DE3786586T2

DE3786586T2 - Genexpressionssystem.

Info

Publication number: DE3786586T2
Application number: DE87303397T
Authority: DE
Inventors: Sven Hastrup
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1986-04-17
Filing date: 1987-04-16
Publication date: 1993-10-28
Anticipated expiration: 2007-04-17
Also published as: EP0242220A3; JPS63157987A; DK177786A; EP0242220B1; DK160947B; EP0242220A2; ES2058108T3; DK160947C; ATE91715T1; DK177786D0; US5036002A; DE3786586D1

Description

Diese Erfindung betrifft im allgemeinen Genexpressionssysteme, die einen Expressionsvektor und ein "trans- wirkendes DNA-Segment" umfassen, wobei der Expressionsvektor das (die) zu exprimierende(n) Gen(e) und ein oder mehrere cis-wirkende Regulatorelemente umfaßt, die auf einen transwirkenden Faktor ansprechen, der von besagtem "trans- wirkenden DNA-Segment" produziert wird. Genauer gesagt betrifft die Erfindung solche Genexpressionssysteme, in denen besagtes "trans-wirkende DNA-Segment" und besagte cis- wirkenden Regulatorelemente ein oder mehrere Segmente des Genoms aus einer Bacillus-Spezies umfassen.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Genexpressionssystenie, in denen die Expression eines bestimmten Gens in der Transkriptionsphase reguliert wird durch die Bindung eines Repressor-Moleküls an die DNA- Sequenz, die den Operator für das betreffende Gen umfaßt, wodurch verhindert wird, daß sich RNA-Polymerase an den Promotor bindet, und Induktion durch die Bindung eines Induktors an das Repressor-Molekül auftritt, was eine Konformationsverschiebung im Repressor bewirkt, welche die Affinität des Repressors für den Operator verringert, sind in Eschericia coli gut bekannt.
Solche Operator-Repressor-Steuerungssysteme, wie z.B. das lac-Operon, sind über eine Anzahl von Jahren für die Expression von fremden Genen in E. coli verwendet worden.
Vor kurzem ist aus einer Anzahl von Gründen ein Interesse aufgekommen für die Klonierung und Expression von fremden Genen in Bazillen, insbesondere Bacillus subtilis. Im Gegensatz zu E. coli ist B. subtilis kein Pathogen und es produziert keine Endotoxine. Auch besitzt es ein sekretorisches System, das Proteine in großen Mengen in das Kulturmedium abgibt. Seine genetische Karte ist gut charakterisiert und eine große Menge an Information über Kultivierung von B. subtilis im Großmaßstab ist verfügbar, da der Organismus in breitem Umfang in der Industrie verwendet wird. Ein Nachteil von B. subtilis-Stämmen, die Bildung von Sporen, ist durch die Entwicklung von asporogenen B. subtilis-Stämmen umgangen worden.
Die bisher in Bazillen bekannten Genexpressionssysteme, die auf dem Transkriptionsniveau arbeiten, werden jedoch nicht durch Induktion reguliert, sondern verwenden einen anderen Mechanismus. Genregulation in diesen Organismen wird durch δ-Faktoren gesteuert, die Proteine sind, die sich an RNA- Polymerase binden und die Erkennungsstelle für RNA- Initiation bestimmen. Solche Systeme können nicht ohne weiteres für die gesteuerte Expression eines fremden Gens verwendet werden.
Die Versuche, die unternommen worden sind, um fremde Gene in B. subtilis zu exprimieren, haben sich bisher auf die Verwendung von aus α-Amylase gewonnenen Sekretionsvektoren konzentriert (Palva et al: Gene 22, (1983) 229-235; Ulmanen et al.: J.Bacteriol 162 (1985) 176-182; und Meyer und Fiechter: Appl.Environ.Microbiol. 50 (1985) 503-507).
Ein allgemeines Problem mit Organismen, die klonierte Gene besitzen, ist die niedrige Expression von fremden oder abnormen Proteinen. Die Genexpression hängt von Umgebungsbedingungen ab, die die Zellphysiologie bestimmen. In vielen Fällen sind optimale Kulturbedingungen zur Produktbildung nicht identisch mit optimalen Wachstumsbedingungen und in manchen Fällen können die fremden Genprodukte für den Wirtsorganismus sogar toxisch sein.
Die Ergebnisse aus den oben erwähnten Versuchen, fremde Gene in Bazillen zu exprimieren, haben gezeigt, daß entweder die Regulation auf dem Translationsniveau durchgeführt oder das fremde Genprodukt durch die proteolytische Wirkung von für subtilis nativen Exoenzymen zersetzt wird. Die Ausbeuten an fremden Proteinen sind daher in diesen Versuchen sehr fluktuierend gewesen.
In E. coli ist dieses Problem durch die Verwendung von induzierbaren Operator-Repressor-Expressionssystemen, wie die oben beschriebenen, abgemildert worden.
Verwendung des lac-Repressor-Operators aus E. coli in B. subtilis ist von Yansura und Henner berichtet worden (Proc.Natl.Acad.Sci. USA 81 (1984) 439-443). Diese Lösung leidet jedoch an dem Nachteil, daß das lac-Operator- Repressorsystem nicht nativ für Bazillen ist.
Über eine Anzahl von Jahren ist es bekannt gewesen, daß die Produktion/das Auftreten einer Anzahl von Enzymen in Bazillen durch Xylose und andere Zucker im Wachstumsmedium induziert werden konnte, aber der Mechanismus hinter diesen Phänomenen ist unbekannt geblieben. Die durch Xylose induzierten Enzyme sind diejenigen, die zur Xylan-Nutzung in Bazillen notwendig sind, wie etwa beschrieben von I.G. Roncero, J.Bacteriol. 156 (1983) 257-263.
Über eine Anzahl von Jahren ist es auch bekannt gewesen, daß diese Xylose-Induktion nur auftritt, wenn eine geeignete Wachstumsphase von der Kultur erreicht worden ist, d.h. wenn die logarithmische Wachstumsphase aufgehört hat und die Kultur eine bestimmte Reife erreicht hat.
Das Strukturgen für die Produktion von Xylanase ist kloniert und für die Expression von Xylanase in E. coli und B. subtilis verwendet worden (veröffentlichtes japanisches Patent Nr. 75286-A und 9198978-A).

KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Es ist nun überraschenderweise festgestellt worden, daß der Mechanismus hinter der Induktion der Produktion von Xylan- verdauenden Enzymen in B. subtilis vom Operator-Repressor- Typ ist.
Ferner ist es möglich gewesen, die betroffenen Gene zu isolieren und die Stuktur und Basensequenz besagten Operator-Repressor-Expressionssystems im Genom von B subtilis zu bestimmen.
Dies legt ferner nahe, daß die Produktion von anderen Enzymen, die durch die Zugabe von anderen Zuckern induziert wird, ebenfalls durch solche Operator-Repressor-Systeme gesteuert wird.
Folglich stellt die Erfindung ein neuartiges Genexpressionssystem zur Verfügung, das einen Expressionsvektor und ein Repressor-Gen umfaßt, wobei der Expressionsvektor das (die) zu exprimierende(n) Gen(e) und einen oder mehrere negativ regulierte Promotor-Operatoren umfaßt, die auf ein Repressor-Protein reagieren, das durch besagtes Repressor-Gen kodiert ist, wobei der (die) Promotor-Operator(en) und das Repressor-Gen aus einer Bacillus-Spezies abgeleitet sind und wobei das Repressor-Gen xylR ist und der (die) Promotor-Operator(en) der Promotor- Operator ist (sind), der mit dem Operon xynC, xynB oder dem Operon xylA, xylB assoziiert ist.
In einem zweiten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Stimulierung der Produktion eines Genproduktes zur Verfügung, welches umfaßt:
a) Inserieren in einen Wirt, wobei besagtes "trans-wirkende DNA-Segment" das xylR-Gen einer Bacillus-Spezies umfaßt;
b) Inserieren eines Expressionsvektors in besagten Wirt, wobei besagter Expressionsvektor das (die) Gen(e) umfaßt, das (die) für das (die) zu exprimierende(n) Genprodukt(e) kodiert (kodieren) und (einen) negativ regulierte(n) Promotor-Operator(en), assoziiert mit dem Operon xynC, xynB oder dem Operon xylA, xylB einer Bacillus-Spezies, der (die) auf reagiert (reagieren), produziert von besagtem Repressor- Gen produziert wird;
c) Kultivieren des Wirtes; und, falls erforderlich;
d) zu einem geeigneten Zeitpunkt, wenn die Population des Wirtes ein wünschenswertes Niveau erreicht hat, Zugeben einer Verbindung, die besagtes Repressor-Protein inaktiviert, zur Kultur, um besagte cis-wirkenden Regulatorelemente zu dereprimieren und dadurch die Produktion besagten gewünschten Genprodukts oder besagter gewünschter Genprodukte zu initiieren.
In einem dritten Aspekt stellt die Erfindung einen Vektor zur Verwendung bei der Expression von Genprodukten zur Verfügung, umfassend DNA-Kodierung für das (die) Genprodukt -produkte und einen oder mehrere negativ regulierte Promotor-Operatoren, assoziiert mit dem Operon xynC, xynB oder dem Operon xylA, xylB einer Bacillus-Spezies, die auf ein Repressor-Protein reagieren, das durch ein xylR-Gen kodiert ist, was aus einer Bacillus-Spezies erhältlich ist, und wobei das DNA-Segnent im Vektor eingeschlossen sein kann.
In einem vierten Aspekt stellt die Erfindung einen Vektor zur Verwendung bei der Expression von Genprodukten zur Verfügung, welcher ein xylR-Gen umfaßt, das aus einer Bacillus-Spezies erhältlich ist und für ein Repressor- Protein kodiert, das einen oder mehrere, mit dem Operon xynC, yxnB oder dem Operon yxlA, xylB einer Bacillus-Spezies assoziiert, negativ regulierte Promotor-Operatoren reprimiert, die an DNA-Kodierung für das Genprodukt oder die Genprodukte gekoppelt sind, und wobei die DNA-Kodierung für das Genprodukt oder die Genprodukte und ein oder mehrere Promotor-Operator(en) im Vektor eingeschlossen sein können.
In einem fünften Aspekt stellt die Erfindung neuartige Mikroorganismen zur Verfügung, die mit einem Vektor gemäß dem dritten oder vierten Aspekt oben transformiert sind.
In einem sechsten Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung des neuartigen Genexpressionssystems der Erfindung für die Produktion von transformierten Mikroorganismen und die Verwendung solcher transformierten Mikroorganismen für die Produktion von zum ursprünglichen Mikroorganismus heterologen Genprodukten zur Verfügung.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG

Die Erfindung wird detaillierter im folgenden unter Bezugnahme auf die Zeichnung erläutert, in der
Fig. 1 die Restriktionskarte des Xylose-Regulons zeigt, das das Genexpressionssystem der Erfindung umfaßt,
Fig. 2 die Struktur eines Vektors pSX 50 gemäß der Erfindung zeigt,
Fig. 3 die Struktur eines anderen Plasmids pSX 56 gemäß der Erfindung zeigt,
Fig. 4A,B,C Ergebnisse aus 10% SDS-PAGE und Western- Blotting intrazellulärer Flüssigkeiten und Überstände von Mikroorganismen zeigt, die mit Vektoren gemäß der Erfindung transformiert worden sind, und
Fig. 5, 6, 7 und 8 die Strukturen von noch vier anderen Vektoren gemäß der Erfindung zeigt.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Wie oben angegeben, betrifft die Erfindung in ihrem ersten Aspekt ein neuartiges Genexpressionssystem, das einen Expressionsvektor und ein trans-wirkendes DNA-Segment umfaßt, wobei der Expressionsvektor das (die) zu exprimierende(n) Gen(e) und ein oder mehrere cis-wirkende regulatorische Eleinente umfaßt die auf einen trans- wirkenden Faktor, der von besagtem "trans-wirkenden DNA- Segment" produziert wird, reagieren, und wobei besagte "trans-wirkenden DNA-Segmente" und cis-wirkenden regulatorischen Elemente aus dem Genom einer Bacillus- Spezies erhältlich sind.
Ein System stammt aus Bacillus subtilis und umfaßt in seinem nativen Zustand zwei cis-wirkende regulatorische Elemente (Promotor-Operatoren), von denen jeder die Transkription von zwei Genen reguliert, und ein für einen trans-wirkenden Faktor kodierendes DNA-Segment (Repressor-Gen), auf die die zwei Promotor-Operatoren reagieren.
Das System reguliert die Produktion der Enzyme, die für das Wachstum von Bacillus subtilis aus Xylose und Xylose- Polymeren notwendig sind, und das Repressor-Molekül wird durch das Vorhandensein von Xylose im Medium dereprimiert.
Wegen der Wachstumsphasenregulierung ist es jedoch nicht notwendig, das Inducer-Molekül (Xylose) aus dem Wachstumsmedium wegzulassen, weil die Induktion erst auftritt, nachdem die logarithmische Wachstumsphase beendet ist und eine angemessene Population erreicht worden ist.
Dies ermöglicht es dem System, selbstregulierend zu sein, wenn es eingesetzt wird, um Bacilli zu transformieren, und Xylose in das ursprüngliche Wachstumsmedium einbezogen wird.
Bei der Aufklärung des Systems wurde überraschenderweise festgestellt, daß das Repressor-Gen zwischen den zwei regulierenden Operons angeordnet war und daß die Transkription in der entgegengesetzten Richtung zur Transkription der zwei Operons erfolgte.
Zur Verwendung des Systems für die Zwecke der Erfindung ist es nicht notwendig, alle oben beschriebenen Elemente einzusetzen, sondern nur das Repressor-Gen in Verbindung mit wenigstens einem der Promotoren.
Eine Ausführungsform des Systems der Erfindung betrifft daher ein Genexpressionssystem, in dem der Expressionsvektor ein cis-wirkendes regulatorisches Element umfaßt, das auf besagten trans-wirkenden Faktor reagiert.
In Bazillen ist das Repressor-Gen bereits vorhanden und es ist folglich nicht notwendig, das Repressor-Gen in einen Vektor zu inserieren, der verwendet wird, um Bazillen transformieren.
In einer anderen Ausführungsform ermöglicht die Erfindung die gleichzeitige Herstellung von wenigstens zwei unterschiedlichen heterologen Genprodukten durch Einsatz eines Expressionsvektors, der zwei unterschiedliche cis- wirkende regulatorische Elemente umfaßt, die auf besagten trans-wirkenden Faktor reagieren.
Obgleich es nicht notwendig ist, wird erwogen, daß für die Verwendung des Systems in anderen Mikroorganismen als B. subtilis das "trans-wirkende DNA-Segment" im Expressionsvektor angeordnet ist.
Es ist auch festgestellt worden, daß die durch Transformieren von Bazillen erhaltenen Ergebnisse überlegen sind, wenn Expressionsvektoren verwendet werden, die das Repressor-Gen enthalten, so daß der Organismus tatsächlich mehrere Gene aufweist, die für den Repressor kodieren.
In einer Anzahl von Experimenten ist gezeigt worden, daß, obgleich das Repressor-Gen im nativen System in einer zur Transkription der zwei Operons entgegengesetzten Richtung transkribiert wird, der Repressor unabhängig davon funktioniert, welches die Transkriptionsrichtung ist.
Es ist gezeigt worden, daß das System auch in Mikroorganismen einer anderen Gattung arbeitet, wie etwa in E. coli, nur in diesem Fall muß ein für den betreffenden Mikroorganismus nativer Promotor vor dem Bacillus-Operator inseriert werden.
Wie oben erwähnt ist die Struktur und Basensequenz des Genexpressionssystems der Erfindung aus B. subtilis, das mit Xylose induzierbar ist, bestimmt worden, und dadurch ist festgestellt worden, daß das Gen, das für den Repressor kodiert, xylR, die folgende Basensequenz besitzt: Start stop
und daß die zwei Promotor-Operator-Sequenzen, P&sub1;O&sub1; und P&sub2;O&sub2;, wie folgt sind:
(die Pfeile zeigen die Bindungsstellen für die Operatoren O&sub1; und O&sub2; an).
Die Struktur des Regulons, das für die Transkription in B. subtilis der Gene verantwortlich ist, die für das Wachstum auf Xylose notwendig sind, wurde wie folgt aufgeklärt:

Klonierung

DNA aus dem Bacillus subtilis-Stamm DN497 wurde partiell mit dem Restriktionsenzym BglII verdaut und Fragmente von 2 bis 10 kb wurden aus einem 1% Agarosegel isoliert. Die DNA wurde dann mit mit BamHI geschnittenem, dephosphoryliertem Plasmid pBR322 (von New England Biolabs) ligiert und danach in E. coli MC1000 r&supmin;m+ transformiert. Selektion wurde auf Ampicillin-Platten durchgeführt und die Transformanten wurden mit einer 2 mM Lösung von 4-Methylumbelleferyl-β-D- xylosid (von Sigma) besprüht.
Kolonien, die das xynB-Gen tragen, das für das Enzym 1,4-β- D-Xylosidase wurden wegen Hydrolyse des Substrats als fluoreszent nachgewiesen, wenn sie UV-Licht ausgesetzt wurden.
Das Gen xynB wurde auf einem 8,4 kb Fragment gefunden, genauer kartiert und sequenziert. Es wurde gezeigt, daß es das letzte Gen in einem 2-Cistron-Operon war, in dem das erste Gen (xynC) für ein Protein mit langen Strecken von hydrophoben Aminosäuren kodiert.
Bei E. coli wurde gezeigt, daß die Transkription von xynB teilweise von innerhalb von xynC stammt und teilweise von Plasmid-Promotoren. Wenn auf pDN1050 kloniert und in B. subtilis DN497 zurücktransformiert, kam eine starke Transkription aus einem 320 bp MspI-BglII-Fragment, stromaufwärts von xynC.
Es wurde gezeigt, daß DNA stromabwärts von xynC diese Transkription reprimierte, aber nur in Abwesenheit von Xylose. Dies zeigte, daß ein Repressor-Gen (xylR) auf dem anfänglichen Klon vorhanden war. SDS-PAGE-Gelelektrophorese zeigte, daß die klonierte DNA ein anderes Gen enthielt, das in derselben Art und Weise reguliert wurde wie xynB, aber von seinem eigenen Promotor transkribiert wurde. Es wurde gezeigt, daß dies das Gen ist, das für das Enzym Xylose- Isomerase kodiert (xylA).
Das xylR-Gen liegt zwischen xynB und xylA und wird vom anderen Strang auf der DNA gelesen (Fig. 1). Das Gen ist 1.152 bp lang, was bedeutet, daß das Repressor-Monomer aus 384 Aminosäuren besteht.
Die zwei Promotoren, die von dem Repressor kontrolliert werden, wurden durch das Enzym S1 kartiert, wie von Gilman und Chamberlain (1983), Cell, 35, 285-93 beschrieben.
Die Struktur des Xylose-Regulons ist in Fig. 1 dargestellt, die auch eine Restriktionskarte des Regulons enthält und in der die Transkriptionsrichtung mit Pfeilen angegeben ist.
In den folgenden Beispielen wurden die Promotor-Operatoren P&sub1;O&sub1;, P&sub2;O&sub2; und das Repressor-Gen xylR bei der Konstruktion einer Anzahl von Vektoren verwendet, die verwendet werden, um verschiedene Mikroorganismen zu transformieren, um das Funktionieren des Genexpressionssystems der Erfindung zu beweisen. Die Beispiele sind in keinem Fall dazu gedacht, die Erfindung zu beschränken.
Im obigen Text und in den Beispielen unten wurden auch eine Anzahl von Mikroorganismen verwendet, die unten aufgelistet sind:

METHODEN

Herstellung von Plasmiden und chromosomaler DNA und Transformation von Bacillus subtilis und E. coli wurden gemäß den folgenden allgemeinen Vorgehensweisen durchgeführt. Verdauung mit Restriktionsenzvmen, Bal 31- Nuklease-Behandlung, Oligo-DNA-Linker-Insertion und Ligation mit T4-Ligase von DNA wurden mit Enzymen von New England Biolabs unter den vom Lieferanten vorgeschlagenen Bedingungen durchgeführt.

Stämme

Alle Bacillus subtilis-Stämme waren Derivate von Bacillus subtilis 168 (Spizizen, Proc.Natl.Acad.Sci., 44: 1072-78, 1958). RUB200: aroI906, amyE07, amyR2 wurde erhalten von Dr. Frank Young, University of Rochester, New York. SL438:trpC2 (Sporulierung und Proteasemangel) wurden erhalten von Dr. Kim Hardy, Biogen, Genf. DN497: amyE07, amyR2 ist ein aro+- Transformat von RUB200 mit chromosomaler DNA aus SL438, QB1133: aroI906, metB5, sacA321, amyE stammte von Dr. Georges Rapport, IRBM, Paris. QB1130:dal, metB5, sacA331, amyE wurde erhalten vom Bacillus Genetic Stock Center, Columbus, Ohio. DN608: dal-1, metB, sacA, amyE war ein aro+, dal-1-Transformant von QB1133 mit chromosomaler DNA aus QB1130.
SHa28: metB, sacA, amyE, xynB, wurde hergestellt durch Kongression in DN608 mit chromosomaler DNA aus DN497 und die eine 4 bp Deletion in xynB (eine aufgebrochene PstI-Stelle) hat. SHa165: ein proteaseschwacher Nitrosoguanidin-Mutant von DN497.
E. coli: MC1000: F&supmin; lacX74 galF, galK, (leu-ara)7697 (Casablaban, M.J., und Cohen, S.N. (1980), J. Mol. Biol. 7697, 138, 179 - 207). Dieser Stamm wurde mit herkömmlichen Methoden r-m+ gemacht.

Plasmide

E. coli:

pBR322: Sutcliffe, J.G. (1979). Cold Spring Harbor Symp. Wuant. Biol. 43, 77-90.

B. subtilis

pDN1050: Dänische Patentanmeldung Nr. 5940/84.

I. Transformation von B. subtilis

Kompetente Bacillus subtilis-Zellen wurden gemäß Yasbin et al. (J. Bacteriol. 121: 296-304, 1975) hergestellt. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugation (7.000 UPM, 3 min) geerntet, in 1/10 Volumenteil Überstand, der 20% Glyzerin einschließt resuspendiert, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -70ºC aufbewahrt. Zur Transformation werden gefrorene Zellen bei 42ºC aufgetaut und mit einem Volumenteil Puffer (Spizizens Minimalmedium (Spizizen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 44:1072-78, 1958)) mit 0,4% Glucose, 0,04 M MgCl&sub2; und 0,002 M EDTA) vermischt. DNA wurde zugegeben und die Mischung unter Rütteln bei 37ºC für 20 min. inkubiert. Die Zellen wurden dann auf geeignete selektive Medien plattiert.

II. Transformation von E. coli

Eine Übernacht-Kultur von E. coli-K-12-Stamm Nr. 802 in LB (10 g Bacto-Trypton, 5 g Bacto-Hefeextrakt und 10 g NaCl pro Liter Wasser, pH 7,0) wurde 100fach in 5 bis 100 ml LB verdünnt und bei 37ºC auf OD&sub4;&sub5;&sub0; = 0,4 gezüchtet. Die Kultur wurde abgekühlt, 15 min. auf Eis stehengelassen, für 15 Min. bei 3.000 UPM (in einem Sorvall GS3-Rotor) geschleudert, in 200 ml kaltem 0,1 M CaCl&sub2; resuspendiert, für 20 min. auf Eis belassen, für 10 min. bei 3.000 UPM geschleudert, in 5 ml kaltem 0,01 M CaCl&sub2; resuspendiert und für 20 Stunden auf Eis belassen. Heißes Glycerin wurde dann auf 10% zugegeben und aliquote Teile wurden mit flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -70ºC aufbewahrt. Eingefrorene Zellen wurden auf Eis aufgetaut, DNA wurde zugegeben, die Mischung für 45 min. auf Eis, 2 min. bei 37ºC inkubiert und dann auf ein geeignetes selektives Medium plattiert.

III. Herstellung von Plasmiden aus E. coli

E. coli wurde über Nacht in 250 ml LB, 0,4% Glucose und einem geeigneten Antibiotikum gezüchtet. Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und in 4 ml Puffer 1 (0,025 M Tris HCl, pH = 8,0, 0,01 M EDTA, 0,05 M Glucose, 2mg/ml Lysozym) resuspendiert. Die Suspension wurde bei 0ºC für 15 min. inkubiert und dann mit 8 ml Puffer 2 (0,2 M NaOH, 1% SDS) vermischt. Dann wurden 6 ml Puffer 3 (3M NaAcetat, pH = 4,8) zugegeben, die Mischung bei 0ºC für 60 min. gehalten, gefolgt von Zentrifugation für 20 min. bei 19.000 UPM (ca. 45.000 g in Sorvall SS34-Rotor). Der Überstand wurde mit 0,6 Volumenteilen kaltem Isopropanol ausgefällt und resuspendiert in 1,2 ml 5TE (0,05 M Tris HCl, pH = 8,0, 0,005 M EDTA), plus 20 ul gekochte RNase A (Boehringer) = (2 mg/ml). 30 min. später wurde die Lösung oben auf 4,0 ml Puffer 4 (80 g CsCl plus 56 ml 5TE) und 0,1 ml EtBr (10 mg/ml Ethidiumbromid) in einem VTi65-Röhrchen überschichtet. Die Mischung wurde bei 45.000 UPM für 20 h zentrifugiert. Das Plasmid wurde dann aus dem Röhrchen entnommen, dialysiert und, wie in Abschnitt VI beschrieben, extrahiert.

IV. Herstellung von Plasmiden aus B. subtilis

Plasmide wurden hergestellt, wie für E. coli-Stämme beschrieben (siehe Abschnitt III), aber mit den folgenden Modifikationen. Wachstum erfolgte in LB, das 0,01 M Kaliumphosphat, pH-7,0, und ein geeignetes Antibiotikum (z.B. 6 ug/ml Chloramphenicol) und, falls erforderlich, 100 ug/ml D-Alanin einschloß. Nach der Ernte wurden die Zellen bei 37ºC mit Lysozym inkubiert. Puffer 2 wurden durch eine Mischung aus einem Volumenteil Puffer 2 und zwei Volumenteilen Puffer 5 (0,2 M Glycin, 0,2 M NaCl und 1% SDS) ersetzt. Die folgenden Stufen waren dieselben wie in III.

V. Herstellung im Kleinmaßstab von Plasmiden aus B. subtilis

Plasmide aus 5 ml B. subtilis in LB (einschließlich 0,01 M Phosphat pH = 7,0 und geeigneten Antibiotika und D-Alanin, falls erforderlich) wurden wie in Abschnitt IV hergestellt, ausgenommen: 1: Volumenteile der Puffer wurden vierfach verringert. 2: 0,5 ml Phenol und 0,5 ml Chloroform wurde nach Puffer 3 zugegeben. 3: Nach Zentrifugation bei 19.000 UPM wurde der Überstand mit Ethanol ausgefällt, in 400 ml Puffer 6 (0,05 M Tris HCl pH = 8,0, 0,1 M NaAcetat) resuspendiert, das Plasmid wurde erneut ausgefällt, in 400 ul Puffer 6 resuspendiert, ausgefällt, gewaschen und mit 100 ul TE (0,01 M Tris HCl, pH = 8,0, 0,001 M EDTA) mit 1 ug/ml gekochter RNase A (Boehringer) resuspendiert.

VI. Herstellung von chromosomaler DNA aus B. subtilis.

Ein Pellet aus eingefrorenen Zellen aus etwa 50 ml Kultur wurde in 1,1 ml Puffer (0,05 M Tris HCl, pH = 7,4, 0,1 M HCl, 25% Saccharose) resuspendiert. 100 ul Lysozym (25 mg/ml) und 150 ul EDTA (0,5 M, pH 8,0) wurden zugegeben. Die Mischung wurde bei 37ºC für 30 min. inkubiert. 2 ml 0,2% SDS wurden zugegeben, gefolgt von Inkubation für 30 min. bei 37ºC. 1 g CsCl und 0,05 ml EtBr (10 mg/ml) wurden pro 0,95 ml Mischung zugegeben und die Mischung wurde bei 45.000 UPM, 15ºC, für 20 Stunden in einem VTi65-Rotor (Beckman) zentrifugiert.
Die DNA wurde unter einer Langwellen-UV-Lampe lokalisiert und durch Punktieren des Röhrchens mit einer Spritze entnommen. EtBr wurde mit Isopropanol extrahiert und die Lösung für 2 Stunden gegen TEE (0,01 M Tris HCl, pH = 8,0, 0,01 M EDTA) dialysiert. Die Lösung wurde dann auf 8 ml mit TEE eingestellt und zweimal mit Phenol und einmal mit Chloroform extrahiert. Die DNA wurde mit 0,1 M NaCl und kaltem Ethanol ausgefällt und in 1 ml TE (0,01 M Tris HCl, pH = 8,0, 0,001 M EDTA) gelöst. Die Lösung von chromosomaler DNA wurde bei 4ºC gehalten.

Beispiel 1 und 2

pSX 50

Zwei grundlegende Genexpressionssysteme gemäß der Erfindung wurden konstruiert, in die verschiedene Gene hineinkloniert und durch einen von P&sub1;O&sub1; und P&sub2;O&sub2; unter Regulation von xylR exprimiert werden konnten.

pSX 56

In Fig. 2 ist eine Restriktionskarte einer der Basisvektoren pSX 50, der in den folgenden Beispielen verwendet wird, gezeigt. Wie in der Figur angegeben, umfaßt er den Promotor- Operator P&sub1;O&sub1; auf einem 322 MspI bis BglII(umgewandelt zu ClaI)-Fragment, ein B. pumilus-xynB-Gen auf einem 2,5 kb ClaI bis SalI-Fragment und das B. subtilis-xylR-Gen auf einem 1380 bp BamHI bis SphI-Fragment aus 134 bp vor dem xylR-Start bis 82 bp nach seinem Stop. Alles inseriert in das Plasmid pDN 1050 (2,5 kb).

pSX 56

Fig. 3 zeigt die entsprechende Restriktionskarte des anderen Basisvektors pSX 56. Wie angegeben umfaßt er das B. subtilis-xylR-Gen und den Promotor-Operator P&sub2;O&sub2; auf einem 1475 bp EcorI bis ClaI-Fragment von 215 bp vor dem xylR- Start bis 82 bp nach seinem Stop zusammen mit demselben xynB-Gen wie in pSX 50. Ebenfalls inseriert in das Plasmid pDN 1050 (2,65 kb).
B. subtilis-SHa28 (yxnB&supmin;), transformiert mit einem dieser zwei Plasmide, zeigt einen Anstieg um einen Faktor von 150 bis 200 in der Xylosidase-Aktivität, gemessen durch die Hydrolyse von p-Nitrophenyl-beta-D-xylopyranosid (Sigma) wenn gezüchtet auf 0,2% Xylose, verglichen mit Wachstum ohne Xylose. Diese Ergebnisse dieses Tests sind in Fig. 4A dargestellt, in der die schraffierten Bereich den Xylosidase-Gehalt der intrazellulären Flüssigkeit aus Zellen, die mit Xylose gezüchtet worden sind (+), zeigen und die benachbarten leeren Bereiche zeigen die Abwesenheit von Xylosidase in der intrazellulären Flüssigkeit aus Zellen, die ohne Xylose gezüchtet sind (-).

Beispiel 3

Das xynB-ClaI-BamH-Fragment auf pSX 50 wurde durch das apr- Gen aus Bacillus licheniformis ersetzt, das für die extrazelluläre alkalische Protease Subtilisin Carlsberg, kodiert, um das Plasmid pSX 55 zu erhalten (Fig. 5).
Fig. 4B zeigt Überstände von SHa28, transformiert mit diesem Plasmid, gezüchtet mit und ohne Xylose. Ohne Xylose kann man kein Subtilisin-Band erkennen, wohingegen es das vorherrschende Band ist, wenn die Zellen in Gegenwart von 0,2% Xylose gezüchtet werden.

Beispiel 4 und 5

pSX 52 und pSX 59

Das Kalbsprochymosin-Gen wurde mit dem B. pumilus-xynB-Gen verschmolzen, was zu einem Gen führt, das ein Fusionsprotein kodiert, das aus den ersten 12 Aminosäuren von Xylosidase, gefolgt von Prochymosin, besteht.
Dieses Fusionsgen wurde in ClaI-HindIII auf pSX 50 und pSX 56 kloniert, um die Plasmide pSX 52 und pSX 59 zu erhalten (Fig. 6 und 7).
Diese Plasmide wurden verwendet, um B. subtilis SHa 165 (DN 497 (Protease(-) (Nitrosoguanidin))) zu transformieren.
Der Western-Blot von interzellulären Flüssigkeiten auf Fig. 4C, die ersten vier Spuren, zeigt, daß das Prochymosin-Gen unter Xylose-Kontrolle steht.

Beispiel 6

pSX 62

Der E. coli-rrnB-Terminator wurde in pSX 52 hinter das Prochymosin-Gen kloniert, um das Plasmid pSX 62 zu erhalten (Fig. 8), das verwendet wurde, um SHa 165 zu transformieren. Spuren 5 und 6 in Fig. 4C zeigen, daß dies die Menge an Prochymosin merkbar erhöht (etwa 40% vom Gesamtprotein).

Beispiel 7

pSX 71

Eine Deletion von 820 bp zwischen der ersten und der dritten EcoRV-Stelle im xylR-Gen in pSX 62 wurde durchgeführt, um ein Plasmid, pSX 71, zu erhalten, in dem das xylR-Gen zerstört war. Dieses Plasmid wurde verwendet um SHa 165 zu transformieren. Spuren 7 und 8 in Fig. 4C zeigen klar, daß die Produktion von Prochymosin nicht länger unter Xylosekontrolle steht.
Die in der vorangehenden Beschreibung, in den folgenden Ansprüchen und/oder in den beigefügten Zeichnungen offenbarten Merkmale können, sowohl einzeln als auch in irgendeiner Kombination derselben, Gegenstand zur Verwirklichung der Erfindung in deren unterschiedlichen Formen sein.
Die Verfügbarkeit von Hinterlegungen, auf die im EP-A-0 185 512 (die der dänischen Patentanmeldung Nr. 5940/84, auf die oben Bezug genommen worden ist, entspricht) Bezug genommen wird, ist gemäß Regel 28(3) EPÜ eingeschränkt und diese Einschränkung findet Anwendung im Zusammenhang mit der vorliegenden Anmeldung. Details der Hinterlegungen, auf die in EP-A-0 185 512 Bezug genommen wird, werden hier durch Bezugnahme mit einbezogen.

Claims

1. Genexpressionssystem, welches einen Expressionsvektor und ein Repressor-Gen umfaßt, wobei der Expressionsvektor das (die) zu exprimierende(n) Gen(e) und (einen) negativ regulierte(n) Promotor-Operator(en) umfaßt, der (die) auf ein Repressor-Protein reagiert (reagieren), das durch besagtes Repressor-Gen kodiert ist, wobei der (die) Promotor-Operator(en) und das Repressor-Gen von einer Bacillus-Spezies abgeleitet sind und wobei das Repressor-Gen xylR ist und der (die) Promotor-Operator(en) der Promotor- Operator ist (sind), der mit dem Operon xynC, xynB oder dem Operon xylA, xylB assoziiert ist.

2. Genexpressionssystem nach Anspruch 1, wobei das Repressor-Gen im Expressionsvektor angeordnet ist.

3. Genexpressionssystem nach Anspruch 1, wobei das Repressor-Gen auf einem vom Expressionsvektor verschiedenen Vektor angeordnet ist.

4. Genexpressionssystem nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Repressor-Gen und der Promotor- Operator aus Bacillus subtilis, Bacillus pumilus oder Bacillus circulans, vorzugsweise Bacillus subtilis erhalten werden.

5. Genexpressionssystem nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Expression von Genen in B. subtilis.

6. Genexpressionssystem nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Repressor-Gen die Sequenz hat: Start stop

und der Promotor-Operator die Sequenz hat:

oder die Sequenz:

7. Genexpressionssystem nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, wobei das (die) zu exprimierende(n) Gen(e) (ein) heterologe(s) Gen(e) ist (sind).

8. Verfahren zur Stimulierung der Produktion eines Gen- Produktes, welches umfaßt:

a) Inserieren eines Repressor-Gens in einen Wirt, wobei das trans-wirkende Segment das xylR-Gen einer Bacillus-Spezies umfaßt;

b) Inserieren eines Expressionsvektors in den Wirt, wobei der Expressionsvektor das (die) Gen(e) umfaßt, das (die) für das (die) zu exprimierende(n) Gen-Produkt(e) kodiert (kodieren), und (einen) negativ regulierte(n) Promotor- Operator(en), assoziiert mit dem Operon xynC, xynB oder dem Operon xylA, xylB einer Bacillus-Spezies, der (die) auf das Repressor-Protein reagiert (reagieren), produziert von dem Repressor-Gen;

c) Kultivieren des Wirtes; und, falls erforderlich,

d) zu einem geeigneten Zeitpunkt Zugeben einer Verbindung, die das Repressor-Protein inaktiviert, zur Kultur, um die Produktion des (der) gewünschten Genprodukte(s) zu initiieren

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Repressor-Gen auf dem Expressionsvektor angeordnet ist und zusammen mit dem Expressionsvektor in einen Wirt inseriert wird.

10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei das Repressor- Gen und der (die) Promotor-Operator(en) aus Bacillus subtilis, Bacillus pumilus oder Bacillus circulans, vorzugsweise Bacillus subtilis erhalten werden.

11. Verfahren zur Stimulierung der Produktion eines Genproduktes in 13. subtilis, welches umfaßt:

a) Inserieren eines Expressionsvektors in einen Wirt, wobei der Expressionsvektor das (die) Gen(e) umfaßt, das (die) für das (die) zu exprimierende(n) Genprodukt(e) kodiert (kodieren), und (einen) negativ regulierte(n) Promotor- Operator(en) assoziiert mit dem Operon xynC, xynB oder dem Operon xylA, xylB einer Bacillus-Spezies, der (die) auf ein von dem xylR-Gen von B. subtilis produzierten Repressor- Protein reagiert (reagieren);

b) Kultivieren des Wirtes; und, falls erforderlich,

c) zu einem geeigneten Zeitpunkt Zugeben einer Verbindung, die das Repressor-Protein inaktiviert, zur Kultur, um die Produktion des (der) gewünschten Genproduktes (Genprodukte) zu initiieren.

12. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 8 bis 11, wobei das Repressor-Protein durch Xylose inaktiviert wird.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Repressor-Gen die Sequenz hat: Start stop

und der Promotor-Operator die Sequenz hat:

oder die Sequenz:

14. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 8 bis 13, wobei das (die) zu exprimierende(n) Gen(e) heterologe(s) Gen(e) ist (sind).

15. Vektor zur Verwendung bei der Expression von Gen- Produkten, umfassend DNA-Kodierung für das (die) Gen-Produkt oder -Produkte und einen oder mehrere negativ regulierte Promotor-Operatoren, assoziiert mit dem Operon xynC, xynB oder dem Operon xylA, xylB einer Bacillus- Spezies, die auf ein Repressor-Protein reagieren, das durch ein xylR-Gen kodiert ist, was erhältlich ist aus einer Bacillus-Spezies, und wobei das Segment im Vektor eingeschlossen sein kann.

16. Vektor zur Verwendung bei der Expression von Gen- Produkten, umfassend ein xylR-Gen, das aus einer Bacillus- Spezies erhältlich ist und für ein Repressor-Protein kodiert, das einen oder mehrere negativ regulierte Promotor- Operator(en), assoziiert mit Operon xynC, xynB oder dem Operon xylA, xylB einer Bacillus-Spezies, reprimiert, die gekoppelt sind an DNA-Kodierung für das (die) Gen-Produkt(e) und wobei die DNA-Kodierung für das (die) Gen-Produkt oder -Produkte und ein oder mehrere Promotor-Operator(en) im Vektor eingeschlossen sein können.

17. Vektor nach Anspruch 15 oder 16, wobei das xylR-Gen und der (die) Promotor-Operator(en) erhalten werden aus Bacillus subtilis, Bacillus pumilis oder Bacillus circulans, vorzugsweise Bacillus subtilis.

18. Vektor nach einem oder mehreren der Ansprüche 15 bis 17, wobei das Repressor-Protein durch Xylose inaktiviert wird.

19. Vektor nach Anspruch 18, wobei das xylR-Gen die Sequenz hat: Start stop

und der Promotor-Operator die Sequenz hat:

oder die Sequenz:

20. Vektor nach einem oder mehreren der Ansprüche 15 bis 19, wobei das (die) zu exprimierende(n) Gen(e) heterologe(s) Gen(e) ist (sind).

21. Verwendung eines Vektors nach einem der Ansprüche 15 bis 19, um einen Mikroorganismus zu transformieren.

22. Mikroorganismus, transformiert mit einem Vektor nach einem der Ansprüche 15 bis 19.

23. Verwendung eines Mikroorganismus nach Anspruch 22 zur Produktion von Gen-Produkt(en).