DE3783294T2

DE3783294T2 - Herstellung von laktonen.

Info

Publication number: DE3783294T2
Application number: DE8787306559T
Authority: DE
Inventors: Peter Samuel James Cheetham; Rooij Johannes Franciscus M De; Katherine Ann Maume
Original assignee: Unilever NV
Current assignee: Unilever NV
Priority date: 1986-07-28
Filing date: 1987-07-24
Publication date: 1993-04-15
Anticipated expiration: 2007-07-25
Also published as: DE3783294D1; CA1281302C; GB8618351D0; JPS6356295A; ES2043660T3; EP0258993A3; ATE84073T1; BR8703876A; EP0258993A2; JPH069514B2; IN166802B; EP0258993B1

Description

Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft die Herstellung von gamma-Hydroxydecansäure aus Rizinusöl oder der Fettsäure, die dessen Hauptbestandteil ausmacht, nämlich Rizinusölsäure, und deren anschließende Umwandlung in optisch aktive gamma- Decalactone.

Hintergrund der Erfindung

Spezielle Chemikalien werden in breitem Maß in Aromazusammensetzungen verwendet, um im Gesamtaromastoff ein vom Verbraucher geschätztes besonderes Element zu ergeben. Ein Beispiel einer solche Chemikalie ist gamma-Decalacton, das ein Lacton der gamma-Hydroxydecansäure ist. Ein Beispiel der Verwendung dieses Materials ist ein in der UK 743 845 (Unilever) angegebener Aromastoff; diese Komponente wird auch in Parfümzusammensetzungen verwendet. Es ist eine generelle Forderung, diese Komponente in einem effizienten Verfahren herzustellen.

Allgemeine Beschreibung

Die vorliegende Erfindung richtet sich auf ein Verfahren zur Herstellung von optisch aktiver gamma-Hydroxydecansäure, die zur Umwandlung in optisch aktives gamma-Decalacton geeignet ist, bei welchem ein Mikroorganismus, ausgewählt aus der Stämme von Sporobolomyces odorus, Rhodotorula glutinis und deren Mischungen umfassenden Gruppe, in einem eine Rizinusölsäurequelle enthaltenden Nährmedium unter aeroben Bedingungen bei einem pH-Wert von etwa 3 bis etwa 9 und einer Temperatur von etwa 15 bis etwa 35ºC, vorzugsweise von etwa 25ºC bis etwa 30ºC, für eine ausreichende Dauer kultiviert wird, um optisch aktive gamma-Hydroxydecansäure zu produzieren. Die Erfindung schließt nach Wunsch auch das Lactonisieren der Säure, z.B. durch Anwendung von Wärme bei einem sauren pH-Wert, und die Gewinnung des gamma-Decalactons ein. Das gamma-Decalacton kann durch Standard-Verfahren z.B. Lösungsmittelextraktion, gewonnen und gereinigt werden. Der für die Fermentation optimale pH-Wert beträgt etwa 5,5 bis etwa 7,5.
Diese Mikroorganismen sind fähig, das Rizinusöltriglycerid zu hydrolysieren und dann die Rizinusölsäure, die der Hauptfettsäurebestandteil (80 bis 90 %) des Glycerids ist, einer beta-Oxidation zu unterziehen. Diese Mikroorganismen können auch verwendet werden, die Rizinusölsäure als ein Substrat entweder in Form der im wesentlichen reinen Säure oder als ein Bestandteil eines Rizinusölhydrolysates, das auf einem Weg ohne Verwendung der beiden angegebenen Mikroorganismen erhalten wurde, umzuwandeln. Das Kulturmedium enthält die nötigen Nährstoffe, z.B. Stickstoff und Phosphor, die für das Wachstum der Mikroorganismen nötig sind.
Die hier angegebenen Mikroorganismen können die Rizinusölsäure zu gamma-Hydroxydecansäure β-oxidieren. Diese Metabolitsäure steht dann der Lactonisierung zur Verfügung. Sp. odorus und Rh. glutinis sind auch zum Hydrolysieren von Rizinusöl befähigt, wodurch diese Quelle der Rizinusölsäure als Substrat verwendet werden kann. Die Anmelder beschreiben die Verwendung hinterlegter Stämme dieser Arten von Mikroorganismen, es gibt jedoch keine kritische Bedeutung bei der Verwendung dieser und anderer Stämme dieser Arten allgemeiner Verfügbarkeit im beanspruchten Verfahren. Das erfindungsgemäße Verfahren schließt die Verwendung von Rizinusölhydrolysat als Rininusölquelle ein, wenn das Hydrolysat unter Verwendung eines anderen Mittels als den hier beschriebenen erhalten wurde. Beispiele solcher Hydrolysierungsmittel sind Basen, Enzyme und andere Mikroorganismen.
Die erhaltene gamma-Hydroxydecansäure kann in situ zum gewünschten Lacton lactonisiert oder gewonnen und in einem getrennten Schritt einer Lactonisierung unterzogen werden.
Das bevorzugte Kultivierungsverfahren arbeitet in den Bereichen:
pH 3 bis 9
Temperatur 15 bis 35ºC
Dauer 1 bis 10 Tage
Substratkonzentration 0,3 bis 10 Gew.-%
Eine Konzentration im Bereich von 0,5 bis 2 % ergibt eine molare Umwandlung von 15 bis 40 % und wird bevorzugt.
Konzentration des Mikroorganismus 1 bis 100 g/l feuchter Zellen in der Impfkultur
Eine Dauer von einem Tag reicht gewöhnlich aus, eine feststellbare Menge an gamma-Decalacton zu ergeben. Die Produktkonzentration erhöht sich im allgemeinen mit der Zeit, und eine Dauer von 7 Tagen liefert gewöhnlich eine kommerziell zweckmäßige Konzentration. So ergab Rh. glutinis mit Konzentrationen an gekochtem Fleischmedium von 2 % Gew./Gew. und Rizinusöl von 1 % Gew./Gew. eine Lactonausbeute von 880 mg/l, und Sp. odorus lieferte eine Ausbeute von 1116 mg/l nach 7 Tagen.
Das Lactonprodukt wird gewöhnlich im Bereich von 200 mg/l bis 1000 mg/l erhalten, kann jedoch auch bis zu 5000 mg/l betragen.
Die Lactonisierung erfolgt vorzugsweise durch Wärmeanwendung bei einem geeigneten pH-Wert, gewöhnlich durch Einstellen der Hydroxysäureumgebung auf einen pH-Wert im Bereich von etwa 1 bis etwa 7 bei einer Temperatur von etwa 15 bis etwa 130ºC für eine ausreichende Dauer.
Ein Co-oxidationsmittel, z.B. Decansäure, kann vorliegen, um für den Mikroorganismus zusätzlich zur Rizinusölquelle eine Nährstoffquelle zu liefern.
Vorzugsweise wird der Mikroorganismus auf einem Trager, z.B. k-Carrageenan oder Calciumalginat, immobilisiert. Beispiele des Verfahrens werden in Eu.J. App.Mic & Biotech 15 (1982), Seiten 147-162, und Biotech & Bioeng 19 (1977), Seite 387 ff., beschrieben. Die Anwendung der Immobilisation erlaubt die Erzielung hoher Zelldichten, was zu erhöhten Reaktionsgeschwindigkeiten führt. Die Zellen können nach der Beendigung des Verfahrens gewonnen werden. Die Zellen sind vor dem Substrat und Produkt partiell geschützt; dies ist von Vorteil, wenn eine inhibitorische Wirkung vorliegt.
Ein wahlweises Verfahrensmerkmal ist die Extraktion der gamma-Hydroxydecansäure oder des Lactons im Verlauf der Fermentation durch ein geeignetes Absorptionsmittel, z.B. ein nicht polares Harz, wie Amberlite XAD Harze, erhältlich von BDH in Poole, Dorset, oder ein Lösungsmittel, z.B. Miglyol, erhältlich von Dynamit Nobel, Witten, Deutschland. Das Substrat kann auch nach Standard-Verfahren, z.B. als Alginat- oder Carrageenan-Gel, immobilisiert werden. Die Zugabe eines Triglycerids oder einer fraktionierten Kokosnußölfettsäure oder von Triacetin unterstützt die Verteilung des Hydroxysäureproduktes aus der wäßrigen Schicht in die hydrophobe Phase. Diese Zugabe treibt die Reaktion voran, indem sie die Konzentration des Reaktionsproduktes am Reaktionsort verringert. Das Vorliegen der hydrophoben festen oder flüssigen Phase kann auch dazu dienen, das Substrat zu maskieren, so daß die Zellen keiner übermäßig hohen lokalen Konzentration von Rizinusöl oder Rizinusölsäure ausgesetzt werden, was sich für die Zellen als toxisch erweisen kann.
Wahlweise kann ein Wachstumfaktor, z.B. Riboflavin, Nikotinsäure und Pantothensäure, mitverwendet werden. Eine besonders bevorzugte Kohlenstoffquelle ist Glycerol, das die Ausbeute an gewünschtem Lacton, insbesondere bei Verwendung von Rh. glutinis, erhöhen kann. Andere alternative Kohlenstoffquellen sind Natriumacetat und Calciumlactat.
Ein wesentliches Merkmal der Erfindung besteht darin, daß mindestens ein Teil der Rizinusölsäurequelle am Anfang der Inkubation vorliegt. Ein wahlweises Merkmal des Verfahrens besteht in der progressiven Zugabe der Rizinusölsäurequelle, z.B. Rizinusöl, zur Inkubation mit einer Geschwindigkeit, bei welcher der Aufbau von inhibitorischen Konzentrationen der Rizinusölsäurequelle vermieden wird, während wesentliche Mengen auf kontinuierlicher Basis umgewandelt werden. Die Inkubation der Rizinusölsäurequelle mit dem gewählten Mikroorganismus kann in einem Verfahren erfolgen, bei dem die Zellen des Mikroorganismus wachsen und die Umwandlung der Rizinusölsäurequelle parallel zu fünf andauert, oder in einem Verfahren, bei dem die Zellen des Mikro- Organismus gezüchtet werden und dann in Folge das erfindungsgemäße Umwandlungsverfahren durchgeführt wird.
In den die Fermentiervorrichtung verlassenden Gasen gibt es einen gewissen Verlust an gewünschtem Produkt, und das gewünschte Lacton kann unter Verwendung eines Absorptionsmittels, z.B. Tenax Gc, das in den Gasstrom gegeben wird, zurückgewonnen werden.
Neben der gewünschten Hydroxysäure gibt es auch geringe Mengen z .B. von C&sub8;- und C&sub1;&sub2;-Hydroxysäuren, die aus der Rizinusölsäure gebildet werden. Daher kann das Lactonprodukt geringe Konzentrationen homologer Lactone entsprechend diesen Säuren enthalten. Ferner können Metaboliten anderer von Rizinusöl stammender Fettsäuren vorliegen. Selbstverständlich können alle diese geringfügigen Produkte zu den organoleptischen Eigenschaften des Lactonproduktes beitragen.

Literatur

Die Herstellung von gamma-Decalacton aus Rizinusöl mit Hilfe spezieller Mikroorganismen wird von Fritzsche, Dodge and Olcott Inc. in der US 4 560 656 offenbart. Diese Mikroorganismen sind nicht diejenigen, auf die sich die vorliegende Erfindung richtet. Die Behandlung von Rizinusöl mit Mikroorganismen zur Bildung von gamma-Decalacton wird auch in der Japanese Kokai 100508/1985 der Kanebo Limited offenbart. Die Verwendung von Sp. odorus zur Herstellung von gamma-Decalacton aus Zuckersubstraten wird von Jourdain et al. (Topics in Flavour Research, 1985, veröffentlicht von Eichhorn) offenbart.
Das vorliegende Verfahren liefert gamma-Decalacton in zweckmäßigen Mengen in einer wirksamen Weise.

Spezielle Beschreibung der Erfindung

Es werden nun Beispiele des Verfahren zur Veranschaulichung der Erfindung, die diese nicht beschränken, gegeben.

Beispiel 1

Eine 3 ml-Impfkultur, die etwa 10 g (Naßgewicht)/l Zellen von Rh. glutinis (NCYC 59, hinterlegt bei der National Collection of Yeast Cultures, Food Research Institute, Norwich, England) als Mikroorganismus enthielt, wurde zu 100 ml eines Medium gegeben, das 2 % Gew./Vol. gekochtes Fleischmedium (OXOID CM 81), 2 % Gew./Vol. Glucose und 0,02 % Gew./Vol. Tween 80 sowie 0,5 % Gew./Vol. Rizinusöl enthielt, und 7 Tage bei 28 bis 30ºC gehalten.
Proben (5 ml) des Mediums wurden aseptisch von Zeit zu Zeit entnommen, um den Verfahrensverlauf zu bestimmen, wobei die Proben durch Ansäuern auf einen pH- Wert von etwa 1,5 und 10 min langes Erhitzen bei 120ºC lactonisiert wurden. Dann wurden die Proben mit Diethylether (5 ml) extrahiert, die organische Schicht wurde abgetrennt und das Lösungsmittel abgedampft; der verbleibende Rückstand wurde erneut in 2 ml Ethylalkohol, der delta-Undecalacton (0,04 % Gew./Vol.) als internen Standard enthielt, gelöst und die Probe durch GLC- Analyse untersucht.
Nach 7 Tagen wurde das fermentierte Material extrahiert. Alternativ können die obere Rizinusölschicht oder die durch Sedimentation isolierten Zellen nach der Fermentation entfernt und das im Rizinusöl oder in den Zellen vorliegende Säure-/Lacton-Material kann wie oben extrahiert werden. Im letztgenannten Fall dient das Lösungsmittel auch der Extraktion des innerhalb der Zellen vorliegenden Säure/Lactons.
Aus der Fermentationsbrühe wurde eine Konzentration von 608 mg/l gamma-Decalacton erhalten, was eine Ausbeute von 21,3 %, bezogen auf Rizinusöl auf der Grundlage einer theoretischen maximalen Ausbeute von etwa 60 %, darstellt.
Die obige Fermentation kann in einer Fermentiervorrichtung (L H Fermentation, stoke Poyes, 500er Serie) erfolgen, wobei ein pH von 7,2, eine Belüftungsgeschwindigkeit von 0,51 Luft/l.v. Fermentiervorrichtung/min und eine Bewegungsgeschwindigkeit von 300 U/min sowie eine Temperatur von 28ºC aufrechterhalten werden.

Beispiel 2

Die Arbeitsweise von Beispiel 1 wurde mit einer Rizinusölkonzentration von 1 % Gew./Vol. in der Lösung wiederholt und ergab eine gamma-Decalactonkonzentration von 851 mg/l, was eine angenäherte molare Ausbeute von 14,7 % darstellt.

Beispiel 3

Die Arbeitsweise von Beispiel 1 wurde unter Verwendung einer Rizinusölkonzentration von 5 % wiederholt, wobei jedoch Proben mit Hexan (5 ml), das 0,5 % Gew./Vol. Tetradecan als internen Standard enthielt, extrahiert und die abgetrennten Hexanzusammensetzungen nach 4- und 10-tägiger Fermentation mittels GLC analysiert wurden, was Ausbeuten von 120 bzw. 425 mg/l ergab. Nach 1 Tag betrug die Ausbeute weniger als 100 mg/l.

Beispiel 4

Die Arbeitsweise von Beispiel 2 wurde unter Verwendung von Sp. odorus (CBS 2636, hinterlegt beim Central Bureau Voor Schimmel Cultures, Delft, Niederlande) als Mikroorganismus mit einer Rizinusölkonzentration von 1 % Gew./Vol. im Medium wiederholt. gamma-Decalacton wurde in Konzentrationen von 388, 564 und 943 mg/l nach 3, 5 bzw. 7 Tagen Inkubation festgestellt.

Beispiel 5

Unter Anwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Arbeitsweise wurden über eine Dauer von 7 Tagen Proben aus einer Fermentationsbrühe entnommen, die 2 % Gew./Vol. gekochtes Fleischmedium, 1 % Rizinusöl und 1 % Gew./Vol. Miglyol 812 enthielt, wobei Rh. glutinis als Mikroorganismus verwendet wurde. Nach 7 Tagen betrug die wie in Beispiel 1 erhaltene Ausbeute an gamma-Decalacton 377 mg/l.

Beispiel 6

Eine 3 ml-Impfkultur, die etwa 10 g (Naßgewicht)/l Zellen von Sp. odorus enthielt, wurde zu 100 ml Medium, das 2 % Gew./Vol. gekochtes Fleischmedium (Oxoid CM 81), 2 % Gew./Vol. Glucose, 0,02 % Gew./Vol. Tween 80 und 0,5 % Gew./Vol. Rizinusöl enthielt, zugefügt. Proben wurden wie zuvor entnommen und wie beschrieben lactonisiert, bevor sie mit 5 ml Hexan, das 0,5 Gew./Vol. Tetradecan als internen Standard enthielt, extrahiert wurden; der Hexanextrakt wurde durch GLC analysiert, wobei das Vorliegen von gamma-Decalacton in der ersten Proben nach 3 Tagen festgestellt wurde; seine Konzentration erhöhte sich linear mit der Zeit, bis nach 7 Tagen eine Konzentration von 950 mg/l erhalten wurde. Dies war einer Ausbeute von 32 %, bezogen auf Rizinusöl auf der Grundlage einer theoretischen maximalen Ausbeute von etwa 60 %, äquivalent.

Beispiel 7

Zellen von Rh. glutinis wurden in 100 ml einer Nährbrühe, die 2 % Gew./Vol. eines feinteiligen porösen Polymers zum Immobilisieren des Mikroorganismus enthielt, kultiviert. Nach 2-tägiger Inkubation wurde die Brühe abdekantiert und durch 2 % gekochtes Fleischmedium und 1 % Rizinusöl ersetzt; die Inkubation wurde 7 weitere Tage forgesetzt, worauf 762 mg/l gamma-Decalacton unter Anwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Extraktionsverfahrens in der Brühe identifiziert wurden.

Beispiel 8

Die Arbeitsweise von Beispiel 7 wurde unter Verwendung von 2 % Rindfleischextrakt anstelle des gekochten Fleischmediums wiederholt. Nach 7-tägiger Inkubation wurde eine Konzentration von 1031 mg/l gamma-Decalacton nachgewiesen.

Beispiel 9

Die Arbeitsweise von Beispiel 2 wurde unter Zugabe von 1 % Gew./Vol. Glasperlen (1,5-2 mm Durchmesser) im Nährmedium zum Immobilisieren des Mikroorganismus wiederholt. Nach 7-tägiger Inkubation wurde eine Konzentration von 1118 mg/l gamma-Decalacton erhalten, was eine Ausbeute von 19,6 %, bezogen auf Rizinusöl auf der beschriebenen Grundlage, darstellt.

Beispiel 10

Die Arbeitsweise von Beispiel 1 wurde wiederholt, wobei 2 % Gew./Vol. Amberlite XAD Harz der Brühe als Maskierungsmittel zugefügt wurden. Nach 7-tägiger Inkubation wurden 448 mg/l gamma-Decalacton extrahiert, und nach nur 2-tägiger Inkubation wurden 199 mg/l erhalten. Das Harz wurde von der Brühe abgetrennt, mit destilliertem Wasser gewaschen und wie in Beispiel 6 beschrieben mit Hexan extrahiert.

Beispiel 11

Das Verfahren von Beispiel 6 wurde mit Mikroorganismuszellen wiederholt, die auf k-Carrageenan immobilisiert waren. Eine 2 % Trockengewicht/Vol. wäßrige Lösung von k-Carrageenan wurde in einer Konzentration von 4:1 Gew./Vol. hergestellt, indem man die Kulturbrühe bei etwa 10 000 U/min 15 min bei 20ºC zentrifugierte. Dann wurde die Zellen-Carrageenan-Aufschlämmung tropfenweise in eine 0,1 M Lösung von Kaliumchlorid extrudiert, um das Carrageenan zu gelieren und die Zellen zu immobilisieren. Dieses Verfahren wird von S. Takamatsu et al. im European Journal of Applied Microbiology and Biotechnology 15 (1982), Seiten 147-152, beschrieben.
Rh. glutinis wurde mit Rizinusöl und Rizinusölsäure in getrennten Medien kultiviert. Sp. odorus wurde mit Rizinusölsäure kultiviert. Nach 5 Tagen betrugen die Ausbeuten an gamma-Decalacton:
Rizinusöl/Rh. glutinis 153,5 mg/l
Rizinusölsäure/Rh. glutinis 154,3 mgL7
Rizinusölsäure/Sp. odorus 518 mg/l
Ein alternativer Träger wurde durch Calciumalginat unter Anwendung des von M. Kierstam et al. in Biotechnology & Bioengineering 19(1977), Seite 387 ff., beschriebenen Verfahrens bereitgestellt.
Die freie Säure war aus jedem der Beispiele durch GLC-Verfahren unter Verwendung einer gepackten Säule, die 10 % SP02330 auf 100/120 mesh Chromosorb AW (Supelcolac) in einer 2 m-Säule von 0,4 cm Durchmesser enthielt, als ihr Methylester erhältlich. Einzelheiten der weiteren Extraktion kann man durch Bezugnahme auf Standard Methods for Analysis of Oils, Fats and Derivatives, 6. Aufl., Methode II D25 (UPAC Methodology Pergamon Press Oxford) erhalten.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung optisch aktiver gamma-Hydroxydecansäure, die zur Umwandlung in optisch aktives gamma-Decalacton geeignet ist, worin ein Mikro-Organismus, ausgewählt aus der Stämme von Sporobolomyces odorus, Rhodotorula glutinis und deren Mischungen umfassenden Gruppe, in einem eine Rizinusölsäurequelle enthaltenden Nährmedium unter aeroben Bedingungen bei einem pH-Wert von etwa 3 bis etwa 9 und einer Temperatur von etwa 15 bis etwa 35ºC auf eine ausreichende Dauer kultiviert wird, um optisch aktive gamma- Hydroxydecansäure zu bilden, und die Säure wahlweise lactonisiert und das erhaltene gamma-Decalacton gewonnen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Rizinusölsäurequelle Rizinusölsäure, Rizinusöl, Rizinusölhydrolysat oder eine Mischung derselben ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin der Mikroorganismus auf einen Träger immobilisiert wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, worin der Träger Carrageenan- oder Alginatgele umfaßt.

5. Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, worin die gamma- Hydroxydecansäure in situ lactonisiert wird.

6. Verfahren nach irgendeinem vorhergehenden Anspruch, worin das Säureprodukt durch Anwendung von Wärme bei einem geeigneten pH-Wert lactonisiert wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin die Lactonisierung durch Einstellen eines sauren pH-Wertes und einer Temperatur von etwa 15 bis etwa 130ºC erreicht wird.

8. Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Fermentation in Gegenwart eines Maskierungsmittels durchgeführt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, worin das Maskierungsmittel ein feinteiliges poröses Polymer oder eine mit Wasser nicht mischbare flüssige Phase umfaßt.

10. Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Rizinusölsäurequelle der Inkubation progressiv mit einer Geschwindigkeit zugegeben wird, die ihre Konzentration unterhalb inhibitorischer Werte hält.