DE3784907T2

DE3784907T2 - Oligosaccharide, immunogene und impstoffe und verfahren zur herstellung dieser oligosaccharide, immunogene und impstoffe.

Info

Publication number: DE3784907T2
Application number: DE8787202625T
Authority: DE
Inventors: Eduard Coen Beuvery; Adolf Evenberg; Peter Hoogerhout; Jan Theunis Poolman; Boeckel Constant Adriaan A Van; Boom Jacobus Hubertus Van
Original assignee: Nederlanden Staat
Current assignee: Nederlanden Staat
Priority date: 1986-12-31
Filing date: 1987-12-28
Publication date: 1993-06-24
Anticipated expiration: 2007-12-29
Also published as: FI875727A0; ATE87003T1; NO169775B; KR880007557A; EP0276516A2; JPS63190896A; NZ223009A; DE3784907D1; FI89172C; IE59734B1; NO875442D0; EP0276516A3; DK694687A; ES2054657T3; FI89172B; AU603405B2; US5034519A; NO875442L; FI875727A; EP0276516B1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue Oligosaccharide, welche D-Ribose-, D-Ribitol- und Phosphateinheiten enthalten, auf Immunogene, welche solche Oligosaccharide enthalten, auf Vaccine, welche solche Immunogene enthalten, und auf Verfahren zur Herstellung solcher Oligosaccharide, Immunogene und Vaccime.
Das kapsulare Polysaccharid des Bacteriums Haemophilus influenza Typus b besteht aus manchen Einheiten von D-Ribose-D-ribitol-phosphat (T 3)-D-Rib- [-(1T1)-ribitol-5TPO&sub4;-]. Haemophilus influenzae Typus b ist unter anderem ein pathogenes Bakterium, welches Meningitis und andere Infektionskrankheiten hervorruft.
Es wurde gefunden, dass Immunität erhalten werden kann durch Verabreichung des kapsularen Polysaccharides von Haemophilus influenzae Typus b (HIB). Es wurde ferner gefunden, dass insbesondere bei Kindern unter 2 Jahren die erhaltene Immunität von kurzer Dauer ist und bei Kindern unter 18 Monaten überhaupt nicht festgestellt werden kann. Dies kann verbessert werden durch Verabreichung des capsularen Polysaccharides zusammen mit einem sogenannten thymusabhängigen Träger (Protein). Solche polysaccharid-Protein-Konjugate haben den Nachteil, dass die Struktur nicht genau definiert ist, und dass der Polysaccharidteil im Produkt nicht homogen ist. Dies führt dazu, dass jeder frisch zubereitete Ansatz des Vaccins, welches solche Konjugate enthält, in Versuchstieren und/oder Menschen in bezug auf die Wirksamkeit des Vaccins geprüft werden muss. Ausserdem kann die Verwendung eines solchen Produktes in einem Vaccin unerwünschte Antikörper oder Toxizität erzeugen.
Oligosaccharide, welche durch Zersetzung des kapsularen Polysaccharides HIB erhalten werden, sind ebenfalls nicht rein, jedoch besser definiert. Auch hier muss die Wirksamkeit immer wieder getestet werden.
Es besteht daher ein Bedürfnis für ein Vaccin gegen HIB-Erkrankung, welches ein genau beschriebenes , reines Oligosaccharidfragment enthält, das heisst, ein Oligosaccharidfragment, welches keine Oligosaccharide enthält, die eine verschiedene Struktur oder Kettenlänge aufweisen.
Es wurde nun gefunden, dass solche reine Oligosaccharide auf synthetischem Wege erhalten werden können, und dass geeignete Immunogene erhalten werden können durch Assoziation solcher Fragmente mit einem Träger. Solche Immunogene können in Vaccinen verwendet werden. Die Tatsache, dass ein solches Oligosaccharid auf synthetischem Wege hergestellt werden kann, weist ferner den Vorteil auf, dass die Verfügbarkeit nicht von der Verfügbarkeit des pathogenen Bakteriums HIB abhängt.
Die Erfindung bezieht sich daher auf Oligosaccharide, welche geeignet sind zur Herstellung von Immunogenen und Vaccinen für die Behandlung von Haemophilus influenza Typus b, und welche D-Ribose-D-ribitol- phosphat, D-Ribitol-phosphat-D-ribose oder Phosphat- D-ribose-D-ribitol 2,3,4...19 oder 20 mal enthalten und insbesondere auf Oligosaccharide der Formel :
in welcher
k = 0 oder 1, wenn L = 1
k = 0, wenn L = 0
L = 0 oder 1
m = 2, 3 ... 19 oder 20, vorausgesetzt dass m 1 sein kann, wenn k , L und n = 1 oder wenn L , n und q = 1
n = 0 oder 1
q = 0 oder 1, wenn n = 1
q = 0, wenn n = 0
x = Wasserstoff, eine reaktionsfähige Gruppe, welche fähig ist, eine Bindung mit einem Protein zu bilden, oder eine Gruppe, welche eine hydrophobe Kette am ungebundenen Ende enthält, welche eine Wechselwirkung mit einer Micelle, einem Vesikel oder einem Liposom eingeht, oder durch eine hydrophobe Wechselwirkung der Oligosaccharide selbst, wobei die reaktionsfähige Gruppe eine der folgenden reaktionsfähigen Funktionen enthält:
in welcher R = -OH, -N&sub3; , -O-Alkyl (C&sub1;&submin;&sub1;&sub2;), -OC&sub6;F&sub5; ,
oder die endständige Gruppe XO- durch die reaktionsfähige Gruppe H&sub2;N- oder HS- ersetzt ist, und
Y = Wasserstoff, eine reaktionsfähige Gruppe, wie zuvor für X definiert, oder die endständige Gruppe -OY ersetzt ist durch die reaktionsfähige Gruppe-NH&sub2; oder -SH unter der Bedingung, dass Y = Wasserstoff, wenn X nicht Wasserstoff ist und dass X = Wasserstoff, wenn Y nicht Wasserstoff ist, und Salze davon.
Die Erfindung bezieht sich auch auf Immunogene,welche ein Oligosaccharid, wie oben beschrieben, enthält, welches Oligosaccharid mit einem Träger assoziiert ist oder eine Assoziation von mehreren Molekülen eines Oligosaccharides, wie oben beschrieben, enthält, und auf Vaccine, welche solche Immunogene enthält.
Die Erfindung bezieht sich ferner auf Verfahren zur Herstellung der Oligosaccharide, der Immunogene und der Vaccine gemäss der Erfindung.
Unter Weglassung von X(XO-) und Y(-OY) kann das in Formel I dargestellte D-Ribose-D-ribitol-phosphat- skelett sowohl rechts wie links in einer Ribose-, in einer Ribitol- oder einer Phosphatgruppe enden. Oligosaccharide, welche unter Nichtbeachtung von X(XO-) und Y-=Y) in einer Ribitol oder Ribosegruppe auf der linken Seite und in einer Phosphatgruppe auf der rechten Seite enden oder in einer Ribitol- oder Ribosegruppe auf der rechten Seite und in einer Phosphatgruppe auf der linken Seite,werden jedoch bevorzugt. Vorzugsweise ist m = 2, 3, 4, 5 oder 6, da ein Oligosaccharid-Skelett mit einer solchen Länge im allgemeinen bereits adequat ist in bezug auf das angestrebte Ziel. Noch mehr bevorzugt ist n = 3, 4, 5 oder 6.
Vorzugsweise sind k, L, n und q = 0, X = H und Y nicht gleich H.
Weil die Phosphatgruppe in den Oligosacchariden gemäss der Erfindung in Lösung bei z.B. neutralen pH in ionisiertem Zustand auftreten, werden die Oligosaccharide gemäss der Erfindung vorzugsweise in der Form eines Salzes, z.B. eines Natriumsalzes hergestellt.
Da die Oligosaccharide gemäss der Erfindung von sich aus keinerlei Immunogenizität oder inadequate Immunogenizität aufweisen, ist es notwendig, diese Oligosaccharide mit einem Träger zu assoziieren, was dazu führt, dass Immunogenizität tatsächlich in genügendem Grade erhalten wird. Abhängig vom Typus des Trägers wird die Art, in welcher das Oligosaccharid mit dem Träger assoziiert wird, variieren. Die Assoziation des Oligosaccharides und des Trägers erfolgt direkt oder indirekt via X(XO-) oder Y(-OY) in Formel I.
Wenn X und Y Wasserstoff sind, müssen die Oligosaccharide an einer dieser Stellen modifiziert werden, um die Assoziation mit dem Träger zu ermöglichen. Weil die in Formel I dargestellten -OH- und =O-Gruppen, welche in grösserem oder geringerem Ausmass aktiv sind, während einer längeren oder kürzeren Zeit während der Herstellung der Oligosaccharide gemäss der Erfindung geschützt sind, ist es vorteilhaft, die für die Assoziation mit dem Träger erforderlichen Modifikationen zuführen, bevor die Schutzgruppen entfernt werden. Wie bereits erwähnt, erfolgt die Assoziation des Oligosaccharides mit dem Träger entweder via X(XO-) oder via Y(-OY). Wenn nun X und Y beide Wasserstoff wären in Formel I, müssten die Schutzgruppen wieder eingeführt werden, bevor die für die Assoziation mit dem Träger erforderlichen Gruppen eingeführt werden könnten. X ist daher vorzugsweise gleich Wasserstoff und Y(-OY) gleich eine der anderen spezifizierten Gruppen oder Y ist gleich Wasserstoff und X(XO-) ist gleich eine der anderen spezifizierten Gruppen.
Wenn im folgenden "X" oder "Y" oder die Bezeichnung "reaktionsfähige Gruppe" verwendet wird, ist auch der Fall gemeint, in welchem die reaktionsfähige Gruppe aus der reaktionsfähigen Gruppe -NH&sub2; oder -SH besteht, wobei es notwendig ist, -NH&sub2; oder -SH für XO- bzw. -OY zu lesen. Das Oligosaccharid gemäss der vorliegenden Erfindung endet daher vorzugsweise am einen Ende in einer Hydroxylgruppe und am anderen Ende in einer reaktionsfähigen Gruppe oder einer Gruppe, welche eine hydrophobe Kette am ungebundenen Ende aufweist. Die Wahl zwischen diesen beiden Gruppenarten wird bestimmt durch die Art, in welcher die Assoziation des Oligosaccharides und des Trägers durchgeführt wird. Grundsätzlich sind zwei an sich bekannte Methoden zu diesem Zwecke verfügbar. Nach der ersten Methode wird das Oligosaccharid an den Träger gebunden. In diesem Fall ist der Träger üblicherweise ein Protein. Nach der zweiten Methode wird die Assoziation des Oligosaccharides durch eine hydrophobe Wechselwirkung zwischen einer Gruppe, die an das Oligosaccharid gebunden ist, welches eine hydrophobe Kette am ungebundenen Ende enthält, und dem Träger erhalten, wobei der Träger eine Micelle, ein Vesikel oder ein Liposom ist, oder durch eine hydrophobe Wechselwirkung der Oligosaccharide untereinander. Im ersten Fall tritt die hydrophobe Gruppe in eine hydrophobe Wechselwirkung mit den hydrophoben Bereichen der amphiphilen Verbindungen (Lipide) in der Micelle, dem Vesikel oder dem Liposom ein, während das Oligosaccharid an der Grenzfläche der Micelle, des Vehikels oder des Liposoms endet.
Reaktionsfähige Gruppen, welche fähig sind, direkt oder indirekt eine Bindung mit dem Protein zu bilden, sind bekannt. Unter einer indirekten Bindung wird in diesem Zusammenhang verstanden, dass die Bindung zwischen der reaktionsfähigen Gruppe und dem Protein mit Hilfe einer zusätzlichen Verbindung erzielt wird. Wenn X oder Y in Formel I eine reaktionsfähige Gruppe ist, sind grundsätzlich alle die reaktionsfähigen Gruppen geeignet, welche fähig sind, eine Bindung mit einer Carboxyl-, Amin- oder einer anderen, gegebenenfalls eingeführten reaktionsfähigen Funktion des Proteins zu bilden, oder welche mit Hilfe einer zusätzlichen Verbindung an eine Carboxyl-, Amin- oder eine andere gegebenenfalls eingeführte reaktionsfähige Funktion des Proteins gebunden werden kann.
Beispiele solcher reaktionsfähiger Gruppen sind Gruppen mit den folgenden reaktionsfähigen Funktionen:
in welchenR = -OH, -N&sub3;, -O-Alkyl(C&sub1;&submin;&sub1;&sub2;), -OC&sub6;F&sub5;. -H, -Br, -Cl oder
Die reaktionsfähige Gruppe kann aus einer dieser reaktionsfähigen Funktionen bestehen oder, wenn die reaktionsfähige Gruppe grösser ist, kann sie eine dieser reaktionsfähigen Funktionen enthalten, in welchem Fall die Gruppe vorzugsweise in einer dieser reaktionsfähigen Funktionen endet.
Weil es vorteilhaft ist für die Förderung der Immunogenizität, wenn die Ribose-Ribitol-Phosphat-Einheiten im Oligosaccharid in einiger Entfernung vom Protein sind nach der Bindung des Oligosaccharides an das Protein, ist die reaktionsfähige Gruppe vorzugsweise eine ziemlich lange Gruppe mit einer der oben erwähnten reaktionsfähigen Funktionen.
Wie erwähnt, wird eine reaktionsfähige Gruppe am Ende des Oligosaccharid-Skelettes einverleibt, vorzugsweise wenn dieses Skelett noch geschützt ist. Sobald eine reaktionsfähige Gruppe, welche eines dieser reaktionsfähigen Funktionen enthält, einverleibt ist, kann diese reaktionsfähige Funktion in eine der anderen reaktionsfähigen Funktionen umgewandelt werden, wenn das Oligosaccharid-Skelett noch geschützt ist, aber auch, wenn das Skelett bereits vollständig vom Schutz befreit ist.
So können reaktionsfähige Gruppen, welche eine -NH&sub2;-Funktion enthalten, wie
in welchen a = 0-16, b = 0-2, c = 1-10 und die endständige Aminosäure vorzugsweise Glycin ist, mit Hilfe einer Verbindung, welche eine aktive Ester- und eine Maleimidfunktion enthält, in eine reaktionsfähige Gruppe umgewandelt werden, welche eine Maleimidfunktion enthält (diese Gruppen ergeben mit
in welcher R dieselbe Bedeutung wie oben aufweist, die Gruppen
Ferner können reaktionsfähige Gruppen, welche eine -NH&sub2;-Funktion enthalten, mit Hilfe einer Verbindung, welche zwei aktive Ester- oder Aldehydfunktionen enthält, in eine reaktionsfähige Gruppe umgewandelt werden, welche eine aktive Ester- oder Aldehydfunktion als reaktionsfähige Funktion enthalten, zum Beispiel
in welcher R dieselbe Bedeutung wie oben aufweist und d = 1-6, oder mit Hilfe einer Verbindung, welche eine aktive Ester- und eine -SH-Funktion enthält, in eine reaktionsfähige Gruppe umgewandelt werden, welche eine -SH-Funktion enthält, z.B.
in welchen D = 1-6 und Ac = Acetyl ist.
Reaktionsfähige Gruppen, welche eine -SH-Funktion enthalten, können mit Hilfe einer Verbindung, welche eine aktive Ester- und eine Maleimidfunktion enthält, in eine reaktionsfähige Gruppe umgewandelt werden, welche eine aktive Esterfunktion als reaktionsfähige Funktion enthält, zum Beispiel
Reaktionsfähige Gruppen, welche eine - -RGruppe als reaktionsfähge Funktion enthalten, können durch Umsetzung mit Verbindungen, welche eine -NH&sub2;- und -SH-Funktion oder eine Maleimid- und -NH&sub2;-Funktion enthalten, in eine reaktionsfähige Gruppe umgewandelt werden, welche eine -SH- bzw. eine Maleimidgruppe als reaktionsfähige Funktion enthält.
Derartige Umwandlungen der reaktionsfähigen Gruppe sind an sich in der Literatur bekannt.
Die derart hergestellten Oligosaccharide gemäss der Erfindung werden an ein Protein oder Peptid gebunden. Reaktionsfähige -NH&sub2;-, -COOH- oder -SH-Gruppen in dem Protein können in eine der oben beschriebenen anderen reaktionsfähigen Gruppen nach einem analogen Verfahren zu den oben beschriebenen umgewandelt werden.
Das Oligosaccharid gemäss der Erfindung und das Protein können sodann aneinander gebunden werden, unter anderem wie folgt :
Oligosaccharid-Maleimid + HS-Protein T Immunogen
Oligosaccharid-SH + Maleimid-Protein T Immunogen Oligosaccharid-SH S-S-Protein T Immunogen Oligosaccharid-S-S HS-Protein T Immunogen
Oligosaccharid- -R + H&sub2;N-Protein T Immunogen
Oligosaccharid-NH&sub2; + R- -Protein T Immunogen,
wobei R dieselbe Bedeutung wie oben aufweist.
Solche Kupplungen können direkt oder indirekt durchgeführt werden.
Ferner können Oligosaccharide mit einer reaktionsfähigen -NH&sub2;-Funktion zum Beispiel mit einer NH&sub2;- Gruppe eines Proteins mit Hilfe eines Kupplungsmittels, wie Bis-[N-hydroxysuccinimid]-Ester oder Glutar-dialdehyd, gekuppelt werden.
Wenn X oder Y in Formel 1 eine Gruppe ist, welche eine hydrophobe Kette am ungebundenen Ende enthält, eignen sich jene Gruppen zu diesem Zweck, welche fähig sind, eine hydrophobe Wechselwirkung mit einer Micelle, einem Vesikel oder einem Liposom einzugehen, oder fähig sind, eine Micelle mit Hilfe einer hydrophoben Wechselwirkung zu bilden.
Die hydrophobe Kette ist vorzugsweise eine Alkylgruppe, welche 12-24 Kohlenstoffatome enthält. Am meisten bevorzugt werden Gruppen, in welchen die Alkylgruppe, welche 12-24 Kohlenstoffatome enthält, diese Gruppe bilden.
Noch mehr bevorzugt ist die Gruppe eine unverzweigte Alkylgruppe, welche 14-22 Kohlenstoffatome enthält.
Die Oligosaccharide gemäss der vorliegenden Erfindung können entsprechend verwendet werden zur Herstellung eines Vaccins gegen HIB-Erkrankungen. Da die Oligosaccharide gemäss der vorliegenden Erfindung an sich nicht immunogen sind, sollten sie mit einem Träger assoziiert werden, welcher dem Assoziat Immunogenizität verleiht. Dieses Prinzip ist an sich von den sogenannten Haptenen bekannt, welche, obwohl sie an sich nicht immunogen sind, durch Assoziierung mit einem Träger immunogen gemacht werden können. Geeignete Träger sind Protein, Peptide, Micellen, Vesikel und Liposome. Am meisten bevorzugt werden Proteine oder Micellen.
Als besonders geeignete Proteine und Peptide können Tetanustoxin, Tetanustoxoid, Diphtherietoxin, Diphtherietoxoid, Keuchhustentoxin, Keuchhustentoxoid, Keuchhusten-fadenförmiges Haemaglutinin, Keuchhusten- Fimbrien, Keuchhusten- äussere Membranproteine, Meningococcen (Neisseria meningitidis)- äussere Membranproteine, Haemophilus influenzae- äussere Membranproteine, Haemophilus influenzae-Fimbrien, Poliovirus-Untereinheitenproteine und Masernvirus-Untereinheitenproteine genannt werden. Proteine von Haemophilus influenzae werden am meisten bevorzugt. Ein Vorteil solcher Träger besteht darin, dass sie in bestehenden DPTP-Vaccinen verwendet werden oder werden können. Diese genannten Proteine sind an sich bekannt, wie auch Verfahren der Isolierung solcher Proteine. Auch sind Verfahren bekannt, Saccharide mit solchen Proteinen zu assoziieren. Ueblicherweise ist eine covalente Bindung zwischen dem Saccharid und dem Protein daran beteiligt.
Wenn X oder Y in Formel 1 eine Gruppe ist, welche eine hydrophobe Kette am ungebundenen Ende enthält, kann das Oligosaccharid in einer geeigneten Weise immunogen gestaltet werden durch Assoziierung des Oligosaccharides mit Micellen, Vesikeln oder Liposomen. Die Assoziazion wird durch eine hydrophobe Wechselwirkung der hydrophoben Kette mit hydrophoben Teilen der Micelle, des Vesikels oder des Liposoms erhalten. Solche Assoziationsmethoden sind an sich bekannt.
Wenn X oder Y in Formel 1 eine reaktionsfähige Gruppe darstellen, kann eine Reaktion gegebenenfalls zuerst mit einer Verbindung, welche eine reaktionsfähige Gruppe und eine hydrophobe Kette enthält, durchgeführt werden. Das derart erhaltene Produkt kann dann mit Micellen, Vehikeln oder Liposomen assoziiert werden.
Eine andere Methode zur Verleihung von Immunogenzität an die Oligosaccharide gemäss der Erfindung besteht darin, Oligosaccharide, in welchen X oder Y eine Gruppe ist, welche eine hydrophobe Kette am ungebundenen Ende enthält, in solcher Weise zu behandeln, dass diese hydrophoben Ketten eine Micellenstruktur mit Hilfe von hydrophoben Wechselwirkungen bilden. In diesem Fall wird die Immunogenizität nicht durch Assoziation des Oligosaccharides mit einem Träger sondern durch Assoziation verschiedener Moleküle dieses Oligosaccharides miteinander erhalten.
Noch eine weitere Möglichkeit zur Herstellung eines Immunogens besteht darin, die Oligosaccharide gemäss der Formel 1, in welcher X oder Y eine reaktionsfähige Gruppe darstellt, an ein amphiphiles Adjuvansmolekül zukuppeln mit Hilfe einer covalenten Bindung über diese reaktionsfähige Gruppe. Diese Kupplung kann direkt oder indirekt sein. Nach Kupplung des Oligosaccharides und des Adjuvans kann das ungebundene Ende des Adjuvans eine Micelle bilden, gegebenenfalls zusammen mit einem ungebundenen Adjuvans oder mit einer anderen Lipidsubstanz. Geeignete amphiphile Adjuvantien sind zum Beispiel Avridin [N,N-Dioctadecyl-N',N'-bis- (2-hydroxyäthyl)-propandiamin], das lipoidale Amin 4-Aminomethyl-1-[2,3-(di-n-decyloxy)-n-propyl]-4- phenylpiperidin, Dimethyl-dioctadecyl-ammoniumbromid, Laurylmuramyldipeptid, Lauryltetrapeptid, N²-[N-(N- Lauryl-L-alanyl)-γ-D-glutamyl]-N&sup6;-(glycyl)-D,D-L,L- 2,6-diaminopimelinsäure, L-Tyrosin und Alkylderivate davon, Maltosetetrapalmitat, Pluronic-polyole, L-Tyrosin-azobenzol-p-arsonat, Sorbitanmonooleat (Span 80), Trehalosederivate (wie Trehalose-dimycolat), Retinoylsäure und Derivate davon, D,L-α-Tocopherol (Vitamin E), Lipid A und Analoge und Glycoside, wie z.B. Saponine (z.B. Quil A aus dem Bast von Quillaja saponaria Molina).
Solche Immunogene und Verfahren zur Herstellung dieser Immunogene sind an sich bekannt aus der Europäischen Patentanmeldung 86 200 203.7. Lipid A und Analoge sind bekannt als Adjuvantien aus der niederländischen Patentanmeldung 85 00 499. Die Verwendung von Saponinen als Adjuvantien und die Micellenbildung von Saponinen, die an Antigendeterminate gekuppelt sind, ist aus der niederländischen Patentanmeldung 83 03 646 bekannt.
Die Immunogene gemäss der vorliegenden Erfindung können zweckmässig zur Herstellung eines Vaccins gegen HIB-Erkrankung verwendet werden. Um die Immunogenzität weiter zu verbessern, können mit Vorteil Adjuvantien verwendet werden. Die Verwendung solcher Adjuvantien und die Adjuvantien selbst sind bekannt. Die Adjuvantien können dem Immunogen zugesetzt werden. Es ist auch möglich, Adjuvantien mit dem Immunogen zu assoziieren. Solche Verfahren zur Verbesserung der Immunogenzität sind an sich bekannt. Die Immunogene gemäss der vorliegenden Erfindung umfassen somit, zusätzlich zu den Assoziationen von Oligosacchariden mit Trägern und den Assoziationen zwischen Oligosacchariden untereinander auch Assoziationen dieser beiden Typen, mit welchen ein Adjuvans auch assoziiert ist.
Das Vaccin gemäss der vorliegenden Erfindung enthält mindestens Immunogene gemäss der vorliegenden Erfindung. Ueblicherweise befindet sich das Immunogen im Vaccin in einer wässerigen Lösung, Emulsion oder Suspension, in welchen Zusätze, die für Vaccine übliche sind, zugegen sein können, wie Adjuvantien, Stabilisatoren, Puffer und andere Immunogene. Geeignete Adjuvantien, welche zugesetzt werden können, sind Aluminiumhydroxid, -phosphat oder -oxid oder eine Zusammensetzung, welche aus einem Mineralöl, z.B. Marcol 52, oder einem pflanzlichen Oel und einem oder mehreren Emulgiermitteln, wie Tween 80 oder Span 80, oder einem der bereits oben erwähnten amphiphilen Adjuvantien bestehen.
Geeignete Stabilisatoren sind Kohlehydrate, wie Sorbit, Lactose, Mannit, Stärke, Saccharose, Dextran und Glucose, oder Proteine, wie Albumin oder Casein.
Als Puffer ist es möglich, einen Alkalimetallphosphat-, einen Alkalimetallcarbonat- oder einen Erdalkalimetallcarbonat-Puffer zu verwenden.
Wie bereits erwähnt können die Vaccine auch andere Immunogene enthalten. In diesem Fall handelt es sich um einen sogenannten Cocktail, welcher den Vorteil aufweist, dass Immunität gegen verschiedene Pathogene mit einer einzigen Verabreichung erhalten werden kann. Andere Immunogene, welche verwendet werden können, sind z.B. die in den bekannten DPTP-Vaccinen verwendeten Immunogene. Das Vaccin wird nach an sich bekannte Verfahren unter Verwendung eines Immunogens gemäss der vorliegenden Erfindung hergestellt, z.B. durch Lösen, Emulgieren oder Suspendieren des Immunogens in einer wässerigen Umgebung. Einer oder mehrere der üblichen Zusätze können zugesetzt werden oder können in der wässerigen Umgebung zugegen sein.
Ein solches Vaccin kann zu Immunisierung gegen HIB-Erkrankung verwendet werden, jedoch auch für sogenannte "Priming" (bei welchem der Körper nicht direkt zur Bildung spezifischer freier Antikörper stimuliert wird, sondern tatsächlich vorkonditioniert wird, so dass nach späterer Infektion oder Revaccination eine starke Immunreaktion hervorgerufen wird). Das Vaccin wird üblicherweise mit Hilfe einer intramuskulären oder subcutanen Injektion verabreicht. Im allgemeinen beträgt die Menge an pro Injektion verabreichtem Immunogen zwischen 0,1 und 100 ug pro Dosis.
Das Vaccin gemäss der vorliegenden Erfindung bietet im Prinzip Schutz für jedes Individuum gegen HIB- Erkrankung und ist äusserst geeignet insbesondere für die Impfung kleiner Kinder (unter 2 Jahren). Als Resultat der Reinheit des Oligosaccharides gemäss der vorliegenden Erfindung ist es nicht notwendig, jeden hergestellten Ansatz des Vaccins, welches ein solches Oligosaccharid enthält, wiederum auf seine Wirksamkeit zu untersuchen. Ausserdem ist die Menge an unerwünschterweise stimulierenden Antikörpern, das Auftreten anderer Nebenwirkungen, wie Toxizität, bei einem solchen Vaccin beschränkt.
Die Oligosaccharide gemäss der vorliegenden Erfindung können durch Reaktion verschiedener Verbindungen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Verbindungen, welche Ribose-, Ribose-ribitol-, Ribose-ribitol- phosphat-, Ribitol-, Ribitol-phosphat-, Ribitol-phosphat- ribose-, Phosphat-, Phosphat-ribose- und Phosphat-ribose- ribitol-Einheiten enthalten, wobei diese Einheiten mit den notwendigen Schutzgruppen versehen sind, miteinander in verschiedenen Stufen und schliesslich Entfernung der Schutzgruppen hergestellt werden. Die Oligosaccharide gemäss der vorliegenden Erfindung werden schliesslich hergestellt durch Ersatz der Schutzgruppen in Oligosacchariden, einschliesslich der Struktur (D-Ribose-D- ribitol-phosphat)m, (D-Ribitol-phosphat-D-ribose)m oder (Phosphat-D-ribose-D-ribitol)m, in welchem m = 2, 3, 4...19 oder 20 und worin das Wasserstoffatom in den freien Hydroxygruppen durch eine Schutzgruppe ersetzt wurde, durch ein Wasserstoffatom. Zum grössten Teil ist es bekannt, dass Oligosaccharide hergestellt werden können durch Bindung grösserer oder kleinerer Einheiten, aus denen das fertige Oligosaccharid zusammengesetzt ist, aneinander mit Hilfe verschiedener Reaktionen, wobei die Einheiten mit den notwendigen Schutzgruppen versehen sind. Nachdem das gewünschte Oligosaccharid hergestellt ist, werden die Schutzgruppen entfernt. Wenn eine der Gruppen X und Y in Formel 1 geinäss dem Formelblatt nicht Wasserstoff ist und diese Gruppen in den Verbindungen, aus welchen das Oligosaccharid zusammengesetzt wurde, nicht auftreten, sollten diese Gruppen auch einverleibt werden, bevor die Schutzgruppen entfernt werden.
Die Oligosaccharide gemäss der vorliegenden Erfindung können hergestellt werden ausgehend von einer Verbindung der Formel 2 gemäss dem Formelblatt. Ausgehend von dieser Verbindung gibt es eine Anzahl Verfahren zur Herstellung der Oligosaccharide gemäss der Erfindung.
Das erste Verfahren besteht darin, dass Oligosaccharid durch kontinuierliche Einverleibung einer kleinen Einheit zusammenzustellen. Dies kann durch Phosphorylierung von Verbindungen der Formel 2 mit Verbindungen der Formel 3, anschliessende Kupplung einer Verbindung mit Formel 5 an die Phosphorgruppe, Wiederholung dieser beiden Stufen so oft als erwünscht und schliesslich Beendigung des Aufbaus durch Reaktion mit einer Verbindung der Formel 6 gemäss dem Formelblatt erfolgen, worauf die Schutzgruppen noch zu entfernen sind. Ein anderer Weg besteht darin, eine Verbindung der Formel 5 mit einer Verbindung der Formel 3 zu phosphorylieren, das erhaltene Produkt mit Hilfe der Phosphorgruppe an eine Verbindung der Formel 2 zu binden, diesen Schritt so oft als erwünscht zu wiederholen und schliesslich den Aufbau zu beenden durch Reaktion mit einer Verbindung der Formel 6 gemäss dem Formelblatt, worauf die Schutzgruppen noch zu entferne sind. Die Erfindung bezieht sich daher insbesondere auf ein Verfahren zur Herstellung der Oligosaccharide gemäss der vorliegenden Erfindung, dadurch gekennzeichnet, dass
1) eine Verbindung der Formel 2 gemäss dem Formelblatt mit einer Verbindung der Formel 3 gemäss dem Formelblatt umgesetzt wird, in welchen Formeln
k = 0, wenn L = 0 ,
k = 0 oder 1, wenn L = 1 ,
L = 0 oder 1 ,
R&sub1;= eine permanente Schutzgruppe, eine reaktionsfähige Gruppe, welche fähig ist, direkt oder indirekt eine Bindung mit einem Träger zu bilden, und welche eine reaktionsfähige Funktion enthält, welche mit einer permanenten Schutzgruppe versehen ist, oder eine Gruppe, welche eine hydrophobe Kette am ungebundenen Ende enthält, oder die Endgruppe R&sub1;O- ist durch reaktionsfähige Gruppe H&sub2;N- oder HS- ersetzt, welche reaktionsfähige Gruppe mit einer permanenten Schutzgruppe versehen ist,
R&sub2;= eine permanente Schutzgruppe,
A = ein Sauerstoffatom, gebunden mit Hilfe einer doppelten Bindung an das Phosphoratom, oder nichts (in diesem Fall weist das Phosphoratom ein freies Elektronenpaar auf),
R&sub3;= eine reaktionsfähige Gruppe und
R&sub4;= eine reaktionsfähige Gruppe oder eine Gruppe der Formel 4 gemäss dem Formelblatt, in welcher q = 0 oder 1, R&sub2; = eine permantente Schutzgruppe und R&sub5; = eine permanente Schutzgruppe, eine reaktionsfähige Gruppe, welche fähig ist, direkt oder indirekt eine Bindung mit einem Träger zu bilden, und welcher eine reaktionsfähige Funktion enthält, welche mit einer permanenten Schutzgruppe versehen ist, oder eine Gruppe mit einer hydrophoben Kette am ungebundenen Ende, oder die Endgruppe -OR&sub5; ist durch die reaktionsfähige Gruppe H&sub2;N- oder HS- ersetzt, welche reaktionsfähige Gruppe mit einer permanenten Schutzgruppe versehen ist, und dass
2) wenn R&sub2; nicht eine Gruppe der Formel 4 ist, das in Stufe 1 erhaltene Produkt mit einer Verbindung der Formel 5 gemäss dem Formelblatt umgesetzt wird, in welcher R&sub6; eine temporäre Schutzgruppe ist, und das derart erhaltene Produkt durch Ersatz von R&sub6; durch ein Wasserstoffatom vom Schutz befreit wird, und dass
3) Stufe 2) m-2 Mal wiederholt wird mit dem in Stufe 2 erhaltenen Produkt anstelle des in Stufe 1 erhaltenen Produktes, und dass
4) das aus Stufe 2) oder Stufe 3) erhaltene Produkt mit einer Verbindung der Formel 6 gemäss dem Formelblatt umgesetzt wird, in welcher
R&sub2;= eine permanente Schutzgruppe,
R&sub3;= eine reaktionsfähige Gruppe,
R&sub7;= eine permanente Schutzgruppe, eine reaktionsfähige Gruppe, welche fähig ist, direkt oder indirekt eine Bindung mit einem Träger zu bilden und welche eine reaktionsfähige Funktion enthält, welche mit einer permanenten Schutzgruppe versehen ist, oder eine Gruppe mit einer hydrophoben Kette am ungebundenen Ende, oder die äussere Gruppe R&sub7;O- ist durch die reaktionsfähige Gruppe H&sub2;N- oder HS- ersetzt, welche reaktionsfähige Gruppe mit einer permanenten Schutzgruppe versehen ist,
n = 0 oder 1,
q = 0, wenn n = 0 ,
q = 0 oder 1, wenn n = 1 , und dass
5) in dem derart erhaltenen Produkt die Schutzgruppe R&sub1; oder R&sub7;, falls vorhanden und falls erwünscht, durch X oder Y ersetzt wird, sofern X oder Y nicht Wasserstoff ist, und dass
6) die in Stufe 1), 4) oder 5) erhaltene Verbindung durch Ersatz der permanenten Schutzgruppen durch ein Wasserstoffatom von der Schutzgruppe befreit wird.
Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Herstellung der Oligosaccharide gemäss der vorliegenden Erfindung, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass
1) eine Verbindung der Formel 2 gemäss dem Formelblatt, in welcher k, L, R&sub1; und R&sub2; dieselbe Bedeutung wie oben aufweisen, mit dem Reaktionsprodukt einer Verbindung der Formel 3 gemäss dem Formelblatt, in welcher R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; dieselbe Bedeutung wie oben aufweisen, unter der Voraussetzung, dass R&sub4; nicht eine Gruppe der Formel 4 gemäss dem Förmelblatt enthält, mit einer Verbindung der Formel 5 gemäss dem Formelblatt, in welcher R&sub2; und R&sub6; dieselbe Bedeutung wie oben aufweisen, umgesetzt wird, und das derart erhaltene Produkt durch Ersatz von R&sub6; durch ein Wasserstoffatom von den Schutzgruppen befreit wird, und dass
2) das in Stufe 1 erhaltene Produkt mit dem Reaktionsprodukt einer Verbindung der Formel 3 und einer Verbindung der Formel 5 gemäss dem Formelblatt umgesetzt wird, und das derart erhaltene Produkt durch Ersatz von R&sub6; ein Wasserstoffatom von den Schutzgruppen befreit wird, und dass dieses Vorgehen m-3 Mal mit dem erhaltenen Produkt wiederholt wird, und dass
3) das in Stufe 1 oder 2 erhaltene Produkt mit einer Verbindung der Formel 6 gemäss dem Formelblatt, in welcher m, q, R&sub2;, R&sub3; und R&sub7; dieselbe Bedeutung wie oben aufweist, umgesetzt wird, und dass
4) in dem derart erhaltenen Produkt die permanente Schutzgruppe R&sub1; oder R&sub7;, falls vorhanden und falls erwünscht, durch X oder Y ersetzt wird, sofern X oder Y nicht Wasserstoff ist, und dass
5) die in Stufe 3) oder Stufe 4) erhaltene Verbindung durch Ersatz der permanenten Schutzgruppe durch ein Wasserstoffatom von den Schutzgruppen befreit wird.
R&sub1; kann eine permanente Schutzgruppe oder, wenn X in dem gewünschten Oligosaccharid nicht Wasserstoff bedeutet, dasselbe wie X sein kann, unter der Voraussetzung, dass die reaktionsfähige Funktion mit einer permanenten Schutzgruppe versehen ist, was zum Resultat führt, dass die reaktionsfähige Funktion nicht in irgend eine Reaktion während der Bildung des Oligosaccharid-Skelettes eintritt. Da X in Formel 1 vorzugsweise Wasserstoff ist, ist R&sub1; vorzugsweise eine permanente Schutzgruppe.
R&sub2; ist eine permanente Schutzgruppe, R&sub3; in Formel 3 ist eine reaktionsfähige Gruppe und R&sub4; ist eine reaktionsfähige Gruppe oder eine Gruppe der Formel 4. Da Y vorzugsweise nicht gleich Wasserstoff ist, ist R&sub5; in Formel 5 vorzugsweise eine andere Gruppe als eine permanemte Schutzgruppe. Da k, L, n und Q vorzugsweise null bedeuten, ist R&sub4; vorzugsweise eine reaktionsfähige Gruppe und daher keine Gruppe der Formel 4.
Unter der Bezeichnung "permanente Schutzgruppe" sind Gruppen zu verstehen, welche während des ganzen Verlaufes der Herstellung der Oligosaccharide gemäss der Erfindung ihren schützenden Einfluss auf die - sonst - reaktionsfähigen Gruppen ausüben. Erst nachdem die Synthese vollständig durchgeführt ist, werden die permanenten Schutzgruppen entfernt, indem sie durch ein Wasserstoffatom ersetzt werden. Solche Schutzgruppen sind in der Zucker- und Nucleotidchemie bekannt.
Die Gruppen R&sub2; in Formel 2, 3, 4, 5 und 6 können gleich oder verschiedene Gruppen sein, vorzugsweise ausgewählt aus dem folgenden Satz von Gruppen : Benzoyl, Benzyl, Benzyloxymethyl, 2-Chlorphenyl, Benzyloxycarbonyl, tert.-Butyldiphenylsilyl, Alkyl mit 10-20 Kohlenstoffatomen, Tetrahydropyranyl, tert.-Butyldimethylsilyl und Trityl. Vorzugsweise ist R&sub2; in den Ribitoleinheiten Benzyl.
Wenn R&sub1; oder R&sub5; permanente Schutzgruppen sind oder enthalten, können diese Gruppen mit Vorteil ausgewählt werden aus dem obenstehenden Satz. Dasselbe gilt für R&sub2;in Formel 3, welches vorzugsweise 2-Chlorphenyl ist.
Vorzugsweise bildet R&sub1; in Formel 2 zusammen mit R&sub2; in Stellung 5' der Riboseeinheit eine Gruppe
(in diesem Fall bedeuten k und L null) oder R&sub2; in Stellung 5' der Riboseeinheit und R&sub1; sind Benzyl.
Vorzugsweise ist R&sub2; in Stellung 2' in der Riboseeinheit Benzyl, Benzyloxymethyl, Tetrahydropyranyl oder tert.-Butyldimethylsilyl, wobei Benzyl und Benzyloxymethyl am meisten bevorzugt werden, und R&sub2; in Stellung 5' der Riboseeinheit in Formel 4, 5 und 6 ist Benzyl, Benzyloxymethyl, Tetrahydropyranyl, Trityl oder tert.- Butyldiphenylsilyl, wobei Benzyl und tert.-Butyldiphenylsilyl am meisten bevorzugt werden.
Die reaktionsfähigen Gruppen R&sub3; und R&sub4; in Formel 3 können Gruppen sein, welche zusammen fähig sind, eine Bindung zwischen der freien OH-Gruppe in Verbindungen der Formel 5 und Formel 2 zu erbringen. Geeignete Verbindungen der Formel 3 sind :
- Die Reaktion zwischen Verbindungen der Formel 2 und 3 erfolgt üblicherweise bei Atmosphärendruck und einer Temperatur von 0 und 60ºC während 20 Minuten bis 3 Stunden.
Dann wird das derart erhaltene Produkt mit einer Verbindung der Formel 5 umgesetzt, in welcher R&sub2; eine permanente Schutzgruppe und R&sub6; eine temporäre Schutzgruppe ist.
In bezug auf R&sub2; gilt dasselbe wie bereits oben bei der Besprechung der Formel 2 bemerkt. Eine temporäre Schutzgruppe bedeutet in diesem Zusammenhang, dass eine Gruppe verwendet wird, welche ihre schützende Funktion während eines Teiles des Aufbaus des Oligosaccharid- Skelettes ausübt, um anschliessend, bevor der Aufbau vollständig beendet ist, selektiv entfernt zu werden, d.h. ohne dass die permanenten Schutzgruppen entfernt werden. Solche Gruppen sind in der Zucker- und Nucleotid- Chemie bekannt. Geeignete Gruppen sind : Allyl, 1-Propenyl, Dimethoxytrityl, Chloracetyl, Bromacetyl, Levulinoyl und Allyloxycarbonyl. Am meisten bevorzugt für R&sub6; wird Allyl und 1-Propenyl.
Die Reaktion mit der Verbindung der Formel 5 erfolgt üblicherweise bei Atmosphärendruck und einer Temperatur zwischen 0 und 60ºC während 20 Minuten bis 3 Stunden.
Nach der Reaktion mit der Verbindung der Formel 5 wird die Gruppe R&sub6; selektiv entfernt, üblicherweise bei Atmosphärendruck und einer Temperatur von 0 bis 60ºC während 10-60 Minuten,und durch ein Wasserstoffatom ersetzt.
Dann kann, falls erwünscht, die Reaktion mit einer Verbindung der Formel 3, vorausgesetzt dass R&sub4; eine reaktionsfähige Gruppe ist, die Reaktion mit einer Verbindung der Formel 5 und der Ersatz von R&sub6; durch ein Wasserstoffatom m-2 Mal wiederholt werden. Die Bedingungen, unter welchen diese Stufen durchgeführt werden, sind dieselben wie für die bereits oben beschriebenen äquivalenten Stufen.
Das erhaltene Produkt wird sodann mit einer Verbindung der Formel 6 gemäss Formelblatt versetzt. In bezug auf R&sub2; und R&sub3; gilt dasselbe, was bereits oben in bezug auf R&sub2; und R&sub3; bei der Diskussion der Formeln 2 und 3 vermerkt wurde. Vorzugsweise sind n und q = 0, R&sub7; weist dieselbe Bedeutung wie R&sub1; auf; dies bedeutet nicht, dass R&sub1; und R&sub7; notwendigerweise identisch sind. Da Y in dem gewünschten Oligosaccharid vorzugsweise nicht Wasserstoff bedeutet, ist R&sub7; vorzugsweise gleich Y (Y ≠ H), unter der Bedingung, dass die reaktionsfähige Funktion mit einer permanenten Schutzgruppe versehen ist. Gruppen, welche geeigneterweise für diesen Zweck verwendet werden können, sind die bereits erwähnten permanenten Schutzgruppen; am meisten bevorzugt wird die Benzyloxycarbonylgruppe.
Die Bedingungen, unter welchen die Reaktion mit einer Verbindung der Formel 6 üblicherweise erfolgt, sind die folgenden : Temperatur 10-60ºC bei Atmosphärendruck, Zeit 15 Minuten - 6 Stunden.
Der Aufbau des Oligosaccharid-Skelettes ist damit vollständig. Falls erwünscht, können R&sub1; oder R&sub7;, sofern R&sub1; oder R&sub7; eine permanente Schutzgruppe darstellt, nun durch X oder Y ersetzt werden, sofern X oder Y ≠ H ist. In den Oligosacchariden gemäss der vorliegenden Erfindung ist X vorzugsweise Wasserstoff; in diesem Fall ist R&sub1; vorzugsweise eine permanente Schutzgruppe. Da Y vorzugsweise nicht Wasserstoff ist, ist R&sub7; vorzugsweise dasselbe wie Y (Y ≠ H) , versehen mit einer permanenten Schutzgruppe. In diesem Fall braucht weder R&sub1; noch R&sub7; durch X oder Y ersetzt zu werden, sofern X oder Y ≠ H ist. Vorzugsweise wird diese Stufe daher nicht durchgeführt.
Schliesslich werden die permanenten Schutzgruppen durch ein Wasserstoffatom ersetzt. Gleich wie die Verwendung und die Einführung von permanenten Schutzgruppen in der Zucker- und Nucleotid-Chemie bekannt ist, ist auch die Entfernung der Schutzgruppen bekannt.
Die Herstellung von Oligosacchariden gemäss der vorliegenden Erfindung, in welchen k, L, n und q = 0 sind, wird jedoch vorzugsweise durchgeführt, indem man eine Verbindung der Formel 2 mit dem Reaktionsprodukt einer Verbindung gemäss Formel 3 und gemäss Formel 5 reagieren lässt. Nach Entfernung der Schutzgruppen vom erhaltenen Produkt durch Entfernung von R&sub6;, kann das Oligosaccharid-Skelett weiter ausgedehnt werden durch Umsetzung mit dem Produkt einer Verbindung gemäss Formel 3 und gemäss Formel 5 und Entfernung der Schutzgruppen im erhaltenen Produkt, wiederum durch Entfernung von R&sub6;. Dies kann so oft als erwünscht wiederholt werden, wobei die erforderliche Länge des Oligosaccharid- Skelettes zu berücksichtigen ist. Der Aufbau des Oligosacchard-Skelettes wird beendet durch Umsetzung mit einer Verbindung gemäss Formel 6. Der Vorteil dieses Verfahrens besteht darin, dass die Anzahl Stufen herabgesetzt werden kann, weil das durch Umsetzung einer Verbindung der Formeln 3 und 5 erhaltene Produkt nur einmal hergestellt zu werden braucht. Ein zweiter Vorteil besteht in der Tatsache, dass eine Verbindung der Formel 3 selektiver mit einer Verbindung der Formel 5 als mit einer Verbindung gemäss Formel 2 reagiert. In beiden Fällen dient die Verbindung der Formel 3 dazu, nur eine Verbindung der Formel 2 oder 5 zu binden, während die andere reaktionsfähige Gruppe der Verbindung der Formel 3 intakt bleibt. Im Fall der Reaktion mit einer Verbindung gemäss Formel 2 tritt die unerwünschtere Dimerbildung auf.
Die Reaktion zwischen einer Verbindung der Formeln 3 und 5 wird bei einer Temperatur zwischen 10 und 60ºC und bei Atmosphärendruck durchgeführt und ist im allgemeinen innerhalb 10-60 Minuten beendet. Das derart gebildete Produkt wird ebenfalls bei 10-60ºC und Atmosphärendruck mit einer Verbindung gemäss Formel 2 umgesetzt. Diese Reaktion ist im allgemeinen nach 0,5-3 Stunden beendet und wird vorzugsweise in Gegenwart eines Katalysators, wie N-Methylimidazol oder Tetrazol durchgeführt oder nach Aktivierung mit oder in Gegenwart eines Aktivierungsmittels, wie 1-(2,4,6-Triisopropylbenzol-2'- sulfonyl)-3-nitro-1,2,4-triazol oder 1-(Mesitylen-2'- sulfonyl)-3-nitro-1,2,4-triazol.
Verbindungen gemäss Formel 3, welche zweckmässigerweise verwendet werden können, sind im Prinzip dieselben wie die bereits oben erwähnten Verbindungen.
Die Oligosaccharide gemäss der vorliegenden Erfindung können auch hergestellt werden, ausgehend von einer Verbindung der Formel 6 gemäss dem Formelblatt.
Diese Verbindung wird mit einer Verbindung der Formel 5, in welcher H durch R&sub6; ersetzt ist und R&sub6; durch H,umgesetzt. Die Entfernung der Schutzgruppen wird sodann durchgeführt unter Ersatz von R&sub6; durch H und Umsetzung des erhaltenen Produktes mit einer Verbindung der Formel 3 und 2 nacheinander. Eine andere Möglichkeit besteht darin, eine Verbindung der Formel 6 mit dem durch Umsetzung einer Verbindung der Formel 3 mit einer Verbindung der Formel 5, in welcher H durch R&sub6; ersetzt ist und R&sub6; durch H, umzusetzen, und die erhaltene Verbindung mit einer Verbindung der Formel 2 umzusetzen. Die Zwischenstufe kann wiederum m - 2 Mal wiederholt werden.
An stelle der Verbindungen der Formel 3 gemäss dem Formelblatt können andere Phosphorverbindungen ebenfalls für die Herstellung der Oligosaccharide gemäss der Erfindung verwendet werden. Dies gilt sowohl für die bereits beschriebenen Methoden wie für die noch zu folgenden Methoden der Herstellung. So können Phosphorverbindungen, welche drei reaktionsfähige Gruppen enthalten, wie PCl&sub3; pder Salicylchlorphosphin, mit Verbindung 2 oder 5 gemäss dem Formelblatt umgesetzt werden, worauf das erhaltene Produkt zu dem entsprechenden Phosphonat hydrolysiert wird, welches nach Aktivierung mit einem Aktivierungsmittel, wie Pivaloylchlorid, mit Verbindung 5 oder 2 gemäss dem Formelblatt umgesetzt wird.
Nach Umsetzung einer Verbindung der Formel 3 gemäss dem Formelblatt mit Verbindung 2 oder 5 gemäss dem Formelblatt kann das gebildete Produkt auch hydrolysiert werden - unter Entfernung der verbliebenen freien reaktionsfähigen Gruppe und der permanenten Schutzgruppe (welche in diesem Fall eine temporäre Schutzgruppe ist) - zu dem entsprechenden Phosponat, welches nach Aktivierung mit einem Aktivierungsmittel mit Verbindung 5 oder 2 gemäss dem Formelblatt umgesetzt wird.
Wenn A in Formel 3 nichts ist und die Phosphorverbindung daher ein freies Elektronenpaar aufweist, oder während der Herstellung der Oligosaccharide gemäss der Erfindung Phosphorverbindungen gebildet werden, welche nicht vollständig oxidiert sind, sollte eine Oxidation durchgeführt werden, z.B. mit I&sub2;/Pyridin oder tert.- Butylperoxid, um das entsprechende Phosphat zu erhalten.
Eine weitere Methode zur Herstellung von Oligosacchariden gemäss der Erfindung ist diejenige mit Hilfe der sogenannten Blocksynthese. In diesem Fall werden ziemlich grosse Fragmente des gewünschten Oligosaccharides getrennt hergestellt und anschliessend aneinander gebunden. Noch ein weiteres Verfahren besteht darin, ein ziemlich grosses Fragment herzustellen und einen Teil des erhaltenen Fragmentes an einer anderen Stelle von den Schutzgruppen zu befreien als den anderen Teil, was dazu führt, dass beide Teile miteinander vereint werden können. Die Erfindung gemäss der vorliegenden Anmeldung bezieht sich daher insbesondere auf ein Verfahren zur Herstellung von Oligosacchariden gemäss der vorliegenden Erfindung, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass
1) eine Verbindung der Formel 2 gemäss dem Formelblatt mit dem Reaktionsprodukt einer Verbindung der Formel 3 und Formel 5 gemäss dem Formelblatt, in welchen Formeln k, L, A, R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und R&sub6; dieselbe Bedeutung wie bereits beschrieben aufweisen und R&sub4; eine reaktionsfähige Gruppe ist, umgesetzt wird, und das derart erhaltene Produkt durch Ersatz von R&sub6; durch ein Wasserstoffatom von den Schutzgruppen befreit wird, und dass
2) Stufe 1) so oft wie erwünscht mit dem in Stufe 1) erhaltenen Produkt anstelle der Verbindung gemäss Formel 2 wiederholt wird, und dass
3) Stufe 1, und falls erwünscht, Stufe 2 wiederholt werden, ausgehend von einer Verbindung gemäss Formel 2, in welcher k = 0, L = 1 und R1 eine temporäre Schutzgruppe ist, und R&sub1; durch ein Wasserstoffatom in der letzten Stufe anstelle von R&sub6; ersetzt wird, und dass
4) das in Stufe 1) oder 2) erhaltene Produkt und das in Stufe 3) erhaltene Produkt miteinander umgesetzt werden, und in dem derart gebildeten Produkt R&sub6; durch ein Wasserstoffatom ersetzt wird, und dass
5) das in Stufe 4) erhaltene Produkt mit einer Verbindung der Formel 6 gemäss dem Formelblatt, in welcher R&sub2;, R&sub3; und R&sub7;, n und q dieselbe Bedeutung wie oben beschrieben aufweisen, umgesetzt wird, und dass
6) die permanenten Schutzgruppen R&sub1; oder R&sub7;, falls zugegen und falls erwünscht, in dem derart erhaltenen Produkt durch X oder Y ersetzt werden, sofern X oder Y nicht Wasserstoff ist, und dass
7) die in Stufe 5) oder 6) erhaltene Verbindung durch Ersatz der permanenten Schutzgruppen durch ein Wasserstoffatom von den Schutzgruppen befreit wird.
Dieses Herstellungsverfahren kann auch durchgeführt werden unter Verwendung einer Verbindung der Formel 6 in Stufe 3) anstelle einer Verbindung der Formel 2, wobei das Reaktionsprodukt einerVerbindung der Formel 3 und 5 verwendet wird.
Dieses Herstellungsverfahren kann auch durchgeführt werden ausgehend von einer Verbindung der Formel 6 analog zu dem, was bereits in dieser Beziehung beschrieben wurde.
Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Herstellung von Oligosacchariden gemäss der vorliegenden Erfindung, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass
1) eine Verbindung der Formel 2 gemäss dem Formelblatt mit dem Reaktionsprodukt einer Verbindung der Formel 3 und der Formel 5 nach dem Formelblatt, in welchen A, R&sub2;, R&sub3; und R&sub6; die bereits beschriebene Bedeutung aufweisen, und R&sub4; eine reaktionsfähige Gruppe ist, k = 0, L = 0 und R&sub1; eine Schutzgruppe ist, umsetzt und das derart erhaltene Produkt durch Ersatz von R&sub6; durch ein Wasserstoffatom von den Schutzgruppen befreit wird, und dass
2) Stufe 1) so oft wie gewünscht mit dem in Stufe 1) erhaltenen Produkt anstelle der Verbindung der Formel 2 wiederholt wird, und dass
3) ein Teil des in Stufe 2) erhaltenen Produktes durch Ersatz von R&sub1; durch ein Wasserstoffatom anstelle von R&sub6; von den Schutzgruppen befreit wird, und dass
4) die Produkte, in welchen R&sub1; und R&sub6; ersetzt wurden, miteinander umgesetzt werden, nachdem eines dieser Produkte mit einer Verbindung der Formel 3 umgesetzt wurde, und dass
5) R&sub6; in dem erhaltenen Produkt durch ein Wasserstoffatom ersetzt wird, und dass
6) das aus Stufe 5) erhaltene Produkt mit einer Verbindung der Formel 6 gemäss Formelblatt umgesetzt wird, in welcher n, q, R&sub2;, R&sub3; und R&sub7; die bereits beschriebene Bedeutung aufweisen, und dass
7) die permanente Schutzgruppe R&sub1; oder R&sub7;, falls vorhanden und falls erwünscht, in dem derart erhaltenen Produkt durch X oder Y ersetzt wird, sofern X oder Y nicht Wasserstoff ist, und dass
8) die in Stufe 6) oder 7) erhaltene Verbindung durch Ersatz der permanenten Schutzgruppen durch ein Wasserstoffatom von den Schutzgruppen befreit wird.
Dieses Herstellungsverfahren kann auch in umgekehrter Reihenfolge durchgeführt werden, d.h. ausgehend von einer Verbindung der Formel 6 und endend mit der gewünschten Einverleibung, um eine Verbindung der Formel 2 zu erhalten.
Eine weitere Variante dieser Blocksynthese besteht darin, die Einverleibung der endständigen Gruppe (durch Umsetzung mit einer Verbindung gemäss Formel 6 oder Formel 2) in einem der Blöcke durchzuführen, bevor die beiden Blöcke gekuppelt werden. Die Blocksynthese ist insbesondere von Vorteil, wenn ziemlich grosse Oligosaccharide hergestellt werden. Die Anzahl der Reaktionsstufen kann auf diese Weise beträchtlich herabgesetzt werden. Die Bedingungen, unter welchen die Blöcke aneinander gebunden werden, sind im Prinzip nicht verschieden von denjenigen, welche bereits oben für die anderen Verfahren beschrieben wurden. Die beschriebenen Herstellungsverfahren können auf geeignete Weise ganz oder teilweise in einer Festphase durchgeführt werden.
Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele erläutert.

Beispiele

1. Herstellung der Verbindung der Formel 2 gemäss dem Formelblatt

Ausgehend von D-Ribonolacton wurde 1-O-[2-Benzyloxymethyl-3,5-O-(tetraisopropyldisiloxan-1,3-diyl)-β-D- ribofuranosyl]-2,3,4-tri-O-benzyl-D-ribitol (Verbindung 15 im Schema 1) über 13 Zwischenprodukte hergestellt.
Verbindung 2 in Schema 1 wurde aus Verbindung 1 hergestellt wie beschrieben in Canadian J. Chem. 36 (1958) 1720.
4,5 ml Allylchlorformiat in 10 ml trockenem Acetonitril wurden tropfenweise unter Rühren zu 4 g Verbindung 2 und 3,5 ml trockenem Pyridin in 10 ml trockenem Acetonitril bei 0ºC zugesetzt. Das Rühren wurde sodann während 1 Stunde bei 0ºC fortgesetzt.
Das überschüssige Chlorformiat wurde durch Zusatz von Eis zerstört. Das Reaktionsgemisch wurde mit 100 ml Aether verdünnt und dreimal mit 50 ml Wasser gewaschen. Die organische Schicht wurde mit MgSO&sub4; getrocknet und unter Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in 10 ml Dichlormethan gelöst und durch eine kleine Säule, welche mit 6 g Silicagel 60 bepackt war, filtriert. Die Säule wurde mit 40 ml Dichlormethan gewaschen. Das Filtrat und die Waschflüssigkeit wurden vereint und unter Vakuum eingeengt. Verbindung 3 wurde daraus mit Aether/Diisopropyläther kristallisiert.
5 g Verbindung 3 in 20 ml Dioxan wurden unter eine Heliumatmosphäre verbracht. Nachdem 15 mg Tetrakis- (triphenylphosphin)-palladium zugesetzt worden waren, wurde die Lösung während 15 Minuten unter Rückflussbedingungen gehalten, und das Reaktionsgemisch mit Verbindung 4 wurde konzentriert.
8,6 g Verbindung 4, 3,5 g Natriumborhydrid und 150 ml trockenes Tetrahydrofuran wurden auf 55ºC erhitzt. 30 ml Methanol wurden im Laufe von 45 Minuten unter Rühren zugesetzt. Das Rühren wurde sodann während 1 Stunde bei 55ºC fortgesetzt.
Nach dem Kühlen wurde das Reaktionsgemisch unter Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mit trockenem Methanol (3 x 50 ml) zusammen verdampft, in 100 ml Dichlormethan aufgenommen und mit 100 ml einer 90 %igen gesättigten Lösung von Ammoniumchlorid in Wasser gewaschen. Die wässerige Schicht wurde mit Dichlormethan (2 x 100 ml) extrahiert. Die vereinten organischen Schichten wurden getrocknet (MgSO&sub4;) und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mit Hilfe der Chromatographie (Eluierung mit Dichlormethan/Methanol 100/0 T95/5) gereinigt. Die geeigneten Fraktionen enthalten Verbindung 5. 6,2 g Verbindung 5 wurden in 100 ml Essigsäure gelöst, worauf 40 ml Wasser zugesetzt wurden. Die Lösung wurde während 4 Stunden bei 50ºC gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde zusammen mit trockenem Toluol (3 x 25 ml) und trockenem Pyridin (3 x 25 ml) verdampft und in 40 ml Pyridin wieder gelöst. Nachdem 7,5 g Tritylchlorid zugesetzt worden waren, wurde die Lösung während 12 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Nach Zusatz von 5 ml Methanol wurde das Reaktionsgemisch unter Vakuum eingeengt.
Der Rückstand wurde zusammen mit Toluol (3 x 25 ml) verdampft und in 150 ml Dichlormethan aufgenommen und mit 150 ml 1 M Natriumbicarbonatlösung und mit 150 ml Wasser gewaschen. Die organische Schicht wurde getrocknet (MgSO&sub4;) und unter Vakuum eingeengt. Nach chromatographischer Reinigung, ausgeführt wie in der vorgehenden Stufe, wurde Verbindung 6 erhalten. 7,3 g Verbindung 6 wurden in 40 ml trockenem N,N-Dimethylformamid gelöst, worauf 2 g Natriumhydrid in kleinen Portionen zugesetzt wurden. Das gerührte Reaktionsgemisch wurde auf 0ºC gekühlt, und 6,2 ml Benzylbromid in 10 ml trockenem N,N-Dimethylformamid wurden tropfenweise im Laufe von 30 Minuten zugesetzt. Das Rühren wurde während weiteren 30 Minuten bei 0ºC fortgesetzt und anschliessend während 12 Stunden bei Zimmertemperatur. Dann wurden 10 ml Methanol langsam zugesetzt und das Reaktionsgemisch unter Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in 150 ml Aether aufgenommen und dreimal mit 50 ml H&sub2;O gewaschen. Die organische Schicht wurde getrocknet (MgSO&sub4;) und unter Vakuum eingeengt. Die chromatographische Reinigung des Konzentrates [Eluierung mit Hexan/Dichlormethan 2/1 (400 ml) und 1/1 (4oo ml), gefolgt von Dichlormethan] und die Verdampfung der richtigen Fraktionen ergab Verbindung 7. 8,5 g Verbindung 7 wurde in 135 ml Essigsäure und 15 ml Wasser gelöst und während 90 Minuten auf 80ºC erhitzt. Die Lösung wurde unter Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in Aether aufgenommen und mit Wasser (50 ml) und 1 M Natriumbicarbonatlösung (2 x 50 ml) gewaschen.
Die organische Schicht wurde getrocknet (MgSO&sub4;) und unter Vakuum eingeengt. 10 ml Dichlormethan/Hexan 1/1 wurden zum Rückstand zugesetzt und eine Filtration durchgeführt. Das Filtrat wurde chromatographisch gereinigt (Eluierung mi 400 ml Chloroform/Hexan 1/1, 400 ml Dichlormethan und Dichlormethan/Methanol 98/2), worauf Verbindung 8 erhalten wurde. 3,4 g Verbindung 9, welche gekauft wurde, und 3,1 g Verbindung 8 wurden durch Verdampfen zusammen mit Dioxan (3 x 50 ml) getrocknet und anschliessend in 50 ml trockenem 1,2-Dichloräthan gelöst. Molekularsiebe (4 Å , 10 g aktivierte Kügelchen) wurden zugesetzt und das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur während 90 Minuten unter einem Stickstoffstrom gerührt. Dann wurden 3 x 30 ul Trimethylsilyl-trifluormethansulfat in Abständen von 1 Stunde zugesetzt. 1 Stunde nach dem letzten Zusatz wurden 100 ul Triäthylamin zugesetzt; die Molekularsiebe wurden abfiltriert und mit Chloroform und Toluol gewaschen. Das Filtrat und die Waschflüssigkeit wurden vereint und unter Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde chromatographisch gereinigt (Eluierung mit Toluol/Aceton 100/0 98/2). Verbindung 10 wurde aus den richtigen Fraktionen erhalten. 5 g davon wurden in 25 ml trockenem Dioxan gelöst; dann wurden 25 ml trockenes Methanol und 1,25 ml 1 M Natriummethoxid in Methanol zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde während 4 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Nachdem 0,25 ml 1 M Natriummethoxid in Methanol zugesetzt worden waren, wurde das Rühren während einer weiteren Stunde fortgesetzt. Dann wurden 1,25 g Dowex 50 WX4 (H&spplus;-Form) zugesetzt und nach 30 Minuten wiederum durch Filtration entfernt und mit Methanol und Chloroform gewaschen. Das Filtrat und die Waschflüssigkeit wurden vereint und unter Vakuum eingeengt. Die chromatographische Reinigung (Eluierung mit Dichlormethan/Methanol 100/0 T 95/5) ergab Verbindung 11, von welcher 2,4 g zweimal in 20 ml trockenem Pyridin eingeengt wurden. Dann wurden 20 ml trockenes Pyridin zugesetzt. Die erhaltene Lösung wurde unter einer Stickstoffatmosphäre bei 0ºC gerührt, und 1,4 ml 1,3-Dichlor-1,1,3,3-tetraisopropyldisiloxan wurden tropfenweise im Laufe von 15 Minuten zugesetzt. Dann wurde während 1 Stunde bei Zimmertemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter Vakuum eingeengt und mit Toluol (3 x 20 ml) zusammen verdampft. Der Rückstand wurde in 75 ml Diäthyläther aufgenommen und mit 1 M KH&sub2;PO&sub4; (3 x 50 ml) und 1 M NaHCO&sub3; (3 x 50 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde getrocknet (MgSO&sub4;) und unter Vakuum eingeengt. Nach chromatographischer Reinigung (Eluierung mit Dichlormethan/Aceton 100/0T98/2) wurde Verbindung 12 erhalten, von welcher 1,49 g zweimal aus 5 ml Acetonitril konzentriert wurden. Dann wurden 4,5 ml Acetonitril zugesetzt. Die Lösung wurde unter einer Stickstoffatmosphäre bei 50ºC gerührt, und 1,35 ml trockenes N,N-Diisopropyläthylamin und 0,5 ml Benzyloxymethylchlorid wurden nacheinander zugegeben. Nach 2 Stunden wurden 0,25 ml Benzyloxymethylchlorid zugesetzt, und anschliessend wurde das Rühren während einer weiteren Stunde fortgesetzt. Dann wurden 2 ml trockenes Methanol bei 50ºC zugesetzt. Nach dem Abkühlen wurde das Reaktionsgemisch unter Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in 40 ml Diäthyläther aufgenommen und mit 1 M KH&sub2;PO&sub4; (3 x 20 ml) und 1 M NaHCO&sub3; (20 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde getrocknet (MgSO&sub4;) und unter Vakuum eingeengt. Nach chromatographischer Reinigung (Eluierung mit Hexan/Aethylacetat 10/0T9/1) wurde Verbindung 13 erhalten. Verbindung 13 (1,32 g) wurde in 4 ml Tetrahydrofuran gelöst. Die Lösung wurde dreimal entgast und unter Helium verbracht. 1,5-Cyclooctadien-bis-(methyldiphenylphosphin)-iridiumhexafluorphosphat (2-3 mg) wurde zugesetzt, worauf die Lösung wiederum dreimal entgast und unter Helium verbracht wurde. Ein H&sub2;-Strom wurde während 2 Minuten über die Lösung geführt, worauf sie wiederum entgast und unter Helium verbracht wurde. Nach 4 Stunden wurde das Reaktionsgemisch unter Vakuum eingeengt. Die derart erhaltene Verbindung 14 wurde in Aceton und Wasser (1,2 g in 15 ml bzw. 1 ml) gelöst. Dann wurden 300 mg HgO und 375 mg HgCl&sub2; zugesetzt, und die Suspension wurde während 30 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt. Das HgO wurde durch Filtration entfernt und gewaschen. Das Filtrat und die Waschflüssigkeit wurden vereint und unter Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in 75 ml Diäthyläther aufgenommen und mit 40 ml 50 %iger gesättigter KI-Lösung (3x), 40 ml einer 1 %igen NaHSO&sub3;-Lösung und 40 ml 1 M NaHCO&sub3; gewaschen. Die organische Schicht wurde getrocknet (MgSO&sub4;) und unter Vakuum eingeengt.
Nach chromatographischer Reinigung (Eluierung mit Hexan/Aethylacetat 9/1T7/3) wurde 0,97 g reine Verbindung 15 erhalten; Rf = 0,34 (Hexan/Aethylacetat 7/3), [α]20D = +39º (c 1,0 - CHCl&sub3;).

2. Herstellung der Verbindung der Formel 5 gemäss dem Formelblatt

Ausgehend von Verbindung 14 im Schema 1 wurde die Verbindung 17 nach dem Schema 2 hergestellt.
Verbindung 14 (425 mg) wurde aus 2 ml trockenem Dioxan (2x) eingeengt und in 2,2 ml 0,5 M Tetra- n-butylammoniumfluorid in Dixan gelöst. Nachdem die Lösung während 30 Minuten bei Zimmertemperatur gestanden hatte, wurde das Lösungsmittel unter Vakuum verdampft. 25 ml 1 M NaHCO&sub3; wurden zum Rückstand zugesetzt, und das Gemisch wurde mit 25 ml Dichlormethan (3x) extrahiert. Die vereinten Extrakte wurden getrocknet (MgSO&sub4;) und unter Vakuum eingeengt. Nach chromatographischer Reinigung (Eluierung mit Dichlormethan/Methanol 100/0T 98/2) und Einengung unter Vakuum der richtigen Fraktionen wurden 239 mg eines Produktes erhalten, welches 200 mg Verbindung 16 enthielt. Dieses Produkt wurde zweimal aus 2,5 ml trockenem Pyridin eingeengt und anschliessend in 2,5 ml Dichlormethan gelöst. Nachdem 65 ul N,N-Diisopropyläthylamin und 90 ul tert.-Butyldiphenylsilylchlorid zugesetzt worden waren, wurde das Reaktionsgemisch während 12 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Nachdem 65 ul N,N-Diisopropyläthylamin und 90 ul tert.-Butyldiphenylsilylchlorid zugesetzt worden waren,wurde das Rühren während weiteren 24 Stunden fortgesetzt. 0,5 ml Methanol wurden sodann zugesetzt und das Einengen wurde unter Vakuum durchgeführt. Der Rückstand wurde in Diäthyläther (25 ml) aufgenommen und mit 1 M KH&sub2;PO&sub4; (3 x 10 ml) und 1 M NaHCO&sub3; (10 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde getrocknet (MgSO&sub4;) und unter Vakuum eingeengt. Die chromatographische Reinigung (Eluierung mit Benzol/Aethylacetat 10/0T7/3) ergab 254 mg Verbindung 17; Rf = 0,41 (Hexan/Aethylacetat 7/3) und [α]20D = -24,8º (c = 1,0 - CHCl&sub3;).

3. Herstellung der Verbindung mit Formel 3 gemäss dem Formelblatt

2-Chlorphenyl-O,O-bis-(1-benzotriazolyl)- phosphat wurde gemäss I.R.L. Press, Oxford, Grossbritannien (1984) 153-183 hergestellt. Diese Verbindung wird im folgenden als Verbindung 18 bezeichnet.

4. Herstellung der Verbindung mit Formel 1 gemäss dem Formelblatt

Ein Oligosaccharid gemäss der vorliegenden Erfindung wurde hergestellt wie in Schema 3 dargestellt.
229 mg Verbindung 15 und 254 mg Verbindung 17 wurden getrennt aus 2,5 ml Pyridin (3 x, das letzte Mal auf ein Volumen von 1 ml) eingeengt. Dann wurden 1,46 ml einer 0,2 M Lösung von Verbindung 18 in Dioxan zu Verbindung 17 zugesetzt, worauf die Lösung während 30 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt wurde. Diese Lösung wurde zu einem Gemisch von Verbindung 15 und 50 ul N-Methylimidazol unter wasserfreien Bedingungen zugesetzt. Nach Rühren während 2 Stunden bei Zimmertemperatur wurde die Lösung mit 50 ml Diäthyläther verdünnt und mit 1 M Triätyhlammoniumbicarbonat (2 x 25 ml), 1 M KH&sub2;PO&sub4; (25 ml) und 1 M Triäthylammoniumbicarbonat (25 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde getrocknet (MgSO&sub4;) und unter Vakuum eingeengt. Die chromatographische Reinigung (Eluierung mit Hexan/Aethylacetat 10/0T 8/2) ergab 368 mg Verbindung 19 (n = 1), welche sodann mit HgO/HgCl&sub2;,wie für die Herstellung der Verbinung 16 beschrieben,behandelt wurde. Nach chromatographischer Trennung (Eluierung mit Hexan/Aethylacetat 9/1T7/3) wurde Verbindung 20 (n = 1) erhalten.
Verbindung 21 (0,22 mMol), hergestellt durch Umsetzung des Pentachlorphenylesters von Benzyloxycarbonylglycin und 3-Amino-1-propanol in Dioxan (Zimmertemperatur, 1 Stunde), wurde mit Verbindung 18 (1,1 ml einer 0,2 M Lösung in Dioxan) phosphoryliert. Die Lösung wurde zu einem Gemisch von 296 mg der Verbindung 20 (n = 1) und 20 ul N-Methylimidazol zugesetzt. Nach Rühren während 2 Stunden bei Zimmertemperatur wurde eine Lösung, erhalten durch Phosphorylierung von 0,30 mMol der Verbindung 21 mit 1,5 ml einer 0,2 M Lösung von Verbindung 18 in Dioxan (30 Minuten) wiederum zum Reaktionsgemisch zugesetzt. Nach 2 Stunden wurde Verbindung 22 (n = 1) mit Hilfe eines Waschverfahrens, wie bei der Herstellung von Verbindung 19 (n = 1) beschrieben, und einer chromatographischen Reinigung (Eluierung mit Chloroform/Aceton 100/0T95/5) erhalten.
Verbindung 22 (n = 1) (285 mg) wurde durch folgende aufeinanderfolgede Stufen von den Schutzgruppen befreit.
- Entfernung der 2-Chlorphenylgruppen durch Umsetzung mit Syn-p yridin-2-carboxaldoxim und N¹,N¹,N³,N³- Tetramethylguanidin in Tetrahydrofuran während 48 Stunden bei Zimmertemperatur;
- Entfernung der 1,1,3,3-Tetraisopropyldisiloxan-1,3-diyl- und der tert.-Butyldiphenylsilylgruppe durch Umsetzung in Dioxan mit Tetra-n-butyl- ammoniumfluorid während 16 Stunden bei Zimmertemperatur;
- Entfernung der Benzyloxycarbonyl-, der Benzyloxymethyl- und der Benzylgruppen durch Hydrogenolyse in tert.-Butanol/Wasser (24 Stunden) und Wasser (24 Stunden) nacheinander, in Gegenwart von 10 % Pd/C (600 mg) und Glycinamid.
Nach Entfernung des Katalysators durch Filtration, Waschen des Filtrates (3x) mit Chloroform, Verdampfen des Chloroforms, Gefriertrocknen, Gelfiltration über Sephadex G-25 (Eluierung mit 0,01 M Triäthylammoniumbicarbonat pH 7), Gefriertrocknung der zuckerpositiven Fraktionen, wurde das erhaltene Material durch eine Dowex 50 WX4 (Na&spplus;-Form) -Säule in Wasser geleitet. Nach Gefriertrocknung wurden 51 mg der festen Verbindung 23 (n = 2) erhalten. ³¹P NMR : δ1,54 und 0,74. ¹H NMR (Ref. HDO, 4,65 ppm): δ4,90 (s,1H); 4,86 (s,1H); 4,5-4,4 (m,8 Linien, 1H); 3,21 (t,-NH- &sub2;-CH&sub2;-, Spacer); 1,71 (t,-CH&sub2;- &sub2;-CH&sub2;, Spacer).
¹³C NMR (äussere Referenz Tetramethylammoniumchlorid δ56,2): δ167,8 (s), 107,7 (s,C-1 Rib ) 107,5 (C-1 Rib ), 83,5 (s,CH), 82,8 (d,CH, JCP 5,8 Hz). 75,2 (s,CH), 75,1 (d,CH, JCP 3,4 Hz), 74,6 (br s,CH, JCP nicht aufgelöst), 72,3 (s, 2x CH), 71,8 (d, 2xCH, JCP 8,8 Hz), 71,4 (s, CH), 71,0 (s, 2xCH), 6,95 (s, CH&sub2;), 69,3 (s, CH&sub2;), 67,5 (d,CH&sub2;, JCP 4,4 Hz), 67,3 (d, CH&sub2; JCP 4,4 Hz), 64,4 (d, CH&sub2;, JCP 5,9 Hz), 63,4 (s, CH&sub2;), 63,2 (s, CH&sub2;), 41,3 (s, CH&sub2; Gly), 37,2 (s, CH&sub2;), 30,0 (d, CH&sub2;, JCP 7,3 Hz).
FAB MS (Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry) ergab m/z 823 [Verbindung 23, n = 2, -Na]&supmin; als das häufigste Signal in der Hochmassenregion.

5. Herstellung der Verbindung 23 (n = 3)

Verbindung 20 (n = 1) (0,46 mMol) wurde zu einer Lösung erhalten durch Phosphorylierung von 0,56 mMol der Verbindung 17 mit 3 ml einer 0,2 M Lösung der Verbindung 18 in Dioxan/Pyridin im Laufe von 30 Minuten zugesetzt. Nach 3 Stunden wurden 0,36 mMol Verbindung 19 (n = 2) erhalten. Analog zu dem bereits oben beschriebenen Vorgehen wurden 0,30 mMol Verbindung 20 (n = 2) sodann hergestellt, und ausgehend aus 0,15 mMol der Verbindung 20 (n = 2) wurden 478 mg der Verbindung 22 (n = 2) erhalten. Von dieser Verbindung wurden 45 uMol von den Schutzgruppen befreit zur Verbindung 23 (n = 3). Ausbeute 22 mg; ³¹P NMR : δ1,66 und 0,85 (zwei überlappende Signale); ¹H NMR in D&sub2;O (ref. HDO, δ4,65): 4,92 (s, 2H); 4,88 (s, 1H); 4,35 - 4,42 (m, 2H); 3,25 (t, 2H, Spacer -NH- &sub2;-CH&sub2;-); 1,74 (t, 2H, Spacer -CH&sub2;- &sub2;-CH&sub2;-); [α]20D = -30,1º (c = 1,0, H&sub2;O).

6. Herstellung der Immunogene

Immunogene wurden hergestellt durch Kupplung von Verbindung 23 (n = 2) und Verbindung 23 (n = 3), (siehe Schema 3) an Tetanustoxoid (TT) und Haemophilus influenzae Typ b -äussere Membran-Protein (MP) gemäss Schema 4.
Zuerst wurden die Oligosaccharide 23 (n = 2,3) durch Umsetzung der endständigen Aminogruppe mit N-Succinimidyl-S-acetylmercaptoacetat modifiziert, was Verbindung 24 (n = 2 oder 3) erzeugte. 2-Pyridyldithio (PDP) - Gruppen wurden in die Proteine eingeführt durch Umsetzung der &epsi;-NH&sub2;-Gruppen der Lysine mit N-Succinimidyl-2-pyridyldithiopropionat (SPDP). Verbindungen 24 und 25 wurden in einem Puffer (pH 6,1) zugesetzt. Die S-Acetylgruppe der Oligosaccharid-Komponente wurde durch Zusatz von Hydroxylamin abgespalten, wodurch eine freie -SH-Gruppe gebildet wird. Das Thiol 26 reagiert sodann mit einer PDP-Gruppe am Protein unter Bildung von Verbindung 27. Das Ausmass der Einverleibung des Oligosaccharides wurde bestimmt durch eine differenziale UV-Messung der Menge an freigesetztem 2-Thiopyridon (Δ&epsi; 343 = 8000 M&supmin;¹).

Materialien

Lösungen von Tetanustoxoid (10 mg/ml) und H. Influenzae-äussere Membran-Protein (2,5 mg/ml in 0,14 M NaCl + 0,1 % Zwittergent 3-14). N-Succinimidyl- S-acetylmercaptoacetat wurde gemäss Anal. Biochem. 132 (1983) 68-73 zubereitet. SPDP wurde erhalten von Pierce Chemical Company and Zwittergent 3-14 (N-Tetradecyl- N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat) von Calbiochem. N-Aethylmorpholin und Dimethylacetamid wurden aus Fluordinitrobenzol destilliert.
Puffer A : 2 M N-Aethylmorpholin/HCl pH 8,5
Puffer B : 0,01 M Triäthylammoniumbicarbonat pH 7,0
Puffer C : 0,1 M Natriumphosphat + 0,005 M EDTA (Dinatriumäthylendiaminotetraacetatdihydrat) pH 6,1
Puffer D : 0,1 M Natriumphosphat pH 7,8.
PD-10-Säule : vorgepackte Sephadex-G-25 M wegwerfbare Säule (Volumen 9,1 ml, Höhe 5 cm) von Pharmacia.
G-25-Säule : 100 x 1,0 cm Sephadex G-25 (superfein) von Pharmacia.

Herstellung von Verbindung 24

19,8 mg (21,4 uMol) der Triäthylammonium-Form der Verbindung 23 (n = 2) wurden in 0,21 ml Puffer A gelöst, worauf 25 mg N-Succinimidyl-S-acetylmercaptoacetat in 0,85 ml Dimethylacetamid zugesetzt wurden. Das homogene Reaktionsgemisch wurde während 1 Stunde bei Zimmertemperatur gehalten. Dann erfolgte die Ansäuerung durch Zusatz von Essigsäure (100 ul). Das Zuckermaterial wurde durch Zusatz von 5 ml Aceton ausgefällt. Der sirupartige Niederschlag wurde abzentrifugiert, in einem kleinen Volumen Puffer B gelöst und über eine G-25-Säule unter Verwendung dieses Puffers als Eluierungsmittel gereinigt. Die zuckerhaltigen Fraktionen wurden vereint und gefriergetrocknet. Das erhaltene Produkt wurde zwei weitere Male aus Wasser gefriergetrocknet und anschliessend in 0,50 ml Puffer C gelöst. Das Produkt enthielt 11,5 uMol der Verbindung 24 (n = 2).
11 mg der Verbindung 23 (n = 3) wurden auf ähnliche Weise zur Verbindung 24 (n = 3) umgewandelt. Das Produkt enthielt 4,2 uMol der Verbindung 24 (n = 3).

Herstellung der Verbindung 25

Eine PD-10-Säule wurde mit 25 ml Puffer D, äquilibriert. Dann wurden 1,50 ml (15 mg, etwa 100 nMol, Molekulargewicht etwa 150'000) einer TT-Lösung eingeführt und mit Puffer D eluiert. 4,5 mg SPDP in 0,45 ml Aethanol wurden zu der derart erhaltenen Lösung von TT in Puffer D zugesetzt (Eluierungsvolumen 2,5 - 6,0 ml). Nach Umsetzung während 1 Stunde auf Zimmertemperatur wurde das Reaktionsgemisch in die G-25-Säule eingeführt und mit Puffer C eluiert. Die proteinhaltigen Fraktionen wurden vereint und auf 20 ml (Proteinkonzentration etwa 5 nMol/ml) mit Puffer C verdünnt, in welcher eine Prise Natriumazid aufgelöst worden war. 3,0 ml dieser Lösung wurden unter Helium mit 1,0 uMol Dithiothreitol behandelt. Nach dem Stehen während 24 Stunden bei Zimmertemperatur war ΔE343 = 1,648 (Referenz: unbehandeltes PDP-TT). Da Δ&epsi;M = 8000, beträgt der Gehalt an 2-Thiopyridon 206 nMol/ml. Die Einverleibung betrug 41 PDP/TT.
15 mg TT wurden mit 1,0 uMol SPDP auf identische Weise behandelt. Die C-25-Fraktion wurde auf 15 ml verdünnt. Einverleibung : 4,5 PDP/TT.
Auf analoge Weise wurden 3,75 mg (etwa 95 nMol, Molekulargewicht etwa 40'000) MP zweimal in 3,5 ml Puffer D transferiert. Das Protein wurde mit 14,4 bzw. 0,4 uMol SPDP behandelt.
Nach Gelfiltration über G-25 wurde die Proteinfraktion auf 15 ml verdünnt (Proteinkonzentration etwa 5,25 nMol/ml). Weil das MP sehr hydrophob ist, wurde in diesem Fall 0,1 % Zwittergent 3-14 zu den Puffern C und D zugesetzt. Einverleibung : etwa 4,9 und etwa 1,3 PDP/MP.

Herstellung der Verbindung 27

43 ul (1,0 uMol) der zuvor erhaltenen Lösung der Verbindung 24 (n = 2) im Puffer C wurden zu 3,0 ml 1 mg/ml) 4,5 PDP/TT, 4,5 ml (0,75 mg/ml) 41 PDP/TT, 4,5 ml (0,25 mg/ml) 1,3 PDP/MP und 4,5 ml 4,9 PDP/MP G-25-Fraktionen in Puffer C, siehe oben) zugesetzt. Die Lösungen wurden mit Helium entlüftet. Dann wurden 10 ul 0,2 M Hydroxylamin, pH 6,15, zugesetzt. Nach Umsetzung über Nacht bei Zimmertemperatur wurde die gebildete Menge an 2'-Thiopyridon bestimmt. Die erwartete Menge an Thiopyridon wurde von den Proteinen 4,5 PDP/TT, 1,3 PDP/MP und 4,9 PDP/MP abgespalten, und eine entsprechende Menge an Verbindung 27 wurde daher gebildet. Ein Durchschnitt von 20 Molekülen der Verbindung 26 wurden an das 41 PDP/TT gekuppelt. Nachdem eine zusätzliche Menge der Verbindung 24 (n = 2) zugesetzt worden war, blieb der Grad an Saccharid-Einverleibung unverändert. Zu einem analogen Konjugat, welches nach einer kürzeren Reaktionszeit 17 Moleküle Dimer enthielt, wurde 1 uMol Cystein zugesetzt. Die erwartete Gesamtmenge an Thiopyridon wurde sodann rasch gebildet.
Verbindung 24 (n = 3) wurde in einer analogen Weise für die Herstellung von Trimer-Proteinkonjugaten gemäss Verbindung 27 verwendet.
Kurz zusammengefasst wurden die folgenden Konjugate hergestellt :
1,3- und 4,9-Dimer und -Trimer/MP
4,5-Dimer und -Trimer/TT
20-Dimer/TT (mit 21 restlichen PDP-Gruppen)
17-Dimer/TT (ohne restliche PDP-Gruppen als Resultat der Nachbehandlung mit Cystein)
13-Trimer/TT (28 restliche PDP-Gruppen).
Die Antigenizität dieser Konjugate wurde gemessen und mit derjenigen von nativem Polysaccharid von HIB (Ca-Salz), menschlichem Polysaccharidvaccin und homologem Antigen (= Polysaccharid/MP), welches Mäuse- Antikörper erzeugt, verglichen. Die zu untersuchenden Substanzen wurden in einer zweifachen Verdünnungsserie mit einer festgesetzten Menge Antiserum vermischt. Nach Inkubation während 1 Stunde bei Zimmertemperatur wurde der Titer der restlichen freien Antikörper in einem direkten ELISA-Inhibitionstest bestimmt. Die Resultate sind wie folgt : Konjugat Konzentration (ug/ml) % Inhibition Dimer/MP Trimer/MP Dimer/TT Trimer/TT natives Polysaccharid (Ca-Salz) menschliches Polysaccharidvaccin homologes Antigen (tyraminiertes Polysaccharid)
Wie daraus ersichtlich ist, weisen die Dimer- Konjugate eine beträchtliche Bindung an die Antikörper auf, obwohl diese Bindung merklich geringer ist als diejenige des nativen Polysaccarides. Die Fähigkeit des nativen Polysaccharides, sich an Antikörper zu binden, kann annähernd durch die Trimer-Konjugate erzielt werden.

7. Herstellung des Vaccins

Ein Trimer- Oligosaccharid (Verbindung 23, n = 3) wurde an Tetanus-toxoid mit Glutardialdehyd gebunden durch Vermischen eines 10- bis 100-fachen Ueberschusses (auf molarer Basis) des Trimers mit Tetanus-toxoid und durch Zusatz von Glutardialdehyd dreimal im Ueberschuss in bezug auf den Liganden in Abständen von 1 Stunde. Nachdem das Reaktionsgemisch während 5 Stunden bei Zimmertemperatur stehen gelassen worden war, wurde ein zwanzigfacher Ueberschuss (in bezug auf den Liganden) Glycin zugesetzt. Nach 1 Stunde bei Zimmertemperatur wurde NaCNBH zugesetzt. Nach 5 Stunden bei Zimmertemperatur wurde das Reaktionsgemisch dialysiert. Ausgehend von 2,4 mMol Trimer wurden 120 uMol Konjugat erhalten, wobei drei Trimere pro Tetanus-toxoid einverleibt waren (drei Trimer/TT), wobei das Gewichtsverhältnis von Trimer : TT 0,1 : 3 betrug.
Ein Konjugat von Haemophilus influenzae Typ b - Polysaccharid und Haemophilus influenzae Typ b - äussere Membran-Protein, gekuppelt mit Hilfe von Adipindihydazid (PS-MP) wurde an Mäusen injiziert. Das Gewichtsverhältnis von Protein zu Polysaccharid in dem Konjugat betrug 1 : 1. Die Dosis pro Injektion betrug 5 ug Konjugat. Die Injektion wurde 3 und 5 Wochen nach der ersten Injektion wiederholt. Nach 6 Wochen wurde der IgG-Titer bestimmt und auf 100 eingestellt.
Anderen Mäusen wurden 3,12 ug des 3-Trimer/TT- Konjugates injiziert. Nach 4 Wochen wurde diese Injektion wiederholt, und nach 6 Wochen wurde der IgG-Titer bestimmt, welcher 36 betrug in bezug auf den auf 100 eingestellten PS-MP-Titer.
Die starke Immunogenizität des 3-Trimer/TT- Konjugates kann aus der Tatsache entnommen werden, dass etwa 1/3 des IgG-Titers, welcher durch Injektion von 7,5 ug Polysaccharid erhalten wurde, mit nur 0,25 ug des Oligosaccharides erzielt wurde. Mit 1/30 des Gewichtes wurde 1/3 der Wirkung erhalten. Ausserdem wurde die Injektion mit dem Trimer nur einmal wiederholt, während diejenige mit dem Polysaccharid zweimal wiederholt wurde. Formelblatt. Formel 1: Formel 2: Formel 3: Formel 4: Formel 5: Formel 6: Schema 1: Schema 2:
All= allyl; Trt= triphenylmethyl;Bzl= benzyl; Bz= benzoyl; Ac= acetyl; BOM= benzyloxymethyl; Prop= propen-1-yl; tBuPh&sub2;Si- = t-butyldiphenylsilyl. Schema 3:
Ph(2-Cl) = 2-chlorphenyl; Z= benzyloxycarbonyl; Gly=glycine und die anderen Abkürzungen haben die gleiche Bedeutung wie in Schema 1 und 2. Schema 4 (Ac= Acetyl) H&sub2;N-protein oligosaccharide protein

Claims

1. Oligosaccharid, welches geeignet ist für die Herstellung von Immunogenen und Vaccinen für die Behandlung von Haemophilus Influenze Typus b, und welches die Struktur (D-Ribose-D-ribitol-phosphat)m, (D-Ribitol- phosphat-D-ribose)m oder (Phosphat-D-ribose-D-ribitol)m umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass in 2, 3, 4 ... 19 oder 20 bedeutet.

2. Oligosaccharid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Oligosaccharid die folgende Formel aufweist :

k = 0 oder 1, wenn L = 1,

k = 0 wenn L = 0,

L = 0 oder 1,

m = 2, 3 ... 19 oder 20, unter der Bedingung, dass m 1 sein kann, wenn k , L und n = 1 oder wenn L , n und q = 1,

n = 0 oder 1,

q = 0 oder 1, wenn n = 1,

q = 0, wenn n = 0,

X = Wasserstoff, eine reaktionsfähige Gruppe, welche fähig ist, eine Bindung mit einem Protein zu bilden, oder eine Gruppe, welche eine hydrophobe Kette am ungebundenen Ende enthält, welche eine Wechselwirkung mit einem Micelle, einem Vesikel oder einem Liposom eingehen kann oder durch eine hydrophobe Wechselwirkung der Oligosaccharide selbst, wobei die reaktionsfähige Gruppe eine der folgenden reaktionsfähigen Funktionen enthält:

in welcher R = -OH, -N&sub3; , -O-Alkyl (C&sub1;&submin;&sub1;&sub2;), -OC&sub6;F&sub5; ,

oder die Endgruppe XO- durch die reaktionsfähige Gruppe H&sub2;N- oder HS- ersetzt ist, und

Y = Wasserstoff, eine reaktionsfähige Gruppe, wie zuvor für X definiert, oder die Endgruppe -OY ersetzt ist durch die reaktionsfähige Gruppe -NH&sub2; oder -SH, unter der Bedingung, dass Y = Wasserstoff, wenn X nicht Wasserstoff ist, und dass X = Wasserstoff, wenn Y nicht Wasserstoff ist,

und Salze davon.

3. Oligosaccharid nach den Ansprüchen 1-2, dadurch gekennzeichnet, dass m = 2, 3, 4, 5 oder 6 ist.

4. Oligosaccharid nach den Ansprüchen 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass X = Wasserstoff und Y nicht Wasserstoff ist.

5. Oligosaccharid nach den Ansprüchen 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass Y = Wasserstoff und X nicht Wasserstoff ist.

6. Oligosaccharid nach den Ansprüchen 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass X oder Y eine Gruppe mit einer Alkylgruppe, welche 12-24 Kohlenstoffatome enthält, am ungebundenen Ende ist.

7. Immunogen, welches ein Oligosaccharid nach den Ansprüchen 1-6 enthält, welches Oligosaccharid mit einem Träger assoziiert ist oder eine Assoziation von mehreren Molekülen eines Oligosaccharides gemäss den Ansprüchen 1-6 miteinander enthält.

8. Immunogen nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger ein Protein ist.

9. Immunogen nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein Haemophilus influenzae Typus b- Oberflächenprotein ist.

10. Immunogen nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger eine Micelle, ein Vesikel oder ein Liposom ist.

11. Vaccin, welches ein Immunogen nach den Ansprüchen 7-10 enthält.

12. Verfahren zur Herstellung eines Oligosaccharides nach Anspruch 1 durch Ersatz der Schutzgruppen in einem Oligosaccharid durch ein Wasserstoffatom, wobei das Oligosaccharid die Struktur (D-Ribose-D-ribitol- phosphat)m, (D-Ribitol-phosphat-D-ribose)m oder Phosphat- D-ribose-D-ribitol)m umfasst, in welcher m = 2, 3, 4 ... 19 oder 20 ist, und worin das Wasserstoffatom in den freien Hydroxygruppen durch eine Schutzgruppe ersetzt wurde.

13. Verfahren zur Herstellung eines Immunogens nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass ein Oligosaccharid nach den Ansprüchen 1-6 mit einem Träger vereint wird, oder dass eine Assoziation von mehreren Molekülen eines Oligosaccharides nach den Ansprüchen 1-6 gebildet wird.

14. Verfahren zur Herstellung eines Vaccins nach Anspruch 11 durch Auflösen, Emulgieren oder Suspendieren des Immunogens der Ansprüche 7-10 in einer wässerigen Umgebung.