CN108624499A - 一种哺乳动物细胞大规模生产培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种哺乳动物细胞大规模生产培养方法，依序由细胞复苏及摇瓶扩培步骤、罐扩培步骤和罐生产步骤组成；所述罐生产步骤在一次性生物反应器中进行；且在泡沫产生高峰期，控制排气流量为排气流量的80‑100％；并添加质量百分比浓度为0.01‑0.1％的消泡剂；且按罐生产步骤之细胞接种后细胞培养液总体积140升计算，消泡剂的添加速度为每小时2.5‑10毫升。本发明通过采用一次性生物反应器大规模生产培养高泡沫量的哺乳动物细胞，既能实现其高质高产，又能有效的控制消泡剂的添加总量，保证了生产培养的顺利进行。

Description

一种哺乳动物细胞大规模生产培养方法
技术领域
本发明属于细胞生产培养技术领域，具体涉及一种哺乳动物细胞大规模生产培养方法。
背景技术
目前，工业上进行细胞大规模培养使用的设备主要为不锈钢细胞罐和一次性生物反应器。不锈钢细胞罐可以根据细胞生长与生产特性更换/增加/减少不同附属件，以实现细胞的高质高产。但不锈钢细胞罐由于存在使用与维护成本高、管道公用工程施工较复杂、增加清洁及验证工序环节等不利影响，近年来被一次性生物反应器替代的趋势越来越明显。一次性生物反应器主要由固定支撑结构、控制器与一次性生物反应袋组成。一次性生物反应袋为一次性无菌产品，无需进行蒸汽灭菌，因此厂房建设时无需考虑蒸汽、罐降温冷水、热排及冷排管道，降低了管道施工难度。每批次生产完成后，细胞袋直接丢弃，还可减少清洁及验证工序。但是，一次性生物反应袋为定型产品，几乎不可对内部空间结构进行再改造，限制了对细胞高质高产的进一步探索；同时对生产过程中出现的某些不利现象(例如泡沫量大)，能用于进行改善的手段也有限。
细胞大规模生产培养过程中，随着细胞的生长和产物表达，培养液黏度逐渐增加，由于通气和搅拌的原因，不可避免会产生泡沫。泡沫过多时，可通过对通气孔径、通气量和搅拌转速等进行工艺优化，减少泡沫的产生量。若工艺优化对泡沫的改善效果不明显时，可采用添加消泡剂、加压/短时负压、加热、除泡筛网、机械消泡等常用的除泡手段。但是，由于一次性生物反应器的一次性生物反应袋为一次性无菌塑料产品，不耐压、不耐热、无菌封闭，且多为磁力底搅拌，因此上述除泡方法中只有添加消泡剂适用于一次性生物反应器。
细胞培养生产用药一般为蛋白类药物，临床上往往以制剂形式回输进行疾病治疗，生产中使用的原辅料必须严格控制，保证对临床使用的安全性。迄今为止，市面上还没有注射剂级别的消泡剂，因此必须严格控制消泡剂的使用量，以减少下游纯化压力，使原液中消泡剂的残留量达到规定限度以内。对于高泡沫量的哺乳动物细胞培养工艺而言，增大消泡剂的使用量能实现高质高产，但会增加药品下游开发的难度和风险。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足之处，提供一种哺乳动物细胞大规模生产培养方法，既能实现细胞的高质高产，又能有效控制消泡剂的添加量。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种哺乳动物细胞大规模生产培养方法，依序由细胞复苏及摇瓶扩培步骤、罐扩培步骤和罐生产步骤组成；所述罐生产步骤在一次性生物反应器中进行；且在泡沫产生高峰期，控制排气流量为排气流量的80-100％；并添加质量百分比浓度为0.01-0.1％的消泡剂；且按罐生产步骤之细胞接种后细胞培养液总体积140升计算，消泡剂的添加速度为每小时2.5-10毫升。
进一步，本发明对罐生产步骤的一次性生物反应器进行压力预警，压力警戒上限为42mbar；及在泡沫产生高峰期内，按罐生产步骤之细胞接种后细胞培养液总体积140升计算，每天24小时内的碱添加量不超过2000毫升。
进一步，本发明在泡沫产生高峰期的到达细胞密度峰值前的时间段，消泡剂的添加速度从每小时2.5毫升到每小时10毫升之间递增；在泡沫产生高峰期的过了细胞密度峰值后的时间段，消泡剂的添加速度从每小时10毫升到每小时2.5毫升之间递减。
进一步，本发明所述一次性生物反应器采用Xcellerex-XDR型一次性生物反应器，其一次性生物反应袋的顶部具有两个通气接口，其中一个通气接口连接消泡剂添加组件，另一个通气接口连接泡沫引流组件。
进一步，本发明所述消泡剂添加组件主要由一个三通、一个排气滤器、一个内置消泡剂的容器和蠕动泵组成；所述三通的第一接口与所述一次性生物反应袋的一个通气接口连接；所述排气滤器与所述三通的第二接口连接；所述蠕动泵的输出端与所述三通的第三接口连接；所述内置消泡剂的容器与所述蠕动泵的输入端连接。
进一步，本发明所述泡沫引流组件主要由抽气装置、无菌密闭容器和排气滤器组成；所述抽气装置的输入端通过连接管与所述一次性生物反应袋的另一个通气接口连接，其输出端通过连接管与所述无菌密闭容器连接；所述排气滤器的输入端通过连接管与所述无菌密闭容器连接；所述无菌密闭容器内盛装少量消泡剂。
进一步，本发明所述抽气装置为蠕动泵；所述抽气装置与一次性生物反应袋之间的连接管为硅胶管或C-flex管；及有一不锈钢中空管，以可滑动方式设置在所述抽气装置与一次性生物反应袋之间的连接管中，且该不锈钢中空管的一端经所述一次性生物反应袋的另一个通气接口延伸入所述一次性生物反应袋中，其另一端留置于所述抽气装置与一次性生物反应袋之间的连接管中。
进一步，本发明所述不锈钢中空管的另一端设有套管，所述不锈钢中空管的另一端通过该套管留置于所述抽气装置与一次性生物反应袋之间的连接管中。
进一步，本发明所述哺乳动物细胞主要是适用于药用重组蛋白生产的主流哺乳动物宿主细胞，包括CHO DG44细胞、CHO-K1细胞、CHO DUXB-11细胞和SP2/0细胞。
本发明通过采用一次性生物反应器大规模生产培养高泡沫量的哺乳动物细胞，既能实现其高质高产，又能有效的控制消泡剂的添加总量，保证了生产培养的顺利进行。
附图说明
图1是本发明所述的罐生产步骤所采用的一次性生物反应袋的结构示意图。
图2是本发明所述泡沫引流组件的结构示意图。
图3是本发明所述的罐生产步骤中活细胞密度与细胞活率曲线图。
图中：
1—一次性生物反应袋本体；11—通气接口；2—消泡剂添加组件；21—三通；22—排气滤器；23—内置消泡剂的容器；24—蠕动泵；3—泡沫引流组件；31—抽气装置；32—无菌密闭容器；33—排气滤器；34—连接管；35—不锈钢中空管；36—套管。
现结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
具体实施方式
本发明所述的一种哺乳动物细胞大规模生产培养方法，依序由细胞复苏及摇瓶扩培步骤、罐扩培步骤和罐生产步骤组成，其中罐生产步骤在一次性生物反应器中进行。该一次性生物反应器的一次性生物反应袋的结构如图1和图2所示。该一次性生物反应袋采用Xcellerex-XDR型的一次性生物反应袋结构，其一次性生物反应袋本体1的顶部具有两个通气接口11，其中一个通气接口连接消泡剂添加组件2，另一个通气接口连接泡沫引流组件3。
所述的消泡剂添加组件2主要由一个三通21、一个排气滤器22、一个内置消泡剂的容器23和蠕动泵24组成。三通21的第一接口与所述一次性生物反应袋的一个通气接口连接；排气滤器22与三通的第二接口连接；蠕动泵24的输出端与三通的第三接口连接；内置消泡剂的容器与蠕动泵的输入端连接。
所述的泡沫引流组件3主要由抽气装置31、无菌密闭容器32、排气滤器33、连接管34和不锈钢中空管35组成，连接管34采用硅胶管或C-flex管。抽气装置31为蠕动泵，其输入端通过连接管与一次性生物反应袋的另一个通气接口连接，其输出端通过连接管与无菌密闭容器连接。排气滤器的输入端通过连接管与无菌密闭容器连接。无菌密闭容器内盛装少量消泡剂。不锈钢中空管以可滑动方式设置在蠕动泵与一次性生物反应袋之间的连接管中，且该不锈钢中空管的一端经一次性生物反应袋的另一个通气接口延伸入一次性生物反应袋中，其另一端则设有套管36而留置于抽气装置与一次性生物反应袋之间的连接管中。
本发明适用于生产培养药用重组蛋白生产的主流哺乳动物宿主细胞，如CHODG44、CHO-K1、CHO DUXB-11、SP2/0等。
现以购于ATCC的CHO DUXB-11细胞为例，在XDR200一次性生物反应器上进行fed-batch培养，具体方法步骤如下：
1、细胞复苏及摇瓶扩培步骤：
取一支冻存细胞，37℃水浴解冻，加入到10ml CHO growth A培养基混匀，1000rpm离心5分钟，移除上清，再加入10mL CHO growth A培养基混匀，移至250mL摇瓶，继续加培养基到工作体积40mL，放入37℃、5％CO2、130rpm转速下培养。
培养2-3天后，取样计数，将细胞进行扩大培养，接种密度维持在4-6×105cells/mL，扩培周期2-3天。
2、罐扩培步骤：
罐扩培在XDR200一次性生物反应器中进行，在摇瓶种子细胞体积达到8L以后，转种到扩培罐，工作体积设定在40L。扩培罐控制条件如下：37±0.5℃、pH 7.00±0.05、90rpm、DO 30％、overlay 0.07vvm、sparge 0.01vvm。培养周期3d±12h。
3、罐生产步骤：
罐生产在XDR200一次性生物反应器中进行，该一次性生物反应器的一次性生物反应袋的结构如图1所示。经过计算，通过无菌转移废弃多余细胞量，再无菌加入新鲜CHOgrowth A培养基，接种后细胞培养液体积140L。生产罐控制条件如下：36±0.5℃、pH 6.95±0.05、120rpm、DO 30％、overlay 0.07vvm、sparge 0.01vvm。D3、D5、D7和D9分别补料5％、5％、5％和5％CHO feed 1培养基，同时添加葡萄糖到8g/L。培养周期15d±1d。
细胞生产培养D0时，开启压力预警，并设定压力警戒上限42mbar。
细胞生产培养进入D5时(泡沫产生高峰期)，将消泡剂添加组件连接到一次性生物反应袋中，开启蠕动泵添加消泡剂，消泡剂的质量百分比浓度为0.01-0.1％；流速为2.5mL/小时。同时，将泡沫引流组件无菌对接到一次性生物反应袋中，将排气流量与排气流量偶联，对参数进行设置，使排气流量维持在排气流量的80％-100％。自D5天起，每天对24小时内碱的添加上限进行控制，使添加量不超过2000mL。
随着生产培养持续进行，细胞密度越来越高，在D10-D11达到细胞密度峰值。细胞生产培养在D5-D11之间，根据泡沫表现，设置消泡剂添加流速从2.5mL/小时到10mL/小时之间递增。当细胞密度经过峰值以后，细胞代谢活动开始下降，通气量持续降低，设置消泡剂添加流速从10mL/小时到2.5mL/小时之间递减。
罐生产步骤的生产培养周期为15d±1d，根据细胞活率表现，对终末细胞培养液进行收获，得到澄清的细胞收获液。
本实施例的整个罐生产培养过程，泡沫可控，没有发生泡沫堵塞排气滤器的现象。细胞生长表现良好，细胞生长曲线见图3。
本发明的消泡剂添加组件的消泡剂添加量刚好能使其排气滤器口持续湿润，泡沫在到达该排气滤器口时立即破裂。
当细胞在达到密度峰值左右时，泡沫的产生不是持续均匀的，呈现出一股一股的涌动膨胀。在短暂的瞬间，涌动膨胀可能会使泡沫接触到排气滤器口，随着气流快速向上突破，在排气管道内破裂，形成的气溶胶会堵塞排气滤器，此时泡沫引流组件对一次性生物反应袋进行抽气，一次性生物反应袋内大部分气体从该路排气管路排除的同时，涌动膨胀的泡沫也随该路排气管路排到无菌密闭容器中，在接触到无菌密闭容器中的消泡剂后立即破裂。
在罐生产步骤中，一旦发生意外情况而导致泡沫堵塞排气滤器，一次性生物反应器的压力会瞬时升高，压力预警可及时感知到排气发生堵塞，人员可立即进行处理。从发现压力警报到警报解除，由于各种因素，中间经历的时间可能会比较长，压力报警后，生物反应器为防止压力过高发生危险，一般设置成自动关闭进气。此时细胞缺氧进行无氧呼吸，产生大量乳酸。控制器为维持培养液pH稳定，持续添加大量碱液，导致渗透压急剧增加，使细胞大量死亡。为避免此类现象发生，对生物反应器24小时内碱的添加上限进行设置和控制，可维持细胞培养工艺的稳定。

Claims (9)

1.一种哺乳动物细胞大规模生产培养方法，依序由细胞复苏及摇瓶扩培步骤、罐扩培步骤和罐生产步骤组成，其特征在于，
所述罐生产步骤在一次性生物反应器中进行；且
在泡沫产生高峰期，控制排气流量为排气流量的80-100％；并添加质量百分比浓度为0.01-0.1％的消泡剂；且按罐生产步骤之细胞接种后细胞培养液总体积140升计算，消泡剂的添加速度为每小时2.5-10毫升。
2.根据权利要求1所述的一种哺乳动物细胞大规模生产培养方法，其特征在于，对罐生产步骤的一次性生物反应器进行压力预警，压力警戒上限为42mbar；及在泡沫产生高峰期内，按罐生产步骤之细胞接种后细胞培养液总体积140升计算，每天24小时内的碱添加量不超过2000毫升。
3.根据权利要求1所述的一种哺乳动物细胞大规模生产培养方法，其特征在于，在泡沫产生高峰期的到达细胞密度峰值前的时间段，消泡剂的添加速度从每小时2.5毫升到每小时10毫升之间递增；在泡沫产生高峰期的过了细胞密度峰值后的时间段，消泡剂的添加速度从每小时10毫升到每小时2.5毫升之间递减。
4.根据权利要求1所述的一种哺乳动物细胞大规模生产培养方法，其特征在于，所述一次性生物反应器采用Xcellerex-XDR型一次性生物反应器，其一次性生物反应袋的顶部具有两个通气接口，其中一个通气接口连接消泡剂添加组件，另一个通气接口连接泡沫引流组件。
5.根据权利要求4所述的一种哺乳动物细胞大规模生产培养方法，其特征在于，所述消泡剂添加组件主要由一个三通、一个排气滤器、一个内置消泡剂的容器和蠕动泵组成；所述三通的第一接口与所述一次性生物反应袋的一个通气接口连接；所述排气滤器与所述三通的第二接口连接；所述蠕动泵的输出端与所述三通的第三接口连接；所述内置消泡剂的容器与所述蠕动泵的输入端连接。
6.根据权利要求4或5所述的一种哺乳动物细胞大规模生产培养方法，其特征在于，所述泡沫引流组件主要由抽气装置、无菌密闭容器和排气滤器组成；所述抽气装置的输入端通过连接管与所述一次性生物反应袋的另一个通气接口连接，其输出端通过连接管与所述无菌密闭容器连接；所述排气滤器的输入端通过连接管与所述无菌密闭容器连接；所述无菌密闭容器内盛装少量消泡剂。
7.根据权利要求6所述的一种哺乳动物细胞大规模生产培养方法，其特征在于，所述抽气装置为蠕动泵；所述抽气装置与一次性生物反应袋之间的连接管为硅胶管或C-flex管；及有一不锈钢中空管，以可滑动方式设置在所述抽气装置与一次性生物反应袋之间的连接管中，且该不锈钢中空管的一端经所述一次性生物反应袋的另一个通气接口延伸入所述一次性生物反应袋中，其另一端留置于所述抽气装置与一次性生物反应袋之间的连接管中。
8.根据权利要求7所述的一种哺乳动物细胞大规模生产培养方法，其特征在于，所述不锈钢中空管的另一端设有套管，所述不锈钢中空管的另一端通过该套管留置于所述抽气装置与一次性生物反应袋之间的连接管中。
9.根据权利要求1所述的一种哺乳动物细胞大规模生产培养方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞主要是适用于药用重组蛋白生产的主流哺乳动物宿主细胞，包括CHO DG44细胞、CHO-K1细胞、CHO DUXB-11细胞和SP2/0细胞。
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