamm. Die mykologischen Eigenschaften dieser beiden Antibiotika-resistenten Stämme werden im folgenden diskutiert.The term "inhibitor-resistant" as used in the present invention means a state in which a microorganism has the ability to grow under conditions in which a cell membrane synthesis inhibitor is present at a concentration of at least the minimum inhibitory concentration (MIC) of the parent strain. Therefore, in order to select the inhibitor-resistant strains among the mutants, first, the MIC of the parent strain is measured, a mutant is cultured in a medium containing the cell membrane synthesis inhibitor at a concentration above the MIC, and colonies forming cells are collected. Typical examples of inhibitor-resistant strains of cellulase-producing microorganisms are vancomycin-resistant Bacillus sp. KSM-635v and ristocetin-resistant Bacillus sp. KSM-635r, both of which were induced from Bacillus sp. KSM-635 as the parent strain. The mycological properties of these two antibiotic-resistant strains are discussed below.
1. Beobachtung unter dem Mikroskop1. Observation under the microscope
Die Zellen sind gram-positive Stäbchen mit einer Größe von 0,5 - 1,2 um · 1,5 - 4,0 um, mit einem Endosporum (0,7 - 1,2 um · 1,0 - 2,0 um), das sich an einem ihrer Enden bildet. Sie haben Flagella und sind motil.The cells are gram-positive rods measuring 0.5 - 1.2 um · 1.5 - 4.0 um, with an endosporum (0.7 - 1.2 um · 1.0 - 2.0 um) forming at one of their ends. They have flagella and are motile.
2. Wachstum in verschiedenen Kulturmedien2. Growth in different culture media
Die Zellen wachsen in einem pH-Bereich von 8 bis 11. Das Wachstum ist am kräftigsten in einem Medium, dem 0,5 bis 1,0% Natriumcarbonat (Na&sub2;CO&sub3;) zugesetzt ist. Die nachstehend beschriebenen mykologischen Eigenschaften der Zellen sind in Anwesenheit von 0,1 Gew.% Na&sub2;CO&sub3; ermittelt.The cells grow in a pH range of 8 to 11. Growth is most vigorous in a medium supplemented with 0.5 to 1.0% sodium carbonate (Na₂CO₃). The following The mycological properties of the cells described were determined in the presence of 0.1 wt.% Na₂CO₃.
a) Nährstoffagarplattea) Nutrient agar plate
Die Kolonie hat eine kreisförmige Gestalt, wobei ihre Oberfläche flach ist. Die Farbe der Kolonie ist weiß bis gelb, semi-transparent und glänzend.The colony has a circular shape with a flat surface. The color of the colony is white to yellow, semi-transparent and shiny.
b) Nährstoffbrüheb) Nutrient broth
Zellen können wachsen und die Brühe wird trüb. Die Zellen wachsen nicht bei einem neutralen pH.Cells can grow and the broth becomes cloudy. Cells do not grow at a neutral pH.
c) Zellen können in einer Nährstoffbrühe wachsen, die 7% NaCl enthält.c) Cells can grow in a nutrient broth containing 7% NaCl.
d) Nährstoffagar enthaltende Gelatined) Nutrient agar containing gelatin
Zellen wachsen nichtCells do not grow
e) Lakmusmilch-Mediume) Litmus milk medium
Milch wird nicht koaguliertMilk is not coagulated
Peptonisierung: negativPeptonization: negative
3. Physiologische Eigenschaften3. Physiological properties
a) Salpetersäure wird zu Nitrit reduziert: positiv Denitrifizierung: negativa) Nitric acid is reduced to nitrite: positive Denitrification: negative
b) MR Test: nicht bestimmbarb) MR test: not determinable
VP Test: positivVP test: positive
c) Erzeugt kein Indolc) Does not produce indole
d) Erzeugung von Schwefelwasserstoff: negativd) Production of hydrogen sulphide: negative
e) Stärke wird nicht hydrolysiert oder genutzte) Starch is not hydrolysed or used
f) Zitronensäure wird genutztf) Citric acid is used
g) Salpetersäure und salpetrige Säure werden genutzt. Ammoniumchlorid wird nur geringfügig genutzt, jedoch wird Ammoniumphosphat in effizienter Weise genutzt.g) Nitric acid and nitrous acid are used. Ammonium chloride is used only marginally, but ammonium phosphate is used efficiently.
h) Wird auf King-B-Agarplatte hellgelb, jedoch nicht fluoreszenth) Becomes light yellow on King B agar plate, but not fluorescent
i) Urease: negativi) Urease: negative
j) Oxidase: unklarj) Oxidase: unclear
k) Katalase: positivk) Catalase: positive
l) Wachstumstemperatur: 20 - 45ºC Optimale Wachstumstemperatur: 29 - 37ºCl) Growth temperature: 20 - 45ºC Optimal growth temperature: 29 - 37ºC
m) Wachstums-pH-Bereich: 8-11m) Growth pH range: 8-11
Optimaler pH-Bereich: 9,5 - 10,2Optimal pH range: 9.5 - 10.2
n) Verhalten gegenüber Sauerstoff: aerobischn) Behavior towards oxygen: aerobic
o) Zuckernutzungo) Sugar use
Nutzung von D-Ribose, L-Arabinose, D-Xylose, D-Glucose, D-Mannose, D-Fructose, Maltose, Sucrose, Trehalose, D-Mannit, Inosit und Glycerin und keine Nutzung von D-Galactose, Lactose, D-Sorbit, Stärke, Dextrin und Raffinose.Use of D-ribose, L-arabinose, D-xylose, D-glucose, D-mannose, D-fructose, maltose, sucrose, trehalose, D-mannitol, inositol and glycerin and no use of D-galactose, lactose, D-sorbitol, starch, dextrin and raffinose.
p) Hydrolyse von Kasein und Gelatine: negativp) Hydrolysis of casein and gelatin: negative
q) Erfordert Biotin (oder Desthiobiotin) für das Wachstumq) Requires biotin (or desthiobiotin) for growth
Die oben erwähnten Charakteristika von Inhibitor-resistenten Mutantenstämme Bacillus sp. KSM-635v und Bacillus sp. KSM- 635r sind die gleichen wie die der Elternstämme Bacillus sp. KSM-635. Im Unterschied zu dem Elternstamm können diese beiden Inhibitor-resistenten Mutanten jedoch in Anwesenheit von Vancomycin oder Ristocetin wachsen und besitzen eine 2- bis 4-fach größere Fähigkeit zur Erzeugung von alkalischer Cellulase als der Elternstamm.The above-mentioned characteristics of inhibitor-resistant mutant strains Bacillus sp. KSM-635v and Bacillus sp. KSM-635r are the same as those of the parent strain Bacillus sp. KSM-635. However, unlike the parent strain, these two inhibitor-resistant mutants can grow in the presence of vancomycin or ristocetin and have a 2- to 4-fold greater ability to produce alkaline cellulase than the parent strain.
Beruhend auf den obigen Ähnlichkeiten der Inhibitor-resistenten Mutanten zu dem Elternstamm werden die Mutanten als solche bewertet, die zur gleichen Gruppe wie der Elternstamm gehören, nämlich als ein alkalophiles Bacillus, welches von Horikoshi und Akiba als das Bacillus, "das in einem alkalischen Medium mit einem pH von mindestens 8, jedoch nicht unterhalb von pH 8 wächst" definiert wurde [Alkalophilic Microorganisms, Japan Scientific Society Press (Tokyo), 1982].Based on the above similarities of the inhibitor-resistant mutants to the parent strain, the mutants are evaluated as belonging to the same group as the parent strain, namely an alkalophilic bacillus, which was defined by Horikoshi and Akiba as the bacillus "growing in an alkaline medium with a pH of at least 8 but not below pH 8" [Alkalophilic Microorganisms, Japan Scientific Society Press (Tokyo), 1982].
Typische Beispiele der Inhibitor-resistenten Stämme der Protease erzeugenden Mikroorganismen sind Vancomycin-resistentes Bacillus sp. KSM-2002v und Ristocetin-resistentes Bacillus sp. KSM-2002r, die beide induziert wurden aus Bacillus sp. KSM- 2002 als der Elternstamm. Mykologische Eigenschaften dieser beiden Inhibitor-resistenten Stämme sind wie folgt:Typical examples of the inhibitor-resistant strains of the protease-producing microorganisms are vancomycin-resistant Bacillus sp. KSM-2002v and ristocetin-resistant Bacillus sp. KSM-2002r, both of which were induced from Bacillus sp. KSM- 2002 as the parent strain. Mycological characteristics of these two inhibitor-resistant strains are as follows:
1) Beobachtung unter dem Mikroskop1) Observation under the microscope
Die Zellen sind gram-positive Stäbchen mit einer Größe von 0,5 - 0,8 um · 1,5 - 3,0 um, mit einem kreisförmigen oder ovalen Endosporum (0,4 - 0,8 um · 0,4 - 0,8 um), das sich zentral-subterminal an der Zelle bildet. Sie haben periphere Flagella und sind motil.The cells are gram-positive rods with a size of 0.5 - 0.8 um · 1.5 - 3.0 um, with a circular or oval endosporum (0.4 - 0.8 um · 0.4 - 0.8 um) that forms centrally-subterminally on the cell. They have peripheral flagella and are motile.
2) Wachstum in verschiedenen Kulturmedien2) Growth in different culture media
(a-i) Nährstoffagarplatte(a-i) Nutrient agar plate
Zellen bilden kreisförmige, konvexe und glatte, wellenartige Kolonien mit einem Durchmeser von 1,0 bis 5,0 mm. Die Kolonie hat eine Tautropfenform mit einer glatten, fettigen, semitransparenten Oberfläche, die blaßgelb bis milchigweiß gefärbt ist.Cells form circular, convex and smooth, wave-like colonies with a diameter of 1.0 to 5.0 mm. The colony has a dewdrop shape with a smooth, greasy, semi-transparent surface that is pale yellow to milky white in color.
(a-ii) Geneigtes Nährstoffagar(a-ii) Tilted nutrient agar
Nur schwaches Wachstum, das ein Band in einer Brühe bei pH 7,0 bildet. Die Kolonie ist milchigweiß und semi-transparent. Das bandartige Wachstum breitet sich bei pH 10,0 aus.Only weak growth forming a band in a broth at pH 7.0. The colony is milky white and semi-transparent. The band-like growth spreads at pH 10.0.
b) Nährstoffbrüheb) Nutrient broth
Zellen können bei pH 7,0 geringfügig wachsen, ohne Zellmembran zu bilden.Cells can grow slightly at pH 7.0 without forming cell membrane.
c) Zellen können in Anwesenheit von 10% Natriumchlorid wachsen.c) Cells can grow in the presence of 10% sodium chloride.
d) Stabkultur in Nährstoffagard) Stick culture in nutrient agar
Verflüssigung von Gelatine bei pH 7,0Liquefaction of gelatin at pH 7.0
e) Lakmusmilchmediume) Litmus milk medium
Geringfügiges Wachstum. Koagulation der Milch und Lakmusentfärbung werden nicht beobachtet.Slight growth. Milk coagulation and litmus discoloration are not observed.
3. Physiologische Eigenschaften3. Physiological properties
a) Salpetersäure wird zu Nitrit reduziert: negativ Denitrifizierungsreaktion: negativa) Nitric acid is reduced to nitrite: negative Denitrification reaction: negative
b) MR Test: negativ VP Test: negativb) MR test: negative VP test: negative
c) Erzeugt kein Indolc) Does not produce indole
d) Erzeugung von Schwefelwasserstoff: negativd) Production of hydrogen sulphide: negative
e) Hydrolyse von Stärke: negative) Hydrolysis of starch: negative
f) Nutzung von Zitronensäure: negativ (in Christensen- Simons Medium)f) Use of citric acid: negative (in Christensen-Simons medium)
g) Nutzung von Salpetersäure und Ammoniumsulfat: negativg) Use of nitric acid and ammonium sulphate: negative
h) Erzeugt kein Pigment.h) Does not produce pigment.
i) Urease: negativi) Urease: negative
j) Oxidase: positivj) Oxidase: positive
k) Katalase: positivk) Catalase: positive
l) Wachstumstemperatur: 10 - 37ºC, Wachstum ist gut bei 20 - 30ºCl) Growth temperature: 10 - 37ºC, growth is good at 20 - 30ºC
m) Wachstums pH Bereich: 6,0 - 11,0m) Growth pH range: 6.0 - 11.0
n) Wachstum sowohl unter aerobischen als auch anaerobischen Bedingungen.n) Growth under both aerobic and anaerobic conditions.
o) Zuckernutzungo) Sugar use
Nutzung von L-Arabinose, D-Xylose, D-Glucose, D-Fructose, D-Galaktose, Maltose, Lactose, D-Sorbit, D-Mannit und Stärke und keine Nutzung von D-Mannose, Sucrose, Trehalose, Inosit und Glycerin.Use of L-arabinose, D-xylose, D-glucose, D-fructose, D-galactose, maltose, lactose, D-sorbitol, D-mannitol and starch and no use of D-mannose, sucrose, trehalose, inositol and glycerin.
p) Erzeugung von Säuren und Basen aus Zuckerp) Production of acids and bases from sugar
Beide Inhibitor-resistente Stämme erzeugen keine Säuren und Gase aus den folgenden Zuckern: L-Arabinose, D-Xylose, D- Glucose, D-Mannose, D-Fructose, D-Galactose, Maltose, Sucrose, Lactose, Trehalose, D-Sorbit, D-Mannit, Inosit, Glycerin und Stärke.Both inhibitor-resistant strains do not produce acids and gases from the following sugars: L-arabinose, D-xylose, D-glucose, D-mannose, D-fructose, D-galactose, maltose, sucrose, lactose, trehalose, D-sorbitol, D-mannitol, inositol, glycerol and starch.
Die oben erwähnten Charakteristika von Inhibitor-resistenten mutanten Stämmen Bacillus sp. KSM-2002v und Bacillus sp. KSM- 2002r sind die gleichen wie die des Elternstammes acillus sp. KSM-2002. Im Unterschied zu dem Elternstamm können diese beiden Inhibitor-resistenten Mutanten jedoch in Gegenwart von Vancomycin und Ristocetin bei einer Konzentration oberhalb der MIC wachsen und besitzen eine 2- bis 3-fach größere Fähigkeit zur Erzeugung von alkalischer Protease als der Elternstamm.The above-mentioned characteristics of inhibitor-resistant mutant strains Bacillus sp. KSM-2002v and Bacillus sp. KSM-2002r are the same as those of the parent strain Bacillus sp. KSM-2002. However, unlike the parent strain, these two inhibitor-resistant mutants can grow in the presence of vancomycin and ristocetin at a concentration above the MIC and have a 2- to 3-fold greater ability to produce alkaline protease than the parent strain.
Als typische Beispiele von Inhibitor-resistenten Stämmen von Amylase erzeugenden Mikroorganismen seien ferner Vancomycinresistentes Bacillus amyloliquefaciens KSM-22v und Ristocetinresistentes Bacillus amyloliquefaciens KSM-22r genannt, die beide aus einem bekannten Mikroorganismus, Bacillus amyloliquefaciens KSM-22 [ATCC 23845; N. E. Welkerand L. L. Campbell, J. Bacteriol., 94, 1124 (1967)], als der Elternstamm induziert wurden. Im Unterschied zu dem Elternstamm können jedoch die Inhibitor-resistenten Mutanten in Anwesenheit von Vancomycin oder Ristocetin wachsen und besitzen eine 1,3- bis 4-fach größere Fähigkeit zur Amylaseerzeugung als der Elternstamm.Further typical examples of inhibitor-resistant strains of amylase-producing microorganisms include vancomycin-resistant Bacillus amyloliquefaciens KSM-22v and ristocetin-resistant Bacillus amyloliquefaciens KSM-22r, both of which were induced from a known microorganism, Bacillus amyloliquefaciens KSM-22 [ATCC 23845; N. E. Welkerand L. L. Campbell, J. Bacteriol., 94, 1124 (1967)], as the parent strain. However, unlike the parent strain, the inhibitor-resistant mutants can grow in the presence of vancomycin or ristocetin and have a 1.3- to 4-fold greater ability to produce amylase than the parent strain.
Die Kultivierung der Inhibitor-resistenten Mutante der vorliegenden Erfindung kann durchgeführt werden, indem man ein normales flüssiges Medium mit den Zellen beimpft und die Zellen gemäß einer herkömmlichen, aerobischen Kultivierungsmethode kultiviert. Der Einschluß einer geeigneten Menge von Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, welche von dem Mikroorganismus genutzt werden können, ist in dem Medium wünschenswert. Es bestehen keine speziellen Beschränkungen hinsichtlich der Kohlenstoff- und Stickstoffquellen. Als Beispiele von Kohlenstoffquellen seien faserige Substanzen genannt, wie beispielsweise Kaff, Spelzen, Filterpapier, gewöhnliches Papier, Sägemehl, Me-lasse, Invertzucker, CMC, Avicel, Cellulosepulver, Xylan, Pectin, lösliche Stärke und dergl . . Zusätzlich können weitere nutzbare Kohlenstoffquellen eingeschlossen werden, wie beispielsweise Ribose, Arabinose, Xylose, Glucose, Mannose, Fructose, Galactose, Lactose, Maltose, Sucrose, Trehalose, Sorbit, Mannit, Inosit, Glycerin, sowie organische Säuren, wie beispielsweise Zitronensäure, Essigsäure und dergl . . Als Stickstoffquellen seien erwähnt anorganische stickstoffhaltige Verbindungen, wie beispielsweise Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Natriumnitrat und dergl., Kornglutenmehl, Sojabohnenmehl, Sojabohnenspelzen, Maisquellwasser, Casaminosäure, Hefeextrakt, Pharmamedia, Fischmehl, Fleischextrakt, Pepton, Hypro, Aji-power, Mais-Sojabohnenmehl, Kaffeemehl, Baumwollsaatmehl, Cultivator, Amiflex, Ajipron, Zest, Ajix und dergl . . Zusätzlich zu diesen Kohlenstoff- und Stickstoffquellen können Phosphorsäure, Salze von Metallen, wie beispielsweise Mg&spplus;², Ca&spplus;², Mn&spplus;², Zn&spplus;², Co&spplus;², Na&spplus;, K&spplus; und dergl., sowie, falls erforderlich, andere als Spurennährstoffe wirkende organische oder anorganische Substanzen dem Kulturmedium zugesetzt werden.The cultivation of the inhibitor-resistant mutant of the present invention can be carried out by inoculating the cells into a normal liquid medium and culturing the cells according to a conventional aerobic cultivation method. It is desirable to include an appropriate amount of carbon and nitrogen sources which can be utilized by the microorganism in the medium. There are no particular restrictions on the carbon and nitrogen sources. As examples of carbon sources, there are fibrous substances such as cob, husks, filter paper, ordinary paper, sawdust, molasses, invert sugar, CMC, Avicel, cellulose powder, xylan, pectin, soluble starch and the like. In addition, Other useful carbon sources may be included, such as ribose, arabinose, xylose, glucose, mannose, fructose, galactose, lactose, maltose, sucrose, trehalose, sorbitol, mannitol, inositol, glycerin, and organic acids, such as citric acid, acetic acid, and the like. Nitrogen sources which may be mentioned are inorganic nitrogen-containing compounds, such as ammonium nitrate, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, sodium nitrate, and the like, grain gluten meal, soybean meal, soybean husks, corn steep liquor, casamino acid, yeast extract, pharmamedia, fish meal, meat extract, peptone, hypro, aji-power, corn-soybean meal, coffee grounds, cottonseed meal, cultivator, amiflex, ajipron, zest, ajix, and the like. In addition to these carbon and nitrogen sources, phosphoric acid, salts of metals such as Mg+2, Ca+2, Mn+2, Zn+2, Co+2, Na+, K+ and the like, and, if necessary, other organic or inorganic substances acting as trace nutrients may be added to the culture medium.
Enzyme, wie beispielsweise Cellulase, Protease, Amylase, die von den Inhibitor-resistenten Mutanten außerhalb der Zellen erzeugt werden können auf herkömmliche Weise gesammelt und gereinigt werden. Die Kulturflüssigkeit, die ein derartiges Enzym enthält, kann so wie sie ist als eine Enzymquelle verwendet werden. Eine derartige Enzymflüssigkeit kann erhalten werden, indem man Zellen von der Kulturbrühe mittels Zentrifugieren, Filtrieren oder dergl. abtrennt oder indem man Proteine mittels herkömmlicher Methoden ausfällt, einschließlich Aussalzen, isoelektrische Fällung, Fällung aus Lösungsmittel oder dergl., und zwar aus den Zellen oder dem Filtrat der Kulturflüssigkeit, oder indem man das Filtrat mittels Ultrafiltration kondensiert. Das Aussalzen kann auf herkömmliche Weise durchgeführt werden, einschließlich Dialyse, Gelfiltration oder dergl . . Es ist möglich, die Enzymflüssigkeit so zu verwenden, wie sie erhalten wurde, sie kann sie jedoch auch für die Verwendung bereit gestellt werden, nachdem man sie gereinigt hat durch eine zweckentsprechende Kombination von Hydroxyapathitchromatographie, Ionenaustauschchromatographie, beispielsweise mit DEAE-Sephadex oder DEAE-Cellulose, Molekularsiebgelchromatographie und dergl . . Enzymes such as cellulase, protease, amylase produced by the inhibitor-resistant mutants outside the cells can be collected and purified in a conventional manner. The culture liquid containing such an enzyme can be used as an enzyme source as it is. Such an enzyme liquid can be obtained by separating cells from the culture broth by centrifugation, filtration or the like, or by precipitating proteins by a conventional method including salting out, isoelectric precipitation, solvent precipitation or the like from the cells or the filtrate of the culture liquid, or by condensing the filtrate by ultrafiltration. The salting out can be carried out in a conventional manner including dialysis, gel filtration or the like. It is possible to use the enzyme liquid as it is obtained, but it can also be used for be made available for use after being purified by an appropriate combination of hydroxyapathite chromatography, ion exchange chromatography, for example with DEAE-Sephadex or DEAE-cellulose, molecular sieve gel chromatography and the like.
Da die Inhibitor-resistenten Mutanten der vorliegenden Erfindung eine 2- bis 4-fach größere Fähigkeit zur extrazellulären Enzymerzeugung aufweisen als die Elternstämme, können sie mit Vorteil zur industriellen Erzeugung von Cellulase, Protease, Amylase und dergl. verwendet werden.Since the inhibitor-resistant mutants of the present invention have a 2- to 4-fold greater ability for extracellular enzyme production than the parent strains, they can be advantageously used for industrial production of cellulase, protease, amylase and the like.
Andere Merkmale der Erfindung werden an Hand der folgenden Beschreibung von beispielhaften Ausführungsformen deutlicher, die zur Erläuterung der Erfindung dienen und diese nicht beschränken sollen.Other features of the invention will become more apparent from the following description of exemplary embodiments, which serve to illustrate the invention and are not intended to limit it.
In den unten stehenden Beispielen werden die enzymatischen Aktivitäten mit der folgenden Methode gemessen.In the examples below, the enzymatic activities are measured using the following method.
(1) CMC-ase-Aktivität(1) CMC-ase activity
Zu einer Lösung, umfassend 0,2 ml 25%ige CMC, 0,1 ml von 0,5 M Glycinpuffer (pH 9,0), und 0,1 ml entsalztes Wasser gibt man 0,1 ml Enzymlösung, verdünnt auf eine zweckentsprechende Konzentration. Das Gemisch wird 20 min bei 40ºC umgesetzt. Nach der Reaktion wird reduzierender Zucker quantitativ analysiert mit der 3,5-Dinitrosalicylsäure-(DNS)-Methode. Speziell wird zur Bestimmung der Menge des erzeugten reduzierenden Zuckers 1 ml des DNS-Reagenz zu 0,5 ml der Reaktionsflüssigkeit gegeben und das Gemisch wird durch Erhitzen auf 100ºC während 5 min dazu gebracht, eine Farbe anzunehmen. Nach dem Abkühlen wird das gefärbte Gemisch mit 4,5 ml entsalztem Wasser verdünnt und einer colorimetrischen quantitativen Analyse bei 535 nm unterworfen.To a solution comprising 0.2 ml of 25% CMC, 0.1 ml of 0.5 M glycine buffer (pH 9.0), and 0.1 ml of deionized water is added 0.1 ml of enzyme solution diluted to an appropriate concentration. The mixture is reacted at 40°C for 20 min. After the reaction, reducing sugar is quantitatively analyzed by the 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) method. Specifically, to determine the amount of reducing sugar produced, 1 ml of the DNS reagent is added to 0.5 ml of the reaction liquid, and the mixture is made to acquire color by heating at 100°C for 5 min. After cooling, the colored mixture is diluted with 4.5 ml of deionized water and subjected to colorimetric quantitative analysis at 535 nm.
Eine (1) Einheit des Enzymtiters wird definiert als die Menge des Enzyms, die einen reduzierenden Zucker erzeugt, der 1 uMol Glucose pro min entspricht. Die Fermentationsproduktivität wird ausgedrückt durch die Enzymeinheit pro 1 Liter der Kulturflüssigkeit.One (1) unit of enzyme titer is defined as the amount of enzyme that produces a reducing sugar equivalent to 1 umol of glucose per min. Fermentation productivity is expressed by the enzyme unit per 1 liter of culture liquid.
(2) Proteaseaktivität(2) Protease activity
Nach der Methode, die von Anson vorgeschlagen wurde (Anson, M. L., J. Ger. Physiol., 22, 79 (1938)) wird Rinderserumhämoglobin mittels Harnstoff denaturiert und mit Natriumhydroxid auf pH 10,5 eingestellt. In 0,5 ml dieser Substratlösung (2,2% als Hämoglobin) gibt man 0,1 ml [1,0 · 10&supmin;&sup5; - 1,0 · 10&supmin;³ uA.U (A.U.: Anson-Einheit)] einer Enzymlösung und das Gemisch wird bei 25ºC während 10 min umgesetzt. Daraufhin werden 1,0 ml 4,9%ige Trichloressigsäure zugesetzt, um die Reaktion zu beenden. Nach Beendigung der Reaktion wird das Reaktionsgemisch bei 3 000 Upm während 10 min zentrifugiert. Proteolysate, die in dem Oberstand enthalten sind, werden quantitativ analysiert mit der Folin-Lowry-Methode [O. H. Lowry et al; J. Biol.Chem., 193, 265 (1951)]. 1 A.U. wird als die Menge des Enzyms definiert, die unter den obigen Reaktionsbedingungen 1 mMol Tyrosin in 1 min freisetzt.According to the method proposed by Anson (Anson, M. L., J. Ger. Physiol., 22, 79 (1938)), bovine serum hemoglobin is denatured with urea and adjusted to pH 10.5 with sodium hydroxide. In 0.5 ml of this substrate solution (2.2% as hemoglobin) is added 0.1 ml [1.0 x 10-5 - 1.0 x 10-3 uA.U (A.U.: Anson unit)] of an enzyme solution and the mixture is reacted at 25°C for 10 min. Then 1.0 ml of 4.9% trichloroacetic acid is added to terminate the reaction. After completion of the reaction, the reaction mixture is centrifuged at 3,000 rpm for 10 min. Proteolysates contained in the supernatant are quantitatively analyzed using the Folin-Lowry method [O. H. Lowry et al; J. Biol.Chem., 193, 265 (1951)]. 1 A.U. is defined as the amount of enzyme that releases 1 mmol of tyrosine in 1 min under the above reaction conditions.
(3) Amylaseaktivität(3) Amylase activity
Zu der Lösung, welche 0,4 ml 1,25%ige lösliche Stärke 0,025 ml 1 M Tris-HCl Puffer (pH 7,0), 0,05 ml 0,2 M Calciumchlorid und 0,425 ml entsalztes Wasser umfaßt, gibt man 0,1 ml einer Enyzmlösung, die auf eine zweckentsprechende Konzentration verdünnt ist. Das Gemisch wird bei 30ºC während 5 min umgesetzt. Nach der Reaktion werden reduzierende Zucker mit der 3,5-Dinitrosalicylsäure-(DNS)-Methode quantitativ analysiert. Speziell wird zur Bestimmung der Menge des erzeugten reduzierenden Zuckers 1 ml des DNS-Reagenz zu 1 ml der Reaktionsflüssigkeit gegeben und das Gemisch wird durch Erhitzen bei 100ºC während 5 min dazu gebracht, die Farbe zu ändern. Nach dem Abkühlen wird das gefärbte Gemisch mit 4 ml entsalztem Wasser verdünnt und der colorimetrischen quantitativen Analyse bei 535 nm unterworfen.To the solution containing 0.4 ml of 1.25% soluble starch, 0.025 ml of 1 M Tris-HCl buffer (pH 7.0), 0.05 ml of 0.2 M calcium chloride and 0.425 ml of deionized water, 0.1 ml of an enzyme solution diluted to an appropriate concentration is added. The mixture is reacted at 30ºC for 5 min. After the reaction, reducing sugars are added with the 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) method. Specifically, to determine the amount of reducing sugar produced, 1 ml of the DNS reagent is added to 1 ml of the reaction liquid and the mixture is made to change color by heating at 100ºC for 5 min. After cooling, the colored mixture is diluted with 4 ml of deionized water and subjected to colorimetric quantitative analysis at 535 nm.
Eine (1) Einheit des Enzymtiters wird definiert als die Menge des Enzyms welche pro min reduzierenden Zucker in einer Menge erzeugt, die 1 uMol Maltose entspricht.One (1) unit of enzyme titer is defined as the amount of enzyme which produces reducing sugar per minute in an amount equivalent to 1 umol of maltose.
Bacillus sp. KSM-635 (FERM P-8872) wird auf dem unten beschriebenen Medium A ausgebreitet, wobei jedes Medium Vancomycin mit einer Konzentration enthält, wie sie in Tabelle 1 gezeigt ist, um die minimale Hemmkonzentration (MIC) zu bestimmen. Das Medium A mit einem Gehalt an Vancomycin, auf dem Bacillus sp. KSM-635 (FERM P-8872) ausgebreitet wurde, wird 3 Tage bei 30ºC stehenlassen. Der Zellwachstumszustand auf der Oberfläche des Mediums wird mit bloßem Auge beobachtet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.Bacillus sp. KSM-635 (FERM P-8872) is spread on medium A described below, each medium containing vancomycin at a concentration as shown in Table 1, to determine the minimum inhibitory concentration (MIC). Medium A containing vancomycin on which Bacillus sp. KSM-635 (FERM P-8872) was spread is allowed to stand at 30°C for 3 days. The cell growth state on the surface of the medium is observed with the naked eye. The results are shown in Table 1.
Medium A:Media A:
Sucrose 2%Sucrose 2%
Gemischte Aminosäurelösung 6%Mixed amino acid solution 6%
KH&sub2;PO&sub4; 0,1%KH₂PO₄ 0.1%
Tris-HCl Puffer 0,1 MTris-HCl buffer 0.1 M
(Endkonzentration pH 8)(Final concentration pH 8)
Bacto Agar-agar 2,0%Bacto Agar-agar 2.0%
Vancomycin Konzentration in Tab. 1Vancomycin concentration in Tab. 1
Konzentration an Vancomycin (γ) Zellwachstum auf der MediumoberflächeConcentration of vancomycin (γ) Cell growth on the medium surface
0 +++0 +++
0,1 ++0.1 ++
0,2 ±0.2 ±
0,3 -0.3 -
0,5 -0.5 -
1,0 -1.0 -
1,5 -1.5 -
Aus der Tabelle wird deutlich, daß die MIC von Vancomycin für Bacillus sp. KSM-635 etwa 0,2γ beträgt.From the table it is clear that the MIC of vancomycin for Bacillus sp. KSM-635 is about 0.2γ.
Bacillus sp. KSM-635 (FERM P-8872) wird auf dem unten beschriebenen Medium B ausgebreitet, wobei jedes Medium Ristocetin mit einer vorgeschriebenen Konzentration enthält, um die minimale Hemmkonzentration (MIC) des Antibiotikums zu ermitteln. Als Ergebnis findet man, daß die MIC von Ristocetin für Bacillus sp. KSM-635 (FERM P-8872) etwa 0,1 γ beträgt.Bacillus sp. KSM-635 (FERM P-8872) is spread on medium B described below, each medium containing ristocetin at a prescribed concentration to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) of the antibiotic. As a result, it is found that the MIC of ristocetin for Bacillus sp. KSM-635 (FERM P-8872) is about 0.1 γ.
Medium B:Medium B:
Sucrose 2%Sucrose 2%
Gemischte Aminosäurelösung 6%Mixed amino acid solution 6%
KH&sub2;PO&sub4; 0,1%KH₂PO₄ 0.1%
Tris-HCl Puffer 0,1 MTris-HCl buffer 0.1 M
(Endkonzentration pH 8)(Final concentration pH 8)
Bacto Agar-agar 2,0%Bacto Agar-agar 2.0%
Ristocetin geeignete KonzentrationRistocetin suitable concentration
Bacillus sp. KSM-635 (FERM P-8872) wird dem flüssigen Medium C eingeimpft und bei 30ºC während 20 h kultiviert. EMS wird der Kulturbrühe zugesetzt, bis eine Konzentration von 0,5 bis 3% (normalerweise 1%) erreicht ist, und die Brühe wird bei 30ºC 20 min stehengelassen. Anschließend wird eine 3%ige, behandelte kultivierte Flüssigkeit in das flüssige Medium okkuliert und die Kultivierung wird bei 30ºC über Nacht fortgesetzt.Bacillus sp. KSM-635 (FERM P-8872) is inoculated into liquid medium C and cultured at 30ºC for 20 h. EMS is added to the culture broth until a concentration of 0.5 to 3% (normally 1%) is reached and the broth is left at 30ºC for 20 min. Then, a 3% treated culture broth is inoculated into the liquid medium and the culture is continued at 30ºC overnight.
Die Kulturflüssigkeit wird auf Medium A ausgebreitet, das nicht weniger als 0,2 γ Vancomycin enthält und wird bei 30ºC während 2 Tagen kultiviert. Kolonien, die auf der Oberfläche des Mediums wachsen, werden gesammelt. Das obige Kultivierungsverfähren wird 5 Mal wiederholt, wobei 18 Vancomycinresistente Stämme erhalten werden.The culture fluid is spread on medium A containing not less than 0.2 γ vancomycin and is cultured at 30ºC for 2 days. Colonies growing on the surface of the medium are collected. The above cultivation procedure is repeated 5 times to obtain 18 vancomycin-resistant strains.
Jeder dieser Vancomycin-resistenten Stämme wird in 100 ml flüssigem Medium D okkuliert und bei 30ºC während 3 Tagen kultiviert. Bei jeder Brühe wird die alkalische Cellulaseaktivität bestimmt. Als Ergebnis findet man, daß Vancomycin resistente Stämme mit einer hohen alkalischen Cellulaseaktivität erzeugt werden, wie in Tabelle 2 gezeigt wird. Der Stamm, welcher den höchsten Titer aufweist (Nr. 3215) wird als Bacillus sp. KSM- 635v bezeichnet. Dieser Stamm wurde bei Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology hinterlegt (FERM P-9084).Each of these vancomycin-resistant strains is inoculated into 100 ml of liquid medium D and cultured at 30ºC for 3 days. The alkaline cellulase activity of each broth is determined. As a result, it is found that vancomycin-resistant strains with high alkaline cellulase activity are produced, as shown in Table 2. The strain showing the highest titer (No. 3215) is designated as Bacillus sp. KSM-635v. This strain has been deposited with Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (FERM P-9084).
Medium C:Medium-C:
Fleischextrakt 1%Meat extract 1%
Hefeextrakt 0,5%Yeast extract 0.5%
NaCl 0,5%0.5%
Glucose 2,0%Glucose 2.0%
KH&sub2;PO&sub4; 1,0%KH₂PO₄ 1.0%
Na&sub2;CO&sub3; 0,75%Na₂CO₃ 0.75%
Medium D:Medium D:
Zucker 2%Sugar 2%
Gemischte Aminosäurelösung 6%Mixed amino acid solution 6%
Hefeextrakt 0,2%Yeast extract 0.2%
Na&sub2;CO&sub3; 0,5% Tabelle 2 Mutante Nr. erworbene Vancomycin Resistenz alkalische Cellulaseproduktion (Einheit/l) Bacillus sp KSM-635 (Elternstamm, KontrolleNa₂CO₃ 0.5% Table 2 Mutant No. Acquired Vancomycin resistance Alkaline cellulase production (unit/l) Bacillus sp KSM-635 (parent strain, control
Bacillus sp. KSM-635 (FERM P-8872) wird dem flüssigen Medium C eingeimpft und bei 30ºC während 20 h kultiviert. EMS wird der Kulturbrühe zugesetzt, bis eine Konzentration von 0,5 bis 3% (normalerweise 1%) erreicht ist. Und die Brühe wird bei 30ºC 20 min stehengelassen. Anschließend wird eine 3%ige behandelte kultivierte Flüssigkeit in das flüssige Medium okkuliert und die Kultivierung wird bei 30ºC über Nacht fortgesetzt.Bacillus sp. KSM-635 (FERM P-8872) is inoculated into the liquid medium C and cultured at 30ºC for 20 h. EMS is added to the culture broth until a concentration of 0.5 to 3% (normally 1%) is reached. And the broth is left at 30ºC for 20 min. Then, 3% treated cultured liquid is inoculated into the liquid medium and the cultivation is continued at 30ºC overnight.
Die Kulturflüssigkeit wird auf Medium B ausgebreitet, das nicht weniger als 0,1 γ Ristocetin enthält und wird bei 30ºC während 2 Tagen kultiviert. Kolonien, die auf der Oberfläche des Mediums wachsen, werden gesammelt. Das obige Kultivierungsverfahren wird 5 Mal wiederholt, wobei 14 Ristocetinresistente Stämme erhalten werden.The culture fluid is spread on medium B containing not less than 0.1 γ ristocetin and is cultured at 30ºC for 2 days. Colonies growing on the surface of the medium are collected. The above cultivation procedure is repeated 5 times to obtain 14 ristocetin-resistant strains.
Jeder dieser Ristocetin-resistenten Stämme wird in 100 ml flüssigem Medium D okkuliert und bei 30ºC während 3 Tagen kultiviert. Bei jeder Brühe wird die alkalische Cellulaseaktivität bestimmt. Als Ergebnis findet man, daß Ristocetin-resistente Stämme mit einer hohen alkalischen Cellulaseaktivität erzeugt werden, wie in Tabelle 3 gezeigt wird. Der Stamm, welcher den höchsten Titer aufweist (Nr. 4021) wird als Bacillus sp. KSM- 635r bezeichnet. Dieser Stamm wurde bei Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, hinterlegt (FERM P-9085). Tabelle 3 Mutante Nr. erworbene Ristocetin Resistenz alkalische Cellulaseproduktion (Einheit/l) Bacillus sp KSM-635 (Elternstamm, KontrolleEach of these ristocetin-resistant strains is inoculated in 100 ml of liquid medium D and cultured at 30ºC for 3 days. The alkaline cellulase activity of each broth is determined. As a result, it is found that ristocetin-resistant strains having a high alkaline cellulase activity are produced, as shown in Table 3. The strain showing the highest titer (No. 4021) is designated as Bacillus sp. KSM- 635r. This strain has been deposited at Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (FERM P-9085). Table 3 Mutant No. Acquired Ristocetin Resistance Alkaline Cellulase Production (Unit/L) Bacillus sp KSM-635 (Parent Strain, Control
Bacillus sp. KSM-635v(FERM P-9084) wird in einem Medium kultiviert (30 ml in einem 500 ml Sakaguchi Kolben), welches 2% Sucrose, 12% Aminosäuremischung, 0,05 Hefeextrakt, 0,1% KH&sub2;PO&sub4; und 0,5% Na&sub2;CO&sub3; enthält, und zwar unter Schütteln bei 30ºC während 3 Tagen. Die Menge an alkalischer Cellulase, die erzeugt wird, wird gemessen. Man erhält als Ergebnis 21 520 Einheiten/l.Bacillus sp. KSM-635v(FERM P-9084) is cultured in a medium (30 ml in a 500 ml Sakaguchi flask) containing 2% sucrose, 12% amino acid mixture, 0.05% yeast extract, 0.1% KH2PO4 and 0.5% Na2CO3 with shaking at 30ºC for 3 days. The amount of alkaline cellulase produced is measured. The result is 21,520 units/l.
Die Menge der durch Bacillus sp. KSM-635r (FERM P-9085) erzeugten alkalischen Cellulase wird gemessen, wobei die in Beispiel 3 beschriebene Methode angewandt wird. Das Ergebnis ist 20 290 Einheiten/l.The amount of alkaline cellulase produced by Bacillus sp. KSM-635r (FERM P-9085) is measured using the method described in Example 3. The result is 20,290 units/l.
Bacillus sp. KSM-2002 (FERM P-9450) wird auf dem unten beschriebenen Medium E ausgebreitet, wobei jedes Medium Vancomycin oder Ristocetin mit einer Konzentration enthält, wie sie in der untenstehenden Tabelle 4 angegeben ist. Auf diese Weise wird die minimale Hemmkonzentration (MIC) von Vancomycin oder Ristocetin bestimmt. Das Medium E mit einem Gehalt an Vancomycin oder Ristocetin, auf dem Bacillus sp. KSM-2002 ausgebreitet wurde, wird bei 30ºC 3 Tage stehenlassen und anschließend werden die Zellwachstumszustände auf der Mediumoberfläche mit bloßem Auge beobachtet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt.Bacillus sp. KSM-2002 (FERM P-9450) is spread on medium E described below, each medium containing vancomycin or ristocetin at a concentration as shown in Table 4 below. In this way, the minimum inhibitory concentration (MIC) of vancomycin or ristocetin is determined. Medium E containing vancomycin or ristocetin on which Bacillus sp. KSM-2002 is spread is allowed to stand at 30ºC for 3 days, and then the cell growth conditions on the medium surface are observed with the naked eye. The results are shown in Table 4.
Medium E:Medium E:
Bacto Trypton 1,5%Bacto Tryptone 1.5%
Bacto Soyton 0,5%Bacto Soyton 0.5%
NaCl 0,5%0.5%
Bacto Agar agar 2.0%Bacto Agar agar 2.0%
Vancomycin oder Ristocetin Konzentration in Tabelle 4 Tabelle 4 Konzentration an Vancomycin Zellwachstum auf Mediumoberfläche Konzentration an RistocetinVancomycin or ristocetin concentration in Table 4 Table 4 Concentration of vancomycin Cell growth on medium surface Concentration of ristocetin
Aus der Tabelle wird deutlich, daß die MIC-Werte für Vancomycin und Ristocetin beim Bacillus sp. KSM-2002 etwa 0,02 γ bzw. 0,03 γ betragen.From the table it is clear that the MIC values for vancomycin and ristocetin for Bacillus sp. KSM-2002 are approximately 0.02 γ and 0.03 γ, respectively.
Bacillus sp. KSM-2002 (FERM P-9450) wird in flüssigem Medium F okkuliert und bei 30ºC während 18 h kultiviert. NTG wird der Kulturbrühe zugesetzt bis zu der Konzentration von 30 bis 100 γ und die Kulturbrühe wird während 20 bis 60 min bei 20ºC stehenlassen. Anschließend wird eine 1%ige behandelte Kulturflüssigkeit in das flüssige Medium okkuliert und die Kultivierung wird bei 30ºC über Nacht fortgesetzt.Bacillus sp. KSM-2002 (FERM P-9450) is inoculated into liquid medium F and cultured at 30ºC for 18 h. NTG is added to the culture broth to the concentration of 30 to 100 γ and the culture broth is left at 20ºC for 20 to 60 min. Then, 1% treated culture broth is inoculated into the liquid medium and the cultivation is continued at 30ºC overnight.
Die Kulturflüssigkeit wird auf Medium E ausgebreitet, welches nicht weniger als 0,02 γ Vancomycin oder nicht weniger als 0,03 γ Ristocetin enthält und wird bei 30ºC während 3 Tagen kultiviert. Die auf der Oberfläche des Mediums wachsenden Kolonien werden gesammelt. Das obige Kultivierungsverfahren wird 5 Mal wiederholt, um 7 Vancomycin-resistente Stämme und 4 Ristocetin-resistente Stämme zu erhalten.The culture fluid is spread on medium E containing not less than 0.02 γ vancomycin or not less than 0.03 γ ristocetin and cultured at 30ºC for 3 days. The colonies growing on the surface of the medium are collected. The above cultivation procedure is Repeated 5 times to obtain 7 vancomycin-resistant strains and 4 ristocetin-resistant strains.
Jeder dieser Stämme wird in 5 ml flüssigem Medium G in einem Reagenzglas okkuliert und bei 30ºC während 3 Tagen kultiviert. Der alkalische Proteasetiter wird bei jeder Brühe bestimmt. Als Ergebnis erhält man Stämme mit hohem Titer, wie in Tabelle 5 zu sehen ist. Unter diesen ist ein Vacomycin-resistenter Stamm mit dem höchsten Titer (Nr. 2016) und ein Ristocetin-resistenter Stamm mit dem höchsten Titer (Nr. 2014) welche als Bacillus sp. KSM-2002v bzw. Bacillus sp. KSM-2002r bezeichnet werden. Diese Stämme wurden bei Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology als FERM P-9939 bzw. FERM P-9938 hinterlegt.Each of these strains is inoculated in 5 ml of liquid medium G in a test tube and cultured at 30ºC for 3 days. The alkaline protease titer is determined for each broth. As a result, high titer strains are obtained, as shown in Table 5. Among them, a vacomycin-resistant strain with the highest titer (No. 2016) and a ristocetin-resistant strain with the highest titer (No. 2014) are designated as Bacillus sp. KSM-2002v and Bacillus sp. KSM-2002r, respectively. These strains were deposited at Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology as FERM P-9939 and FERM P-9938, respectively.
Medium F:Medium F:
Bacto Trypton 1,5%Bacto Tryptone 1.5%
Bacto Sotton 0,5%Bacto Sotton 0.5%
NaCl 0,5%0.5%
(pH 7,0)(pH7.0)
Medium G:Medium-G:
Glucose 0,2%Glucose 0.2%
Wollkeratin 0,5%Wool keratin 0.5%
Hefeextrakt 0,05%Yeast extract 0.05%
KH&sub2;PO&sub4; 0,1%KH₂PO₄ 0.1%
MgSO&sub4;·7H&sub2;O 0,02%MgSO₄·7H₂O 0.02%
Na&sub2;CO&sub3; 0,4%Na₂CO₃ 0.4%
(pH 9,0) Tabelle 5 Mutante Nr. erworbene Vacomycin Resistenz alkalische Cellulaseproduktion (Einheit/l) Bacillus sp. KSM-2002 0,02 (Elternstamm: Kontrolle) erworbene Ristocetin Resistenz(pH9.0) Table 5 Mutant No. Acquired Vacomycin resistance Alkaline cellulase production (unit/l) Bacillus sp. KSM-2002 0.02 (parent strain: control) Acquired Ristocetin resistance
Bacillus amyloliquefaciens KSM-22 (ATCC 23845) wird auf dem Medium E ausgebreitet, wobei jedes Medium Vancomycin oder Ristocetin mit einer vorgeschriebenen Konzentration enthält, um die minimale Hemmkonzentration (MIC) von Vancomycin oder Ristocetin auf die gleiche Weise wie in Referenzbeispiel 3 zu ermitteln. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt. Tabelle 6 Konzentration an Vancomycin Zellwachstum auf Mediumfläche Konzentration an Ristocetin (Kontrolle)Bacillus amyloliquefaciens KSM-22 (ATCC 23845) is spread on the medium E, each medium containing vancomycin or ristocetin at a prescribed concentration to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) of vancomycin or ristocetin in the same manner as in Reference Example 3. The results are shown in Table 6. Table 6 Concentration of vancomycin Cell growth on medium surface Concentration of ristocetin (control)
Bacillus amyloliquefaciens KSM-22 (ATCC 23845) wird in flüssigem Medium F okkuliert und bei 30ºC während 16 h kultiviert. NTG wird der Kulturbrühe zugesetzt bis zu der Konzentration von 30 bis 100 γ und die Kulturbrühe wird während 30 bis 60 min bei 20ºC stehenlassen. Anschließend wird eine 1%ige behandelte Kulturflüssigkeit in das flüssige Medium okkuliert und die Kultivierung wird bei 30ºC über Nacht fortgesetzt.Bacillus amyloliquefaciens KSM-22 (ATCC 23845) is inoculated into liquid medium F and cultured at 30ºC for 16 h. NTG is added to the culture broth to the concentration of 30 to 100 γ and the culture broth is left at 20ºC for 30 to 60 min. Then, 1% treated culture fluid is inoculated into the liquid medium and the culture is continued at 30ºC overnight.
Die Kulturflüssigkeit wird auf Medium E ausgebreitet, welches nicht weniger als 0,3 γ Vancomycin oder nicht weniger als 0,9 Ristocetin enthält, und wird bei 30ºC während 3 Tagen kultiviert. Die auf der Oberfläche des Mediums wachsenden Kolonien werden gesammelt. Das obige Kultivierungsverfahren wird 5 Mal wiederholt, um 5 Vancomycin-resistente Stämme und 4 Ristocetinresistente Stämme zu erhalten.The culture fluid is spread on medium E containing not less than 0.3 γ vancomycin or not less than 0.9 ristocetin and is cultured at 30ºC for 3 days. The colonies growing on the surface of the medium are collected. The above cultivation procedure is repeated 5 times to obtain 5 vancomycin-resistant strains and 4 ristocetin-resistant strains.
Jeder dieser Stämme wird in 5 ml flüssigem Medium F okkuliert und bei 30ºC während 2 Tagen kultiviert. Der Amylasetiter wird bei jeder Brühe bestimmt. Als Ergebnis erhält man Stämme mit hohem Titer, wie in Tabelle 7 zu sehen ist. Unter diesen ist ein Vancomycin-resistenter Stamm mit dem höchsten Titer (Nr. 4591) und ein Ristocetin-resistenter Stamm mit dem höchsten Titer (Nr. 4551), welche als Bacillus amyloliquefaciens KSM-22v bzw. Bacillus amyloliquefaciens KSM-22r bezeichnet werden. Diese Stämme wurden bei Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, als FERM P-9937 bzw. FERM P-9936 hinterlegt. Tabelle 7 Mutante Nr. erworbene Vancomycin-Resistenz alkalische Cellulaseproduktion (Einheit/l) Bacillus amyloliquefaciens KSM-22 (Elternstamm: Kontrolle) erworbene Ristocetin ResistenzEach of these strains is inoculated in 5 ml of liquid medium F and cultured at 30ºC for 2 days. The amylase titer of each broth is determined. As a result, high titer strains are obtained as shown in Table 7. Among them, a vancomycin-resistant strain with the highest titer (No. 4591) and a ristocetin-resistant strain with the highest titer (No. 4551) are designated as Bacillus amyloliquefaciens KSM-22v and Bacillus amyloliquefaciens KSM-22r, respectively. These strains were deposited at Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, as FERM P-9937 and FERM P-9936, respectively. Table 7 Mutant No. Acquired vancomycin resistance Alkaline cellulase production (unit/l) Bacillus amyloliquefaciens KSM-22 (parent strain: control) Acquired ristocetin resistance
Es dürfte klar sein, daß im Licht der vorstehend gegebenen Lehren zahlreiche Modifizierungen und Variationen möglich sind. Angaben betreffend die Mikroorganismen Identifizierung des Stamms Hinterlegungsnummer bei FERM Umgewandelt aus Datum der UrsprungshinterlegungIt will be appreciated that numerous modifications and variations are possible in light of the teachings given above. Information on the microorganisms Identification of the strain Deposit number at FERM Converted from date of original deposit
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