DE3788423T2

DE3788423T2 - Vorrichtung und verfahren zum inkubieren tierischer zellen.

Info

Publication number: DE3788423T2
Application number: DE87904965T
Authority: DE
Inventors: Tadashi Ishibashi; Hideo Kawaguchi; Yoji Odawara; Saeko Yoshino
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1986-08-08
Filing date: 1987-07-31
Publication date: 1994-03-24
Anticipated expiration: 2007-08-01
Also published as: JP2613892B2; KR950005423B1; EP0316449B1; CA1289093C; WO1988000965A1; DE3788423D1; EP0316449A4; EP0316449A1; KR880701772A; JPS63164880A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Züchten tierischer Zellen in einem mechanisch gerührten Züchtungsbehälter gemäß den Oberbegriffen der Ansprüche 1 und 9.
Wenn tierische Zellen in einem mechanisch gerührten Züchtungsbehälter vermehrt werden, geht Sauerstoff, der in der Dampfphase im oberen Teil des Behälters vorhanden ist, durch die Flüssigkeitsoberfläche in der flüssigen Phase in Lösung, wodurch der erforderliche Sauerstoff zugeführt wird. Die Wanderungsrate (Lösungsrate von der Dampfphase in die Flüssigkeitsphase) von Sauerstoff wird in diesem Fall beträchtlich durch die Anzahl von Umdrehungen eines Rührers (Blattes) zusammen mit der Dampf/Flüssigkeit-Grenzfläche pro Volumen Züchtungslösung und durch Erneuerung der Dampf/Flüssigkeit-Grenzfläche beeinflußt. Jedoch führt eine Erhöhung der Anzahl der Umdrehungen zu einer Erhöhung der Scherkraft, die die Zellen beschädigen oder abtöten kann, weswegen hier eine Grenze besteht. Ferner schäumt die Züchtungslösung wegen der Belüftungsbewegung heftig, da Serum derselben zugeführt wird; daher muß das Verhältnis der Flüssigkeitsmenge zum Fassungsvermögen des Behälters minimiert werden. Ferner schäumt die Züchtungslösung so, daß sie überläuft, weswegen die Züchtung nicht aufrechterhalten werden kann. Demgemäß kann die Übertragung von Sauerstoff (Auflösung in der flüssigen Phase aus der Gasphase) nicht durch Belüftung und starke Bewegung wie im Fall einer mikrobiologischen Züchtung beschleunigt werden; daher wurden verschiedene Verbesserungen versucht.
Bei einem Versuch zur Verbesserung wird (1) Sauerstoff enthaltendes Gas der Züchtungslösung zugeführt, um die Gas/ Flüssigkeit-Grenzfläche zu vergrößern, oder (2) der Flüssigkeitsspiegel wird bewegt (gestört), um die Erneuerung der Gas/Flüssigkeit-Grenzfläche zu beschleunigen. Details sind zu (1) in der Literaturstelle 1: [Ann. New York Acad. Sci. Vol. 413, Seiten 316 - 364 (1983)] und für (2) in der Literaturstelle 2: Biotechnology and Bioengineering Vo. XXVIII, Seiten 122 bis 125 (1985) gegeben. Jedoch wurden ein zufriedenstellendes Verfahren und eine Vorrichtung bisher nicht entwickelt.
Die vorstehend genannten Mängel sind beim Stand der Technik unvermeidlich, und bisher wurde immer nach einer Verbesserung gesucht, jedoch werden nachfolgend die Schwierigkeiten im einzelnen dargestellt.

(1) System mit Belüftung durch Bewegung

Ein Sauerstoff enthaltendes Gas wird in die Züchtungslösung eingeblasen (durch Gaszuführung eingebracht), die Lösung wird ferner durch ein Rührerblatt gerührt, und das Gas wird in der Lösung dispergiert. Ein Vorteil dieses Verfahrens ist es, daß das Gas kleine Blasen bildet und in der Lösung bleibt und daß daher die Gas/Flüssigkeit-Grenzfläche zunimmt und die Übertragung von Sauerstoff beschleunigt wird. Jedoch enthält eine Züchtungslösung zum Züchten tierischer Zellen häufig eine Proteinkomponente wie ein Serum oder dergleichen, weswegen sie sehr schnell Schäume bildet. Ferner zersetzt die Schaumbildung eine Zellmembran (dies wird in der Literaturstelle 1 angegeben), was die Fortpflanzung der Zellen verhindert. Als Gegenmaßnahme ist es denkbar, ein Antischäumungsmittel (oder eine oberflächenaktive Substanz) hinzuzufügen, jedoch weisen tierische Zellen anders als mikrobiologische Zellen schwache Widerstandskraft gegen ein oberflächenaktives Mittel auf, wodurch die Fortpflanzung verhindert wird, so daß es nicht verwendet werden kann. Nichts wurde bisher gefunden, das weniger virulent aber wirkungsvoll wäre.
Andererseits besteht ein Ansatz, bei dem die Zelle in einer halbdurchlässigen Kapsel wie einer solchen aus Natriumalginat oder dergleichen eingeschlossen wird, um die Zelle davor zu schützen, daß sie durch Schaumbildung verletzt wird, wobei die Kapsel in einem Züchtungsmedium suspendiert wird und ein Sauerstoff enthaltendes Gas in dieses eingeblasen wird, um die Zelle im geschäumten Zustand zu züchten. Jedoch erfordert das System eine Vorrichtung, mit der die Kapsel in sterilem Zustand hergestellt werden kann, was das Züchtungssystem verkompliziert. Ferner muß, da das Züchtungsmedium wegen der Schaumbildung in ein Abpumpsystem kommt, verhindert werden, daß ein Sterilisierfilter verstopft, und ein Rohrleitungssystem muß entsprechend gereinigt werden.

(2) System mit Rühren des Flüssigkeitsspiegels

Bei diesem Verfahren wird ein Flüssigkeitsspiegel mit einem an einer Rührachse befestigten Blatt gerührt, um den Flüssigkeitsspiegel zu stören, um dadurch die Gas/Flüssigkeit- Kontaktfläche zu vergrößern. Das Blatt, das als Oberflächenbelüfter bezeichnet wird, wirkt auf eigene Weise bei Umdrehung mit niedriger Drehzahl; jedoch arbeitet es wie eine Schäumungseinrichtung, wenn es mit hoher Drehzahl gedreht wird, um eine hohe Übertragungsrate für Sauerstoff zu erzielen. Demgemäß wird versucht, die Übertragungsrate für Sauerstoff dadurch zu verbessern, daß Sauerstoff enthaltendes Gas in eine Gasphase eingeblasen wird.
Wie oben beschrieben, wurde beim Stand der Technik die Beziehung zwischen einer Betriebsbedingung und der Schäumungseigenschaft der Züchtungslösung nicht voll berücksichtigt, die eine der einflußreichsten Faktoren, die die Realisierung einer Züchtung mit hoher Dichte beschränken.
DE-C-911 962 betrifft eine Vorrichtung, bei der Ausblasdüsen zum Ausblasen von Sauerstoff enthaltendem Gas in eine Fermentierlösung unterhalb des Flüssigkeitsspiegels vorhanden sind.
Der Artikel "Cultivation of Anchorage-dependent Cells and Their Applications" von A. L. van Wezel in J. Chem. Tehcn. Biotechnol. 1982, 32, 318-323 offenbart ein Verfahren zum Blasen eines Sauerstoff enthaltenden Gases über die Oberfläche eines Züchtungsfluids, um die Zelldichte in der Lösung zu verbessern.
Es ist eine Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Züchten tierischer Zellen anzugeben, bei denen die Belüftung und damit der Sauerstoffaustausch einer Züchtungslösung weiter verbessert ist, um dadurch eine Erhöhung der Zelldichte zu ermöglichen und um zu vermeiden, daß Blasen in die Flüssigkeit eingezogen werden.
Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst, wie sie in den Ansprüchen 1 und 9 dargelegt ist.
Bevorzugte Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in den abhängigen Ansprüchen beschrieben.
Eine erste Erscheinungsform der Erfindung ist ein Verfahren zum Züchten tierischer Zellen, wobei eine Züchtungslösung gerührt wird, während die Bildung von Turbulenzen oder Strudeln am Flüssigkeitsspiegel unterdrückt wird, um tierische Zellen in einem mechanisch gerührten Züchtungsbehälter zu züchten, wobei Sauerstoff enthaltendes Gas kontinuierlich von einer Ausblasdüse zum Flüssigkeitsspiegel hin ausgeblasen wird, um auf dem Flüssigkeitsspiegel eine Vertiefung oder Vertiefungen auszubilden. In diesem Fall ist es erwünscht, daß während des Betriebs das Produkt fG aus der Gasausblasmenge Q (cm³/s) und der Gaslineargeschwindigkeit v (cm/s) an einer Düsenspitze auf 2,5 · 10&sup5; · h oder kleiner gehalten wird, wobei der Abstand von der Düsenspitze bis zum ruhigen Flüssigkeitsspiegel h cm ist. Demgemäß ist es erwünscht, wenn die Düsenbohrung 1 mm ist, daß die Lineargeschwindigkeit des aus der Düse vertikal zum Flüssigkeitsspiegel ausgeblasenen, Sauerstoff enthaltenden Gases zwischen 5 m/s und 65 m/s am Flüssigkeitsspiegel eingestellt wird.
Eine zweite Erscheinungsform der Erfindung ist eine Vorrichtung zum Züchten tierischer Zellen in einem mechanisch gerührten Züchtungsbehälter, wobei eine einzelne Gasausblasdüse oder mehrere zum kontinuierlichen Ausblasen eines Sauerstoff enthaltenden Gases in einem Gasphasenraum im Teil über dem Flüssigkeitsspiegel so angeordnet ist bzw. sind, daß sie zum Flüssigkeitsspiegel hin zeigt bzw. hin zeigen.
In diesem Fall ist es erwünscht, daß das Rührerblatt zum Rühren der Züchtungslösung so aufgebaut ist, daß es eine mittig ausgestanzte, rechteckige Platte aufweist, die um eine halbe Drehung verwunden ist.
Eine dritte Erscheinungsform der Erfindung ist ein Verfahren zum Züchten tierischer Zellen in einem Züchtungsbehälter, während die Züchtungslösung, in der tierische Zellen dispergiert sind, mit einem Rührer gerührt wird, wobei die Züchtungslösung gerührt wird, während der Flüssigkeitsspiegel im wesentlichen glatt gehalten wird, und es wird ein Sauerstoff enthaltendes Gas kontinuierlich zum Flüssigkeitsspiegel von Gasausblasdüsen mit mehreren Löchern kontinuierlich ausgeblasen, wodurch mehrere Vertiefungen an der Flüssigkeitsoberfläche ausgebildet werden, wodurch das Sauerstoffgas in der Züchtungslösung gelöst wird.
Eine vierte Erscheinungsform der Erfindung weist ein Verfahren zum Züchten tierischer Zellen unter mechanischem Rühren der Züchtungslösung auf, wobei tierische Zellen in einem Züchtungsbehälter dispergiert sind, wobei die Züchtungslösung gerührt wird, während Schaumbildung derselben und ein Aufbrechen der tierischen Zellen verhindert wird, und ein Sauerstoff enthaltendes Gas von Gasausblasdüsen aus auf den Flüssigkeitsspiegel aufgeblasen wird, wodurch Vertiefungen auf der Flüssigkeitsoberfläche ausgebildet werden, wodurch das Sauerstoffgas in der Züchtungslösung zur Lösung gebracht wird.
Eine fünfte Erscheinungsform der Erfindung weist ein Verfahren zum Züchten tierischer Zellen in einem mechanisch gerührten Züchtungsbehälter auf, wobei die Züchtungslösung gerührt wird, während die Ausbildung von Turbulenzen oder Strudeln an der Flüssigkeitsoberfläche unterdrückt wird und ein Sauerstoff enthaltendes Gas dauernd von Gasausblasdüsen zur Flüssigkeitsoberfläche hin ausgeblasen wird, wodurch Vertiefungen an der Flüssigkeitsoberfläche ausgebildet werden und eine Strömung der Züchtungslösung vom Boden einer Vertiefung zur Flüssigkeitsoberfläche hin ausgebildet wird, wodurch das Sauerstoffgas in der Züchtungslösung in Lösung gebracht wird.
Eine sechste Erscheinungsform der Erfindung weist eine Vorrichtung zum Züchten tierischer Zellen auf, mit einem Züchtungsbehälter, der eine Züchtungslösung, in der tierische Zellen dispergiert sind, enthält, einem Rührer zum Rühren der Züchtungslösung und einer Einrichtung zum Zuführen Sauerstoff enthaltenden Gases zur Flüssigkeitsoberfläche der Züchtungslösung, wobei Gasausblasdüsen zum kontinuierlichen Ausblasen des Sauerstoff enthaltenden Gases zur Flüssigkeitsoberfläche im Gasphasenraum im Teil über der Flüssigkeitsoberfläche vorhanden sind.
Eine siebte Erscheinungsform der Erfindung weist eine Vorrichtung zum Züchten tierischer Zellen auf, mit einem Züchtungsbehälter, der eine Züchtungslösung enthält, in der tierische Zellen dispergiert sind, einem Rührer zum Rühren der Züchtungslösung und einer Einrichtung zum Zuführen von Sauerstoff enthaltenden Gases zur Oberfläche der Flüssigkeit der Züchtungslösung, wobei Gasausblasdüsen zum Ausblasen des Sauerstoff enthaltenden Gases beinahe vertikal auf die Flüssigkeitsoberfläche im Gasphasenraum im Teil über der Flüssigkeitsoberfläche vorhanden sind.
Eine achte Erscheinungsform der Erfindung weist eine Vorrichtung zum Züchten tierischer Zellen auf, mit einem Züchtungsbehälter, der eine Züchtungslösung enthält, in der tierische Zellen dispergiert sind, einem Rührer zum Rühren der Züchtungslösung und einer Einrichtung zum Zuführen eines Sauerstoff enthaltenden Gases zur Flüssigkeitsoberfläche der Züchtungslösung, mit Gasausblasdüsen zum Ausblasen des Sauerstoff enthaltenden Gases beinahe vertikal auf die Flüssigkeitsoberfläche und einer Steuerungseinrichtung zum Steuern des Ausblasdrucks aus der Düse, um dadurch Vertiefungen an der Flüssigkeitsoberfläche auszubilden.
Eine neunte Erscheinungsform der Erfindung weist ein Verfahren zum Züchten tierischer Zellen auf, die in einer Züchtungslösung in einem Züchtungsbehälter dispergiert sind, während mechanisch gerührt wird, wobei die Züchtungslösung gerührt wird, während Schaumbildung derselben und ein Aufbrechen der tierischen Zellen verhindert wird, und ein Sauerstoff enthaltendes Gas aus Gasausblasdüsen vertikal auf die Flüssigkeitsoberfläche mit einer Rate von 5 m/s bis 65 m/s (Lineargeschwindigkeit an der Flüssigkeitsoberfläche, wenn für eine Düsenbohrung von 1 mm berechnet) ausgeblasen wird, wodurch Vertiefungen an der Flüssigkeitsoberfläche ausgebildet werden, wodurch das Sauerstoff enthaltende Gas in der Züchtungslösung zur Lösung gebracht wird.
Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen detailliert beschrieben.
In Fig. 1 ist ein Züchtungsbehälter 1 ein solcher vom mechanisch gerührten Typ, in dem eine Züchtungslösung durch ein Rührblatt 3 gerührt wird. Das Rührblatt 3 ist an einer Antriebsachse eines Rührmotors 4 angebracht und wird dadurch vom Rührmotor 4 gedreht. Das Rührblatt 3 kann durch ein magnetisches System gedreht werden, wofür keine besondere Beschränkung besteht. Im Behälter sind ein Gasausblasrohr 2 zum Ausblasen eines Sauerstoff enthaltenden Gases auf die Flüssigkeitsoberfläche, ein pH-Sensor 6, ein Sensor 7 für gelösten Sauerstoff und ein Temperatursensor 8 vorhanden. Ein Thermostatgefäß 5 beheizt den Züchtungsbehälter 1. Ein Sterilisierbehälter 13, der an einem Lufteinlaß 11 und einer Abpumpöffnung 12 vorhanden ist, weist eine Bohrung von 0,2 bis 0,45 um auf und entfernt Keime im Sauerstoff enthaltenden Gas und verhindert auch, daß Keime durch die Abpumpöffnung 12 eindringen. Um Verdampfung der Züchtungslösung in Verbindung mit dem Abpumpen zu unterdrücken, wird ein Sauerstoff enthaltendes Gas, dessen Dampfdruck auf einen Wert eingestellt ist, der ungefähr dem Sättigungsdampfdruck bei der Züchtungstemperatur entspricht, dem Züchtungsbehälter 1 zugeführt. Das Filter verwendet ein hydrophobes Material wie Teflon oder dergleichen, das wenig anfällig für Verstopfung durch Feuchtigkeit ist.
Fig. 2 repräsentiert ein Beispiel für das Gasausblasrohr 2. Das Gasausblasrohr 2 wird durch ein Pufferrohr 2a, eine Ausblasdüse 2b und ein Luftrohr 2c gebildet. Das Sauerstoff enthaltende Gas gelangt über das Luftrohr 2c in das Pufferrohr 2a, und es wird bei ausgeglichenem Druck von jeder Ausblasdüse 2b ausgeblasen, die im unteren Teil des Pufferrohrs 2a vorhanden ist. Die Gasausblasseite der Ausblasdüse 2b ist auf die Flüssigkeitsoberfläche ausgerichtet, jedoch wird sie vorzugsweise parallel zur ruhigen Flüssigkeitsoberfläche gehalten. Ferner werden die Bohrung der Ausblasdüse 2b und der Abstand zwischen der Gasausblasseite und der Flüssigkeitsoberfläche so festgelegt, daß das ausgeblasene, Sauerstoff enthaltende Gas an der Flüssigkeitsoberfläche eine invertiert konische Vertiefung ausbilden kann. Wenn die Düsenbohrung 1 mm beträgt, wird die Lineargeschwindigkeit des Sauerstoff enthaltenden Gases in vertikaler Richtung an der Flüssigkeitsoberfläche auf 5 m/s oder höher eingestellt, um dadurch die invertiert konische Vertiefung an der Flüssigkeitsoberfläche auszubilden. Für die Anzahl der Ausblasdüsen 2b besteht keine praktische Begrenzung, und sie kann so eingestellt werden, daß die maximale Sauerstoffübertragungsrate erhalten wird. Wenn mehrere Ausblasdüsen 2b angebracht werden, werden sie in einer Ebene so angeordnet, daß es nicht möglich ist, daß sich die Vertiefungen an der Flüssigkeitsoberfläche einander überlappen.
Indessen wird, wenn starke Turbulenz an der Flüssigkeitsoberfläche vorhanden ist, Gas durch das Sauerstoff enthaltende Gas in die Lösung gezogen, das von der Ausblasdüse 2b ausgeblasen wird, was Schaumbildung hervorruft.
Wenn ein tiefer Strudel an der Flüssigkeitsoberfläche ausgebildet wird, ist die Ausblasdüse 2b von der Flüssigkeitsoberfläche entfernt, und demgemäß wird an ihr keine Vertiefung ausgebildet. Demgemäß ist eine ebene Flüssigkeitsoberfläche mit wenig Turbulenz bevorzugt.
Die Ausbildung von Turbulenzen oder Strudeln an der Flüssigkeitsoberfläche wird hauptsächlich durch die Form des Rührblatts 3 beeinflußt, weswegen ein geeignetes ausgewählt werden muß. Das in Fig. 1 dargestellte, mittig ausgestanzte, rechteckige Rührblatt 3 ist ein Beispiel dafür, was möglich ist, um die Ausbildung von Turbulenzen oder Strudeln an der Flüssigkeitsoberfläche zu unterdrücken.
Der Betrieb zum Züchten tierischer Zellen mit der Vorrichtung wird unter Bezugnahme auf Fig. 1 beschrieben.
Tierische Zellen werden grob in solche klassifiziert, die an einer festen Fläche wachsen, und solche, die sich in suspendiertem Zustand fortpflanzen. Bei den ersteren kann Züchtung gemäß einem Mikroträgerprozeß erfolgen, d. h. einem Prozeß, bei dem eine Zelle an einem Träger wie einem solchen aus Dextran oder dergleichen befestigt wird und der Träger suspendiert wird. Demgemäß kann die Erfindung, die sich auf Suspensionszüchtung bezieht, für tierische Zellen der beiden vorstehend genannten Arten verwendet werden.
Ein Züchtungsmedium wird steril von einer Mediumzuführöffnung 9 in den Züchtungsbehälter 1 eingespeist. Das Züchtungsmedium kann so eingespeist werden, daß ein Minimalraum (einschließlich des Abstandes von der Flüssigkeitsoberfläche bis zur Düsenausblasfläche) freigelassen wird, der zum Anbringen des Gasausblasrohrs 2 erforderlich ist, und der bevorzugte Anteil des Arbeitsvolumens des Behältervolumens beträgt 40 bis 70%. Die Züchtung beginnt nach dem Impfen mit einer Keimzelle von der Mediumzuführöffnung 9. Eine Temperaturregelung arbeitet mit dem Signal des Temperatursensors 8, und so werden die Temperatur- und die Durchflußrate von heißem Wasser, das dem Thermostatgefäß 5 zugeführt wird, geregelt, um dadurch die Temperatur der Züchtungslösung innerhalb eines vorgegebenen Bereichs zu regeln. Zu Beginn eines Züchtungsvorgangs wird ein Sauerstoff enthaltendes Gas mit etwa 5% Kohlendioxid einem Gasphasenteil des Züchtungsbehälters 1 vom Gasausblasrohr 2 mit solcher Durchflußrate zugeführt, daß keine Vertiefung auf der Flüssigkeitsoberfläche gebildet wird. Sauerstoff, wie er für die Zellfortpflanzung erforderlich ist, wird durch die Flüssigkeitsoberfläche hindurch von der Gasphase aus zugeführt. Wenn die Zellendichte niedrig ist, befindet sich die Konzentration gelösten Sauerstoffs auf keinem Wert, der ein begrenzender Faktor für die Zellfortpflanzung wäre. Das Rührblatt 3 kann maßvoll betrieben werden, jedoch schnell genug, um die Zellen gleichförmig zu verteilen. Wenn dann der Sauerstoffverbrauch ansteigt, wenn sich die Zellen fortpflanzen und die Konzentration gelösten Sauerstoffs auf einen Wert fällt, der ein begrenzender Faktor für die Zellfortpflanzung ist, wird die Ausbildung von Vertiefungen an der Flüssigkeitsoberfläche dadurch begonnen, daß Sauerstoff enthaltendes Gas aufgeblasen wird. D. h., daß ein Einstellventil für die Durchflußrate des Sauerstoff enthaltenden Gases durch eine Steuerung für gelösten Sauerstoff geöffnet wird, die ein Signal vom Sauerstoffsensor 7 empfängt, und die Durchflußrate wird so erhöht, daß in vertikaler Richtung an der Flüssigkeitsoberfläche eine Lineargeschwindigkeit von 5 m/s oder mehr erzielt wird. Der Zeitpunkt für eine Erhöhung wird als derjenige Zeitpunkt gewählt, zu dem der Pegel der Konzentration gelösten Sauerstoffs, wie er alle 10 bis 30 Minuten gemessen wird, ein solcher Pegel ist, der ein begrenzender Faktor ist oder darunter. Ferner verhindert eine Konzentration gelösten Sauerstoffs mit höherem Wert die Zellfortpflanzung. Demgemäß wird die Durchflußrate so eingestellt, daß eine Konzentration gelösten Sauerstoffs erzielt wird, die zwischen einem Wert liegt, der als begrenzender Faktor für die Zellfortpflanzung wirkt, und einem Wert, der ein Hindernis für die Zellfortpflanzung ist. Durch Steuern der Konzentration gelösten Sauerstoffs, wie oben ausgeführt, innerhalb des vorstehend genannten Bereichs, wenn die Zelldichte ansteigt, steigt die Durchflußrate des Sauerstoff enthaltenden Gases allmählich an. Wenn jedoch das Produkt fG aus der Menge, das in das Gasausblasrohr 2 eingeblasen wird, und der Gaslineargeschwindigkeit an der Düsenspitze größer als 2,5 · 10&sup5; · h wird, wird die Vertikallineargeschwindigkeit des von der Ausblasdüse 2b des Gasausblasrohrs 2 ausgeblasenen Sauerstoff enthaltenden Gases an der Flüssigkeitsoberfläche größer als 65 m/s, wenn die Düsenbohrung 1 mm ist, und Blasen werden in die Flüssigkeit gezogen, was Schaumbildung der Züchtungslösung hervorruft. D. h., daß eine Grenze für den Gasdurchsatz besteht. Wenn demgemäß die Durchflußrate des Sauerstoff enthaltenden Gases größer als ein Schwellenwert wird, sollte der Sauerstoffpartialdruck des Sauerstoff enthaltenden Gases erhöht werden.
Indessen sammeln sich, wenn die Zellendichte den hohen Wert von 1 · 106 Zellen/ml oder darüber ist, Abfallstoffe an, und die Nahrungsquelle wird unzureichend. So wird die Züchtungslösung an einem Züchtungslösungsauslaß 10 entnommen, und die Zellen werden steril abgetrennt. Dann werden die Zellen dem Züchtungsbehälter 1 zusammen mit neuem Züchtungsmedium über die Züchtungsmedium-Zuführöffnung 9 wieder zugeführt. Der Betrieb wird entweder intermittierend oder kontinuierlich ausgeführt. Ferner besteht keine besondere Beschränkung für das Abtrennverfahren für die Zellen. Durch diesen Vorgang wird nur der pH-Wert kleiner als ein optimaler Wert. Der Grund ist der, daß die Menge und Rate der Kohlendioxiderzeugung mit einer Erhöhung der Zelldichte ansteigen, weswegen die Menge gelösten Kohlendioxids ansteigt. Demgemäß werden erfindungsgemäß die Flüssigphase und die Gasphase des Kohlendioxids bei guten Bedingungen ausgetauscht. Demgemäß wird das Mischungsverhältnis des Sauerstoff enthaltenden Gases zum Kohlendioxidgas durch ein pH-Meter geändert, das das Signal des pH-Sensors 6 empfängt. D. h., daß Kohlendioxid aus der flüssigen Phase in die Gasphase ausgegeben wird und daß der pH-Wert dadurch erhöht wird, daß das Sauerstoff enthaltende Gas eingeblasen wird, während das Mischungsverhältnis zum Kohlendioxidgas verringert wird, wenn der pH- Wert unter den optimalen Wert geht. In diesem Fall wird das Mischungsverhältnis des Kohlendioxidgases allmählich auf das Verhältnis von 0,1 bis 0,5% verringert. Ferner ist dann, wenn sich Milchsäure stark angesammelt hat, die Zugabe eines alkalischen Stoffs wie von Natriumhydrogencarbonat oder dergleichen wirkungsvoll.
Da der Betrieb, bei dem Sauerstoff enthaltendes Gas kontinuierlich von einer Düse zur Flüssigkeitsoberfläche ausgeblasen wird, wodurch eine invertiert konische Vertiefung an der Flüssigkeitsoberfläche ausgebildet wird, die Gas/Flüssigkeit-Grenzfläche aufgrund der Vertiefung erhöht, und da auch eine Strömung vom Boden der invertiert konischen Vertiefung zur Flüssigkeitsoberfläche erzwungen wird, erhöht sich die Austauschrate an der Gas/Flüssigkeit-Grenzfläche, wodurch die Sauerstoffübertragungsrate erhöht wird. In diesem Fall wird die kinetische Energie des von der Düse ausgeblasenen Sauerstoff enthaltenden Gases an der Flüssigkeitsoberfläche auf einen solchen Wert eingestellt, daß die Flüssigkeitsoberfläche nach unten gedrückt wird, da Sauerstoff enthaltende Gase doch nicht durch Überwinden der Oberflächenspannung der Flüssigkeit in die Flüssigphase hineingedrückt wird. D. h., daß Schaumbildung der Züchtungslösung unterdrückt werden kann.
Gemäß der oben beschriebenen Funktion wird Schaumbildung der Züchtungslösung unterdrückt, während die Sauerstoffübertragungsrate erhöht werden kann.
Fig. 1 ist eine Zeichnung zum Aufbau des Behälters bei einem Ausführungsbeispiel der Erfindung; Fig. 2 ist eine Zeichnung für den Aufbau eines Gaseinblasrohrs im Behälter; Fig. 3 ist eine Zeichnung zum Aufbau eines Rührblatts im Behälter; Fig. 4 ist ein Diagramm, das den kritischen Wert anzeigt, bei dem Gas in die Lösung hineingezogen wird; Fig. 5 ist ein Diagramm, das die Beziehung zwischen einem Wert fG und dem Abstand zwischen einer Düsenbohrungsfläche und der Flüssigkeitsoberfläche zeigt, wenn Gas gerade in die Lösung eingezogen wird; Fig. 6 ist ein Diagramm, das die Beziehung zwischen der Vertikallineargeschwindigkeit der von einer Düse des Gasströmungsrohrs ausgeblasenen Luft an der Flüssigkeitsoberfläche und dem volumetrischen Sauerstoffübertragungskoeffizienten zeigt; Fig. 7 und Fig. 8 sind Diagramme, die die Beziehung zwischen der Drehzahl des Rührblatts mit der Luftflußrate als Parameter und dem volumetrischen Sauerstoffübertragungsratenkoeffizienten zeigen; Fig. 9, Fig. 10 und Fig. 11 sind Diagramme, die die Änderung der Zelldichte, der Konzentration gelösten Sauerstoffs bzw. des pH-Wertes abhängig von einer Änderung der Zeit nach dem Impfen als Ergebnis eines Züchtungsversuchs zeigen.

Beispiel 1

Der volumetrische Sauerstoffübertragungskoeffizient für das wäßrige System wurde durch ein Ausgasungsverfahren unter Verwendung eines Meßgeräts für gelösten Sauerstoff im Züchtungsbehälter erhalten, der mit einem erfindungsgemäßen Gasausblasmechanismus für Sauerstoff enthaltendes Gas versehen ist.
Der Züchtungsbehälter ist aufgebaut, wie dies in Fig. 1 dargestellt ist, mit einem Volumen von 5 l. Der Behälterkörper bestand aus Pyrexglas, mit einem Außendurchmesser von 160 mm und einer höhe von 270 mm. Das Gasausblasrohr war so aufgebaut, daß Rohre 14 mit sechs daran angebrachten Ausblasdüsen mit einer Bohrung von jeweils 1 mm mit gegenseitigen Abständen von 60º am unteren Teil eines ringförmigen Pufferrohrs mit einem Außendurchmesser von 78 mm angebracht waren, wobei die Düsenbohrungsflächen horizontal lagen. Dann wurde ein Rührblatt mit zwei Arten erstellt, wie in Fig. 3 dargestellt. Ein Rührblatt A wies eine Struktur auf, bei der eine Platte mit einer Breite von 80 mm und einer Höhe von 100 mm mittig gestanzt wurde, um eine rechteckige Platte mit einer Breite von 50 mm und einer Höhe von 60 mm mit einer Verwindung von 1/2 Windung auszubilden. Ein Rührblatt B wies eine Struktur auf, bei der eine rechteckige Platte einer Breite von 80 mm und einer Höhe von 100 mm um 1/2 Windung verwunden wurde. Jedes Blatt wurde so an einer Rührachse befestigt, daß sich der untere Abschnitt 20 mm vom Behälterboden entfernt befand. Das Gasausblasrohr und der Rührflügel wurden unter Verwendung des Materials SUS316 hergestellt.
2,5 l destilliertes Wasser wurden in den Züchtungsbehälter mit dem vorstehend genannten Aufbau gegeben, und das Gasausblasrohr wurde so angebracht, daß jede Gasdüsenfläche 20 mm vom Wasserspiegel entfernt war. Zunächst wurde Stickstoffgas eingeblasen, um die Konzentration gelösten Sauerstoffs auf null oder etwa diesen Wert zu verringern, der Gasphasenteil im Behälter wurde durch Luft ausgetauscht, und dann wurden das Rühren und Ausblasen von Luft aus der Düse mit vorgegebenen Bedingungen begonnen. Die Zunahme der Dichte gelösten Sauerstoffs mit der Zeit wurde durch die Meßeinrichtung für gelösten Sauerstoff erhalten, und der volumetrische Sauerstoffübertragungskoeffizient wurde durch Daten erhalten. Die Meßtemperatur betrug 37 ± 1ºC und Luft, deren Druck vorab auf den Sättigungsdampfdruck bei der vorstehend genannten Temperatur eingestellt wurde, wurde als Einblasluft verwendet.
Fig. 6 zeigt die Vertikallineargeschwindigkeit an der Flüssigkeitsoberfläche für die von der Düse ausgegebene Luft für jede Durchflußrate, und den volumetrischen Sauerstoffübertragungskoeffizienten. Es wurde das Rührblatt A verwendet, und die Drehzahl wurde konstant auf 80 U/min gehalten. Ferner wurde die Belüftungsrate durch die Luft zwischen 0 und 22 l/min gehalten. Die Vertikallineargeschwindigkeit am Flüssigkeitsspiegel der von der Düse ausgeblasenen Luft entspricht einem Wert, wie er dadurch erhalten wurde, daß die Strömungsgeschwindigkeit an einem Punkt 20 mm entfernt von der Düsenausblasfläche mit einem Anemometer in einem leeren Behälter gemessen wurde. Eine Vertiefung an der Flüssigkeitsoberfläche wurde bei einer Lineargeschwindigkeit von 5 m/s oder darüber ausgebildet, und der volumetrische Sauerstoffübertragungskoeffizient nahm gleichzeitig damit zu. Jedoch war der volumetrische Sauerstoffübertragungskoeffizient bei einer Lineargeschwindigkeit von 5 m/s oder darunter ein Wert, wie er durch einen herkömmlichen Prozeß erhalten werden kann, d. h. in einem Fall, bei dem Sauerstoff von einem Gasphasenteil im oberen Teil des Behälters durch den Flüssigkeitsspiegel übertragen wird. Ferner nahm im Fall einer Düsenbohrung von 1 mm der volumetrische Sauerstoffübertragungskoeffizient bei einer Lineargeschwindigkeit von 65 m/s oder darüber drastisch zu, da Blasen in die Flüssigkeit gezogen wurden. Wenn ein Schäumungstest dadurch ausgeführt wird, daß 10% Serum zugemischt werden, stellte sich heraus, daß Schaumbildung eindrucksvoll bei einer Lineargeschwindigkeit von 65 m/s oder darüber auftrat.
Danach wurden zum Untersuchen der Auswirkungen verschiedener Rührblätter volumetrische Sauerstoffübertragungskoeffizienten für die Rührflügel A und B gemessen, wie sie in Fig. 3 dargestellt sind. Fig. 7 repräsentiert den Fall für das Rührblatt A, während Fig. 8 den Fall für das Rührblatt B repräsentiert. Der volumetrische Sauerstoffübertragungskoeffizient nahm im ersteren Fall proportional zur Drehzahl des Rührblatts zu, erreichte im letzteren Fall jedoch bei 80 U/min ein Maximum und nahm dann ab. Es stellte sich heraus, daß der Unterschied von der Tatsache herrührt, daß während der Flüssigkeitsspiegel im ersten Fall unabhängig von der Erhöhung der Drehzahl beim Rühren mit kleinen Turbulenzen eben blieb, während im letzteren Fall Strudel gebildet wurden. Dies, weil die Lineargeschwindigkeit der Luft an der Flüssigkeitsoberfläche abnahm, da die Düsenausblasfläche durch den Strudel weiter von der Flüssigkeitsoberfläche weg beabstandet war. Es stellte sich demgemäß heraus, daß ein Rührblatt auszuwählen war, das als Ergebnis seiner Drehung keinen Strudel erzeugt.
Indessen kann sauerstoffreiches Gas verwendet werden, um die Sauerstoffübertragungsrate zu erhöhen. Zu diesem Zweck wurde der volumetrische Sauerstoffübertragungskoeffizient durch ein sauerstoffreiches Gas mit 40% Sauerstoff gemessen. Gemäß den Meßbedingungen wurde das Rührblatt A verwendet, und die Drehzahl wurde konstant auf 80 U/min gehalten. Ferner betrug die Belüftungsrate mit dem sauerstoffreichen Gas 12,5 l/m.
Das Meßergebnis ist in Fig. 5 dargestellt. Es stellte sich heraus, daß es zu einer Verbesserung auf etwa das 1,5-fache im Vergleich zum Fall der Verwendung von Luft kam. Ein höherer volumetrischer Sauerstoffübertragungskoeffizient kann wirkungsvoll aus einer Kombination der Erfindung und der Verwendung sauerstoffreichen Gases erzielt werden.

Beispiel 2

Der volumetrische Sauerstoffübertragungskoeffizient wurde bei der beim Beispiel 1 verwendeten Vorrichtung unter Düsen mit Bohrungen von 0,3; 0,4; 1,0; 2,5 oder 5 mm erhalten.
Die Meßbedingungen sind die folgenden. Sechs Düsen wurden am Gasausblasrohr so angebracht, daß der Abstand zwischen der Bohrungsfläche und dem Flüssigkeitsspiegel 20 mm betrug. In den Behälter wurden 2,5 l destilliertes Wasser eingefüllt, und mit dem Rührblatt A wurde konstant mit einer Drehzahl von 80 U/min gerührt. Die Meßtemperatur betrug 37 ± 1ºC und die Messung wurde mit einem Ausgasungsverfahren ausgeführt wie im Fall des Beispiels 1.
Das Meßergebnis ist in Fig. 4 dargestellt. In der Zeichnung repräsentiert fG das Produkt aus der in das Gasausblasrohr eingeblasenen Gasmenge und der Gaslineargeschwindigkeit an der Düsenspitze.
Eine Kraft F, die auf eine ebene Platte wirkt, wenn eine strahlförmige Strömung auf die ebene Platte trifft, wird durch die Gleichung (1) in "Guide to Mechanical Designing" (von Maruzen Co., Ltd. am 25. Juni 1958 herausgegeben), Seite 1504 gegeben:
F = (γ/g) Qv (1),
wobei γ das Gewicht pro Einheitsvolumen, g die Erdbeschleunigung, Q die Durchflußrate und v die Geschwindigkeit der strahlförmigen Strömung bezeichnen.
Es wurde überlegt, daß die Kraft des aus der Düse ausgeblasenen Gases zum Herunterdrücken der Flüssigkeitsoberfläche proportional zum Produkt aus der Strömungsrate des ausgeblasenen Gases und der Gaslineargeschwindigkeit an der Düsenspitze gemäß der obigen Gleichung proportional ist. Hierbei wird die Kraft FG des Ausblasgases zum Herunterdrücken der Flüssigkeitsoberfläche dadurch erhalten, daß die Durchflußrate g (cm³/s) für das ausgeblasene Gas pro Düse und die Gaslineargeschwindigkeit (cm/s) an der Düsenspitze für jede Bedingung berechnet werden. D. h., daß eine Kraft f für das aus jeder Düse ausgeblasene Gas, um die Flüssigkeitsoberfläche um v herunterzudrücken, durch Gleichung (2) gegeben ist:
f=k · q · v (2),
wobei k eine Proportionalitätskonstante ist. Demgemäß ist FG wie folgt gegeben:
FG = 6 · f (3),
wobei für g gilt:
q = QG/t (4),
QG: Mene des in das Gasausblasrohr eingeblasenen Gases. Demgemäß ist FG wie folgt gegeben:
FG = k · QG · v (5),
(QG · v wird in Gleichung (5) durch fG repräsentiert).
Gemäß Fig. 4 stellte sich heraus, daß dann, wenn fG für jede Düse gleich war, der volumetrische Sauerstoffübertragungskoeffizient (h&supmin;¹) fast auf demselben Wert blieb. D. h., daß dann, wenn die Kraft des Ausblasgases zum Herunterdrücken der Flüssigkeitsoberfläche identisch ist, derselbe volumetrische Sauerstoffübertragungskoeffizient unabhängig von einer Änderung der Düsenbohrung erhalten wurde. Ferner wurde beobachtet, daß Gas in die Flüssigkeit hineingezogen wurde, wenn der Wert fG für jede Düsenbohrung 2,5 · 10&sup6; [(cm²/s)²] betrug.
Demgemäß ist dann, wenn die Beziehung zwischen dem volumetrischen Sauerstoffübertragungskoeffizienten und dem Wert fG vorab durch eine beliebige Düse erhalten wird, der volumetrische Sauerstoffübertragungskoeffizient dadurch erhältlich, daß der Wert fG berechnet wird, ohne die Lineargeschwindigkeit an der Flüssigkeitsoberfläche zu messen, selbst wenn die Düsenbohrung geändert wird.

Beispiel 3

Für das Beispiel 2 wurde für den Fall einer einzigen Düse ein Wert für fG erhalten, bei dem das Ausblasgas gerade in die Flüssigkeit gezogen wird, wenn der Abstand zwischen der Düsenausblasfläche und dem ruhigen Flüssigkeitsspiegel verändert wurde.
Das Ergebnis ist in Fig. 5 dargestellt. Der Abstand zwischen der Düsenbohrungsfläche und dem Flüssigkeitsspiegel wurde mit 10 mm, 20 mm und 40 mm vorgegeben.
Aus Fig. 5 stellte sich heraus, daß der Wert von fG, bei dem das Gas gerade in die Flüssigkeit gezogen wird, proportional zum Abstand zwischen der Düsenbohrungsfläche und dem Flüssigkeitsspiegel ist. Demgemäß kann dann, wenn der Abstand zwischen der Düsenbohrungsfläche und dem ruhigen Flüssigkeitsspiegel h cm beträgt, der Wert von fG, bei dem kein Gas in die Flüssigkeit gezogen wird, auf 2,5 · 10&sup5; · h oder darunter eingestellt werden.

Beispiel 4

In dem beim Beispiel 1 verwendeten Züchtungsbehälter wurde ein Züchtungsversuch ausgeführt. Dann wurde ein anderer Züchtungsversuch als Vergleichsbeispiel gemäß einem herkömmlichen Prozeß ausgeführt.
JTC-1 (errichtete Zellenlinie, die aus einem aszitischen Hepatom einer Ratte gewonnen wurde und suspendierbar ist) wurde als dem Versuch unterworfene Zelle verwendet. Eine Mischung von 10% Serum eines neugeborenen Kalbs und DM-160 (von Kyokuto Seiyaku hergestellt) wurde als Züchtungsmedium verwendet. Die Menge des hergestellten Züchtungsmediums betrug 2,5 l. Es wurde das Rührblatt vom Typ A in Fig. 3 verwendet, und die Düsenausblasfläche des Gasausblasrohrs war 20 mm vom Flüssigkeitsspiegel entfernt.
Die Züchtungsbedingungen waren die folgenden. Die Drehzahl des Rührblatts wurde konstant auf 80 U/min gehalten, und die Züchtungstemperatur wurde auf 36 ± 1ºC geregelt. Das Sauerstoff enthaltende Gas war eine Mischung aus Luft und Kohlendioxid, das dadurch beim Sättigungsdampfdruck gehalten wurde, daß es auf Wasser von 37ºC geblasen wurde. Dann wurde es durch ein Sterilisierfilter von 0,45 u in den Behälter eingespeist. Zu Beginn des Züchtungsvorgangs wurde die Flüssigkeit mit dem Mischgas mit einer Rate von 0,2 l/min belüftet, um keine Vertiefung an der Oberfläche auszubilden.
Die Anfangskonzentration des Kohlendioxidgases betrug 5V/V%. Die Ausbildung einer Vertiefung an der Flüssigkeitsoberfläche durch das aufgeblasene, Sauerstoff enthaltende Gas wurde begonnen, wenn die Konzentration gelösten Sauerstoffs 2 ppm oder weniger wurde. Die Durchflußrate des Sauerstoff enthaltenden Gases wurde danach so eingestellt, daß die Konzentration gelösten Sauerstoffs auf 2 ppm gehalten wurde. Das Mischungsverhältnis von Kohlendioxid wurde erniedrigt, nachdem die Zellendichte den Wert 1,5 · 106 Zellen/ml erreicht hatte. Beim Vergleichsbeispiel wurde mit Kohlendioxidgas gemischte Luft mit einer Konzentration von 5V/V% konstant mit 0,2 l/min eingeblasen. Ferner wurde das Züchtungsmedium während des Versuchs ausgetauscht, um Abfallstoffe zu beseitigen und um eine Nahrungsquelle zuzugeben. Das Austauschverhältnis betrug 100%.
Die Züchtungsergebnisse sind in Fig. 9, Fig. 10 und Fig. 11 dargestellt. Wie in Fig. 9 gezeigt, nahmen, während die Zellen im Vergleichsbeispiel eine Obergrenze bei einer Zellendichte von etwa 3 · 10&sup6; Zellen/ml erreichten (herkömmlicher Prozeß), die Zellen bei der Erfindung mit derselben Fortpflanzungsgeschwindigkeit wie beim Vergleichsbeispiel zu und pflanzten sich beinahe exponentiell bis zu 1,2 · 10&sup7; Zellen fort. Beide pH-Werte lagen innerhalb der Züchtungsperiode zwischen 6,9 und 7,5, wie in Fig. 11 dargestellt, und so war der pH-Wert nicht als begrenzender Faktor für das Wachstum von Einfluß. Demgemäß beruht der vorstehend genannte Unterschied auf den folgenden Gründen. Die Dichte gelösten Sauerstoffs beim Vergleichsbeispiel betrug bei einer Zellendichte von 1,4 · 10&sup6; Zellen/ml oder darüber beinahe null, wie in Fig. 10 dargestellt, was ein begrenzender Faktor für die Fortpflanzung ist. Andererseits konnte, da bei der Erfindung eine hohe Sauerstoffübertragungsrate erzielbar war, wie beim Beispiel 1 gezeigt, die Konzentration gelösten Sauerstoffs bis zum Ende des Züchtungsvorgangs auf 1,8 bis 2,6 ppm gehalten werden, so daß also der für die Fortpflanzung erhaltene Sauerstoff ausreichend zugeführt werden konnte.
Während des Züchtungsvorgangs wurde keine merkliche Schaumbildung beobachtet, und die Lebensfähigkeit der Zellen betrug zu Ende des Züchtungsvorgangs 85%, was keine deutliche Verringerung im Vergleich zu den 88% zum Zeitpunkt des Beginns der Züchtung ist.
Wie oben angegeben, wurde bestätigt, daß Zellen mit einer Dichte gezüchtet werden konnten, die mehr als das Dreifache als beim herkömmlichen Prozeß ist, selbst wenn bei der Erfindung Luft als Sauerstoff enthaltendes Gas verwendet wurde.
Es wird darauf hingewiesen, daß erfindungsgemäß die flüssige Phase und die gasförmige Gase des Kohlendioxids in gutem Zustand ausgetauscht werden können. Dies tritt im Bereich des pH-Werts zu dem Zeitpunkt auf, zu dem eine Vertiefung an der Flüssigkeitsoberfläche ausgebildet wird. Während beim Vergleichsbeispiel der pH-Wert abnahm, nahm er bei der Erfindung zu. D. h., daß die Massenübertragung für ein Gas zwischen der flüssigen Phase und der gasförmigen Phase dadurch erhöht wird, daß das Sauerstoff enthaltende Gas auf die Flüssigkeitsoberfläche aufgeblasen wird und dort eine Vertiefung ausgebildet wird, wodurch das Kohlendioxid in der flüssigen Phase bei der Erfindung unter guten Bedingungen in die Gasphase ausgegeben werden kann. Ferner kann bei der Erfindung selbst in einer Züchtung hoher Dichte, in der die Erzeugungsrate von Kohlendioxid hoch ist, die Massenübertragungsrate eines Gases zwischen der flüssigen Phase und der gasförmigen Phase erhöht werden; daher kann das Kohlendioxid von der flüssigen Phase in die gasförmige Phase dadurch ausgegeben werden, daß ein Sauerstoff enthaltendes Gas mit geringer Konzentration an Kohlendioxidgas verwendet wird. Demgemäß kann, wie dies in Fig. 11 dargestellt ist, eine Verringerung des pH-Wertes, wie sie von einem Ansammeln des gelösten Kohlendioxids herrühren würde, unterdrückt werden.
Erfindungsgemäß kann die Massenübertragungsrate von Gas zwischen der Gasphase im oberen Teil eines mechanisch gerührten Züchtungsbehälters und der flüssigen Phase der Züchtungslösung erhöht werden, während Schaumbildung der Züchtungslösung im Behälter unterdrückt wird.

Claims

1. Verfahren zur Züchtung tierischer Zellen in einem mechanisch gerührten Züchtungsbehälter, wobei eine Züchtungslösung unter Vermeidung der Bildung von Turbulenzen oder Strudeln auf der Flüssigkeitsoberfläche gerührt wird und ein sauerstoffhaltiges Gas aus zumindest einer Blasdüse kontinuierlich auf die Flüssigkeitsoberfläche ausgeblasen wird, dadurch gekennzeichnet, daß das Produkt (fG) der Gasdurchflußrate und der Gaslineargeschwindigkeit an der Düsenmündung den Wert 2,5 · 10&sup5; ((cm²/s)²), multipliziert mit der Entfernung h (cm) von der Düsenmündung zur glatten Flüssigkeitsoberfläche, nicht überschreitet und daß zumindest eine Vertiefung durch das Gas gebildet wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Gas derartig ausgeblasen wird, daß die Gaslineargeschwindigkeit des sauerstoffhaltigen Gases, das von einer Blasdüse mit 1 mm Bohrung auf die Flüssigkeitsoberfläche ausgeblasen wird, 5 m/s bis einschließlich 65 m/s beträgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die tierischen Zellen mittels eines Rührers dispergiert werden und die Züchtungslösung umgerührt wird, während die Oberfläche der Züchtungslösung im wesentlichen glatt gehalten wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem der Rührer ein Rührblatt mit einer um eine halbe Drehung verwundenen, mittig ausgestanzten rechteckigen Platte aufweist.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem eine Züchtungslösung unter Vermeidung der Bildung von Turbulenzen oder Strudeln auf der Flüssigkeitsoberfläche und unter Erzeugung einer Strömung von der Züchtungslösung aus dem Bodenabschnitt der Vertiefung in Richtung der Flüssigkeitsoberfläche gerührt wird, und ein sauerstoffhaltiges Gas in der Züchtungslösung gelöst wird.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das sauerstoffhaltige Gas unter derartigen Bedingungen in Richtung der Flüssigkeitsoberfläche ausgeblasen wird, daß eine invertierte, konische Vertiefung auf der Flüssigkeitsoberfläche gebildet wird und der Sauerstoff in der Züchtungslösung gelöst wird, während im wesentlichen verhindert wird, daß Blasen in die Züchtungslösung gezogen werden.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Durchflußrate des sauerstoffhaltigen Gases mit der Zeit erhöht wird, um eine Konzentration gelösten Sauerstoffs zu erhalten, der oberhalb desjenigen Wertes liegt, welcher ein begrenzender Faktor für die Vermehrung der tierischen Zellen wäre.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Sauerstoffgehalt des sauerstoffhaltigen Gases erhöht wird, wenn die Durchflußrate sich einem Wert nähert, bei dem das Produkt fG 2,5 · 10&sup5; ((cm²/s)²) · h beträgt.

9. Vorrichtung zur Züchtung tierischer Zellen mit einem Züchtungsbehälter (1) zur Aufnahme einer Züchtungslösung, in der tierische Zellen dispergiert sind, mit einem Rührer (3) zum Umrühren der Züchtungslösung, mit einer Einrichtung (2) zur Zuführung eines sauerstoffhaltigen Gases auf die Flüssigkeitsoberfläche der Züchtungslösung, wobei zumindest eine Gasblasdüse (2b) oberhalb der Flüssigkeitsoberfläche vorgesehen ist, um das Gas kontinuierlich in Richtung der Oberfläche auszublasen, und mit einer Regeleinrichtung zur Regelung des Ausblasdrucks des Gases aus der Düse, um eine Vertiefung in der Flüssigkeitsoberfläche zu bilden.

10. Vorrichtung nach Anspruch 9, bei der die Gasblasdüse (2b) das sauerstoffhaltige Gas nahezu vertikal in Richtung der Flüssigkeitsoberfläche ausbläst.

11. Vorrichtung nach Anspruch 9, wobei der Rührer (3) ein Rührblatt mit einer um eine halbe Drehung verwundenen, mittig ausgestanzten rechteckigen Platte aufweist.